CN102478577A - 一种检测伏马菌素的化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：发光板为吸附有伏马菌素与卵清蛋白（OVA）偶联物的可拆96孔不透明白色发光板，偶联物包被浓度为0.25mg/L；标准品浓度为0、0.1、0.5、2.5、12.25、61.25ug/L的甲醇：PBS（7：93，v/v）：化学发光底物液为鲁米诺和过氧化氢溶液两部分按1：1混合：稀释液为含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.4）：10倍浓缩的洗涤液为0.1M的磷酸盐缓冲液（含有0.5%吐温-20）。具有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等特点，可用于谷物等粮食及其制品中伏马菌素的检测。

Description

一种检测伏马菌素的化学发光试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明公开一种伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，属于免疫检测领域。

背景技术

伏马菌素（Fumonisins）是20世纪80年代末期发现的一类主要由串珠镰刀菌（Fusarium Moniliforme）产生的真菌毒素，到目前为止，已经发现包括伏马菌素有伏马菌素B1（FB1）、伏马菌素B2（FB2）和伏马菌素B3（FB3）等在内的11种，其中FB1是污染玉米或串珠镰刀菌培养物中伏马菌素的主要组分，也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。FB1相对分子质量为721.83。在众多的真菌毒素中，伏马菌素被认为是对人、畜健康威胁较严重的真菌毒素之一，它广泛存在于世界范围的玉米及其制品中，与人类食管癌的高发率有关，可引起马脑白质软化症(ELEM)，猪肺水肿症候群(PPE)、并具有致癌活性。许多动物实验证明，它可引起实验动物的肝、肾损伤。因此其在食品卫生领域中越来越受到人们的重视，是一种具有重大卫生学意义的真菌毒素，已被国际癌症研究中心（IARC）列入人类可能的致癌物名单。自伏马菌素被发现后，立刻引起世界各国的广泛重视，相继建立了各种检测方法，对伏马菌素在食品中的污染状况进行了广泛的调查，一些国家相继制定了伏马菌素在食品及饲料中的限量标准。目前我国尚未建立伏马菌素的限量标准。

检测伏马菌素的方法主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis)、气/质联用法(GC/MS)、液体二次离子探针质谱法(Liquid- SMS)、放射免疫检测技术(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。HPLC法和毛细管电泳法等仪器分析方法具有较高的灵敏度和特异性，但是需要复杂的提取净化步骤和较贵重的仪器，不易推广使用。ELISA方法虽具有简单、快速、灵敏的特点，也适宜大规模的筛查工作，但其灵敏度有一定的制约。本发明提供的伏马菌素化学发光酶联免疫检测试剂盒，通过检测发光底物产生的光信号代替ELISA方法中的显色底物，提高了检测的灵敏度，具有特异，快速，可靠的特点。

发明内容

本发明提供了一种伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，具有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等特点，可用于谷物等粮食及其制品中伏马菌素的检测。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法。

本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理，在间接竞争ELISA的基础上，将免疫分析法与化学发光法相结合而实现的。

本发明检测伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括已包被的发光板、标准品、酶标羊抗小鼠IgG、伏马菌素单克隆抗体、化学发光底物液、稀释液、10倍浓缩的洗涤液。

其中：

所述发光板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被有伏马菌素与卵清蛋白偶联物制成的包被抗原，其包被浓度为0.25mg/L。

所述伏马菌素系列标准溶液浓度分别是0、0.1、0.5、2.5、12.25、61.25μg/L。

所述酶标羊抗小鼠IgG为商品化原液，其工作浓度为1：5000。

所述伏马菌素单克隆抗体是由伏马菌素FB1与血蓝蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠获得的单克隆抗体，该抗体与伏马菌素FB2、FB3的交叉反应率398%和56%。其工作浓度为1：20000。

所述发光液是增强型鲁米诺化学发光底物液，分试剂A（含有发光增强剂的鲁米诺化学发光底物溶液）和B（过氧化氢溶液），临用时1：1混合。

所述稀释液为含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.4）。

所述10倍浓缩的洗涤液为0. 1M的磷酸盐缓冲液（含有0.5% 吐温-20）。

本发明试剂盒最大检测范围为0.1～61.25 μg/L。

试剂盒中涉及的试剂主要成份及配制方法如下：

1．稀释液：0.5%BSA-PBS

                                                 

 2.10倍浓缩洗涤液           

 

 3. 化学发光底物

A液：   

 

 B液：0.3%的H₂O₂

使用时A液与B液按体积比1：1混合。

本发明的积极效果在于：具有灵敏度高，简便快速，安全稳定的特点，较传统的ELISA方法，灵敏度提高1个数量级以上。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1、抗原的制备

