CN102614843B

CN102614843B - 蛋白a免疫吸附材料及其制备方法

Info

Publication number: CN102614843B
Application number: CN201210096913.9A
Authority: CN
Inventors: 张旭锋; 李树兴
Original assignee: YUNNAN AODUN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2032-04-05
Also published as: CN102614843A

Abstract

本发明公开了一种用于吸附抗体的蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，所述蛋白A是带有半胱氨酸的重组蛋白A；所述蛋白A免疫吸附材料通过重组蛋白A的制备、琼脂糖凝胶的活化、免疫吸附材料的合成三个步骤制备而成；本发明的蛋白A免疫吸附材料可从体液中直接、高效、选择性吸附自身免疫性疾病有关的致病抗体，且可安全地进行体外循环，实现一次性灌流即可达到清除患者致病抗体的目的。

Description

蛋白A免疫吸附材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用生物材料领域，具体涉及一种用于吸附抗体的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。

背景技术

即使在医学发达的今日，人类仍有很多疑难疾病无法攻克，自身免疫性疾病就是其中一种。自身免疫性疾病发病机制复杂，可累及全身多器官、多系统，传统治疗方法以糖皮质激素和细胞毒药物为主，治疗效果一直不佳。自身免疫性疾病已经成为威胁人类健康与生命的主要疾病之一。

自身免疫性疾病以患者血清或其它体液中可检测到一种或多种高滴度的自身抗体为特点，自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要依据，每种自身自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱，是早期诊断必不可少的生物学指标。病人血液中存在高效自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫疾病的重要依据。某些自身抗体因对疾病的诊断具有高度特异性，已成为诊断相应疾病的金标准，目前比较公认的标志性抗体有10多种，例如抗ds-DNA、抗Sm抗体仅发现于系统性红斑狼疮患者中；抗线粒体抗体(AMA-M2)是原发性胆汁性肝硬化的标志性抗体；抗角蛋白抗体是类风湿性关节炎的标志性抗体等等。因此，如果能够除去患者体内这些自身抗体，则有望抑制自身抗体对全身器官的攻击，缓解病情，减轻免疫抑制剂的用药量，使患者早日康复。

蛋白A是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，其分子量为约42kD，其氨基末端含有4个高度类似的免疫球蛋白Fc段结合区，可与人血浆中的抗体及其免疫复合物的Fc段特异结合。如果将蛋白A固定在某一载体上制备成载体-蛋白A复合物免疫吸附柱，当人体血浆通过该吸附柱时，血浆中的抗体及其免疫复合物就会被特异性地吸附，一些因抗体和免疫复合物导致的疾病，如系统性红斑狼疮、自身免疫性疾病、器官移植、恶性肿瘤等即可得到治疗与缓解。

1984年瑞典Excorim公司将蛋白A固定在琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B)上，用于吸附患者血浆中的致病抗体。该吸附材料每毫升可吸附20mg抗体，每支吸附柱一次可吸附1.2g左右抗体(每支吸附柱填充62.5ml吸附剂)。一般而言，患者体内抗体总量为20～30g，为达到清除抗体的目的，该吸附柱必须反复多次吸附10次以上。为保证吸附柱重复、安全使用，该公司还生产了与免疫吸附柱配套使用的设备：连续免疫吸附治疗监视与控制系统(CITEM 10)，由预制电脑程序控制两个吸附柱交替“吸附-再生-吸附”，循环进行，每支吸附柱与患者血浆反复接触、吸附10次，实现对致病物质清除的连续性和相对非受限性。

目前，关于蛋白A免疫吸附材料合成方法的专利很多，一般情况下通过蛋白A分子链上的伯氨基与其它基团反应固定在琼脂糖凝胶基质上，由于伯胺基的化学反应活性不高，公开的文献和专利的实验数据显示，通过蛋白A上的伯氨基与载体反应后，固定在载体上的蛋白A含量为3～10mg/mL载体，合成得到的材料每毫升吸附10～25mg抗体，由于吸附柱对抗体的吸附能力不高，不能一次性灌流达到清除致病抗体的目的，吸附柱必须配套CITEM10系统，这阻碍了蛋白A免疫吸附疗法在临床上的广泛应用。

