CN102690788A - 一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用。该玉米赤霉烯酮抗独特型抗体是β型抗独特型抗体，与玉米赤霉烯酮存在“内影像”关系，是由杂交瘤细胞株1D5分泌得到的。其制备方法是用ZEN单克隆抗体为免疫原，免疫小鼠，细胞融合筛选后即得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。本发明还提供了一株分泌ZEN单克隆抗体的细胞株1G4G10D3。本发明的玉米赤霉烯酮抗独特型抗体可以替代标准品用于玉米赤霉烯酮的现场快速检测，实现无毒检测，具有良好的市场前景。

Description

一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用。 

背景技术

玉米赤霉烯酮（Zenralenone, ZEN）是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素，污染范围广泛，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节，都有可能受到ZEN 的污染。ZEN具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽、反刍动物均影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，并且ZEN对高温稳定，不易去除，严重危害人类健康。目前大多数国家对食品、谷物、饲料中ZEN 含量进行了严格限定。 

目前，免疫检测方法已成为食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥了重要作用。ZEN是一种小分子毒素，目前用于ZEN残留检测的免疫学方法存在有以下缺陷：（1）ZEN标准品的使用不仅给操作人员带来危害，同时也增加了环境中有毒有害物质的排放；（2）检测中需用到固相抗原（包被原ZEN-载体蛋白），但在包被原的制备过程中通常难以保证每个载体蛋白都连接相同数目的ZEN，因而存在重复性差的现象；（3）ZEN-载体蛋白竞争物通常稳定性不好，是影响检测试剂盒保质期的主要因素之一。因此，寻求ZEN的替代物用于ZEN的无毒检测具有重要的现实意义。β型抗独特型抗体（β-Anti- idiotype antibody，β-AId or Ab2β）具有与（半）抗原相同抗原决定簇的“内影像”作用，因而可以替代小分子物质。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体其制备方法和应用。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

杂交瘤细胞株1D5，是由ZEN单抗免疫小鼠得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成，于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201238。 

 一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体，该玉米赤霉烯酮抗独特型抗体为β型抗独特型抗体，与玉米赤霉烯酮存在“内影像”关系，该玉米赤霉烯酮抗独特型抗体是由上述杂交瘤细胞株1D5分泌得到的。 

一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法，步骤如下： 

（1）制备ZEN单克隆抗体：采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得一株杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法制备腹水型ZEN单克隆抗体；

（2）以ZEN单克隆抗体为免疫原，免疫小鼠，细胞融合，得到杂交瘤细胞株1D5，诱导分泌抗体；以ZEN为竞争物，通过竞争ELISA筛选最终得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。

上述制备方法中，步骤（1）所述细胞融合后得到的杂交瘤细胞命名为1G4G10D3（杂交瘤细胞1G4G10D3），于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201237。 

步骤（2）具体方法为：ZEN单克隆抗体与KLH偶联，偶联物免疫BALB/c小鼠，经血清效价和灵敏度检测合格后，再进行偶联物腹腔注射小鼠，3天后取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株1D5，分泌产物经过纯化，得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。 

上述玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法中，也可以使用市售的ZEN单抗直接进行步骤（2）的操作。 

本发明的玉米赤霉烯酮抗独特型抗体在玉米赤霉烯酮检测中的应用，具体是利用ZEN单克隆抗体和玉米赤霉烯酮抗独特型抗体建立ZEN的竞争ELISA，进行无毒检测。 

一种利用玉米赤霉烯酮抗独特型抗体检测玉米赤霉烯酮的方法，步骤为： 

（1）用生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体；

（2）间接ELISA确定生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的效价；

（3）检测ZEN对生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与ZEN单抗结合的抑制，同时检测玉米赤霉烯酮抗独特型抗体对生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与ZEN单抗结合的抑制，分别绘制ZEN和玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的抑制曲线及其相应线性回归方程；根据抑制率在20%-80%间，在相同抑制率条件下，ZEN与抗ZEN单抗独特型抗体间浓度对应关系，绘制ZEN替代标准曲线及对应的线性回归方程，作为定量换算公式；

