CN109293771A - 一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体。该方法采用由杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体进行检测；杂交瘤细胞株2D53D12在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15195。采用地塞米松抗体进行检测采用酶联免疫吸附法进行。实验证明，利用由杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体可以检测地塞米松，不仅灵敏度高，而且特异性好。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测地塞米松的方法及其专用单克隆抗体，尤其涉及一种检测化妆品中地塞米松的方法及其专用单克隆抗体。
背景技术
地塞米松(别名为氟美松、氟甲强地松龙或德沙美松)的化学名称为16α-甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮，CAS登录号为24916-90-3，分子式为C22H28O5，相对分子量为392，化学结构式见式(I)。
地塞米松对皮肤疾病(如湿疹)有良好的疗效，甚至对由皮肤炎症引起的严重斑块牛皮癣也能起到缓解作用。因此，地塞米松被用于进行临床治疗。但是长期大剂量使用或者长期局部使用强效地塞米松，会引发依赖性，使血管扩张，皮肤形成红色斑点，副作用很多。有不良商家在化妆品(如面膜、面霜、药膏、乳液)中添加地塞米松以代替成本较高的功效添加物，使消费者在使用后的皮肤状态能在短期内有明显改善，但是容易造成依赖性，还可能引发皮炎或其它更严重的疾病，因此地塞米松已被列为化妆品禁用物质。目前，已有相关规定禁止地塞米松等41种糖皮质激素在化妆品中添加。但近几年来的抽检活动中，仍然有大量违禁添加的化妆品被检出。为净化市场，保障消费者的合法权益，有必要建立高效、灵敏的检测地塞米松的方法。
地塞米松检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法(ELISA方法)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS联用法)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS联用法)。薄层色谱法虽然能够进行简单的定性分析，但其灵敏度较低。GC-MS联用法检测地塞米松时，需经过一些列衍生化反应使激素获得挥发性，所以采用GC-MS联用法检测地塞米松具有较大的困难。LC-MS联用法是GB/T 24800.2-249采用的检测化妆品中41种糖皮质激素的方法，在动物饲料和组织的检测中也有广泛的应用；LC-MS联用法不需要对样品进行衍生化处理，前处理过程略微简单一点，但其余操作过程仍然非常复杂。GC-MS联用法要求分析物具有挥发性，LC-MS联用法对分析物没有此类要求，但也需要具有较高的纯度避免损害仪器，这两种方法使用的仪器价格均比较高昂，日常维护的成本也很高，还需要掌握实验操作技能的技术人员来使用。相比之下，ELISA方法使用的仪器设备更实用，且对样品纯度要求也不高，前处理过程简便，整体操作简单易行，且比薄层色谱法灵敏度更高，常被用来检测动物尿液、组织和饲料中的糖皮质激素。此外，虽然已有关于地塞米松的单克隆抗体报道，但化妆品剂型多样，基质复杂，还未有采用ELISA方法检测化妆品中的地塞米松的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测地塞米松的方法，尤其是检测化妆品中的地塞米松含量的方法。
本发明首先保护杂交瘤细胞株2D53D12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15195。
本发明还保护由所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体。
本发明还保护一种检测地塞米松的方法，可包括步骤a4)：采用地塞米松抗体进行检测；
所述地塞米松抗体为以式(II)所示的化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备的抗体；
上述方法中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
上述方法中，式(II)所示的化合物与载体蛋白通过酰胺键连接。所述酰胺键是式(II)所示的化合物的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。所述偶联物可为地塞米松-卵清白蛋白偶联物(式(III)所示化合物)或地塞米松-牛血清白蛋白偶联物(式(IV)所示化合物)。
