CN102071170A

CN102071170A - 抗重金属铜的单克隆抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN102071170A
Application number: CN 201010533370
Authority: CN
Inventors: 赵丽; 李霞; 杨慧
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences; Beijing Research Center For Agricultural Standards and Testing
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences; Beijing Research Center For Agricultural Standards and Testing
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2011-05-25

Abstract

本发明公开了一种抗重金属铜的单克隆抗体。该单克隆抗体是由杂交瘤细胞株C9D11 CCTCC NO：C201087分泌得到的。本发明的抗重金属铜的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于铜离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

Description

抗重金属铜的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗重金属铜的单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

随着科技的进步和工业的发展，人们的生活水平有了很大的提高。但是在工业高速发展的同时，也带来了一系列环境问题。1931-1972年发生于日本富山县神通川流域的痛痛病和1953年发生于日本熊本县水鱼湾渔村的水俣病都是由食物受到重金属污染引发的，这些悲剧事件引发了人们对环境中重金属污染的关注。

什么是重金属呢？重金属系指密度4.0以上约60种元素或密度在5.0以上的45种元素。环境污染方面所指的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，也包括具有一定毒性的金属，如铜、锌、镍、锡等元素。重金属不能被微生物降解为无害物，它们在水体中富集起来，造成水体污染，最终危害人类身体健康。有些重金属元素，例如铜，是人体和其它生物体必需的元素，但无论必须元素还是有毒元素，人体对它的忍受都要有一定的限度，超过这个限度后便会引起中毒对生命造成危害。

随着现代工业的迅猛发展，重金属在工农业生产中的广泛应用，人们在制造GDP和财富的同时，人为活动引起的环境污染也在加剧。重金属是有毒并对环境有着持久污染的物质，重金属可以在生物体内长期积累不可降解，在环境中可长时间结合在土壤或沉淀物中，随着环境的变化使金属发生移动，大大提高了它们的毒性和可吸收性。因此重金属在环境、农产品中残留检测都是非常重要的。土壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。

铜在常量下对作物或人体为营养物质，而过量时就会产生危害(Tyler G..Heavy-metal ecology of terrestrial plants，microorganisms and invertebrates.Water Air andSoil Pollution，1989，47：189-225)。随着工农业生产的快速发展，铜的用途越来越广泛，用量不断增加，在当代人类使用的金属中，按金属用量计，铜(Cu)是仅次于铁、铝之后的第三大用量的重金属，含铜污染物排放越来越多，对土壤等环境的污染也逐渐显现出来。过量的铜在体内特别是肝脏的大量蓄积，会出现肝脏异常、胃肠反应、肾脏病变及溶血，在养殖业配制饲料过程中，铜作为微量元素添加的促长剂，添加时过量，动物吸收不完全，通过粪便排出进入生物链，造成污染。高铜饲料在畜牧生产中使用普遍，过量的铜会引发母畜流产等。铜极难在自然界降解，造成土壤、水源、植被的严重污染(许梓荣，周勃，王敏奇.长期饲喂高铜饲粮对猪生长的影响及其机理讨论.浙江农业学报，2000，12(2)：55-60.)。水生生物可以富集铜，通过食物链的富集，最终使大量铜进入人体；农作物可通过根吸收土壤中的铜，其中一部分也可经食物进入人体。重金属铜的污染来源具多样性，作物中积累的重金属铜离子通过食物链的生物放大作用进入人畜体内，威胁着人畜健康。重金属污染是食品、环境、卫生监测的重要内容之一(倪才英，陈英旭，骆永明.土壤-植物系统铜污染与修复的研究进展[J].浙江大学学报，2003，29(3)：237-243.；Valcbo D.Zbejazkov.Effect of heavy metals onpeppermint and commint.Plant and Soil，1996，178：59-66；郎明林，张玉秀，柴团耀.基因工程改良植物重金属抗性与富集能力的研究进展.生物工程学报，2004，20(2)：157-164；Diane AB，Jones RM，Robert CB，et al.Antibody-base sensors for heavy metalions.Biosen Bioelec，2001，16：799-809.)，在重金属铜污染的预防和治理中，重金属铜污染物的监测和识别至关重要。

