JPH11269157A

JPH11269157A - ベンタゾンのハプテン化合物、抗体及び測定方法

Info

Publication number: JPH11269157A
Application number: JP10068145A
Authority: JP
Inventors: Shigehisa Ito; 茂壽伊東; Hirokazu Imazawa; 裕和今澤
Original assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Current assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 1999-10-05

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、ベンタゾンのハプテン化合物、抗
体および測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のハプテン化合物は、ベンタゾン
又はその部分にスペーサーアームおよび結合のための官
能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、３−イソプロピル
−１Ｈ−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）
−オン２，２−ジオキシド（以下、本明細書中「ベン
タゾン」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそ
のフラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ベンタゾンは、以下の式（４）：

【化３】で表される構造を有する、ダイアジン系除草剤である。
ダイアジン系除草剤は、窒素２原子を含む６員環化合物
ダイアジンの構造を有する一連の化合物をいう。ベンタ
ゾン剤の他に、核酸塩基ウラシル系のターバシル剤、ブ
ロマシル剤、レナシル剤、畑地一年生雑草を対象とした
除草剤のＰＡＣ剤、ピリデート剤、並びに殺虫、殺菌作
用も有する多目的の土壌薫蒸剤のダゾメット剤等が含ま
れる。

【０００４】ベンタゾンは、非ホルモン移行型の除草剤
で、水田の多年草雑草、一年生広葉雑草あるいは畑の雑
草防除に使用される。水によく溶け、雑草の生育期（発
生盛期−増殖初期）に根部、茎葉部の両方から吸収さ
れ、主に蒸散流によって上方に移行し、作用部位である
葉部に多く蓄積され、殺草効果を示す。ミズガヤツリな
どでは根茎を通じて分株への移行も認められる。主な殺
草作用は光合成阻害作用であると考えられ、このほか高
濃度液を茎葉に散布した場合は接触的な速効性の殺草作
用もあることが認められている。イネ科植物には作用が
弱い。イネはベンタゾンを代謝、解毒する能力が大きく
不活性代謝物に変化させる。水溶性が高く、土壌吸着が
弱いので土壌移行性は大きい。ベンタゾンの他にベンタ
ゾンナトリウム塩製剤がある（農薬ハンドブック第３
８４頁−第３８８頁、１９９４年版、日本植物防疫協
会；「最新農薬の残留分析法」第６８頁−第７０頁、
農薬残留分析法研究班編集中央法規出版）。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農薬のポストハーベ
スト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ベンタゾンについては、食品衛生法に基づき残留基
準値が、穀類、豆類（０．２ｐｐｍ）、野菜（０．２−
０．５ｐｐｍ）等に定められている。環境や食品に関す
る安全確保のためには、これらに含有される、ベンタゾ
ンの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。

【０００６】従来、ベンタゾンは、穀類、豆類、野菜等
の試料から抽出し、精製した後Ｎ−メチル化を行い、ガ
スクロマトグラフィー（ＧＣ）等により分析されてき
た。例えば、試料をジクロロメタンで抽出して、フロリ
ジルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣで測定す
る方法が採用されている。これらの方法は、試料の調製
が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要
すること、並びに測定装置や設備等に高額の費用を必要
とする等の問題点がある。ベンタゾンの測定は、特に輸
入農産物等の残留農薬の分析においては、短時間で膨大
な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけで
なく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定
方法が要求されてきている。

【０００７】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００８】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄｔｈｅｏｒｙｏｆ
ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒ
ｄａｍＮｅｗＹｏｒｋ，ＯｘｆｏｒｄＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載
されている。

【０００９】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ベンタゾンのような低分子
化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すこ
とができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子
化合物に結合させることによって初めて一団のエピトー
プとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起
こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生さ
れる。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫
原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。

【００１０】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１１】ベンタゾンについては、抗体を得るための
種々の試みが行われていたにもかかわらず、ベンタゾン
に対する感受性が低く、ベンタゾンよりもむしろその類
似化合物への反応性の方が高い抗血清が得られているの
みであった（ＱｉｎｇＸｉａｏＬｉら、Ｊ．Ａｇｒ
ｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．
８、１９９１，ｐ．１５３７−１５４４）。よって、そ
の必要性が非常に高かったにもかかわらず、抗体のみな
らず、抗体を得るために必要な適当なハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ベンタゾン
に反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、及び
その作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細
書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可
能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１３】本発明はその一態様において、ベンタゾン
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１４】本発明は、また、ベンタゾンに反応性を有
する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテ
ン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供することを
目的とする。

【００１５】本発明は、さらに、ベンタゾン誘導体と高
分子化合物との結合体を提供することを目的とする。当
該結合体はベンタゾンに反応性を有する抗体を作製する
ための抗原となる。

【００１６】本発明は、さらにまた、前記抗体又はその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び／又は前記ベンタゾン誘導体と高分子
化合物との結合体を使用することを含む、ベンタゾンの
免疫学的測定方法を提供することを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ベンタゾン又はその部分にスペーサーア
ーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導
入した、ベンタゾンの誘導体をハプテンとして使用する
ことにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得るこ
とに成功し、本発明の完成に至った。

【００１９】本発明の対象となるベンタゾンは、以下の
式（４）：

【化４】で表される化合物である。

【００２０】本発明の抗体は、例えば、ベンタゾンにス
ペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した
誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させ
たものを抗原として用いることによって得ることができ
る。例えば、以下の式（１）−（３）：

【化５】［式（１）−（３）中、Ｒは、水素原子または炭素数１
−５のアルキル基であり；ｎは、０−１０の整数であ
り；ｍは、２−１０の整数であり；そしてｌは、１−１
０の整数である］からなるグループから選択される構造
を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使
用する。好ましくは、式（１）の化合物を本発明のハプ
テンとする。

【００２１】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ベンタゾンに反応す
る抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物又
は該抗体を用いるベンタゾンの免疫学的測定方法に関す
る。