地塞米松-卵清白蛋白偶联物的制备方法可如下：(1)将式(II)所示的化合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺用有机溶剂溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)向含卵清白蛋白的磷酸盐缓冲液中滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-卵清白蛋白偶联物。
地塞米松-卵清白蛋白偶联物的制备方法具体可如下：(1)将9.8mg式(II)所示的化合物、9.0mg N-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺用0.4mL二甲基亚砜溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)取18mg卵清白蛋白，加入5mL pH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-卵清白蛋白偶联物。
地塞米松-牛血清白蛋白偶联物的制备方法可如下：(1)将式(II)所示的化合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺用有机溶剂溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)向含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-牛血清白蛋白偶联物。
地塞米松-牛血清白蛋白偶联物的制备方法具体可如下：(1)将9.8mg式(II)所示的化合物、9.0mg N-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺用0.4mL二甲基亚砜溶解，室温搅拌至出现白色沉淀后，离心，收集上清液；(2)取26mg牛血清白蛋白，加入5mL pH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(1)收集的上清液，4℃搅拌12h，离心，收集上清液；该上清液即为地塞米松-牛血清白蛋白偶联物。
上述方法中，所述地塞米松抗体可为a1)或a2)或a3)：
a1)由所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体；
a2)所述免疫原免疫动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；
a3)所述免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体。
上述方法中，所述动物可为小鼠、兔、山羊、绵羊或马中的任一种。
上述方法中，所述“采用地塞米松抗体进行检测”可采用酶联免疫吸附法进行。
上述方法中，当检测化妆品中的地塞米松时，还可包括步骤a1)-a3)：
a1)向化妆品中加入乙腈，超声提取；
a2)完成步骤a1)后，离心，收集上清液；
a3)完成步骤a2)后，取所述上清液，氮气吹干，加入磷酸盐缓冲液溶解；
在进行所述步骤a4)前先进行所述步骤a1)-a3)。
所述步骤a1)中，化妆品和乙腈的比例具体可为1g：1-3mL(如1-2mL、2-3mL、1mL、2mL或3mL)。
所述步骤a1)中，超声提取的时间可为5-15min(如5-10min、10-15min、5min、10min或15min)。超声提取的参数可为频率50Hz，温度16-25℃。
所述步骤a1)中，还可加入饱和NaCl溶液。所述化妆品、饱和NaCl溶液和乙腈的比例具体可为1g：2-4mL(如2-3mL、3-4mL、2mL、3mL或4mL)：1-3mL(如1-2mL、2-3mL、1mL、2mL或3mL)。
本发明还保护一种产品，其可含有b1)或b2)或b3)；
b1)式(II)所示的化合物；
b2)上述任一所述偶联物；
b3)上述任一所述地塞米松抗体。
所述产品的应用也属于本发明的保护范围。所述产品的应用可为S1)或S2)：
S1)检测地塞米松；
S2)制备用于检测地塞米松的试剂盒。
上述应用中，所述试剂盒可为酶联免疫吸附试剂盒。
本发明还保护式(II)所示的化合物的制备方法。
式(II)所示的化合物的制备方法可为将式(I)所示化合物、吡啶和丁二酸酐混合，搅拌，获得式(II)所示的化合物；
式(II)所示的化合物的制备方法可为：(1)将100mg式(I)所示化合物、5mL无水吡啶和31mg丁二酸酐混匀，室温搅拌过夜，然后除去溶剂(如采用旋转蒸发仪进行)，收集残留物；(2)向步骤(1)收集的残留物中加入展开剂(石油醚和乙酸乙酯等体积混合而成)进行柱色谱分离，得到的浅黄色液体化合物即为式(II)所示的化合物。
本发明还保护T1)或T2)或T3)：
T1)上述任一所述偶联物在制备地塞米松抗体中的应用；
T2)式(II)所示的化合物在作为地塞米松半抗原中的应用；
T3)上述任一所述偶联物在作为免疫原中的应用。
