CN102127523A - 杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够产生抗伏马毒素FB1的单克隆抗体，并用于检测伏马毒素FB1污染情况。一种杂交瘤细胞株，其特征在于其保藏编号为CCTCC NO：C201008。本发明的优点在于：本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对伏马毒素FB1的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。本发明的优点还在于：利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。

Description

杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够产生抗伏马毒素FB1的单克隆抗体，并用于检测伏马毒素FB1污染情况。

背景技术

伏马毒素(Fumonisin，FB)主要是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素。其中FB₁是污染物的主要成分、也是导致毒性作用的主要原因。FB₁广泛存在于世界范围的玉米及其制品中，对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。研究证明FB₁可引起马的脑白质软化病(equineleukoencephalomalacia，ELEM)和猪的肺水肿综合症(porcinepulmonary edema，PPE)。流行病学资料显示，人类膳食中FB₁污染与食管癌高发有一定的关联。因此建立一种快速、灵敏、简便的检测方法成为当务之急。

目前，用于分析食品及饲料中的FB₁的检测方法较多，有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱一质谱联用(LC-MS)、气相色谱(GC)、毛细管电泳法(CZE)等。尽管这些方法具有较高的灵敏度，但样品的前处理步骤较多，相对费时且费用较高，特别是不适用于大量样品的筛选。

酶联免疫检测方法(ELISA)提供了一种伏马毒素FB₁的快速、灵敏、简便的检测方法。科学家们先后建立了几种测定FB₁的ELISA检测方法。1994年，Satoshi Fukuda，Ayumu Nagahara，Mamoru Kikuchi等在Biosci.Biotech.Biochem.发表《Preparation and Characterization ofAnti-Fomonisin Monoclonal Antibodies》(Vol.58(4)，765-767)。2000年，Ildiko Barna-Vetro，Erzsebet Szabo，bela Fazekas等在J.Agric.FoodChem.发表《Development of a Sensitive ELISA for the Determination ofFumonisin B₁ in Cereals》(Vol.48，2821-2825)中以单克隆抗体测定谷 物中的FB1。2003年，M.E.SAVARD，R.C.SINHA，R.LAU，C.SEGUIN等人在Food and Agricultural Immunology发表的《MonoclonalAntibodies for Fumonisin B₁，B₂and B₃》(Vol.15，127-134)中以单克隆抗体对玉米样品中FB₁的检测建立了直接ELISA法。目前我国报道关于FB₁的ELISA检测方法还很少。

本发明为检测FB₁，提供一种新的杂交瘤细胞株，能很好地检测出玉米及其饲料制品中伏马毒素的污染量，为保障食品的安全和畜牧业的快速健康发展提供了有力的检测工具和手段。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前检测伏马毒素FB1存在的问题，提供一种能产生与FB1发生抗原抗体反应的IgM亚型抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

本发明的目的是这样实现的：一种杂交瘤细胞株，其特征在于：在中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：C201008，保藏时间为2010年4月15日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

在本发明中：一种杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于

a)将免疫抗原FB₁-KLH与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射每只BALB/C小鼠，每次注射体积为0.2mL，毒素量为40μg，对BALB/C小鼠实施基础免疫；

b)将免疫抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔两周腹腔注射进行一次，重复3～4次，每次注射体积为0.2mL，毒素量为40μg；将免疫抗原与浓度为0.9％的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，经腹腔注射，毒素量为80μg，对BALB/C小鼠实施加强免疫；

c)按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10∶1的比例以50％的PEG4000进行融合，用HAT培养液选择培养，融合后10～15d，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗FB₁的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆；

d)重复c步骤，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

一种上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于：它与FB1发生抗原抗体反应，属IgMκ型，是由杂交瘤细胞株的培养液中获得，或用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得。其中，所述的由杂交瘤细胞株的培养液中获得是指：将杂交瘤细胞细胞按1×10⁶接种量接种到5mL含20％新生小牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养3天，然后将细胞培养液在800rpm下离心10min，收集上清，获得单克隆抗体；所述的用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得是指：选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶-2×10⁶个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水，收取的腹水与4℃、13000rpm离心30min，收集上清，获得单克隆抗体。