总之，重金属是一种很危险的污染物。污染环境中存在的高浓度重金属，对生物的生理活动能产生多种影响，使一些生物发生病害甚至死亡，最终使生态系统平衡被破坏、生态环境恶化。重金属通过食物链可以在人体中积累，引起多种疾病甚至癌症，而且危害还可以遗传到下一代。因此，痕量重金属的定量分析在食品和环境检测等方面都是非常重要的。

对重金属的常规性检测方法已经有很多种，有些也已经是非常成熟的技术，但因为重金属离子存在的范围很广，根据检测精度、方便程度和检测成本，每种技术都有它们的局限性，同时还需合适的场所，因此都不利于在生产中推广应用。建立更快速、更经济的免疫分析法检测铜离子是生产及经济发展的需要。

传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法(Atomic AbsorptionSpectroscopy)、紫外分光光度法(Ultra-violet Spectroscopy)、阳极溶出伏安法(AnodicStripping Voltammeter)、示波极谱法(Oscillopolarography)和各种仪器联用技术，如电感耦合等离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)、电感耦合等离子体原子发射光谱分析(Inductively Coupled Plasma-Atomic EmissionSpectrometry)、氢化物发生-原子吸收法(Hydride Generation-Atomic AbsorptionSpectrometry)等。传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，如利用AAS、ICP-AES或电化学方法等，检测仪器昂贵，样品要经过湿法消解或微波消解，逐个测定单种重金属浓度，测量精度虽可达到mg/kg或更高，但检测步骤繁琐，检测成本高，需耗时2天左右，不适应实践中快速简便的需要，难以适应环境及市场产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。

重金属的免疫分析方法作为一种新型的检测技术，与传统检测方法相比，具有快速、灵敏和便携等优点(Khosraviani M，Pavlov AR，Flowers GC，et al.Detection of heavymetals by immunoassay：optimization and validation of a rapid，portable assay for ioniccadmium.Environ Sci Ttechnoy，1998，32(1)：137-142；Blake RC，Delehanty JB，Khosraviani M.Allosteric binding properties of a monoclonal antibody and its fab fragment.Biochemistry，2003，42(2)：497-508.)，可以减少定点检测和补救工作的费用，并且能极大的提高风险评估工作的效率和质量，可用于环境和农产品重金属污染的现场检测，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验(Blake RC，Delehanty JB，Khosraviani M.Allosteric binding properties of a monoclonal antibody and its fab fragment.Biochemistry，2003，42(2)：497-508.)。

发明内容

本发明的一个目的是提供杂交瘤细胞株及其分泌的抗重金属铜的单克隆抗体。

本发明所提供的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株C9D11，其保藏编号为CCTCCNO：201087。

由杂交瘤细胞株C9D11 CCTCC NO：C201087分泌得到的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种抗原。

本发明所提供的抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到：

1)将可溶性铜盐溶液与螯合剂溶液混合，进行络合反应，得到铜离子与螯合剂的络合物；

2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白溶液和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述络合物的偶联物，即为抗原。

上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述可溶性铜盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件：所述可溶性铜盐中的Cu²⁺与所述螯合剂的物质的量比为1∶1；

上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件：所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述络合反应在pH值为7.4的条件下进行；

上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述偶联反应在pH值为9.0的条件下进行。

上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25℃，所述络合反应的时间为10分钟；

上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25℃，所述偶联反应的时间为12小时。

上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C₂₂H₂₈N₄O₁₀S·3HCl；

上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述可溶性铜盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将铜片溶于浓度为68％(体积百分含量)的HNO₃水溶液中，待铜片完全反应后，得到所述可溶性铜盐溶液；

上述抗原制备中，所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述螯合剂加入pH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，再调节pH值至9.0，得到所述螯合剂溶液；

上述抗原制备中，所述步骤2)中，载体蛋白BSA溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述载体蛋白BSA溶于pH值为7.4、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液，得到所述载体蛋白溶液；

