CN101948807B - 一种抗重金属汞离子抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗重金属汞离子抗体及其应用。该抗重金属汞离子抗体为杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948分泌的单克隆抗体。本发明的金属汞离子螯合物的单克隆抗体的获得，为汞离子残留免疫学检测方法的建立打下了基础。可以利用上述单克隆抗体，研究和建立重金属的免疫学检测方法。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

Description

一种抗重金属汞离子抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗重金属汞离子抗体及其应用。

背景技术

近年来，重金属污染事件层出不穷、愈演愈烈，人类赖以生存的空气、土壤、蔬菜和动物均受到了重金属等毒物的污染。环境污染和饲料药物添加剂的滥用，造成畜禽产品重金属残留不同程度超标(逄瑞玥.我国畜禽产品质量安全存在的问题及应对策略.黑龙江粮食，2007，(4)：20-22)。作物中积累的重金属离子通过食物链的生物放大作用进入人畜体内，威胁人畜健康(郎明林，张玉秀，柴团耀.基因工程改良植物重金属抗性与富集能力的研究进展.生物工程学报，2004，20(2)：157-164)。汞是蓄积作用较强的元素，主要在动物体内蓄积。湖泊、沼泽中的水生植物、水产品易蓄积大量的汞。后期，农业上使用含汞杀螨剂以来，汞对土壤、自然水系和大气的污染日益严重。汞污染在世界的某些地方，已成为大众健康的公害(梅光泉.重金属废水的危害及治理.微量元素与健康研究，2004，21(4)：54-56)。快速灵敏地检测食物中的重金属含量是保障食品安全的基础，传统检测重金属残留的分析方法包括原子吸收光谱分析(Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)和电感耦合等离子发射光谱(InductivelyCoupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy，ICP-AES)等是灵敏、可靠的(BontideanI，Lloyd JR，Hobman JL，et al.Bacterial metal-resistance proteins and their use inbiosensors for the detection of bioavailable heavy metals.J Inorg Biochemy，2000，79(1-4)：225-229.)。但昂贵的仪器、专业的分析人员及复杂的样品前处理限制了这些方法的应用。检测必须在具备大型分析仪器的重点实验室内进行，无法用于现场检测，而且受到费用高、处理量有限和检测时间长等限制(刘功良，王菊芳.重金属离子的免疫检测研究进展.生物工程学报，2006，22(6)：877-881)。传统的重金属检测方法不适合蔬菜、水果等保鲜期短、利润低和需大通量检测的样品。

对重金属的常规性检测方法已经有很多种，有些也已经是非常成熟的技术，但因为重金属离子存在的范围很广，根据检测精度、方便程度和检测成本，每种技术都有它们的局限性，同时还需合适的场所，因此都不利于在生产中推广应用。建立更快速、更经济的免疫分析法检测汞离子是生产及经济发展的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗重金属汞离子抗体及其应用

本发明提供的抗重金属汞离子抗体为杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948分泌的单克隆抗体。

杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948也属于本发明保护的范围，已于2009年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武汉大学)，保藏登记号为CCTCC №.C200948。

杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948或其分泌的单克隆抗体在汞离子免疫检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供的杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948分泌的单克隆抗体为特异性单克隆抗体。其制备过程因Hg²⁺离子太小以至于不能引起免疫反应，所以用螯合剂(二乙烯三胺五乙酸，DTPA)将金属离子与载体蛋白(匙孔血蓝蛋白，KLH)连接起来。成功合成、鉴定汞复合物抗原后，免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合获得了稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。用极限稀释法亚克隆，通过ELISA筛选，最终获得了稳定分泌抗汞离子抗体的细胞株(H2H5)。小鼠腹腔注射1×10⁷H2H5细胞株制备腹水，腹水抗体效价在1∶51200以上。经鉴定杂交瘤为IgG1亚类，轻链为kappa型且分泌抗体稳定性较好。杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948分泌的单克隆抗体为汞离子残留免疫学检测方法的建立提供了技术基础，对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

本发明的金属汞离子螯合物的单克隆抗体的获得，为汞离子残留免疫学检测方法的建立打下了基础。可以利用上述单克隆抗体，研究和建立重金属的免疫学检测方法。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