1.1免疫抗原的制备

采用戊二醛法将伏马菌素与血蓝蛋白偶联，具体操作为：将1.0 mg KLH、600 μg FB1溶于1.0 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液，加入等体积0.5%的戊二醛溶液，室温搅拌2h，加入0.25 mL 1 mol/L甘氨酸，继续搅拌1h后透析并浓缩，复溶于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液中，-20℃冻存。

1.2包被抗原的制备

采用戊二醛法将伏马菌素与卵清蛋白偶联，具体操作为：将1.5 mg OVA、300 μg FB1溶于1.5 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液，加入等体积0.5%的戊二醛溶液，室温搅拌2h，加入0.375 mL 1 mol/L甘氨酸，继续搅拌1h后透析并浓缩，复溶于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液中，-20℃冻存。

、单克隆抗体的制备

取12周龄雌性Balb/c小鼠，经足垫免疫。首免疫采用福氏完全佐剂与免疫抗原乳化，免疫的剂量为40μg/只；其后换用福氏不完全佐剂与免疫抗原乳化，于第4、7天加强免疫，免疫的剂量为20μg/只。第14至17天检测血清抗体，效价达1：4000即可进行融合。取腘淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，采用常规方法进行细胞融合并筛选杂交瘤细胞株，腹水法获得单克隆抗体，辛酸-硫酸铵法纯化。

、化学发光酶免疫检测方法的建立

3.1包被抗原与抗体浓度的优选

将包被抗原按2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L用包被液（0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液）稀释并纵向包被发光板，100μL/孔，4℃ 24h，用洗液洗涤3次，250μL/孔，3min/次，在吸水纸上拍干。加入100μL/孔系列稀释的伏马菌素单克隆抗体（1：10000至1：1280000），37℃ 45min，洗板（同前）。加入1：5000稀释的酶标羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃ 60min，洗板。加入现配的发光底物溶液，100μL/孔，测定发光值。以发光值随包被抗原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。

3.2抗体灵敏度的测定

根据2.1确定包被抗原浓度为0.25mg/L，抗体稀释倍数为1：40000，进行抗体灵敏度的测定：

3.2.1 取96孔不透明白色发光板，将包被抗原用包被液稀释至0.25mg/L，每孔内加入100μL，4℃ 24h。用洗液洗涤3次，250μL/孔，3min/次，在吸水纸上拍干。

3.2.2 加稀释抗体（1：20000）50μL/孔与不同浓度的标准品50μL/孔于已包被的反应板孔内，37℃ 45min，洗板（同前）。

3.2.3 加入稀释的酶标羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃ 60min，洗板（同前）。

3.2.4 加入临时配制的发光底物溶液，100μL/孔，测定发光值。

3.2.5 检测结果以抑制率计算。抑制率（%）=B/B₀*100（%），B是不同浓度标准品竞争的发光值，B₀是不加标准品的发光值。计算50%抑制率时标准品的浓度即为该抗体的灵敏度。

、伏马菌素化学发光酶联免疫检测试剂盒

4.1 试剂盒的组成

4.1.1 包被有包被抗原的发光板：发光板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被有伏马菌素与卵清蛋白偶联物制成的包被抗原，其包被浓度为0.25mg/L。

4.1.2 伏马菌素系列标准溶液：浓度分别是0、0.1、0.5、2.5、12.25、61.25μg/L。

4.1.3 酶标羊抗小鼠IgG：其工作浓度为1：5000，用稀释液稀释。

4.1.4 伏马菌素单克隆抗体：纯化抗体浓度为1 g/L，其工作浓度为1：20000，用稀释液稀释。

4.1.5发光液：增强型鲁米诺化学发光底物液，试剂A（含有发光增强剂的鲁米诺化学发光底物溶液）和B（过氧化氢溶液）单独分装，临用时1：1混合。

4.1.6 稀释液：含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.4）。

4.1.7 洗涤液（10倍浓缩）：0. 1M的磷酸盐缓冲液（含有0.5% 吐温-20）。

4.2 发光板的制备方法

取96孔不透明白色发光板，将包被抗原用包被液稀释至0.25mg/L，每孔内加入100μL，4℃ 24h。用洗液洗涤3次，250μL/孔，3min/次，在吸水纸上拍干。用铝箔袋真空密封保存。

试验例1

试剂盒在方法学上的鉴定

本试剂盒中所设伏马菌素标准品浓度为0、0.1、0.5、2.5、12.25、61.25μg/L，其定量检测范围为0.1-61.52 μg/L，最小检检出量为0.1 μg/L。

