KR20180128293A

KR20180128293A - 유기인계 농약의 검출을 위한 단일클론 항체의 제조방법

Info

Publication number: KR20180128293A
Application number: KR1020170063676A
Authority: KR
Inventors: 봉진종; 박양찬
Original assignee: 주식회사 넥스바이오
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2018-12-03

Abstract

본 발명은 유기인계 농약의 검출을 위한 단일클론 항체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 개발된 유기인 계열 농약의 검출을 위한 단클론성 항체 및 이를 생산하기 위한 세포주는 항혈청 역가가 높고, 특정 구조의 유기인 농약에 대한 민감도가 특이적으로 높음으로써, 저농도 유기인 농약의 검출에 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

유기인계 농약의 검출을 위한 단일클론 항체의 제조방법{Preparation method of monoclonal antibody for detection of organophosphorus pesticide}

본 발명은 유기인계 농약의 검출을 위한 단일클론 항체의 제조방법에 관한 것이다.

농약은 농업 생산성의 향상과 농산물의 품질 향상을 가져왔으나 농약의 오남용으로 인한 식품과 자연환경의 오염은 우리의 건강에 심각한 위협이 되고 있다. 카바메이트(carbamate) 및 유기인(organophosphate)은 주로 살충제로 사용되고 있으며 농촌에서는 파라티온(parathion), 말라티온(malathion), 클로르피로포스(chlorpyrifos), 디클로르보스(dichlorvos)로 알려져 있다. 이는 주로 해충 구제 목적으로 사용되고 있지만, 매년 아시아 지역의 농촌에서 500,000 명이 유기인 계열 농약에 의해 사망하고 있으며, 그 중 200,000 명은 치사량 이하의 노출에 의한 사망으로 보고되고 있다. 이에 따라 농약의 위해성에 대한 새로운 인식과 더불어 잔류농약을 효율적으로 분석하기 위한 방법의 필요성이 대두되었다.

농약에 대한 노출은 대표적으로 직업적 노출과 비직업적 노출로 나누어 볼 수 있으나, 직업적 노출이 절대량에서 압도적으로 높다. 직업별로는 농업인이 가장 높으며, 농약 제조업 노동자, 정원, 골프장 방제사 및 농약 원료 작업자의 순서로 노출이 높다. 비직업적인 노출군으로는 항공방제지역 거주인, 농약이 오염된 식수음용 인구 집단 및 농약 잔류식품 섭취군 등의 순으로 노출량이 높다.

피부적인 접촉, 흡입 및 섭취를 통해 중독되는 카바메이트 및 유기인은 노출량과 노출 정도에 따라 중간형 증후군(intermediate syndrome), 근위부 근력 약화(proximal muscle weakness), 호흡 근력 약화(respiratory muscle weakness), 안면 근육 약화(facial muscle weakness), 지연 신경병(delayed neuropathy)을 나타낸다.

기존의 농약 분석법으로는 기체 크로마토그래피(gas chromatography, GC)와 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)가 주로 이용되어 왔다. 그러나 GC와 HPLC는 감도가 매우 높고 정확하며 다수성분을 동시에 분석할 수 있다는 장점은 있지만 분석하기에 앞서 전처리 과정을 필요로 하므로 장시간이 소요되며 전문적인 인력과 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다.

이러한 단점을 해결하기 위해 보다 효율적이고 간단하며 경제적인 농약분석법의 개발이 활발하게 시도되고 있는데 그러한 새로운 농약분석법들 중 가장 기대를 모으고 있는 것이 면역분석법(immunoassay)에 의한 농약검출법이다. 면역분석법은 항체의 항원에 대한 높은 친화도와 특이성으로 인하여 감도가 높고 전처리 과정이 거의 불필요하며 신속하고 비용이 적게 든다는 장점을 가지므로 현대적인 물질분석에서 차지하는 비중이 급속도로 높아지고 있다. 면역분석법 중에서도 항원(antigen) 혹은 항체(antibody)를 고체 표면에 고정시키고 항원-항체 반응을 효소반응으로 측정하여 물질을 정량하는 효소결합면역흡착검사 또는 효소면역학적 검사(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)는 생체관련 물질의 분석에 많이 이용되어 왔으며 80년대에 들어 농약의 분석에도 이용되고 있다(Vanderlaan 등, 1991).