发明内容

本发明提供一种高吸附性能的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。

本发明的技术方案：一种蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，所述蛋白A是带有半胱氨酸的重组蛋白A，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

所述固定在琼脂糖凝胶基质上的重组蛋白A含量为10-20mg/mL。

所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)、重组蛋白A的制备：将一个半胱氨酸残基引入蛋白A的C端或N端，得到重组蛋白A；

(2)、琼脂糖凝胶的活化：将琼脂糖凝胶与0.2M高碘酸钠溶液混合，振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，得到活化琼脂糖凝胶；

(3)、免疫吸附材料的合成：将步骤(1)的重组蛋白A溶于0.1mol/L的硼酸缓冲溶液，然后与步骤(2)的活化琼脂糖凝胶混合，第一次振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，最后再加入含1％硼氢化钠的磷酸盐缓冲溶液，第二次振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。

步骤(2)中琼脂糖凝胶与高碘酸钠溶液的重量比为1∶1-2。

步骤(2)中振摇反应温度为室温、时间2-6小时、摇速50-200rpm。

步骤(3)中重组蛋白A与活化琼脂糖凝胶的重量体积比为12-25mg/ml。

步骤(3)中活化琼脂糖凝胶、硼酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液的体积比为1∶1-2∶1-3。

步骤(3)中第一次振摇反应和第二次振摇反应的温度为室温、时间2-6小时、摇速50-200rpm。

步骤(3)中硼酸缓冲溶液PH值为9，磷酸盐缓冲溶液PH值为7.4。

一种吸附抗体的体外循环柱，体外循环柱填充所述的蛋白A免疫吸附材料。

本发明的技术效果：本发明通过基因工程的方法，将半胱氨酸引入到蛋白A的羧基末端(C端)或氨基末端(N端)，从而蛋白A带有反应活性更高的巯基(-SH)，与蛋白A本身带有的伯胺基相比，巯基反应活性更高，能够实现固定在琼脂糖凝胶基质的蛋白A含量达到10～20mg/mL载体，达到对抗体的吸附量为80mg/mL载体以上，本发明的免疫吸附材料可从体液中直接、高效、选择性吸附自身免疫性疾病有关的致病抗体，且可安全地进行体外循环，实现一次性灌流即可达到清除患者致病抗体的目的。

具体实施方式

实施例1

(1)、重组蛋白A的制备：通过人工合成的方法获得带有半胱氨酸的蛋白A的编码序列(SEQ ID NO：1)，该序列包括天然蛋白A中EDABC结构域的序列，一个编码半胱氨酸的密码子tgt，分别位于序列5’端的限制性内切酶NdeI的识别序列和3’端XhoI的识别序列。

SEQ ID NO：1

gggcatatggcgcaacacgatgaagctcaacaaaatgctttttatcaagtcttaaatatgcctaacttaaatgctgatcaacgcaatggttttatccaaagccttaaagatgatccaagccaaagtgctaacgttttaggtgaagctcaaaaacttaatgactctcaagctccaaaaGctgatgcgcaacaaaataacttcaacaaagatcaacaaagcgccttctatgaaatcttgaacatgcctaacttaaacgaagcgcaacgtaacggcttcattcaaagtcttaaagacgacccaagccaaagcactaacgttttaggtgaagctaaaaaattaaacgaatctcaagcaccgaaaGctgataacaatttcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttgaatatgcctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcttaaaagatgacccaagccaaagtgctaacctattgtcagaagctaaaaagttaaatgaatctcaagcaccgaaagcggataacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcctaaaagatgacccaagccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctcaagcaccaaaagctgacaacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaattttacatttacctaacttaactgaagaacaacgtaacggcttcatccaaagccttaaagacgatccttcggtgagcaaagaaattttagcagaagctaaaaagctaaacgatgctcaagcaccaaaatgtctcgagccc

通过NdeI和XhoI酶切和T4DNA连接酶的作用，将上述序列连接到本领域公开的大肠杆菌表达菌株pET-22b，并转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得重组蛋白A表达菌株。

