CN101775074B - 重金属Cu2+完全抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重金属Cu2+完全抗原及其制备方法，将Cu2+与双功能螯合剂反应形成半抗原，Cu2+-螯合剂半抗原再与载体蛋白反应形成Cu2+-螯合剂-载体蛋白完全抗原。本发明所得抗原具有较好的免疫原性，用此抗原免疫小鼠能制备Cu2+特异性单克隆抗体，可以进一步制各重金属Cu2+快速检测ELISA试剂盒及胶体金免疫层析试纸。
Description
技术领域：
本发明公开一种重金属Cu2+完全抗原及其制备方法，属于免疫学方法检测技术领域。
背景技术：
目前已知有20多种重金属具有较大的毒性，其中铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)、铬、钴、镍、锡、钒等在农畜等产品中有不同程度的残留，对人类健康构成严重威胁。因此，世界各国都十分重视环境和农产品重金属污染的控制和监测。传统的重金属检测方法如：原子吸收光谱分析、电感耦合等离子发射光谱分析等需要大型的昂贵的分析仪器，无法用于现场检测，难以适应环境及农畜产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。免疫学检测技术检测速度快、费用低、仪器简单易携、可用于现场检验，对提高我国环境和农产品重金属控制和监测水平、保障农产品质量安全和消费者的健康具有重要意义。
重金属免疫学检测方法建立的关键在于重金属特异性单克隆抗体的制备，而重金属特异性单克隆抗体的制备的关键在于重金属完全抗原的制备。重金属离子的分子量小(分子量＜1000)，自身不能作为有效的抗体识别目标，不能产生免疫反应。由于Cu2+的分子量约为64，分子量＜1000，并且Cu2+的螯合物在机体内很容易被分解代谢，不能作为有效的抗体识别目标，不能刺激机体产生免疫反应。因此，Cu2+的完全抗原、Cu2+特异性单克隆抗体及以此为基础的Cu2+免疫学检测方法尚未有报道。
发明内容：
本发明提供了一种重金属Cu2+完全抗原，可用于制备重金属Cu2+残留快速检测ELISA试剂盒、胶体金免疫层析试纸及传感器。
本发明还公开了上述抗原的制备方法，整个制备过程无需特别的仪器设备、技术简便可行、容易工厂化规模生产。
本发明的重金属Cu2+完全抗原，具有以下表证：
分子量70000～80000dal，紫外吸收峰值240nm～280nm，Cu2+含量达4.0μg/mL～20.0μg/mL，电泳结果图见图1，紫外扫描结果见图2，Cu2+含量检测结果见表1。
本发明重金属Cu2+完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
取0.5～10mg水溶性铜盐溶于50μL超纯水，配制2.0～80mg/mL的Cu2+溶液；取0.8～20mg双功能螯合剂溶于50μL二甲基亚砜，配制16～400mg/mL的ITCBE或p-SCN-Bn-DOTA溶液；取2.0～20.0mg载体蛋白溶于1mL HEPES缓冲溶液或碳酸盐缓冲液，配制2～20mg/mL的载体蛋白溶液；将配制的50μL 2.0～80mg/mL的Cu2+溶液逐滴加入到50μL ITCBE或p-SCN-Bn-DOTA溶液中，于15～55℃、pH4.5～6.5、振荡条件下反应15min～3h形成半抗原溶液；再将此半抗原溶液逐滴加入到1mL 2～20mg/mL的载体蛋白溶液中，于4℃或室温、pH7.5～10.5条件下振荡反应24h；用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，得Cu2+的完全抗原。
所述的水溶性铜盐包括Cu(NO3)2或CuCl2、CuSO4、Cu(CH3COO)2、CuBr2任意一种。
所述的双功能螯合剂为：
1-(4-isothiocyanobenzyl)ethylenediamine N，N，N′，N′-tetraacetic acid(ITCBE)或
S-2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane tetraacetic acid(p-SCN-Bn-DOTA)。
所述的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白或卵清蛋白中的任意一种。
所述的反应溶液中载体蛋白与ITCBE与Cu2+的质量比为：(20～32)∶(4～12)∶1；反应溶液中载体蛋白与p-SCN-Bn-DOTA与Cu2+的质量比为：(8～12)∶(8～12)∶1。
所述的溶解载体蛋白的缓冲溶液为HEPES缓冲液，浓度为30～100mM、pH为7.5～10.5；或碳酸盐缓冲液，pH为9.0～10.5。
所述制备方法中，用于溶解、保存完全抗原的缓冲液为HEPES缓冲溶液，浓度为30～100mM、pH为6.5～8.0；或柠檬酸铵缓冲液，浓度为10～30mM、pH为6.5～8.0。
所述制备方法中，采用超滤方法去除未反应的低分子物质时，选用截留分子量为10000～30000dal的超滤离心管，6000rpm～8000rpm超滤6次，每次5～30min。
对本发明制得的完全抗原进行如下检测：
1、完全抗原的SDS-PAGE电泳检测：
SDS-PAGE电泳结果表明，载体蛋白的迁移速度比螯合剂-载体蛋白复合物快、螯合剂-载体蛋白复合物的迁移速度比金属离子-螯合剂-载体蛋白复合物快，表明金属离子-螯合剂-载体蛋白复合物完全抗原的分子量大于螯合剂-载体蛋白复合物、螯合剂-载体蛋白复合物的分子量大于载体蛋白。根据此结果可以初步鉴定完全抗原的合成成功。以Cu-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA为例，检测结果见图1。
2、完全抗原的紫外分光光度法检测：
对完全抗原进行200～800nm全波长扫描，结果表明完全抗原的紫外吸收峰相比载体蛋白发生漂移，峰值与载体蛋白相比发生改变，据此进一步证实完全抗原的合成成功。以Cu-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA为例，检测结果见图2。
3、完全抗原的Cu2+含量测量：
石墨炉原子吸收分光光度法检测完全抗原中的Cu2+含量，结果表明完全抗原中Cu2+含量达4.0μg/mL～20.0μg/mL，此结果进一步表明完全抗原的合成成功。以Cu-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA为例，检测结果见表1。
表1完全抗原Cu-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA中Cu2+含量检测结果
4、完全抗原的免疫原性检测：