附图说明

图1为小鼠五免后的差异率；

图2为阳性杂交瘤细胞的筛选

图3为H2H5第二次克隆后细胞上清抗体效价

图4为杂交瘤H2H5染色体核型的鉴定

图5为H2H5腹水型单克隆抗体的检测

图6为和H2H5分泌抗体亚型

图7为H2H5分泌抗体的稳定性

具体实施方式

实施例1、分泌抗重金属汞离子抗体的杂交瘤的制备及鉴定

一、分泌抗重金属汞离子抗体的杂交瘤的制备

1、抗原的制备与鉴定

Hg-DTPA-KLH：称取5.65mg二乙烯三胺五乙酸(DTPA)加入1mL pH 9.73的HEPES缓冲液中形成A液，转入反应器，再加入浓度为3.46mol/L的Hg(NO₃)₂10μL，室温下反应30min后同时加入0.4mL pH 9.73的HEPES缓冲液和1.7mL浓度为5.9g/L的匙孔血蓝蛋白(KLH)，调节pH至9.0，室温下搅拌反应12h。偶联反应后，用预处理的CentriconYM-30超滤管对蛋白质复合物进行分离纯化，除去没有参与反应的Hg²⁺、螯合剂DTPA和Hg-DTPA复合物。

Hg-DTPA-OVA的合成方法同上，用鸡卵白蛋白(OVA(ovalbumin)替代匙孔血蓝蛋白(KLH)，DTPA-OVA的合成方法同上用超纯水代替金属离子即可。

超滤后用BCA试剂盒测定复合物蛋白浓度(Robert C.Blake II，Andrey R.Pavlov，Mehraban Khosraviani，et al.Blake.Novel Monoclonal Antibodies with Specificity forChelated Uranium(VI)：Isolation and Binding Properties.Bioconjugate Chem，2004，15(5)：1125-1136)。参照国标GB/T 17141-1997，用石墨炉原子吸收光谱法检测超滤后的上清，滤过液及HEPES液中Hg²⁺浓度(Khosraviani M，Pavlov AR，Flowers GC，etal.Detection of heavy metals by immunoassay：optimization and validation of a rapid，portable assay for ionic cadmium.Environ Sci Ttechnoy，1998，32(1)：137-142)。

结果表明，超滤后用BCA试剂盒测定蛋白浓度，绘制标准曲线后，据公式y＝0.0008x+0.0065(R²＝0.9995)y表示OD₅₇₀，x表示蛋白浓度(mg/L)计算出上清中完全抗原Hg-DTPA-KLH蛋白浓度为4.615g/L，滤过液中蛋白浓度为0.01g/L。

用石墨炉原子吸收光谱法检测Hg²⁺结果：Hg-DTPA-KLH，DTPA-KLH，HEPES溶液中汞离子的溶度分别为208mg/Kg，0mg/Kg，0mg/Kg。如果抗原未合成成功，游离的Hg²⁺或Hg-DTPA会随着超滤而被过滤掉，超滤后的上清中不会含有Hg²⁺，而我们从超滤后的上清中检测出了Hg²⁺且含量较高，证明抗原合成成功。

2、小鼠的免疫及融合小鼠的选择

小鼠的免疫：免疫BALB/c小鼠(购于中国军事医学科学院实验动物中心)五只，首免时，免疫抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀后乳化1h～2h(Palmarini M，Murgia C，Fan H.Spliced and prematurely polyadenylated Jaagsiekte sheepretrovirus(JSRV)-specific RNAs from infected or transfected cells.Virology，2002，294(1)：180-188)，每只BABL/c小鼠皮下多点注射200μg抗原。三周后第二次免疫，相同剂量抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫，以后每隔两周免疫一次，方法同第二次免疫。第三次免疫及以后每次免疫后7d，尾静脉采血，分离血清，测定血清的效价和产生抗体的特异性。

融合小鼠的选择：用间接ELISA法选择融合小鼠，方法如下：

①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)分别稀释Hg-DTPA-OVA和DTPA-OVA，并以相同的浓度5mg/L分别包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2h；②封闭：PBST(1L PBST组分：NaCl 8g，KCl 0.2g，NaHPO₄12H₂O 3.63g，KH₂PO₄0.24g，Tween20 500μL，pH7.3)洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1h；③一抗：一抗：PBST洗涤5次，分别加入相同稀释比的上述五次免疫后的小鼠血清，以未免疫BALB/c小鼠(购于中国军事医学科学院实验动物中心)的血清作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1h；④酶标二抗：洗涤同步骤③，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG/IgM(混合物)1∶5000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1h；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD₄₅₀值，以空白孔调零。按公式计算差异率Differnce％＝(OD₄₅₀ ofHg-DTPA-OVA-OD₄₅₀ of DTPA-OVA)/OD₄₅₀ of DTPA-OVA×100％。

