CN101914153B - 一种Pb2+抗原和相应单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Pb2+抗原和相应单克隆抗体，同时还提供了该抗原及单克隆抗体的制备方法，将Pb2+与螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA螯合，通过戊二醛与血蓝蛋白(KLH)偶联，超滤，得到完全免疫抗原(KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb)。免疫BALB/c小鼠，取该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb强阳性，对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA及其它各种金属离子无交叉反应的特异性单克隆抗体。该抗体可用于检测Pb2+的ELISA试剂盒、试纸条的开发，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明公开一种Pb2+抗原和相应单克隆抗体，同时还提供了该抗原及单克隆抗体的制备方法，属于免疫学方法检测技术领域。
背景技术
重金属污染是世界性问题。目前已知有20多种重金属具有较大的毒性，其中铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)、铬、钴、镍、锡、钒等以“工业三废”的形式进入自然环境，不仅对自然环境造成了严重的污染，而且影响了农产品的质量，并可通过食物链及生物富集作用对人类健康构成极大的威胁。目前，重金属检测所采用的原子吸收法、溶出伏安法和电感耦合、离子体光谱法等技术尽管灵敏度较高，可满足痕量检测需要，但这些方法都需要复杂的前处理，加之仪器设备昂贵，检测费时费力且成本高，不能满足环境和农产品检测实践快速简便的需要。
为了克服以上检测方法的缺点，国内外都开展了重金属快速免疫检测技术的研究。基于金属螯合物抗体的免疫检测方法为重金属检测提供了一种新的策略，与其它检测系统相比，免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异和便携等优点，可以满足环境和农产品现场检测的需要，对提高我国环境和农产品重金属污染的控制和监测水平以及保障农产品质量安全和消费者的健康具有重要意义。
Blake等人(2001)分别用KinExA法和间接竞争ELISA法对样品中的Cd2+、Co2 +、U6+、Pb2+离子进行检测。KinExA法的灵敏度和精度都远远优于间接竞争ELISA法。目前应用KinExA仪器对重金属离子进行检测仍处在实验室阶段，Blake等正与Sapidyne仪器公司和KinExA制造商进行合作，力图使仪器小型化，以便于现场检测。荧光偏振重金属免疫检测法(FPIA)是一种不同于ELISA法的荧光标记免疫检测方法，其原理为：样品中的金属离子与过量螯合剂形成金属-螯合剂复合物后，与固定浓度的金属-螯合剂荧光复合物竞争检测抗体上的结合位点，然后进入荧光偏振分析仪进行分析，通过与标准曲线对照得出金属离子的浓度。
建立重金属快速免疫学检测方法的关键在于重金属特异性单克隆抗体的制备，而重金属特异性单克隆抗体制备的关键在于重金属完全抗原的制备。重金属离子的分子量小，自身不能作为完全抗原诱导机体产生免疫反应。但是，重金属离子与螯合剂反应后所形成的重金属-螯合剂复合物是低分子量的半抗原，此半抗原与大分子的载体蛋白如钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白等偶联形成的载体蛋白-螯合剂-重金属复合物便可作为一种完全抗原诱导小鼠发生免疫反应。因此选用结构较复杂的大分子双功能螯合剂，先与重金属离子螯合形成螯合剂-重金属复合物，再与载体蛋白偶联，即可得到完全抗原：载体蛋白-螯合剂-重金属。
目前尚无用双功能螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA制备Pb2+完全抗原、相应特异性单克隆抗体及以此为基础的用于检测Pb2+的ELISA试剂盒或试纸条的报道。
发明内容
本发明提供了一种Pb2+完全免疫抗原，可用于制备重金属Pb2+的单克隆抗体。
本发明还提供了Pb2+抗原的相应单克隆抗体，对Pb2+具有特异性。
本发明进一步公开了Pb2+抗原和相应单克隆抗体的制备方法，该方法制备的抗原、单克隆抗体稳定性好、实用性强。
本发明公开的Pb2+完全免疫抗原，其特征在于：
Pb2+完全免疫抗原紫外吸收峰值为230nm～280nm，Pb含量达40μg/mg，紫外扫描结果见图1。
上述Pb2+完全免疫抗原的制备方法，包括以下步骤：
称取1.7mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于0.9-1.1ml 1mg/ml、pH5.0-6.0的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH5.0-6.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时；将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌；调节pH值为5.0-6.0，37℃搅拌反应12小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH5.0-6.0的Hepes缓冲液，每次离心15min；超滤完毕后，补加0.1M、pH5.0-6.0的Hepes缓冲液，使KLH终浓度为1mg/ml，得到完全抗原。
本发明公开的Pb2+抗原的单克隆抗体对Pb2+具有特异性。
上述Pb2+抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：用以上步骤得到的完全免疫抗原免疫BALB/c小鼠，选择对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb血清效价高、对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA血清效价低的小鼠加强免疫，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合；采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株，只保留对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb反应为强阳性、对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA反应为阴性、对其它金属离子无交叉反应的细胞株。
在上述Pb2+抗原的单克隆抗体的制备方法中，采用的免疫方法为：
首免：取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH5.0-6.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入完全弗氏佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫：取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl10mg/ml、pH5.0-6.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
