JPH10248565A

JPH10248565A - ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法

Info

Publication number: JPH10248565A
Application number: JP9064097A
Authority: JP
Inventors: Shigehisa Ito; 茂壽伊東; Shiyunichi Takewaki; 俊一竹脇; Shiro Miyake; 司郎三宅; Takashi Hironaka; 孝史弘中; Masaki Yamaguchi; 優樹山口; Yoshinori Beppu; 佳紀別府
Original assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Current assignee: KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Priority date: 1997-03-18
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 1998-09-22
Anticipated expiration: 2017-03-18
Also published as: JP3188641B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、ミクロブタニルのハプテン化合
物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のハプテン化合物は、以下の式
（１）【化１】［式中、ｎは１−１０の整数である］で表される構造を
有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２−ｐ−クロロフ
ェニル−２−（１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−−１−
イルメチル）ヘキサンニトリル（以下、本明細書中「ミ
クロブタニル」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体
及びそのフラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ミクロブタニルは、以下の式（２）：

【化５】で表される構造を有し、トリアゾール系のエルゴステロ
ール生合成阻害剤（以下、「ＥＢＩ剤」と言う）に属す
る。

【０００４】エルゴステロールは、藻菌類を除く多くの
糸状菌が体内で合成するステロール類の内の一つで、生
体膜のリン脂質の二重層の間に存在し、細胞膜の強度
や、透過性、各種の膜酵素の機能に重要な影響を与えて
いる。エルゴステロールは、生体内では、酢酸からメバ
ロン酸、スクワレンなどを経て合成されるが、この経路
のいずれかの反応を特異的に阻害する一連の化合物群を
ＥＢＩ剤と総称する。ＥＢＩ剤は、幅広い抗菌スペクト
ルと浸透性、治療性など優れた特性を有する。子のう菌
類、担子菌類、不完全菌類などに有効で、中でも各種作
物のうどんこ病に卓効を有することが特徴である。従来
の薬剤と比較すると低薬量で効力を発揮し、植物体内へ
速やかに浸透するため耐雨性もある。また、ミツバチな
ど訪花昆虫に対する毒性が低いので、果樹などの開花期
の散布が可能である。ＥＢＩ剤は化学構造から、トリア
ゾール系、イミダゾール系、ピリミジン系等に分けられ
る。本発明のミクロブタニルは、これらのうちトリアゾ
ール系のＥＢＩ剤に属する（農薬ハンドブック第２２
４頁−第２２７頁１９９４年版日本植物防疫協
会）。

【０００５】ミクロブタニルは、野菜、果樹などのうど
んこ病やさび病、黒星病、赤星病に有効である。植物体
内への浸透移行性があり、散布後の降雨による影響は少
ない。またガス効果が認められ、ハウス栽培ではかけむ
らによる発病防止が期待できる。予防効果もあるが、特
に治療効果が優れている。リンゴの黒星病菌を用いた治
療効果試験では、菌糸の生育防止、および子座の微細構
造変化とその活動停止が観察された。予防効果試験で
は、子座の形成阻止効果は強いが、胞子発芽および付着
器形成には影響は認められなかった。うどんこ病菌に対
しては、吸器の構造破壊、胞子形成阻害が認められてい
る（上記農薬ハンドブック第２２６頁−第２２７
頁）。

【０００６】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。ミクロブタニルについては、食品衛生法に基づき残
留基準値が、小麦で０．３ｐｐｍ、大麦で０．５ｐｐ
ｍ、ごぼう、たまねぎ等の野菜で１．０ｐｐｍ、りんご
で５．０ｐｐｍ、なし、もも等の果実で１．０ｐｐｍ
等、定められている（農薬登録保留基準残留農薬基準
ハンドブック農薬環保全対策研究会編第９２０頁−
第９２１頁）。環境や食品に関する安全確保のために
は、これらに含有される、ミクロブタニルの量を迅速、
かつ正確に測定することが必要である。

【０００７】従来、ミクロブタニルは、穀類、果実、野
菜、茶等の試料から抽出し、精製した後、ガスクロマト
グラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。例えば、試
料をアセトンで抽出して、カラムクロマトグラフィーで
精製した後、ＧＣで分析する方法が採用されている。こ
れらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を
必要とし、分析に熟練を有すること、並びに、測定装置
や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。
ミクロブタニルの測定は、特に輸入農産物等の残留農薬
の分析においては、短時間で膨大な数の試料の分析結果
を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性
及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきて
いる。