上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白；

上述抗原制备中，所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液。

本发明的另一个目的是提供一种不完全包被原。

本发明所提供的不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到：将螯合剂、载体蛋白和反应缓冲液混合，在pH至9.0、25℃的条件下反应12小时，得到螯合剂与载体蛋白的不完全包被原。

上述不完全包被原制备中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件：所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

上述不完全包被原制备中，所述偶联反应在pH值为9.0的条件下进行。

上述不完全包被原制备中，所述反应的温度为25℃，所述偶联反应的时间为12小时。

上述不完全包被原制备中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将螯合剂加入pH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，再调节pH值至9.0，得到所述螯合剂溶液；

上述不完全包被原制备中，所述螯合剂的分子式为C₂₂H₂₈N₄O₁₀S·3HCl。

上述不完全包被原制备中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白；

上述单克隆抗体在检测样品中是否含有铜中的应用也属于本发明的保护范围。

上述单克隆抗体在检测样品中铜的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的抗重金属铜的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于铜离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

附图说明

图1为Cu-DTPA-BSA，DTPA-BSA，BSA的紫外扫描图谱；

图2为Cu-DTPA-KLH、KLH的紫外扫描图谱；

图3为Cu-DTPA-BSA，DTPA-BSA及载体蛋白BSA的SDS-PAGE电泳图；

图4为Cu-DTPA-KLH，载体蛋白KLH的SDS-PAGE电泳图；

图5为小鼠六免后的差异率比较；

图6细胞株C9D11分泌抗体与DTPA结合系数测定结果；

图7为杂交瘤细胞株C9D11分泌抗体的亚型；

图8为单克隆抗体效价的检测

图9为细胞株C9D11分泌抗体特异性鉴定；

图10为C9D11分泌抗体的稳定性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗原与不完全包被原的制备

一、制备

p-Scn-Bn-DTPA购自美国Macrocyclics，货号为B-305。

产品名：p-SCN-Bn-DTPA

英文名：2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaaceticacid

别名：S-2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid

分子式：C₂₂H₂₈N₄O₁₀S·3HCl。

pH值为9.73的HEPES缓冲液：1.4165g HEPES，去离子水溶解，用10mol/L的KOH调pH至9.73，定容至50mL，配后过滤除菌，4℃保存。(浓度为1.4165g/50mL)。

pH值为7.4的HEPES缓冲液：14.165g HEPES，去离子水溶解，调pH至7.4，定容至500mL。(浓度为1.4165g/50mL)。

A液：11g铜片溶于100mL体积百分含量为68％的HNO3水溶液中，得到浓度为110mg/mL的Cu(NO3)2溶液。

B液：10.668mg p-SCN-Bn-DTPA，加入0.4mL pH9.73的HEPES缓冲液，终浓度为26.67mg/mL。

C液：20mg BSA溶于0.4mL pH7.4的HEPES缓冲液，得到浓度为50mg/mL的溶液。

B1液：称取10mg p-SCN-Bn-DTPA溶于0.6mL pH9.73的HEPES缓冲液，得到浓度为16.67mg/mL的溶液

C1液：浓度为5.9mg/mL的匙孔血蓝蛋白(KLH)溶液1.695mL。

C1液购自Sigma，货号：H8283。

中文名：匙孔血蓝蛋白(KLH)。

产品英文名：Hemocyanin from Megathura crenulata(keyhole limpet)。

1、Cu-DTPA-BSA和Cu-DTPA-KLH的制备

Cu-DTPA-BSA的制备：(1)取0.4mL的B液加入反应器，再加入9.5μLA液，在pH为7.4、室温(25℃)下反应10分钟，得到Cu-DTPA液；(2)再向其中加入1.2mL pH9.73的HEPES缓冲液、C液0.4mL，再加pH9.73的HEPES缓冲液将调节pH至9.0，室温(25℃)下搅拌，反应12小时，得到Cu-DTPA-BSA。步骤(1)中，Cu(NO₃)₂中的Cu²⁺与p-SCN-Bn-DTPA的物质的量比为1∶1。步骤(2)中，p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