【００２２】ベンタゾン誘導体の作製式（１）−（３）で表されるベンタゾン誘導体は、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００２３】Ｉ．（１）の化合物の製造方法の例先ず、以下の式（Ｘ１）：

【化６】［式（Ｘ１）中、Ｒおよびｎは先に定義した通りであ
る］で表される遊離アミノ酸のカルボキシル基に保護基
を導入することにより、以下の式（Ｘ２）：

【化７】［式（Ｘ２）中、Ｐ¹はカルボキシル基の保護基であ
り；そしてＲおよびｎは先に定義した通りである］で表
されるエステルを合成する。

【００２４】Ｐ¹で示されるカルボキシル基の保護基は
公知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキ
シベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリク
ロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることがで
きる。

【００２５】式（Ｘ２）のエステル化合物の合成法とし
ては既知の多くの方法が知られている。例えば、アミノ
酸と対応するアルコールの溶液あるいは懸濁液に等量以
上の塩化チオニルを加える方法、あるいは塩化水素、塩
化チオニル、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の酸触媒
を加え脱水縮合する方法が挙げられる。また、アミノ酸
のアミノ基を適当な保護基で保護したのちジクロロメタ
ン、１，２−ジクロロエタン、テトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）、ジエチルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシ
レン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の適
当な溶媒存在下で、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイ
ミド（ＤＩＰＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボ
ジイミド系縮合剤、あるいはトリフェニルホスフィンと
アゾジカルボン酸ジエチル等のアゾジカルボン酸エステ
ルを用いアルコールと脱水縮合する方法、あるいはＢＯ
Ｐ試薬、ＤＰＰＡ試薬等の他の縮合剤を用いてエステル
を合成する方法等（実験化学講座２２、４３頁−５１
頁、日本化学会編、丸善株式会社）により得られたアミ
ノ酸誘導体の保護基を除去することによりアミノ酸エス
テルを得る方法も挙げられる。あるいは、塩基存在下ア
ルキルハライドを反応させる方法等により得られたアミ
ノ酸誘導体の保護基を除去する方法も挙げられる。アミ
ノ酸のｔｅｒｔ−ブチルエステルについてはジクロロメ
タン、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、
ＴＨＦ等の適当な溶媒中、リン酸、硫酸、三フッ化ホウ
素ジエチルエーテル錯体等の存在下、アミノ基を保護し
たアミノ酸とイソブテンを撹拌して得られたアミノ酸誘
導体の保護基を除去することにより得る方法も挙げられ
る。

【００２６】アミノ基の保護基としては、例えば、ベン
ジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、ｔｅｒｔ−ブトキシ
カルボニル基（Ｂｏｃ基）、９−フルオレニルメトキシ
カルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等が挙げられる。アミノ基
の保護基を除去する方法としては加水分解による方法、
塩酸、硫酸等の鉱酸、あるいはトリフルオロ酢酸等の有
機酸を用いる方法、ピリジンやピペリジン等の塩基を用
いる方法等が挙げられる。

【００２７】次に、式（Ｘ２）の化合物に、塩化スルフ
リルを反応させる。反応は、例えば、アセトニトリル、
ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチ
ル、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等
の適当な有機溶媒中で、五塩化アンチモン等の触媒の存
在下で行う。さらに、反応は０℃から溶媒の沸点の温
度、好ましくは５０℃から１５０℃、１時間から２０時
間、好ましくは２時間から５時間撹拌することにより行
う。

【００２８】上記反応物をさらに以下の式（Ｘ３）：

【化８】［式（Ｘ３）中、Ｐ²はカルボキシル基の保護基であ
る］で表されるアントラニル酸エステルと反応させ、以
下の式（Ｘ４）：

【化９】［式（Ｘ４）中、Ｒ、Ｐ¹、Ｐ²およびｎは先に定義した
通りである］で表される化合物を得る。

【００２９】反応は、例えば、トルエン、アセトニトリ
ル、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、酢酸エ
チル、ベンゼン、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な
有機溶媒中で、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸ナト
リウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム等の塩基の存在下で行う。さらに、反応は０℃から
溶媒の沸点の温度、好ましくは１０℃から１００℃、
０．５時間から２０時間、好ましくは１時間から３時間
撹拌することにより行う。

【００３０】Ｐ²は、Ｐ¹に関して上述したような公知の
任意のカルボキシル基の保護基であり、Ｐ¹と同一であ
っても異なっていてもよい。

【００３１】次に、式（Ｘ４）の化合物を、例えば、ナ
トリウムエトキシド（ナトリウムエチラート）、ナトリ
ウムメチラート、水素化ナトリウム等の縮合剤の存在下
で加熱撹拌することにより、式（１）の化合物を得るこ
とができる。反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは５０℃から１２０℃、１０分間から１０時間、好
ましくは０．５時間から１時間撹拌することにより行
う。

【００３２】ＩＩ．（２）の化合物の合成方法の例式（２）の化合物は、例えば、上述した式（４）のベン
タゾンを、以下の式（Ｘ５）：

【化１０】［式（Ｘ５）中、Ｌ¹はＣｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン原
子であり；そしてｍは先に定義した通りである］で表さ
れるハロゲン化カルボン酸と反応させることによって得
られる。

【００３３】反応は、例えば、トルエン、アセトニトリ
ル、エタノール、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフ
ラン、ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド及び水等の溶媒中
で、トリエチルアミン、水素化ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等の
塩基の存在下において行う。さらに、反応は０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは１０℃から１２０℃、１０
分間から１０時間、好ましくは０．５時間から２時間撹
拌することにより行う。

