JP3050820B2 - ビテルタノール及びその類縁化合物のハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、１−（ビフェニル
−４−イルオキシ）−３,３−ジメチル−１−（１−Ｈ
−１,２,４−トリアゾール−１−イル）ブタン−２−オ
ール（以下、本明細書中「ビテルタノール」と言う）及
びその類縁化合物（以下、「ビテルタノール類縁化合
物」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフ
ラグメントに関する。

【０００２】本発明は、さらに前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ビテルタノール類縁化合物は、以下の式
（５）または（６）：

【化１１】

【化１２】 ［式（５）または（６）中Ｌは、ハロゲン原子であり
（本明細書中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ
を意味する）；Ａは、以下の式：

【化１３】 からなる群より選択された基であり；そしてｍは１−４
の整数である］で表される構造を有する、一連の化合物
である。これらの化合物はトリアゾール系のエルゴステ
ロール生合成阻害剤（以下、「ＥＢＩ剤」と言う）に属
する。

【０００４】エルゴステロールは、藻菌類を除く多くの
糸状菌が体内で合成するステロール類の内の一つで、生
体膜のリン脂質の二重層の間に存在し、細胞膜の強度
や、透過性、各種の膜酵素の機能に重要な影響を与えて
いる。エルゴステロールは、生体内では、酢酸からメバ
ロン酸、スクワレンなどを経て合成されるが、この経路
のいずれかの反応を特異的に阻害する一連の化合物群を
ＥＢＩ剤と総称する。ＥＢＩ剤は、幅広い抗菌スペクト
ルと浸透性、治療性など優れた特性を有する。子のう菌
類、担子菌類、不完全菌類などに有効で、中でも各種作
物のうどんこ病に卓効を有することが特徴である。従来
の薬剤と比較すると低薬量で効力を発揮し、植物体内へ
速やかに浸透するため耐雨性もある。また、ミツバチな
ど訪花昆虫に対する毒性が低いので、果樹などの開花期
の散布が可能である。ＥＢＩ剤は化学構造から、トリア
ゾール系、イミダゾール系、ピリミジン系等に分けられ
る。本発明の化合物は、これらのうちトリアゾール系の
ＥＢＩ剤に属する（農薬ハンドブック 第２２４頁−第
２３０頁 １９９４年版 日本植物防疫協会）。

【０００５】本発明の代表的な化合物であるビテルタノ
ールは、以下の式（７）：

【化１４】 で表される。ビテルタノールは、果実・野菜などに用い
られ、りんごの黒星病に優れた効果を有する。同じくト
リアゾール系ＥＢＩ剤に属するトリアジメホンと類似し
た化合物であるが、脂溶性が高い分浸透移行性が低くな
っており、移行性がほとんど見られない。予防効果及び
治療効果を有し、残効性もある。土壌中で速やかに分解
する（農薬ハンドブック 同上、「最新農薬の残留分析
法」 農薬残留分析法研究班編集 中央法規出版）。

【０００６】また、１−（４−クロロフェノオキシ）−
３,３−ジメチル−１−（１−Ｈ−１,２,４−トリアゾ
ール−１−イル）ブタン−２−オール（以下、「トリア
ジメノール」と言う）、１−（２,４−ジクロロフェニ
ル）−４,４−ジメチル−２−（１−Ｈ−１,２,４−ト
リアゾール−１−イル）ペンタン−３−オール（以下、
「ジクロブトラゾル」と言う）、１−（２,４−ジクロ
ロフェニル）−４,４−ジメチル−２−（１−Ｈ−１,
２,４−トリアゾール−１−イル）−１−ペンテン−３
−オール（以下、「ジニコナゾール」と言う）等も本発
明のビテルタノール類縁化合物に含まれる。

