CN101845094B

CN101845094B - 一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN101845094B
Application number: CN2010103013556A
Authority: CN
Inventors: 李泳宁; 郭养浩; 汪媛媛
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2030-02-08
Also published as: CN101845094A

Abstract

本发明涉及了一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。该方法用桔霉素先与双交联试剂(C₂H₃O)-(CH₂)n-(C₂H₃O)进行反应，然后与载体进行偶联，反应后用甘氨酸进行封闭，最后经分离纯化得到桔霉素载体偶联抗原。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌的抗桔霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素的单克隆抗体。本发明制备条件温和、操作简且过程可控，所获得的抗桔霉素单克隆抗体特异性高、亲和力强，可用于进一步制备桔霉素检测的酶联免疫检测试剂盒或试纸卡。

Description

一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及了一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

桔霉素或桔青霉素是由青霉、曲霉、红曲霉等丝状真菌产生的毒素，具有严重肝肾毒性以及致畸、致癌和致突变作用。近年来的调查研究发现，许多食品和农产品中都可检测到桔霉素，主要原因是与玉米、大米、面包、奶酪、苹果、梨等农产品或食品的霉变有关。因此，桔霉素引起的食品安全问题越来越受到人们的关注。

红曲霉菌在我国的应用源远流长，用红曲菌发酵可生产多种中国传统食品，如红曲酒、红腐乳、红曲米等。桔霉素是真菌的次级代谢产物，常伴随在红曲色素中产生，在大部分红曲发酵产品中，桔霉素含量高达欧盟标准的几十到几百倍。出于食品安全的考虑，桔霉素已被欧洲各国列为必检毒素之一。

酶联免疫检测法是目前最为灵敏、方便的方法。以单克隆抗体为基础的酶免疫检测方法是桔霉素检测发展的方向。桔霉素是小分子化合物，属于半抗原，不能有效地刺激机体产生免疫应答反应。桔霉素必须和大分子载体偶联反应后制成人工偶联抗原才能激发有效的免疫反应。桔霉素分子量较小(250.3Da)，结构比较简单，含有三个活性基团，分别是C₁位置的活泼氢、C₇位置的羧基和C₈位置的羟基。在偶联反应过程中如何保证抗原决定簇基团未被破坏，是关键性技术，制备免疫原性强、能刺激机体产生高亲和力和高效价抗桔霉素特异性抗体的人工抗原的难度较大。

目前报导的用于桔霉素-蛋白偶联抗原制备的方法有活性酯法、甲醛加成法和羰基二咪唑法等。活性酯法利用了桔霉素C₇位置的羧基基团进行偶联反应，许杨等在专利《桔霉素免疫层析检测试纸及制备方法与应用(CN1603823A)》中采用该法制备了桔霉素-蛋白的人工抗原作为检测抗原或免疫抗原，获得的抗体在免疫层析检测试纸中进行应用，但免疫层析检测试纸只能用定性检测，定量检测所用的试剂盒仍需从国外进口，检测费用极其昂贵。甲醛加成法则利用了桔霉素C₁位置的活泼氢进行偶联反应，但该方法反应的pH接近蛋白的等电点，常引起蛋白的大量沉淀，降低了溶液中偶联产物的得率。羰基二咪唑法则利用了桔霉素C₈位置的羟基进行偶联反应，刘仁荣等在文献(刘仁荣，余宙，何庆华等.抗桔青霉素单克隆抗体的研制与鉴定.卫生研究，2007，36(2)：190-193)中报导采用该法制备了桔霉素蛋白偶联物并免疫小鼠，但未能获得针对桔霉素的特异性抗体。可见，在偶联反应过程中如何保证抗原决定簇基团未被破坏，是关键性技术。

目前国内尚无商品化的桔霉素ELISA检测试剂盒，仅有能用于定性检测的桔霉素检测试纸(许杨CN1603823A)，其主要原因是无法制备高亲和力和高特异性的抗桔霉素抗体，因此合成较强免疫原性的抗原，制备高亲和力和高特异性的抗桔霉素抗体具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反应条件温和、操作简单的桔霉素-蛋白偶联抗原的合成方法以及免疫原性强、能刺激机体产生高亲和力和高效价抗桔霉素的高特异性抗体的制备方法，可用于进一步制备能对桔霉素检测进行定量分析的酶联免疫检测试剂盒或试纸卡。

本发明采用双交联试剂(C₂H₃O)-(CH₂)_n-(C₂H₃O)为偶联剂。桔霉素先与双交联试剂进行反应，然后与大分子载体进行偶联，反应后用甘氨酸进行封闭，最后经分离纯化得到桔霉素载体偶联抗原。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌抗桔霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素的单克隆抗体。