면역분석법에서 사용되는 항체로는 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb)와 단일클론 항체(monoclonal antibody, mAb)가 주로 쓰이고 있다. 다클론 항체는 다양한 B세포 클론으로부터 생성된 다양한 항체의 집합체를 말하는데 주입된 항원에 대해서 동물 체내에서 자발적으로 일어나는 면역반응에 의해 생성되므로 항체를 얻는 방법은 비교적 간단하다. 그러나 다클론 항체는 면역화 시킨 동물의 혈청으로부터 얻는데 동물의 종류와 면역화 과정에서의 채혈의 시점에 따라 감도와 특이성이 다양하게 나타나고, 면역에 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 단일클론 항체는 단일의 B세포 클론으로부터 생성된 항체로서, 동일한 친화력과 특이성을 지니므로 물질에 대한 일정한 교차반응성을 가지고 또한 영구적인 항체의 공급이 가능하다는 장점으로 인하여 농약 면역분석법에서의 사용이 증가되고 있다.

대한민국 등록특허공보 0644205호(2005.06.30.).

본 발명에서는 유기인 계열 농약의 고감도 검출을 위해 합성된 합텐과 담체 단백질로 구성된 유기인계 항원을 이용하여 단클론성 항체를 생산할 수 있는 세포주를 개발하고, ELISA 방법을 통해 민감도 및 교차반응성을 측정하여 검출 민감도가 높은 항체를 개발하고자 하였다.

본 발명은 하기의 구조를 갖는 합텐에 관한 것이다.

또는

상기 식에서,

R₁은 C1~C4 알킬이고,

R₂은 H, C1~C4 알킬, F 또는 Cl이고,

R₃는 H 또는 C1~C4 알킬이고,

R₄, R₅은 서로 독립적으로 H 또는 CO₂H이고,

R_6, R₇은 서로 독립적으로 C1~C4 알킬이고,

n은 1 내지 12 중 어느 하나의 정수이다.

본 발명에서, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 제한되지는 않으나 R₁은 CH₃이고, n은 2 내지 6 중 어느 하나의 정수를 만족하는 것일 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 제한되지는 않으나 R₄, R₅ 중 적어도 하나는 CO₂H이고, R_6, R₇은 동일하게 CH₃ 또는 CH₂CH₃일 수 있다.

또한 본 발명의 일 구체예로서, 상기 합텐은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 제한되지는 않으나 하기의 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 합텐과 담체 단백질(carrier protein)을 접합시킨 항원으로부터 수득되는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 유기인계 농약은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 제한되지는 않으나, 바람직하게는 파라티온-메틸 또는 파라티온일 수 있다.

본 발명에서 상기 담체 단백질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 합텐과 담체 단백질을 접합시킨 항원으로 마우스를 면역화하고, 면역화한 마우스의 비장을 적출하여 그 세포를 SP2/0-Ag14 (ATCC CRL-1851) 골수종 세포와 융합시킨 후 클로닝하여 단일클론 항체를 수득하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 단일클론 항체를 이용하여 ELISA(효소면역학적 분석법)을 통한 민감도를 측정함으로써 상기 단일클론 항체 특이적 유기인계 농약을 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 a) 하기의 구조를 갖는 합텐을 제조하는 단계;

또는

상기 식에서,

R₁은 C1~C4 알킬이고,

R₂은 H, C1~C4 알킬, F 또는 Cl이고,

R₃는 H 또는 C1~C4 알킬이고,

R₄, R₅은 서로 독립적으로 H 또는 CO₂H이고,

R_6, R₇은 서로 독립적으로 C1~C4 알킬이고,

n은 1 내지 12 중 어느 하나의 정수이다.

