JP3884586B2 - イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１−（６−クロロ−３−ピリジルメチル）−Ｎ−ニトロイミダゾリジン−２−イリデンアミン（以下、本明細書中「イミダクロプリド」と言う）およびその類似化合物のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【０００２】
本発明はさらに、前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
イミダクロプリドは、以下の式（３）：
【化３】
で表される構造を有する、クロロニコチニル系の殺虫剤である。速効的な殺虫活性を示す。より詳しくは、イミダクロプリドはシナプス後膜のニコチン性アセチルコリン受容体に作用し、神経伝達を遮断すると考えられている。本剤に曝露された害虫は従来の有機リン剤やカーバメート剤の異常興奮とは異なり、麻痺、弛緩症状を起こして死に至る。致死濃度以下でも害虫の摂食、交尾、産卵、飛翔、歩行などの活動を抑える（農薬ハンドブック 第１１６頁−第１１８頁及び第５３８頁、１９９４年版、日本植物防疫協会；「最新農薬の残留分析法」 第３５５頁−第３５７頁、農薬残留分析法研究班編集 中央法規出版）。
【０００４】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。イミダクロプリドについては、環境庁長官個別設定の農薬登録保留基準値が、例えば、米（０．２ｐｐｍ）、果実（１ｐｐｍ）、野菜、いも類（０．５ｐｐｍ）、茶（５ｐｐｍ）、ピーマン（５ｐｐｍ）と定められている（「最新農薬の残留分析法」 同上）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、農作物、特に米に含有される、イミダクロプリドの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【０００５】
従来、例えば農作物中のイミダクロプリドは、米、果実、野菜、いも類等から抽出し、精製した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析されてきた。即ち、試料をアセトニトリルで抽出し、多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣで測定する方法が採用されている。この方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。イミダクロプリドの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【０００６】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【０００７】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ ０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載されている。
【０００８】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、イミダクロプリドのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【０００９】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１０】
このように、イミダクロプリドについては、その必要性が非常に高かったにもかかわらず、抗体のみならず、抗体を得るために必要なハプテンも本発明前には得られていなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イミダクロプリドに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【００１２】
本発明はその一態様において、イミダクロプリドに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００１３】
本発明は、また、イミダクロプリドに反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明は、さらに、イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を使用することを含む、イミダクロプリドの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イミダクロプリド又はその部分にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、イミダクロプリドの誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００１８】
本発明の対象となるイミダクロプリドは、以下の式（３）：
【化４】
で表される構造を有する化合物である。
【００１９】
また、本発明の抗体は、式（３）のイミダクロプリドにおいて、塩素原子が他のハロゲン原子で置換されているイミダクロプリド類似化合物を認識するものも含む。即ち、本発明の抗体は、以下の式（２）：
【化５】
［式（２）中、Ｌ1は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなるグループから選択されるハロゲン原子である］
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体である。本明細書において、「イミダクロプリド」は、文脈により、式（３）で表されるイミダクロプリドおよび／または式（２）で表されるイミダクロプリド類似化合物を意味する。
【００２０】
本発明の抗体は、例えば、イミダクロプリドの部分にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【化６】
［式（１）中、
Ａは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2およびＮＨからなるグループから選択される基であり、；そして
ｎは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。
【００２１】
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、イミダクロプリドに反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるイミダクロプリドの免疫学的測定方法に関する。
【００２２】
イミダクロプリドハプテンの作製
式（１）で表されるイミダクロプリドハプテンは、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
【００２３】
まず、以下の式（Ｘ１）：
【化７】
［式（Ｘ１）中、Ｌ2はＣｌ、Ｂｒ、およびＩからなるグループから選択されるハロゲン原子である］
で表される構造を有する化合物に、有機溶媒中、塩基の存在下、以下の式（Ｘ２）：
【化８】
［式（Ｘ２）中、
Ｐは、カルボキシル基の保護基であり；そして
Ａおよびｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を反応させて、以下の式（Ｘ３）：
【化９】
［式（Ｘ３）中、Ａ、Ｐおよびｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２４】
Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。
【００２５】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは１０℃から１００℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から２時間行う。
【００２６】
式（Ｘ３）の化合物の合成のための溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及び水等を用いることができる。塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等が挙げられる。
【００２７】
次に、式（Ｘ３）の化合物を還元することにより、以下の式（Ｘ４）：
【化１０】
［式（Ｘ４）中、Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２８】
還元反応は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸及び水等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて行う。反応は、マイナス８０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から５時間撹拌して行う。
【００２９】
次に、式（Ｘ４）の化合物を、クロロホルム、ジクロロメタン等の有機溶媒中、または、ハロゲン化剤を溶媒としても使用し、塩化チオニル等のハロゲン化剤と反応させて、以下の式（Ｘ５）：
【化１１】
［式（Ｘ５）中、
Ｌ3は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなるグループから選択されるハロゲン原子であり；そして
Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００３０】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から３時間行う。
【００３１】
次に、式（Ｘ５）の化合物に、有機溶媒中、塩基の存在下、以下の式（Ｘ６）：
【化１２】
で表される構造を有する２−ニトロイミノイミダゾリジンを反応させて、以下の式（Ｘ７）：
【化１３】
［式（Ｘ７）中、Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００３２】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から３時間行う。
【００３３】
式（Ｘ７）の化合物の合成のための溶媒および塩基は、式（Ｘ３）の化合物の合成に用いることができるものと、同様のものを用いることができる。
【００３４】
さらに、式（Ｘ７）の化合物からＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式（１）の化合物を得ることができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。
【００３５】
すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ７）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させることにより式（１）の化合物を得ることができる。
【００３６】
