CN101942415B - 一种杂交瘤细胞株及其产生的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种杂交瘤细胞株及其产生的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，属于免疫化学技术领域。该杂交瘤细胞株6G11，产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体为6G11’。本发明还提供所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’的制备方法：制备免疫原和包被原；动物免疫注射；筛选免疫鼠血清；制备杂交瘤细胞；采集并纯化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’。本发明通过小鼠杂交瘤细胞株6G11产生特异强的盐酸克伦特罗单克隆抗体，与沙丁胺醇、莱克多巴胺交叉反应率低，能够大量生产，可用于制备检测盐酸克伦特罗的酶联免疫分析法试剂盒、胶体金试纸条等免疫学检测试剂，达到快速且灵敏地检测尿液，肌肉及内脏中的盐酸克伦特罗药物残留的效果。

Description

一种杂交瘤细胞株及其产生的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体

技术领域

本发明涉及盐酸克伦特罗的特异性单克隆抗体及制备，还涉及其杂交瘤细胞株，属于免疫化学技术领域。

背景技术

克伦特罗(Clenbuterol.CL)又名双氯醇胺，氨哮素，是一种人工合成的肾上腺素受体激动剂，临床上一般应用其盐酸盐。其化学结构为4一氨基一(叔丁胺甲基)一3，5-二氯苯甲醇盐酸盐(图1)。分子式为C₁₂H₁₈C₁₂N₂O·HCl，分子量313.7kDa。它具有强效松弛支气管平滑肌作用，可明显增加每秒肺活量和最大呼气流速，降低气道阻力，增强支气管纤毛运动和促进痰液排出，因此该药物最初是作为支气管扩张剂用于防治支气管哮喘、哮喘性慢性支气管炎及肺气肿等呼吸系统疾病所致的支气管痉挛。人服用本品后10-20min起效，2～3h达最高血药浓度，作用维持5小时以上。

在兽医临床上，只有欧盟批准CL允许用于牛、马和宠物的支气管疾病和产科治疗。一般治疗用量为1-5g/kg，使用期不得超过10d。治疗奶牛产科疾病不得超过300/头(0.5g/kg)。当其应用剂量达到治疗量的5～10倍时，且应用时间较长的情况下，能降低胴体脂肪沉积和增加肌肉的合成。因此又有“瘦肉精”(leanness enhancer)之称。但长期使用后，可在体内形成积累性残留，通过食物链直接危害人体健康。CL在动物体内具有吸收快、分布广、脂溶性高以及具有残留性积累及半衰期长等药理特性。人在食用残留有CL肉品后引起中毒事件不断发生，因此研究残留CL的检测方法对广大消费者、研究人员及执法部门具有重要意义。

现有检测残留CL的方法中盐酸克伦特罗的单克隆抗体的特异性不高，例如有人报道其制备的盐酸克伦特罗的单克隆抗体与CL类似物沙丁胺醇的交叉反应率达到50.04％，与莱克多巴胺的交叉反应率达到75％。这类特异性不高的抗体并不能适应检测的需要。

发明内容

本发明的目的是：获得一种与沙丁胺醇和莱克多巴胺无交叉反应的，具有抗盐酸克伦特罗的特异性的单克隆抗体以及能够高效产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明提供一种产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G11，其保藏号为CGMCC No.3573。

本发明还提供所述杂交瘤细胞株6G11分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’。

所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’，其抗体亚型为IgG1型。

本发明还提供所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’的制备方法，包括以下步骤：

a.制备免疫原和包被原：采用重氮化法(Greg T.Hermanson.Bioconjugatetechniques.Academic Press，2008：773-776.)将载体蛋白与盐酸克伦特罗偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以Balb/c鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原，间隔两周以后用免疫原进行加强免疫；

c.筛选免疫鼠血清：测免疫鼠血清抗体效价(杨利国，《酶免疫测定技术》，南京大学出版社，1998)，选取血清效价高的Balb/c鼠进行加强免疫。

d.制备杂交瘤细胞：取步骤c所得加强免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆获得可稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的细胞株6G11；

e.采集并纯化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’：用杂交瘤细胞6G11对小鼠进行腹腔注射，采集腹水，对腹水进行液相层析纯化(Gary C.Howard.Makingand Using Antibodies：A Practical Handbook.CRC Press，2006.127-130.)，获得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’。