具体的制备方法包括以下步骤：

桔霉素的活化：将0.5～10mg桔霉素(购自美国sigma公司)溶解于0.5～10ml的0.6mol/l氢氧化钠溶液中，加入0.5～10ml的2mg/ml硼氢化钠溶液，摇匀后，再加入0.5～10μl的双交联试剂，室温下反应4～10小时；

桔霉素载体偶联反应：加入30～600mg碳酸钠，调节pH9.0～11.0，然后按桔霉素与载体初始摩尔比为10/1～1000/1加入载体，混匀完全后，置于37℃振摇反应，反应24～48小时；

甘氨酸封闭：偶联反应后，加入100～2000mg甘氨酸进行封闭，置于37℃振摇反应，反应24～48小时；

分离纯化：将反应液取出，采用G-25凝胶柱洗脱或透析，收集洗脱液或透析袋内溶液，进行紫外全波长扫描，检测278nm和319nm波长的吸收值，计算偶联比，并将偶联物冷冻干燥后，-20℃保存；

动物免疫：用制备的免疫抗原，免疫小鼠。首次免疫将免疫抗原与福氏完全佐剂(按1∶1体积比例)混合，进行腹腔注射。此后，每隔2周加强免疫一次，将免疫抗原与福氏不完全佐剂(按1∶1体积比例)混合，免疫方法同首免，共免疫4次；

细胞融合：采用聚乙二醇(PEG)化学融合法取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合；

杂交瘤细胞的筛选及克隆化：采用有限稀释法对阳性的杂交瘤细胞进行克隆化培养；

抗桔霉素单克隆抗体的生产及纯化：采用动物体内生产法接种杂交瘤细胞，制备腹水。腹水采用正辛酸-硫酸铵盐析法或PEG法进行纯化，获得抗桔霉素的单克隆抗体。纯化后的单克隆抗体经检测效价后分装，置于-20℃保存。

其中双交联试剂为(C₂H₃O)-(CH₂)_n-(C₂H₃O)，n＝2～12，(C₂H₃O)为环氧基团，双交联试剂优选1，4-丁二醇二缩水甘油醚。所用的蛋白载体为天然蛋白质或含氨基的蛋白化合物或糖化合物或高分子化合物，其分子量为20～1200Kda，包括牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)或匙孔贝血蓝蛋白(KLH)或其他带有氨基的蛋白化合物或糖化合物或高分子化合物中的一种。

本方法的有益效果：

(1)本发明所提供的双交联化学合成法是一种新型的桔霉素-蛋白偶联抗原制备方法，其优点是可在桔霉素与载体蛋白之间形成一定长度的连接空间臂，减少桔霉素与蛋白结合过程的空间位阻效应，使交联物结构紧凑，同时保持一定的伸展和旋转空间，有助于改善所得抗体的特异性。而且双环氧试剂分子中有多个氧原子，结合产物中不会引入疏水基团，不会降低产物的溶解度。该方法还具有制备条件温和、操作简便、过程可控等特点。

(2)本发明所制备的桔霉素人工偶联抗原具有较强的免疫原性，采用杂交瘤细胞技术，筛选获得稳定分泌高产抗桔霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获得大量特异性高、亲和力强的抗桔霉素单克隆抗体。本发明制备的抗桔霉素单克隆抗体特异性高、亲和力强，可用于进一步制备能对桔霉素检测进行定量分析的酶联免疫检测试剂盒或试纸卡。

附图说明

附图为桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法及其抗桔霉素单克隆抗体的制备方法流程示意图。

具体实施方式

实施例1：

桔霉素-牛血清白蛋白(CIT-BSA)免疫抗原的制备

0.5毫克桔霉素溶于0.5毫升氢氧化钠(0.6摩尔/升)中，加入0.5毫升硼氢化钠溶液(2毫克/毫升)，再加入0.5微升1，4-丁二醇二缩水甘油醚进行活化，室温下振摇反应4小时；加入31.8毫克碳酸钠，调节pH至9.0，加入5毫克牛血清白蛋白，37℃偶联反应24小时；反应结束，加入100毫克的甘氨酸进行封闭，置于37℃振摇反应48小时。将反应产物溶液过G-25层析柱进行纯化，用磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升，pH 7.4)洗脱，收集的第一个洗脱峰即为目标产物CIT-BSA。偶联产物CIT-BSA采用紫外全波长扫描仪进行分析，偶联抗原CIT-BSA的紫外图谱同时出现两个特征吸收峰(278nm和326nm)，其中278nm处的吸收峰与BSA的特征吸收峰相一致，在319～326nm存在明显肩部，与CIT吸收峰319nm对比，存在一定的位移，计算得CIT/BSA的偶联比为8.16。实验结果表明，双交联法成功合成了CIT-BSA偶联抗原。