【０００８】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【０００９】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【００１０】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ミクロブタニルのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピ
トープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答
を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産
生される。このように高分子化合物と結合させて初めて
免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」という。

【００１１】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１２】しかしながら、ミクロブタニルについては
その必要性が非常に高かったにもかかわらず、本出願前
は感度・特異性とも十分な抗体は得られていなかった
（Ｊ．Ａｇｒｉ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．１９９５，４
３，２０８３−２０９１）。従って、適切な抗体はもと
より、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発
明前には得られていなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ミクロブタ
ニルに特異的に反応する新規な抗体を作製するための抗
原を構成するハプテン化合物となる、当該化合物の誘導
体を提供することを目的とする。

【００１４】本発明は、また、前記ミクロブタニル誘導
体と高分子化合物又は標識物質との結合体を提供するこ
とを目的とする。当該結合体はミクロブタニルに特異的
に反応する抗体を作製するための抗原となる。

【００１５】本発明は、さらに、ミクロブタニルに強い
親和性を有する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本
明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結
合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１６】本発明はその一態様において、ミクロブタ
ニルに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１７】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１８】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、ミクロブタニルの免疫学的測定方法を提供す
ることを目的とする。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ミクロブタニルにスペーサーアーム及び
高分子との結合に利用できる官能基を導入した、ミクロ
ブタニルの誘導体をハプテンとして使用することによ
り、前記化合物に特異的な抗体を得ることに成功し、本
発明の完成に至った。

【００２０】本発明の対象となるミクロブタニルは、以
下の式（２）：

【化６】で表される化合物である。

【００２１】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、前記ミクロブタニルの

【化７】の部分を

【化８】［式中、ｎは１−１０の整数であり、好ましくは２−７
である］に変化させたものである。即ち、本発明のミク
ロブタニル誘導体は、以下の式（１）：

【化９】［式（１）中、ｎは前述した通りである］で表される構
造を有する化合物である。

【００２２】尚、式（１）においてｎ＝３の化合物は、
化学構造と抗菌活性の関係を解析するための化合物の一
つとして合成されていたにすぎなかった（ＰＥＳＴＩＣ
ＩＤＥＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤＰＨＹＳ
ＩＯＬＯＧＹ３０，１９９−２１３(１９８８)）。従
って、抗体作製のためのハプテン化合物としての使用
も、また免疫学的測定における使用も、本発明前には全
く知られていない。

【００２３】本発明は、ミクロブタニルにスペーサーア
ーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体を、
ハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを
抗原として用いることによって、ミクロブタニルに特異
的な抗体を得ることを可能にした。

【００２４】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ミクロブタニルに反
応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるミクロブタニルの免疫学的測定方
法に関する。

【００２５】ミクロブタニルの誘導体の作製式（１）の化合物は、例えば、式（３）：

【化１０】［式中、Ｒはカルボキシル基の保護基を示し、ｎは先に
定義した通りである。］で示されるエステル化合物か
ら、Ｒで示されるカルボキシル基の保護基を除去するこ
とにより製造できる。

【００２６】上記式（３）中、Ｒで示されるカルボキシ
ル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例え
ば、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジ
ル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリクロロエチル基、
トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチル
シリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリ
ルエトキシメチル基等を挙げることができる。

【００２７】Ｒで示されるカルボキシル基の保護基の除
去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で
行うことができる。

【００２８】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式
（３）のエステル化合物を、好ましくはメタノール、エ
タノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等
の有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウムまたは水
酸化カリウム水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸点の温
度、好ましくは室温から５０℃で、５分−５時間、好ま
しくは１−２時間撹拌反応させることにより式（１）の
カルボン酸化合物を得ることができる。

【００２９】また酸加水分解の場合は、式（３）のエス
テル化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジク
ロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶
解し、次いで塩酸、硫酸、三塩化ホウ素、トリフルオロ
酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸を加えて、０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃で、５分−１
０時間、好ましくは１−５時間撹拌反応させることによ
り式（１）のカルボン酸化合物を得ることができる。