一种上述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体用于检测伏马毒素FB1。

在杂交瘤细胞株的应用中，将所述的单克隆抗体配置在检测伏马毒素FB1免疫试剂盒中。

在杂交瘤细胞株的应用中，将所述的单克隆抗体制成用于检测伏马毒素FB1的胶体金免疫试纸条。

在杂交瘤细胞株的应用中，将所述的单克隆抗体制成用于检测伏马毒素FB1的免疫亲和柱。

在杂交瘤细胞株的应用中，通过把杂交瘤细胞产生的抗体用胰蛋白酶或其类似物经酶处理，或经还原可获得本发明的抗体片段。通过从杂交瘤细胞中提取mRNA，把从mRNA制备的cDNA插入到原核或真核表达载体中，再将载体导入原核或真核细胞中，然后在其中表达所需的产物也可获得抗体片段。

本发明的优点在于：本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对伏马毒素FB1的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。

本发明的优点还在于：利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。

附图说明

图1抗体SDS-PAGE电泳图

图2用间接竞争ELISA法测定抗体反应标准曲线

图3免疫胶体金试纸条功能区，其中1：玻璃纤维素膜 2：聚氯乙烯板 3：纤维素膜 4：检测线 5：对照线 6：吸收垫

图4为伏马毒素FB1结构式(Fumonisin B1)

具体实施方式

杂交瘤细胞株的建立

一、实验材料

1.培养基：RPMI1640、新生小牛血清、双抗、HAT和HT选择培养基均购自Gibco公司；弗氏完全/不完全佐剂、降植烷购于Sigma公司。

2.实验动物：Balb/c小鼠，6-8周龄，雌性，按一级动物喂养。

3.其他材料：PEG4000、HRP-羊抗小鼠IgG购自购于Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

二、免疫抗原和筛选抗原的合成

A、采用戊二醛二步法合成FB₁-KLH免疫抗原(伏马毒素FB₁与乙酰化匙孔鏚血蓝蛋白偶联物)，具体步骤如下：

(1)将25％的戊二醛(GA)用PH7.4的PBS稀释至2％；

(2)将60mg KLH用上述戊二醛溶液6ml溶解，4℃连续搅拌反应24h后，在PBS缓冲液中透析36h，除去未反应的戊二醛；

(3)将1mg FB₁溶于1mL甲醇中，逐滴加入到上述KLH溶液中，室温搅拌反应1～2h，然后于4℃连续搅拌15～20h过夜， 形成混合液；

(4)向上述混合液中加入1000ppm的硼氢化钠(NaBH₄)600μl，搅拌2h，中止反应，形成反应液1；

(5)将上述反应液1装入透析袋，在PBS缓冲液中透析72h，分装，-20℃保存备用。

B、采用戊二醛一步法合成FB₁-OVA筛选抗原(伏马毒素FB₁与卵清白蛋白OVA偶联物)，具体步骤如下：

(1)称取7mg OVA溶解于1mL 25％乙醇中；

(2)将1mgFB₁溶于1mL甲醇中在磁力搅拌下于逐滴加入到上述蛋白溶液中，于4℃缓慢加入25％GA溶液90μL，密封后置于4℃连续搅拌过18～24h，形成反应液2；

(3)将上述反应液2装入透析袋，在PBS缓冲液中透析72h，分装，-20℃保存备用。

三、杂交瘤细胞株的建立

1.动物免疫

(1)基础免疫：将免疫抗原FB₁-KLH与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射每只BALB/C小鼠，每次注射体积为0.2mL，毒素量为40μg。

(2)加强免疫：加强免疫采用免疫抗原与弗氏不完全佐剂的乳化液，每隔两周进行一次。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含80μg免疫抗原的生理盐水溶液。

2.杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10∶1的比例以50％的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10-15d，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗FB₁的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。

间接ELISA法的操作步骤如下：用2μg/mL FB₁-OVA包被酶标板，用免疫小鼠血清1∶100作为阳性对照，无克隆生长的培养上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1∶10000羊抗鼠 IgG-HRP100μL，最后测定450nm值，凡OD₄₅₀值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。

3.杂交瘤细胞株的建立

重复步骤2，进行4次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E10，并于2010年4月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201008，保藏地址为中国武汉武汉大学。

4.应用杂交瘤细胞株4E10所得单抗的效价测定

将4E10细胞在含20％新生小牛血清的RPMI1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到16代后进行单抗效价测定。

(1)细胞培养液上清效价测定：将第16代细胞按1×10⁶接种量接种到5mL含20％新生小牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养3天，然后将细胞培养液在800rpm下离心10min，收集上清，用间接ELISA法测定上清中单抗效价，结果表明上清效价为1∶2000-1∶4000。