将该菌株分别在三个装有6L的LB培养基的摇瓶中于37℃、200rpm振荡培养至OD600＝1.2，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mM，继续振摇6小时后，离心收集三个摇瓶的菌体(6000rpm，20分钟)共约180克。将按上述方法获得的菌体混匀于900毫升的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，超声破碎细胞(超声时间5s，间隔时间5s，超声次数99次，功率300W)后离心收集(8000rpm，20分钟)上清组分。上清液在沸水浴中加热半小时，静置，离心(8000rpm，20分钟)除去沉淀，上清液经镍离子螯合亲和层析纯化，平衡液是0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，上样后先用平衡液冲洗未结合成分，再用含咪唑浓度为250mM的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗并收集洗脱液，收集液在缓冲溶液中充分透析，透析液经0.45μm的过滤膜过滤后，冷冻干燥得到带有半胱氨酸的蛋白A约1000毫克。

(2)琼脂糖凝胶的活化：在30毫升抽干的琼脂糖凝胶中加入30毫升0.2M高碘酸钠溶液混匀，室温下在摇床中振摇(50-200rpm)反应4小时。反应完毕后，用蒸馏水充分冲洗，抽干，得到带有醛基的琼脂糖凝胶。

(3)、免疫吸附材料的合成：将450毫克步骤(1)中的蛋白A溶于30毫升0.1mol/L硼酸缓冲溶液(pH＝9)中，然后加入到30毫升步骤(2)中的活化琼脂糖凝胶中，室温下振摇(50-200rpm)反应约8小时，用水多次洗涤，抽干，加入30毫升含1％硼氢化钠的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，室温下振摇(50-200rpm)反应4小时，用蒸馏水多次洗涤干净后，抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。

实施例2

SEQ ID NO：1

(2)琼脂糖凝胶的活化：在30毫升抽干的琼脂糖凝胶中加入45毫升含有0.02％硼氢化钠的2.5mol/L氢氧化钠溶液，混匀，加入10毫升环氧氯丙烷后，在35℃下振摇(50-200rpm)反应4小时。结束反应，用大量蒸馏水冲洗至中性，过滤抽干，加入0.1mol/L的硼酸缓冲溶液(pH＝9)45mL，加入6mL乙二胺，在50℃恒温反应3小时。反应停止后，用1mol/L氯化钠溶液和蒸馏水大量冲洗，除去残留的乙二胺，得到含有氨基的活化琼脂糖凝胶。过滤抽干，加入0.1mol/L的硼酸缓冲溶液(pH＝9)45毫升，25％戊二醛水溶液6mL，在室温下振荡反应4小时。反应完毕后，用蒸馏水充分冲洗，抽干，得到带有醛基的琼脂糖凝胶。

本发明的蛋白A免疫吸附材料IgG吸附能力实验如下：

分别采集实施例一和实施例二中的吸附材料1毫升，加入健康人血浆10mL，在37℃振荡2小时进行吸附反应。将该混悬液以5000rpm的速度离心分离5分钟，以免疫比浊法测定上清液中的IgG浓度。

作为对照试验，将1毫升生理盐水代替吸附材料，与上述方法同法处理，测定溶液中的IgG浓度。

通过下式计算IgG的吸附量，结果如表1所示。

IgG吸附量＝(Cr-Ct)×10

Cr：对照试验溶液中的IgG浓度

Ct：吸附试验上清中的IgG浓度

表1

吸附材料	IgG吸附量(mg/mL)
		实施例一	82.2
实施例二	89.8

体外循环柱一次灌流的动物试验一：

将实施例二中的蛋白A免疫吸附材料25毫升，放入烧杯中用生理盐水浸泡1小时，装于一根φ26×50mm的吸附柱中，吸附剂体积为25mL，用生理盐水充分冲洗柱子。以动物实验狗(体重约为10kg)为试验对象，将狗麻醉后，建立体外循环。启动A泵，从狗的股动脉中以60ml/min的速度引出血液，经过血浆分离器分离出血浆，经B泵驱动以25ml/min的速度进入吸附柱进行IgG吸附，经过吸附柱的血浆与血细胞混合一同泵入狗的股动脉中。吸附1小时后，完成吸附试验。试验动物狗在免疫吸附后当天恢复正常生理活动，试验后一周未发现异常症状。