将制备的完全抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠检测完全抗原的免疫原性。首次免疫取50～200μg完全抗原与等量完全弗氏佐剂混合，于漩涡混匀器混合均匀，颈部皮下多点或腹腔注射免疫小鼠。自第2次免疫始，每次免疫取50～200μg完全抗原与等量不完全弗氏佐剂混合，于漩涡混匀器混合均匀，颈部皮下多点或腹腔注射免疫小鼠。每次免疫间隔2～3周。自第3次免疫始每次免疫后10d尾静脉采血检测小鼠血清抗体效价。用含Cu2+检测抗原(Cu2+-螯合剂-载体蛋白)与无Cu2+检测抗原(螯合剂-载体蛋白)(二者的载体蛋白与免疫小鼠所用抗原的载体蛋白不同)同时包被酶标板，以间接ELISA法检测小鼠血清效价，结果显示小鼠血清效价可达1∶4000～1∶128000。并且，间接ELISA检测血清效价时，含Cu2+检测抗原(Cu2+-螯合剂-载体蛋白)的OD值远大于无Cu2+检测抗原(螯合剂-载体蛋白)，说明该发明制备的抗原具有较好的免疫原性。取血清效价高、且ELISA检测血清效价时含Cu2+检测抗原(Cu2+-螯合剂-载体蛋白)的OD值与无Cu2+检测抗原(螯合剂-载体蛋白)的OD值差异最大的小鼠的脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。融合后14d，以间接ELISA检测杂交瘤细胞上清效价，筛选阳性杂交瘤细胞株，对选出的阳性杂交瘤细胞株进行克隆化，直至克隆细胞阳性率达100％，在24孔、6孔细胞培养板和细胞培养瓶中扩大培养。通过体内诱生法制备出Cu2+特异性单克隆抗体。制备出的单克隆抗体可以用于制备重金属Cu2+快速检测ELISA试剂盒及胶体金免疫层析试纸。
本发明的积极效果在于：解决了重金属Cu2+完全抗原制备的技术难点，为重金属Cu2+快速检测试剂盒及胶体金免疫层析试纸的研制奠定了基础。用于制备的Cu2+完全抗原免疫动物可以制备重金属Cu2+特异性单克隆抗体，进而利用特异性单克隆抗体可以研制重金属Cu2+快速检测试剂盒、胶体金免疫层析试纸或传感器。可以为进出口检验检疫部门、食品卫生部门、水产养殖检测部门、环保部门等部门提供新的方便、实用、简易、快速检测工具。具有良好的经济价值、社会效益和广阔的市场前景。
附图说明：
图1为电泳结果图；其中：1：Cu-p-SCN-Bn-DOTA-BSA，2：p-SCN-Bn-DOTA-BSA，3：BSA。
图2Cu-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA、BSA的紫外光谱检测结果图。
具体实施方式：
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。
一、所用可溶性铜盐为Cu(NO3)2：
实施例1：
称取2mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例2：
称取1mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例3：
称取2mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例4：
称取1mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例5：
称取4mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例6：
称取2mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例7：
称取4mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例8：
称取2mg Cu(NO3)2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(NO3)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
二、所用可溶性铜盐为CuCl2：
实施例9：
称取1.6mg CuCl2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例10：
称取0.8mg CuCl2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例11：
称取1.6mg CuCl2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例12：
称取0.8mg CuCl2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例13：
称取3.2mg CuCl2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例14：
称取1.6mg CuCl2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例15：
称取3.2mg CuCl2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例16：
称取1.6mg CuCl2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuCl2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
三、所用可溶性铜盐为CuS04：
实施例17：
称取2.2mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mMHEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例18：
称取1.2mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mMHEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例19：
称取2.2mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，4mgITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例20：
称取1.2mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例21：
称取4.4mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例22：
称取2.2mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例23：
称取4.4mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例24：
称取2.2mg CuSO4·5H2O溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuSO4·5H2O溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
四、所用可溶性铜盐为Cu(CH3COO)2：
实施例25：
称取1.8mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM
HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例26：
称取0.9mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mMHEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例27：
称取1.8mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例28：
