CN105112376A

CN105112376A - 一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN105112376A
Application number: CN201510561370.7A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 彭双; 胥传来; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 宋珊珊; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2015-12-02

Abstract

一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。本发明将金刚烷胺完全抗原与等量福氏免疫佐剂TM混合均匀后，通过背部多点注射免疫BALB/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株，命名为1E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.？10865。此细胞株1E5分泌的单克隆抗体，对金刚烷胺具有较好的亲和力和检测灵敏度，亲和常数为8.04×10⁹？L/mol，检测灵敏度IC₅₀值为1ng/mL，可以用于食品安全中金刚烷胺含量的检测。

Description

一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其产生的抗金刚烷胺单克隆抗体和应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术

金刚烷胺为抗病毒药物和抗震麻痹药，由于其毒副作用强，早在2005年农业部就明确规定禁止金刚烷胺等抗病毒兽药的销售和使用。

目前检测金刚烷胺的方法主要有仪器检测方法和免疫检测方法。仪器检测方法虽然检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，样品前处理繁琐。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及由该细胞株制备的抗体，所述抗体对金刚烷胺具有较好的亲和力和高检测灵敏度，可以用来建立金刚烷胺总量的免疫学检测方法，或金刚烷胺免疫亲和柱的制备。

本发明的技术方案，一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10865。

金刚烷胺单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.10865的金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株1E5所分泌产生。

所述金刚烷胺单克隆抗体的应用，所述的金刚烷胺单克隆抗体在金刚烷胺分析检测中的应用。

所述金刚烷胺单克隆抗体的应用，将通过体内腹水制备的金刚烷胺单克隆抗体应用于金刚烷胺的ELISA添加回收试验。

该小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株1E5也属于本发明的保护范围。

本发明提供的1E5细胞株的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：金刚烷胺与6-溴已酸反应后，通过活化酯法与蛋白载体相连，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过蛋白质电泳方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏免疫佐剂^TM混合均匀后，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；免疫过程总共五次：第一次将金刚烷胺完全抗原与福氏完全佐剂混合，后三次用金刚烷胺与福氏不完全佐剂混合免疫，最后一次用完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株1E5；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：IC₅₀值、亲和力的测定通过ELISA法。

所述的金刚烷胺单克隆抗体在金刚烷胺分析检测中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明获得金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株1E5，对金刚烷胺有高检测灵敏度和亲和力，（IC₅₀值为1ng/mL和亲和力亲常数为8.04×10⁹L/mol）；

（2）通过制备新的抗体的思路，在于用两种或更多结构相似的半抗原的完全抗原，连续间隔免疫，得到很好的通用型单克隆抗体细胞株。

生物材料样品保藏：一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株1E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10865。保藏日期：2015年5月19日。

附图说明

图1细胞株1E5分泌的金刚烷胺单克隆抗体对金刚烷胺的标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将金刚烷胺完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对金刚烷胺具有较好亲和力和高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1：杂交瘤细胞株1E5的制备

（1）完全抗原的合成

将金刚烷胺6-溴已酸加入到甲苯中，氮气保护下升温至130℃回流48h；减压浓缩，加水，水相用盐酸调pH约为2后加乙酸乙酯萃取，饱和NaCl洗涤，干燥浓缩得产品金刚烷胺半抗原。取10mg金刚烷胺半抗原，加入2mL超纯水溶解，再分别加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），EDC（碳二亚胺）；半抗原︰NHS︰EDC的摩尔比为1︰2︰2，室温下，混匀，搅拌反应6h，再在室温25℃下反应12h进行活化。取25mg牛血清蛋白，半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80︰1，加入5mL0.1MpH9.6碳酸盐缓冲液。将活化的金刚烷胺半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺完全抗原。

（2）动物免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取金刚烷胺完全抗原（1mg/mL）与等量福氏免疫佐剂^TM混合均匀后，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只200μL。第一次免疫用金刚烷胺完全抗原与福氏完全佐剂混合免疫，之后用金刚烷胺完全抗原与福氏不完全佐剂混合免疫，间隔时间均为21天；四免后10天采血，使用间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在四免后15天冲击免疫，只用金刚烷胺完全抗原不使用佐剂，腹腔注射。

（3）细胞融合

在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10的计数比例混合，离心后用50%PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HAT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用金刚烷胺标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对金刚烷胺标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株1E5。

实施例2单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞株1E5，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对金刚烷胺的IC₅₀为1ng/mL，亲和常数为8.04×10⁹L/mol，说明对金刚烷胺具有很好的灵敏度和亲和力，可用于金刚烷胺总量免疫分析检测和亲和柱的制备。

实施例3抗体应用

将金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株1E5通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于金刚烷胺的ELISA添加回收试验，具体步骤如下:

（1）用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的1.5μg/mLAm-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；

（2）用含0.01%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；

（3）磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.03，0.1，0.3，1，3，9，27ng/mL的金刚烷胺标准溶液。将金刚烷胺标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL1︰16000稀释的抗金刚烷胺单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（4）每孔加入100μL用含0.01%明胶的PBS1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（5）每孔加入100μLTMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL2MH₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

（6）添加回收及样品前处理：称取2g空白鸡肉样品均质样品置入50mL离心管中，分别添加0.5ng、1ng及5ng金刚烷胺。向样品中加入5mL乙腈，再加入0.5gNaCl，用振荡器振荡5min，室温400r/min离心5min；移取3mL上层液体至离心管中，于50℃氮气吹干；加入0.5mL正己烷，用漩涡仪涡动1min，再加入0.5mLPBS溶液，室温离心3min。除去上层有机相，取下层水相用于分析，稀释倍数为0.5倍，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为75%，82%，92%。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH₂PO₄，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05%吐温-20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按1︰5体积比混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.一株金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10865。

2.金刚烷胺单克隆抗体，其特征在于：其由所述保藏编号为CGMCCNo.10865的金刚烷胺单克隆抗体杂交瘤细胞株1E5所分泌产生。

3.权利要求2所述金刚烷胺单克隆抗体的应用，其特征在于：所述的金刚烷胺单克隆抗体在金刚烷胺分析检测中的应用。

4.权利要求3所述金刚烷胺单克隆抗体的应用，其特征在于：将通过体内腹水制备的金刚烷胺单克隆抗体应用于金刚烷胺的ELISA添加回收试验。