CN102680696A - 一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法 - Google Patents

Abstract

一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明首先从新鲜花生仁中获取含Arah1纯度较高的花生蛋白，用其免疫小鼠获得14株单抗，从中选择P/N值最大者的组合为最优组合。利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（OD值），即可确定待测抗原含量。本发明直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA法，检测花生过敏成分Arah1。

Description

一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测花生过敏成分Arah1方法的建立，属于免疫分析技术领域。

背景技术

近年来，食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题，而花生是最常见的八大食品过敏原之一。过敏疾病严重危害人们的身体健康，虽然激发过敏反应的最低过敏原的量随着人群的不同而不同，但是微量的过敏原就可以使绝大部分患者产生过敏症状。为了避免接触微量的过敏原，过敏原的检测成为当务之急。现在，虽然有许多过敏原检测方法可供借鉴，但在具体应用上都存在着各自不同的问题。体内实验方法可提供最为直接的证据，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全点，但却存在着准确性差的缺点。目前体外微量的检测方法有免疫法、PCR法、组胺释放实验法、过敏原指纹快速检测法等。虽然目前有关过敏原检测的方法很多，但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析仪器等，这些制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。

双抗体夹心法是检测抗原的最常用方法，操作步骤如下：

1)将特异性抗体与固相载体联接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质；

2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗体抗原复合物。洗涤除去未结合的抗原物质；

3)加酶标抗体，保温反应。固相抗体抗原复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关；

4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于建立一种可以直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA方法。用于检测花生过敏成分Arah1。

本发明所说的双抗体夹心ELISA检测花生过敏成分Arah1方法，是鼠抗花生过敏成分Arah1单克隆抗体作为一抗包被，与其配对成功的鼠抗花生过敏成分Arah1单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记后作为二抗，夹心法检测花生过敏成分Arah1。

本发明方法中所说的鼠抗花生过敏成分Arah1单克隆抗体，其制备方法是：杂交瘤的准备，筛选出针对花生过敏成分Arah1的强阳性细胞株14株用于免疫BALB/c小鼠，收集该免疫小鼠的腹水，进行脱脂纯化酶标，将此14株细胞株进行配对筛选，得到配对成功即两株能检测针对花生过敏成分Arah1的细胞株。

本发明方法的检测分析原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比（在本方法可检测范围内）。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（OD值），即可确定待测抗原含量。

本发明的技术方案：一种花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法， 

（1）酶标板的制备：所用的包被原是鼠抗Arah1单克隆抗体，所用包被缓冲液是0.05 M、pH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含0.1％明胶的上述包被缓冲液；

其中，鼠抗Arah1单克隆抗体是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制备；

（2）酶标二抗是辣根过氧化物酶标记与一抗配对成功的鼠抗Arah1单克隆抗体；

（3）洗涤液PBST的配方为：1000 mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9 g、氯化钾0.2 g、吐温-20  0.5mL。

（4）标准品稀释液的配方为：在含30%体积甲醇的pH 6.5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠；

（5）显色液包括A液和B液，A液配方为每100 mL水中加入0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂；B液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于100 mL乙二醇，使用时按A︰B=1︰1体积比使用；

（6）终止液为2 mol/L的硫酸；

检测步骤为： 

1)以鼠抗Arah1单克隆抗体anti-Arah1-NO.8作为捕获抗体包被酶标板，100μL/孔，以0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液为包被缓冲液，37℃孵育2h；

2)洗板：包被后，将酶标板内容溶液洗掉，拍干，每孔加220μL洗涤液，放摇床上振动3min，倒掉拍干，再加洗液反复洗板三次；

3)封闭：将板拍干后，每孔220μL封闭液，37℃孵育2h，洗板三次拍干，置37℃烘箱15min烘干备用；

4)加受检标本，以NaCl含量为0.9%的0.01M pH 7.4的 PBS溶液稀释， 100ul/孔，37℃孵育0.5h，同法洗板拍干；

5)加酶标鼠抗Arah1单克隆抗体HRP-anti-Arah1-NO.5作为检测抗体，以含0.1%明胶的PBST为抗体稀释液，100ul/孔，37℃孵育0.5h，同法洗涤拍干；

6)显色：每孔加入100 μL显色液，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

本发明的有益效果：本发明建立了一种可以直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA方法，用于检测花生过敏成分Arah1。