本发明的积极效果在于：制备的抗原及相应单克隆抗体可以制成重金属Pb2+快速检测试剂盒、胶体金免疫层析试纸或传感器，为重金属铅免疫检测技术的研究解决了一个技术难题。该方法制备的抗原稳定性好、实用性强，为进出口检验检疫部门、食品卫生部门、水产养殖检测部门、环保部门等部门提供新的方便、实用、简易、快速检测工具，具有良好的经济价值、社会效益和广阔的市场前景。
附图说明：
图1为KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb、KLH的紫外光谱检测结果图。
图2为BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb、BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA、BSA的紫外光谱检测结果图。
具体实施方式
实施例1
1.免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原的制备及检测
(1)免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb的制备
称取1.7mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.0ml 1mg/ml、pH5.5的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH5.5、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌。调节pH值为5.5，37℃搅拌反应12小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH5.5的Hepes溶液，每次离心15min。超滤完毕后，补加0.1M、pH5.5的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml。免疫抗原制备完毕，分装，-20℃保存。
(2)检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的制备
称取3.127mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.71ml 1mg/ml、pH5.5的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH5.5、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌。调节pH值为5.5，37℃搅拌反应12小时，将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH5.5的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH5.5的Hepes稀释成1mg/ml，分装，于-20℃保存。
(3)对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的制备
称取3.127mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.71ml 0.1M、pH5.5的Hepes溶液中，37℃搅拌0.5小时，然后加入pH5.5、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌。调节pH值为5.5，37℃搅拌反应12小时，将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH5.5的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH5.5的Hepes稀释成1mg/ml，分装，于-20℃保存。
(4)免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原的检测
对免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、对照检测抗原B SA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA进行190-500nm进行全波长扫描，判断螯合剂与载体蛋白相比是否发生吸收峰漂移。在本发明的实施例1中，KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、KLH的紫外扫描结果见图1，BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA、BSA的紫外扫描结果见图2。螯合后最大吸收峰与载体蛋白性比较发生漂移，说明免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原合成成功。
用石墨炉院子吸光光度法测免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb中Pb的含量。在本发明的实施例1中，KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb中Pb含量为40.00μg/mg，检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb中Pb含量达34.6μg/mg。进一步说明免疫抗原、检测抗原合成成功。
2.制备单克隆抗体
(1)小鼠免疫
首免时取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH5.5的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl10mg/ml、pH5.5的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
(2)小鼠血清效价测定
①间接ELISA法测定血清效价
4免疫后小鼠断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。将检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA作100倍稀释，按每孔100μl分别包被酶标板，37℃温育1小时，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)150μl/孔，37℃温育1小时，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品4000倍稀释后，再做倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。将酶标二抗(羊抗鼠)以1∶5000倍稀释按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光静置10分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔，用酶标仪测定450nm处OD值。把待检血清OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时的最高血清稀释倍数作为血清效价。四免疫后所有小鼠血清针对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的效价为1∶32000以上，针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的OD值为BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的1/4以下。
