CN109781978A - 一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用 - Google Patents
一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109781978A CN109781978A CN201910147969.4A CN201910147969A CN109781978A CN 109781978 A CN109781978 A CN 109781978A CN 201910147969 A CN201910147969 A CN 201910147969A CN 109781978 A CN109781978 A CN 109781978A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microballoon
- cys
- amino
- antibody
- subunit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法和应用,属于免疫检测技术领域,所述定向偶联抗体Fc端的高分子微球包括氨基微球和Cys‑结合亚基;所述氨基微球和Cys‑结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接;所述Cys‑结合亚基为N端连接一个半胱氨酸的蛋白质亚基。所述定向偶联抗体Fc端的高分子微球能够特异性地结合抗体的Fc端,与抗体结合时的空间位阻小,最大程度地提高抗体Fab端的利用率。有利于放大生产,批间差小。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域,尤其涉及一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法和应用。
背景技术
高分子微球已广泛应用于生物医学的各个领域,既可作为分离材料用于蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的分离,也可以应用于载体固定支持抗原、抗体和酶蛋白等物质。
胶乳增强免疫透射比浊法是以多克隆抗体或单克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析法,利用化学偶联方法将抗体与胶乳颗粒结合,即是将待测物质相对应的抗体包被在直径为60~200nm的胶乳颗粒上,当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物,使抗原抗体结合物的体积增大,光通过之后,透射光和散射光的强度变化更为显著,从而提高试验的敏感性。反应示意图如图1。利用生化分析仪进行比浊测定,整个分析过程只需几分钟,该方法与传统免疫比浊法比较其灵敏度更高。
目前经典的胶乳增强免疫透射比浊技术,是指通过:①羧基微球(指纳米微球表面含有游离羧基)与NHS或Sulfo-NHS反应形成活泼酯基团;②然后在缩合剂EDC的作用下,带有活泼酯基团的微球与抗体的氨基发生偶联,从而使抗体偶联在微球表面。
但相比化学发光免疫测定技术,经典胶乳增强免疫透射比浊技术灵敏度相对较低,无法测定浓度低于1.0ng/mL的待测物。由于医疗技术的加速发展,在对疾病的预测和诊断上也在不断研究,这也使早期和超早期指标物的准确测定尤为重要,而这些指标物往往浓度极低(<1.0ng/mL),所以经典胶乳增强免疫透射比浊技术已无法满足这些指标物的准确测定。
由于目前胶乳增强免疫透射比浊技术只是作为几种测定手段在使用,所以很少有人去深入研究,但作为最简易和通用的免疫学检测技术,值得深入研究。从经典胶乳增强免疫透射比浊技术的关键步骤分析——抗体与微球的偶联,在目前的胶乳增强免疫透射比浊技术中常用到的抗体与微球偶联的方式,是基于抗体的Fc端疏水性强,在水溶液中使抗体Fc端更易向内包裹,其氨基更容易与微球的羧基发生偶联。
抗体的结构如图2所示,正常的免疫球蛋白(特指IgG)是呈“Y”字型结构,其中包含2个功能结构域,分别是Fc端(主要是抗体重链恒定区)和Fab端(主要包含抗体重链和轻链的可变区和恒定区),而与抗原发生特异性结合的区域则是Fab端的可变区。由此可推断,抗体与抗原的结合效率与Fab端数量呈正相关。目前的偶联方式是随机的将抗体的Fc端与微球偶联,通过Fc端的疏水性无法保证有效数量的Fab端外露,这是由于Fab端和Fc端都拥有大量的氨基,如图3所示,部分抗体的Fab端上的氨基会与微球发生偶联,减少了Fab外露的数量,降低与抗原结合的效率。
所以,若能够将抗体的Fc端定向地偶联在微球表面,使Fab端能够得到最大化的外露,则在其他条件合适的情况下,抗体与抗原的结合效率会达到最大化。对于灵敏度要求很高的待测抗原,可能能够通过这种方法提高抗原与抗体的结合效率,提高灵敏度。