附图说明

图1 Arah1双抗体夹心ELISA标准曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂

Costar96孔8×12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

AKTA purifier10 自动快速蛋白纯化系统，superdex 7510/300 GL 凝胶过滤柱   GE health life sciences公司

垂直电泳仪  Bio-rad公司

倒置生物显微镜  德国莱卡公司

二、试剂：

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP–IgG)，康成生物工程公司

四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司

Arah1标品，Indoor 公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1、花生过敏原的提取与纯化

a、将新鲜花生仁去皮，研磨粉碎。称取10g，按1:10（W/V）浸入石油醚（60~90）中4℃脱脂，磁力搅拌下过夜，静置0.5h，8000r离心20min，弃上清，反复脱取三次，沉淀用吹风机冷风吹干。

b、随即按1:20（W/V）浸入0.05M、pH 7.4 PBS中浸提，磁力搅拌4h，静置0.5h，8000r离心20min，去残渣，取上清。

c、在b所得上清中缓慢加入硫酸铵固体，边加边搅拌，加入的完全溶解后才继续往后加，直至饱和度为30%，4℃静置0.5h，8000 r/min离心20 min，沉淀用所述PBS复溶。继续往上清液中加硫酸铵同理得到60%、80%饱和度组分。上述分级组分分别装入透析袋中，在0.05M、pH 7.4 PBS中透析24h。

d、上述三个分级组分分别用紫外测定其蛋白含量，然后用SDS-PAGE鉴定各组分蛋白成分。

e，通过SDS-PAGE鉴定后，挑选含有Arah1较多的硫酸铵沉淀组进行凝胶过滤层析。层析柱为superdex 7510/300 GL 凝胶过滤柱，层析条件：洗脱液为0.05M、pH 7.4 PBS，流速为0.35mL/min，280nm紫外吸收监测。收集所需出峰样品，超纯水透析24h即得含Arah1纯度较高的花生蛋白。

2、单抗的准备

用上述得到的Arah1纯度较高的蛋白免疫小鼠，挑选效价最高的小鼠进行冲刺免疫，冲免三天后取其脾脏中脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合后筛选出阳性杂交瘤细胞并及时进行亚克隆，经多次亚克隆后，挑选到14颗强阳性的纯细胞株。将这14株细胞株扩大培养，将收集的细胞腹腔注射到已打石蜡油的BALB/c小鼠体内，待小鼠腹部明显变大且行动迟缓时抽取腹水，5000r/min、10min后收集中层澄清腹水。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法分别纯化收集到的14类腹水，并记为anti-Arah1-NO.1~14。

3、配对筛选

采用过碘酸钠法对纯化后的抗体anti-Arah1-NO.1~14进行HRP标记，并用直接ELISA法鉴定HRP标记抗体是否成功。

利用两种单抗进行双抗体夹心法ELISA法检测过敏原时，必须是针对不同抗原表位的两种单抗才能成功，而所针对的两个抗原表位的空间位置也是双抗体夹心法ELISA法效果好坏的关键。以制备的anti-Arah1-NO.1~14这14种单抗中的任意一种稀释1000倍包被酶标板，然后封闭，封闭后加入Arah1标准品溶液，设置阳性对照（P，100ng/mL的Arah1标准品溶液）和阴性对照（N，0ng/mL的Arah1标准品溶液），待标准品与包被抗体反应后，加入除包被的单抗外的13种HRP标记的抗Arah1单抗(稀释1000倍)，显色终止、检测后，选择P/N值最大者的组合为最优组合。

4、ELISA方法条件的优化

通过优化实验，建立了Arah1双抗体夹心ELISA检测方法，最终确定的工作条件为：以anti-Arah1-NO.8为捕获抗体，稀释1600倍包被酶标板；以HRP-anti-Arah1-NO.5为检测抗体，工作浓度为800倍稀释；包被液采用0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液；封闭液为含0.1%明胶的包被液；以NaCl含量为0.9%的0.01M pH 7.4的 PBS溶液作为样品稀释液，含0.1%明胶的PBST为酶标抗体稀释液。

5、ELISA标准曲线的建立

根据优化的ELISA条件，建立Arah1标准曲线。配制成一系列的Arah1标准溶液：1200ng/mL、600ng/mL、300ng/mL、150ng/mL、75ng/mL，37 ng/mL，18 ng/mL，9 ng/mL，4.5 ng/mL，2.3 ng/mL，1.1 ng/mL，0.5 ng/mL 12个浓度梯度，每个浓度做3个重复，零孔做6个重复。以标品浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标绘制曲线。根据绘制的曲线选取最佳的线性范围，最低检测限（LOD）为零孔加3倍标准差所对应标准曲线上的浓度值。本实验建立的Arah1双抗体夹心ELISA检测方法检测限达到0.42ng/mL，线性范围是为0.8～100μg/mL。具体见附图1。 