结果如图1所示，五免后检测小鼠血清中抗体效价后，计算各小鼠的差异率的结果显示1号小鼠差异率最高。几只小鼠同时产生了抗DTPA和Hg-DTPA的抗体，但是1号小鼠抗Hg-DTPA的抗体水平最高且差异率最大，说明1号小鼠产生针对Hg²⁺的抗体特异性最强，所以选1号小鼠用于融合(图1)。

3、细胞融合、阳性融合孔的筛选及阳性融合细胞的克隆

选择步骤2所述的1号小鼠进行细胞融合，融合前3d加强免疫小鼠。融合前1d制备饲养细胞(BABL/c小鼠腹腔巨噬细胞)，将细胞浓度调至1×105/mL，按0.1mL/孔加到96孔细胞培养板内，备用。取强免疫1号小鼠脾细胞及处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞株(购自中国医学科学院肿瘤研究所)以6∶1细胞数量比混合，用50％(质量百分含量)PEG1450研究所赠送(美国sigma公司购买)溶液介导融合，将融合后的细胞加入到含饲养细胞的培养板中，0.1mL/孔，37℃，5％CO₂培养箱培养(李凤奎，王纯耀主编.实验动物与动物实验方法学.郑州：郑州大学出版社.2007：377)。

待细胞长满孔底的1/3后，用间接ELISA法检测融合孔上清，方法同步骤2中的融合小鼠的选择，一抗是细胞上清，用未融合孔做阴性对照。用极限稀释法克隆阳性细胞，细胞上清的检测方法同阳性融合孔的筛选。

阳性融合孔的筛选的结果表明，10天后96孔细胞培养板中长出肉眼可见的杂交瘤细胞团，待细胞长满孔底的1/3取细胞上清检测抗体效价，结果显示杂交瘤H2H5、3D12、H1H8、2A11抗体效价都大于阴性对照的2.1倍，判定为阳性杂交瘤，且H2H5的差异率比2A11、3D12的差异率大四株细胞上清与Hg-DTPA-OVA反应OD₄₅₀值均高于与DTPA-OVA反应OD₄₅₀值，其中H2H5差异较大(图2)，说明这两株细胞分泌的抗体针对Hg²⁺离子的特异性较强，H2H5进行亚克隆。

4、阳性融合细胞的亚克隆化

H2H5经过两次亚克隆化后细胞分泌的抗体的效价有所升高，获得稳定的分泌抗Hg²⁺单克隆抗体的细胞株，说明亚克隆较成功，还可以看出H2H5分泌的抗体对金属Hg²⁺的特异性较H1H8的强(图3)。

H2H5已于2009年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武汉大学)，H2H5保藏登记号为CCTCC №.C200948。

二、分泌抗重金属汞离子抗体的杂交瘤的鉴定

1、杂交瘤染色体核型的鉴定

参照文献(司徒镇强主编.细胞培养.西安：世界图书出版社.2007：242)所述的方法进行杂交瘤染色体核型的鉴定，具体方法为：取对数生长期杂交瘤细胞株H2H5用终浓度为0.05mg/L～0.1mg/L的秋水仙素处理4h～6h，收集细胞后用低渗KCL溶液处理30min，固定液固定，滴加细胞悬液到4℃预冷的载玻片上，室温自然干燥，Giemsa染色，经光学显微镜观察，挑选细胞形态完整染色体分散均匀的细胞计数。每株计数5个细胞，记录染色体数目并算出平均值。

杂交瘤细胞染色体核型分析结果表明，SP2/0细胞的染色体数目平均为68条，脾细胞染色体数目平均为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目均在100以上(图4)，高于两亲本细胞的染色体数目，说明这两株杂交瘤细胞是SP2/0细胞和脾细胞的杂交产物。

2、腹水型单克隆抗体的制备

取8周龄～10周龄的雌性BABL/c小鼠，腹腔注射石蜡油0.5mL/只，1周～2周后分别腹腔注射1×10⁶个杂交瘤H2H5和HIH8，接种细胞7d～10d后密切观察动物的健康状况与腹水征象，抽取腹水。室温放置30min后，4℃放置1.5h～2h后12000r/min，离心2min，取上清-20℃保存备检。梯度稀释腹水型抗体后检测小鼠腹水效价，检测方法同步骤一种的步骤2所述的融合小鼠的选择，一抗是稀释后的腹水。取得细胞株H2H5腹水型抗体后检测得出H2H5的效价大于1∶51200(图5)。