（4）检测时用玉米赤霉烯酮抗独特型抗体作为标准品，根据标准曲线计算出实验抑制率所对应的玉米赤霉烯酮抗独特型抗体质量浓度，再根据定量换算公式计算出对应的ZEN浓度。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

ZEN污染范围广泛，给畜牧业带来很大经济损失；并且严重威胁人类健康。目前大多数国家对食品、谷物、饲料中ZEN 含量进行了严格限定。传统的ZEN免疫学检测方法均需使用ZEN标准品，不仅给操作人员带来危害，同时也增加了环境中有毒有害物质的排放。本研究提供的玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与玉米赤霉烯酮存在“内影像”关系，可以替代玉米赤霉烯酮标准品用于玉米赤霉烯酮的现场快速检测，可以实现无毒检测。因此具有良好的市场前景。

保藏信息： 

杂交瘤细胞株1D5，保藏日期：2012年4月5日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：C201238。

杂交瘤细胞1G4G10D3，保藏日期：2012年4月5日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国. 武汉. 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C201237。 

附图说明

图1. ZEN间接竞争ELISA标准抑制曲线。 

图2. 非还原SDS-PAGE鉴定Fab抗体片段。 

图3. ZEN对抗血清（Ab2）与Fab的结合抑制。 

图4. 6株ZEN抗独特型抗体杂交瘤细胞鉴定结果。 

图5. ZEN的标准曲线和β-AId-1D5的标准曲线。 

图6. ZEN抗独特性抗体（β-AId-1D5）与ZEN标准品之间的相关性。 

具体实施方式

实施例1 制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体

1. 采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原（ZEN-OVA），ZEN与BSA偶联制备检测抗原（ZEN-BSA），免疫BALB/c小鼠，细胞融合，制备ZEN单抗。

取3只6～8周龄健康BALB/c小鼠（购自南方医科大学动物所），分别编号，每只小鼠每次免疫剂量为100 μg，免疫原ZEN-OVA与等体积弗氏完全佐剂（初免）或者不完全佐剂（加强）乳化（0.2 mL），背部皮下多点注射，免疫周期为14 d，每次加强免疫后7 d，断尾取血，获得血清，保存于-20 ℃备用。ZEN-BSA作为包被原，间接ELISA测定抗血清效价，间接竞争ELISA测定抗血清的灵敏度。 

经3次加强免疫，检测结果(如图1)表明1号小鼠的灵敏度最高，IC₅₀值为39.8 ng/mL，选择1号小鼠脾脏作为脾细胞供体，细胞融合前3 d腹腔注射100 μg ZEN-OVA（0.1 mL），3 d后取小鼠脾细胞（3.75×10⁸），在50% PEG 4000作用下与骨髓瘤细胞SP2/0（购买自中国典型培养物保藏中心）（3.75×10⁷）进行融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，经过三次克隆化，获得1株稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞，命名为1G4G10D3，其分泌的抗ZEN单抗命名为单抗1G4G10D3。通过小鼠体内诱生法制备腹水型单克隆抗体，具体参见文献（刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用，安徽科学技术出版社，1994年11月）。 

HAT选择培养基含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷；HT选择培养基含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷。 

实施例2 制备玉米赤霉烯酮抗独特型抗体

1. 以稳定分泌高灵敏度抗ZEN单抗的杂交瘤细胞1G4G10D3分泌的单抗为免疫原，免疫小鼠，细胞融合，制备玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。