6、ELISA检测方法评估

1)将纯牛奶稀释五倍，分别添加Arah1标准品至浓度为1ng/mL，5ng/mL，30 ng/mL，60 ng/mL，每个浓度做6次测定平均值，做5次重复实验，添加回收实验结果见表1。

表1  Arah1双抗体夹心ELISA精密度、稳定性和准确度验证

	批间（n=6）		批次（n=6）
					添加量（ng/ml）	检测值±SD(ng/ml)	回收率（%）	检测值± SD(ng/ml)	回收率（%）
60	70.51±5.879	117	69.00±6.79	114.9
					30	30.80±3.149	102	29.06±3.79	98.28
5	4.673±0.279	93.9	5.207±0.289	103.54
					1	1.403±0.066	139.2	1.289±0.210	128.93

由表1可知，在批间实验中，回收率在93.9~139.2之间，变异系数在4.68%~10.32%之间，在批次实验中，回收率在98.28~128.9之间，变异系数在6.98%~12.30%之间，所以建立的Arah1双抗体夹心ELISA检测方法精密度高、稳定性和准确度好。

2）实际样品检测：从本地超市选购10种包装食品，按建立的ELISA方法进行Arah1实际样品检测，根据标准曲线结果进行分析，检测结果如表2所示

表2 样品检测结果分析

样品	P/N值	结果判定	检测值（ng/g）
				诗蒂果仁巧克力	23.48	阳性	＞500
阿里山蒜香豌豆	2.08	阴性
				银鹭花生牛奶	6.89	阳性	13.62
四季宝颗粒花生酱	18.21	阳性	399.21
				雀巢早餐咖啡	1.08	阴性
天喔煮瓜子	1.52	阴性
				散装生花生米	19.60	阳性	＞500
鲁花压榨花生油	1.82	阴性
				奥利奥巧克力饼干	17.23	阳性	＞500
味全花生面筋	3.46	阳性	4.29

表2中，6种标注含有花生成分的食品均检测阳性，而花生油和标注不含花生成分的食品均检测为阴性，同时也说明所制备的抗体对瓜子和豌豆蛋白没有交叉反应，抗体特异性较好。所以本检测方法可靠，能用于实际检测。

Claims (1)

1.一种捡测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：

（1）酶标板的制备：所用的包被原是鼠抗Arah1单克隆抗体，所用包被缓冲液是0.05 M、pH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含0.1％明胶的上述包被缓冲液；

其中，鼠抗Arah1单克隆抗体是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制备；

（2）酶标二抗是辣根过氧化物酶标记与一抗配对成功的鼠抗Arah1单克隆抗体；

（3）洗涤液PBST的配方为：1000 mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9 g、氯化钾0.2 g、吐温-20  0.5mL；

（4）标准品稀释液的配方为：在含30%体积甲醇的pH 6.5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠；

（5）显色液包括A液和B液，A液配方为每100 mL水中加入0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂；B液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于100 mL乙二醇，使用时按A︰B=1︰1体积比使用；

（6）终止液为2 mol/L的硫酸；

检测步骤为： 

1)以鼠抗Arah1单克隆抗体anti-Arah1-NO.8作为捕获抗体包被酶标板，100μL/孔，以0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液为包被缓冲液，37℃孵育2h；

2)洗板：包被后，将酶标板内容溶液洗掉，拍干，每孔加220μL洗涤液，放摇床上振动3min，倒掉拍干，再加洗液反复洗板三次；

3)封闭：将板拍干后，每孔220μL封闭液，37℃孵育2h，洗板三次拍干，置37℃烘箱15min烘干备用；

4)加受检标本，以NaCl含量为0.9%的0.01M pH 7.4的 PBS溶液稀释， 100μL/孔，37℃孵育0.5h，同法洗板拍干；

5)加酶标鼠抗Arah1单克隆抗体HRP-anti-Arah1-NO.5作为检测抗体，以含0.1%明胶的PBST为抗体稀释液，100μL/孔，37℃孵育0.5h，同法洗涤拍干；

6)显色：每孔加入100 μL显色液，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。

Images