CN115637258B - 一种丙酸氯倍他索人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丙酸氯倍他索人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明合成了一种丙酸氯倍他索半抗原，半抗原与载体蛋白偶联合成完全抗原，随后与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。将高滴度和高灵敏度小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞，并进行多次亚克隆，最终得到一株杂交瘤细胞。此细胞株分泌的单克隆抗体，对丙酸氯倍他索具有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为0.11ng/mL)与特异性，可以用于丙酸氯倍他索的残留检测。

Description

一种丙酸氯倍他索人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其 应用

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，尤其涉及一种丙酸氯倍他索人工抗原、 单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

丙酸氯倍他索的英文通用名为：Clobetasol propionate，CAS:25122-46-7， 别名：氯倍他索丙酸酯。丙酸氯倍他索为抗炎皮质类固醇，是一种皮肤科外 用糖皮质激素类药物，适用于慢性湿疹、神经性皮炎、银屑病、掌跖脓疱病、 扁平苔藓、盘状红斑狼疮等糖皮质激素外用治疗有效的瘙痒性及非感染性炎 症性皮肤病。丙酸氯倍他索具有较强的抗炎、抗瘙痒和毛细血管收缩作用， 其抗炎作用约为氢化可的松的112.5倍，倍他米松磷酸钠的2.3倍，氟轻松的 18.7倍。同时具有抑制细胞有丝分裂的作用，能有效地渗透进皮肤角质层。 丙酸氯倍他索广泛应用于皮肤疾病的治疗，常见的有丙酸氯倍他索软膏，并且在部分化妆品中也有添加，特别是婴幼儿面霜中已报到含量超标，过量的 使用丙酸氯倍他索会使得局部可出现毛细血管扩张、多毛、皮肤萎缩、创伤 愈合障碍，并使皮肤容易发生继发感染，如毛囊炎及真菌感染。长期、大面 积使用可因药物的累计吸收作用，出现糖皮质激素所致的全身性反应，出现 库欣综合征，表现为多毛、痤疮、满月脸、高血压、骨质疏松、精神抑郁、 伤口愈合不良等。儿童长期使用可抑制生长发育。因此，对于丙酸氯倍他索的检测十分必要。

目前，丙酸氯倍他索检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、 液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度 和特异性，但也存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂 贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简便的检测丙酸氯倍 他索残留物的方法。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法， 检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操 作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在药物残留分析中得到了广 泛应用。而使用酶联免疫法检测丙酸氯倍他索的前提是得到对丙酸氯倍他索具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对丙酸氯倍他 索具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过 杂交瘤细胞制备丙酸氯倍他索单克隆抗体，但在制备能分泌丙酸氯倍他索单 克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备丙酸氯倍他索半抗原和完全抗 原和如何使小鼠产生强免疫效应，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂 交瘤细胞株能够成功分泌出丙酸氯倍他索单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的丙酸氯倍他索单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进 一步的研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种丙酸氯倍他索人工抗原、单克 隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的丙酸氯倍他索单克 隆抗体对丙酸氯倍他索具有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为0.11ng/mL)，可以 用于建立丙酸氯倍他索的免疫学检测方法，检测化妆品，乳膏等中丙酸氯倍 他索的残留。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一株分泌丙酸氯倍他索单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，所述杂交瘤细胞株分类命名为单克隆细胞株，已于2022年03月03 日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.45122，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供所述分泌丙酸氯倍他索单克隆抗体的杂交瘤 细胞株的制备方法，包含如下步骤：

(1)制备丙酸氯倍他索半抗原及丙酸氯倍他索完全抗原，将获得的丙酸 氯倍他索完全抗原与弗氏佐剂进行乳化得到免疫原1，丙酸氯倍他索完全抗原 与不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；

(2)将步骤(1)所得免疫原1对动物进行首次皮下免疫，并用免疫原2 进行加强免疫；

(3)对经过步骤(2)免疫过程的动物进行采血，筛选出血清中丙酸氯 倍他索抗体灵敏度高的动物；

(4)对步骤(3)筛选出的动物进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏 佐剂的丙酸氯倍他索完全抗原；

(5)将步骤(4)冲刺免疫后的动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合， 得到所述分泌丙酸氯倍他索单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述丙酸氯倍他索半抗原的 分子式为：

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述丙酸氯倍他索完全抗原 的分子式为：

在本发明的一种实施方式中，所述丙酸氯倍他索半抗原通过以下方法制 备得到：将丙酸氯倍他索溶解在溶剂中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐搅拌，反 应物氮气吹干后加入有机溶剂，收集有机相，得到丙酸氯倍他索半抗原。