【００３４】ＩＩＩ．（３）の化合物の合成方法の例先ず、以下の式（Ｘ６）：

【化１１】で表される５−ヒドロキシアントラニル酸にカルボキシ
ル基の保護基Ｐ²を導入することにより、以下の式（Ｘ
７）：

【化１２】［式（Ｘ７）中、Ｐ²はカルボキシル基の保護基であ
る］で表される化合物を得る。

【００３５】Ｐ²のカルボキシル基の保護基は上述した
ように、公知のものから選択することができる。また、
保護基の導入は、例えば、上述したように、５−ヒドロ
キシアントラニル酸と対応するアルコールの溶液あるい
は懸濁液に塩化水素、塩化チオニル、硫酸、ｐ−トルエ
ンスルホン酸等の酸触媒を加え脱水縮合する方法によっ
て行うことができる。

【００３６】次に、式（Ｘ７）の化合物を、以下の式
（Ｘ８）：

【化１３】［式（Ｘ８）中、Ｐ¹、Ｌ¹およびｌは先に定義した通り
である］で表されるハロゲン化カルボン酸誘導体と反応
させて、以下の式（Ｘ９）：

【化１４】［式（Ｘ９）中、Ｐ¹、Ｐ²およびｌは先に定義した通り
である］で表される化合物を得る。

【００３７】反応は、例えば、ジメチルホルムアミド、
アセトニトリル、エタノール、ベンゼン、トルエン、ジ
クロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、
酢酸エチル、ジメチルスルホキシド及び水等の溶媒中
で、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメ
チラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン等
の塩基の存在下において行う。さらに、反応は０℃から
溶媒の沸点の温度、好ましくは２０℃から２００℃、１
０分間から２０時間、好ましくは０．５時間から３時間
撹拌することにより行う。

【００３８】次に、例えば、Ｌｉｅｂｉｇ．Ａｎｎ．Ｃ
ｈｅｍ．７２９巻４０−５１頁（１９６９）記載の方
法により、式（Ｘ９）の化合物を以下の式（Ｘ１０）：

【化１５】［式（Ｘ１０）中、Ｌ²はＣｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン
原子である］で表されるハロゲン化イソプロピルスルフ
ァモイルと反応させ、以下の式（Ｘ１１）：

【化１６】［式（Ｘ１１）中、Ｐ¹、Ｐ²およびｌは先に定義した通
りである］で表される化合物を得る。

【００３９】次に、式（Ｘ１１）の化合物をナトリウム
エトキシド（ナトリウムエチラート）、ナトリウムメチ
ラート、水素化ナトリウム等の縮合剤の存在下で加熱撹
拌することにより、以下の式（Ｘ１２）：

【化１７】［式（Ｘ１１）中、Ｐ¹およびｍは先に定義した通りで
ある］で表される化合物を得ることができる。反応は、
０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは５０℃から１２
０℃、１０分間から１０時間、好ましくは０．５時間か
ら１時間撹拌することにより行う。

【００４０】最後に、式（Ｘ１２）の化合物からＰ¹の
カルボキシル基の保護基を除去することにより、式
（３）で表される化合物を得ることができる。

【００４１】カルボキシル基の保護基は、酸又はアルカ
リ存在下で除去することができる。メチル基、エチル基
等の低級アルキル基、及びベンジル基、フェニル基など
は、水とメタノール、エタノール、ＴＨＦ等の有機溶媒
との混合溶液中で、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ存在下、０℃から６０
℃、好ましくは０℃から１０℃、５分から２０時間、好
ましくは５分から１時間撹拌することによって除去でき
る。メチル基、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、
３，４−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔ
ｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジ
フェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、２−ト
リメチルシリルエトキシメチル基などはジクロロメタ
ン、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、
トルエン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル
等の適当な有機溶媒中で、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸
あるいは酢酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタン
スルホン酸等の有機酸存在下、マイナス１０℃から６０
℃、好ましくは０℃から２５℃、１時間から２０時間、
好ましくは２時間から５時間撹拌することにより除去で
きる。また、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、
３，４−ジメトキシベンジル基は加水素分解、ｔｅｒｔ
−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニ
ルシリル基、トリイソプロピルシリル基、２−トリメチ
ルシリルエトキシメチル基等のシリル基は、フッ化ピリ
ジウム、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡ
Ｆ）等によって除去することができる。

【００４２】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又
は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製
品とすることができる。

【００４３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００４４】ベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合
体の作製上述のように合成されたベンタゾン誘導体を適当な高分
子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。

【００４５】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ
及びＢＳＡが好ましい。特に好ましいのはＢＳＡであ
る。

【００４６】ベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合
は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅ
ｒｅｔａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐
1094（1954））、又は活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡ
ＲＵｅｔａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅ
ｍ．42 301−309（１９９４））等の公知の方法によっ
て行うことができる。

【００４７】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを高分子化合物と反応させることにより目的と
するハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショ
ッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応
において慣用されている化合物を使用することができ
る。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、ト
リメチルアミン、Ｎ−メチルホルマリン、ピリジン、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣ
Ｏ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙
げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１００
℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時
間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間であ
る。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、
通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から
１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時
間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法
は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水
物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、
具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロ
メタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化
炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族
炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極
性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用さ
れるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチ
ル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸
エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方
法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物
の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。

【００４８】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく
酸イミド活性化エステルを生成させる。

【００４９】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハ
プテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比
は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは
１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反
応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０
℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５
分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好
ましくは１時間から２時間である。反応温度は各々の融
点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００５０】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、ベンタゾン
誘導体と高分子化合物との結合体を得ることができる。

【００５１】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をベンタゾン誘導体に結合させたものを、免疫
学的測定方法において使用することができる。標識物質
としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲ
Ｐ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フ
ルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物
質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが
ある。

【００５２】ポリクローナル抗体の作製ベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、ベンタゾン誘導体
−ＫＬＨ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「Ｐ
ＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント
又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助
剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫する
ことによって得ることができる。免疫される動物として
は当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、
例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げ
ることができる。

【００５３】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は1回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし5週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００５４】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ベンタゾンと反応するポリクロー
ナル抗体の存在を評価することができる。

【００５５】本発明において後述するベンタゾン誘導体
と高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた
抗血清は、後述する間接競合ＥＬＩＳＡ法において、約
１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの濃度でベンタゾ
ンと反応する（実施例７、図１）。