②检测抗原最佳包被浓度的测定(方阵间接ELISA法)
用包被缓冲液将检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb作系列倍比稀释即作1∶100…～…1∶6400倍稀释包被于酶标板1～7列孔内；将抗血清用PBS缓冲液(0.01MpH7.4)作系列倍比稀释即作1∶1000…～…1∶32000倍稀释加于包被有检测抗原的酶标板A～F行孔内，按照间接ELISA进行操作，酶标仪测定450nm波长处各孔OD值。OD值最接近1.0时的抗原浓度即为最佳抗原包被浓度。经试验，确定检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的最佳包被浓度为400倍稀释。
(3)细胞融合、筛选及克隆方案
①饲养细胞的制备
将8～10周龄健康雄性BALB/c小鼠眼球摘除放血，拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即移入超净工作台，腹部朝上固定于解剖板上；用灭菌镊子提起小鼠腹部皮肤，用灭菌剪刀剪一小口，然后用手向上下两侧撕拉皮肤，充分暴漏腹膜；用无菌注射器吸取5mlHAT培养液注入小鼠腹腔，针头不拔出，手持酒精棉球小鼠按摩腹部1～2min，然后抽回腹腔内液体，注入离心管；补加HAT培养液，调整细胞浓度为2×105个/mL；将细胞悬液加入96孔培养板内，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养，备用。
②Sp2/0骨髓瘤细胞的准备
融合前36～48h，将SP2/0细胞扩大培养于100ml细胞培养瓶中，每瓶加10～12ml完全培养液，置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养；融合当天，用10ml弯头吸量管将SP2/0细胞轻轻吹下，吸入50ml离心管中，1000rpm离心10min；用10ml不完全培养液将SP2/0细胞重悬，混匀，加等体积台盼兰溶液作细胞计数，备用。
③脾细胞的准备
选择血清针对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb 效价高而针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA效价低的BABL/c小鼠于融合前3天加强免疫1次。免疫时取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH 5.5的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
融合前取小鼠摘眼球放血(分离血清作检测抗体)，拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即移入超净工作台，无菌打开小鼠腹腔，取出脾脏，除去周围结缔组织，然后用不完全培养液轻轻冲洗；将脾脏移入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于灭菌铜网上，用注射器针柄挤压研磨脾脏，使脾细胞全部进入溶液中；将脾细胞溶液转至50ml离心管中，加不完全培养液30ml，混匀，1000rpm离心10min；用10ml不完全培养液将脾细胞重悬，取脾细胞悬液，加等体积台盼兰溶液作细胞计数，备用。
④细胞融合
分别吸取含1×108个脾细胞和2～3×107个SP2/0细胞的悬液，移入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心8min；弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞均匀松散呈糊状；将离心管置于37℃水浴中，用1ml吸量管吸取0.7ml50％PEG加于离心管，边加边转动离心管，60s内加完；然后立即将细胞悬液吸入吸量管中(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管(时间也控制在30s左右)；立即在5min内加入25ml不完全培养液，边加边转动离心管，终止PEG的融合作用：第1分钟加1ml，第2分钟加4ml，随后3分钟内加完剩余培养液；800rpm离心8min，弃上清，加入50mlHAT培养液，使细胞重悬，混匀。将细胞悬液加入含饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养；融合后第3天补加HAT培养液，50μl/孔；以后根据细胞生长状况每2～3d更换1/3～1/2的培养液，补加等量HAT培养液；融合后第7～14天内换用HT培养液培养，之后换用1640完全培养液培养即可。
⑤阳性细胞株的筛选和克隆
融合后8～9d杂交瘤细胞克隆集落可占据培养孔面积的1/3～1/2，此时即可对杂交瘤上清进行检测。采用已建立的间接ELISA法(同上)，检测抗原为BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb，对照检测抗原为BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。目的杂交瘤细胞的标准为：对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的反应为强阳性，对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的反应为阴性。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单克隆细胞株的培养上清液进行抗体检测，选取阳性的细胞株继续扩大培养并进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％。
⑥上清液与其它金属之间交又反应的测定
按照间接竞争ELISA法检测单克隆抗体与其他金属离子间的交叉反应。检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb作400倍稀释包被于酶标板，螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA分别与浓度系列稀释为10-7mM、10-6mM、10-5mM、10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM、1mM的Cd2+、Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cr2+、In3+、Ni2+、Co2+置37℃反应1h，然后再与待检上清置37℃反应1h；将混合液加于酶标板37℃恒温孵育1h，洗涤；加酶标二抗37℃恒温孵育1h，洗涤；显色，酶标仪测定各孔OD450值。分别构建抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按以下公式计算交叉反应率(CR)：CR＝IC50(Pb2+)/IC50(其它金属离子)×100％。只保留上清液与其他各种金属的交叉反应率低于0.2％的细胞株。