また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ７）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させることにより式（１）の化合物を得ることができる。
【００３７】
更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素による加水素分解によっても行うことができる。
【００３８】
更にまた、Ｐがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても行うことができる。
【００３９】
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【００４０】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
【００４１】
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたイミダクロプリドハプテンを適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。
【００４２】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。
【００４３】
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．42 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐1094（1954））等の公知の方法によって行うことができる。
【００４４】
活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成させる。
【００４５】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好ましくは１時間から４時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
【００４６】
カップリング反応後、反応液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を得ることができる。
【００４７】
一方、混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、カルボン酸とハロゲン蟻酸エステルとの反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【００４８】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をイミダクロプリドハプテンに結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32Ｐ、125Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
【００４９】
ポリクローナル抗体の作製
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を作製することができる。例えば、イミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【００５０】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。
【００５１】
免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、イミダクロプリドと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
【００５２】
本発明においてイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でイミダクロプリドと反応できる（実施例４、表１）。
【００５３】
モノクローナル抗体の作製
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。
【００５４】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
【００５５】
（ａ）免疫用抗原として使用するイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等
【００５６】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載されている。
【００５７】
以下、本発明のイミダクロプリドに対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
【００５８】
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００５９】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００６０】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５, １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））等を使用できる。
【００６１】
上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約１×１０6以上の細胞数を確保する。
【００６２】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。
【００６３】
脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００６４】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、イミダクロプリドに対する抗体活性を測定する。
【００６５】
さらに、測定によりイミダクロプリドに反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。
【００６６】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗イミダクロプリドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。
【００６７】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可能である。
【００６８】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗イミダクロプリドモノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗イミダクロプリドモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００６９】
以上のようにして得られた抗イミダクロプリドモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
【００７０】
抗体によるイミダクロプリドの測定
本発明で使用する抗体によるイミダクロプリドの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【００７１】
イミダクロプリドの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
【００７２】
（ａ）まず、抗原であるイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
【００７３】
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。
【００７４】
（ｃ）これに各種濃度のイミダクロプリドを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びイミダクロプリドに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、イミダクロプリド−抗体複合体を生成させる。
【００７５】
（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のイミダクロプリドの量を決定することができる。
【００７６】
（ａ）工程において、抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
【００７７】
抗原を担体に固相化させるには、例えば、抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で５０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【００７８】
なお、担体に固相化させる抗原としては、抗体を作製したイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を用いることもできる。例えば、式（１）で表されている化合物でＡまたはｎが抗体作製用と相違する抗原を固相化用として用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のイミダクロプリド類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【００７９】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、イミダクロプリドハプテン部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、約４℃、室温で、１時間から５時間インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００８０】
次いで（ｃ）工程において、イミダクロプリドを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びイミダクロプリドと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及びイミダクロプリド−抗体複合体が生成する。
【００８１】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のイミダクロプリドに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【００８２】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００８３】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【００８４】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からイミダクロプリドの量を算出することができる。
【００８５】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並びに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００８６】