（1）免疫原1G4G10D3-KLH偶联物制备 

①将25.6 mg EDC加入4 mg/mL IgG溶液（PBS，500 μL）中，室温搅拌反应30 min；

②将2 mg/mL的KLH溶液(PBS，1 mL)加入到上述溶液中，4 ℃搅拌反应12 h~16 h；

③最后的反应液用0.01 M PBS透析两天，即获得免疫原mAb-KLH偶联物（即1G4G10D3-KLH偶联物），分装、冻存于-20 ℃备用。

（2）单抗1G4G10D3 的Fab抗体片段制备及鉴定 

①饱和硫酸铵沉淀初步纯化ZEN单抗1G4G10D3，然后经Protein G免疫亲和层析柱进一步纯化；

②在20 mM醋酸盐缓冲液（pH4.5）中，用250 μL固定化胃蛋白酶消化10 mg 纯化的ZEN单抗1G4G10D3，37 ℃水浴中摇动反应1 h；

③在4 ℃条件下，消化产物1000g离心3min，取上清，然后加入1.5 mL 10 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5），离心取上清，合并两次上清；

④所获得的上清通过Protein G免疫亲和层析柱，收集流出液并浓缩，即获得抗ZEN单抗1G4G10D3 Fab片段；

⑤采用BCA试剂盒测定Fab蛋白浓度；用间接ELISA鉴定Fab片段活性，从表1中可以看出Fab的IC₅₀较完整IgG降低了3倍多，表明抗体片段的灵敏度较高，活性很好；同时用非还原SDS-PAGE鉴定Fab抗体片段（如图2），结果显示酶切片段分子量为50 kD，与抗体片段Fab大小吻合。

表1 ZEN单抗与抗体片段Fab特性对比 

（3）小鼠免疫及血清检测

实验选用10只健康的6-7周龄Balb/c雌性小鼠为实验对象

免疫原（1G4G10D3-KLH偶联物）免疫剂量为40 μg/只；

用生理盐水将免疫原稀释到2倍最终浓度（50 μL），与等体积新型佐剂Qickadjuvant充分混匀，通过小腿（后腿）肌肉注射免疫小鼠；

第21天按同样方式加强免疫一针；

第35天采取微量尾血进行效价和灵敏度测定：

a.抗血清效价测定   

包被缓冲液将抗体片段Fab稀释至1 μg/mL，100 μL/孔，37 ℃孵育3 h；弃反应液，PBST洗板3次；5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h；弃反应液，PBST洗板3次；抗血清从1:200倍起开始倍比稀释，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；弃反应液，PBST洗板3次；加入100 μL 1：10000稀释的羊抗鼠IgG（Fc特异）-HRP酶标二抗，37 ℃孵育40 min；弃反应液，PBST洗板5次；加入100 μL TMB底物，避光反应10 min；50 μL 2 M硫酸终止反应，酶标仪测定OD450光吸收值，选定OD450在1.0左右时，抗血清稀释倍数即为效价，此浓度为抗血清的工作浓度，检测结果如表2，结果显示1号小鼠的效价最高为1:1600，2、3号小鼠的效价分别为、1:800、1:400。

表2 间接ELISA测定抗血清（Ab1）效价 

b.抗血清灵敏度测定  

间接竞争ELISA测定抗血清灵敏度，操作过程类似于间接ELISA，不同处为同时加入50 μL 不同浓度的ZEN竞争物和50 μL 2倍于效价的抗血清，结果如图3，1号小鼠的抗血清对ZEN灵敏度最高，在100 ng/mL ZEN的竞争下，相对于PBS组OD450值下降了58%，因此选择1号小鼠作为融合脾细胞的供体。

（4）细胞融合，杂交瘤细胞筛选及腹水制备 

提前10 d复苏骨髓瘤细胞SP2/0（购买自中国典型培养物保藏中心），并经8-氮杂鸟嘌呤筛选；

细胞融合前3 d腹腔注射40 μg 1G4G10D3-KLH（0.1 mL）；

3 d后取加强免疫小鼠脾细胞（3.75×10⁸），在50%PEG 4000作用下与小鼠骨髓瘤细胞（3.75×10⁷）融合；

用含13%小牛血清，10%杂交瘤细胞生长因子的HAT或HT选择培养基培养融合细胞；

待杂交瘤细胞生长到板孔的1/4-1/3时，采用间接ELISA和间接竞争ELISA检测细胞上清，筛选阳性克隆；

采用有限稀释法克隆阳性孔，经2-3次克隆化，筛选到6株能稳定分泌ZEN抗独特型抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D5、2C11、2D9、3H8、3F8、6D8，及时保存细胞株。