伏马菌素FB1与伏马菌素FB2、FB3的交叉反应率398%和56%。与黄曲霉毒素B1、桔青霉素、玉米赤霉烯醇、赭曲霉毒素、T-2毒素、展青霉素均无交叉反应。

试验例2

伏马菌素化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用

1 试剂的配制方法

1.1 洗涤液：将试剂盒中的浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后备用。

1.2 发光液：按所需量，将试剂盒中发光试剂A和B在临用前配制使用。

2 样品前处理

2.1样品经组织高速捣碎机磨成粉，过40目网筛，称取5g加到50mL离心管中，加入甲醇：水（30：70，v/v）25mL，振荡提取15min，3500 转离心 10min，用1moL/L NaOH，将上清pH值调至7.4为样品提取液。用水10倍稀释进行检测。

3 检测步骤

3.1 临用前将发光板及所需试剂回复至室温，待用。

3.2 按样品前处理方法制备样品。

3.3 加样。向发光板中加入伏马菌素系列标准溶液或样品溶液50μL，然后加入工作浓度的伏马菌素抗体溶液50μL，37℃ 45min。

3.4 洗涤。倾出孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次， 每次3min，在吸水纸上拍干。

3.5 加入酶标羊抗小鼠IgG。每孔加入工作浓度的抗体溶液100μL，37℃ 60min。

3.6 洗涤。倾出孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤4次， 每次3min，在吸水纸上拍干。

3.7 加入发光溶液。每孔加入现配制的底物发光溶液100μL。

3.8 用化学发光免疫分析仪测定发光值。

4 结果判断

以抑制率为纵坐标，伏马菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，则样品的浓度可以从标准曲线获得。

抑制率（%）=B/B₀*100（%），B是不同浓度标准品孔（或样品孔）的发光值，B₀是不加标准品孔的发光值。

试验例3

玉米粉加标样品的检测

将空白玉米粉按试验例1中的方法进行前处理，设3个伏马菌素添加浓度分别为0.5、5.0、50μg/L，利用本发明中的化学发光试剂盒进行检测。其平均批内变异系数为8.2%（n=5），平均批间变异系数为12.8%（n=5），回收率范围在84.0%-113.6%之间。同时利用玉米粉质控样品（Biopure，含伏马菌素B1 2406 ± 612μg/kg）验证方法的可靠性。

Claims (2)

1.一种检测伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括已包被的发光板、标准品、酶标羊抗小鼠IgG、伏马菌素单克隆抗体、化学发光底物液、稀释液、10倍浓缩的洗涤液：

其中，发光板为吸附有伏马菌素与卵清蛋白（OVA）偶联物的可拆96孔不透明白色发光板，偶联物包被浓度为0.25mg/L；

标准品浓度为0、0.1、0.5、2.5、12.25、61.25ug/L的甲醇：PBS（7：93，v/v）：

化学发光底物液为鲁米诺和过氧化氢溶液两部分按1：1混合：

稀释液为含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.4）：

10倍浓缩的洗涤液为0. 1M的磷酸盐缓冲液（含有0.5% 吐温-20）。

2.根据权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）抗原的制备

采用戊二醛法将伏马菌素分别与血蓝蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原和包被抗原；

2）单克隆抗体的制备

取Balb/c小鼠，采用足垫免疫并取腘淋巴结，常规融合法制备单克隆抗体；

3）化学发光酶免疫检测方法的建立

将包被抗原用包被液稀释并纵向包被发光板，用洗液洗涤拍干；加入稀释的伏马菌素单克隆抗体，洗板；加入1：5000稀释的酶标羊抗小鼠IgG，洗板；加入现配的发光底物溶液，100μL/孔，测定发光值；以发光值随包被抗原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定；

4）试剂盒的组装

包被有包被抗原的发光板：发光板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被有伏马菌素与卵清蛋白偶联物制成的包被抗原，其包被浓度为0.25mg/L；

伏马菌素系列标准溶液；

酶标羊抗小鼠IgG：

伏马菌素单克隆抗体：发光液：增强型鲁米诺化学发光底物液，试剂A（含有发光增强剂的鲁米诺化学发光底物溶液）和B（过氧化氢溶液）单独分装，临用时1：1混合；

稀释液：0.01M的磷酸盐缓冲液（含有0.5%BSA，pH7.4）；

洗涤液：0. 1M的磷酸盐缓冲液（为10倍浓缩液，含有0.5% 吐温-20）；

发光板：取96孔不透明白色发光板，将包被抗原用包被液稀释至0.25mg/L，每孔内加入100μL，4℃ 24h，用洗液洗涤3次，250μL/孔，3min/次，在吸水纸上拍干；用铝箔袋真空密封保存。