【０００７】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。例えば、前出のビテルタノールについては、食品衛
生法に基づき残留基準値が大麦・トウモロコシ・そばで
０.０５ｐｐｍ、小麦・ライ麦・その他の穀類及び落花
生で０.１ｐｐｍ、その他の豆類で０.２ｐｐｍ、バナナ
で０.５ｐｐｍ、その他の果実・野菜で０.３−３.０ｐ
ｐｍと定められている（残留農薬基準便覧 厚生省生活
衛生局食品化学課監修 第１７５頁−第１７７頁 社団
法人 日本食品衛生協会）。環境や食品に関する安全確
保のためには、これらに含有される、ビテルタノールを
始めとするビテルタノール類縁化合物の量を迅速、かつ
正確に測定することが必要である。

【０００８】従来、ビテルタノール類縁化合物は、果
実、野菜、穀類等の試料から抽出し、精製した後、ガス
クロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。例
えば、ビテルタノールの場合、試料をアセトンで抽出し
て、酢酸エチルに転溶した後、カラムクロマトグラフィ
ーで溶出し、さらにＧＣで分析する方法が採用されてい
る。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手間と
時間を必要とし、分析に熟練を有すること、並びに、測
定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点が
ある。ビテルタノール類縁化合物の測定は、特に輸入農
産物等の残留農薬の分析においては、短時間で膨大な数
の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでな
く、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方
法が要求されてきている。

【０００９】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。

【００１０】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of e
nzyme immunoassays" in Laboratory techniques in bi
ochemistry and molecular biology, Elsevier Amsterd
am New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) に記
載されている。

【００１１】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、ビテルタノール類縁化合物
のような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応
答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性
を有する高分子化合物に結合させることによって初めて
一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下
で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球によ
り抗体が産生される。このように高分子化合物と結合さ
せて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテ
ン」と言う。

【００１２】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なけらばならない。

【００１３】ビテルタノール類縁化合物についてはその
必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体は
もとより、抗体を作製するためのハプテンも本発明前に
は得られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ビテルタノ
ール類縁化合物に特異的に反応する新規な抗体を作製す
るための抗原を構成するハプテン化合物となる、当該化
合物の誘導体を提供することを目的とする。

【００１５】本発明は、また、ビテルタノール類縁化合
物誘導体と高分子化合物との結合体を提供することを目
的とする。当該結合体はビテルタノール類縁化合物に特
異的に反応する抗体を作製するための抗原となる。

【００１６】本発明は、さらに、ビテルタノール類縁化
合物に反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本
明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結
合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１７】本発明はその一態様において、前記化合物
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１８】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１９】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、ビテルタノール類縁化合物の免疫学的測定方
法を提供することを目的とする。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ビテルタノール類縁化合物にスペーサー
アーム及び高分子との結合に利用できる官能基を導入し
た、ビテルタノール類縁化合物の誘導体をハプテンとし
て使用することにより、前記化合物に特異的な抗体を得
ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００２１】本発明の対象となるビテルタノール類縁化
合物は、以下の式（５）または（６）：

【化１５】

【化１６】 ［式（５）または（６）中Ｌは、ハロゲン原子であり；
Ａは、以下の式：

【化１７】 からなる群より選択された基であり；そしてｍは１−４
の整数である］で表される一連の化合物である。

【００２２】抗体作製のためのハプテンとして使用され
る誘導体は、前記ビテルタノール類縁化合物の

【化１８】 の部分を

【化１９】 ［式中、Ｒはカルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシ
ル基、アミノ基又はメルカプト基であり；ｎは１−１０
の整数であり、好ましくは３−５の整数であり；そして
Ｘは、以下の式：

【化２０】 からなる群より選択された基であるか、あるいは直接結
合である］に変化させたものである。即ち、本発明のビ
テルタノール類縁化合物誘導体は、以下の式（１）また
は（２）

【化２１】

【化２２】 ［式（１）または（２）中、Ｒ、Ｘ、Ｌ、Ａ、ｎ及びｍ
は先に定義した通りである］で表される構造を有する化
合物である。

【００２３】あるいは、式（５）または（６）の化合物
の

【化２３】 の部分を

【化２４】 ［式中、Ｒはカルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシ
ル基、アミノ基又はメルカプト基であり；そしてｎは１
−１０の整数であり、好ましくは３−５の整数である］
に変化させてもよい。即ち、本発明の誘導体は式（３）
または（４）