【００５６】モノクローナル抗体の作製ベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００５７】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００５８】（ａ）免疫用抗原として使用するベンタゾ
ン誘導体と高分子化合物との結合体の作製（ｂ）動物への免疫（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製（ｄ）ミエローマ細胞の調製（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００５９】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ），コールドスプリングハーバーラボラト
リーズ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二
ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載
されている。

【００６０】以下、本発明のベンタゾンに対するモノク
ローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限され
ないことは当業者によって明らかであろう。

【００６１】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００６２】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６３】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）
（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５,
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５
３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来
の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３．（Ｙ３）（Ｎ
ａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））
等を使用できる。

【００６４】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改
変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日
に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００６５】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９
８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的
に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細
胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別
の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法
を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学
５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜
採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の
方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細
胞を３−１０倍程度用いればよい。

【００６６】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６７】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ベンタゾンに対する抗体活性を測定
する。

【００６８】さらに、測定によりベンタゾンに反応する
抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞ク
ローニングを行う。この細胞クローニング法としては、
限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含ま
れるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上
に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーター
によって1個の細胞を取り出す方法；セルソーターによ
って１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が
挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられ
る。

【００６９】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗ベンタゾンモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハ
イブリドーマを培養する培地としては、例えば、１０％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００７０】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７１】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ベンタゾンモノクローナル抗体として使用す
ることできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる
塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精
製することにより抗ベンタゾンモノクローナル抗体を得
ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの慣用されている方法を組合わせることにより
実施できる。

【００７２】以上のようにして得られた抗ベンタゾンモ
ノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法など
の公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定
することができる。

【００７３】抗体によるベンタゾンの測定本発明で使用する抗体によるベンタゾンの測定法として
は、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳ
Ａ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８
０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗体の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００７４】ベンタゾンの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法の
うち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のよ
うな手順により行うことができる。（ａ）まず、抗原で
あるベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合体を担体
に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を
抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキング
する。（ｃ）これに各種濃度のベンタゾンを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びベンタゾン
に競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、
ベンタゾン−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗
原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成し
た検量線から試料中のベンタゾンの量を決定することが
できる。

【００７５】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００７６】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベッコのリン酸緩衝液を挙げることができ
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００７７】なお、抗体に固相化させる抗原としては、
抗体に作製したベンタゾン誘導体と高分子化合物との結
合体自体のみならず、式（１）−（３）で表される他の
誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式（１）−（３）の化合物でｎまたはｍの
数が相違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いる
こともできる。さらに、式（１）−（３）に含まれない
他のベンタゾン類似化合物も、固相化抗原として使用す
ることも可能である。

【００７８】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（ベン
タゾン誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化した
担体において、ベンタゾン誘導体部分以外に後で添加す
る抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっ
ぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤とし
て、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。
あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、
大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等のブロッ
キング剤として市販されているものを使用することもで
きる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば
抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液
［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加した
８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、
約４℃、室温で、１時間から５時間インキュベーション
した後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液
としては特に制限はないが、例えば、６０ｍＭＮａＣ
ｌを添加したホウ酸緩衝液を用いることができる。

【００７９】次いで（ｃ）工程において、ベンタゾンを
含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化
抗原及びベンタゾンと反応させることにより、固相化抗
原−抗体複合体及びベンタゾン−抗体複合体が生成す
る。

【００８０】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のベンタゾンに対する抗体を加え、更に第二抗体
として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次
加えて反応させる。

【００８１】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは２５℃から３７℃で約1時間行えばよい。反
応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合し
なかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例え
ば、６０ｍＭＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を用い
ることができる。

【００８２】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００８３】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からベンタゾンの量
を算出することができる。

【００８４】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【００８５】ベンタゾンを添加しない反応溶液の吸光度
に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸
光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のベ
ンタゾンを添加した反応液の阻害率により予め作成して
おいた検量線を用いて、試料中のベンタゾンの濃度を算
出できる。

【００８６】本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ２２
−１１は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でベンタゾンの量
を０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましく
は０．０１μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で測定で
きる。また、ＢＴＺ２２−２１は、間接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法でベンタゾンの量を０．００１μｇ／ｍｌから
１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから２
μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。

【００８７】あるいはベンタゾンの測定は、例えば以下
に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。

【００８８】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。（ｃ）各種濃度のベンタゾンを含む試料及び、ベンタゾ
ン誘導体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを、担体
に固相化した抗体と反応させる。（ｄ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料
中のベンタゾンの量を決定する。

【００８９】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００９０】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のベンタゾン
並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ
目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００９１】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ベンタゾン誘導体を酵素に結合する方法で
あれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例
えば、前述した活性化エステル法を採用することができ
る。調製した酵素結合ハプテンは、ベンタゾンを含む試
料と混合する。

【００９２】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したベンタゾン
誘導体自体のみならず、式（１）−（３）で表される他
の誘導体を用いることもできる。例えば、式（１）−
（３）においてｎまたはｍの数が相違する化合物を各々
抗体作製用と標識競合用の化合物として用いることがで
きる。さらに、式（１）−（３）に含まれない他のベン
タゾン類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして
使用可能である。（ｃ）工程においてベンタゾンを含む
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、ベンタゾンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応に
より、これらと固相化担体との複合体が生成する。ベン
タゾンを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。
限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよ
そ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去す
る。洗浄液は、例えば６０ｍＭＮａＣｌを添加したホウ
酸緩衝液を使用することができる。

【００９３】さらに、（ｄ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からベンタゾンの量を算出することができ
る。

【００９４】本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ２２
−１１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でベンタゾンの量
を０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましく
は０．０１μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で測定で
きる。また、ＢＴＺ２２−２１は、直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法でベンタゾンの量を０．００１μｇ／ｍｌから
１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから３
μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。

【００９５】また、本発明のモノクローナル抗体は、上
述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法により、ベンタゾンのナトリウム塩を測定する
ことも可能である。