理想的抗体微球复合物,是完全将抗体的Fab端呈现在微球表面,在尽量小空间位阻下以获得最大程度地结合目的抗原。以上表面功能化的微球虽然可以和抗体共价结合,但却不能得到理想的抗体微球复合物,这是由于羧基、羟基、氨基、乙烯基、偶氮基等功能团能够和抗体任意相应的结合部位发生共价结合,所以导致抗体在微球表面杂乱无序,不能有效地结合目的抗原,抗原抗体微球聚集颗粒不能有效形成或形成较少,从而浊度变化较小,灵敏度低。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法和应用;所述定向偶联抗体Fc端的高分子微球能够特异性地结合抗体的Fc端,提高抗体Fab端的利用率。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球,包括氨基微球和Cys-结合亚基;所述氨基微球和Cys-结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接;所述Cys-结合亚基为N端连接一个半胱氨酸的蛋白质亚基。
优选的,所述氨基微球为具有氨基功能团的聚苯乙烯微球。
优选的,所述双功能偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯SMCC、或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸盐]LC-SMCC、[ε-马来酰亚胺己酰氧]琥珀酰亚胺酯EMCS、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯GMBS和m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-N-羟基琥珀酰亚胺酯MBS中的一种。
优选的,所述蛋白质亚基中无游离巯基。
本发明提供了所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球的制备方法,包括以下步骤:
1)将氨基微球与双功能偶联剂混合,进行氨基微球表面的活化,获得表面连接有马来酰亚胺基团的微球;
2)将三(2-羧乙基)膦溶液与Cys-结合亚基的PBS溶液混合,对Cys-结合亚基进行还原,获得有一个游离巯基的Cys-结合亚基;
3)将步骤1)中的表面连接有马来酰亚胺基团的微球与步骤2)中的有一个游离巯基的Cys-结合亚基混合,23~28℃偶联25~35min;获得偶联微球;
所述步骤1)和2)之间无时间顺序限定。
优选的,所述氨基微球与双功能偶联剂的比例以氨基微球上氨基的数量和双功能偶联剂上马来酰亚胺基团的数量比例计,为1:(3~8)。
优选的,步骤1)中所述氨基微球表面的活化的温度为23~28℃;所述氨基微球表面的活化的时间为25~35min。
优选的,步骤2)中所述三(2-羧乙基)膦溶液的浓度为0.8~1.2mmol/L,所述Cys-结合亚基的PBS溶液中Cys-结合亚基的浓度为8~12mg/mL。
优选的,步骤3)所述偶联后还包括用半胱氨酸对所述偶联微球进行封闭。
本发明提供了所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球在免疫检测中的应用。
本发明的有益效果:本发明提供的定向偶联抗体Fc端的高分子微球,包括氨基微球和Cys-结合亚基;所述氨基微球和Cys-结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接;所述Cys-结合亚基为N端为半胱氨酸蛋白质亚基;由于Cys-结合亚基的引入,使所述微球能够特异性地结合抗体的Fc端,而不结合抗体的Fab端,并且Cys-结合亚基提供了具有一定支撑作用的间隔臂,减少了微球与抗体结合时的空间位阻,最大程度地提高抗体Fab端的利用率。同时,本发明提供的所述定向偶联抗体Fc端的高分子微球是一种通用的定向偶联抗体的微球,使抗体能够更有效地定向固定在微球表面,并使抗体的Fab端呈现在微球表面,更加有利于放大生产,减少批间差。
附图说明
图1为胶乳增强免疫透射比浊反应原理图;
图2为抗体结构图;
图3为抗体偶联微球的位置的随机性示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球,包括氨基微球和Cys-结合亚基;所述氨基微球和Cys-结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接;所述Cys-结合亚基为N端为半胱氨酸蛋白质亚基。
在本发明中,所述氨基微球优选为具有氨基功能团的聚苯乙烯微球;本发明对所述的氨基微球的来源没有特殊限定,采用本领域常规市售氨基微球即可,在本发明具体实施过程中,所述氨基微球优选的购自东莞市汉诺生物技术有限公司。
在本发明中,所述Cys-结合亚基为N端连接一个半胱氨酸的蛋白质亚基,所述所述Cys-结合亚基有一个游离巯基,所述一个游离巯基即为N端半胱氨酸上的巯基;所述蛋白质亚基优选的无游离的巯基;本发明对所述蛋白质亚基的种类无其他特殊要求,任意一种不含游离巯基的蛋白质亚基均可;所述Cys-结合亚基优选的通过基因工程的方法制备获得,具体的可以在编码所述蛋白质亚基的基因序列的N端计引入一个半胱氨酸密码子后进行表达获得。在本发明具体实施过程中,所述Cys-结合亚基优选为Cys-B亚基;所述Cys-B亚基为在金黄色葡萄球菌的蛋白A基因序列(Genebank:AAA26677)中的B亚基基因序列的N端设计引入一个半胱氨酸密码子后的序列表达的亚基。