本发明提供了式(II)所示的化合物，该化合物可以作为地塞米松半抗原与载体蛋白偶联，得到抗原；然后用抗原免疫动物，经体细胞杂交获得的单克隆抗体(即由所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体)。采用酶联免疫吸附法，以该单克隆抗体为一抗检测地塞米松，不仅灵敏度高，而且特异性好。本发明在检测化妆品中的地塞米松含量方面具有重大的应用价值。
附图说明
图1为制备式(II)所示化合物的路线图。
图2为制备式(IV)所示化合物的路线图。
图3为地塞米松标准曲线；其中B0为空白孔的OD450nm值，B为抑制孔的OD450nm值。
图4为直接竞争ELISA方法和LC-MS方法的相关性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的磷酸盐缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.01M)。
实施例1、抗原的制备
一、式(II)所示化合物(即地塞米松半抗原)的制备
制备式(II)所示化合物(即地塞米松半抗原)的路线图如图1所示。
制备地塞米松半抗原的具体步骤如下：
1、取100mg地塞米松标准品，先加入5mL无水吡啶，充分溶解；再加入31mg丁二酸酐，混匀，得到反应体系。
2、取步骤1得到的反应体系，置于室温搅拌过夜，然后用旋转蒸发仪除去溶剂，收集残留物。
3、取步骤2收集的残留物，加入展开剂(石油醚和乙酸乙酯等体积混合而成)进行柱色谱分离，得到的浅黄色液体化合物即为地塞米松半抗原。
二、地塞米松完全抗原的制备
1、地塞米松-卵清白蛋白偶联物的制备
制备地塞米松-卵清白蛋白偶联物(式(III)所示化合物)的具体步骤如下：
(1)取9.8mg地塞米松半抗原，先加入0.4mL二甲基亚砜，充分溶解；再加入9.0mgN-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺，混匀，得到体系1。
(2)取步骤(1)得到的体系1，室温条件下搅拌，待出现白色沉淀后，离心，收集上清液。
(3)取18mg卵清白蛋白，加入5mL pH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(2)收集的上清液，得到体系2。
(4)取步骤(3)得到的体系2，4℃搅拌过夜，然后离心，收集上清液。该上清液即为地塞米松-卵清白蛋白偶联物。
在下文中，地塞米松-卵清白蛋白偶联物简称DSMS-H2-OVA。
2、地塞米松-牛血清白蛋白偶联物的制备
制备式(IV)所示化合物(即地塞米松-牛血清白蛋白偶联物)的路线图如图2所示。
制备地塞米松-牛血清白蛋白偶联物(式(IV)所示化合物)的具体步骤如下：
(1)取9.8mg地塞米松半抗原，先加入0.4mL二甲基亚砜，充分溶解；再加入9.0mgN-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺，混匀，得到体系1。
(2)取步骤(1)得到的体系1，室温条件下搅拌，待出现白色沉淀后，离心，收集上清液。
(3)取26mg牛血清白蛋白，加入5mL pH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(2)收集的上清液，得到体系2。
(4)取步骤(3)得到的体系2，4℃搅拌过夜，然后离心，收集上清液。该上清液即为地塞米松-牛血清白蛋白偶联物。
在下文中，地塞米松-牛血清白蛋白偶联物简称DSMS-H2-BSA。
3、地塞米松-辣根过氧化物酶蛋白偶联物的制备
制备地塞米松-辣根过氧化物酶蛋白偶联物(式(V)所示化合物)的具体步骤如下：
(1)取9.8mg地塞米松半抗原，先加入0.4mL二甲基亚砜，充分溶解；再加入9.0mgN-羟基琥珀酰亚胺和16mg二环己基碳二亚胺，混匀，得到体系1。
(2)取步骤(1)得到的体系1，室温条件下搅拌，待出现白色沉淀后，离心，收集上清液。
(3)取18mg辣根过氧化物酶蛋白，加入5mL pH7.5、0.01M的磷酸盐缓冲液，充分溶解；然后逐滴滴加步骤(2)收集的上清液，得到体系2。
(4)取步骤(3)得到的体系2，4℃搅拌过夜，然后离心，收集上清液。该上清液即为地塞米松-辣根过氧化物酶蛋白偶联物。
在下文中，地塞米松-辣根过氧化物酶蛋白偶联物简称DSMS-H2-HRP。
实施例2、地塞米松单克隆抗体的制备
本实施例中的Bal b/c小鼠为6只6-7周龄的健康Bal b/c雌性小鼠(北京维通利华实验动物有限公司的产品)。
采用pH7.5、0.1M的PBS缓冲液稀释DSMS-H2-BSA，得到浓度为1.0mg/mL(以BSA计)的DSMS-H2-BSA溶液。
一、基础免疫
1、将1mLDSMS-H2-BSA溶液和1mL完全佐剂(美国sigma公司的产品)混合，4℃搅拌至充分乳化(混合物滴入水中不会分散即视为充分乳化)，得到乳化的完全抗原。