步骤a中，以牛血清白蛋白、人血清白蛋白和匙孔血蓝蛋白中的至少一种为载体蛋白与盐酸克伦特罗偶联合成免疫原，以卵清蛋白为载体蛋白与盐酸克伦特罗偶联合成包被原。

免疫Balb/c鼠腹腔注射免疫原的各次注射剂量至少为50μg/只。

本发明还提供所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’应用于盐酸克伦特罗残留的定性或定量检测。

本发明的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞株6G11产生特异强的盐酸克伦特罗单克隆抗体，与沙丁胺醇、莱克多巴胺交叉反应率低，能够大量生产，可用于制备检测盐酸克伦特罗的酶联免疫分析法试剂盒、胶体金试纸条等免疫学检测试剂，达到快速且灵敏地检测尿液，肌肉及内脏中的盐酸克伦特罗药物残留的效果。

附图说明

图1是BSA蛋白标准品质谱检测图；

图2是免疫原CL-BSA质谱检测图；

图3是OVA蛋白标准品质谱检测图；

图4是包被原CL-OVA质谱检测图；

图5是HSA蛋白标准品质谱检测图；

图6是包被原CL-HSA质谱检测图；

图7是单克隆抗体6G11’亚型鉴定图；

图8是本发明的单克隆抗体6G11’与盐酸克伦特罗标准品的反应曲线标准曲线图。

产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G11(也称为“抗盐酸克伦特罗抗体的杂交瘤细胞株6G11”)，已经在2009年12月31日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.3573。

具体实施方式

实施例一

试剂与材料准备

盐酸克伦特罗标准品(北京上立方联合化工技术研究院，BW8001)，浓盐酸(上海中试化工总公司)、碳酸钠(Sigma，22353-0)、碳酸氢钠(Sigma，S6297)，亚硝酸钠(上海焱晨化工实业有限公司)，氨基磺酸铵(国药集团化学试剂有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，0332)、人血清白蛋白(HSA)(Sigma，A9511)，卵清白蛋白(OVA)(Sigma，A5503)，弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)，弗氏不完全佐剂(Sigma，F5506)，四甲基联苯胺(TMB)(Amresco，0759)，HAT(Sigma，H0262)和HT(Sigma，H0137)，氯化钠(Amresco，0241)，氯化钾(Amresco，0395)，磷酸二氢钾(Sigma，P9791)，磷酸氢二钠(Sigma，71639)，羊抗鼠IgG-HRP(Jackson，115-035-044)，二甲基亚砜(DMSO)(Applichem，0231)，聚乙二醇4000(PEG4000)(Sigma，P7306)，DMEM高糖培养基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco，C2027050)。

实验动物与细胞：Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性)，购自扬州大学动物中心；SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)。

本发明的实验步骤如下：

a.采用重氮法制备免疫原(CL-BSA、CL-HSA)和包被原(CL-OVA)：

(1)取200ul浓度为1M的HCl溶解20mg的盐酸克伦特罗。

(2)在震荡状态下缓慢滴加2M的亚硝酸钠溶液，低温震荡10min以上。

(3)缓慢滴加5M的氨基磺酸胺溶液；

(4)将20mg BSA、20mg HAS、20mg OVA分别溶于碳酸钠缓冲溶液(pH9.5)中，将步骤(3)所得反应产物分别滴加上述各溶液中，低温避光反应10小时以上；

(5)将各反应产物分别透析，离心30min，收集上清，保存于-20℃。

(6)对BSA，HSA，OVA蛋白标准品及透析后的免疫原CL-BSA，CL-HSA和包被原CL-OVA，分别进行质谱检测，结果见图1～图6。从图示结果可见，偶联比例分别为6∶1，8∶1和3∶1。

b.动物免疫：

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原是CL-HSA或CL-BSA，每次免疫剂量≥50μg/只小鼠，两次以上。

c.筛选免疫鼠血清：

以上免疫鼠在最后一次免疫后7-10天，用间接ELISA法和间接竞争ELISA方法测血清抗体效价(杨利国，《酶免疫测定技术》，南京大学出版社，1998)。选取血清效价高的小鼠进行加强免疫。

d.制备杂交瘤细胞：

取上述加强免疫后的Balb/c小鼠的脾细胞，以50％(w/v)的PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按2∶1～10∶1的比例进行细胞融合。采用间接ELISA法和间接竞争ELISA方法检测融合后存活的细胞培养上清的抗体效价及灵敏，对阳性克隆进行亚克隆，检测有单克隆生长孔的细胞培养上清，阳性率达到100％，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G11。