本发明中所述氨基微球和Cys-结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接。在本发明中,所述氨基微球的氨基与双功能偶联剂的马来酰亚胺基团进行连接;所述Cys-结合亚基的巯基与马来酰亚胺基团发生1,4-加成反应,使Cys-结合亚基与表面含马来酰亚胺功能团的微球特异性结合。本发明中所述双功能偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯SMCC、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸盐]LC-SMCC、[ε-马来酰亚胺己酰氧]琥珀酰亚胺酯EMCS、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯GMBS和m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-N-羟基琥珀酰亚胺酯MBS中的一种。所述双功能偶联剂也可以是其他包括马来酰亚胺基团的双功能偶联剂。
本发明中,所述定向偶联抗体Fc端的高分子微球中引入的Cys-结合亚基能够特异性地结合抗体的Fc端,并且提供了具有一定支撑作用的间隔臂,减少了微球与抗体结合时的空间位阻,能够最大程度地提高抗体Fab端的利用率。
本发明提供了所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球的制备方法,包括以下步骤:1)将氨基微球与双功能偶联剂混合,进行氨基微球表面的活化,获得表面连接有马来酰亚胺基团的微球;2)将三(2-羧乙基)膦溶液与Cys-结合亚基的PBS溶液混合,对Cys-结合亚基的进行还原,获得有一个游离巯基的Cys-结合亚基;3)将步骤1)中的表面连接有马来酰亚胺基团的微球与步骤2)中的有一个游离巯基的Cys-结合亚基混合,23~28℃偶联25~35min;获得偶联微球;所述步骤1)和2)之间无时间顺序限定。
本发明中,将氨基微球与双功能偶联剂混合,进行氨基微球表面的活化,获得表面连接有马来酰亚胺基团的微球。本发明中,所述氨基微球的质量浓度优选为1~5%,所述氨基微球在使用前优选的进行稀释;所述稀释用溶液优选为去离子水,所述稀释的倍数优选为0.5~2倍。本发明中,所述双功能偶联剂的浓度优选为3.5~4.0mg/mL,更优选为3.7mg/mL;所述双功能偶联剂的溶剂优选为DMSO或DMF。在本发明具体实施过程中,优选的用为DMSO或DMF将所述双功能偶联剂溶解至浓度3.5~4.0mg/mL。在本发明中,所述氨基微球与双功能偶联剂的比例以氨基微球上氨基的数量和双功能偶联剂上马来酰亚胺基团的数量比例计,优选为1:(3~8),更优选为1:5。本发明中,所述氨基微球表面的活化的温度优选为23~28℃,更优选为25℃;所述氨基微球表面的活化的时间优选为25~35min,更优选为30min。本发明在所述氨基微球表面的活化后优选的还包括去除未偶联的双功能偶联剂;所述去除未偶联的双功能偶联剂的方法优选为柱层析;在本发明具体实施过程中,所述柱层析用柱优选为Histrap Desalting G25层析柱;所述洗脱液优选为PBS缓冲液,所述洗脱的流速优选为18~22mL/min,更优选为20mL/min。
本发明将三(2-羧乙基)膦TCEP溶液与Cys-结合亚基的PBS溶液混合,对Cys-结合亚基的进行还原,获得有有一个游离巯基的Cys-结合亚基。本发明中,所述三(2-羧乙基)膦溶液的浓度优选为0.8~1.2mmoL/L,更优选为1.0mmoL/L,所述Cys-结合亚基的PBS溶液中Cys-结合亚基的浓度优选为8~12mg/mL,更优选为10mg/mL。本发明中,所述还原反应的温度优选为22~28℃,更优选为25℃,所述还原反应的时间优选为20~40min,更优选为30min。
本发明将表面连接有马来酰亚胺基团的微球与有一个游离巯基的Cys-结合亚基混合,23~28℃偶联25~35min;获得偶联微球。在本发明中,所述表面连接有马来酰亚胺基团的微球与有一个游离巯基的Cys-结合亚基的混合比例优选为1:(3~8),更优选为1:5。所述偶联的温度优选为25℃,所述偶联的时间优选为30min。在本发明所述偶联结束后,优选的将所述偶联反应料液进行分离,去除未偶联的Cys-结合亚基和三(2-羧乙基)膦。在本发明中,所述分离优选的通过柱层析法的方法进行,所述柱层析用柱优选为HistrapSuperdex200层析柱;所述洗脱液优选为PBS缓冲液,所述洗脱液的pH值优选为6.5~8.0;所述洗脱的流速优选为18~22mL/min,更优选为20mL/min。本发明在所述分离过程中,收集乳白色洗脱液;所述乳白色洗脱液中包括偶联Cys-结合亚基微球和未偶联微球。
本发明在获得所述偶联微球后,优选的还包括用半胱氨酸对所述偶联微球进行封闭。本发明中,优选的还加入三(2-羧乙基)膦,使半胱氨酸能与未发生偶联的微球表面的马来酰亚胺基团结合,使微球表面封闭,不能与其他含有巯基(-SH)的分子发生反应。所述半胱氨酸相对于偶联微球过量。在本发明具体实施过程中,优选的向所述偶联微球中加入半胱氨酸至半胱氨酸的中浓度为0.8~1.2mmoL/L,更优选为1.0mmoL/L。本发明在所述封闭后,优选的进行分离,除去多余的半胱氨酸和TCEP。在本发明中,所述分离优选的通过柱层析法的方法进行,所述柱层析用柱优选为Histrap Superdex200层析柱;所述洗脱液优选为PBS缓冲液,所述洗脱液的pH值优选为6.5~8.0;所述洗脱的流速优选为18~22mL/min,更优选为20mL/min。本发明在所述分离过程中,收集乳白色洗脱液;所述乳白色洗脱液中包括偶联Cys-结合亚基微球和封闭后的未偶联微球。