3、抗汞离子抗体亚型的鉴定

取出正在培养的杂交瘤H2H5和HIH8细胞上清，按1∶50稀释后，按照鼠单抗亚型鉴定试剂盒ISOStripTM Monoclonal Antibody Isotyping Kit说明书操作，取稀释液0.15mL加入试剂盒小管中，室温放置1min。待其自然溶解后，轻轻混匀。然后将试剂条插到小管底部，大约5min后，当最前端条带在两对“+”中间出现时，即可见与杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚类和轻链类型对应的指示条带所在位置，从而确定抗体亚型。

结果表明，当最前端条带出现在两对“+”中间时，抗体亚类和轻链指示条带分别在G1，k位置，即细胞株H2H5所分泌的抗体为IgG1亚类，轻链为kappa型(图6)。

4、杂交瘤分泌抗体稳定性的测定

将杂交瘤细胞株冻存后，过一段时间再复苏并且连续培养后测抗体效价。检测方法同步骤一的步骤3中阳性融合孔的筛选，用Hg-DTPA-OVA包被酶标板，二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG。

经检测显示细胞株H2H5分泌抗金属Hg²⁺单克隆抗体的水平未见明显下降(图7)，表明抗体的稳定性较好，同时可证明亚克隆较成功。效价稍有波动，可能是由于取细胞上清备检时间间隔不同以及每次检测之间的误差所致，属正常。

三、讨论

由于Hg²⁺能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒，因此，可利用特异性的双功能螯合剂DTPA螯合Hg²⁺，形成能被动物免疫系统识别的螯合物，但这些重金属复合物是分子量低于1kD的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反应(Yu HN，Jones RM，Blake DA.An immunosensor for autonomous in-line detection ofheavy metals：validation.Int J Environ Anal Chem，2005，85(12-13)：817-830)。DTPA除了能螯合金属离子之外，还能与载体蛋白偶联，可以成功制备重金属汞的包被抗原和免疫抗原(Darwish IA，Blake DA.One-step competitive immunoassay for cadmiumions：development and validation for enviromental water samples.Anal Chem，2001，73(8)：1889-1895；Darwish IA，Blake DA.Development and validation of a one-stepimmunoassay for determination of cadmium in human serum.Anal Chem，2002，74(1)：52-58)。有多种蛋白质如KLH、BSA、OVA等能作为载体蛋白，但从诱发免疫应答的角度来看，KLH的免疫原性优于BSA、OVA等，因此本研究用KLH作为载体蛋白来免疫小鼠以期产生更强的免疫应答。

重金属Hg²⁺单克隆抗体制备的关键在于重金属免疫原的制备，所以对免疫原鉴定后再免疫小鼠是成功得到重金属单克隆抗体的保证。本研究先用BCA法测定了超滤后上清中的重金属复合物蛋白浓度，然后用石墨炉原子吸收光谱法检测其中的Hg²⁺含量，这为之后重金属Hg²⁺的单克隆抗体的成功制备提供了可靠的保证。

本研究根据差异率(Difference％)筛选融合所用小鼠，Difference％越大，说明产生针对Hg²⁺的抗体特异性越强，融合筛选得到阳性杂交瘤细胞的几率就越大。

本研究成功获得了抗重金属Hg²⁺或Hg-DTPA的单克隆抗体，目前正在纯化抗体并对抗体的各项性能进行鉴定。该工作的完成为其它抗重金属抗体的制备提供了可行的方法，也为重金属免疫检测方法的建立及应用(如ELISA方法、免疫胶体金快速诊断法(陈凤梅，李娟，曲原君，等.免疫胶体金的研究进展及应用.中国兽药杂志，2004，38(8)：33-35)等)奠定基础。

本发明所获得的抗体，可用于免疫学检测技术检测重金属，具有检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，可用于现场对重金属进行灵敏、准确、实时、快速的检验分析。免疫分析技术引起人们越来越多的关注，这也是免疫分析技术发展的必然趋势，也是成本低工业化生产所要求的。

Claims (3)

1.杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948。

2.杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948分泌的单克隆抗体。

3.杂交瘤细胞株H2H5 CCTCC №.C200948或其分泌的单克隆抗体在汞离子免疫检测中的应用。

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