经过上述筛选，得到3株针对Pb2+的特异性细胞株，将其扩大培养、冻存。
(4)单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)0.5ml/只，7-12天后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加12ml PBS(0.02M，pH7.0)，在冰浴中缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌30分钟，置4℃24小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72小时，第一天每4小时换透析液一次，以后每8小时换透析液一次。透析结束后，加等体积甘油，-20℃保存。
3.单克隆抗体亚类的鉴定
以包被原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育1小时，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加HRP标记的马抗羊IgG(1∶5000倍稀释)，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时为阳性。
经过鉴定，所得的3株杂交瘤细胞中，1株分泌的单克隆抗体为IgG，2株为IgM。
4.单克隆抗体的亲和性
①通过夹心ELISA法利用已知浓度羊抗鼠IgG及小鼠IgG标准品测定纯化后的腹水中抗体浓度，即以小鼠IgG标准品系列稀释浓度及其OD值建立标准曲线，然后根据待测腹水OD值计算得出腹水中抗体浓度。
②包被系列稀释的抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb(1mg/ml)(5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml)于酶标板，加入系列稀释且已知抗体浓度的腹水，按间接ELISA法操作，测定反应系统的OD450值，然后以抗体的不同浓度为横坐标，相应OD值为纵坐标建立三条测定曲线。以各曲线最大平缓处OD450值为100％，查出其OD450值为50％时的抗体浓度。然后按公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，公式中[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag’]t时OD450＝1/2OD450max对应的抗体浓度，n为抗原[Ag’]t与[Ag]t间的稀释倍数。
结果表明3株杂交瘤所分泌的抗体亲和常数较高，对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb具有较强的结合能力。
5.纯化抗体与其它金属之间交又反应的测定
同上(上清液与其它金属之间交又反应的测定)。结果表明所得单克隆抗体与其他金属的交叉反应率均低于0.2％。
实施例2
1.免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原的制备
(1)免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb的制备
称取1.7mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.1ml 1mg/ml、pH5.0的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH5.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌。调节pH值为5.0，37℃搅拌反应12小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH5.0的Hepes溶液，每次离心15min。超滤完毕后，补加0.1M、pH5.0的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml。免疫抗原制备完毕，分装，-20℃保存。
(2)检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的制备
称取3.127mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.71ml 1mg/ml、pH5.0的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH5.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌。调节pH值为5.0，37℃搅拌反应12小时，将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH5.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH5.0的Hepes稀释成1mg/ml，分装，于-20℃保存。
(3)对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的制备
称取3.127mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.71ml 0.1M、pH5.0的Hepes溶液中，37℃搅拌0.5小时，然后加入pH5.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌。调节pH值为5.0，37℃搅拌反应12小时，将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH5.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH5.0的Hepes稀释成1mg/ml，分装，于-20℃保存。
2.制备单克隆抗体
(1)小鼠免疫
首免时取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH5.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl10mg/ml、pH5.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
(2)小鼠血清效价测定
①间接ELISA法测定血清效价
