JP3026942B2 - ダイアジノンのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｏ,Ｏ−ジエチル
Ｏ−２−イソプロピル−６−メチルピリミジン−４−イ
ル ホスホロチオアート（以下、本明細書中「ダイアジ
ノン」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びその
フラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ダイアジノンは、以下の式（２）：

【化３】 で表される構造を有する有機リン系の化合物である。

【０００４】ダイアジノン剤は有機リン殺虫剤で、広範
囲の害虫に対して効果を示す。茎葉散布のほか、土壌施
用剤、水面施用剤としても用いられる。本剤は適用範囲
が広く、接触剤及び消化中毒剤、くん蒸剤として作用
し、速効的である。植物体への浸透性があり、食入した
ニカメイチュウ、シンクイムシ、ハモグリバエなどにも
効く。蒸気圧が高いので粒剤の水面施用によりウンカ・
ヨコバイ類にも効果を表す。しかし、揮散が早いこと及
び植物体内に浸透したものも分解されやすいので残効は
あまりない。ダイアジノン剤は、単独でも他の有機リン
殺虫剤、カルバマート系殺虫剤に抵抗性となったツマグ
ロヨコバイに殺虫力を持つが、カルバマート剤との混合
剤は特に抵抗性ツマグロヨコバイに効果があるので、カ
ルバマート剤との混合剤が各種登録されている（農薬ハ
ンドブック 第１２頁−第１３頁１９９４年版 日本植
物防疫協会、「最新農薬の残留分析法」 第１９０頁−
第１９２頁 農薬残留分析法研究班編集 中央法規出
版）。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ダイアジノンについては、食品衛生法に基づき残留
基準値が、米（０.１ｐｐｍ）、豆類（０.１ｐｐｍ）、
果実（０.１ｐｐｍ）、いも類（０.１ｐｐｍ）、野菜
（０.１ｐｐｍ）、茶（０.１ｐｐｍ）と定められている
（「最新農薬の残留分析法」、前出）。また、ダイアジ
ノンのＡＤＩは０.００２ｍｇ／ｋｇ（ＦＡＯ／ＷＨ
Ｏ）である。環境や食品に関する安全確保のためには、
これらに含有される、ダイアジノンの量を迅速、かつ正
確に測定することが必要である。

【０００６】従来、ダイアジノンは、米、果実、野菜、
いも類、豆類、抹茶等の試料から抽出し、精製した後、
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてき
た。例えば、試料をアセトンで抽出して、フロリジルカ
ラムクロマトグラフィーで精製した後、さらにＧＣで分
析する方法が採用されている。これらの方法は、試料の
調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練
を有すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用
を必要とする等の問題点がある。ダイアジノンの測定
は、特に輸入農産物等の残留農薬の分析においては、短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ダイアジノンのような低分
子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出す
ことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分
子化合物に結合させることによって初めて一団のエピト
ープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を
起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生
される。このように高分子化合物と結合させて初めて免
疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」という。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なけらばならない。

【００１１】ダイアジノンについてはその必要性が非常
に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、抗
体を作製するためのハプテンも本発明前には得られてい
なかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ダイアジノ
ンに特異的に反応する新規な抗体を作製するための抗原
を構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導体
を提供することを目的とする。

【００１３】本発明は、また、ダイアジノン誘導体と高
分子化合物との結合体を提供することを目的とする。当
該結合体はダイアジノンに特異的に反応する抗体を作製
するための抗原となる。

【００１４】本発明は、さらに、ダイアジノンに強い親
和性を有する新規な抗体もしくはそのフラグメント、及
びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明
細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合
可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１５】本発明はその一態様において、前記化合物
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、ダイアジノンの免疫学的測定方法を提供する
ことを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ダイアジノンにスペーサーアーム及び高
分子との結合に利用できる官能基を導入した、ダイアジ
ノンの誘導体をハプテンとして使用することにより、前
記化合物に特異的な抗体を得ることに成功し、本発明の
完成に至った。