【化２５】

【化２６】 ［式（３）または（４）中、Ｒ、Ｌ、Ａ、ｎ及びｍは先
に定義した通りである］で表される構造を有する化合物
も含む。

【００２４】本発明において、化合物の立体異性体は特
に特に限定されず全ての立体異性体を含む。

【００２５】限定するわけではないが、本発明の対象と
なる好ましい化合物は、式（１）−（４）中、Ｒがカル
ボキシル基であり、Ｘが−Ｏ−であり、そしてＡは以下
の式：

【化２７】 で示されるものである。特に好ましくはビテルタノー
ル、トリアジメノール、ジクロブトラゾル、またはジニ
コナゾールの誘導体である。最も好ましい化合物はビテ
ルタノールの誘導体である。

【００２６】本発明のビテルタノール類縁化合物にスペ
ーサーアーム及び結合に利用できる官能基を結合させた
誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させ
たものを抗原として用いることによって、ビテルタノー
ル類縁化合物に特異的な抗体を得ることができる。

【００２７】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、ビテルタノール類縁
化合物に反応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハ
プテン化合物または該抗体を用いるビテルタノール類縁
化合物の免疫学的測定方法に関する。

【００２８】ビテルタノール類縁化合物の誘導体の作製 式（１）ないし（４）で表されるビテルタノール類縁化
合物誘導体は、公知の方法に従って作製することができ
る。例えば以下に記載するI−IVのような方法がある。

【００２９】I Ａが

【化２８】 である式（２）の化合物は、例えば以下のように作製す
ることができる。

【００３０】I−１ Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または−ＮＨＣＯ−の場
合 I−１−１ Ｒが−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場合 以下の式（Ｚ１）

【化２９】 ［式中、Ｘ’は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または−ＮＨ
ＣＯ−を表し、Ｌ及びｍは式（１）−（４）で定義した
通りである］で表される化合物を、メタノール、エタノ
ール、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチ
ルホルムアミド等の溶媒中、炭酸ナトリウム、水酸化カ
リウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等の塩基
の存在下、以下の式（Ｚ２）：

【化３０】 ［式中、Ｌはハロゲン原子である］の化合物と反応させ
ることにより、式（Ｚ３）：

【化３１】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。反応は、０℃−溶媒の沸点
の温度、好ましくは１５℃−１２０℃で、５分−２０時
間、好ましくは１−５時間行う。

【００３１】式（Ｚ３）の化合物を精製後、トルエン、
ベンゼン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、
四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、
ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニ
トリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド等の不活性溶媒中、炭酸水素ナトリウム、
炭酸水素カリウム等の無機塩基、トリエチルアミン、ピ
リジン、ジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存
在下に、式（Ｚ４）：

【化３２】 ［式中、Ｐはアルキル基、アルコキシ基またはベンジル
オキシ基であり、Ｌは先に定義した通りである］で表さ
れる化合物と反応させ、式（Ｚ５）：

【化３３】 ［式中、Ｐ、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応は、０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分
−１０時間、好ましくは１−５時間行う。

【００３２】尚、式（Ｚ５）の化合物は、式（Ｚ１）の
化合物を式（Ｚ４）の化合物と反応させ、以下の式：

【化３４】 ［式中、Ｐ、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を得て、さらに式（Ｚ２）の化合
物と反応させることによっても合成することができる。

【００３３】式（Ｚ５）の化合物を精製後、四塩化炭
素、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、
クロロホルム、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセ
トニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド等の不活性溶媒中、塩化スルフリル、
臭素等のハロゲン化剤を加えて反応させる。反応は、０
℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃
で、５分−２０時間、好ましくは１−５時間行う。次
に、このハロゲン化合物に、特公昭５５−５０９４７号
に記載された方法に準じて、１Ｈ−１,２,４−トリアゾ
ール、及び炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの塩基を
加えて反応させ、式（Ｚ６）：

【化３５】 ［式中、Ｐ、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応は、０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分
−１０時間、好ましくは１−５時間行う。