4免疫后小鼠断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。将检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA作100倍稀释，按每孔100μl分别包被酶标板，37℃温育1小时，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)150μl/孔，37℃温育1小时，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品4000倍稀释后，再做倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。将酶标二抗(羊抗鼠)以1∶5000倍稀释按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光静置10分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔，用酶标仪测定450nm处OD值。把待检血清OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时的最高血清稀释倍数作为血清效价。四免疫后所有小鼠血清针对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的效价为1∶32000以上，针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的OD值为BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的1/4以下。
②检测抗原最佳包被浓度的测定(方阵间接ELISA法)
用包被缓冲液将检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb作系列倍比稀释即作1∶100…～…1∶6400倍稀释包被于酶标板1～7列孔内；将抗血清用PBS缓冲液(0.01MpH7.4)作系列倍比稀释即作1∶1000…～…1∶32000倍稀释加于包被有检测抗原的酶标板A～F行孔内，按照间接ELISA进行操作，酶标仪测定450nm波长处各孔OD值。OD值最接近1.0时的抗原浓度即为最佳抗原包被浓度。经试验，确定检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的最佳包被浓度为400倍稀释。
(3)细胞融合、筛选及克隆方案
①饲养细胞的制备
将8～10周龄健康雄性BALB/c小鼠眼球摘除放血，拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即移入超净工作台，腹部朝上固定于解剖板上；用灭菌镊子提起小鼠腹部皮肤，用灭菌剪刀剪一小口，然后用手向上下两侧撕拉皮肤，充分暴漏腹膜；用无菌注射器吸取5mlHAT培养液注入小鼠腹腔，针头不拔出，手持酒精棉球小鼠按摩腹部1～2min，然后抽回腹腔内液体，注入离心管；补加HAT培养液，调整细胞浓度为2×105个/mL；将细胞悬液加入96孔培养板内，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养，备用。
②Sp2/0骨髓瘤细胞的准备
融合前36～48h，将SP2/0细胞扩大培养于100ml细胞培养瓶中，每瓶加10～12ml完全培养液，置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养；融合当天，用10ml弯头吸量管将SP2/0细胞轻轻吹下，吸入50ml离心管中，1000rpm离心10min；用10ml不完全培养液将SP2/0细胞重悬，混匀，加等体积台盼兰溶液作细胞计数，备用。
③脾细胞的准备
选择血清针对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb效价高而针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA效价低的BABL/c小鼠于融合前3天加强免疫1次。免疫时取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH5.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
融合前取小鼠摘眼球放血(分离血清作检测抗体)，拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即移入超净工作台，无菌打开小鼠腹腔，取出脾脏，除去周围结缔组织，然后用不完全培养液轻轻冲洗；将脾脏移入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于灭菌铜网上，用注射器针柄挤压研磨脾脏，使脾细胞全部进入溶液中；将脾细胞溶液转至50ml离心管中，加不完全培养液30ml，混匀，1000rpm离心10min；用10ml不完全培养液将脾细胞重悬，取脾细胞悬液，加等体积台盼兰溶液作细胞计数，备用。
④细胞融合
分别吸取含1×108个脾细胞和2～3×107个SP2/0细胞的悬液，移入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心8min；弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞均匀松散呈糊状；将离心管置于37℃水浴中，用1ml吸量管吸取0.7ml50％PEG加于离心管，边加边转动离心管，60s内加完；然后立即将细胞悬液吸入吸量管中(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管(时间也控制在30s左右)；立即在5min内加入25ml不完全培养液，边加边转动离心管，终止PEG的融合作用：第1分钟加1ml，第2分钟加4ml，随后3分钟内加完剩余培养液；800rpm离心8min，弃上清，加入50mlHAT培养液，使细胞重悬，混匀。将细胞悬液加入含饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养；融合后第3天补加HAT培养液，50μl/孔；以后根据细胞生长状况每2～3d更换1/3～1/2的培养液，补加等量HAT培养液；融合后第7～14天内换用HT培养液培养，之后换用1640完全培养液培养即可。
⑤阳性细胞株的筛选和克隆
融合后8～9d杂交瘤细胞克隆集落可占据培养孔面积的1/3～1/2，此时即可对杂交瘤上清进行检测。采用已建立的间接ELISA法(同上)，检测抗原为BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb，对照检测抗原为BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。目的杂交瘤细胞的标准为：对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的反应为强阳性，对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的反应为阴性。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单克隆细胞株的培养上清液进行抗体检测，选取阳性的细胞株继续扩大培养并进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％。
⑥上清液与其它金属之间交又反应的测定
按照间接竞争ELISA法检测单克隆抗体与其他金属离子间的交叉反应。检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb作400倍稀释包被于酶标板，螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA分别与浓度系列稀释为10-7mM、10-8mM、10-5mM、10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM、1mM的Cd2+、Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cr2+、In3+、Ni2+、Co2+置37℃反应1h，然后再与待检上清置37℃反应1h；将混合液加于酶标板37℃恒温孵育1h，洗涤；加酶标二抗37℃恒温孵育1h，洗涤；显色，酶标仪测定各孔OD450值。分别构建抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按以下公式计算交叉反应率(CR)：CR＝IC50(Pb2+)/IC50(其它金属离子)×100％。只保留上清液与其他各种金属的交叉反应率低于0.2％的细胞株。
经过上述筛选，得到2株针对Pb2+的特异性细胞株，将其扩大培养、冻存。
(4)单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)0.5ml/只，7-12天后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加12ml PBS(0.02M，pH7.0)，在冰浴中缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌30分钟，置4℃24小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72小时，第一天每4小时换透析液一次，以后每8小时换透析液一次。透析结束后，加等体积甘油，-20℃保存。
3.单克隆抗体亚类的鉴定
以包被原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育1小时，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加HRP标记的马抗羊IgG(1∶5000倍稀释)，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时为阳性。
经过鉴定，所得的2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均为IgM。
4.单克隆抗体的亲和性
①通过夹心ELISA法利用已知浓度羊抗鼠IgG及小鼠IgG标准品测定纯化后的腹水中抗体浓度，即以小鼠IgG标准品系列稀释浓度及其OD值建立标准曲线，然后根据待测腹水OD值计算得出腹水中抗体浓度。
②包被系列稀释的抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb(1mg/ml)(5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml)于酶标板，加入系列稀释且已知抗体浓度的腹水，按间接ELISA法操作，测定反应系统的OD450值，然后以抗体的不同浓度为横坐标，相应OD值为纵坐标建立三条测定曲线。以各曲线最大平缓处OD450值为100％，查出其OD450值为50％时的抗体浓度。然后按公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，公式中[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag’]t时OD450＝1/2OD450max对应的抗体浓度，n为抗原[Ag’]t与[Ag]t间的稀释倍数。
结果表明2株杂交瘤所分泌的抗体亲和常数较高，BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb具有较强的结合能力。
5.纯化抗体与其它金属之间交又反应的测定
同上(上清液与其它金属之间交又反应的测定)。结果表明所得单克隆抗体与其他金属无交叉反应。
实施例3
1.免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原的制备及检测
(1)免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb的制备
称取1.7mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于0.9ml 1mg/ml、pH6.0的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH6.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌。调节pH值为6.0，37℃搅拌反应12小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH6.0的Hepes溶液，每次离心15min。超滤完毕后，补加0.1M、pH6.0的Hepes溶液，使KLH终浓度为1mg/ml。免疫抗原制备完毕，分装，-20℃保存。
(2)检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的制备
称取3.127mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.71ml 1mg/ml、pH6.0的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH6.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌。调节pH值为6.0，37℃搅拌反应12小时，将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH6.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH6.0的Hepes稀释成1mg/ml，分装，于-20℃保存。
(3)对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的制备
称取3.127mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于1.71ml 0.1M、pH6.0的Hepes溶液中，37℃搅拌0.5小时，然后加入pH6.0、1％戊二醛溶液2ml，37℃搅拌反应0.5小时。将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的BSA溶液中，边加边搅拌。调节pH值为6.0，37℃搅拌反应12小时，将反应液转移至截留分子量为30000dal超滤管中，7500g离心15min，用0.1M、pH6.0的Hepes溶液洗涤，如此反复进行超滤6次，再用0.1M、pH6.0的Hepes稀释成1mg/ml，分装，于-20℃保存。
(4)免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原的检测
对免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA进行190-500nm进行全波长扫描，判断螯合剂与载体蛋白相比是否发生吸收峰漂移。在本发明的实施例1中，KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、KLH的紫外扫描结果见图1，BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA、BSA的紫外扫描结果见图2。螯合后最大吸收峰与载体蛋白性比较发生漂移，说明免疫抗原、检测抗原、对照检测抗原合成成功。
用石墨炉院子吸光光度法测免疫抗原KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb中Pb的含量。在本发明的实施例1中，KLH-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb中Pb含量为40.00μg/mg，检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb中Pb含量达34.6μg/mg。进一步说明免疫抗原、检测抗原合成成功。
2.制备单克隆抗体
(1)小鼠免疫
首免时取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH6.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
二免及以后免疫取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl10mg/ml、pH6.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，然后加入弗氏不完全佐剂110μl，乳化，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。每两周免疫一次。
(2)小鼠血清效价测定
①间接ELISA法测定血清效价
4免疫后小鼠断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。将检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb、对照检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA作100倍稀释，按每孔100μl分别包被酶标板，37℃温育1小时，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)150μl/孔，37℃温育1小时，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品4000倍稀释后，再做倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。将酶标二抗(羊抗鼠)以1∶5000倍稀释按100μl/孔加入，37℃温育1小时，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光静置10分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔，用酶标仪测定450nm处OD值。把待检血清OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时的最高血清稀释倍数作为血清效价。四免疫后所有小鼠血清针对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的效价为1∶32000以上，针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的OD值为BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的1/4以下。
②检测抗原最佳包被浓度的测定(方阵间接ELISA法)
用包被缓冲液将检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb作系列倍比稀释即作1∶100…～…1∶6400倍稀释包被于酶标板1～7列孔内；将抗血清用PBS缓冲液(0.01MpH7.4)作系列倍比稀释即作1∶1000…～…1∶32000倍稀释加于包被有检测抗原的酶标板A～F行孔内，按照间接ELISA进行操作，酶标仪测定450nm波长处各孔OD值。OD值最接近1.0时的抗原浓度即为最佳抗原包被浓度。经试验，确定检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的最佳包被浓度为400倍稀释。
(3)细胞融合、筛选及克隆方案
①饲养细胞的制备
将8～10周龄健康雄性BALB/c小鼠眼球摘除放血，拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即移入超净工作台，腹部朝上固定于解剖板上；用灭菌镊子提起小鼠腹部皮肤，用灭菌剪刀剪一小口，然后用手向上下两侧撕拉皮肤，充分暴漏腹膜；用无菌注射器吸取5mlHAT培养液注入小鼠腹腔，针头不拔出，手持酒精棉球小鼠按摩腹部1～2min，然后抽回腹腔内液体，注入离心管；补加HAT培养液，调整细胞浓度为2×105个/mL；将细胞悬液加入96孔培养板内，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养，备用。
②Sp2/0骨髓瘤细胞的准备
融合前36～48h，将SP2/0细胞扩大培养于100ml细胞培养瓶中，每瓶加10～12ml完全培养液，置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养；融合当天，用10ml弯头吸量管将SP2/0细胞轻轻吹下，吸入50ml离心管中，1000rpm离心10min；用10ml不完全培养液将SP2/0细胞重悬，混匀，加等体积台盼兰溶液作细胞计数，备用。
③脾细胞的准备
选择血清针对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb效价高而针对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA效价低的BABL/c小鼠于融合前3天加强免疫1次。免疫时取100μl 1mg/ml KLH-NH-Bn-CHX-A″-DTPA-Pb，加入10μl 10mg/ml、pH6.0的Pb(NO3)2溶液振荡2分钟，供1只小鼠1次腹腔注射免疫。
融合前取小鼠摘眼球放血(分离血清作检测抗体)，拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精溶液中5min，随即移入超净工作台，无菌打开小鼠腹腔，取出脾脏，除去周围结缔组织，然后用不完全培养液轻轻冲洗；将脾脏移入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于灭菌铜网上，用注射器针柄挤压研磨脾脏，使脾细胞全部进入溶液中；将脾细胞溶液转至50ml离心管中，加不完全培养液30ml，混匀，1000rpm离心10min；用10ml不完全培养液将脾细胞重悬，取脾细胞悬液，加等体积台盼兰溶液作细胞计数，备用。
④细胞融合
分别吸取含1×108个脾细胞和2～3×107个SP2/0细胞的悬液，移入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心8min；弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞均匀松散呈糊状；将离心管置于37℃水浴中，用1ml吸量管吸取0.7ml50％PEG加于离心管，边加边转动离心管，60s内加完；然后立即将细胞悬液吸入吸量管中(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管(时间也控制在30s左右)；立即在5min内加入25ml不完全培养液，边加边转动离心管，终止PEG的融合作用：第1分钟加1ml，第2分钟加4ml，随后3分钟内加完剩余培养液；800rpm离心8min，弃上清，加入50mlHAT培养液，使细胞重悬，混匀。将细胞悬液加入含饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、含5％～8％CO2培养箱内培养；融合后第3天补加HAT培养液，50μl/孔；以后根据细胞生长状况每2～3d更换1/3～1/2的培养液，补加等量HAT培养液；融合后第7～14天内换用HT培养液培养，之后换用1640完全培养液培养即可。
⑤阳性细胞株的筛选和克隆
融合后8～9d杂交瘤细胞克隆集落可占据培养孔面积的1/3～1/2，此时即可对杂交瘤上清进行检测。采用已建立的间接ELISA法(同上)，检测抗原为BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb，对照检测抗原为BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA，免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。目的杂交瘤细胞的标准为：对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb的反应为强阳性，对BSA-NH-Bn-CHX-A″-DTPA的反应为阴性。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单克隆细胞株的培养上清液进行抗体检测，选取阳性的细胞株继续扩大培养并进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％。
⑥上清液与其它金属之间交又反应的测定
按照间接竞争ELISA法检测单克隆抗体与其他金属离子间的交叉反应。检测抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb作400倍稀释包被于酶标板，螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA分别与浓度系列稀释为10-7mM、10-6mM、10-5mM、10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM、1mM的Cd2+、Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cr2+、In3+、Ni2+、Co2+置37℃反应1h，然后再与待检上清置37℃反应1h；将混合液加于酶标板37℃恒温孵育1h，洗涤；加酶标二抗37℃恒温孵育1h，洗涤；显色，酶标仪测定各孔OD450值。分别构建抑制标准曲线，并计算各自的IC50，按以下公式计算交叉反应率(CR)：CR＝IC50(Pb2+)/IC50(其它金属离子)×100％。只保留上清液与其他各种金属的交叉反应率低于0.2％的细胞株。
经过上述筛选，得到2株针对Pb2+的特异性细胞株，将其扩大培养、冻存。
(4)单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)0.5ml/只，7-12天后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加12ml PBS(0.02M，pH7.0)，在冰浴中缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌30分钟，置4℃24小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4ml PBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72小时，第一天每4小时换透析液一次，以后每8小时换透析液一次。透析结束后，加等体积甘油，-20℃保存。
3.单克隆抗体亚类的鉴定
以包被原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育1小时，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加HRP标记的马抗羊IgG(1∶5000倍稀释)，室温孵育0.5小时，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15分钟，加终止液(2M H2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2.1倍时为阳性。
经过鉴定，所得的2株杂交瘤细胞中，1株分泌的单克隆抗体为IgG，1株为IgM。
4.单克隆抗体的亲和性
①通过夹心ELISA法利用已知浓度羊抗鼠IgG及小鼠IgG标准品测定纯化后的腹水中抗体浓度，即以小鼠IgG标准品系列稀释浓度及其OD值建立标准曲线，然后根据待测腹水OD值计算得出腹水中抗体浓度。
②包被系列稀释的抗原BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb(1mg/ml)(5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml)于酶标板，加入系列稀释且已知抗体浓度的腹水，按间接ELISA法操作，测定反应系统的OD450值，然后以抗体的不同浓度为横坐标，相应OD值为纵坐标建立三条测定曲线。以各曲线最大平缓处OD450值为100％，查出其OD450值为50％时的抗体浓度。然后按公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，公式中[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag’]t时OD450＝1/2OD450max对应的抗体浓度，n为抗原[Ag’]t与[Ag]t间的稀释倍数。
结果表明2株杂交瘤所分泌的抗体亲和常数较高，对BSA-NH-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb具有较强的结合能力。
5.纯化抗体与其它金属之间交又反应的测定
同上(上清液与其它金属之间交又反应的测定)。结果表明所得单克隆抗体与其他金属的交叉反应率均低于0.2％。
Claims (1)
1.一种Pb2+完全免疫抗原的制备方法，包括以下步骤：称取1.7mg螯合剂p-NH2-Bn-CHX-A″-DTPA溶于0.9-1.1ml 1mg/ml、pH 5.0-6.0的Pb(NO3)2溶液中，37℃搅拌反应1小时，然后加入pH 5.0-6.0、1％戊二醛溶液1ml，37℃搅拌反应0.5小时；将上述反应后的混合液逐滴加入到2ml浓度为5mg/ml的KLH溶液中，边加边搅拌；调节pH值为5.0-6.0，37℃搅拌反应12小时，选用截留分子量为30000dal的超滤离心管、7500g超滤6次，洗涤液为0.1M、pH 5.0-6.0的Hepes缓冲液，每次离心15min；超滤完毕后，补加0.1M、pH 5.0-6.0的Hepes缓冲液，使KLH终浓度为1mg/ml，得到完全抗原。
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