【００９６】本発明の抗体の交差反応性上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。

【００９７】例えば、ＢＴＺ２２−１１およびＢＴＺ
２２−２１は、ベンタゾンの類縁化合物、例えば、ベ
ンタゾンの代謝物である６−ヒドロキシベンタゾン及び
Ｎ−メチルベンタゾン、並びに除草剤のベンスルフロン
メチルおよびメフェナセット、殺虫剤のフェニトロチオ
ンおよびイミダクロプリド、殺菌剤のプロベナゾールお
よびトリシクラゾールに対してほとんど反応せず、ベン
タゾンに対する特異性の高い抗体である（実施例１２、
図４）。

【００９８】本発明の抗体のｐＨ依存性およびメタノー
ル耐性本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＢＴＺ２２
−１１およびＢＴＺ２２−２１はともに、ｐＨ約９から
約１１の弱アルカリ領域が最も適した反応条件である
（実施例１３）。従って、ベンタゾンのナトリウム製剤
についても測定できることは明らかである。

【００９９】本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ２２
−１１およびＢＴＺ２２−２１はさらに、上述した直
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれば、各々０％から約１０
％および０％から約２０％の濃度のメタノール存在下に
おいて、ベンタゾンを濃度依存的に認識できる（実施例
１３）。一般に分析はメタノール等の有機溶媒中で行わ
れることを考慮すると、本発明のモノクローナル抗体の
このような特性は非常に有効である。

【０１００】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０１】

【実施例】実施例１ベンタゾン誘導体−１の合成

【化１８】

【０１０２】６−アミノヘキサン酸メチル塩酸塩（１）メタノール５０ｍｌへ塩化チオニル１３ｍｌ（１８０ｍ
ｍｏｌ）をマイナス１０℃からマイナス５℃で滴下し、
１０分後、同温度で６−アミノヘキサン酸６.６ｇ（５
０ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で一夜撹拌した。反応混
合物を濃縮し、残渣の固体をジエチルエーテルで洗浄
後、乾燥し８.４ｇ（９２％）の目的物（１）を得た。

【０１０３】融点：１２０−１２２℃

【０１０４】６−［Ｎ−（２−メトキシカルボニルフェ
ニル）スルファモイルアミノ］ヘキサン酸メチル（２）アセトニトリル２０ｍｌに６−アミノヘキサン酸メチル
塩酸塩（１）３.６ｇ（２０ｍｍｏｌ）、塩化スルフリ
ル２.７ｇ（２０ｍｍｏｌ）および五塩化アンチモン０.
０２ｇを加えた。この懸濁液を２時間撹拌下に環流させ
た後、更に塩化スルフリル２.７ｇ（２０ｍｍｏｌ）を
加え、２時間環流させた。反応混合物を濃縮後、残渣を
トルエン３ｍｌに溶解し、この溶液をトルエン１０ｍｌ
中のアントラニル酸メチル３.０ｇ（２０ｍｍｏｌ）お
よびトリエチルアミン２.２ｇ（２２ｍｍｏｌ）に２０
℃から４０℃で加え、次いで６０℃で１時間撹拌した。
反応混合物を酢酸エチル１５０ｍｌで抽出し、酢酸エチ
ル層を水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濾
液を濃縮した。残渣の固体をｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝２：１の混合溶媒で再結し、４.９ｇ（７５％）の目
的物（２）を得た。

【０１０５】融点：１０３−１０４℃

【０１０６】３−（５−カルボキシペンチル）−１Ｈ−
２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）−オン
２，２−ジオキシド（３）６−［Ｎ−（２−メトキシカルボニルフェニル）スルフ
ァモイルアミノ］ヘキサン酸メチル（２）１.０ｇ（３
ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、この溶液に
ナトリウムエチラート０.７ｇ（１０ｍｍｏｌ）を室温
下に加え、９０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を濃
縮後、残渣に３Ｎの塩酸を加え酸性とし、酢酸エチル１
５０ｍｌで抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸
ナトリウムで乾燥、濾過し、濾液を濃縮した。残渣の固
体をトルエンで再結し、０.７ｇ（７３％）の目的物
（３）を得た。

【０１０７】融点：１２９−１３１℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ）δ １．
３３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．５４（２Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ₂），１．６７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），２．２１
（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．８４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），
７．１８（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），７．３４（１
Ｈ，ｔ，Ａｒ：Ｈ），７．７０（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：
Ｈ），８．０２（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），１１．６５
（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ）ＭＳ（ＣＩ⁺，ＭＨ⁺）ｍ／
ｚ３１３

【０１０８】実施例２ベンタゾン誘導体−２の合成

【化１９】

【０１０９】１−（５−カルボキシペンチル）−３−イ
ソプロピル−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３
Ｈ）−オン２，２−ジオキシド３−イソプロポキシ−２，１，３−ベンゾチアジアジン
−４（３Ｈ）−オン２，２−ジオキシド（ベンタゾン）
０．６ｇ（２．５ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸
０.６ｇ（３.０ｍｍｏｌ）をトルエン１５ｍｌに溶解し
た。この溶液に室温下トリエチルアミン０.６ｇ（５.９
ｍｍｏｌ）を加え、撹拌下に１.５時間環流した。反応
混合物に酢酸エチル７０ｍｌを加え、有機層を水、２Ｎ
の塩酸、水の順に洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマ
トグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に通
し、０.６ｇ（収率６７％）の目的物を得た。

【０１１０】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨ
ｚ）δ １．２５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．４９（８
Ｈ，ｍ，ＣＨ₂，２ＣＨ₃），１．５５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ
₂），２．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.２Ｈｚ，ＣＨ₂），
３．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.２Ｈｚ，ＣＨ₂），４．９
３（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），７．４７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.
２Ｈｚ，Ａｒ：Ｈ），７．５９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８.４
Ｈｚ，Ａｒ：Ｈ），７．７９（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ
），８．０７（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），１２．０１
（１Ｈ，ｂｒｓ，ＣＯＯＨ）