イミダクロプリドを添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のイミダクロプリドを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のイミダクロプリドの濃度を算出できる。
【００８７】
あるいはイミダクロプリドの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
【００８８】
（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
【００８９】
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
【００９０】
（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のイミダクロプリドを含む試料に、イミダクロプリドハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。
【００９１】
（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。
【００９２】
（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料中のイミダクロプリドの量を決定する。
【００９３】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。
【００９４】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のイミダクロプリド並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【００９５】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製は、イミダクロプリドハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンは、イミダクロプリドを含む試料と混合する。
【００９６】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したイミダクロプリドハプテン自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンを用いることもできる。例えば、式（１）で表される化合物でＡまたはｎが抗体作製用と相違する化合物を標識競合用として用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のイミダクロプリド類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。
【００９７】
（ｄ）工程においてイミダクロプリドを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、イミダクロプリドと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。イミダクロプリドを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。
【００９８】
さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からイミダクロプリドの量を算出することができる。
【００９９】
本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．３ｎｇ／ｍｌないし５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｎｇ／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌの範囲でイミダクロプリドを測定できる（実施例７、図１）。
【０１００】
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
【０１０１】
例えば、３３Ｃ３−１−１は上述した間接競合ＥＬＩＳＡ法においてイミダクロプリドに高い特異性を示し、類縁化合物にはほとんど反応性を示さない（実施例６、表２）。
【０１０２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０３】
【実施例】
実施例１ イミダクロプリドハプテンの合成
【化１４】
【０１０４】
３−（５−ホルミル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（１）の合成
エタノール２０ｍｌに２−クロロ−５−ホルミルピリジン１.４ｇ（１０ｍｍｏｌ）、エチル ３−メルカプトプロピオネート１.５ｇ（１１ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム１.６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水を加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し１.７ｇ（収率７１％）の（１）を得た。
【０１０５】
３−（５−ヒドロキシメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（２）の 合成
３−（５−ホルミル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル２.０ｇ（８．４ｍｍｏｌ）を１、４−ジオキサン２０ｍｌに溶解した溶液に、水３ｍｌに溶かした水素化ホウ素ナトリウム０.３２ｇ（８．４ｍｍｏｌ）の溶液を１０−１５℃で加え、室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に水４０ｍｌを加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、次いで酢酸エチル：メタノール １：１）で精製し、１.４ｇ（収率７０％）の（２）を得た。
【０１０６】
３−（５−クロロメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（３）の合成
３−（５−ヒドロキシメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（２）２.２ｇ（９.０ｍｍｏｌ）をクロロホルム５ｍｌに溶解し、この溶液に、塩化チオニル１.３ｇ（１１ｍｍｏｌ）を１０−１５℃で加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に５％炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌを加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し２.３ｇ（収率６４％）の（３）を得た。
【０１０７】
３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリジン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオン酸エチル（４）の合成
アセトニトリル１０ｍｌに２−ニトロイミノイミダゾリジン０.８ｇ（６.２ｍｍｏｌ）、３−（５−クロロメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（３）１.６ｇ（６.２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム０.９４ｇ（６.８ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水を加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ 酢酸エチル）で精製し１.５ｇ（収率６８％）の（４）を得た。
【０１０８】
３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリジン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオン酸（５）の合成
エタノール４０ｍｌ中に３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオン酸エチル（４）１.３ｇ（３.７ｍｍｏｌ）を含む懸濁液に、水３０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣に水２０ｍｌとエーテル３０ｍｌを加え、分配後、水層を希塩酸でｐＨ５にし、酢酸エチル７０ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ 酢酸エチル：メタノール＝１：１）で精製し０.６ｇ（収率５０％）の（５）を得た。
【０１０９】
上記イミダクロプリドハプテン（５）の１Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−Ｄ６ , ４００ ＭＨｚ) δ
２．６２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２）, ３．２９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２）,
３．４７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ ２ ）, ３．６２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２）,
４．４２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２）, ７．３１（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ）,
７．５８（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ ）,８．４３（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ）,
８．９５（１Ｈ，ｓ，ＮＨ ）, １２（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ ）
【０１１０】
実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原の作製
免疫原およびスクリーニング用抗原としてイミダクロプリドハプテンとＢＳＡとの結合体を活性化エステル法を用いて作製した。
【０１１１】
実施例１で作製したイミダクロプリドハプテン０.２ｍｍｏｌをＤＭＳＯ１.０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０.３ｍｍｏｌ及び１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド０.３ｍｍｏｌを加え、室温で３.５時間撹拌した。反応後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿に分離した。