该步骤中所述间接ELISA法的步骤如下：

(1)包被：用0.01mol/L、pH7.4的PBS将包被原稀释成一系列浓度加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温(体积浓度)的0.01mol/L、pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4)洗涤同上；

(5)一抗：加入系列浓度的抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；

(6)洗涤同上；

(7)酶标二抗：加入羊抗鼠-HRP(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；

(8)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min；

(9)终止反应：加入2M的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：当阳性血清OD值与阴性血清OD值之比(P/N)≥2.1，阳性OD值在1.0左右时，所对应的稀释度为最佳稀释度。实验结果表明包被原最佳稀释度为1∶28000。

间接竞争ELISA法的步骤如下：

(1)包被：用0.01mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原按照上述最佳稀释度稀释，加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰(体积浓度)吐温的0.01mol/L、pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4)洗涤同上；

(5)加样：先将相邻两孔内加入稀释液(配方同洗涤液)，50μL/孔，与此两孔相邻的孔内加入适当浓度的盐酸克伦特罗标准品进行竞争反应，50μL/孔，最后加入稀释好的抗体，50μL/孔，酶标板稍作震荡混匀，37℃孵育1h；

(6)洗涤同上；

(7)酶标二抗：加入羊抗鼠-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；

(8)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min；

(9)终止反应：加入2mo1/L的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：首先，从肉眼可以看出，抑制孔与未抑制孔颜色的变化，抑制孔颜色较浅或者无色，说明有特异性抗体产生，反之则无特异性抗体产生。其次，根据OD值可以判定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，说明有特异性抗体产生。

抗体灵敏的强弱可根据竞争抑制率的大小来判定。竞争抑制率＝1-B/B₀(B为加竞争物的抑制孔OD值，B₀为不加竞争物的阳性对照孔OD值)。

e.采集并纯化单克隆抗体6G11’

采集和鉴定单克隆抗体：

(1)细胞复苏时取出冻存管，立即于37℃水浴中融解，之后移入培养皿内扩大培养，培养基为含10％(V/V)胎牛血清的DMEM培养基。其中，冻存管内冻存的是对数生长期的能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G11。

(2)用灭菌石蜡免疫Balb/c小鼠，7天后分别对每组小鼠腹腔注射杂交瘤细胞6G11，注射剂量≥10⁶个/只，7-10天采集腹水，得到单克隆抗体，命名为6G11’。采用购自Pierce公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(MouseMonoclonal Antibody Subtype Identification Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，其亚型鉴定结果表明，单克隆抗体6G11’为IgG1亚型。结果见表1和图7。

表1抗体亚型鉴定结果

抗体亚型	8E6clone
		IgA	0.273
IgG3	0.201
		IgM	0.176
IgG1	1.598
		IgG2a	0.196
IgG2b	0.107
		κ链	0.93
λ链	0.246
		blank control	0.204
negative	0.22

纯化单克隆抗体6G11’(以下简称单抗)：用液相层析法对上述腹水进行处理，具体步骤如下：

(1)取1倍体积的腹水，加入4倍体积的NaAC-HAc缓冲液；

(2)每ml腹水加入10-50％(V/V)的辛酸，加好后，室温于摇床上摇30min。之后4℃静置3h；

(3)高速离心30min，取上清，用NaOH调pH至7.4；

(4)向上清中加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。之后高速离心10min；

(5)弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀；

(6)将悬浮液转入透析袋内透析12h；

(7)进一步纯化，上样缓冲液为20mM的Tris-HCL(pH8.6)，洗脱缓冲液为20mM的Tris-HCL(1M的NaCL，pH8.6)，1ml/管收集单抗。