【００３０】更に、Ｒがベンジル基の場合、除去は水素
による接触還元反応によっても行うことができる。

【００３１】式（３）で示されるエステル化合物は以下
に記載するような、例えば特許公開公報昭５１−１４
３６６７号および米国特許第４３６６１６５号明細書に
記載の方法と同様の方法により製造することができる。

【００３２】即ち、例えばテトラヘドロンレターズ
（Tetrahedron Letters),４７３頁（１９７２年）記載
の方法により、以下の式（Ｚ１）：

【化１１】で表されるフェニルアセトニトリル誘導体をカルボアニ
オンの第４級アンモニウム塩とし、クロロホルム、ジク
ロロメタン等の非プロトン溶媒中で、以下の式（Ｚ
２）：

【化１２】［式中、Ｘはハロゲン原子を示し（本明細書中、ハロゲ
ン原子はＣｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する）、ｎおよび
Ｒは先に定義した通りである。］で表されるハロゲン化
アルキルエステル化合物と反応させることにより、以下
の式（Ｚ３）：

【化１３】［式中、ｎおよびＲは先に定義した通りである。］で表
される化合物が得られる。次いで、この化合物を単離、
または単離することなしに、上記文献と同様の反応条件
下にジブロモメタンでブロモメチル化することにより、
以下の式（Ｚ４）：

【化１４】［式中、ｎおよびＲは先に定義した通りである。］で表
される臭化物が得られる。

【００３３】次に、この臭化物（Ｚ４）と、１Ｈ−１,
２,４−トリアゾールを溶媒なしで、またはＮ,Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、ア
セトン、アセトニトリル、ジグライム等の有機溶媒中、
またはこれらの混合溶媒中、ナトリウムメチラート、ナ
トリウムエチラート、水素化ナトリウム等の塩基の存在
下に反応させることにより、式（３）で表される目的と
する化合物が得られる。

【００３４】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３５】ミクロブタニル誘導体と高分子化合物との
結合体の作製上述のように合成されたミクロブタニル誘導体を適当な
高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。

【００３６】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ］と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがあるが、ＫＬＨ
及びＢＳＡが好ましい。

【００３７】ミクロブタニル誘導体と高分子化合物との
結合は、例えば、活性化エステル法（A.E. KARU et a
l.:J. Agric. Food Chem. 42 301-309 (1994)）、又は
混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.Biol.Chem. 2
34 1090-1094 (1954)）等の公知の方法によって行うこ
とができる。

【００３８】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステルを生成させる。

【００３９】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ
−ヒドロキシコハク酸イミドのモル比は好ましくは１：
１０−１０：１、より好ましくは、１：１−１：１０、
最も好ましくは１：１である。反応温度は、０−１００
℃、好ましくは５−５０℃、より好ましくは２２−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３０分−
６時間、より好ましくは１−２時間である。反応温度は
各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。

【００４０】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃、より好ましくは２２−２７℃で、
反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６時間、
より好ましくは１−２時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、ミクロブタニル誘導体と
高分子化合物との結合体を得ることができる。

【００４１】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下
に行われる。塩基性化合物としてはショッテン−バウマ
ン反応において慣用されている化合物を使用することが
できる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジ
ン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡ
ＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、
炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等
が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃−１００
℃、好ましくは０℃−５０℃において行われ、反応時間
は５分−１０時間、好ましくは５分−２時間である。得
られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マ
イナス２０℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃に
おいて行われ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは
５分−５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で
行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されて
いるいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキ
サン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメト
キシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベン
ゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸
メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられ
る。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステ
ルとしては、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸
メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ
蟻酸エチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテン
とハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い
範囲から適宜選択され得る。

【００４２】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をミクロブタニル誘導体に結合させたものを、
免疫学測定方法において使用することができる。標識物
質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「Ｈ
ＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、
フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン等の発
色物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。

【００４３】ポリクローナル抗体の作製ミクロブタニル誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル
抗体を作製することができる。例えば、ミクロブタニル
誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢ
Ｓ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又
は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤
と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫するこ
とによって行う。免疫される動物としては当該分野で常
用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができ
る。

【００４４】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。投与は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間
隔で複数回行うことができる。

【００４５】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ミクロブタニルと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。

【００４６】モノクローナル抗体の作製ミクロブタニル誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を
作製することができる。

