CN104560886A - 一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。本发明将纳他霉素完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后免疫都用不完全弗氏佐剂。将高效价低IC₅₀的小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤（单克隆）细胞株。此（单克隆）细胞株分泌的单克隆抗体，对纳他霉素具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为2.2μg/L），可以用于食品安全中纳他霉素的残留检测。

Description

一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域，涉及杂交瘤细胞株M及其产生的抗纳他霉素单克隆抗体。

背景技术

纳他霉素是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌抑制剂，属于多烯大环内酯类。它不仅能够抑制真菌，还能防止真菌毒素的产生。可广泛用于食品防腐保鲜以及抗真菌治疗。纳他霉素对细菌没有抑制作用，因此它不影响酸奶、奶酪、生火腿、干香肠的自然成熟过程。1982年6月，美国FDA正式批准纳他霉素可以用作食品防腐剂。1996年，中国食品添加剂标准化学技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂。

目前，纳他霉素的测定方法主要有生物效价法、微孔板生物检测法、紫外分光光度计法、元素分析法、比色分析法、薄层色谱法和液相色谱法等。生物效价测定法对实验环境因素（温度等）、材料因素（培养基等）、操作技术等条件要求高，操作过程也比较繁琐；微孔板生物检测法适用于大批量的发酵液或样品的检测；紫外分光光度法一般用来做纳他霉素检测的常规对照，若将其用于定量分析，对实验条件要求比较高；元素分析法、比色分析法和薄层色谱法主要用于纳他霉素的定性分析；高效液相色谱法(HPLC)多集中于高纯度纳他霉素产品及食品中纳他霉素残留量的检测分析，但是这种方法的样品前处理繁琐、耗时、仪器贵重、需要专业人员来操作，不能实现大量样品的同时检测。因此建立一种快速、简单、高通量的纳他霉素检测方法具有重要意义。酶联免疫吸附分析法（ELISA）是一种极为高效、灵敏的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高灵敏性和高特异性的单克隆单体是免疫学检测的前提。

发明内容

    本发明提供一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对纳他霉素具有较好特异性和检测灵敏度,可以用来建立纳他霉素的免疫学检测方法。

    本发明提供一种对纳他霉素具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体的制备方法。

本发明的技术方案：一株纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株M,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9802。

所述杂交瘤细胞株M分泌产生的纳他霉素单克隆抗体，它由所述的杂交瘤细胞株M所分泌产生。

所述的纳他霉素单克隆抗体的应用，在纳他霉素分析检测中的应用。

纳他霉素单克隆抗体，是由保藏号为 CGMCC  No.9802的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株M 所分泌。

本发明提供的M细胞株的制备，基本步骤为：

（1）免疫原的合成：称取纳他霉素20mg，溶解于3mL DMF中；称取100mg BSA，溶解于5mL PBS 中；将50μL 质量浓度25%戊二醛溶液逐滴加入纳他霉素溶液中，避光在室温下搅拌活化30min；将活化好的纳他霉素逐滴加入BSA中，避光在室温下搅拌反应4h。反应结束后，用0.01M PBS透析三天去除未反应的纳他霉素，得到纳他霉素和BSA的偶联物，并用紫外进行表征。

（2）小鼠的免疫：纳他霉素抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天。最后一次用纳他霉素（不含佐剂）冲击免疫，通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合和细胞株的建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株M；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明获得的抗纳他霉素单克隆抗体细胞株，对纳他霉素有较好的检测灵敏度和特异性，IC₅₀值为2.2μg/L。

生物材料样品保藏：一株纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株M，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年10月 15日，保藏编号为CGMCC No.9802，分类命名为：单克隆细胞株。

附图说明

图1. 细胞株M单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将纳他霉素抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对纳他霉素有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例 1：杂交瘤细胞株M的制备

1、抗原的合成

称取纳他霉素20mg，溶解于3mL DMF中；称取100mg BSA，溶解于5mL PBS 中；将50μL 质量浓度25%戊二醛溶液逐滴加入纳他霉素溶液中，避光在室温下搅拌活化30min；将活化好的纳他霉素逐滴加入BSA中，避光在室温下搅拌反应4h。反应结束后，用0.01M PBS透析三天去除未反应的纳他霉素，得到纳他霉素和BSA的偶联物，并用紫外进行表征。

2．小鼠免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取纳他霉素抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

3.细胞融合

    在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用纳他霉素为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对纳他霉素标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株M。

5、单克隆抗体的制备与鉴定

    取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10--⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存；

使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体纳他霉素的IC₅₀分别为：2.2μg/L，说明对纳他霉素有很好的灵敏度，可用于纳他霉素免疫分析检测。

6. 抗体应用

将杂交瘤细胞株M通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于纳他霉素的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原NATA-GA-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL /孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

（8）添加回收及样品前处理：吸取1mL牛奶于15mL离心管中，向

牛奶中分别添加20ng，50ng，100ng纳他霉素，用0.01M PBS稀释牛奶 20倍，采用间接ELISA 进行添加回收试验，其回收率分别为109%，109%，110%。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明专利申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株M，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9802。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株M分泌产生的纳他霉素单克隆抗体，其特征在于：它由所述的杂交瘤细胞株M所分泌产生。

3.权利要求2所述的纳他霉素单克隆抗体的应用，其特征在于在纳他霉素分析检测中的应用。