(8)纯化后的单抗进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。利用紫外分光光度计测定其浓度，效价，分装，低温保存；

(9)单抗效价的测定：以1∶28000稀释的包被原CL-OVA包被ELISA板，将纯化的6G11’单抗进行1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000稀释，加入酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，最后用TMB显色，结果见表2。

表2 6G11’的效价测定结果

单抗稀释度	OD450
		1∶2000	1.208
1∶4000	1.196
		1∶8000	1.005
1∶16000	0.908
		1∶32000	0.605
1∶64000	0.554
		1∶128000	0.357
阴性	0.057
		空白	0.052

阳性判定标准：P/N≥2.1

单抗6G11’检测结果：当纯化的单抗6G11’浓度为1mg/ml时，效价可达1.28×10⁵以上。

(10)检测单抗6G11’的特异性：采用步骤d中建立的间接竞争ELISA法进行，包被有抗原的ELISA板内，加入纯化后的单抗6G11’，同时加入不同浓度的盐酸克伦特罗(缩写为CL)标准品，在有6G11’的孔内加入的盐酸克伦特罗浓度分别为8.1ng/mL、2.7ng/mL、0.9ng/mL、0.3ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，结果分别见表4。以药物浓度的自然对数为横坐标，以不同浓度药物的OD450与零浓度药物的OD450的比值(B/B₀)为纵坐标绘制标曲，结果见图8。根据试验数据计算单抗6G11’的半数抑制量(IC₅₀)值2.05ng/ml。

从标准曲线的OD值和IC₅₀值可以看出，单抗6G11’在CL浓度为0.1ng/ml时，仍具有很好的抑制效果，这说明本发明中筛选到的一株单克隆抗体具有很高的特异性和敏感性。

表4单克隆抗体6G11’的抑制效果

(11)单克隆抗体6G11’亲和力的测定

根据Gosling介绍的ELISA方法进行抗体亲和力的测定，其亲和力的大小用亲和常数Ka的大小来表示，公式为：

$\frac{V}{\mathrm{\α}}=K_a(1-v)$

亲和常数的单位为浓度的倒数，即：克分子浓度(L^-/moL)，其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。其检测过程如下：

第一步：确定抗原，抗体最佳作用浓度：

1、将包被原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别进行1000，2000，4000，8000，16000，32000倍稀释，每个稀释度各包被4列孔，100μL/孔，37℃，温育2h，洗涤、封闭；

2、将单克隆抗体6G11’进行4000，8000，16000，20000，240000，28000，32000倍稀释，分别加入步骤1所述的各条中，每个稀释度分别加入2列孔，100μLL/孔，室温温育1h；

3、将这两列孔内的液体分别移入其余两列中；

4、将这两列(指液体被移走的两列)洗涤加酶标二抗，室温作用1h后洗板显色，最后测定OD值A1；

5、后两列(指被移入液体的两列)，室温温育1h，洗涤加酶标二抗，再室温作用1h后洗板显色，最后测定OD值A2。

6、根据公式计算 $f=\frac{A_1\left(c\right)-A_2\left(c\right)}{A_1\left(c\right)}$

计算f值，选取所有f值都小于10％的抗原、抗体稀释度，并结合OD值大小来确定最佳抗原浓度为32000倍稀释，最佳抗体浓度为4000倍稀释。

第二步：测定亲和力

1、配制一系列浓度的包被抗原6个；

2、在加有等量单抗6G11’(浓度为最佳浓度)的各管内分别加入等量系列浓度抗原，共7管，最后一管为不加抗原的对照管，室温下过夜；

3、将包被原稀释32000倍后进行包被，室温下过夜，洗板，封闭；

4、将第二步的反应产物取100μL加入步骤3中封闭的板孔内，室温下进行间接竞争ELISA，最后测定OD值A；

5、根据Scatchard公式 $\frac{V}{\mathrm{\α}}=K_a(1-V)$ 计算其斜率值，

其中，α为游离抗原的浓度，V为结合抗体位点与总抗体位点的比，所得亲和力的大小即亲和常数Ka，为斜率值的负数。得到的结果是单克隆抗体6G11’的亲和常数为7.62*10⁸。