(2)小鼠腹水效价测定：选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶-2×10⁶个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。收取的腹水与4℃、13000rpm离心30min，收集上清。用间接ELISA法测定上清中单抗效价，效价为1∶1×10⁴～1∶1×10⁵。

5.4E10细胞株的传代培养

将4E10细胞株在含20％新生小牛血清的RPMI1640培养基中继续进行培养、传代，培养到60代后，杂交瘤细胞株4E10仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1∶2000以上。

以上结果表明，所得4E10细胞株能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗伏马毒素FB1的单克隆抗体。

实施例2、应用4E10细胞株制备抗FB₁的单克隆抗体

一、抗体制备

选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷， 7-10天后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶-2×10⁶个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。收取的腹水于4℃，13000rpm离心30min，收集上清。

收集的腹水采用饱和(NH₄)₂SO₄沉淀法进行纯化，具体步骤为：取上述步骤中的上清，加入等体积PBS缓冲液，再加入等体积醋酸缓冲液和33μL辛酸，磁力搅拌30min。于4℃，3000rpm离心30min，取上清；加入等体积的饱和(NH₄)₂SO₄溶液，4℃静置4h，再于4℃、3000rpm离心30min，弃上清；沉淀中加入与第一次相同体积的PBS缓冲液，透析，每隔5h换液一次，透析后的蛋白溶液过0.45μm孔径的微孔膜，得到抗FB1的单克隆抗体(mAb 4E10)。

二、抗体mAb 4E10鉴定及结果如下

1、抗体纯度鉴定

将mAb 4E10用12％SDS-PAGE电泳鉴定纯度，电泳图如图1所示，图中A为蛋白标记物，B为细胞株4E10所生成的小鼠腹水，C为纯化后的小鼠腹水，D为纯化上清。

2、抗体mAb 4E10亚类鉴定

采用小鼠抗体分型试剂盒(sigma)鉴定抗体的亚型。测定结果表明mAb 4E10的亚型为IgM。

3、检测抗体mAb 4E10的轻链和重链的氨基酸序列。

经氨基酸序列测序表明，抗体mAb 4E10的重链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列，轻链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列。

4、交叉反应率(Cross Reactive，CR％)

利用FB₁标准品和类似结构的相关化合物进行交叉反应实验。交叉反应率(CR)＝IC₅₀(FB₁)/IC₅₀(其它类似物)×100％(IC₅₀是抑制率为50％的吸光度时所对应的标准品浓度)。从下表数据可知，本发明的抗体除了与结构形似的FB₂有一定的交叉反应，与其他类型的真菌毒素交叉反应率很低，说明本抗体具有较好的特异性。

表1mAb 4E10与镰刀菌属产生的其它毒素的交叉反应

5、抗体的标准曲线

将纯化所得抗体用0.1M磷酸盐缓冲液PBS稀释1∶2000倍，添加FB₁毒素，使得终浓度为分别为0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL FB₁，用间接竞争ELISA法测定抗体反应标准曲线，结果如图2所示。

FB₁浓度在0.01μg/mL～8μg/mL时，标准曲线线性良好，线性方程为y＝0.8065x+0.2533(R²＝0.9659)，IC₅₀为0.5μg/mL，LOD为0.051μg/mL，LOQ为5.39μg/mL。

6、回收率测定及玉米样品提取方法确定

取高、中、低三个标准品浓度，在酶标板上重复5个数据测定其可重复性，测定A值基本一致，加标玉米样品回收进行ELISA检测，结果见表2，平均回收率在80％以上，变异株数处于10％以内。说明该方法测定结果准确可靠，重复性良好。

表2ELISA检测玉米样品中FB1添加回收率(n＝5)

实施例3、将单克隆抗体用于检测试剂盒

由以上的研究结果，我们研制了伏马毒素FB1的免疫检测试剂盒，由于本发明的抗FB1单克隆抗体具有较高的灵敏性，并且理化 性质稳定，可以按照标准方法方便地制备检测伏马毒素的试剂盒。