分别抽取试验前和试验后狗的血浆进行IgG浓度的测试，计算IgG的下降率。IgG下降率按照以下公式计算，结果如表2所示。

下降率＝(Cb-Ca)/Cb×100％

Cb为试验前狗的IgG浓度

Ca为试验后狗的IgG浓度

体外循环柱一次灌流的动物试验二：

除将上述动物试验一中的蛋白A免疫吸附材料换成实施例三中的蛋白A免疫吸附材料外，其它与动物实验一同法操作。

表2

体外循环柱	IgG下降率
		动物试验一	48.6％
动物试验二	53.8％

SEQ ID NO：1

<110>云南澳敦生物科技有限公司

<120>蛋白A免疫吸附材料及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>297

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

SEQ ID NO:1

<110>云南澳敦生物科技有限公司

<120>蛋白A免疫吸附材料及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>894

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

Ggg Cat Atg Gcg Caa Cac Gat Gaa Gct Caa Caa Aat Gct Ttt Tat 45

Caa Gtc Tta Aat Atg Cct Aac Tta Aat Gct Gat Caa Cgc Aat Ggt 90

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Ggc Ttc Att Caa Agt Ctt Aaa Gac Gac Cca Agc Caa Agc Act Aac 315

Gtt Tta Ggt Gaa Gct Aaa Aaa Tta Aac Gaa Tct Caa Gca Ccg Aaa 360

Gct Gat Aac Aat Ttc Aac Aaa Gaa Caa Caa Aat Gct Ttc Tat Gaa 405

Atc Ttg Aat Atg Cct Aac Tta Aac Gaa Gaa Caa Cgc Aat Ggt Ttc 450

Atc Caa Agc Tta Aaa Gat Gac Cca Agc Caa Agt Gct Aac Cta Ttg 495

Tca Gaa Gct Aaa Aag Tta Aat Gaa Tct Caa Gca Ccg Aaa Gcg Gat 540

Aac Aaa Ttc Aac Aaa Gaa Caa Caa Aat Gct Ttc Tat Gaa Atc Tta 585

Cat Tta Cct Aac Tta Aac Gaa Gaa Caa Cgc Aat Ggt Ttc Atc Caa 630

Agc Cta Aaa Gat Gac Cca Agc Caa Agc Gct Aac Ctt Tta Gca Gaa 675

Gct Aaa Aag Cta Aat Gat Gct Caa Gca Cca Aaa Gct Gac Aac Aaa 720

Ttc Aac Aaa Gaa Caa Caa Aat Gct Ttc Tat Gaa Att Tta Cat Tta 765

Cct Aac Tta Act Gaa Gaa Caa Cgt Aac Ggc Ttc Atc Caa Agc Ctt 810

Aaa Gac Gat Cct Tcg Gtg Agc Aaa Gaa Att Tta Gca Gaa Gct Aaa 855

Aag Cta Aac Gat Gct Caa Gca Cca Aaa Tgt Ctc Gac Ccc 894

Claims

1.一种蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)重组蛋白A的制备：将一个半胱氨酸残基引入蛋白A的C端或N端，得到重组蛋白A；

(2)琼脂糖凝胶的活化：将琼脂糖凝胶与0.2M高碘酸钠溶液混合，振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，得到活化琼脂糖凝胶；

(3)免疫吸附材料的合成：将步骤(1)的重组蛋白A溶于0.1mol/L的硼酸缓冲溶液，然后与步骤(2)的活化琼脂糖凝胶混合，第一次振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，最后再加入含1％硼氢化钠的磷酸盐缓冲溶液，第二次振摇反应，蒸馏水洗涤、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料；

步骤(2)中琼脂糖凝胶与高碘酸钠溶液的重量比为1：1-2；

步骤(2)中振摇反应温度为室温、时间2-6小时、摇速50-200rpm；

步骤(3)中重组蛋白A与活化琼脂糖凝胶的重量体积比为12-25mg/mL；

步骤(3)中活化琼脂糖凝胶、硼酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液的体积比为1：1-2：1-3；

步骤(3)中第一次振摇反应和第二次振摇反应的温度为室温、时间2-6小时、摇速50-200rpm；

步骤(3)中硼酸缓冲溶液pH值为9，磷酸盐缓冲溶液pH值为7.4；

固定在所述活化琼脂糖凝胶上的所述重组蛋白A含量为10-20mg/mL。

2.一种吸附抗体的体外循环柱，其特征在于：体外循环柱填充权利要求1所述的蛋白A免疫吸附材料。