【００４７】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。（ａ）免疫用抗原として使用するミクロブタニル誘導体
と高分子化合物との結合体の作製（ｂ）動物への免疫（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製（ｄ）ミエローマ細胞の調製（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００４８】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリングハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００４９】以下、上述の本発明のミクロブタニルに対
するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これ
に制限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００５０】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５１】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５２】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【００５３】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変
ダルベコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約
３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００５４】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法に
ついては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）
に記載されている。別の融合方法としては、電気処理
（電気融合）による方法を採用することもできる（大河
内悦子ら、実験医学５．１３１５−１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３−１０倍程度用いれ
ばよい。

【００５５】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
産生能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使
用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製し
たＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００５６】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ミクロブタニルに対する抗体活性を
測定する。

【００５７】さらに、測定によりミクロブタニルに反応
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレー
ターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーター
によって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いら
れる。

【００５８】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗ミクロブタニ
ルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒
温器中）で培養するのが好ましい。

【００５９】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６０】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ミクロブタニルモノクローナル抗体として使
用することができるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗ミクロブタニルモノクローナ
ル抗体を得ることができる。さらに高度な精製が必要な
場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わ
せることにより実施できる。

【００６１】以上のようにして得られた抗ミクロブタニ
ルモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。

【００６２】抗体によるミクロブタニルの測定本発明で使用する抗体によるミクロブタニルの測定方法
としては、放射性同位元素免疫測定方法（ＲＩＡ法）、
ＥＬＩＳＡ法（Engvall,E., Methods in Enzymol., 7
0, 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、スポ
ット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎ
ｙ）法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方
法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和
５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点
からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００６３】ミクロブタニルの測定は各種ＥＬＩＳＡ法
のうち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下
のような手順により行うことができる。（ａ）まず、抗
原であるミクロブタニル誘導体と高分子化合物との結合
体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固
相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロ
ッキングする。（ｃ）これに各種濃度のミクロブタニル
を含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及
び遊離ミクロブタニルに競合的に反応させて、固相化抗
原−抗体複合体及び遊離ミクロブタニル−抗体複合体を
生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中の遊離
ミクロブタニルの量を決定することができる。

【００６４】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００６５】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、ダルベコのリン酸緩衝液を挙げることができる。
緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通
常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.０５
−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウ
ェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、
３００μｌ／ウェル以下で２０−１５０μｌ／ウェル程
度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特
に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーショ
ンが適している。

【００６６】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（ミク
ロブタニル誘導体と高分子化合物との結合体）を固相化
した担体において、ミクロブタニル誘導体部分以外に後
で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があ
り、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング
剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用で
きる。あるいは、ブロックエース（「ＢｌｏｃｋＡｃ
ｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等
のブロッキング剤として市販されているものを使用する
こともできる。具体的には、限定されるわけではない
が、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキング剤を
含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌ
を添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を
適量加え、約４℃−室温で、１時間−５時間インキュベ
ーションした後、緩衝液で洗浄することにより行われ
る。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、６０ｍ
ＭＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を用いることがで
きる。

【００６７】次いで（ｃ）工程において、ミクロブタニ
ルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及び遊離ミクロブタニルと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及び遊離ミクロブタニル−
抗体複合体が生成する。

【００６８】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のミクロブタニルに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識物質を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。

【００６９】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、３７℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
６０ｍＭＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を用いるこ
とができる。

【００７０】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約５００−１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００７１】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からミクロブタニル
の量を算出することができる。

【００７２】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば基質として過酸化水
素、発色試薬として３,３',５,５'−テトラメチルベン
チジンまたはｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰ
Ｄ」と言う）を使用する。限定されるわけではないが、
発色溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの
硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３,
３',５,５'−テトラメチルベンチジンを使用する場合、
４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場
合、４９０ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に
結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する
場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし
て発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、
４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。

【００７３】遊離のミクロブタニルを添加しない反応溶
液の吸光度に対して、ミクロブタニルを添加して抗体と
反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算す
る。既知の濃度のミクロブタニルを添加した反応液の阻
害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中
のミクロブタニルの濃度を算出できる。

【００７４】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体ＭＣＢ２−２３は約
０．８−５０ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＢ３−３３は約０．４−
６．３ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＢ７−１４は約１．６−１２．
５ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＢ３１−２は、約０．８−１２．５
ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例５、図１）。中
でも、ＭＣＢ３−３３が最も反応性が高い。