以下是本发明利用抗伏马毒素FB1单克隆抗体制备的一种检测试剂盒的具体组成：

包被抗原：伏马毒素FB1半抗原与血蓝蛋白KLH的偶联物，50μl/瓶，使用时用包被缓冲液稀释3000倍；

检测抗体：小鼠腹水经纯化获得，100μl/瓶，使用时用PBS缓冲液稀释6000倍和样品预混；

底物：四甲基联苯胺(TMB)，5mg/瓶；

HRP标记的羊抗鼠IgG：工作浓度1∶10000，用PH7.4的磷酸盐缓冲液稀释使用；

0.65％的过氧化氢：100μl/瓶；

脱脂奶粉：0.5g/瓶；

20X磷酸盐缓冲液：50ml；

20X碳酸盐缓冲液：50ml；

20X磷酸碳酸盐缓冲液：50ml；

2M硫酸：20ml；

96孔可拆卸酶标板二块。

检测试剂盒工作方法：按实施例2中有关方法进行检测。

实施例4、将单克隆抗体用于制备胶体金免疫试纸条

胶体金试纸条主要由样品垫、胶金垫、固相硝酸纤维素膜(NC)和吸收垫4部分组成。

只要能够制备出胶体金，可以采用任何方法，优先采用的是柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒。用上述伏马毒素的抗体进行标记纯化，并包被在玻璃纤维膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜(胶体金垫)。在PVC(聚氯乙烯)底板上依次将包被有抗原和MAb的NC膜、胶体金垫与玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫按图3组装，组装好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即为抗体检测试纸条成品。

实施例5、将单克隆抗体用于制备免疫亲和柱

免疫亲和层析可分为三个步骤：

(1)将上述单克隆抗体与基质/微珠共价交联并制备抗体亲和层析柱。将上述伏马毒素的抗体以共价方式交联到固相基质/微珠上，优先使用的是将抗体交联到蛋白A或蛋白G微珠上。

(2)将抗原结合到抗体-微珠/基质上。在抗体-微珠基质制备好后，转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，将抗原(或待纯化的样品)加入到层析柱中，然后用20倍柱床体积的结合缓冲液(即PBS)洗柱。

(3)抗原的洗脱。用适当苛刻的洗脱条件处理免疫复合物，降低抗体与抗原结合的亲和力，抗原即被释放到洗脱液中。再用20倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生，加入0.01％硫柳汞可长期保存于4℃的环境中。

实施例6、利用杂交瘤细胞株获得抗体片段

抗体片段的获得可通过以下途径：通过将上述杂交瘤细胞产生的抗体用胰蛋白酶或其类似物经酶处理，或经还原可获得本发明的抗体片段。

抗体片段也可通过以下途径获得：利用上述杂交瘤细胞株，提取其RNA，反转录获得cDNA，参考小鼠重轻链可变区旁侧保守序列设计简并引物，通过PCR的方法从4E10cDNA中分别扩增出重链和轻链可变区，再通过linker将重链和轻链可变区连接获得单链抗体文库，通过多轮淘选获得高亲和力的单链抗体，再将筛得的抗体转入菌株中高效表达获得本发明的抗体片段。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于其保藏编号为CCTCC NO：C201008。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于按如下步骤获得

a)将免疫抗原FB₁-KLH与弗氏完全佐剂混合并充分乳化，腹腔注射对BALB/C小鼠实施基础免疫；

b)收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用HAT培养液选择培养，融合后10～15d，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗FB₁的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆；

c)获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体与FB1发生抗原抗体反应，属IgM亚型的抗体，是由杂交瘤细胞株的培养液中获得，或用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体重链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列，所述的单克隆抗体轻链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列。

5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于由杂交瘤细胞株的培养液中获得是指：将杂交瘤细胞细胞按1×10⁶接种量接种到5mL含20％新生小牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养3天，然后将细胞培养液在800rpm下离心10min，收集上清，获得单克隆抗体；用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得是指：选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶～2×10⁶个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水，收取的腹水于4℃、13000rpm离心30min，收集上清，获得单克隆抗体。

6.一种根据权利要求1所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体用于检测伏马毒素FB1。

7.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于将所述的单克隆抗体配置在检测伏马毒素FB1免疫试剂盒中。

8.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于将所述的单克隆抗体制成用于纯化伏马毒素FB1的胶体金免疫试纸条。

9.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于将所述的单克隆抗体制成用于纯化伏马毒素FB1的免疫亲和柱。

10.一种根据权利要求1所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于通过把杂交瘤细胞产生的抗体用胰蛋白酶或其类似物经酶处理，或经还原可获得的抗体片段；通过从杂交瘤细胞中提取mRNA，把从mRNA制备的cDNA插入到原核或真核表达载体中，再将载体导入原核或真核细胞中，然后在其中表达所需的产物也获得抗体片段。

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