在本发明的一种实施方式中，所述丙酸氯倍他索完全抗原通过以下方法 制备得到：将丙酸氯倍他索半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于溶剂中，搅拌反应，得到活化的丙酸氯倍他 索半抗原溶液，将丙酸氯倍他索半抗原溶液加入到载体蛋白溶液中进行反应， 得到丙酸氯倍他索完全抗原。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中，所述免疫之间的间 隔在3-4周，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18天～21天。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中，所述首次免疫剂量 为50-100μg/只，加强免疫剂量为首次免疫的一半，冲刺免疫剂量为加强免疫 的一半。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中，所述免疫过程，包 含1次首次免疫、4-6次加强免疫和1次冲刺免疫；

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述采血为第3次免疫过程 结束后第5-8天进行采血。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述融合是在冲刺免疫结束 3天～5天后进行。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述融合是通过聚乙二醇 (PEG4000)法进行的。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述培养基为RPMI-1640培 养基。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述亚克隆次数为2-4次。

本发明的第三个目的是提供所述杂交瘤细胞株在制备丙酸氯倍他索单克 隆抗体中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种丙酸氯倍他索单克隆抗体，所述丙酸氯 倍他索单克隆抗体是由所述杂交瘤细胞株分泌获得。

本发明的第五个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交 瘤细胞株和/或所述的丙酸氯倍他索单克隆抗体。

本发明的第六个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交 瘤细胞株、所述的丙酸氯倍他索单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。

本发明的第七个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的丙酸氯倍他索 单克隆、所述的组合物或所述的试剂盒在检测丙酸氯倍他索中的应用。

本发明的技术方案具有以下优点：

(1)本发明获得的丙酸氯倍他索单克隆抗体对丙酸氯倍他索有较好的检 测灵敏度(IC₅₀值为0.11ng/mL)；

(2)本发明获得的丙酸氯倍他索单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检 测。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施 例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明丙酸氯倍他索单克隆抗体对丙酸氯倍他索的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术 人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的 限定。

下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨 酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L- 羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸 15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、 L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、 无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱 甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌 醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维 生素B120.005、碳酸氢钠2000。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液：称取Na₂CO₃1.59 g，NaHCO₃2.93 g，分别溶于少量双蒸 水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液：8.00gNaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

磷酸缓冲液T：含0.05％吐温20的磷酸缓冲液；

抗体稀释液：含0.1％明胶的磷酸缓冲液；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容 至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混 合即为TMB显色液，使用时再进行混合。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

丙酸氯倍他索抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗 原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至0.01μg/mL，0.03μg/mL，0.1 μg/mL和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03μg/mL，0.1μg/mL， 0.3μg/mL和1μg/mL。选择最佳工作点后，将丙酸氯倍他索标准品稀释为8 个浓度(0ng/mL，0.019ng/mL，0.056ng/mL，0.17ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL， 5ng/mL和10ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图 (结果如图1所示)，获得丙酸氯倍他索标准抑制曲线，计算IC₅₀。

丙酸氯倍他索交叉反应测定方法：用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至0.01 μg/mL，0.03μg/mL，0.1μg/mL和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至 0.03μg/mL，0.1μg/mL，0.3μg/mL和1μg/mL，采用ic-ELISA进行测定，加 入不同结构类似物的标准溶液，测定所制备的丙酸氯倍他索单克隆抗体对结 构类似物的交叉率。

实施例1：丙酸氯倍他索半抗原的合成

由于丙酸氯倍他索小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答， 进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将丙酸氯倍他索偶联到蛋白上，使 其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯 基等，鉴于丙酸氯倍他索分子结构式中不含有这些活泼基团，因此对丙酸氯 倍他索进行衍生。

将500mg丙酸氯倍他索溶解在10mL无水吡啶中，加入410mg羧甲基 羟胺半盐酸盐(CAS：2921-14-4)，溶解搅拌。密封后，37℃搅拌过夜，反 应物氮气吹干。加入8mL甲醇水溶液(v/v,甲醇:纯水＝3:5)，涡旋振荡并加 入5mL乙酸乙酯，萃取3次，收集有机相。有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量黄色粘稠蜡状固体，吹干后即得到丙酸氯倍他索半抗原。

实施例2：丙酸氯倍他索完全抗原的合成

称取9.2mg丙酸氯倍他索半抗原，8mg N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应10min；再称取9.2mg 1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入到丙酸氯倍他索半抗原溶液中，室温搅拌反 应8h-10h，进行活化。取6mg钥孔血蓝蛋白，加入到3mL0.01 M碳酸盐缓 冲液，充分溶解，将活化的半抗原缓慢加入到溶解了钥孔血蓝蛋白(KLH) 的稀释液中，室温搅拌过夜。然后用0.01M磷酸缓冲液溶液透析，除去未反应的小分子物质，得到较为纯净的丙酸氯倍他索完全抗原，并通过紫外吸收 扫描方法进行鉴定。