【０１１２】
一方、ＢＳＡ５０ｍｇを１４５ｍＭ ＮａＣｌ−０.０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２：以下「ＰＢＳ」と言う)５.０ｍＬに溶解し、ＤＭＳＯ １.０５ｍＬを加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記の上清０.２５ｍＬを加え、室温にて１６時間反応させた。反応後、蒸留水にて４℃で透析し、イミダクロプリドハプテンとＢＳＡとの結合体（以下、「イミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体」と言う）を調製し、以降免疫用抗原として使用した。
【０１１３】
また、同様の方法を用いて、イミダクロプリドハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「イミダクロプリドハプテン−ＲＳＡ結合体」と言う）、および、イミダクロプリドハプテンとＨＲＰとの結合体（以下、「イミダクロプリドハプテン−ＨＲＰ結合体」と言う）も作製した。
【０１１４】
実施例３ 免疫感作
免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製したイミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体１００μｇをＰＢＳ ５０μＬに溶解し、等量のフロイント完全アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュバンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加免疫した。また、６週間目に１８０μＬのＰＢＳに溶解した免疫用抗原３０μｇをマウス尾静脈より追加免疫した。
【０１１５】
実施例４ 抗血清によるイミダクロプリドの反応性
実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した抗血清を希釈調製して、以下に詳述するように間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にてイミダクロプリドを測定し、抗血清を評価した。
【０１１６】
実施例２で調製したイミダクロプリドハプテン−ＲＳＡ結合体溶液(０.５μｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートにコーティングし(２５ｎｇ /５０μｌ/ウェル)、４倍希釈したブロックエース (「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ)でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製した。これに抗血清１００００倍希釈液と、各種濃度のイミダクロプリドを含む２０%メタノール溶液とを等量混合し、その５０μＬを各ウェルに入れ、室温で１時間反応させた。
【０１１７】
ＰＢＳで５回洗浄した後に、１０倍希釈のブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 (Ｔａｇｏ社製)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１０分間反応させて発色させた。
【０１１８】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果の一例を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
表１より、イミダクロプリド１０ｎｇ／ｍＬにおいて阻害反応が認められたことから、用いた抗血清はイミダクロプリドに対して反応性があることが確認された。
【０１２１】
実施例５ ハイブリドーマの作製
実施例３に続いて、血清中の抗イミダクロプリド抗体活性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞(Ｓｐ２/０−Ａｇ１４)とを山下修二らの方法(組織細胞化学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年)に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養した。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッキングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清液をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。
【０１２２】
ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍希釈のブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体(Ｔａｇｏ社製)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２%の過酸化水素を含む０.１Ｍ クエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１０分間発色させた。
【０１２３】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、反応性を示す細胞(ハイブリドーマ)を選抜した。次に、各ウェルのイミダクロプリドとの反応性を実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗体を産生している細胞について限界希釈法によりクローニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗イミダクロプリド抗体を産生する細胞としてクローン化された。そのうちの３３Ｃ３−１−１を平成１０年１２月１７日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９４で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨城県つくば市１丁目１番３号）に寄託した。
【０１２４】
実施例６ モノクローナル抗体の交差反応性の評価
実施例５で得られたハイブリドーマ細胞３３Ｃ３−１−１が産生するモノクローナル抗体を精製し、抗イミダクロプリド抗体３３Ｃ３−１−１を得た。（以降、モノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマと同一の名称を用いる。）
【０１２５】
モノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１について、実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いて、２種類のイミダクロプリド類縁化合物に対する反応性を検討した。この結果を表２に示す。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
表２中、ＩＣ50（ｎｍｏｌ/Ｌ）は、イミダクロプリド等の化合物を添加しない反応溶液の吸光度に対して吸光度を５０％減少させる反応溶液中の対象化合物の濃度を示す。また、交差反応率（％）は、（イミダクロプリドのＩＣ50／対象化合物のＩＣ50）×１００で定義される。イミダクロプリドと類縁化合物の交差反応率の数値が乖離している程、イミダクロプリドと特異的に反応する抗体であることを示す。
【０１２８】
表２に示したように、モノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１はイミダクロプリドに対しては高い反応性を示したが、類縁化合物に対しては、ほとんど反応性を示さなかった。従って、モノクローナル抗体３３Ｃ−１−１は、イミダクロプリドに対して特異的に反応する抗体である。
【０１２９】
実施例７ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイミダクロプリドの測定
実施例５で得られたハイブリドーマ３３Ｃ３−１−１をマウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得られた腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１を精製した。この３３Ｃ３−１−１抗体を用いて直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、イミダクロプリドの量を測定した。
【０１３０】
上記の３３Ｃ３−１−１抗体溶液(１０μｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティングし、さらに４倍希釈のブロックエース(雪印乳業社製)でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製した。各濃度のイミダクロプリドを含む２０％メタノール溶液及び実施例２で作製したイミダクロプリドハプテン−ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μＬずつ各ウェルに入れ、２５℃で１.５時間反応させた。
【０１３１】
反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２%の過酸化水素を含むクエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬずつ各ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。
【０１３２】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１は、イミダクロプリドを０.３ｎｇ／ｍＬないし５０ｎｇ/ｍＬの範囲で測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイミダクロプリドの測定を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、１−（６−クロロ−３−ピリジルメチル）−Ｎ−ニトロイミダゾリジン−２−イリデンアミン（以下、本明細書中「イミダクロプリド」と言う）およびその類似化合物のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【０００２】
本発明はさらに、前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
イミダクロプリドは、以下の式（３）：
【化３】