实施例二药物交叉反应试验

按实施例一中建立的间接竞争ELISA方法进行，盐酸克伦特罗的单克隆抗体6G11’分别与盐酸克伦特罗半抗原结构类似物如沙丁胺醇、莱克多巴胺进行竞争试验。将这些标准品稀释成不同浓度进行间接竞争ELISA实验，绘制抑制曲线，计算竞争物的IC₅₀值和交叉反应率，其最高交叉反应率为2.7％。文献中报道的盐酸克伦特罗的单克隆抗体与沙丁胺醇的交叉反应率达到50.04％，与莱克多巴胺的交叉反应率达到75％，而本发明所制备的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体只与盐酸克伦特罗反应，因此，本发明中所制备的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体具有更高的特异性，具体结果见表5。

种类	％CR
		盐酸克伦特罗	100％
沙丁胺醇	1.5％
		莱克多巴胺	2.7％

表5 6G11’单克隆抗体与其他药物的交叉反应

实施例三单克隆抗体6G11’在检测盐酸克伦特罗残留的ELISA方法的应用

单克隆抗体6G11’可以应用于检测盐酸克伦特罗残留的ELISA方法，例如可以用于牛眼、尿液、肌肉中盐酸克伦特罗残留的检测。以猪肉(市场购买)为例，说明检测猪肉中盐酸克伦特罗残留的主要步骤如下：

1.样品前处理：采用通用方法进行处理。

2.本发明中试剂盒的检测原理是间接竞争ELISA方法，将包被原OVA-CL包被于微孔板上，加入系列稀释的盐酸克伦特罗标准品或者样品，再加入抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体6G11’，样品中残留的盐酸克伦特罗与包被的抗原同时与抗盐酸克伦特罗的抗体竞争性结合，然后加入酶标二抗，TMB显色，显色后在酶标仪上读取OD₄₅₀，样品中盐酸克伦特罗的含量与样本吸光度值呈负相关，与标准曲线相比，即可得出相应残留物盐酸克伦特罗的含量。

3.本发明中抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体的高特异性，使得与现有的样品处理方法相比，大大简化了肌肉样品的前处理步骤，只需要10mM HCl 5倍稀释即可用于检测。由于抗体的高亲和力，使得检测的灵敏度大大提高，标准曲线范围为0.1-8.1ng/ml。

实施例四  单抗6G11’在检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸条中的应用本实施例是本发明中的单克隆抗体6G11’在检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸条中的应用举例，主要是应用于检测可以用于牛眼、尿液、肌肉中盐酸克伦特罗残留。

反应原理采用竞争法对小分子药物盐酸克伦特罗进行半定量检测，样品中存在的盐酸克伦特罗分子在沿试纸条上移过程中先与金颗粒标记的抗体蛋白结合，固定在NC膜上的包被原与盐酸克伦特罗同时竞争结合抗体，T线的显色强弱与样品中残留盐酸克伦特罗的含量成反比，若样品中无盐酸克伦特罗残留，则金标抗体全部与包被原反应，试纸条的T线显色最深。即C、T线均显色深浅一致，此时表示阴性，当C线显色，T线不显色或显色弱于C线时则表示为阳性，若C线不显色，不管T线显色或不显色都表示试纸条失效。

(1)具体操作步骤如下：

1、样品前处理：本方法中各种样品的处理方法同ELISA方法中的样品前处理方法；

2、将试纸条放于干净平整的台面上，用滴管吸取待测样品溶液，滴加1～2滴于样品垫上；

3、等待紫红色条带的出现，静置反应5-10分钟时读取测试结果，10分钟以后判定无效。

(2)试纸条检测限的确定：

取试纸条平放于试验台上，分别用含不同浓度的盐酸克伦特罗的PBS溶液作为待测样品液，滴加于样品垫上，反应后5-10min判定结果，来确定试纸条的检测限；对各种肌肉的检测限可以根据检测要求进行不同的稀释，再乘以不同的稀释倍数即为各种样品的检测限。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G11，其保藏号为CGMCC No.3573。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株6G11分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’。

3.根据权利要求2所述杂交瘤细胞株6G11分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’，其特征在于：其抗体亚型为IgG1型。

4.权利要求2的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体6G11’应用于盐酸克伦特罗残留的定性或定量检测。

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