选取8周龄Balb/c小鼠制备腹水，提前1周注射0.5 mL/只 弗氏不完全佐剂，1周后腹腔接种1×10⁶个杂交瘤细胞，大概7-8 d抽取腹水，1000 r/min离心10 min，取上清保存于-20 ℃。 

（5）间接竞争ELISA检测6株杂交瘤细胞上清抗体 

包被缓冲液将Fab抗体片段稀释至1 μg/mL，37 ℃孵育3 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入200 μL 5%脱脂奶粉封闭，37 ℃孵育1 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入50 μL适当稀释的细胞上清和50 μL 不同浓度的ZEN竞争物，37 ℃孵育1 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入100 μL 1:10000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG（Fc特异性）二抗，37 ℃孵育40 min；

弃反应液，300 μL PBST洗板5次，3 min/次；

加入100 μL TMB底物，避光显色10 min；

加入50 μL 2M硫酸终止反应，酶标仪测定OD450值。

检测结果如图4 ，这6株抗独特型抗体抗体都与ZEN竞争结合ZEN单抗Fab片段，表明它们都为β 型抗独特型抗体。其中杂交瘤细胞1D5产生的抗体的IC₅₀为10 ng/mL，在这6株杂交瘤细胞中最低，因此选择1D5建立玉米赤霉烯酮的无毒ELISA检测技术。 

实施例3 用玉米赤霉烯酮抗独特型抗体β-AId-1D5检测玉米赤霉烯酮

1. ZEN抗独特型抗体（β-AId-1D5）生物素标记

    标记过程参考Pierce 生物素标记试剂盒（购自Pierce公司）说明书对ZEN抗独特型抗体1D5进行标记：

将3 mg 已经纯化的β-AId-1D5溶入1 mL PBS（pH7.2）中，然后加入43.7 μL 20 mM NHS-LC-Biotin溶液，室温反应1 h；

将反应产物加到Zeba脱盐柱中心，1000 g离心5 min，对反应产物进行脱盐，即获得Biotinylated-β-AId-1D5（生物素标记的ZEN抗独特型抗体）。

2. 生物素标记的β-AId-1D5效价测定 

包被缓冲液将ZEN单抗1G4G10D3稀释至1 μg/mL，37 ℃孵育3 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入200 μL 5%脱脂奶粉封闭，37 ℃孵育1 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入100 μL从1:3000稀释的Biotinylated-β-AId-1D5，37 ℃孵育1 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入100 μL 1:1000稀释的HRP标记链霉亲和素，37 ℃孵育40 min；

弃反应液，300 μL PBST洗板5次，3 min/次；

加入100 μL TMB底物，避光显色10 min；

加入50 μL 2M硫酸终止反应，酶标仪测定OD450值。

当其值在1.0左右时，抗体的稀释倍数被称为该抗体的效价，也是此抗体的工作浓度。 

3. ZEN或β-AId-1D5对Biotinylated-β-AId-1D5与1G4G10D3结合抑制影响 

包被缓冲液将ZEN单抗1G4G10D3稀释至1 μg/mL，37 ℃孵育3 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入200 μL 5%脱脂奶粉封闭，37 ℃孵育1 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入不同浓度的ZEN标准品（0-10 ng）或不同浓度（0-10 μg）β-AId-1D5，37 ℃孵育1 h；

弃反应液，300 μL PBST洗板3次，3 min/次；

加入100 μL 1:1000稀释的HRP标记链霉亲和素，37 ℃孵育40 min；

弃反应液，300 μL PBST洗板5次，3 min/次；

加入100 μL TMB底物，避光显色10 min；

加入50 μL 2M硫酸终止反应，酶标仪测定OD450值。

依据实验结果绘制Biotinylated-β-AId-1D5对ZEN或者β-AId-1D5的标准抑制曲线及相应的线性回归方程（如图5中的2-a、2-b）。结果显示ZEN的标准曲线IC₅₀值为25.13 ng/mL；β-AId-1D5的标准曲线 IC₅₀值为1.12 μg/mL。 