b) 상기 합텐과 담체 단백질(carrier protein)을 접합시키는 단계;

c) 항체 생산을 위한 개체에 상기 b) 단계에서 얻은 합텐-담체 단백질 접합체를 면역화 처리하는 단계;

d) 상기 c) 단계의 일부 조직 세포와 골수종 세포를 융합하여 클로닝하는 단계;

를 포함하는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 개발된 유기인 계열 농약의 검출을 위한 단클론성 항체 및 이를 생산하기 위한 세포주는 항혈청 역가가 높고, 특정 구조의 유기인 농약에 대한 민감도가 특이적으로 높음으로써, 저농도 유기인 농약의 검출에 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 간접경쟁 ELISA 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 교차반응성의 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 합텐-BSA 단백질 복합체의 형성을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 유기인계 농약의 검출을 위한 합텐, 단일클론 항체 및 이를 이용한 면역 분석 방법을 상세히 설명한다.

도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명은 하기의 구조를 갖는 합텐에 관한 것이다.

또는

상기 식에서,

R₁은 C1~C4 알킬이고,

R₂은 H, C1~C4 알킬, F 또는 Cl이고,

R₃는 H 또는 C1~C4 알킬이고,

R₄, R₅은 서로 독립적으로 H 또는 CO₂H이고,

R_6, R₇은 서로 독립적으로 C1~C4 알킬이고,

n은 1 내지 12 중 어느 하나의 정수이다.

유기인은 비가역적인 콜린에스터라아제(cholinesterase, ChE) 억제자(inhibitor)로 알려져 있으며 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase, AChE) 억제로 인해 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 유기인의 화학 구조는 P 원자 주변에 4개의 그룹 또는 원자 사슬(atom chain)로 구성되어 있는데 이들은 O 원자로 존재하지만, S, F, C 또는 N 또한 발견되고 있다. 중앙의 P 원자는 P=O와 P=S로 결합하고 있으며, 2개 이상의 측쇄(side chain)가 방향족(aromatic) 또는 지방족(aliphatic) 그룹을 이룬다. 4번째 그룹은 이탈기(leaving group)이라 하며 화합물의 특성을 나타낸다.

유기인은 비가역적 콜린에스터라아제 억제자이지만, 두 번째 반응인 에이징(aging) 단계를 거치게 되면 R 그룹 중의 하나가 인산기를 해리시키면서 유기인 계열 화합물과 아세틸콜린에스터라아제의 결합이 비가역적으로 진행되게 된다. 다른 유기인 계열 화합물의 에이징(aging) 단계는 2분 내지 72시간 동안 진행되기도 한다.

유기인 계열과 마찬가지로 카바메이트(carbamate)는 유사한 아세틸콜린에스터라아제 억제 과정을 가지고 있다. 아세틸콜린에스터라아제 억제 과정 중의 주요 차이점은 카바메이트와 아세틸콜린에스터라아제 또는 유기인과 아세틸콜린에스터라아제 복합체의 안정성에 있다. 유기인 계열은 비가역적 과정에서 아세틸콜린에스터라아제의 세린(serine) 잔기를 인산화할 수 있는 반면, 카바메이트의 세린 잔기(serine residue)는 불안정하며 30 내지 40분 이내에 디카바밀화(decarbamylation)가 진행된다. 결과적으로, 카바메이트 계열 농약은 가역적 아세틸콜린에스터라아제 억제자이다. 즉, 유기인 계열 농약에 중독되었을 경우, 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제하여 아세틸콜린 축적을 일으키게 된다. 또한, 카바메이트의 카바밀기(carbamyl group)가 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제하여 유기인 계열 농약과 유사하게 작용하지만, 상대적으로 카바밀기가 아세틸콜린에스터라아제와의 결합이 약하여 빠르게 회복될 수 있다.

아세틸콜린에스터라아제의 억제 정도에 따라 다음과 같은 병리적 현상이 보고되어 있다(Maroni et al., 2013)

또한, 카바메이트 및 유기인계 물질은 세포 내의 세포질(cytoplasm), 미토콘드리아(mitochondria), 퍼옥시좀(peroxisome)에서 탄화수소, 지방, 단백질 대사 과정에 관여하는 효소를 억제한다고 알려져 있다. 또한, 카바메이트 및 유기인계 농약에 노출된 환자에 대해 12년간 추적 조사한 결과, 치매 발병률이 2배 이상 증가하는 것으로 확인되었다(Lin et al., 2015).