2、取乳化的完全抗原，腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只Bal b/c小鼠的注射剂量为0.2mL(其中腹腔0.1mL，背部皮下多点共0.1mL)。
二、加强免疫
1、将1mLDSMS-H2-BSA溶液和1mL不完全佐剂(美国sigma公司的产品)混合，4℃搅拌至充分乳化(混合物滴入水中不会分散即视为充分乳化)，得到乳化的不完全抗原。
2、取乳化的不完全抗原，对完成步骤一两周后的Bal b/c小鼠进行3次免疫，每次免疫间隔两周。每次免疫的步骤如下：取乳化的不完全抗原，腹腔及背部皮下多点注射Balb/c小鼠，每只Bal b/c小鼠的注射剂量为0.2mL(其中腹腔0.1mL，背部皮下多点共0.1mL)。
3、完成步骤2第6天，用毛细玻璃管(直径为0.9-1.1mm)从每只Bal b/c小鼠眼角采血，先室温静置30min，再4℃放置2h，最后4000rpm离心10min，收集上清液；收集的上清液即为Bal b/c小鼠血清。
4、取步骤3收集的上清液，以实施例1二中1制备的DSMS-H2-OVA作为包被抗原，采用棋盘格实验间接非竞争ELISA方法通过计算抑制率来评价抗体效价。抗体效价定义为OD492nm为1.0时Bal b/c小鼠血清的最大稀释倍数。
挑选抗体效价最高的Bal b/c小鼠进行后续实验。抗体效价最高的Bal b/c小鼠的抑制率为86.6％，血清效价高于8×103。
5、取1mLDSMS-H2-BSA溶液，腹腔及背部皮下多点注射步骤4中抗体效价最高的Balb/c小鼠，注射剂量为0.2mL(其中腹腔0.1mL，背部皮下多点共0.1mL)。
6、完成步骤5第4天，将Bal b/c小鼠摘除眼球放血至死，然后取Bal b/c小鼠的脾细胞。
7、完成步骤6后，将Bal b/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(北京勤邦生物技术公司的产品)进行细胞融合，得到若干融合细胞。
三、杂交瘤细胞的克隆
对步骤二得到的融合细胞进行阳性和抑制率检测，筛选出其中的三株杂交瘤细胞，分别命名为2D5细胞株、4A9细胞株和4G6细胞株。
采用有限稀释法对这三株杂交瘤细胞进行克隆，通过对阳性和抑制率的检测，2D5细胞株克隆得到的单克隆细胞株效果更好，再从2D5细胞株中筛选两株阳性和特异性最强的单克隆细胞株，分别命名为2D53D12细胞株和2D53F7细胞株。将这两株细胞进行扩大培养后冻存。其中2D53D12细胞株阳性和抑制率最好。2D53D12细胞株即杂交瘤细胞株2D53D12，已于2017年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15195。
用杂交瘤细胞株2D53D12制备腹水，将收集到的腹水纯化后冻干得到地塞米松单克隆抗体2D5(以下简称单克隆抗体2D5)。
四、单克隆抗体2D5的大量制备与纯化
采用诱导动物体内分泌单克隆抗体的方法大量制备单克隆抗体2D5。
五、单克隆抗体2D5性质的鉴定
1、单克隆抗体2D5的效价
采用间接非竞争ELISA方法检测单克隆抗体2D5的效价。
实验结果表明，单克隆抗体2D5的效价高于8×103。
2、单克隆抗体2D5的性质检测
采用单抗类型检测试剂盒(美国sigma公司的产品)检测单克隆抗体2D5的亚型。
实验结果见表1。结果表明，单克隆抗体2D5的类型为IgG2a。
表1
抗体类型 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA
OD值 0.508 1.075 0.859 0.128 0.104 0.148
实施例3、单克隆抗体2D5在检测化妆品中地塞米松含量的应用
一、地塞米松标准曲线的建立
1、取地塞米松标准品(北京百灵威科技有限公司的产品)，用磷酸盐缓冲液溶解并稀释，得到地塞米松标准品稀释液；地塞米松标准品稀释液的浓度为0.00ng/mL、0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL或50ng/mL。
2、取单克隆抗体2D5，用磷酸盐缓冲液稀释至2μg/mL，然后加入酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后，将酶标板上的液体弃去，用含1％(v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤4次。
3、将各浓度标准品稀释液分别加入酶标板，每孔50μL，随后每孔加入50μL含0.5μg/mL DSMS-H2-HRP的磷酸盐缓冲液，4℃温育30min后，将板上的液体弃去，用含1％(v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤4次。
4、向酶标板加入TMB显色液(美国sigma公司的产品)，每孔100μL，室温显色15min后，加入1M的HCl溶液终止反应，用酶标仪读取各孔的OD450nm值。