【００１９】本発明の対象となるダイアジノンは、以下
の式（２）：

【化４】 で表される化合物である。

【００２０】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、前記ダイアジノンの

【化５】 の部分を

【化６】 ［式中、ｎは１−１０の整数であり、好ましくは２−５
である］に変化させたものである。即ち、本発明のダイ
アジノン誘導体は、以下の式（１）：

【化７】 ［式（１）中、ｎは前述した通りである］で表される構
造を有する化合物である。

【００２１】本発明のダイアジノンにスペーサーアーム
及び結合に利用できる官能基を結合させた誘導体をハプ
テンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原
として用いることによって、ダイアジノンに特異的な抗
体を得ることができる。

【００２２】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ダイアジノンに反応
する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物
又は該抗体を用いるダイアジノンの免疫学的測定方法に
関する。

【００２３】ダイアジノンの誘導体の作製 式（１）で表されるダイアジノン誘導体は、公知の方法
によって、例えば以下に記載するような方法に従って作
製することができる。

【００２４】まず、以下の式（Ｚ１）

【化８】 ［式（Ｚ１）中、Ｌはハロゲン原子である（本明細書
中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味す
る）］で表されるジハロゲン化チオリン酸エステルに、
以下の式：

【化９】 ［式中、Ｒはカルボキシル基の保護基を表し、ｎは式
（１）で定義した通りである］で表される化合物を、不
活性溶媒中、塩基の存在下で求核置換反応させることに
より、式（Ｚ２）：

【化１０】 ［式（Ｚ２）中、Ｌ、Ｒ及びｎは前述した通りである］
の化合物を合成する。

【００２５】不活性溶媒としては、例えば、アセトニト
リル、トルエン、ベンゼン、キシレン、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチ
ルケトン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド等が使用できる。塩基としては、例え
ば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム等の無機塩基、トリエチルアミ
ン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ,Ｎ−
ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン等の有機
塩基等を使用することができる。反応は、マイナス２０
℃−５０℃、好ましくは２０℃−３０℃で、１−５０時
間、好ましくは２０−３０時間行う。

【００２６】尚、Ｒで表されるカルボキシル基の保護基
は公知のものでよく、その具体例として、例えば、ｔｅ
ｒｔ−ブチル基、メチル基、エチル基、ベンジル基、ｐ
−メトキシベンジル基、トルクロロエチル基、トリメチ
ルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅ
ｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル
基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエト
キシメチル基等を挙げることができる。

【００２７】式（Ｚ２）の化合物をシリカゲルカラム等
で精製した後、以下の式：

【化１１】 で表されるピリミジノンを、不活性溶媒中、塩基の存在
下で求核置換反応させることにより、式（Ｚ３）：

【化１２】 ［式（Ｚ３）中、Ｒ及びｎは前述した通りである］の化
合物を合成する。反応は、始めに０℃−５０℃、好まし
くは２０℃−３０℃で、０.５−３時間、好ましくは０.
５−１時間、さらに、５０℃−９０℃、好ましくは７０
℃−８０℃で、１−５時間、好ましくは２−３時間行
う。不活性溶媒及び塩基は上述したものと同様のものを
使用することができる。

【００２８】さらに、式（Ｚ３）の化合物をシリカゲル
カラム等で精製した後、Ｒで表されるカルボキシル基の
保護基を除去することにより、式（１）の化合物を合成
することができる。カルボキシル基の保護基の除去は、
酸加水分解、アルカリ加水分解等の公知の方法で行うこ
とができる。

【００２９】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｚ
３）のエステル化合物を、好ましくはジクロロメタン、
酢酸、蟻酸、ベンゼン、１,２−ジクロロエタン等の有
機溶媒に溶解し、次いで、トリフルオロ酢酸、塩酸、硫
酸、三塩化ホウ素、ｐ−トルエンスルホン酸等を加え
て、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５
０℃で、１−５時間撹拌反応させることにより式（１）
の化合物を得ることができる。

【００３０】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｚ
３）のエステル化合物を、好ましくはメタノール、エタ
ノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の
有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化
カリウム水溶液を加えて０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から５０℃で、１−２時間撹拌反応させる
ことにより式（１）の化合物を得ることができる。