【００７５】あるいは、ミクロブタニルの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を担体に固相
化する。（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のミクロブタニルを
含む試料に、ミクロブタニル誘導体と酵素を結合させた
酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のミクロブタニルの量を決定する。

【００７６】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【００７７】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のミクロブタ
ニル及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ
目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００７８】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ミクロブタニル誘導体を酵素に結合する方
法であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、ミクロブタニ
ルを含む試料と混合する。

【００７９】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のミクロブタニルと酵素結
合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗
体との複合体が生成する。ミクロブタニルを含む試料は
適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけでは
ないが、反応は例えば室温でおよそ１時間行う。反応終
了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の酵素結合ハプテ
ンを除去する。洗浄液は、例えば６０ｍＭＮａＣｌを
添加したホウ酸緩衝液を使用することができる。

【００８０】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からミクロブタニルの量を算出することがで
きる。

【００８１】本発明のモノクローナル抗体ＭＣＢ３−３
３は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってミクロブタニ
ルを約０.２−１２ｎｇ／ｍｌの範囲で測定するするこ
とができる（実施例８、図２）。モノクローナル抗体Ｍ
ＣＢ３−３３は非常に特異性が高く、ミクロブタニルと
のみ反応し、他の類縁化合物、例えば、ヘキサコナゾー
ル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、トリアジメノ
ールとはほとんど反応しない（実施例９表２）。

【００８２】本発明の抗体のメタノール耐性本発明の一態様であるモノクローナル抗体ＭＣＢ３−３
３はさらに、上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば０−約２０％の濃度のメタノール存在下においてミク
ロブタニルを濃度依存的に認識できる（実施例８、図
２）。ミクロブタニルは有機溶媒に易溶性であり、一般
に分析はメタノール等の有機溶媒中で行われることを考
慮すると、本発明のモノクローナル抗体のこのような特
性は非常に有効である。

【００８３】本発明の抗体の交差反応性上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法または間接競合阻害
ＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体の交
差反応性を調べることができる。ＭＣＢ３−３３は、例
えば直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において類縁化合物、例
えば、ヘキサコナゾール、ペンコナゾール、プロピコナ
ゾール、トリアジメノールとは１％以下しか交差反応し
ない。したがって、ＭＣＢ３−３３はミクロブタニルと
特異性が高い（実施例９表２）。

【００８４】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００８５】

【実施例】実施例１ミクロブタニル誘導体の合成

【化１５】

【００８６】７−（４−クロロフェニル）−７−シアノ
ヘプタン酸エチルエステル（１）の合成４−クロロフェニルアセトニトリル９．０ｇ（６０ｍｍ
ｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸エチルエステル１３．
２ｇ（６０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍｌに溶解
した。この溶液に３０ｍｌの水に溶解した水酸化ナトリ
ウム９．６ｇ（２４０ｍｍｏｌ）の溶液と０．３ｇの塩
化テトラブチルアンモニウムを加え、激しく撹拌しなが
ら還流下に６時間反応させた。反応混合物に１００ｍｌ
のジクロロメタンを加え、ジクロロメタン層を水洗い
後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃
縮した。残渣を真空蒸留に付し、１１．４ｇ（収率６５
％）の目的物を無色の油状物質として得た。沸点：２３０℃／７ｍｍＨｇ。

【００８７】８−ブロモ−７−（４−クロロフェニル）
−７−シアノオクタン酸エチルエステル（２）の合成Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌ中の６０％水素
化ナトリウム０．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）懸濁液に７−
（４−クロロフェニル）−７−シアノヘプタン酸エチル
エステル（１）５．３ｇ（１８ｍｍｏｌ）を加え、室温
で３０分間撹拌した。この溶液をＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド３０ｍｌ中のジブロモメタン６．３ｇ（３６ｍ
ｍｏｌ）にマイナス１０℃から０℃で加えた。室温下に
１時間撹拌後、この混合物に５ｍｌの水を注意深く加
え、トルエンで抽出した。トルエン層を水洗い後、無水
硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮した。
残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：
酢酸エチル＝５：１）で精製し、４．８ｇ（収率６９
％）の目的物を無色の油状物質として得た。