实施例2：

桔霉素卵清蛋白(CIT-OVA)检测抗原的制备

10毫克桔霉素溶于10毫升氢氧化钠(0.6摩尔/升)中，加入10毫升硼氢化钠(2毫克/毫升)，再加入10微升1，4-丁二醇二缩水甘油醚进行活化，室温下振摇反应10小时；加碳酸钠调节pH至9.0，加入43毫克卵清蛋白，37℃偶联反应24小时；反应结束，加入200毫克的甘氨酸进行封闭，置于37℃振摇反应48小时。将反应产物溶液采用0.01mol/L PBS(pH 7.4)缓冲液中4℃透析2天，中间更换透析液3次。收集的透析袋中的反应液即为目标产物CIT-OVA。偶联产物CIT-OVA采用紫外全波长扫描仪进行分析，偶联产物CIT-OVA在279nm有明显的特征吸收峰，对应于OVA(279nm)的吸收峰，而319～328nm之间的吸收峰是偶联产物中CIT的特征吸收峰，计算得CIT/OVA的偶联比为5.80。实验结果表明，双交联法成功合成了CIT-OVA偶联抗原。

实施例3：

桔霉素-匙孔贝血蓝蛋白(CIT-KLH)检测抗原的制备

5毫克桔霉素溶于5毫升氢氧化钠(0.6摩尔/升)中，加入5毫升硼氢化钠溶液(2毫克/毫升)，再加入5微升1，4-丁二醇二缩水甘油醚进行活化，室温下振摇反应8小时；加碳酸钠调节pH至10.0，加入30毫克匙孔贝血蓝蛋白，37℃偶联反应24小时；反应结束，加入1000毫克的甘氨酸进行封闭，置于37℃振摇反应48小时。将反应产物溶液过G-25层析柱进行纯化，用磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升，pH 7.4)洗脱，收集的第一个洗脱峰即为目标产物CIT-KLH。偶联产物CIT-KLH采用紫外全波长扫描仪进行分析，偶联抗原CIT-BSA的紫外图谱同时出现两个特征吸收峰(278nm和326nm)，其中278nm处的吸收峰与KLH的特征吸收峰相一致，在319～326nm存在明显肩部，与CIT吸收峰319nm对比，存在一定的位移，计算得CIT/KLH的偶联比为52.3。实验结果表明，双交联法成功合成了CIT-KLH偶联抗原。

实施例4：

利用PEG法制备抗桔霉素单克隆抗体

(1)、小鼠免疫：选6只8～10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射CIT-BSA偶联抗原0.5毫升/只·次，首次免疫将免疫抗原与福氏完全佐剂(按体积1∶1比例)混合，进行腹腔注射。此后，每隔2周加强免疫一次，将免疫抗原与福氏不完全佐剂(按体积1∶1比例)混合，免疫方法同首免，共免疫4次。

(2)、多克隆抗体的测定：断尾取血，将血样置4℃过夜，3000rpm离心10min，收集上清，此即抗血清。采用CIT-OVA作为检测抗原，对抗血清中抗CIT的多抗的效价进行检测。采用间接非竞争ELISA检测多抗的效价，采用间接竞争ELISA检测抗血清中抗体的特异性。本发明制备的多克隆抗体的效价达到1∶1.1×10⁵，竞争ELISA法检测结果表明，本发明制备的CIT-BSA抗原免疫小鼠获得的抗桔霉素多克隆抗体的特异性高，IC₅₀达到100ng/mL。

(3)、细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞，按5∶1细胞数量比例与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以50％(体积)PEG6000作融合剂。细胞重悬浮于50毫升HAT培养液中，接种于5块含有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1毫升，置37℃、5％CO₂的培养箱中培养。用间接非竞争ELISA对细胞培养上清液中的抗体进行检测。检测抗原采用双交联法制备CIT-OVA抗原，阳性对照为阳性血清，阴性对照为SP2/0细胞的上清液，阳性孔的判定标准为(测定孔值-空白值)/(阴性孔值-空白值)≥2.1。

(4)、杂交瘤细胞的筛选及克隆化：采用有限稀释法对阳性的杂交瘤细胞进行克隆化培养。制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用HT培养液稀释至每mL大概含50、10和5个细胞。分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的培养板中，每孔0.1毫升。置37℃、5％CO₂的培养箱中培养，培养8天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体。对阳性单克隆再进行克隆化培养，经过4次克隆化，检测到100％的克隆分泌特异性抗体。将阳性克隆扩大培养，保种后置于-80℃保存。本发明筛选得到一株稳定分泌抗桔霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞H2-F8。