【０００４】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。イミダクロプリドについては、環境庁長官個別設定の農薬登録保留基準値が、例えば、米（０．２ｐｐｍ）、果実（１ｐｐｍ）、野菜、いも類（０．５ｐｐｍ）、茶（５ｐｐｍ）、ピーマン（５ｐｐｍ）と定められている（「最新農薬の残留分析法」 同上）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、農作物、特に米に含有される、イミダクロプリドの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【０００５】
従来、例えば農作物中のイミダクロプリドは、米、果実、野菜、いも類等から抽出し、精製した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析されてきた。即ち、試料をアセトニトリルで抽出し、多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣで測定する方法が採用されている。この方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。イミダクロプリドの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【０００６】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【０００７】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ ０−７２０４−４２００−１ （１９９０） に記載されている。
【０００８】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、イミダクロプリドのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【０００９】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１０】
このように、イミダクロプリドについては、その必要性が非常に高かったにもかかわらず、抗体のみならず、抗体を得るために必要なハプテンも本発明前には得られていなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イミダクロプリドに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【００１２】
本発明はその一態様において、イミダクロプリドに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００１３】
本発明は、また、イミダクロプリドに反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明は、さらに、イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を使用することを含む、イミダクロプリドの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イミダクロプリド又はその部分にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、イミダクロプリドの誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００１８】
本発明の対象となるイミダクロプリドは、以下の式（３）：
【化４】
【００１９】
また、本発明の抗体は、式（３）のイミダクロプリドにおいて、塩素原子が他のハロゲン原子で置換されているイミダクロプリド類似化合物を認識するものも含む。即ち、本発明の抗体は、以下の式（２）：
【化５】
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体である。本明細書において、「イミダクロプリド」は、文脈により、式（３）で表されるイミダクロプリドおよび／または式（２）で表されるイミダクロプリド類似化合物を意味する。
【００２０】
本発明の抗体は、例えば、イミダクロプリドの部分にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【化６】
Ａは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2およびＮＨからなるグループから選択される基であり、；そして
ｎは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。
【００２１】
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、イミダクロプリドに反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるイミダクロプリドの免疫学的測定方法に関する。
【００２２】
イミダクロプリドハプテンの作製
式（１）で表されるイミダクロプリドハプテンは、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
【００２３】
まず、以下の式（Ｘ１）：
【化７】
で表される構造を有する化合物に、有機溶媒中、塩基の存在下、以下の式（Ｘ２）：
【化８】
Ｐは、カルボキシル基の保護基であり；そして
Ａおよびｎは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を反応させて、以下の式（Ｘ３）：
【化９】
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２４】
Ｐで示されるカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。
【００２５】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは１０℃から１００℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から２時間行う。
【００２６】
式（Ｘ３）の化合物の合成のための溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及び水等を用いることができる。塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等が挙げられる。
【００２７】
次に、式（Ｘ３）の化合物を還元することにより、以下の式（Ｘ４）：
【化１０】
で表される構造を有する化合物を得る。
【００２８】
還元反応は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸及び水等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて行う。反応は、マイナス８０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から５時間撹拌して行う。
【００２９】
次に、式（Ｘ４）の化合物を、クロロホルム、ジクロロメタン等の有機溶媒中、または、ハロゲン化剤を溶媒としても使用し、塩化チオニル等のハロゲン化剤と反応させて、以下の式（Ｘ５）：
【化１１】
Ｌ3は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなるグループから選択されるハロゲン原子であり；そして
Ａ、Ｐおよびｎは、先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を得る。
【００３０】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から３時間行う。
【００３１】
次に、式（Ｘ５）の化合物に、有機溶媒中、塩基の存在下、以下の式（Ｘ６）：
【化１２】
【化１３】
で表される構造を有する化合物を得る。
【００３２】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から３時間行う。
【００３３】
式（Ｘ７）の化合物の合成のための溶媒および塩基は、式（Ｘ３）の化合物の合成に用いることができるものと、同様のものを用いることができる。
【００３４】
さらに、式（Ｘ７）の化合物からＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、式（１）の化合物を得ることができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。
【００３５】
すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｘ７）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させることにより式（１）の化合物を得ることができる。
【００３６】
また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｘ７）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム水溶液等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させることにより式（１）の化合物を得ることができる。
【００３７】
更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素による加水素分解によっても行うことができる。
【００３８】
更にまた、Ｐがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても行うことができる。
【００３９】
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【００４０】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
【００４１】
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたイミダクロプリドハプテンを適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用する。
【００４２】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。
【００４３】
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．42 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．234 1090‐1094（1954））等の公知の方法によって行うことができる。
【００４４】
活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成させる。
【００４５】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好ましくは１時間から４時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
【００４６】
カップリング反応後、反応液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を得ることができる。