Cu-DTPA-KLH：(1)取0.133mL的B1液加入反应器，再加入A液9.9μL，在pH为7.4、室温(25℃)下反应10分钟，得到Cu-DTPA液；(2)再向其中加入0.420mL pH9.73的HEPES缓冲液、C1溶液1.695mL，调节pH至9.0，室温(25℃)下搅拌，反应12小时。步骤(1)中，Cu(NO₃)₂中的Cu²⁺与p-SCN-Bn-DTPA的物质的量比为1∶1。步骤(2)中，p-SCN-Bn-DTPA与KLH中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

CentriconYM-30超滤离心管预先用0.1mol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)溶液浸泡过夜，然后用pH9.73的HEPES缓冲液充分冲洗。偶联反应后，用CentriconYM-30超滤离心管对蛋白质复合物进行分离纯化，即用CentriconYM-30过滤除去没有参与反应的过量的金属离子Cu²⁺和螯合剂DTPA及Cu-DTPA，分离纯化时先用pH9.73的HEPES缓冲液洗涤超滤管一次，再用pH7.4的HEPES缓冲液洗涤两次。

2、DTPA-BSA的制备

DTPA-BSA：取0.4mL的B液加入反应器，再向其中加入1.2mL pH9.73的HEPES缓冲液、C液0.4mL，再加pH9.73的HEPES缓冲液将调节pH至9.0，室温(25℃)下搅拌，反应12小时，得到DTPA-BSA。反应中p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

分离纯化步骤同步骤1。

纯化后所得的抗原分装于-20℃保存，长期保存存于-80℃。

二、抗原的鉴定

1、抗原的浓度测定

参照BCA试剂盒步骤，用BCA法构建浓度检测标准曲线。蛋白浓度测定标准曲线的绘制：在聚苯乙烯微孔板上，分别将2mg/mL的BSA标准蛋白稀释至浓度为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL，0μg/mL。用BCA蛋白定量试剂盒测定570nm的光吸收值。以吸收值减去空白值得到的数值对BSA含量作图，绘出标准曲线。KLH的标准曲线绘制原理同BSA。抗原浓度的测定：将分离纯化后的抗原样品适当稀释，用BCA蛋白定量试剂盒测定570nm的光吸收值，通过标准曲线计算样品溶液中抗原浓度。

结果表明，利用BCA法检测分离纯化后的的Cu-DTPA-BSA、Cu-DTPA-KLH、DTPA-BSA中蛋白的实际浓度依次为6.3175±0.035mg/mL，6.314±0.024mg/mL29.65±0.031mg/mL(见表1)。

表1、BCA法检测抗原中蛋白浓度

2、抗原与载体蛋白的紫外扫描图谱

以0.1mol/L，pH 7.4的HEPES缓冲液作空白，取10μL BSA，88μL KLH及其相应的抗原及DTPA-BSA，用HEPES缓冲液稀释至0.5mg/mL，在波长228-320nm范围内进行紫外扫描。

如图1所示，BSA在231nm，278nm各有一个吸收波峰，DTPA-BSA在231nm，278nm也各有一个吸收波峰，完全抗原Cu-DTPA-BSA与其相应的载体蛋白和DTPA-BSA相比，在229nm-237nm之间属于高吸收值的区域，载体蛋白和抗原的紫外扫描曲线在229nm-237nm之间完全没有重叠之处。完全抗原Cu-DTPA-BSA紫外扫描的特征既具有BSA的特征，还具有DTPA-BSA的特征。这证明了抗原合成成功。

如图2所示，KLH在238nm，282nm各有一个吸收波峰，完全抗原Cu-DTPA-KLH与其相应的载体蛋白相比，在228nm-260nm之间属于高吸收值的区域，载体蛋白和抗原的紫外扫描曲线在228nm-260nm之间完全没有重叠之处。完全抗原Cu-DTPA-KLH，紫外扫描的特征具有KLH的特征，又不与KLH重合，这证明了抗原合成成功。