以地塞米松标准品稀释液的浓度为横坐标，以吸光度值的比值(B/B0)为纵坐标绘制标准曲线。其中B0为空白孔的OD450nm值(地塞米松标准品稀释液的浓度为0ng/mL)，B为抑制孔的OD450nm值(地塞米松标准品稀释液的其它浓度)。
标准曲线见图3。结果表明，检测地塞米松的IC50(即B/B0为50％时对应的地塞米松浓度)为3.52ng/mL，检测范围(IC20-IC80)为0.7-17ng/mL。
二、化妆品前处理
超声提取的参数为50Hz，温度16-25℃。
1、面膜化妆品前处理
随机选取46个市售面膜化妆品进行前处理，得到面膜样品。每个面膜化妆品进行前处理的步骤如下：
(1)取离心管(规格为10mL)，加入1g面膜化妆品和3mL饱和NaCl溶液，振荡均匀；然后加入2mL乙腈，超声提取10min。
(2)完成步骤(1)后，5000rpmin离心10min，收集上清液(约1mL)。
(3)完成步骤(2)后，取上清液(约1mL)，用氮气吹干；然后加入1mL磷酸盐缓冲液溶解，得到面膜样品。
2、膏霜化妆品前处理
随机选取16个市售面霜化妆品进行前处理，得到面霜样品。每个面霜化妆品进行前处理的步骤如下：
(1)取离心管(规格为10mL)，加入1g面霜化妆品和2mL乙腈，振荡均匀，然后超声提取10min。
(2)完成步骤(1)后，5000rpmin离心10min，收集上清液(约1mL)。
(3)完成步骤(2)后，取上清液(约1mL)，用氮气吹干；然后加入1mL磷酸盐缓冲液溶解，得到面霜样品。
3、润肤水化妆品前处理
随机选取20个市售润肤水化妆品进行前处理，得到润肤水样品。每个润肤水化妆品进行前处理的步骤如下：
(1)取离心管(规格为10mL)，加入1g润肤水化妆品和3mL饱和NaCl溶液，振荡均匀；然后加入2mL乙腈，超声提取10min。
(2)完成步骤(1)后，5000rpmin离心10min，收集上清液(约1mL)。
(3)完成步骤(2)后，取上清液(约1mL)，用氮气吹干；然后加入1mL磷酸盐缓冲液溶解，得到润肤水样品。
三、化妆品中地塞米松含量的测定
待测化妆品样品为46个面膜样品、16个面霜样品和20个润肤水样品。
A、直接竞争ELISA方法检测各个待测化妆品样品中地塞米松的含量
1、取单克隆抗体2D5，用磷酸盐缓冲液稀释至2μg/mL，然后加入酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后，将酶标板上的液体弃去，用含1％(v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤4次。
2、完成步骤1后，将各个待测化妆品样品分别加入酶标板，每孔50μL，随后每孔加入50μL含0.5μg/mL DSMS-H2-HRP的磷酸盐缓冲液，4℃温育30min后，将板上的液体弃去，用含1％(v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤4次。
3、完成步骤2后，向酶标板加入TMB显色液(美国sigma公司的产品)，每孔100μL，室温显色15min后，加入1M的HCl溶液终止反应，用酶标仪读取各孔的OD450nm值(B)。计算各孔吸光度值的比值(B/B0)。B0为空白孔的OD450nm值(即地塞米松标准品稀释液的浓度为0ng/mL)。
根据步骤一绘制的标准曲线，进而计算得出各个待测化妆品样品中的地塞米松含量。
B、采用LC-MS方法检测各个待测化妆品样品中地塞米松的含量。
部分检测结果见表2。
表2
注：ND表示未检测到地塞米松。
3、完成步骤2后，对比本发明提供的直接竞争ELISA方法和LC-MS方法的相关性。相关性的结果见图4。结果表明，本发明提供的直接竞争ELISA方法和LC-MS方法趋势一致，相关性良好，R2为0.988(y＝1.358x+72.44)。由此可见，采用本发明提供的直接竞争ELISA方法检测化妆品中的地塞米松含量具有可行性。

Claims (10)

1.杂交瘤细胞株2D53D12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15195。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体。
3.一种检测地塞米松的方法，包括步骤a4)：采用地塞米松抗体进行检测；
所述地塞米松抗体为以式(II)所示的化合物与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备的抗体；
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述地塞米松抗体为a1)或a2)或a3)：
a1)由权利要求1所述杂交瘤细胞株2D53D12分泌产生的单克隆抗体；
a2)所述免疫原免疫动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；