【００３４】式（Ｚ６）の化合物を精製後、アルカリ加
水分解などで加水分解することにより式（Ｚ７）：

【化３６】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。なお、式（Ｚ６）の化合物
を合成する際、式（Ｚ７）の化合物が同時に生成する場
合がある。

【００３５】式（Ｚ７）の化合物を、メタノール、エタ
ノール、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロ
ホルム、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメ
チルホルムアミド等の溶媒中、炭酸ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等の塩
基の存在下、以下の式：

【化３７】 ［式中、Ｐ'は、Ｒの保護基であり；Ｒ'は、−ＯＣ(Ｏ)
−、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−であり；ｎは、１−
１０の整数であり；そしてＬは先に定義した通りであ
る］で表される化合物と反応させ、式（Ｚ８）

【化３８】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｘ'、Ｌ、ｎ及びｍは先に定義した
通りである］で表される化合物を合成する。反応は、０
℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃
で、５分−１０時間、好ましくは１−５時間行う。

【００３６】Ｐ'で示される保護基は公知のものでよ
く、具体例として、Ｒ'が−ＯＣ(Ｏ)−の場合には、例
えば、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベン
ジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリクロロエチル
基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシ
リル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエ
チルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチル
シリルエトキシメチル基等を挙げることができる。ま
た、Ｒ'が、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−の場合に
は、例えば、以下の式：

【化３９】 ［式中、Ｐは先に定義した通りである］を挙げることが
できる。

【００３７】式（Ｚ８）の化合物を精製後、例えばメタ
ノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、
ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸
エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、酢酸及び水等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、
水素化リチウムアルミニウム等の還元剤を用いて、式
（Ｚ９）：

【化４０】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｘ'、Ｌ、ｎ及びｍは先に定義した
通りである］で表される化合物を合成する。反応は−８
０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃
で、５分から１０時間、好ましくは１−５時間行う。

【００３８】最後に、式（Ｚ９）の化合物からＰ'で表
される保護基を除去することにより、式（１）の化合物
を製造できる。保護基の除去は、酸加水分解、アルカリ
加水分解等の公知の方法で行うことができる。

【００３９】例えば、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｚ９）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒、又はこれらの有機溶媒と水との混合溶媒に水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムまたは炭
酸カリウム等を加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から１００℃で、１−２時間撹拌反応させ
ることにより式（Ｚ１０）：

【化４１】 ［式中、Ｒ”は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−
ＳＨであり；そして、Ｘ'、Ｌ、ｎ及びｍは先に定義し
た通りである］で表される化合物を合成することができ
る。

【００４０】また、該保護基がｔｅｒｔ−ブチル基であ
る場合は、式（Ｚ９）の化合物を含む有機溶媒に酸触媒
を加えて、好ましくは撹拌下で反応させることにより行
われる。有機溶媒としては、例えば、ベンゼン等の芳香
族炭化水素類、ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタ
ン等のハロゲン化炭化水素類、又はこれらの混合溶媒等
を使用できる。酸触媒としては公知のもの、例えばトリ
フルオロ酢酸等のカルボン酸、ｐ−トルエンスルホン酸
等のスルホン酸、塩酸、硝酸等の鉱酸などが使用できる
が、その中でもトリフルオロ酢酸が好ましい。反応温度
は、通常０℃−１００℃程度、好ましくは室温がよく、
反応時間は通常０.５−３時間程度とすればよい。

【００４１】更に、ベンジル基の除去は水素による接触
還元反応によっても行うことができる。

【００４２】また、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、
トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリ
メチルシリルエトキシメチル基は、フッ化水素、テトラ
ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリ
ド等のフッ素イオンを発生させる試薬により特異的に除
去することもできる。

【００４３】I−１−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ８）の化合物から式（Ｚ９）の化合物を合成する
場合と同様の反応操作を用い、式（Ｚ６）の化合物を還
元することにより、以下の式（Ｚ１１）：