【００４７】
一方、混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、カルボン酸とハロゲン蟻酸エステルとの反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【００４８】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をイミダクロプリドハプテンに結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32Ｐ、125Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
【００４９】
ポリクローナル抗体の作製
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を作製することができる。例えば、イミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【００５０】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。
【００５１】
免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、イミダクロプリドと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
【００５２】
本発明においてイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でイミダクロプリドと反応できる（実施例４、表１）。
【００５３】
モノクローナル抗体の作製
イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。
【００５４】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
【００５５】
（ａ）免疫用抗原として使用するイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等
【００５６】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，1980年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、1986年）に記載されている。
【００５７】
以下、本発明のイミダクロプリドに対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
【００５８】
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００５９】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００６０】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ/ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１, １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５, １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ, ２７７，１３１−１３３,（１９７９））等を使用できる。
【００６１】
上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約１×１０6以上の細胞数を確保する。
【００６２】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ)らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。
【００６３】
脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００６４】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、イミダクロプリドに対する抗体活性を測定する。
【００６５】
さらに、測定によりイミダクロプリドに反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。
【００６６】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗イミダクロプリドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。
【００６７】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可能である。
【００６８】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗イミダクロプリドモノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗イミダクロプリドモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００６９】
以上のようにして得られた抗イミダクロプリドモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
【００７０】
抗体によるイミダクロプリドの測定
本発明で使用する抗体によるイミダクロプリドの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【００７１】
イミダクロプリドの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
【００７２】
（ａ）まず、抗原であるイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
【００７３】
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。
【００７４】
（ｃ）これに各種濃度のイミダクロプリドを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びイミダクロプリドに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、イミダクロプリド−抗体複合体を生成させる。
【００７５】
（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のイミダクロプリドの量を決定することができる。
【００７６】
（ａ）工程において、抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
【００７７】
抗原を担体に固相化させるには、例えば、抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で５０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【００７８】
なお、担体に固相化させる抗原としては、抗体を作製したイミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を用いることもできる。例えば、式（１）で表されている化合物でＡまたはｎが抗体作製用と相違する抗原を固相化用として用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のイミダクロプリド類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【００７９】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（イミダクロプリドハプテンと高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、イミダクロプリドハプテン部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−25Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、約４℃、室温で、１時間から５時間インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００８０】
次いで（ｃ）工程において、イミダクロプリドを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びイミダクロプリドと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及びイミダクロプリド−抗体複合体が生成する。
【００８１】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のイミダクロプリドに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【００８２】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００８３】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【００８４】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からイミダクロプリドの量を算出することができる。
【００８５】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並びに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はο−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００８６】
イミダクロプリドを添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のイミダクロプリドを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のイミダクロプリドの濃度を算出できる。
【００８７】
あるいはイミダクロプリドの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
【００８８】
（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
【００８９】
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
【００９０】
（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のイミダクロプリドを含む試料に、イミダクロプリドハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。
【００９１】