a3)所述免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述“采用地塞米松抗体进行检测”采用酶联免疫吸附法进行。
6.如权利要求3至5任一所述的方法，其特征在于：当检测化妆品中的地塞米松时，还包括步骤a1)-a3)：
a1)向化妆品中加入乙腈，超声提取；
a2)完成步骤a1)后，离心，收集上清液；
a3)完成步骤a2)后，取所述上清液，氮气吹干，加入磷酸盐缓冲液溶解；
在进行所述步骤a4)前先进行所述步骤a1)-a3)。
7.一种产品，其含有b1)或b2)或b3)；
b1)权利要求3中式(II)所示的化合物；
b2)权利要求3中所述偶联物；
b3)权利要求3或4中所述地塞米松抗体。
8.权利要求7所述产品的应用，为S1)或S2)：
S1)检测地塞米松；
S2)制备用于检测地塞米松的试剂盒。
9.权利要求3中式(II)所示的化合物的制备方法，为将式(I)所示化合物、吡啶和丁二酸酐混合，搅拌，获得式(II)所示的化合物；
10.T1)或T2)或T3)：
T1)权利要求3中所述偶联物在制备地塞米松抗体中的应用；
T2)权利要求3中式(II)所示的化合物在作为地塞米松半抗原中的应用；
T3)权利要求3中所述偶联物在作为免疫原中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112759646A (zh) * 2021-04-07 2021-05-07 北京纳百生物科技有限公司 一种地塞米松单克隆抗体及其应用
CN115637258A (zh) * 2022-10-20 2023-01-24 江南大学 一种丙酸氯倍他索人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103421072A (zh) * 2012-05-19 2013-12-04 北京勤邦生物技术有限公司 地塞米松半抗原及其制备方法和应用
CN105838681A (zh) * 2016-05-30 2016-08-10 江南大学 一株抗地塞米松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株c3及其应用
CN106317153A (zh) * 2015-06-18 2017-01-11 北京维德维康生物技术有限公司 一种地塞米松半抗原制备方法及其应用
CN106443019A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 广东省药品检验所 一种用于快速检测化妆品中多种糖皮质激素的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103421072A (zh) * 2012-05-19 2013-12-04 北京勤邦生物技术有限公司 地塞米松半抗原及其制备方法和应用
CN106317153A (zh) * 2015-06-18 2017-01-11 北京维德维康生物技术有限公司 一种地塞米松半抗原制备方法及其应用
CN105838681A (zh) * 2016-05-30 2016-08-10 江南大学 一株抗地塞米松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株c3及其应用
CN106443019A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 广东省药品检验所 一种用于快速检测化妆品中多种糖皮质激素的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOSHINO NISHIGUCHI等: ""Enzyme immunoassay for serum dexamethasone using 4-(carboxymethylthio)dexamethasone as a new hapten"", 《STEROIDS》 *
罗晓琴等: ""酶联免疫法检测鸡肉中的地塞米松残留"", 《黑龙江畜牧兽医》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112759646A (zh) * 2021-04-07 2021-05-07 北京纳百生物科技有限公司 一种地塞米松单克隆抗体及其应用
CN112759646B (zh) * 2021-04-07 2021-06-22 北京纳百生物科技有限公司 一种地塞米松单克隆抗体及其应用
CN115637258A (zh) * 2022-10-20 2023-01-24 江南大学 一种丙酸氯倍他索人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

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