【００８８】７−（４−クロロフェニル）−７−シアノ
−８−（１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）オ
クタン酸エチルエステル（３）の合成Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌ中の６０％水素
化ナトリウム０．５５ｇ（１４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、
１Ｈ−１,２,４−トリアゾール１．０ｇ（１４ｍｍｏ
ｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。この溶液にジメ
チルホルムアミド２０ｍｌ中の８−ブロモ−７−（４−
クロロフェニル）−７−シアノオクタン酸エチルエステ
ル（２）４．２ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で
６時間撹拌した。反応混合物に５ｍｌの水を注意深く加
え、トルエンで抽出した。トルエン層を水洗い後、無水
硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮した。
残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メ
タノール＝２０：１）で精製し、２．６ｇ（収率６３
％）の目的物を油状物質として得た。

【００８９】７−（４−クロロフェニル）−７−シアノ
−８−（１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）オ
クタン酸（４）の合成エタノール３０ｍｌに７−（４−クロロフェニル）−７
−シアノ−８−（１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−
イル）オクタン酸エチルエステル（３）２．５ｇ
（６．６ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液に水１０ｍｌ
に溶かした水酸化ナトリウム１．０ｇ（２５ｍｍｏｌ）
の溶液を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃
縮し、残渣を４０ｍｌの水に溶解した。この水溶液に５
Ｎの塩酸を徐々に加えてｐＨ５．５にし、酢酸エチルで
抽出した。酢酸エチル層を水洗いし、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣を薄層クロマト
グラフィー（酢酸エチル：メタノール＝１０：１）で精
製し、１．５ｇ（６５％）の目的物を結晶として得た。融点；１１７−１１９℃¹ ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ）１．００（１Ｈ，ｍ）１．２８（３Ｈ，ｍ）１．４３（２Ｈ，ｍ）２．１２（４Ｈ，ｍ）４．８６（２Ｈ，ｑ）７．４３（２Ｈ，ｄ）７．４９（２Ｈ，ｄ）７．９３（１Ｈ，ｓ）８．２０（１Ｈ，ｓ）１１．９９（１Ｈ，ｓ）

【００９０】実施例２：ミクロブタニル誘導体と高分子
化合物との結合体の作製ミクロブタニル誘導体とＫＬＨまたはＢＳＡとの結合体
を以下のように活性化エステル法によって作製した。

【００９１】実施例１によって作製されたミクロブタニ
ル誘導体の３．５μｍｏｌをＤＭＳＯ５０μｌに溶解
した。次に、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド５μｍｏｌ
をＤＭＳＯ１０μｌに溶解したものを、前記ミクロブ
タニル誘導体を含む溶液に添加した。さらに１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩（４μｍｏｌ）をＤＭＳＯ２０μｌに溶解したも
のを添加した。室温にて１．５時間反応させた後、この
反応溶液に８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００
μｌに溶解したＫＬＨあるいはＢＳＡ１０ｍｇを、さら
に添加し、再び室温にて１．５時間反応させた。反応終
了後ダルベコのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（−）」
という）に対して透析し、ミクロブタニル誘導体−ＫＬ
Ｈ結合体、ミクロブタニル誘導体−ＢＳＡ結合体を各々
調製した。

【００９２】実施例３：免疫感作免疫は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で調製
したミクロブタニル誘導体−ＫＬＨ結合体１００μｇを
ＰＢＳ（−）５０μｌに溶解した。これを等量のフロイ
ント完全アジュバントと乳化混合した後、マウスの腹腔
内に接種した。１カ月後に初回免疫の１／４量を追加免
疫し、さらにその１０日後に追加免疫と同量を最終免疫
した。

【００９３】実施例４：モノクローナル抗体の作製細胞融合は、実施例３の最終免疫後３日目のマウスの脾
細胞を用いて行った。ステンレスメッシュで大きな固形
物を除去しながら、ＤＭＥＭ中に取り出した脾細胞をＤ
ＭＥＭにて３回洗浄した。次いで、マウスのミエローマ
細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞数の比で５：
１（脾細胞：ミエローマ細胞）になるように混合し、遠
心（１，２００ｒｐｍ、５分間）して細胞残渣を集め
た。この細胞残渣に予め３７℃に加温しておいた５０％
ポリエチレングリコール（分子量１,５００）１ｍｌを
加え、細胞を融合した。次いで、ＤＭＥＭ１０ｍｌを徐
々に添加し、ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」という）
１ｍｌを更に添加することにより、融合を停止した。Ｄ
ＭＥＭにて１回洗浄後、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥ
Ｍにヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を添加し
たＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウェルのポリスチレンプレ
ートに２×１０⁵細胞／ウェルで分注し、３７℃、５％
二酸化炭素存在下で１０日−１４日間培養した。培養
後、ウェル中の抗体活性の有無をそれぞれスクリーニン
グした。