3、抗原SDS-PAGE电泳

用5％浓缩胶，6％分离胶，点样量20μL/孔，对BSA、DTPA-BSA、Cu-DTPA-BSA进行垂直SDS-PAGE电泳。用3％浓缩胶，5％分离胶，点样量15μL/孔，对KLH、DTPA-KLH、Cu-DTPA-KLH进行垂直SDS-PAGE电泳。步骤如下：

取各样品做好稀释，分别与载样缓冲液等体积混合在99℃预热8min，然后加入凝胶样品孔中，记录样品序号。

电泳时在浓缩胶中电流用10mA，进入分离胶时用20mA，当溴酚蓝到达底部时关闭电源。

电泳结束后，用考马斯亮蓝G-250染色、脱色。

扫描仪扫描并保存图片。

分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8，5.45g Tris，加5mL蒸馏水预溶，用2MHCl调pH至8.8，定容至30mL，4℃保存。

浓缩胶缓冲液：0.494mol/L Tris-HCl，pH6.8，0.598g Tris，加5mL蒸馏水预溶，用2MHCl调pH至6.8，定容至10mL，4℃保存。

丙稀酰胺贮备液：8.73g Acr，0.27g Bis，加蒸馏水至30mL，不溶物用过滤法除去，棕色瓶4℃避光保存。

10％SDS(十二烷基磺酸钠)：1.0g SDS在68℃加热条件下溶于一定量蒸馏水，用浓HCl调溶液pH值至7.2，再加蒸馏水至10mL，室温保存。

10％过硫酸铵：1.0gAP，加蒸馏水至10mL，4℃避光保存。

Tris-Gly电极缓冲液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，SDS 1.0g，调pH至8.3，定容至1000mL，4℃保存。

样品缓冲液：SDS 1.6g，4％巯基乙醇0.80mL，10％甘油2.0mL，0.01％溴酚蓝1.0mg，用10mM磷酸钠/钾(pH7.0)定容至20mL，4℃保存。

5％浓缩胶：H₂O 2.7mL，Acr/Bis 0.67mL，浓缩胶缓冲液0.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.04mL，TEMED 0.004mL。

6％分离胶：H₂O5.32mL，Acr/Bis 1.98mL，分离胶缓冲液2.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.1mL，TEMED 0.004mL。

3％浓缩胶：H₂O 2.968mL，Acr/Bis 0.402mL，浓缩胶缓冲液0.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.04mL，TEMED 0.004mL。

5％分离胶：H₂O 5.65mL，Acr/Bis 1.65mL，分离胶缓冲液2.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.1mL，TEMED 0.004mL。

由图3(M：Marker 1：BSA 2：DTPA-BSA 3：Cu-DTPA-BSA)可以看出，由于DTPA-BSA上交联有螯合剂，与BSA相比，分子量变大，DTPA-BSA电泳图带滞后且较模糊。同理Cu-DTPA-BSA与DTPA-BSA及BSA相比，分子量变大，且由于Cu²⁺带正电，所以电泳图带滞后且模糊，由此可定性判断抗原合成成功。

由于KLH分子量大(大于2000kDa)，实验中使用还原SDS-PAGE。图4(M：Marker1：KLH 2：Cu-DTPA-KLH)中3条带是KLH使用二巯基乙醇切后的亚基条带，分子量虽然无法确定，但可以看出，二巯基乙醇切后的Cu-DTPA-KLH与KLH的各亚基相比，分子量变大，且由于Cu²⁺带正电，所以电泳图带滞后且较模糊，由此可定性判断抗原合成成功。

4、抗原中全Cu的含量

以0.1mol/L，pH7.4的HEPES缓冲液做空白，将离心纯化后的抗原用pH7.4的HEPES缓冲液稀释适当倍数后，参照国标GB/T 17141-1997，用石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中的Cu²⁺浓度(Khosraviani M，Pavlov A R，Flowers G C，et al.Detection of heavymetals by immunoassay：optimization and validation of a rapid，portable assay for ioniccadmium.Environmental science & technology，1998，32：137-142)。