유기인계 물질은 카르복실계 에스테라아제 효소 억제제이며, 적혈구, 신경 조직, 골격근에 분포하는 아세틸콜린에스터라아제와 혈장, 간, 심장, 췌장, 뇌에 분포하는 부티릴콜린에스터라아제(butyrylcholinesterase, BChE)에 작용한다.

병리생리학적 측면에서 카바메이트 및 유기인은 에스테르 가수분해효소(ester hydrolases)로 불리는 아세틸콜린에스터라아제와 부티릴콜린에스터라아제의 억제 과정에 작용한다. 아세틸콜린에스터라아제는 신경전달자인 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)을 콜린(choline)과 아세트산으로 분해하는 데 관여하는 효소이며, 아세틸콜린은 중추신경계, 말초신경계, 신경근육부위 및 적혈구에 존재하는 것으로 알려져 있다. 유기인 계열 농약은 아세틸콜린에스터라아제의 활성 부위(active site)에 위치한 세린 히드록실(serine hydroxyl) 그룹의 인산화와 동시에 불활성화 시킨다. 인산화는 유기인 계열의 이탈기(leaving group)의 손실에 의해 일어나게 되면 이중결합을 형성한다. 일단 아세틸콜린에스터라아제가 불활성화 되면 아세틸콜린은 신경계 시스템에 축적되고, 콜린성 효과를 방해하는 무스카린(muscarinic) 수용체 및 니코틴(nicotinic) 수용체의 과잉 흥분을 유발한다. 의학적인 증상은 중추신경계 및 근육의 니코틴 수용체 활성화 또한 관찰된다.

아세틸콜린에스터라아제의 억제가 시작되고 유지되는 기간은 유기인제 화합물의 흡수 경로, 활성 대사물질로의 전이 정도, 지용성 정도에 따라 다르며, 펜티온(fenthion)이나 말라티온(malathion)과 같은 고지용성 유기인제는 독성 증상의 발현이 최대 5일까지 지연될 수 있고, 작용 기간이 30일 이상까지 길어질 수 있다.

유기인 계열 농약 중독은 의증, 외형적 특징, 혈액의 부틸콜린에스터라아제와 아세틸콜린에스터라아제의 억제 활성으로 진단할 수 있으며, 과도하게 노출된 환자는 무스카린 흥분, 니코틴 흥분 및 중추신경계 독성을 나타낸다. 반면, 카바메이트 중독은 의학적으로 구별되지는 않으나, 효소와의 결합이 비가역적이 아니므로 중독되더라도 유기인과는 다르게 빠르게 회복되는 특징을 보여준다.

본 발명의 방법에 이용되는 상기 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 단클론성 항체의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있다. 단클론성 항체는 합텐-담체 복합체를 포함하는 조성물을 쥐에 주사하고, 이어서 혈청 시료를 제거하여 항체 생성을 확인하며, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻고, 이 B-림프구와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 제조하고, 이 하이브리도마를 클로닝하고, 합텐-담체 복합체에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선발하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 얻을 수 있다.

단클론성 항체는 잘 확립된 각종 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술로는 단백질-A 세파로오스를 이용한 친수성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 들 수 있다. 예를 들면, 콜리간(Coligan)의 2.7.1~2.7.12 페이지 및 2.9.1~2.9.3 페이지를 참조한다. 또한, 바인스(Baines) 등의 "Purification of Immunoglobulin G(IgG)"(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, 79~104 페이지, The Humana Press, Inc. 1992)을 참조한다.