4. 替代标准曲线及ZEN无毒ELISA检测技术建立 

根据抑制率在20%-80%间，在相同抑制率条件下，ZEN与抗ZEN单抗独特型抗体间浓度对应关系，绘制替代标准曲线及对应的线性回归方程（如图6），作为定量换算公式，本实施例的线性回归方程为y = 37.22x-13.14，r²=0.989。

5. 饲料中ZEN无毒ELISA检测技术的建立 

用玉米赤霉烯酮抗独特型抗体标准曲线代替ZEN抗原标准曲线，检测过程分为两步：

依据Biotinylated-β-Id-1D5对β-Id-1D5标准抑制曲线计算出实验抑制率所对应的β-Id-1D5质量浓度；

再根据定量换算公式（步骤4得出的线性回归方程）计算出对应的ZEN浓度。

6. 样品检测 

ZEN标准品购自Sigma公司，配制不同浓度的ZEN标准品，将不同量ZEN标准品加入玉米样品中，进行加标回收，分别采用本发明的ZEN无毒ELISA检测技术和HLPC进行测量，两种方法加测结果有很高相符度，说明本检测方法是可行的。

①用购自Sigma的ZEN标准品配制12.5 ng/mL、15 ng/mL、25 ng/mL三个浓度，做3重复的平行样，分别采用HLPC和本ZEN无毒ELISA检测技术进行检测，结果如下： 

表3

②玉米样品中分别加入20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg三个浓度的ZEN标准品进行加标回收试验，每个加标浓度做3个重复的平行样。分别采用HLPC和本ZEN无毒ELISA检测技术进行检测，结果如下：

表4

Claims (8)

1.杂交瘤细胞株1D5，其特征在于由ZEN单抗免疫小鼠得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成，于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201238。

2.一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体，其特征在于由权利要求1所述杂交瘤细胞株1D5分泌得到，该玉米赤霉烯酮抗独特型抗体为β型抗独特型抗体。

3.权利要求2所述玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）制备ZEN单克隆抗体：采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法制备腹水型ZEN单克隆抗体；

（2）以ZEN单克隆抗体为免疫原，免疫小鼠，细胞融合，经过筛选得到杂交瘤细胞株1D5，诱导分泌抗体；以ZEN为竞争物，通过竞争ELISA筛选最终得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。

4.根据权利要求3所述玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法，其特征在于步骤（1）

所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞1G4G10D3，于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201237。

5.根据权利要求3所述玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法，其特征在于步骤（2）

具体方法为：ZEN单克隆抗体与KLH偶联，偶联物免疫BALB/c小鼠，经血清效价和灵敏度检测合格后，再进行偶联物腹腔注射，3天后取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株1D5，分泌产物经过纯化，得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。

6.权利要求2所述玉米赤霉烯酮抗独特型抗体在玉米赤霉烯酮检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于利用ZEN单克隆抗体和玉米赤霉烯酮抗独特型抗体建立ZEN的竞争ELISA，进行无毒检测。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于检测玉米赤霉烯酮的步骤为：

（1）用生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体；

（2）间接ELISA确定生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的效价；

（3）检测ZEN对生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与ZEN单抗结合的抑制，同时检测玉米赤霉烯酮抗独特型抗体对生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与ZEN单抗结合的抑制，分别绘制ZEN和玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的抑制曲线及其相应线性回归方程；根据抑制率在20%-80%间，在相同抑制率条件下，ZEN与抗ZEN单抗独特型抗体间浓度对应关系，绘制ZEN替代标准曲线及对应的线性回归方程，作为定量换算公式；

（4）检测时用玉米赤霉烯酮抗独特型抗体作为标准品，根据标准曲线计算出实验抑制率所对应的玉米赤霉烯酮抗独特型抗体质量浓度，再根据定量换算公式计算出对应的ZEN浓度。

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