石墨炉原子吸收光谱法检测抗原及各组分中全Cu的含量结果(见表2)所示。说明金属通过螯合剂偶联到蛋白质上，进一步证明抗原合成成功。

表2、人工抗原中Cu的含量

实施例2、单克隆抗体的制备及功能验证

一、单克隆抗体的制备

(一)杂交瘤细胞株C9D11的制备

1、小鼠的免疫及融合小鼠的选择

1)基础免疫：首免时，选择8周龄的BABL/c小鼠体重约23-25g)取蛋白浓度为6.314mg/mL的免疫抗原液Cu-DTPA-KLH与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀后乳化1～2小时直到滴入水中不扩散，每只BABL/c腹腔注射200μg Cu-DTPA-KLH抗原。三周后第二次免疫，相同剂量抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫，以后每隔两周免疫一次，方法同第二次免疫。第三次免疫及以后每次免疫后7天，尾静脉采血，分离血清，测定血清的效价和产生抗体的特异性。

2)加强免疫：融合前3天加强免疫小鼠，加强免疫无需乳化，所用抗原Cu-DTPA-KLH剂量为600ug/只。

3)融合小鼠的选择：第六免后用间接ELISA法选择融合小鼠，方法如下：

①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释Cu-DTPA-BSA和DTPA-BSA，并以相同的浓度2.5mg/L分别包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，加入相同的待检血清，以未免疫小鼠的血清作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG/IgM(混合物)1∶5000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD₄₅₀值，以空白孔调零。

间接ELISA检测各小鼠血清抗体效价及差异率结果见表3，本研究根据差异率Difference％筛选融合所用小鼠，Difference％越大，说明产生针对Cu²⁺的抗体特异性越强，融合筛选得到阳性杂交瘤细胞的几率就越大。按公式计算差异率Difference％＝(Cu-DTPA-BSA_OD450-DTPA-BSA_OD450)/DTPA-BSA_OD450×100，各小鼠差异率比较柱状图见图5。从表3及图5可知，1号小鼠的差异率最大，所以筛选到分泌针对Cu²⁺的抗体杂交瘤的可能性最大，所以应选择1号小鼠进行细胞融合。

表3、第六免后间接ELISA检测各小鼠血清抗体

2、骨髓瘤细胞(SP2/0)的培养

融合前36-48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养于75cm²细胞瓶内。融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000rpm离心5min，然后用DMEM营养液重新悬浮，取少量台盼蓝染色计数，保证细胞成活率大于90％以上，用于细胞融合。

3、免疫脾细胞的制备

在加强免疫后第三天取免疫小鼠，摘除眼球放血并分离血清作为抗体检测时阳性对照；将颈椎脱臼处死的小鼠置75％酒精中浸泡5min，置超净工作台蜡盘内；无菌取出小鼠脾脏，放入盛有10mL DMEM营养液的平皿中，轻轻漂洗，除去附着的结缔组织与脂肪；用剪刀剪碎脾脏，置于200目铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用DMEM营养液冲洗使脾细胞全部通过网孔进入溶液中；将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM营养液至30mL，混匀，1000rpm离心8min，弃上清液；同法离心、洗涤细胞一次，然后将细胞悬于10mL DMEM营养液中混匀；取上述细胞混悬液进行计数备用。

4、饲养细胞的制备

细胞融合的前一日，将未经免疫的BALB/c小鼠(8-12周龄)眼球采血，颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精5min，置超净工作台蜡盘内，腹部向上固定；将BALB/c小鼠皮肤用消毒镊子提起，小心剪开腹部皮肤，分离皮肤与腹膜，充分暴露腹膜；用无菌注射器吸取适量DMEM营养液注入腹腔，按摩腹部，待腹腔细胞与注入的营养液充分混合后，轻轻吸回营养液加入无菌离心管内，重复冲洗2-3次；所得液体1000rpm离心5min，弃上清液。向沉淀中加入10mL DMEM营养液，重新吹散细胞，取上述细胞混悬液进行台盼蓝染色计数；用含HAT(Sigma公司，目录号H0262)的培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为1-2×10⁵个/mL，加入96孔细胞培养板中(100μL/孔)，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养备用。