다클론성 항체의 제조 기술도 당업계에 공지되어 있다. 다클론성 항체는 공지된 표준 기술에 따라 제조된다. 다클론성 항체를 제조하기 위하여, 면역원성 물질을 동물에 주사하고 주사된 면역원의 수많은 에피토프에 대한 항체 혼합물을 함유하는 혈청을 채취한다. 항체 생산용으로 적합한 숙주 포유동물로는 인간, 쥐, 마우스, 토끼 및 염소를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 담체 단백질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 소 혈청 알부민을 사용할 수 있다.

본 발명의 담체 단백질은 T-세포를 자극할 수 있고, 이어서 B-세포로 하여금 전체 합텐-담체 복합체 분자에 대한 항체를 생산하도록 유도하는 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 함유하는 분자를 포함한다. 에피토프의 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹들로 구성되며, 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정한 3차원 구조적 특성을 갖는다. 면역원성을 가지기 위해서는 단백질 또는 폴리펩티드가 T-세포를 자극할 수 있어야 한다고 여겨진다. 그러나, T-세포 에피토프가 결핍된 담체 단백질도 또한 면역원성을 가질 수 있다.

이와 같은 ELISA(효소면역학적 분석법)은 항체와 항원 사이의 특이적이며 친화력이 높은 결합에 근거한 분석법이므로, 면역분석법을 개발하기 위해서는 분석물질에 대한 항체를 생산하여야하며, 따라서 적절한 항원이 준비되어야 한다. 그러나, 농약과 같은 저분자 물질은 그 자체로서 항원으로 작용할 수 없어서 항체의 생산이 불가능하므로, 농약과 구조가 유사하며, 단백질과 공유결합할 수 있는 원자단을 가진 물질, 즉, 합텐(hapten)의 합성이 요구되었다. 또한, 경쟁적 면역분석법에서 사용되는 경쟁자인 코팅항원 및 효소 트레이서(enzyme tracer)의 제조를 위해서도 합텐의 합성이 요구되었다.

분자량이 작은 물질도 항체와 결합할 수 있으나, 생체 내에서 면역반응을 유발하지는 않는다. 따라서 이 물질은 분자량이 큰 담체(carrier)에 연결시켜야만 한다. 대부분의 농약은 면역계를 자극할 수 있을 만큼 충분히 크지 않기 때문에 농약에 대한 항체를 얻기 위해서는 단백질과 같이 분자량이 큰 담체(carrier)에 연결시켜 실험동물에 주사하여야 한다. 담체와 결합시키기 좋은 -COOH, -SH, -OH 또는 -NH2 등의 작용기를 가진 농약들도 있으나, 대부분의 농약에는 이러한 작용기가 없기 때문에 작용기를 도입한 농약 유도체를 합성하여 이용하는데, 이렇게 단백질과 결합할 수 있는 물질을 합텐이라고 한다.

합텐이 단백질과 아미드 결합을 형성하기 위해 카르복실기 또는 아미노기를 포함할 수 있다. 합텐의 카르복실기는 단백질의 아미노기와 아미드 결합을 형성할 수 있으며, 합텐의 아미노기는 단백질의 카르복실기와 아미드 결합을 형성할 수 있다. 담체 단백질에 합텐의 결합은 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 상기 방법은 당연히 담체 단백질에 존재하는 작용기에 의존할 것이다. 본 발명에서는 소 혈청 알부민(BSA) 단백질을 이용하여 합텐과 결합시켰다. 단백질과 카르복실기가 있는 합텐과 결합시키는 방법은 카보디이미드와 N-히드록시숙신이미드를 이용한 활성 에스테르 방법을 이용하였다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 파라티온-메틸(parathion-methyl, PM) 항원 합성

합텐(hapten) 유도

파라티온-메틸 구조 중에서 유기인 계열 농약의 공통 부위인 벤젠 고리 부분을 보존하고, 티오포스페이트(thiophosphate)의 메톡실(methoxyl)기 중 하나를 아미노카르복실산(amino carboxylic acid)으로 치환시켜 n=3 및 n=5의 합텐 A 및 합텐 B를 각각 유도하였다.

Organophosphate (OP) Pesticide Mix(시그마알드리치)을 1,4-디옥산 5ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(20mg, 2eq)를 1ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응액에 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 32mg의 생성물을 얻었다.

(에틸 아세테이트:n-헥산=1:3, 0.1% 아세트산)

TLC:Rf=0.21(아세톤:헥산=3:7, 0.1% 아세트산)

LC/MS; 471(M+H), 473

NMR(아세톤 d6); 1.67(3H,d), 5.12(1H, q), 7.1~8.8(11H, m), 9.2(1H,s)

[화학식 1] 합텐 A/B 합성 반응식

항원 합성

25mg 합텐은 5ml 디옥산(dioxane)에 현탁하고 BSA 용액(50mg BSA/10ml 증류수, pH 6)을 첨가하였다. 반응물에 300mg 카르보디이미드(Carbodiimide)를 1시간 동안 천천히 첨가하면서 pH 6을 유지하였다. 24시간 동안 상온에서 저어준(stirring) 후 300mg 카르보디이미드를 앞선 방법과 동일하게 첨가하고 48시간 동안 상온에서 저어준(stirring)다. 위 반응으로 생성된 항원은 30% 디옥산으로 세척하였다. PM 10 멤브레인(membrane)이 장착된 Amicon cell(EMD Millipore)를 이용하여 세척하였다. 항원은 탈염증류수(deionized distilled water, ddH₂O)를 이용하여 2mg으로 희석하고 0.45um membrane filter (Millipore Corp., Bedford, Mass.)을 이용하여 정제하였다. 정제된 항원은 1ml을 동결건조하고 -20℃에 저장하였다. 합텐에 결합된 BSA 효율은 흡광도를 측정하며 항원 농도는 뷰렛법(biuret method)으로 측정하였다.

[화학식 2] 합텐 A/B로부터 항원 합성 반응식

합텐 A, B 각각과 1.1 당량의 N-히드록시숙신이미드, 1.3 당량의 DCC를 DMF 1ml에 녹인 후 밤새 저어 주었다. 원심분리하여 우레아 침전을 제거하고, pH9.6 완충용액에 녹아 있는 단백질(BSA)에 0.5m씩 천천히 적가하였다.

합성된 항원이 포함된 생성물을 50 mM PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 2 L를 이용하여 1일 2 내지 3회 교환하면서 분자량 cut-off 6000 내지 8000으로 4 ℃에서 3일간 투석하여 BSA와 반응하지 않은 합텐 A, B를 각각 제거하였다.

[실시예 2] 합텐 페스트 2 항원 합성

합텐(hapten) 유도

파라티온- 메틸 (200mg)을 1,4-디옥산 5ml에 녹인 다음 수산화리튬 일수화물(20mg, 2eq)를 1ml의 물에 녹여 가하고 상온에서 5~6시간 저어주었다. 반응액에 2N HCl로 pH 2로 산성화시킨 다음에 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하여 감압증류 하였다. 농축액을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 32mg의 생성물을 얻었다.

항원 합성

상기 과정을 통해 합성된 합텐 페스트 2를 각각 담체 단백질인 BSA(bovine serum albumin)에 결합시켜 항원을 합성하였다. 이를 위해 하기 화학식과 같이 N-히드록시숙시니미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)와 디시클로헥실 카보디이미드(dicyclohexyl carbodiimide, DCC)를 이용하여 4 ℃에서 하룻밤동안 디클로로메탄과 반응시켜 반응성이 큰 숙시니미드 에스테르(succinimide ester) 형으로 제조하였다. 이 후 다시 4 ℃에서 하룻밤동안 담체 단백질인 BSA와 결합시키는 반응을 유도하여 합텐-담체 단백질 복합체 형태의 항원을 제조하였다.

[화학식 3] 합텐 페스트 2로부터 항원 합성 반응식

[실시예 3] 합텐 페스트 10 항원 합성

합텐(hapten) 유도

항원 합성

실시예 2에서, 합성된 합텐이 하기 구조의 합텐 페스트 (Hapten Pest) 10인 것을 제외하고 다른 조건은 동일하게 하여 유기인계 항원을 합성하였다.

[화학식 4] 합텐 페스트 10로부터 항원 합성 반응식

[실시예 4] 합텐 페스트 11 항원 합성

합텐(hapten) 유도

항원 합성

실시예 2에서, 합성된 합텐이 하기 구조의 합텐 페스트 (Hapten Pest) 11인 것을 제외하고 다른 조건은 동일하게 하여 유기인계 항원을 합성하였다.

[화학식 5] 합텐 페스트 11로부터 항원 합성 반응식

[실시예 5] 합텐 페스트 12 항원 합성

합텐(hapten) 유도

항원 합성

실시예 2에서, 합성된 합텐이 하기 구조의 합텐 페스트 (Hapten Pest) 12인 것을 제외하고 다른 조건은 동일하게 하여 유기인계 항원을 합성하였다.

[화학식 6] 합텐 페스트 12로부터 항원 합성 반응식

[실시예 6] 합텐에 대한 단클론성 항체 생산

항혈청의 생산 및 역가 검정

합텐과 결합된 단백질의 양은 뷰렛법(biuret method)으로 정량하여 다음 실험에 사용하였다.

합텐-BSA 복합체(유기인계 항원) 0.5 mg이 용해된 PBS 용액을 프로인트 완전 애쥬반트(Freund complete adjuvant) 용액과 1:1로 혼합하여 유화액을 조제하고 생후 7~8주 개월령 BALB/c 마우스(암컷) 등 부위에 나누어 15~20 군데 주사하였다. 마우스는 각 항원당 2마리씩 사용하였다. 부스트(Boost) 주사시에는 합텐-BSA 복합체 0.2 mg이 용해된 PBS 용액을 프로인트 불완전 애쥬반트(Freund incomplete adjuvant)에 1:1로 혼합하여 유화액을 주사하고 최초 주사와 같은 방법으로 2주 간격으로 2차례 주사하였다. 주사 후 fusion 4일 전에 귀 정맥에서 혈액을 채취하여 항체 생성을 확인하고, 충분한 역가가 나타날 때가지 200 ug/200 uL 항원을 주사하여 PM-BSA 복합체(conjugate) 4차례 면역을 실시하였다.

항혈청의 분리

채취한 혈액을 냉장고에서 하루 정도 응고 시킨 후, 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하여 사용시까지 -70℃에서 냉동보관하였다.

항체의 순수 분리

항체를 순수 분리하기 위하여 PIERCE사의 protein A Immunoglobulin 정제 키트를 이용하였다. 키트를 실온에서 안정화시킨 후 결합 완충액 5ml를 흘려주어 평형화시켰다. 결합 완충액과 1:1로 희석한 혈청을 로딩하고 결합 완충액 15ml로 세정하였다. 5ml의 용출 완충액으로 용출시켰다. 각 분획을 280nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도가 측정된 E2-E3 부분을 합하여 다음 실험에 이용하였다. 도 3은 분리된 항체의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다. 도 3에서 레인 1은 마커를 나타내며, 레인 2는 황산암모늄 1차 정제 항체, 레인 3은 Protein G 비결합 분획, 레인 4는 Protein G 2차 정제 항체를 나타낸다. 도 3에서 보여주는 바와 같이, SDS-PAGE 결과 정제 후 항체의 경쇄(Light chain)와 중쇄(Heavy Chain)의 밴드가 나타남으로써 항체가 순수하게 분리되었음을 확인할 수 있었다.

체크 보드 적정(check board titration)

ELISA에 필요한 코팅 항원과 항혈청의 희석배수를 결정하기 위하여 비경쟁 간접 ELISA를 수행한 결과, PM-BSA 항혈청의 경우에는 코팅항원과 항혈청의 희석배수는 각각 5ng/well, 1:10,000이었다.

항혈청 역가 측정(ELISA)

민감도와 표준 직선을 확인하기 위하여 상기에서 확인한 코팅항원과 항혈청의 희석배수로 간접경쟁 ELISA법을 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

① 0.1M 카보네이트-비카보네이트 완충액(pH9.6)에 녹여 희석한 (5ng/웰, PM-BSA) 코팅 항원 100㎕를 마이크로플레이트의 웰에서 인큐베이션시켰다(4℃, 12시간 이상).

② PBST(10mM 인산염완충식염수 + 0.05% Tween 20) 100㎕로 5회 세척하였다.

③ 1% BSA/PBS 100㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블록킹시킨 후, PBST에 희석한 파라티온 표준용액(100ppm~1ppt) 50㎕ 와 PBS로 희석한 항혈청(1:10,000) 50㎕를 웰에 넣어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.

④ PBST 100㎕로 5회 세척하였다.

⑤ PBST로 1:10,000으로 희석한 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 염소 항-토끼 IgG 용액 100㎕를 넣어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.

⑥ PBST 100㎕로 5회 세척하였다.

⑦ 포스페이트-시트레이트 완충액(pH 5.0)에 용해된 효소 기질 o-페닐렌디아민(OPD)(0.4 mg/ml) 100㎕를 넣은 후 37℃에서 30분간 반응시켰다.

⑧ 4N H2SO4 용액 50㎕를 넣어 반응을 중단시킨 후 492nm에서 흡광도를 측정하였다.

통상적으로 알려진 방법으로 SP2/0-Ag14 (ATCC CRL-1851) 골수종 세포를 이용하여 단클론성 항체 생산용 세포주 개발을 통해 총 6종의 하이브리도마 세포(1B6, 1D1, 1D12, 1D9, 1G7 및 1H2)를 확보하였고, 이 중 상기 과정을 통해 가장 좋은 역가를 보인 1H2 세포주의 배양 상등액으로 ELISA를 수행하였다.

도 1은 간접경쟁 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 방법으로 실험한 결과, ELISA 검량 곡선에서 1 ppb (ng/ml)까지 검출이 가능한 항체가 생산되는 것을 확인하였다.

또한 도 2로부터 다른 유기인계 농약에 대한 교차 반응성은 파라티온, 페니트로티온 및 EPN인 것을 확인하였다.

상기 도 2의 교차 결과로부터 흡광도를 50% 저해시키는 분석물질의 농도(IC₅₀)로 민감도를 분석하였다.

[표 1] 민감도 분석 결과

상기 민감도 분석 결과로부터 본 발명의 실시예 1로부터 파라티온 계열의 유기인 농약에 대해 높은 민감도를 가짐을 확인할 수 있으며, 파라옥손(paraoxon), 디메톤-s-메틸(dimeton-s-methyl), 펜티온(fenthion), 마라티온(marathion) 계열에 대해서는 민감도가 크게 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이로부터, 본 발명의 ELISA 방법을 통해 본 발명의 유기인 화합물 또는 이와 유사한 구조의 화합물을 높은 정확도로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Claims

a) 하기의 구조를 갖는 합텐을 제조하는 단계;

또는

상기 식에서,
R₁은 C1~C4 알킬이고,
R₂은 H, C1~C4 알킬, F 또는 Cl이고,
R₃는 H 또는 C1~C4 알킬이고,
R₄, R₅은 서로 독립적으로 H 또는 CO₂H이고,
R_6, R₇은 서로 독립적으로 C1~C4 알킬이고,
n은 1 내지 12 중 어느 하나의 정수이다.
b) 상기 합텐과 담체 단백질(carrier protein)을 접합시키는 단계;
c) 항체 생산을 위한 개체에 상기 b) 단계에서 얻은 합텐-담체 단백질 접합체를 면역화 처리하는 단계;
d) 상기 c) 단계의 일부 조직 세포와 골수종 세포를 융합하여 클로닝하는 단계;
를 포함하는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체의 제조방법.
제 1항에 있어서,
R₁은 CH₃이고,
n은 2 내지 6 중 어느 하나의 정수인 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체의 제조방법.
제 1항에 있어서,
하기의 구조를 갖는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 유기인계 농약은 파라티온-메틸 또는 파라티온인 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 담체 단백질은 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 피브리노겐, 오발부민, 티로글로불린(thyroglobulin) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)인 것을 특징으로하는 유기인계 농약 검출용 단일클론 항체의 제조방법.