本发明提供了所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球在免疫检测中的应用。本发明提供定向偶联抗体Fc端的高分子微球时一种通用的定向偶联抗体的微球,使抗体能够更有效地定向固定在微球表面,并使抗体的Fab端呈现在微球表面,更加有利于放大生产,减少批间差。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.氨基微球表面进行马来酰亚胺基团功能化
取0.5mL浓度为5%的氨基微球(购自东莞市汉诺生物技术有限公司),加入去离子水0.5mL稀释2倍。称取3.7mg SMCC(购自赛默飞世尔科技),并用1mL DMSO进行溶解,使SMCC溶液浓度为3.7mg/mL。取100μL3.7mg/mL SMCC溶液加入1mL的氨基微球悬液中(SMCC过量于氨基),充分混匀后置于25℃条件下反应30min。反应结束后,使用Histrap Desalting G25层析柱按20mL/min的洗脱速度进行脱盐除去未偶联的SMCC,洗脱液为PBS,当洗脱液中出现乳白色时开始收集直至乳白色消失,共收集表面马来酰亚胺基团功能化的活化微球悬液2.5mL备用。
2.蛋白A的B亚基基因改造合成
选取金黄色葡萄球菌的蛋白A基因序列(Genebank:AAA26677)中的B亚基基因序列,委托华大基因在B亚基基因序列的N端设计引入一个半胱氨酸密码子,并完成基因合成,获得N端含一个半胱氨酸的B亚基基因。并委托华大基因对该改造后的基因进行蛋白表达及纯化,获得氨基端含一个半胱氨酸的B亚基蛋白,简称为Cys-B亚基。
3.将Cys-B亚基偶联至表面马来酰亚胺基团功能化的活化微球
称取Cys-B亚基蛋白2mg,溶于1mL PBS溶液中,使Cys-B亚基蛋白溶液浓度为2mg/mL,并在该溶液中加入10μL 1mM的TCEP溶液,置于2~8℃条件下备用。取上述备用的表面马来酰亚胺基团功能化的活化微球2.5mL,加入经TCEP还原处理的1mL 2mg/mL的Cys-B亚基蛋白溶液中,并加入50μL 1mM的TCEP溶液,充分混匀,置于25℃条件下反应30min。反应结束后,使用Histrap Superdex200层析柱按20mL/min的洗脱速度进行分离,除去未偶联的Cys-B亚基蛋白和TCEP,洗脱液为PBS,当洗脱液中出现乳白色时开始收集直至乳白色消失,共收集微球悬液10mL,该悬液中包含已偶联Cys-B亚基的微球和未偶联的微球。
4.对未发生偶联的微球进行封闭
取上述微球悬液10mL,向当中加入500μL 10mM的半胱氨酸溶液,并加入50μL 1mM的TCEP溶液,充分混匀,置于25℃条件下反应30min。使半胱氨酸能与未发生偶联的微球表面的马来酰亚胺基团结合,使其封闭不能与其他含有巯基(-SH)的分子发生反应。反应结束后,使用Histrap Superdex200层析柱按20mL/min的洗脱速度进行分离,除去多余的半胱氨酸和TCEP,洗脱液为PBS,当洗脱液中出现乳白色时开始收集直至乳白色消失,共收集微球悬液12mL,该悬液中包含已偶联Cys-B亚基的微球和封闭后未偶联的微球。
实施例2
5.验证偶联Cys-B亚基的微球与IgG抗体的结合能力
取上述微球悬液和原始氨基微球(使用原始氨基微球作为空白对照,其对IgG在不含偶联剂的情况下,不会发生化学偶联,并且在短时间内不会发生物理吸附)各1mL,同时加入1mL 2mg/mL的兔抗鼠IgG抗体溶液,充分混合,置于25℃反应30min。反应结束后,取上述反应液各自离心10min,转速12000rpm,离心后分别取上清标记S1(代表与上述微球悬液的反应液)和S2(代表与原始氨基微球的反应液),使用BCA法进行蛋白浓度测定,结果显示S1中蛋白浓度为0.3mg/mL,S2中蛋白浓度为0.97mg/mL。结果显示偶联Cys-B亚基的微球已具备结合IgG抗体Fc端的能力,完成表面含有Cys-结合亚基的功能化微球的制备。
6.与传统偶联方法比较抗体结合效率
取实施例1步骤4中偶联Cys-B亚基的微球悬液1mL,加入1mL 2mg/mL的兔抗鼠降钙素原(PCT)IgG抗体溶液,充分混合,置于25℃反应30min。反应结束后,取反应液离心10min,转速12000rpm,离心后取上清液标记S3。
取10%的羧基聚苯乙烯微球0.5mL,加入250μL 2mg/mL的NHS溶液和250μL 20mg/mL的EDC活化缓冲液,充分混合,置于2~8℃反应30min,再向其中加入1mL 2mg/mL的兔抗鼠PCT IgG抗体溶液,充分混合,置于25℃反应4h。反应结束后,取反应液离心10min,转速12000rpm,离心后取上清液标记S4。
使用BCA法对S3和S4进行蛋白浓度测定,结果显示S3中蛋白浓度为0.28mg/mL,S4中蛋白浓度为0.64mg/mL。结果显示偶联Cys-B亚基的微球比传统的羧基微球对抗体的结合效率更高。
7.在同等抗体浓度条件下比较抗原结合效率
取步骤6中离心后的沉淀分别用PBS进行漂洗,然后离心10min,转速12000rpm,反复三次,去除未偶联的兔抗鼠PCT IgG分子,收集沉淀,分别为偶联兔抗鼠PCT IgG的Cys-B亚基微球和偶联兔抗鼠PCT IgG的羧基微球。按步骤6中两种偶联微球剩余未结合的IgG浓度进行换算,偶联兔抗鼠PCT IgG的Cys-B亚基微球上的IgG浓度是偶联兔抗鼠PCT IgG的羧基微球上的IgG的2倍。