【００９４】抗体活性は、実施例２で調製したミクロブ
タニル誘導体−ＢＳＡ結合体を用いたＥＬＩＳＡ法にて
測定した。まずＰＢＳ（−）に溶解したミクロブタニル
誘導体−ＢＳＡ結合体（４μｇ／ｍｌ）を９６ウェルの
マイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで添加
し、４℃で１晩静置することにより、固相化した。次に
３００μｌ／ウェルでブロッキング緩衝液［１％ＢＳＡ
と６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）］に置き換え、室温で１時間ブロッキン
グした。このウェルを洗浄液（６０ｍＭＮａＣｌを添
加したホウ酸緩衝液）で洗浄した後、ハイブリドーマの
培養上清を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反
応した。洗浄液で３回洗浄した後、第二抗体希釈液
［０．３％ＢＳＡと６０ｍＭＮａＣｌを添加した８５
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）］で１０００倍希釈し
たペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社
製）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応
した。洗浄液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基
質溶液［３,３'５,５'−テトラメチルベンチジン（１０
０μｇ／ｍｌ）、０.００６％過酸化水素を添加した
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）］で１０
分間発色し、１Ｎ硫酸で反応停止後４５０ｎｍの吸光度
を測定した。

【００９５】抗体活性を示したウェル中のハイブリドー
マは、限界希釈法によって細胞クローニングし、モノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択し
た。

【００９６】これらの結果、表１に示したとおり、ミク
ロブタニル誘導体−ＢＳＡ結合体に反応するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを４株（ＭＣＢ２−
２３、ＭＣＢ３−３３、ＭＣＢ７−１４、ＭＣＢ３１−
２）分離した。

【００９７】

【表１】

【００９８】これらのうちＭＣＢ３−３３を、平成９年
３月１２日に寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６１３０として
工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５茨城県
つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【００９９】実施例５：間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にお
ける各モノクローナル抗体のミクロブタニルとの反応性実施例４で得られた４株のハイブリドーマが産生するモ
ノクローナル抗体（以後モノクローナル抗体は、これら
を産生するハイブリドーマと同一名称を用いる）とミク
ロブタニルとの反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
って検討した。

【０１００】まず実施例４に示したＥＬＩＳＡ法と同様
に固相化し、ブロッキングしたマイクロタイタープレー
トへ、希釈液［１５０ｍＭＮａＣｌを添加した８５ｍＭ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］で適当な濃度に希釈した
ミクロブタニル溶液を５０μｌ／ウェルで加え、その後
直ちに、同じ希釈液で適当な濃度に希釈した抗体溶液を
５０μｌ／ウェルで加えて混合し、室温で１時間反応し
た。３回洗浄した後、実施例４に示したＥＬＩＳＡ法と
同様の方法で第二抗体と反応させ、発色後、４５０ｎｍ
の吸光度を測定した。得られた吸光度から以下の式：

【化１６】を用いて阻害率を算出し、各モノクローナル抗体のミク
ロブタニルに対する反応性を調べた。

【０１０１】結果は、図１に示すように、ＭＣＢ２−２
３が約０．８−５０ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＢ３−３３が約
０．４−６．３ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＢ７−１４が約１．６
−１２．５ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＢ３１−２が約０．８−１
２．５ｎｇ／ｍｌの測定範囲でミクロブタニルと反応し
た。従って、これらの抗体はすべてミクロブタニルと反
応し、中でもＭＣＢ３−３３が最も反応性の高いことが
明らかとなった。

【０１０２】実施例６：モノクローナル抗体の精製抗体精製は、ミクロブタニルと反応性の最も高かったＭ
ＣＢ３−３３について行った。まず、ハイブリドーマを
ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用い
て培養し、その培養上清に５０％飽和となるように硫安
を加え、４℃で１時間撹拌した。生じた沈殿物にＰＢＳ
（−）を加えて可溶化した後、ＰＢＳ（−）で透析し、
プロテインＧ（ファルマシア社製）カラムクロマトグラ
フィーによって精製した。回収率は、実施例４に記載し
たＥＬＩＳＡ法で確認した結果、ほぼ９５％だった。ま
た、純度もＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で、
少なくとも９０％以上であった。