（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。
【００９２】
（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した、検量線から試料中のイミダクロプリドの量を決定する。
【００９３】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。
【００９４】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のイミダクロプリド並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【００９５】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製は、イミダクロプリドハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンは、イミダクロプリドを含む試料と混合する。
【００９６】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したイミダクロプリドハプテン自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンを用いることもできる。例えば、式（１）で表される化合物でＡまたはｎが抗体作製用と相違する化合物を標識競合用として用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のイミダクロプリド類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。
【００９７】
（ｄ）工程においてイミダクロプリドを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、イミダクロプリドと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。イミダクロプリドを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。
【００９８】
さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からイミダクロプリドの量を算出することができる。
【００９９】
本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．３ｎｇ／ｍｌないし５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．４ｎｇ／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌの範囲でイミダクロプリドを測定できる（実施例７、図１）。
【０１００】
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
【０１０１】
例えば、３３Ｃ３−１−１は上述した間接競合ＥＬＩＳＡ法においてイミダクロプリドに高い特異性を示し、類縁化合物にはほとんど反応性を示さない（実施例６、表２）。
【０１０２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０３】
【実施例】
実施例１ イミダクロプリドハプテンの合成
【化１４】
３−（５−ホルミル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（１）の合成
エタノール２０ｍｌに２−クロロ−５−ホルミルピリジン１.４ｇ（１０ｍｍｏｌ）、エチル ３−メルカプトプロピオネート１.５ｇ（１１ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム１.６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水を加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し１.７ｇ（収率７１％）の（１）を得た。
【０１０５】
３−（５−ヒドロキシメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（２）の 合成
３−（５−ホルミル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル２.０ｇ（８．４ｍｍｏｌ）を１、４−ジオキサン２０ｍｌに溶解した溶液に、水３ｍｌに溶かした水素化ホウ素ナトリウム０.３２ｇ（８．４ｍｍｏｌ）の溶液を１０−１５℃で加え、室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に水４０ｍｌを加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１、次いで酢酸エチル：メタノール １：１）で精製し、１.４ｇ（収率７０％）の（２）を得た。
【０１０６】
３−（５−クロロメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（３）の合成
３−（５−ヒドロキシメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（２）２.２ｇ（９.０ｍｍｏｌ）をクロロホルム５ｍｌに溶解し、この溶液に、塩化チオニル１.３ｇ（１１ｍｍｏｌ）を１０−１５℃で加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に５％炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍｌを加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し２.３ｇ（収率６４％）の（３）を得た。
【０１０７】
３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリジン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオン酸エチル（４）の合成
アセトニトリル１０ｍｌに２−ニトロイミノイミダゾリジン０.８ｇ（６.２ｍｍｏｌ）、３−（５−クロロメチル−２−ピリジルチオ）プロピオン酸エチル（３）１.６ｇ（６.２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム０.９４ｇ（６.８ｍｍｏｌ）を入れ、この混合物を環流下に２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水を加え、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ 酢酸エチル）で精製し１.５ｇ（収率６８％）の（４）を得た。
【０１０８】
３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリジン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオン酸（５）の合成
エタノール４０ｍｌ中に３−［５−（２−ニトロイミノイミダゾリン−１−イルメチル）−２−ピリジルチオ］プロピオン酸エチル（４）１.３ｇ（３.７ｍｍｏｌ）を含む懸濁液に、水３０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣に水２０ｍｌとエーテル３０ｍｌを加え、分配後、水層を希塩酸でｐＨ５にし、酢酸エチル７０ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ 酢酸エチル：メタノール＝１：１）で精製し０.６ｇ（収率５０％）の（５）を得た。
【０１０９】
上記イミダクロプリドハプテン（５）の１Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−Ｄ６ , ４００ ＭＨｚ) δ
２．６２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２）, ３．２９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２）,
３．４７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ ２ ）, ３．６２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２）,
４．４２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２）, ７．３１（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ）,
７．５８（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ ）,８．４３（１Ｈ，ｍ，Ｐｙｒ：Ｈ）,
８．９５（１Ｈ，ｓ，ＮＨ ）, １２（１Ｈ，ｂｒ，ＣＯＯＨ ）
【０１１０】
実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原の作製
免疫原およびスクリーニング用抗原としてイミダクロプリドハプテンとＢＳＡとの結合体を活性化エステル法を用いて作製した。
【０１１１】
実施例１で作製したイミダクロプリドハプテン０.２ｍｍｏｌをＤＭＳＯ１.０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０.３ｍｍｏｌ及び１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド０.３ｍｍｏｌを加え、室温で３.５時間撹拌した。反応後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿に分離した。
【０１１２】
一方、ＢＳＡ５０ｍｇを１４５ｍＭ ＮａＣｌ−０.０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.２：以下「ＰＢＳ」と言う)５.０ｍＬに溶解し、ＤＭＳＯ １.０５ｍＬを加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記の上清０.２５ｍＬを加え、室温にて１６時間反応させた。反応後、蒸留水にて４℃で透析し、イミダクロプリドハプテンとＢＳＡとの結合体（以下、「イミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体」と言う）を調製し、以降免疫用抗原として使用した。
【０１１３】
また、同様の方法を用いて、イミダクロプリドハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「イミダクロプリドハプテン−ＲＳＡ結合体」と言う）、および、イミダクロプリドハプテンとＨＲＰとの結合体（以下、「イミダクロプリドハプテン−ＨＲＰ結合体」と言う）も作製した。
【０１１４】
実施例３ 免疫感作