【０１１１】実施例３ベンタゾン誘導体−３の合成

【化２０】

【０１１２】５ーヒドロキシアントラニル酸メチル
（１）メタノール２００ｍｌに５−ヒドロキシアントラニル酸
２５ｇ（０．１６ｍｏｌ）と濃硫酸４０ｍｌを加え、３
時間撹拌下に環流した。反応混合物を濃縮し、残渣に水
２００ｍｌおよび２８％水酸化ナトリウム溶液１００ｍ
ｌを加えて、更にアルカリ性になるまで重炭酸ナトリウ
ムを加えた。析出した結晶を酢酸エチルで抽出し、有機
層を水洗し、炭酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮し
て、１１.６ｇ（収率４２％）の目的物（１）を得た。

【０１１３】５−（５−エトキシカルボニルペンチルオ
キシ）アントラニル酸メチル（２）５−ヒドロキシアントラニル酸メチル（１）３.３ｇ
（２０ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸４．９ｇ（２
２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム３．０ｇ（２４ｍｍｏ
ｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド６０ｍｌに入れ、
１６０℃で１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで
抽出、有機層を水洗し、炭酸マグネシウムで乾燥後、濾
過、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー
（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し２.８ｇ
（収率４５％）の目的物（２）を得た。

【０１１４】５−（５−エトキシカルボニルペンチルオ
キシ）−２−イソプロピルスルファモイルアミノ安息香
酸メチル（３）５−（５−エトキシカルボニルペンチルオキシ）アント
ラニル酸メチル（２）２．５ｇ（８ｍｍｏｌ）およびト
リエチルアミン０．９０ｇ（９ｍｍｏｌ）をトルエン３
０ｍｌに溶解し、この溶液にトルエン５ｍｌに溶かした
塩化イソプロピルスルファモイル１.４ｇ（９ｍｍｏ
ｌ）を２０℃から４０℃で滴下し、６０℃で１時間撹拌
した。反応混合物にトルエン５０ｍｌを加え、有機層を
水洗し、炭酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。
残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸
エチル＝３：１）で精製し１.５ｇ（収率４３％）の目
的物（３）を得た。

【０１１５】６−（５−エトキシカルボニルペンチルオ
キシ）−３−イソプロピル−１Ｈ−２，１，３−ベンゾ
チアジアジン−４（３Ｈ）−オン２，２−ジオキシド
（４）エタノール３０ｍｌに５−（５−エトキシカルボニルペ
ンチルオキシ）−２−イソプロピルスルファモイルアミ
ノ安息香酸メチル（３）１．２ｇ（２．７ｍｍｏｌ）お
よびナトリウムエチラート０．５７ｇ（１４．３ｍｍｏ
ｌ）を加え、９０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を
濃縮後、残渣を１０ｍｌの水に溶かし、希塩酸で酸性と
し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水洗し、炭酸マグ
ネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。残渣をシリカゲル
クロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）
で精製し１.０ｇ（収率８３％）の目的物（４）を得
た。

【０１１６】６−（５−カルボキシペンチルオキシ）−
３−イソプロピル−１Ｈ−２，１，３−ベンゾチアジア
ジン−４（３Ｈ）−オン２，２−ジオキシド（５）エタノール１０ｍｌに６−（５−エトキシカルボニルペ
ンチルオキシ）−３−イソプロピル−１Ｈ−２，１，３
−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）−オン２，２−ジ
オキシド（４）１．０ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を溶解し、
この溶液に水１０ｍｌに溶かした水酸化ナトリウム０．
５７ｇ（１４．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹
拌した。反応混合物を濃縮した後、残渣を水３０mに溶
解し３０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。水層に１Ｎの塩
酸を加えて酸性とし、５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出
した。酢酸エチル層を水洗し、炭酸マグネシウムで乾燥
後、濾過、濃縮した。

【０１１７】残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘ
キサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し０.７０ｇ（収
率７５％）の目的物（５）を得た。

【０１１８】融点：９４−９７℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．４１（６Ｈ，ｄ，２ＣＨ₃），１．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．８４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），２．２５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），４．５６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），４．７９（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），７．９０（３Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），１２．０６（２Ｈ，ｂｒ，ＮＨ，ＣＯＯＨ）

【０１１９】実施例４免疫用抗原の作製実施例１で作製したベンタゾン誘導体−１をハプテンと
して免疫用抗原を混合酸無水物法により作製した。

【０１２０】先ず、実施例１で作製したベンタゾン誘導
体−１の５μmolを無水ジオキサン５０μlに溶解し、こ
こにトリ−ｎ−ブチルアミン２.６２μl及びクロロ蟻酸
イソブチル１.４３μlを添加し、３７℃で１時間撹拌し
た。さらに、０．２Ｍホウ酸緩衝液１．５ｍｌに溶解し
たＫＬＨまたはＢＳＡ１０ｍｇを加え、常温で６時間反
応を行った。ＰＢＳに透析後、７％Ｋ₂ＣＯ₃を含んだＰ
ＢＳの条件下で４時間処理し、再度ＰＢＳで透析して目
的物を得た。

【０１２１】このようにして得られたベンタゾン誘導体
−１とＫＬＨとの結合体（以下、「ベンタゾン誘導体１
−ＫＬＨ結合体」という）、およびベンタゾン誘導体−
１とＢＳＡとの結合体（以下、「ベンタゾン誘導体１−
ＢＳＡ結合体」という）を免疫用抗原として用いた。

【０１２２】実施例５スクリーニング用抗原の作製実施例１で作製したベンタゾン誘導体−１をハプテンと
してスクリーニング用抗原を活性化エステル法により作
製した。

【０１２３】まず、ベンタゾン誘導体−１の３．６４μ
ｍｏｌをＤＭＳＯ５０μｌに溶解した。ここに次に、１
８４ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド／ＤＭ
ＳＯ溶液１μｌ（１．６０μｍｏｌ相当量）と５３ｍｇ
／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩／ＤＭＳＯ溶液（０．２７μ
ｍｏｌ相当量）を添加した。ＤＭＳＯ５０μｌを加えた
後、遮光下、室温で９０分間放置し活性化させた。