取2mLPBS溶液重悬偶联兔抗鼠PCT IgG的Cys-B亚基微球,并取出1mL悬液,向1mL悬液中加入1mL 2mg/mL的PCT抗原溶液,置于37℃反应5min。反应结束后,取反应液离心10min,转速12000rpm,离心后取上清液标记S5。
取1mLPBS溶液重悬偶联兔抗鼠PCT IgG的羧基微球,向其中加入1mL2mg/mL的PCT抗原溶液,置于37℃反应5min。反应结束后,取反应液离心10min,转速12000rpm,离心后取上清液标记S6。
使用BCA法对S5和S6进行蛋白浓度测定,结果显示S5中蛋白浓度为0.68mg/mL,S6中蛋白浓度为0.82mg/mL。结果显示偶联兔抗鼠PCT IgG的Cys-B亚基微球比偶联兔抗鼠PCTIgG的羧基微球结合PCT抗原的效率更高,说明在同等IgG浓度条件下,由于Cys-B亚基微球的间隔臂更长,减少了空间位阻,以及IgG的Fc端定向结合于Cys-B亚基,使IgG的Fab端能够最大效率地结合抗原分子,然而传统的偶联微球因间隔臂较短,且IgG的Fc是随机偶联于微球表面,则空间位阻较大,且不能有效与抗原结合。
8.降钙素原检测试剂配制以及临床比对分析
按双试剂形式配制降钙素原检测试剂,其中试剂1(R1)为缓冲液成分,试剂2(R2)包含偶联PCT IgG的Cys-B亚基微球等成分。按下述配方进行配制:
表1 R1的配方
表2 R2配方
表3检测结果对比
结果显示,上述PCT检测试剂与罗氏电化学发光检测临床样本比对结果偏差较小,相关性更高,R=0.9976,而市售PCT检测试剂在检测小于5ng/mL的样本时,由于灵敏度不够,导致不能有效测出。
由上述实施例可知,本发明提供的定向偶联抗体Fc端的高分子微球,能够特异性地结合抗体的Fc端,最大程度地提高抗体Fab端的利用率。同时,使抗体能够更有效地定向固定在微球表面,并使抗体的Fab端呈现在微球表面,更加有利于放大生产,减少批间差。与罗氏电化学发光检测临床样本比对结果偏差较小,相关性更高,R=0.9976;效果优于市售的PCT检测试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球,其特征在于,包括氨基微球和Cys-结合亚基;所述氨基微球和Cys-结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接;所述Cys-结合亚基为N端连接一个半胱氨酸的蛋白质亚基。
2.根据权利要求1所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球,其特征在于,所述氨基微球为具有氨基功能团的聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求1所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球,其特征在于,所述双功能偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯SMCC、或4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸盐]LC-SMCC、[ε-马来酰亚胺]己酰氧琥珀酰亚胺酯EMCS、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯GMBS和m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-N-羟基琥珀酰亚胺酯MBS中的一种。
4.根据权利要求1所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球,其特征在于,所述蛋白质亚基中无游离巯基。
5.权利要求1~4任意一项所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球的制备方法,包括以下步骤:
1)将氨基微球与双功能偶联剂混合,进行氨基微球表面的活化,获得表面连接有马来酰亚胺基团的微球;
2)将三(2-羧乙基)膦溶液与Cys-结合亚基的PBS溶液混合,对Cys-结合亚基进行还原,获得有一个游离巯基的Cys-结合亚基;
3)将步骤1)中的表面连接有马来酰亚胺基团的微球与步骤2)中的有一个游离巯基的Cys-结合亚基混合,23~28℃偶联25~35min;获得偶联微球;
所述步骤1)和2)之间无时间顺序限定。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述氨基微球与双功能偶联剂的比例以氨基微球上氨基的数量和双功能偶联剂上马来酰亚胺基团的数量比例计,为1:(3~8)。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述氨基微球表面的活化的温度为23~28℃;所述氨基微球表面的活化的时间为25~35min。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤2)中所述三(2-羧乙基)膦溶液的浓度为0.8~1.2mmol/L,所述Cys-结合亚基的PBS溶液中Cys-结合亚基的浓度为8~12mg/mL。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤3)所述偶联后还包括用半胱氨酸对所述偶联微球进行封闭。