(5)、抗桔霉素单克隆抗体的生产及纯化：采用动物体内生产单抗的方法。每只BALB/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5毫升，10天后可供腹腔注射杂交瘤细胞。收集杂交瘤细胞，离心，去上清液，加入不完全1640培养基，调节细胞密度至2×10⁶个/毫升，每只小鼠腹腔注射0.5毫升。10天后观察小鼠腹水产生情况，等到腹部明显膨大，即可抽取腹水。腹水采用4％PEG6000(体积浓度)进行纯化，获得抗桔霉素的单克隆抗体。测定其抗体效价后分装并置-20℃下冻存。

(6)、抗桔霉素单克隆抗体的鉴定：得到的抗桔霉素单克隆抗体采用间接非竞争ELISA分析，效价为1∶2.70×10⁵。该单抗重链约65KDa，轻链为25KDa，亲和力为4.17×10⁸L/mol。该单抗具有很强的特异性，与其他毒素(AFB₁、OTA、DON、ZEN)的交叉反应率均小于等于0.015％。采用间接竞争ELISA检测抗桔霉素单克隆抗体的特异性，IC₅₀达到0.03ng/mL。

实施例5：

利用正辛酸-硫酸铵盐析法制备抗桔霉素单克隆抗体

按照实施例5所述的步骤制备腹水，用正辛酸-硫酸铵盐析法进行纯化，取2ml腹水，用0.06mol/L醋酸盐调节pH4.5，加入5ml 5％辛酸，离心(10000r/min，30min)，收集上清夜，弃去沉淀。上清液用5mol/LNaOH调至PH7.4，在加入35％饱和硫酸铵沉淀蛋白质，离心(5000r/min、15min)，弃去上清液，收集沉淀，重复两次。沉淀物用2ml PBS缓冲液溶解，4℃下PBS缓冲液中透析2天，中间更换透析液3次，收集的透析袋中的抗体即为抗桔霉素的单克隆抗体，测定其抗体效价后分装并置-20℃下冻存。抗桔霉素单克隆抗体的鉴定：得到的抗桔霉素单克隆抗体采用间接非竞争ELISA分析，效价为1∶1.90×10⁵。

Claims

1.一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成方法，其特征在于桔霉素先与双交联试剂 (C₂H₃O)-(CH₂)_n-(C₂H₃O)反应，然后与大分子载体进行偶联，反应后用甘氨酸封闭，最后经分离纯化得到桔霉素-载体偶联抗原；

具体包括以下步骤：

（1）桔霉素的活化：将0.5～10mg桔霉素溶解于0.5～10ml的0.6mol/l氢氧化钠溶液中，加入0.5～10ml的2mg/ml硼氢化钠溶液，摇匀后，再加入0.5～10μl的双交联试剂，室温下反应4～10小时；所述的双交联试剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；

（2）桔霉素-载体偶联反应：加入30～600mg碳酸钠，调节pH9.0～11.0，然后按桔霉素与载体初始摩尔比为10/1～1000/1加入载体，混匀完全后，置于37℃振摇反应，反应24～48小时；

（3）甘氨酸封闭：偶联反应后，加入100～2000mg甘氨酸进行封闭，置于37℃振摇反应，反应24～48小时；

（4）分离纯化：将反应液取出，采用G-25凝胶柱洗脱或透析，收集洗脱液或透析袋内溶液，进行紫外全波长扫描，检测278nm和319nm波长的吸收值，计算偶联比，并将偶联物冷冻干燥后-20℃保存。

2.根据权利要求1所述一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法，其特征在于所用大分子载体为天然蛋白质或含氨基的蛋白化合物、糖化合物、高分子化合物，其分子量为20～1200Kda。

3.根据权利要求1所述一种桔霉素-蛋白偶联抗原的双交联化学合成法，其特征在于所用大分子载体为牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA或匙孔贝血蓝蛋白KLH。

4.一种由权利要求1所述桔霉素-蛋白偶联抗原制备抗桔霉素单克隆抗体的方法，其特征在于应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，获得稳定分泌的抗桔霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过制备腹水和纯化，获得抗桔霉素的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的一种抗桔霉素单克隆抗体的制备方法，其特征在于采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合和筛选，采用的细胞株为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。

6.根据权利要求4所述的一种抗桔霉素单克隆抗体的制备方法，其特征在于采用小鼠动物体内生产法制备腹水，采用正辛酸-硫酸铵盐析法或PEG法对腹水进行纯化。