【０１２４】一方、ＢＳＡ及びヒトアルブミン（Ｈｕ
Ａ）を各々１０ｍｇ秤量し、１５０ｍＭＮａＣｌを含
む８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μｌに添
加溶解した。これを上記の反応液と混合し、遮光下、室
温で９０分間放置することにより結合反応を行った。最
後に反応試薬除去のため、遮光、４℃の条件下で一晩、
２ＬのＰＢＳで２回、透析を行い、ベンタゾン誘導体１
−ＢＳＡ結合体及びベンタゾン誘導体１−ＨｕＡ結合体
を各々作製した。

【０１２５】実施例６免疫感作免疫はＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例４で調製し
た免疫用抗原１００μｇをＰＢＳ５０μｌに溶解し、さ
らに等量のフロイント完全アジュバントを添加混合した
後、マウスの腹腔内に接種した。１ヶ月後に初回免疫の
１／４量を追加免疫した。さらにその１週間後に、マウ
ス尾静脈から血液を採取した。血液を３７℃で３０分イ
ンキュベーショントした後、４℃で一晩静置した。５０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を採取しこ
れを抗血清とした。

【０１２６】実施例７抗血清の力価の測定実施例６で調製した抗血清の力価を、実施例５で調製し
たスクリーニング用抗原を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法によって評価した。

【０１２７】先ず、実施例５で調製したスクリーニング
用抗原を４μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し、９
６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェル
となるように添加し、４℃で１晩静置することにより固
定化した。ここで免疫用抗原としてベンタゾン誘導体１
−ＫＬＨ結合体を用いたものに対してはスクリーニング
用抗原としてベンタゾン誘導体１−ＢＳＡ結合体を、そ
してベンタゾン誘導体１−ＢＳＡ結合体を用いたものに
はベンタゾン誘導体１−ＨｕＡ結合体を各々使用するこ
ととした。次に溶液を廃棄し、１％ＢＳＡを含んだＰＢ
Ｓ溶液を３００μｌ／ウェル添加することによりブロッ
キングを行った。

【０１２８】このウェルを洗浄後、少量のメタノールに
溶解した後ＰＢＳで任意の濃度となるよう希釈したベン
タゾン溶液５０μｌ、０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳで希
釈した抗体希釈液５０μｌを添加し、１時間常温で反応
を行った。３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗マ
ウスＩｇＧ抗体（キルケガードアンドペリー社製）を１
００μｌ／ウェルで添加し、室温でさらに１時間反応さ
せた。洗浄液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基
質溶液［３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン
（１００μｇｌ／ｍｌ）、並びに０．００６％過酸化水
素を添加した０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５）］で１０分間発色させ、１Ｎの硫酸で反応を停止さ
せた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１２９】結果は図１に示すように、ベンタゾン誘導
体１−ＢＳＡ結合体を免疫用抗原として用いた場合、約
１−約１００μｇ／ｍｌの範囲でベンタゾンと反応する
ことがわかった。

【０１３０】実施例８モノクローナル抗体の作製実施例７で抗血清の評価により選抜されたマウスについ
て細胞融合を行った。

【０１３１】最終免疫後３日目のマウスの脾臓細胞をダ
ルベッコ培地中に取り出し、ダルベッコ培地にて３回遠
心により洗浄した（１２００ｒｐｍ，４℃，５分）。一
方、あらかじめ培養しておいたマウスミエローマ細胞
（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）を同様に３回遠心洗
浄（１０００ｒｐｍ，４℃，５分）し、これら脾臓細
胞、ミエローマ細胞を細胞数の比で５：１となるように
混合し、ポリエチレングリコールを１ｍｌ添加し、細胞
融合操作を行った。ＨＡＴ培地を添加し、９６ウェル培
養プレートに１プレートあたり総細胞数が２×１０⁷細
胞となるように分注し、培養を行なった。培養後、細胞
培養液を用いて実施例７と同様の間接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法でベンタゾンに対する反応性を指標にスクリーニン
グした。

【０１３２】次に選抜された細胞について限界希釈法に
より細胞クローニングを行った。その３日後に培養液を
半量交換し、ハイブリドーマがコロニーを形成するまで
培養を続けた。

【０１３３】その結果、ベンタゾン誘導体１−ＢＳＡ結
合体を免疫用抗原として用いたものから、ベンタゾンに
反応性に示すモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを２株（ＢＴＺ２２−１１，ＢＴＺ２２−２
１）分離した。これらの産生するモノクローナル抗体は
いずれもＩｇＧ１λであった。これら２株を平成１０年
３月１３日に各々寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６７０４お
よびＦＥＲＭＰ−１６７０５で工業技術院生命工学工
業技術研究所（〒３０５−００４６茨城県つくば市東
１丁目１番３号）に寄託した。

【０１３４】実施例９間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
るベンタゾンの測定実施例８で得られたハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔
に移植し、１０日−１５日経過後の腹水を採取し、硫安
分画法によりモノクローナル抗体を採取し、プロテイン
Ａカラム（アマルシャム社製）を用いて精製した。この
操作によって抗ベンタゾンモノクローナル抗体、ＢＴＺ
２２−１１およびＢＴＺ２２−２１を得た（以降、
モノクローナル抗体は、これらを産生するハイブリドー
マと同一名称を用いる）。

【０１３５】さらに、ＢＴＺ２２−１１およびＢＴＺ
２２−２１を用いて、実施例７と同様に間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法を行った。その結果、図２に示すようにＢ
ＴＺ２２−１１では０．０１−３μｇ／ｍｌの範囲でベ
ンタゾンと反応し、またＢＴＺ２２−２１は０．０１
−２μｇ／ｍｌの範囲で反応した。