【０１０３】実施例７：ミクロブタニル誘導体とＨＲＰ
との結合体の作製実施例２と同様の活性化エステル法により、実施例１で
作製したミクロブタニル誘導体とＨＲＰとの結合体を作
製した。

【０１０４】ミクロブタニル誘導体１．２５μｍｏｌを
ＤＭＳＯ５０μｌに溶解した。この溶液へＤＭＳＯに
溶解したＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（５．５μｍｏ
ｌ）３μｌ、および１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３．５μｍｏ
ｌ）７μｌを加え、室温にて１時間反応させた。この反
応液に１Ｍ炭酸水素ナトリウム４０μｌを加え、更にＨ
ＲＰ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを加えて混合
し、室温にて３時間反応した。得られた反応液を、ゲル
濾過カラム（セファデックスＧ−２５）に通して、ペル
オキシダーゼ画分を得て、ミクロブタニル誘導体−ＨＲ
Ｐ結合体とした。

【０１０５】実施例８：直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にお
けるモノクローナル抗体ＭＣＢ３−３３のミクロブタニ
ルとの反応性およびメタノール耐性実施例６で精製したモノクローナル抗体ＭＣＢ３−３３
を用いて、ミクロブタニルとの反応性を直接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法で検討した。直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法は、
以下の手順で実施した。

【０１０６】まず実施例６で精製したＭＣＢ３−３３を
４μｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．３）に溶解し、９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートに１００μｌ／ウェルで加えた後、４℃で１
晩静置することにより固相化した。つぎに３００μｌ／
ウェルでブロッキング緩衝液に置き換え、室温で１時間
ブロッキングした。一方、これとは別に最終濃度が０か
ら３０％となるようにメタノールを添加した希釈液で適
当な濃度に調整したミクロブタニルとミクロブタニル誘
導体−ＨＲＰ結合体を混合した。これらの混合液を先に
ブロッキングしたプレートに２００μｌ／ウェルで加え
た後、室温にて１時間反応した。洗浄液で５回洗浄した
後、実施例４に示したＥＬＩＳＡ法と同様の方法で発色
させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１０７】結果は、図２に示したように、メタノール
濃度にかかわらず、約０．２−１２ｎｇ／ｍｌの測定範
囲でミクロブタニルと反応し、２０％メタノールまで
は、ほぼ同じ測定感度でミクロブタニルを測定出来た。

【０１０８】実施例９：モノクローナル抗体ＭＣＢ３−
３３のミクロブタニル類縁化合物との交差反応性実施例８に示した条件のうち、競合反応時のメタノール
の最終濃度を０％としてＭＣＢ３−３３のミクロブタニ
ルや類縁化合物との交差反応性を調べた。結果は、化合
物未添加時の反応を５０％阻害する化合物の濃度を各々
ＩＣ₅₀値として、表２に示した。

【０１０９】

【表２】

【０１１０】表２から明らかなとおり、ＭＣＢ３−３３
を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡにおいて、その他の類
縁化合物とはほとんど反応しなかった。従って、ＭＣＢ
３−３３はミクロブタニルと特異的に反応することが明
らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の各モノクローナル抗体の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるミクロブタニルとの反応性
を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体ＭＣＢ３
−３３の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるミクロブタニ
ルとの反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＧ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者弘中孝史東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者山口優樹東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者別府佳紀東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式（１）：【化１】［式（１）中、ｎは１−１０の整数（但し、３を除く）
である］で表される構造を有する化合物。
【請求項２】以下の式（１）：【化２】［式（１）中、ｎは１−１０の整数である］で表される
構造を有する化合物と高分子化合物又は標識物質との結
合体。
【請求項３】以下の式（１）：【化３】［式（１）中、ｎは１−１０の整数である］で表される
構造を有する化合物と高分子化合物を結合させることに
より抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下
の式（２）：【化４】で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
造することを特徴とする、式（２）の化合物に反応性を
示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項４】請求項２に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式（２）の化合物と反応性を
示す抗体又はそのフラグメント。
【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】ＭＣＢ３−３３である、請求項４又は５に
記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６１３０で寄託
されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】請求項４ないし６のいずれか１項に記載の
抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とする、
式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。