实施例3：丙酸氯倍他索包被原的合成

将4.5mg丙酸氯倍他索半抗原和3.1mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应10min；将7.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于上述溶液中，室温搅拌进行反应8h-10h，得到半 抗原活化液；将6mg牛血清白蛋白溶解于碳酸盐缓冲液中；将半抗原活化液 缓慢加入到蛋白稀释液中，室温搅拌过夜。然后，用0.01M磷酸缓冲液溶液 透析反应液，除去未反应的小分子物质，得到包被原。

实施例4：分泌丙酸氯倍他索单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫的获得

将丙酸氯倍他索完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进 行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂， 剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/ 只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为 25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间 隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶 联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。

2、细胞融合

在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进 行细胞融合，具体步骤如下：

a、颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右， 无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网 得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗 涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％胎牛血清 RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中进行扩增，融合前要求SP2/0瘤细胞数 量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤 细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞 中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640 培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7 min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。除第2min，其他时间不断晃 动溶液。然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加 到96孔细胞板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合后的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液， 第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行 全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用丙 酸氯倍他索为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。

选择对丙酸氯倍他索标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行 亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。

按上述方法进行至少三次亚克隆，最终获得丙酸氯倍他索单克隆抗体细 胞株。

实施例5：丙酸氯倍他索单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后 每只小鼠腹腔注射1×10⁶丙酸氯倍他索杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水， 将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋 白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆 抗体，离心，弃上清，用0.01M的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测得丙酸氯倍他索单克隆抗体的IC₅₀值为0.11 ng/mL，并验证其对结构类似物的IC₅₀及交叉反应率，对丙酸氯倍他索结构类 似物交叉率小于5％，其中，交叉率＝(丙酸氯倍他索的IC₅₀/类似物的IC₅₀) ×100％，根据交叉反应率数值，可以看出该抗体对丙酸氯倍他索有较高的特 异性，具体如表1所示。

表1丙酸氯倍他索单克隆抗体对结构类似物的的IC₅₀及交叉反应

由表1可以看出，丙酸氯倍他索单克隆抗体对丙酸氯倍他索有很好的灵 敏度，可用于丙酸氯倍他索免疫分析检测。

实施例6：丙酸氯倍他索单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于丙酸氯倍他索的 ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液稀释好的浓度为0.1μg/mL的包被原包被96孔酶 标板，每孔100μL，37℃烘2h后，用磷酸缓冲液T洗液洗板三次，每次每 孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的碳酸盐缓冲液进行封闭，每孔200μL，37℃烘2h， 用磷酸缓冲液T洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(磷酸缓冲液)分别配置0ng/m，0.019ng/m，0.056 ng/m，0.17ng/m，0.5ng/m，1ng/m，5ng/m和10ng/mL的丙酸氯倍他索标 准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标 板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.1μg/mL 的丙酸氯倍他索单克隆抗体，37℃反应30min后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的磷酸缓冲液以1:3000稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应30min后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入 50μL2 M的H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

(6)添加回收及样品前处理：

称取待测乳膏样品0.5g，分别称取三份样品，向样品中分别添加1μg/kg、 5μg/kg、10μg/kg的丙酸氯倍他索标准品，加入5mL甲醇，涡旋分散溶解， 超声提取20min，10000r/min离心10min，吸取上清液至50mL离心管中， 加入20mL超纯水，混匀，直接上固相萃取小柱净化。将HLB固相萃取柱置 于固相萃取装置上，小柱预先依次用5mL甲醇，10mL水活化，将待净化的 样品清液全部流经柱子，随后用5mL 30％的甲醇清洗离心管，并淋洗固相萃 取柱，再用5mL甲醇缓慢洗脱HLB柱，收集洗脱液。

采用ic-ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为90.4％，110.7％， 93.5％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的 限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出 其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而 由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一株分泌丙酸氯倍他索单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2022年03月03日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45122，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备丙酸氯倍他索单克隆抗体中的应用。

3.一种丙酸氯倍他索单克隆抗体，其特征在于，所述丙酸氯倍他索单克隆抗体是由权利要求1中所述杂交瘤细胞株分泌获得。

4.一种用于检测丙酸氯倍他索的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株和/或权利要求3所述的丙酸氯倍他索单克隆抗体。

5.一种用于检测丙酸氯倍他索的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求3所述的丙酸氯倍他索单克隆抗体和权利要求4所述的组合物中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求3所述的丙酸氯倍他索单克隆抗体、权利要求4所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在检测丙酸氯倍他索中的应用。

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