5、细胞融合

将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按6∶1比例混合于离心管内，1000rpm离心8min，弃上清液，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；用1mL移液管吸取预热至37℃的50％PEG(WT 1450Sigma公司，目录号P5402)(PH8.0)溶液1mL，沿转动的管壁缓缓滴入，控制在60s加完，然后将细胞悬液吸入移液管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)；在5min内向离心管内加入25mL DMEM营养液终止融合作用；将融合后的细胞液1000rpm离心5min，弃上清液，用37℃水浴预热的含HAT培养液重悬；加入有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，置37℃、5％CO₂的培养箱中培养。每天记录细胞生长情况，融合后第四天，用1％HAT选择培养液半量换液，约7-10天，改用1％HT(Sigma公司，目录号H0137)选择培养液半量换液继续培养。

6、阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆化

每天观察细胞的生长情况，融合后3-5天，可见有克隆细胞生长，待细胞集落生长至孔底的1/3-1/2时，对其上清液用间接ELISA方法进行检测，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，甲基纤维素半固体培养法克隆细胞，使阳性率达100％，注意及时冻存细胞，然后扩大培养以制备腹水，并将一部分细胞连续传代、冻存、复苏，观察细胞分泌单克隆抗体的稳定性。

得到稳定分泌抗铜单克隆抗体的杂交瘤细胞株C9D11，该细胞株已于2010年8月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO：C201087。

(二)单克隆抗体的大量制备

在获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆后，通常以两种方法大量生产单克隆抗体：一种是体外培养法，不含其他免疫球蛋白，易于纯化。另一种是动物体内诱生法制备单克隆抗体，利用纯系小鼠诱发腹水，该法产量和效价多很高，是目前大量获得单抗的主要途径。

体外法培养法：将对数生长期的杂交瘤细胞C9D11在CELLine CL1000膜支持的细胞培养系统中用含10％FBS的DMEM中培养，37℃，5％CO₂培养箱中培养7天收集上清即获得单克隆抗体。

体内培养法：采用小鼠体内诱生法，取8周龄健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后使用。将细胞瓶中培养的杂交瘤细胞C9D11吹下来，1000rpm离心10min弃上清液，收集细胞沉淀。用DMEM基础培养液将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。密切观察动物的健康状况与腹水征象，接种细胞7-10天后产生腹水，待腹水尽可能多，处死小鼠，用滴管将腹水收集到离心管中。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/mL，此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。将腹水12000rpm离心10min，弃去上层的脂肪、石蜡油和下层的沉淀，小心抽去中层的淡黄色清凉液体，即获得单克隆抗体，-20℃冷冻保存。

二、抗体的功能

1、DTPA浓度对抗体的影响

①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释Cu-DTPA-BSA，并以浓度2.5mg/L包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，加入细胞株C9D11分泌的抗体25uL分别与等体积浓度为1mM，5mM，10mM，25mM，50mM的DTPA混合后静置1小时，以SP2/0上清代替细胞株C9D11分泌的抗体作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM1∶10000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD₄₅₀值，以空白孔调零。从图6可见，抗体与浓度低于25mMp-SCN-Bn-DTPA结合较小，而25mM DTPA远远高于铜的浓度，结果说明细胞株C9D11分泌的抗体不与p-SCN-Bn-DTPA反应，而是针对金属Cu ²⁺或Cu-DTPA。

2、单克隆抗体类型及亚型鉴定

利用鼠单抗亚型鉴定试剂盒ISOStrip^TMMonoclonal Antibody Isotyping Kit对杂交瘤细胞株所分泌的抗体进行亚类鉴定。取稀释液0.15mL加入试剂盒小管中，室温放置1min。待其自然溶解后，轻轻混匀。然后将试剂条插到小管底部，大约5min后，当最前端条带在两对“+”中间出现时，即可见与杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚类和轻链类型对应的指示条带所在位置，从而确定抗体亚型，结果杂交瘤细胞C9D11所分泌的抗体为IgM亚类，轻链为κ型(图7)。