【００３１】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操
作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とするこ
とができる。

【００３２】また、（２）で表されるダイアジノンの一
部の官能基が他の類似する官能基に置換されている類似
する化合物についても、上記記載に基づいて誘導体を作
製し、さらに後述するように、その抗原、抗体の作製等
を行うことは当業者の技術範囲内である。例えば、ダイ
アジノンのリン酸基上のＯ,Ｏ−ジエチルがＯ,Ｏ−ジメ
チルである化合物、ダイアジノンのピリミジン環上のイ
ソプロピル基がメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基等
である化合物、また同じくピリミジン環上のメチル基が
エトキシ基である化合物、あるいはピリミジン環が無置
換の化合物等、具体的には、チオナジン、エトリムホ
ス、リリムホス、メチルダイアジノン等についても、当
業者は本明細書の記載に基づいてハプテン、抗原、抗体
の作製等を行うことができる。

【００３３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３４】ダイアジノン誘導体と高分子化合物との結
合体の作製 上述のように合成されたダイアジノン誘導体を適当な高
分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。

【００３５】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ］と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００３６】ダイアジノン誘導体と高分子化合物との結
合は、例えば、混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:
J.Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)）、又は活性化エ
ステル法（A.E. KARU et al.:J. Agric. Food Chem. 42
301-309 (1994)）等の公知の方法によって行うことが
できる。

【００３７】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応によりカル
ボン酸とハロ蟻酸エステルとを反応させることにより得
られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的
とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。シ
ョッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行わ
れる。塩基性化合物としてはショッテン−バウマン反応
において慣用されている化合物を使用することができ
る。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、ト
リメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、
Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣ
Ｏ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙
げられる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、
好ましくは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５
分−１０時間、好ましくは５分−２時間である。得られ
た混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナ
ス２０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃におい
て行われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは５分
−５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行わ
れる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されている
いずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサ
ン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキ
シエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホル
ム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メ
チル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン
酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられ
る。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステ
ルとしては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸
メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ
蟻酸エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテン
とハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い
範囲から適宜選択され得る。

【００３８】一方活性化エステル法は、一般に以下のよ
うに行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶
媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキ
シこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸
イミドエステルを生成する。

【００３９】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ
−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：
１０−１０：１、より好ましくは、１：１−１：１０、
最も好ましくは１：１である。反応温度は、０−１００
℃、好ましくは５−５０℃、より好ましくは２２−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３０分−
６時間、より好ましくは１−２時間である。反応温度は
各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００４０】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、ダイアジノン誘導体と高
分子化合物との結合体を得ることができる。

【００４１】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をダイアジノン誘導体に結合させたものを、免
疫測定法において使用することができる。標識物質とし
ては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」
と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン等の発色物
質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが
ある。

【００４２】ポリクローナル抗体の作製 ダイアジノン誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、ダイアジノン誘導
体−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と
言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完
全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合
したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによ
って行う。免疫される動物としては当該分野で常用され
るものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。但
し、ヒトは除く。

【００４３】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００４４】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ダイアジノンと反応するポリクロ
ーナル抗体の存在を評価することができる。

【００４５】モノクローナル抗体の作製 ダイアジノン誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００４６】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００４７】（ａ）免疫用抗原として使用するダイアジ
ノン誘導体と高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００４８】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００４９】以下、上述の本発明のダイアジノンに対す
るモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに
制限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５０】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５１】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５２】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００５３】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００５４】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法に
ついては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）
に記載されている。別の融合方法としては、電気処理
（電気融合）による方法を採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いれ
ばよい。

【００５５】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００５６】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ダイアジノンに対する抗体活性を測
定する。さらに、測定によりダイアジノンに反応する抗
体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クロ
ーニングを行う。この細胞クローニング法としては、限
界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれ
るように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に
撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターに
よって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによっ
て１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙
げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。

【００５７】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗ダイアジノン
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。

【００５８】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤ
Ｍ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二
酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中
の恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００５９】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６０】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ダイアジノンモノクローナル抗体として使用
することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによ
る塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め
精製することにより抗ダイアジノンモノクローナル抗体
を得ることができる。さらに精製が必要な場合には、イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることによ
り実施できる。