称取0.9mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例29：
称取3.4mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例30：
称取1.8mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例31：
称取3.4mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例32：
称取1.8mg Cu(CH3COO)2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将Cu(CH3COO)2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
五、所用可溶性铜盐为CuBr2：
实施例33：
称取1.9mg CuBr2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例34：
称取0.95mg CuBr2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲溶液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例35：
称取1.9mg CuBr2溶于50μL超纯水，4mg ITCBE溶于50μL DMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例36：
称取0.95mg CuBr2溶于50μL超纯水，2mg ITCBE溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到ITCBE溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-ITCBE半抗原。将Cu-ITCBE溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例37：
称取3.7mg CuBr2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例38：
称取1.85mg CuBr2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μL DMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 100mM HEPES缓冲液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以100mM HEPES缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以100mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例39：
称取3.7mg CuBr2溶于50μL超纯水，10mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，20mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
实施例40：
称取1.85mg CuBr2溶于50μL超纯水，5mg p-SCN-Bn-DOTA溶于50μLDMSO，10mg载体蛋白KLH或BSA、OVA溶于1mL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。将CuBr2溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不断搅拌下反应3h，形成Cu-p-SCN-Bn-DOTA半抗原。将Cu-p-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0.5mL载体蛋白溶液中，室温、振荡反应24h。将抗原转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500rpm离心10min，以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)洗涤6次，再将抗原以15mM柠檬酸铵缓冲液(pH7.5)稀释、分装，得Cu2+完全抗原，于-20℃保存。
Claims (1)
1.一种重金属Cu2+完全抗原的制备方法，包括以下步骤：取0.5~10 mg水溶性铜盐溶于50 μL超纯水，配制2.0~80 mg/mL的Cu2+溶液；取0.8~20 mg双功能螯合剂溶于50 μL二甲基亚砜，配制16~400 mg/mL的ITCBE或p-SCN-Bn-DOTA溶液；取2.0~20.0 mg载体蛋白溶于1 mL HEPES缓冲溶液或碳酸盐缓冲液，配制2~20 mg/mL的载体蛋白溶液；将配制的50 μL 2.0~80 mg/mL的Cu2+溶液逐滴加入到50 μL ITCBE或p-SCN-Bn-DOTA溶液中，于45~55 ℃、pH5.0~6.5振荡条件下反应15 min~3 h形成半抗原溶液；再将此半抗原溶液逐滴加入到1 mL 2~20 mg/mL的载体蛋白溶液中，于4℃或室温、pH9.0~10.5条件下振荡反应24 h；用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，得Cu2+的完全抗原。
2、根据权利要求1所述重金属Cu2+完全抗原的制备方法，其特征在于：水溶性铜盐包括Cu(NO3)2、CuCl2、CuSO4、Cu(CH3COO)2或CuBr2任意一种。
3、根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所用载体蛋白为钥孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白或卵清蛋白中的任意一种。
4、根据权利要求1所述重金属Cu2+完全抗原的制备方法，其特征在于：反应溶液中载体蛋白与ITCBE与Cu2+的质量比为：(20~32):(4~12):1；反应溶液中载体蛋白与p-SCN-Bn-DOTA与Cu2+的质量比为：(8~12):(8~12):1。
5、根据权利要求1所述重金属Cu2+完全抗原的制备方法，其特征在于：溶解载体蛋白的缓冲溶液为HEPES缓冲液，浓度为30~100 mM、pH为7.5~10.5；或碳酸盐缓冲液，pH为9.0~10.5。
6、根据权利要求1所述重金属Cu2+完全抗原的制备方法，其特征在于：用于溶解、保存完全抗原的缓冲液为HEPES缓冲溶液，浓度为30~100 mM、pH为6.5~8.0；或柠檬酸铵缓冲液，浓度为10~30 mM、pH为6.5~8.0。
7、根据权利要求1所述重金属Cu2+完全抗原的制备方法，其特征在于：采用超滤方法去除未反应的低分子物质时，选用截留分子量为10000~30000 dal的超滤离心管，6000 rpm~8000 rpm超滤6次，每次5~30 min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130529 Termination date: 20131118 |