免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製したイミダクロプリドハプテン−ＢＳＡ結合体１００μｇをＰＢＳ ５０μＬに溶解し、等量のフロイント完全アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュバンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加免疫した。また、６週間目に１８０μＬのＰＢＳに溶解した免疫用抗原３０μｇをマウス尾静脈より追加免疫した。
【０１１５】
実施例４ 抗血清によるイミダクロプリドの反応性
実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した抗血清を希釈調製して、以下に詳述するように間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にてイミダクロプリドを測定し、抗血清を評価した。
【０１１６】
実施例２で調製したイミダクロプリドハプテン−ＲＳＡ結合体溶液(０.５μｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートにコーティングし(２５ｎｇ /５０μｌ/ウェル)、４倍希釈したブロックエース (「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ)でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製した。これに抗血清１００００倍希釈液と、各種濃度のイミダクロプリドを含む２０%メタノール溶液とを等量混合し、その５０μＬを各ウェルに入れ、室温で１時間反応させた。
【０１１７】
ＰＢＳで５回洗浄した後に、１０倍希釈のブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 (Ｔａｇｏ社製)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１０分間反応させて発色させた。
【０１１８】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果の一例を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
表１より、イミダクロプリド１０ｎｇ／ｍＬにおいて阻害反応が認められたことから、用いた抗血清はイミダクロプリドに対して反応性があることが確認された。
【０１２１】
実施例５ ハイブリドーマの作製
実施例３に続いて、血清中の抗イミダクロプリド抗体活性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞(Ｓｐ２/０−Ａｇ１４)とを山下修二らの方法(組織細胞化学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年)に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養した。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッキングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清液をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。
【０１２２】
ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍希釈のブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体(Ｔａｇｏ社製)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２%の過酸化水素を含む０.１Ｍ クエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１０分間発色させた。
【０１２３】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェルの量で加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、反応性を示す細胞(ハイブリドーマ)を選抜した。次に、各ウェルのイミダクロプリドとの反応性を実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗体を産生している細胞について限界希釈法によりクローニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗イミダクロプリド抗体を産生する細胞としてクローン化された。そのうちの３３Ｃ３−１−１を平成１０年１２月１７日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９４で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−００４６ 茨城県つくば市１丁目１番３号）に寄託した。
【０１２４】
実施例６ モノクローナル抗体の交差反応性の評価
実施例５で得られたハイブリドーマ細胞３３Ｃ３−１−１が産生するモノクローナル抗体を精製し、抗イミダクロプリド抗体３３Ｃ３−１−１を得た。（以降、モノクローナル抗体は、これを産生するハイブリドーマと同一の名称を用いる。）
【０１２５】
モノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１について、実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いて、２種類のイミダクロプリド類縁化合物に対する反応性を検討した。この結果を表２に示す。
【０１２６】
【表２】
表２中、ＩＣ50（ｎｍｏｌ/Ｌ）は、イミダクロプリド等の化合物を添加しない反応溶液の吸光度に対して吸光度を５０％減少させる反応溶液中の対象化合物の濃度を示す。また、交差反応率（％）は、（イミダクロプリドのＩＣ50／対象化合物のＩＣ50）×１００で定義される。イミダクロプリドと類縁化合物の交差反応率の数値が乖離している程、イミダクロプリドと特異的に反応する抗体であることを示す。
【０１２８】
表２に示したように、モノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１はイミダクロプリドに対しては高い反応性を示したが、類縁化合物に対しては、ほとんど反応性を示さなかった。従って、モノクローナル抗体３３Ｃ−１−１は、イミダクロプリドに対して特異的に反応する抗体である。
【０１２９】
実施例７ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイミダクロプリドの測定
実施例５で得られたハイブリドーマ３３Ｃ３−１−１をマウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得られた腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１を精製した。この３３Ｃ３−１−１抗体を用いて直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、イミダクロプリドの量を測定した。
【０１３０】
上記の３３Ｃ３−１−１抗体溶液(１０μｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティングし、さらに４倍希釈のブロックエース(雪印乳業社製)でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製した。各濃度のイミダクロプリドを含む２０％メタノール溶液及び実施例２で作製したイミダクロプリドハプテン−ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μＬずつ各ウェルに入れ、２５℃で１.５時間反応させた。
【０１３１】
反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０.０２%の過酸化水素を含むクエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５.０)を５０μＬずつ各ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。
【０１３２】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１は、イミダクロプリドを０.３ｎｇ／ｍＬないし５０ｎｇ/ｍＬの範囲で測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるイミダクロプリドの測定を示す。
Claims (11)
- 以下の式（１）：
Ａは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２およびＮＨからなるグループから選択される基であり、；そして
ｎは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物。 - ＡがＳであり、そして、ｎが２である、請求項１に記載の化合物。
- 請求項１又は２に記載された化合物と高分子化合物又は標識物質とを式（１）中のカルボキシル基を介して結合させた結合体。
- 請求項１又は２に記載の化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）：
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントの製造方法。 - 請求項３に記載の結合体を抗原として用いることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
- モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体又は抗原と結合可能なフラグメント。
- 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９４で寄託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体３３Ｃ３−１−１である、請求項５又は６に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
- 請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７０９４で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
- 請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントを用いることを特徴とする、式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
- さらに、請求項１もしくは２に記載の化合物又は請求項３に記載の結合体を用いることを含む、請求項１０に記載の免疫学的測定方法。
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