3、抗体效价测定

检测体外培养杂交瘤细胞C9D11得到的抗体的效价。

间接ELISA方法如下：①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释C9D11-DTPA-BSA，并以浓度2.5mg/L包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，不同稀释度的体外培养得到的抗体，以SP2/0上清作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM1∶10000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD₄₅₀值，以空白孔调零。

实验设3次重复，结果取平均数。结果如表4和图8所示。结果显示，间接ELISA方法杂交瘤细胞株C9D11细胞培养上清液效价达1∶51200。

4、细胞株C9D11分泌抗体特异性鉴定

用间接ELISA法①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释Cu-DTPA-BSA和DTPA-BSA，并以相同的浓度2.5mg/L分别包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，加入细胞株C9D11培养上清，SP2/0细胞上清做阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM 1∶10000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD₄₅₀值，以空白孔调零。

实验设3次重复，结果取平均数。结果如图9所示。结果显示细胞株C9D11分泌的抗体与Cu-DTPA-BSA反应的OD₄₅₀高于与DTPA-BSA反应的OD₄₅₀，阴性对照的OD₄₅₀低于0.05，说明此株细胞分泌的抗体效价较高，针对Cu²⁺或Cu-DTPA特异性较强。

表4、抗体的效价

5、杂交瘤分泌抗体稳定性的测定

将杂交瘤细胞C9D11株冻存后，过一段时间再复苏并且连续培养后测抗体效价。检测方法同抗体效价测定所用间接ELISA方法。

经检测显示细胞株C9D11分泌抗金属Cu²⁺单克隆抗体的水平未见明显下降(图10)，表明细胞株分泌抗体的稳定性较好。

Claims

1.杂交瘤细胞株C9D11，其保藏编号为CCTCC NO：C201087。

2.由杂交瘤细胞株C9D11CCTCC NO：C201087分泌得到的单克隆抗体。

3.一种抗原，按照包括如下步骤的方法制备得到：

2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白溶液和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述络合物的偶联物，即为完全抗原。

4.根据权利要求3所述的抗原，其特征在于：

所述步骤1)中，所述可溶性铜盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件：所述可溶性铜盐中的Cu²⁺与所述螯合剂的物质的量比为1∶1；

所述步骤2)中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件：所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

5.根据权利要求3或4所述的抗原，其特征在于：

所述步骤1)中，所述络合反应在pH值为7.4的条件下进行；

所述步骤2)中，所述偶联反应在pH值为9.0的条件下进行。

6.根据权利要求3-5中任一所述的抗原，其特征在于：

所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25℃，所述络合反应的时间为10分钟；

所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25℃，所述偶联反应的时间为12小时。

7.根据权利要求3-6中任一所述的抗原，其特征在于：

所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C₂₂H₂₈N₄O₁₀S·3HCl；

所述步骤1)中，所述可溶性铜盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将铜片溶于浓度为68％(体积百分含量)的HNO₃水溶液中，待铜片完全反应后，得到所述可溶性铜盐溶液；

所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述螯合剂加入pH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，得到所述螯合剂溶液；

所述步骤2)中，载体蛋白BSA溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述载体蛋白BSA溶于pH值为7.4、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液，得到所述载体蛋白溶液；

所述步骤2)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白；

所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液。

8.一种不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到：将螯合剂、载体蛋白和反应缓冲液混合，在pH至9.0、25℃的条件下反应12小时，得到螯合剂与载体蛋白的不完全包被原。

9.根据权利要求8所述的不完全包被原，其特征在于：所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件：所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的物质的量的比为5∶1。

和/或，所述反应在pH值为9.0的条件下进行。

和/或，所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为12小时；

和/或，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将螯合剂加入pH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，再调节pH值至9.0，得到所述螯合剂溶液；

和/或，所述螯合剂的分子式为C₂₂H₂₈N₄O₁₀S·3HCl；

和/或，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

10.权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中是否含有铜中的应用；权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中铜的含量中的应用。