CN105907725B

CN105907725B - 一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh7及其应用

Info

Publication number: CN105907725B
Application number: CN201610538905.3A
Authority: CN
Inventors: 刘丽强; 王忠兴; 胥传来; 匡华; 徐丽广; 马伟; 吴晓玲; 宋珊珊; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-07-11
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2036-07-11
Also published as: CN105907725A

Abstract

一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明提供的抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12022。所述杂交瘤细胞株CGMCC No.12022可以分泌产生对氢化可的松具有较好的特异性和较高的灵敏度，对氢化可的松的50%抑制浓度IC₅₀为0.1μg/L，可以用于制备氢化可的松的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为食品安全中氢化可的松的特异性检测和畜牧业快速健康的发展提供有力的检测方法及手段。

Description

一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

氢化可的松（Hydrocortisone，HDS）是一种重要的肾上腺皮质激素，具有调节糖、脂肪和蛋白质生物合成和代谢的作用，还具有抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克等多种药理作用。在饲料中使用可以促进动物生长，增强动物免疫力以及增加动物体重等的作用，在奶牛饲养中还可用于治疗奶牛乳房炎，增加产奶量等。其不当使用可能会导致水产品、肉类、蛋类及乳类中的氢化可的松残留污染。欧盟、美国、日本均规定了其在牛奶中的最大残留限量为10μg/kg。

已报道的测定氢化可的松的方法主要有液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱法、毛细管电色谱、放射免疫法等。然而，这些方法都存在一定的缺陷，例如色谱法和质谱法需要专门的技术人员和昂贵的仪器，并且对环境的要求也相对较高；放射性免疫方法尽管比较准确和稳定，但是它存在着放射性同位素污染的问题，这在非专业实验室是无法解决的。因此，建立一种简单、快速、灵敏度高、安全性好的氢化可的松检测方法具有重要意义。

酶联免疫法检测技术具有成本低、高通量、灵敏度高、仪器设备简单、对技术人员要求低和分析速度快等优点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种对氢化可的松具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的单克隆抗体对氢化可的松具有较好的亲和力和特异性，可以用来建立氢化可的松酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发及市场推广奠定基础。

本发明的技术方案，一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.12022。

抗氢化可的松特异性单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12022的抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7分泌产生。

所述抗氢化可的松特异性单克隆抗体的应用，用于食品安全中氢化可的松的残留检测。

本发明提供的抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7制备基本步骤如下：

（1）免疫原的制备与鉴定：氢化可的松为原料，通过琥珀酸酐取代，得到氢化可的松四碳取代物（HDS-HS），LC-MS鉴定结果。衍生后的半抗原HDS-HS通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG-4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株YH7；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC₅₀值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。

本发明的有益效果：本发明获得的抗氢化可的松单克隆抗体细胞株，对氢化可的松有较好的检测灵敏度和亲和力；还提供了一种新的合成氢化可的松免疫原的方法，其半抗原的合成步骤更加简化有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株YH7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12022，保藏日期2016年1月20日。

附图说明

图1是免疫原的紫外吸收光谱表征。

图2是抗氢化可的松特异性单克隆抗体对氢化可的松的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将氢化可的松完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对氢化可的松有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1：抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7的制备

（1）完全抗原的合成：称取0.1g 氢化可的松和0.3g琥珀酸酐于50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水吡啶，混合物在60℃下加热搅拌12h，将反应物转入含10% HCl(V/V)的冰水（4℃）中，有白色沉淀析出，离心除去吡啶及过量的琥珀酸酐，去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后，LC-MS鉴定后保存，作为半抗原；

取2mg上述半抗原，溶解于3mL的DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中，再加入2.5mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和1.5mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），室温搅拌，活化4h；另取7.5mg KLH（钥孔血蓝蛋白）溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB（碳酸盐缓冲溶液）溶液中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析三天，-20℃分装保存。

（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取氢化可的松完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。

（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比2-10︰1的比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清，质量浓度2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含质量浓度为20%的胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用氢化可的松为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对氢化可的松有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH7。

（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型，具体如表1所示。

表1. 氢化可的松单克隆抗体的亚型鉴定

使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对氢化可的松的IC₅₀为0.1μg/L，并验证了其对氟氢可的松（FDS），地塞米松（DEX），泼尼松龙（PRE），己烯雌酚（DES），己烷雌酚（HES），双烯雌酚（DS）等的IC₅₀和交叉反应率，具体如表2所示。

表2. YH7单克隆抗体对氟氢可的松，地塞米松，泼尼松龙，己烯雌酚，己烷雌酚以及双烯雌酚的IC₅₀和交叉反应率。

（6）抗体应用：

将杂交瘤细胞株YH7通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于氢化可的松ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

d、用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL的氢化可的松包被作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

e、用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；

f、用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2μg/L的氢化可的松标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰16000稀释的抗氢化可的松单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

g、每孔加入100μL 用含0.1% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

h、每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

i、添加回收及样品前处理：称取1g阴性牛奶样品置入50mL离心管中，分别添加0.4ng、0.8ng及 2ng 氢化可的松。向样品加入25mL 80%的甲醇PBS溶液（w/v）震荡均匀后，超声提取15min，静置后上清用0.45μm滤膜过滤，滤液用含0.01% 明胶的PBS稀释4倍后，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为93%，94%，97%。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.62g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% Tween-20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12022。

2.抗氢化可的松特异性单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCCNo.12022的抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH7分泌产生。

3.权利要求2所述抗氢化可的松特异性单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全中氢化可的松的残留检测。