10.权利要求1~4任意一项所述的定向偶联抗体Fc端的高分子微球或权利要求5~9任意一项所述的制备方法制备获得的定向偶联抗体Fc端的高分子微球在免疫检测中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910147969.4A CN109781978A (zh) | 2019-02-28 | 2019-02-28 | 一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910147969.4A CN109781978A (zh) | 2019-02-28 | 2019-02-28 | 一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109781978A true CN109781978A (zh) | 2019-05-21 |
Family
ID=66487483
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910147969.4A Pending CN109781978A (zh) | 2019-02-28 | 2019-02-28 | 一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109781978A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110196323A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-09-03 | 扬州大学 | 一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用 |
CN112326953A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-02-05 | 广东海洋大学深圳研究院 | 抗体定向标记多聚生物素的方法 |
CN112495319A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-03-16 | 海丰生物科技(北京)有限公司 | 一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用 |
CN112557666A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-26 | 湖南博奥瑞康生物科技有限公司 | 一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102614843A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-08-01 | 云南澳敦生物科技有限公司 | 蛋白a免疫吸附材料及其制备方法 |
CN104049079A (zh) * | 2013-03-14 | 2014-09-17 | 苏州德沃生物技术有限公司 | 一种定向自标记免疫纳米微球的制备方法及其应用 |
CN106501505A (zh) * | 2016-10-03 | 2017-03-15 | 王贤俊 | 一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法 |
CN106932567A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-07-07 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种重组蛋白a介导的免疫靶向纳米金的制备方法 |
-
2019
- 2019-02-28 CN CN201910147969.4A patent/CN109781978A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102614843A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-08-01 | 云南澳敦生物科技有限公司 | 蛋白a免疫吸附材料及其制备方法 |
CN104049079A (zh) * | 2013-03-14 | 2014-09-17 | 苏州德沃生物技术有限公司 | 一种定向自标记免疫纳米微球的制备方法及其应用 |
CN106501505A (zh) * | 2016-10-03 | 2017-03-15 | 王贤俊 | 一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法 |
CN106932567A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-07-07 | 天津市泌尿外科研究所 | 一种重组蛋白a介导的免疫靶向纳米金的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