【０１３６】実施例１０ベンダゾン誘導体−１とＨＲ
Ｐとの結合体の作製ベンタゾン誘導体−１とＨＲＰとの結合体を作製するた
めに、先ずベンタゾン誘導体−１の複素環上の水素原子
が結合した窒素原子に保護基を結合させた類似体を合成
した。

【０１３７】

【化２１】

【０１３８】実施例１で合成したベンタゾン誘導体−１
の０．２３ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）とクロロ蟻酸イソブ
チル０．２２ｇ（１．６３ｍｍｏｌ）をジオキサン１０
ｍｌに溶解し、１０℃から１５℃でトリエチルアミン
０．１６ｇ（１．６３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時
間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝
１：１）に通し、１２０ｍｇ（収率４０％）の３−（５
−カルボキシペンチル）−１−イソブトキシカルボニル
−１Ｈ−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）
−オン２，２−ジオキシド（以下、「ベンタゾン誘導
体−１類似体」と言う）を得た。

【０１３９】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ ０．８６（６Ｈ，ｄ，２ＣＨ₃），１．３５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．６７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．９２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），２．４９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），３．９３（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），４．０７（２Ｈ，ｄ，ＣＨ₂），７．６３（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），７．７２（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），７．８４（１Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），８．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ：Ｈ），１１．９（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ）

【０１４０】次いで、実施例５と同様の活性化エステル
法により上記ベンダゾン誘導体−１類似体とＨＲＰとの
結合体を作製した。さらに、実施例５の方法に従って結
合させた後、７％Ｋ₂ＣＯ₃を含んだＰＢＳ溶液中で４時
間反応させることにより、窒素原子上の保護基を除去
し、ベンタゾン誘導体１−ＨＲＰ結合体を作製した。

【０１４１】実施例１１直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
よる本発明のモノクローナル抗体のベンタゾンとの反応
性本発明のモノクローナル抗体、ＢＴＺ２２−１１およ
びＢＴＺ２２−２１を用いて、以下に示す直接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法を行った。

【０１４２】精製抗体を４μｇ／ｍｌとなるようにＰＢ
Ｓに希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ
ずつ添加し、４℃で１晩静置することにより固相化し
た。抗体結合後、１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ溶液を、３
００μｌ／ウェル添加することによりブロッキングを行
った。ここに各濃度に希釈したベンタゾン溶液及び実施
例１０で作製したベンタゾン誘導体１−ＨＲＰ結合体を
含むＰＢＳ溶液を５０μｌずつ添加し、１時間室温で反
応させた。反応後、実施例７と同様の方法で発色させ、
４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１４３】その結果、図３に示すようにＢＴＺ２２
−１１は０．０１−３μｇ／ｍｌの範囲でベンタゾンと
反応し、またＢＴＺ２２−２１も０．０１−３μｇ／
ｍｌの範囲で反応した。

【０１４４】実施例１２本発明のモノクローナル抗体
のベンタゾン類縁化合物との交差反応性本発明のモノクローナル抗体、ＢＴＺ２２−１１およ
びＢＴＺ２２−２１について、ベンタゾン類縁化合物
との交差反応性を直接競合ＥＬＩＳＡ法によって調べ
た。

【０１４５】その結果、ベンタゾンの代謝物である６−
ヒドロキシベンタゾン及びＮ−メチルベンタゾンについ
ては、ＢＴＺ２２−１１、ＢＴＺ２２−２１とも
に、測定範囲内において（０．０１ｐｐｍ−１０ｐｐ
ｍ）交差反応性は認められなかった。また、水田で用い
られる主な農薬原体についても同様に直接競合ＥＬＩＳ
Ａ法によって交差反応性を調べた。その結果、ベンスル
フロンメチル、メフェナセット（以上、除草剤）、フェ
ニトロチオン、イミダクロプリド（以上、殺虫剤）、プ
ロベナゾール、トリシクラゾール（以上、殺菌剤）のい
ずれに対しても、交差反応性は認められなかった。

【０１４６】実施例１３モノクローナル抗体のｐＨ依
存性およびメタノール耐性本発明のモノクローナル抗体のｐＨ依存性を調べた。そ
の結果、ＢＴＺ２２−１１、ＢＴＺ２２−２１とも
ｐＨ９からｐＨ１１の弱アルカリ域が最も適した反応条
件であった。

【０１４７】また、有機溶媒の測定系への影響を調べる
ため、メタノールを添加して試験をおこなった。ＢＴＺ
２２−１１では１０％程度のメタノールまで、そし
て、ＢＴＺ２２−２１では２０％程度のメタノール濃
度までは測定系に影響を与えないことが認められた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のベンタゾン誘導体１を用いて
得られた抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるベン
タゾンとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ
２２−１１およびＢＴＺ２２−２１の間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法によるベンタゾンとの反応性を示す。

【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ
２２−１１およびＢＴＺ２２−２１の直接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法によるベンタゾンとの反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＧＧ０１Ｎ 33/53 33/577 ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式（１）−（３）：【化１】［式（１）−（３）中、Ｒは、水素原子または炭素数１−５のアルキル基であ
り；ｎは、０−１０の整数であり；ｍは、２−１０の整
数であり；そしてｌは、１−１０の整数である］からな
るグループから選択される構造を有する化合物。
【請求項２】請求項１に記載の式（１）−（３）の化合
物と高分子化合物又は標識化合物との結合体。
【請求項３】請求項１に記載の式（１）−（３）の化合
物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製
し、当該抗原を用いることにより、以下の式（４）：【化２】で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
造することを特徴とする、式（４）で表される構造を有
する化合物に反応性を示す抗体の製造方法。
【請求項４】請求項３に記載の方法により製造された、
式（４）で表される化合物に反応性を示す抗体またはそ
のフラグメント。
【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】ＢＴＺ２２−１１またはＢＴＺ２２−
２１である、請求項４または５に記載の抗体またはその
フラグメント。
【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
抗体またはフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６７０４または
ＦＥＲＭＰ−１６７０５で寄託されている、請求項７
に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
（４）で表される化合物の免疫学的測定方法。