【００６１】以上のようにして得られた抗ダイアジノン
モノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法な
どの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決
定することができる。

【００６２】抗体によるダイアジノンの測定 本発明で使用する抗体によるダイアジノンの測定方法と
しては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth. Enzymol., 70,419-439
(1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法等の一
般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブ
リドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプ
ラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００６３】ダイアジノンの測定は各種ＥＬＩＳＡ法の
うち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下の
ような手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原
であるダイアジノン誘導体と高分子化合物との結合体を
担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表
面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキ
ングする。（ｃ）これに各種濃度のダイアジノンを含む
試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び遊離
ダイアジノンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体
複合体及び遊離ダイアジノン−抗体複合体を生成させ
る。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定すること
により、予め作成した検量線から試料中の遊離ダイアジ
ノンの量を決定することができる。

【００６４】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６５】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭのＰＢＳを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０.０５−５μｇ／ｍｌが適している。
また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレー
トを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０
−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュ
ベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度
で一晩インキュベーションが適している。

【００６６】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（ダイ
アジノン誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化し
た担体において、ダイアジノン誘導体部分以外に後で添
加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、
もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤と
して、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用でき
る。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃ
ｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等
のブロッキング剤として市販されているものを使用する
こともできる。具体的には、限定されるわけではない
が、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを
適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした後、
緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液としては
特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ
７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％（ｗ
／ｖ）ＫＣｌ，０.０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の
組成のものが適している。

【００６７】次いで（ｃ）工程において、ダイアジノン
を含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相
化抗原及び遊離ダイアジノンと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及び遊離ダイアジノン−抗体複
合体が生成する。

【００６８】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のダイアジノンに対する抗体を加え、更に第二抗
体として標識物質を結合した第一抗体に対する抗体を順
次加えて反応させる。

【００６９】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。この反応に用いる試薬とし
ては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／
ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌの組成のも
のが好ましい。

【００７０】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５０００−１
００００倍、好ましくは最終吸光度が１．０−１.５と
なるように希釈した第二抗体を反応させるのが望まし
い。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではない
が、反応は約３７℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で
洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結
合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その
場合、第二抗体は不要である。

【００７１】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からダイアジノンの
量を算出することができる。

【００７２】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬としてｏ−フェニレンジアミン（以下、
「ＯＰＤ」と言う）を使用する。限定されるわけではな
いが、発色溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた
後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させ
る。ＯＰＤを使用する場合、４９０ｎｍの吸光度を測定
する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホ
スファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフ
ェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを
加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定す
る方法が適している。

【００７３】遊離のダイアジノンを添加しない反応溶液
の吸光度に対して、ダイアジノンを添加して抗体と反応
させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。
既知の濃度のダイアジノンを添加した反応液の阻害率に
より予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のダイ
アジノンの濃度を算出できる。

【００７４】あるいは、ダイアジノンの測定は、例えば
以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用い
た直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。

【００７５】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のダイアジノンを含
む試料に、ダイアジノン誘導体と酵素を結合させた酵素
結合ハプテンを加えた混合物を調製する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のダイアジノンの量を決定する。

【００７６】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００７７】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のダイアジノ
ン及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に吸
着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目
的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００７８】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ダイアジノン誘導体を酵素に結合する方法
であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよい。
例えば、前述した活性化エステル法を採用することがで
きる。調製した酵素結合ハプテンは、ダイアジノンを含
む試料と混合する。

【００７９】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のダイアジノンと酵素結合
ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体
との複合体が生成する。ダイアジノンを含む試料は適当
な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではない
が、反応は例えば室温でおよそ１時間行う。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテン
を除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することが
できる。

【００８０】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からダイアジノンの量を算出することができ
る。

【００８１】本発明のモノクローナル抗体ＤＡＺ ２−
７８は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってダイアジノ
ンを０.１−１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０−１
０００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定するすることができる
（実施例９、図１）。モノクローナル抗体ＤＡＺ ２−
７８は非常に特異性が高く、ダイアジノンとのみ反応
し、他の有機リン系化合物であるピリミホスメチル、エ
トリムホス、ピリダフェンチオン、クロルピリホスとは
反応しない（実施例１０ 図２）。

【００８２】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００８３】

【実施例】実施例１ ダイアジノン誘導体−１の合成

【化１３】

【００８４】クロロチオリン酸誘導体（２）の合成 ジクロロチオリン酸エチル（１）１.８ｇ（１０ｍｍｏ
ｌ）と４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル１.６ｇ（１０
ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１５０ｍｌに溶解させ、炭
酸カリウム４.３ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加えて室温で２
４時間撹拌した。反応液をセライトでろ過して、濃縮
後、シリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
４：１）で精製すると、透明液体として１.６ｇ（収率
５９％）のクロロチオリン酸誘導体（２）を得た。

【００８５】誘導体エステル（３）の合成 クロロチオリン酸誘導体（２）２.１ｇ（７.８ｍｍｏ
ｌ）とピリミジノン１.２ｇ（７.８ｍｍｏｌ）のアセト
ニトリル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウムを加えて室温
で一晩、更に５０℃で２時間撹拌した。反応溶液を氷冷
後に、セライトで濾過した。その濾液を濃縮して、シリ
カゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝４：１）で精製すると、透明液体として０.６ｇ（収
率２０％）の誘導体エステル（３）を得た。

【００８６】ダイアジノン誘導体−１（４）の合成 誘導体エステル（３）１.０ｇ（２.６ｍｍｏｌ）を１０
０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸
１０ｍｌを加えて室温で３時間撹拌した。反応溶液を減
圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝４：１→２：１）で精製すると、透
明液体として０.７０ｇ（収率８２％）のダイジノン誘
導体−１（４）を得た。

【００８７】

【表１】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １.２０−１.５１（重複，１１Ｈ）、１.７５−１.９５（ｍ，２Ｈ） ２.３２−２.５１（ｔ，２Ｈ）、 ２.６１（ｓ，３Ｈ）、 ３.０９−３.２５（ｍ，２Ｈ）、 ３.２５−３.３８（ｍ，１Ｈ） ３.６２−３.９３（ｂｒ，１Ｈ）、４.０３−４.３２（ｍ，２Ｈ） ６.８６（ｓ，１Ｈ）、 ７.９４−８.５７（ｂｒ，１Ｈ）

【００８８】実施例２ ダイアジノン誘導体−２の合成

【化１４】

【００８９】クロロチオリン酸誘導体（２）の合成 ジクロロチオリン酸エチル（１）４.１ｇ（２３ｍｍｏ
ｌ）と６−アミノカプロン酸ｔｅｒｔ−ブチル３.８ｇ
（２０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１００ｍｌに溶解さ
せ、炭酸カリウム８.４ｇ（６１ｍｍｏｌ）を加えて室
温で２４時間撹拌した。反応液をセライトでろ過して、
濃縮後、シリカゲルカラム（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝９：１→４：１）で精製すると、透明液体として３.
９ｇ（収率５８％）のクロロチオリン酸誘導体（２）を
得た。

【００９０】誘導体エステル（３）の合成 クロロチオリン酸誘導体（２）３.９ｇ（１２ｍｍｏ
ｌ）とピリミジノン２.０ｇ（１３ｍｍｏｌ）のアセト
ニトリル溶液１００ｍｌに、炭酸カリウム４.３ｇ（３
１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間、更に６０℃で３時
間撹拌した。反応溶液を氷冷後に、セライトで濾過し
た。その濾液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィ
ー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製する
と、透明液体として１.８５ｇ（収率３５％）の誘導体
エステル（３）を得た。

【００９１】ダイアジノン誘導体−２（４）の合成 誘導体エステル（３）１.８５ｇ（４.１ｍｍｏｌ）を１
００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢
酸１０ｍｌを加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を
減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル＝１：１）で精製すると、透明液体
として１.６２ｇ（収率１００％）のダイジノン誘導体
−２（４）を得た。

【００９２】

【表２】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） １.２０−１.４１（重複，１１Ｈ）、１.４１−１.６１（ｍ，４Ｈ） ２.１８−２.３１（ｔ，２Ｈ）、 ２.６２（ｓ，３Ｈ）、 ３.０２−３.２０（ｍ，２Ｈ）、 ３.２０−３.３５（ｍ，１Ｈ） ３.４８−３.８３（ｂｒ，１Ｈ）、４.１１−４.３２（ｍ，２Ｈ） ６.８７（ｓ，１Ｈ）、 ８.３５−８.９５（ｂｒ，１Ｈ）

【００９３】実施例３ 免疫用抗原の作製 免疫原としてダイアジノン誘導体−１とＫＬＨとの結合
体を以下のように混合酸無水物法により作製した。

【００９４】実施例１によって作製されたダイアジノン
誘導体−１の７ｍｇを無水ジオキサン０.７ｍｌに溶解
し、１０−１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチルアミ
ン ４μｌ及びクロロ蟻酸イソブチル２４μｌを添加
し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した（以下これを
「Ａ液」と言う）。

【００９５】一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶
解し、０.５％ ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９.４を外液として一
晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心し得
られた上清１.５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。４℃
にて２時間反応させた後、スバーテル１杯のグリシンを
添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することにより反
応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣｌ−
１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中で１週間透析して免
疫用抗原を得た。このようにして得られたダイアジノン
誘導体１−ＫＬＨ結合体を免疫用抗原として用いた。

【００９６】実施例４ スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例３と同様の方法によ
りダイアジノン誘導体１−ＢＳＡ結合体を得た。

【００９７】実施例５ 免疫感作 免疫用抗原として実施例３において作製したダイアジノ
ン誘導体１−ＫＬＨ結合体について、それぞれマウスに
免疫を行った。免疫用抗原１００μｇをＰＢＳ１００μ
ｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合
した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。１７日後にフ
ロイント不完全アジュバントを用いて調製した免疫用抗
原を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫をおこ
なった。また、４１日後にはＰＢＳに溶解した免疫抗原
をマウスに追加免疫した。

【００９８】実施例６ 抗血清による測定 ダイアジノン誘導体１−ＢＳＡ結合体の溶液（０.１μ
ｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレート
にコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロッ
クエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：大日本製薬社製）
でブロッキングした後、抗血清希釈液と各種濃度のダイ
アジノンあるいはその類似化合物を含む１０％メタノー
ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに入
れ、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、０.０
５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢ
Ｓを用いて５０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗
マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μｌ
ずつ各ウェルに添加し、３７℃にて１時間反応させる。
さらに反応終了後、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ
にて２回洗浄し、０.４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０.０
４％過酸化水素を含む０.０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液
（ｐＨ４.５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温に
て２０分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１０
０μｌを各ウェルに加えて反応を停止させた後、４９０
ｎｍの吸光度を測定した。

【００９９】実施例７ ハイブリドーマ細胞の作製 実施例５に続き、血清中の抗ダイアジノン抗体の活性が
高くなったマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞
（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞融合をおこなっ
た。細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方
法でダイアジノンに対する抗体活性を調べた。ダイアジ
ノン誘導体１−ＢＳＡ結合体の溶液（０.１μｇ／ｍ
ｌ）を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコー
ティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエー
スでブロッキングした後、培養上清液と各種濃度のダイ
アジノンあるいはその類似化合物を含む１０％メタノー
ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに入
れ、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、０.０
５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢ
Ｓを用いて、５０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合
抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０μ
ｌずつ各ウェルにて３７℃１時間反応させた。さらに反
応終了後、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて２回
洗浄の後、０.４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０.０４％過
酸化水素を含む０.０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ
４.５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０
分間放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌ
を各ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの
吸光度を測定し、特異性のある抗体活性が認められたも
のを選抜した。

【０１００】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いた細胞クローニングをおこなった。その
結果、抗ダイアジノン抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株をクローン化した。そのうちのＤＡＺ ２−７８を
平成８年１１月１３日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５９
４６として工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５茨
城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１０１】実施例８ ダイアジノン誘導体とＨＲＰ
との結合体の作製 実施例３と同様な混合無水物法により、実施例１で作製
したダイアジノン誘導体１とＨＲＰとの結合体を作製し
た。１ｍｇのダイアジノン誘導体を無水ジオキサン０.
２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン０.５μ
ｌ、クロロ蟻酸イソブチル０.３μｌを添加し、１０−
１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これを「Ｂ液」
と言う） 一方、０．５％ＮａＨＣＯ₃をＮａＯＨでｐ
Ｈ９.４に調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解
し、Ｂ液をこの中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、
さらにグリシンを添加して３０分間撹拌することにより
反応を終了させた。反応物をＰＢＳにて透析することに
より、精製ＨＲＰ結合ダイアジノン誘導体−１を得た。

【０１０２】実施例 ９ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法
によるダイアジノンの測定 実施例７で得られたハイブリドーマ細胞（ＤＡＺ ２−
７８）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得ら
れた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗
体を分取し、以下の試験法にてダイアジノンを測定し
た。

【０１０３】それぞれのモノクロ−ナル抗体溶液（５μ
ｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート
に加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブロック
エースでブロッキングした後、ダイアジノン及び実施例
８で作製した適度に希釈されたＨＲＰ結合ダイアジノン
誘導体−１を含む１０％メタノール−ＰＢＳ溶液を５０
μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間静置した。反応終
了後、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ にて２回洗
浄の後、０.４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ、及び０.０４％過酸
化水素を含む０.０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４.
５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ室温にて２０分間
放置し、発色させた。反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各
ウェルに加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光
度を測定した。その結果を図１に示す。直接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法においても、ダイアジノンを測定することが
でき、その測定範囲は１−１０００ｎｇ／ｍｌであっ
た。

【０１０４】実施例１０ モノクロ−ナル抗体の評価 ダイアジノン誘導体−１に由来する、クローン化したハ
イブリドーマＤＡＺ２−７８の産生するモノクロ−ナル
抗体ＤＡＺ ２−７８について実施例９と同様の方法を
用いてダイアジノン及び他の類似する有機リン系化合物
に対する反応性について調べた。この結果を図２に示
す。図２より、この抗体は非常に特異性が高く、ダイア
ジノンとのみ反応し、他の類似する有機リン系化合物で
あるピリミホスメチル、エトリムホス、ピリダフェンチ
オン、クロルピリホスとは反応しない。モノクローナル
抗体ＤＡＺ ２−７８ は直接結合ＥＬＩＳＡ法でダイア
ジノンの量を１−１０００ｐｍｏｌ／ｍｌの範囲で測定
することができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体ＤＡＺ
２−７８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるダイアジノ
ンの測定を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＤＡＺ
２−７８の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるダイアジノ
ン及び他の類似する有機リン系化合物の測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 谷口 佳隆 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (56)参考文献 特開 平８−231591（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−503760（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅ ｍ．，Ｖｏｌ．44（12），ｐ．4052− 4063（1996) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/44 G01N 33/53 C07F 9/6509 C12N 5/10 C12N 15/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、ｎは、１−１０の整数である］で表される構造
   を有する化合物と高分子化合物とを式（１）中のカルボ
   キシル基を介して結合させた結合体を抗原として用いる
   ことにより製造された、ダイアジノンと反応性を示すモ
   ノクローナル抗体又はそのフラグメント。
2. 【請求項２】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４６で寄託
   されているハイブリドーマによって産生されるＤＡＺ
   ２−７８である、請求項１に記載のモノクローナル抗体
   又はそのフラグメント。
3. 【請求項３】請求項１若しくは２に記載のモノクローナ
   ル抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドー
   マ。
4. 【請求項４】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４６で寄託
   されている、請求項３に記載のハイブリドーマ。
5. 【請求項５】請求項１若しくは２に記載のモノクローナ
   ル抗体又はそのフラグメント、及び所望により請求項１
   に記載の式（１）の化合物を用いることを特徴とする、
   ダイアジノンの免疫学的測定方法。