冯燕: "SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)医药卫生科技辑》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110196323A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-09-03 | 扬州大学 | 一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用 |
CN112495319A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-03-16 | 海丰生物科技(北京)有限公司 | 一种环瓜氨酸肽双微球偶联物及其制备方法与应用 |
CN112326953A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-02-05 | 广东海洋大学深圳研究院 | 抗体定向标记多聚生物素的方法 |
CN112557666A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-26 | 湖南博奥瑞康生物科技有限公司 | 一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒 |
CN112557666B (zh) * | 2020-11-16 | 2023-08-01 | 湖南博奥瑞康生物科技有限公司 | 一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109781978A (zh) | 一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用 | |
Stevenson | Immuno-affinity solid-phase extraction | |
CN101616691B (zh) | 多聚体缀合物 | |
WO2013065314A1 (ja) | 蛍光標識抗体可変領域含有ポリペプチド複合体を用いた蛍光免疫測定方法 | |
CN101775074B (zh) | 重金属Cu2+完全抗原及其制备方法 | |
JP2021504711A (ja) | 標的による干渉が抑制された抗薬物抗体アッセイ | |
CN103940816A (zh) | 一种测定人体中甘胆酸含量的试剂盒及制备方法 | |
CN102854314B (zh) | 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒 | |
CN105988000A (zh) | 一种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方法 | |
CN110702926A (zh) | 一种胃泌素g17检测试剂盒及其制备方法 | |
JP2019507890A5 (zh) | ||
CN110240704A (zh) | 基于磁性分子印迹技术的靶向酶固定化载体的制备方法及应用 | |
Turan et al. | A fluoroimmunodiagnostic nanoplatform for thyroglobulin detection based on fluorescence quenching signal | |
Zhou et al. | Ultrasensitive paper sensor for simultaneous detection of alpha-amanitin and beta-amanitin by the production of monoclonal antibodies | |
CN104977401A (zh) | 一种过敏原阳性血清的纯化制备方法 | |
JPS59202064A (ja) | 抗原決定基具有物質を測定する方法 | |
JPWO2018194152A1 (ja) | アルドステロン及びレニンの検出方法 | |
CN105988001A (zh) | 一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法 | |
CN104198692B (zh) | 一种混合标记物质和标记方法及其应用 | |
CN104833797A (zh) | 检测双特异性抗体msbody的elisa方法及应用 | |
CN101809166A (zh) | 用于快速竞争性同质性分析的装置、组合物和方法 | |
CN104311654A (zh) | 一种cide3多肽及其抗体的制备和应用 | |
JP4544437B2 (ja) | 精製血清アルブミン及び免疫学的測定方法 | |
CN101738480B (zh) | 用于核糖体失活蛋白检测的纳米颗粒探针及其制法和用途 | |
US10703805B2 (en) | Molecular imprinting of West Nile antibodies with physiological pH matching |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |