CN101845097A - 一种海洋贝毒素单抗制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于：制备小分子贝毒素单抗用于动物免疫和杂交瘤细胞筛选的抗原为同一偶联物，减少了常规小分子物质单抗制备方法中免疫原与检测原不同制备的麻烦与浪费；并采用了正筛法和负筛法相结合的筛选法进行单抗杂交瘤细胞的筛选，可减少大量标准抗原的消耗，其筛选的杂交瘤细胞分泌的抗体具有较好的抗原竞争活性。本发明积极效果是抗原制备简单、标准抗原用量小，节约成本，抗体竞争活性好。
Description
技术领域：
本发明涉及一种海洋贝毒素单抗制备方法，用于小分子食品污染物单克隆抗体制备过程中杂交瘤细胞株的筛选，特别是针对海洋贝毒素中的腹泻性贝毒素大田软海绵酸单克隆抗体制备。
背景技术：
近年来，全球气候变暖、赤潮频发，海洋贝毒素引发的海产品安全问题日益严重，已成为公共卫生和进出口检验检疫中值得关注的重大问题。导致食源性中毒的海洋贝毒素多来源于某些藻类，通过食物链蓄积于贝、螺等海产品中，毒性放大，多数毒素性质非常稳定，一般加工处理不能破坏，由误食有毒海产品而引发中毒的事件时有发生，毒素对机体具有致癌、致畸、致突变等毒性作用，且中毒后无特效药救治。因此开展海洋贝毒素的快速检测方法，确保海产品食用安全具有重要的公共卫生意义。目前最常用、最成熟的方法是高效液相或液质联用技术。但此项技术所需仪器设备价格昂贵，样品前处理过程困难，需要专业的人员操作，不适于现场携带使用等缺点。人们正在积极探索研究海洋贝毒素的免疫学方法，此法常以单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)为探针，采用竞争方式，被公认为是一种快速、灵敏、经济、实用的检测方法，已有多种海洋毒素全安检测试剂盒商品化。免疫学方法的建立最关键的步骤就是抗体的获得。而单克隆抗体由于理化性状高度均一，与抗原结合的特异性强、容易大量获得，因此在免疫学检测中备受青眯。对于海洋贝毒素类食品污染物来说，其分子量小，结构简单，不能刺激机体产生抗体，因此若想制备其单抗，必须将其与大的载体蛋白偶联，使其成为载体蛋白上的一个抗原表位，借助载体效应激活T淋巴细胞，进而使B细胞活化并分泌针对小分子的抗体。在常规单抗制备过程中，要采用免疫原进行免疫，检测原(与免疫原载体不同)进行检测，需制备两种偶联物，麻烦又浪费；免疫脾细胞与SP20细胞融合后要进行大量的筛选工作，多数融合的杂交瘤分泌的抗体均是针对载体蛋白，针对小分子抗体的杂交瘤数量很少，常规利用检测原进行筛选会消耗大量标准物质；另外由于海洋生物毒素制备困难，价格昂贵，据调查腹泻性贝毒大田软海绵酸1mg最高时达两万多元人民币，石房蛤毒素竞高达十几万元。要想获得这类物质的一株单抗顺利的话至少也需数十万元，而标准品的消耗主要体现在杂交瘤细胞的筛选上，很多研究均因为标准抗原用量大引起的资金问题限制了其免疫学方法的建立。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种海洋贝毒素单抗制备方法，解决昂贵小分子海洋贝毒素在单克隆抗体制备过程中杂交瘤的筛选消耗大量标准抗原问题，其改进了常规小分子单抗制备过程中两种抗原的使用与抗体杂交瘤细胞的筛选方法，免疫抗原与检测抗原只需一种偶联物，不但能够节省大量的抗原标准物，而且获得的抗体与抗原的结合活性好，用改进后的方法制备的海洋贝毒素大田软海绵酸的单抗，具体采用活泼酯法合成大田软海绵酸与载体蛋白的偶联物作为免疫原兼检测原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，利用改进的方法对融合细胞所分泌的抗体进行筛选；经过3次克隆，获得1株可稳定分泌抗OA的杂交瘤细胞株，该株杂交瘤细胞分泌的抗体属于IgG1亚类，相对分子质量约为160kD，抗体滴度为2.56×106，抗体亲和力为9.0×108L/mol，与软骨藻酸、膝钩藻毒素1/4、膝钩藻毒素2/3、石房蛤毒素、微囊藻毒素、节球藻毒素、河豚毒素等非腹泻性贝毒没有交叉反应，不但节约大量的标准抗原，而且获得的抗体能够用于ELISA等免疫学方法的建立。
本发明的技术方案是这样实现的：一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于：制备小分子贝毒素单抗用于动物免疫和杂交瘤筛选的抗原为同一偶联物，并采用了正筛法和负筛法相结合的筛选法进行小分子贝毒素单抗杂交瘤细胞的筛选，其步骤如下：
(1)、抗原的制备
采用活泼酯法制备免疫原兼检测原，操作方法如下：1mg贝毒素大田软海绵酸OA、0.155mg N-羟丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100μLN，N二甲基甲酰胺N，N-DMF中混均，室温孵育2h，以载体蛋白与小分子物质摩尔比为1∶20～1∶50的比例加入载体蛋白，并试先用50μL 0.1mol/L NaHCO3溶解，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用一定体积的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，-20℃保存备用；
(2)、动物免疫与效价测定
采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用100μg偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d；3周后再用100μg偶联抗原与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量偶联抗原重复腹腔加强免疫；用载体竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下：偶联抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入载体蛋白(1μg/mL)与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照；
(3)、细胞融合与筛选
效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
①负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3min；加入细胞培养上清液100μL，37℃板反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
②正筛选择针对OA的目标克隆：用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂交瘤细胞：用偶联抗原包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值；用阴性和阳性血清作对照，选择阳性克隆进入下一轮筛选；
③竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用偶联抗原(1μg/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
所述的海洋贝毒素是腹泻性贝毒素大田软海绵酸，所述的免疫原兼检测原为大田软海绵酸与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)或人免疫球蛋白(hIgG)等经活泼酯法制备的偶联物；其大田软海绵酸单克隆抗体属于IgG1亚类，相对分子质量约为160kD，抗体滴度为2.56×106，抗体亲和力为9.0×108L/mol。
所述的在单抗杂交瘤细胞筛选过程中采用了正筛负筛相结合的筛选法，即先用载体蛋白对融合杂交瘤细胞进行筛选，去除大量针对载体蛋白呈阳性的杂交瘤细胞株；阴性克隆继续用免疫原兼检测原与标准品竞争筛选针对目标毒素的杂交瘤。
本发明的积极效果是减少了常规方法中免疫原与检测原采用不同制备的麻烦与浪费，尤其是在杂交瘤筛选过程中利用载体负筛法选择去除大量阴性克隆，利用正筛及抗原竞争筛选法选择优异阳性克隆，筛选的杂交瘤细胞分泌的抗体具有较好的抗原竞争能力，减少了大量标准抗原的消耗，具有制备简单方便、抗原用量小，节约成本，抗体竞争活性好等优点。
具体实施方式：
下面结合腹泻性贝毒素大田软海绵酸单克隆抗体制备实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1：
1.OA-BSA抗原的制备：
大田软海绵酸：Okadaic Acid，OA
牛血清白蛋白：Bovine Serum Albumi，BSA
采用活泼酯法制备免疫原兼检测原OA-BSA，操作方法如下：1mg大田软海绵酸OA、0.155mg N-羟丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100μL N，N二甲基甲酰胺(N，N-DMF)中混均，室温孵育2h，加入4mg牛血清白蛋白BSA(溶于50μL 0.1mol/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用400μL的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，使其蛋白浓度为10mg/mL，-20℃保存备用。
2.动物免疫与效价测定
采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μgOA-BSA与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d；3周后再用100μgOA-BSA与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量OA-BSA重复腹腔加强免疫；用BSA竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下：OA-BSA用0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入BSA(1μg/mL)与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。
3.细胞融合与筛选
效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体抗原BSA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3min；加入细胞培养上清液100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
(2)正筛选择针对OA的目标克隆：用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用OA-BSA(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用OA-BSA(1μg/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
4.腹水制备与抗体特性研究
将高压灭菌的石蜡油注射到10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔0.5～1.0mL/只，1周后再注入2×106个杂交瘤细胞。根据小鼠的腹部膨大情况，10～14d后收集腹水，间接ELISA方法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析，利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量；用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。根据文献计算亲和常数；用竞争ELISA法对相关类似毒素作交叉反应测定。
实施例2：
1.OA-OVA抗原的制备
大田软海绵酸：Okadaic Acid，OA
卵清蛋白：Ovalbumin，OVA
采用活泼酯法制备免疫原兼检测原OA-OVA，操作方法如下：1mg大田软海绵酸OA、0.155mg N-羟丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100μL N，N二甲基甲酰胺(N，N-DMF)中混均，室温孵育2h，加入2.5mg OVA(溶于50μL 0.1mol/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用250μL的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，使其蛋白浓度为10mg/mL，-20℃保存备用。
2.动物免疫与效价测定
采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μgOA-OVA与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d；3周后再用100μgOA-OVA与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量OA-OVA重复腹腔加强免疫；用OVA竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下：OA-OVA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入OVA(1μg/mL)与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。
3.细胞融合与筛选
效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体抗原OVA用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3min；加入细胞培养上清液100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
(2)正筛选择针对OA的目标克隆：用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用OA-OVA(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用OA-OVA(1μg/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
4.腹水制备与抗体特性研究
将高压灭菌的石蜡油注射到10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔0.5～1.0mL/只，1周后再注入2×106个杂交瘤细胞。根据小鼠的腹部膨大情况，10～14d后收集腹水，间接ELISA方法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析，利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量；用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。根据文献计算亲和常数；用竞争ELISA法对相关类似毒素作交叉反应测定。
实施例3：
1.OA-hIgG抗原的制备
大田软海绵酸：Okadaic Acid，OA
人免疫球蛋白：human immunoglobulin G，hIgG
采用活泼酯法制备免疫原兼检测原OA-hIgG，操作方法如下：1mg大田软海绵酸OA、0.155mg N-羟丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100μL N，N二甲基甲酰胺(N，N-DMF)中混均，室温孵育2h，加入4.0mg hIgG(溶于50μL 0.1mol/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用400μL的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，使其蛋白浓度为10mg/mL，-20℃保存备用。
2.动物免疫与效价测定
采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μgOA-hIgG与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d；3周后再用100μgOA-hIgG与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量OA-hIgG重复腹腔加强免疫；用hIgG竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下：OA-hIgG用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至0.5μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入hIgG(0.5μg/mL)与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。
3.细胞融合与筛选
效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体抗原hIgG用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至0.5μg/mL，4℃过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3min；加入细胞培养上清液100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
(2)正筛选择针对OA的目标克隆：用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用OA-hIgG(0.5μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用OA-hIgG(0.5μg/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
4.腹水制备与抗体特性研究
将高压灭菌的石蜡油注射到10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔0.5～1.0mL/只，1周后再注入2×106个杂交瘤细胞。根据小鼠的腹部膨大情况，10～14d后收集腹水，间接ELISA方法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析，利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量；用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。根据文献计算亲和常数；用竞争ELISA法对相关类似毒素作交叉反应测定。
Claims (3)
1.一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于：制备小分子贝毒素单抗用于动物免疫和杂交瘤筛选的抗原为同一偶联物，并采用了正筛法和负筛法相结合的筛选法进行小分子贝毒素单抗杂交瘤细胞的筛选，其步骤如下：
(1)、抗原的制备
采用活泼酯法制备免疫原兼检测原，操作方法如下：1mg贝毒素大田软海绵酸OA、0.155mg N-羟丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100μL N，N二甲基甲酰胺N，N-DMF中混均，室温孵育2h，以载体蛋白与小分子物质摩尔比为1∶20～1∶50的比例加入载体蛋白，并试先用50μL 0.1mol/LNaHCO3溶解，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用一定体积的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，-20℃保存备用；
(2)、动物免疫与效价测定
采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μg偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d；3周后再用100μg偶联抗原与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量偶联抗原重复腹腔加强免疫；用载体竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下：偶联抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，每次3min；加入载体蛋白1μg/mL与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照；
(3)、细胞融合与筛选
效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
①负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体抗原用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3min；加入细胞培养上清液100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
②正筛选择针对OA的目标克隆：用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用偶联抗原1μg/mL包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
③竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用偶联抗原1μg/mL包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品20ng/mL与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应40min；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG1：4000，每孔100μL，37℃，30min，洗板3次；加邻苯二胺OPD显色液，每孔100μL，37℃，10-15min；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于所述的海洋贝毒素是腹泻性贝毒素大田软海绵酸，所述的免疫原兼检测原为大田软海绵酸与载体蛋白牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA或人免疫球蛋白hIgG等经活泼酯法制备的偶联物；其大田软海绵酸单克隆抗体属于IgG1亚类，相对分子质量约为160kD，抗体滴度为2.56×106，抗体亲和力为9.0×108L/mol。
3.根据权利要求1所述的一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于所述的在单抗杂交瘤细胞筛选过程中采用了正筛负筛相结合的筛选法，即先用载体蛋白对融合杂交瘤细胞进行筛选，去除大量针对载体蛋白呈阳性的杂交瘤细胞株；阴性克隆继续用免疫原兼检测原与标准品竞争筛选针对目标毒素的杂交瘤。
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