【化４２】 ［式中、Ｐ、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。

【００４４】この式（Ｚ１１）の化合物をアルカリ加水
分解などで加水分解することにより式（Ｚ１２）：

【化４３】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。

【００４５】式（Ｚ１２）の化合物に、以下の式：

【化４４】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物を、式（Ｚ７）の化合物から式（Ｚ８）の化合
物を合成する場合と同様の操作で反応させることによ
り、式（Ｚ１３）：

【化４５】 ［式中、Ｘ'、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００４６】I−２ Ｘが−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−の場合 I−２−１ Ｒが−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場合 式（Ｚ７）の化合物の中で、Ｘ'が−Ｏ−、−ＮＨ−の
化合物に、以下の式：

【化４６】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ及びｎは、先に定義した通りであ
る］で表される化合物を式（Ｚ５）の化合物を合成する
場合と同様の反応条件で反応させることにより式（Ｚ１
４）：

【化４７】 ［式中、Ｘ”は−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−であり；
そして、Ｐ'、Ｒ'、ｍ及びｎは、先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００４７】次に式（Ｚ１４）の化合物を、式（Ｚ９）
を合成する場合と同様の反応条件で還元し、さらに式
（Ｚ１０）を得る場合と同様の反応条件で保護基のＰ'
を除去することにより、式（Ｚ１５）：

【化４８】 ［式中、Ｒ”、Ｘ”、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通り
である］で表される化合物を合成することができる。

【００４８】Ｉ−２−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ１２）の化合物の中で、Ｘ'が−Ｏ−、−ＮＨ−
の化合物と、以下の式：

【化４９】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物から、式（Ｚ３）の化合物から式（Ｚ５）の化
合物を合成する場合と同様の反応操作で、式（Ｚ１
６）：

【化５０】 ［式中、Ｘ”、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００４９】II Ａが

【化５１】 である式（２）の化合物は、例えば以下のように作製す
ることができる。

【００５０】II−１ Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または−ＮＨＣＯ−の場
合 II−１−１ Ｒが−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場合 以下の式（Ｘ１７）：

【化５２】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
クロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、
メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の不活性
溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の無
機塩基、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピル
エチルアミン等の有機塩基の存在下に、以下の式（Ｚ
４）：

【化５３】 ［式中、Ｐ及びＬは先に定義した通りである］で表され
る化合物と反応させ、式（Ｚ１８）：

【化５４】 ［式中、Ｐ、Ｘ'，Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応は０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分か
ら１０時間、好ましくは１−５時間行う。

【００５１】式（Ｚ１８）の化合物を精製後、四塩化炭
素、ベンゼン、シクロヘキサン等の不活性溶媒中、過酸
化ベンゾイル、アゾビスブチロニトリル等のラジカル開
始剤の存在下、塩化スルフリル、臭素、Ｎ−ブロモこは
く酸イミド等のハロゲン化剤を反応させ、式（Ｚ１
９）：

【化５５】 ［式中、Ｌ'はハロゲン原子であり；そして、Ｐ、Ｘ'，
Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で表される化合物
を合成する。反応は０℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは室温から１００℃で、５分から２０時間、好ましく
は１−５時間行う。

【００５２】式（Ｚ１９）の化合物を精製後、特開昭５
３−２８１７０号公報に記載されたα−１Ｈ−１,２,４
−トリアゾール−１−イル−ピナコロンと同公報に記載
された合成方法と同様の操作で反応させ、式（Ｚ２
０）：

【化５６】 ［式中、Ｐ、Ｘ'，Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。反応は０℃から溶媒
の沸点の温度、好ましくは室温から１００℃で、５分か
ら１０時間、好ましくは１−５時間行う。

【００５３】式（Ｚ２０）の化合物を精製後、アルカリ
加水分解などで加水分解することにより、式（Ｚ２
１）：

【化５７】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。

【００５４】式（Ｚ２１）の化合物を精製後、式（Ｚ
７）から式（Ｚ１０）の合成法と同様の操作で式（Ｚ２
２）：

【化５８】 ［式中、Ｒ”は−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−
ＳＨであり；そして、Ｘ'、ｎ及びｍは先に定義した通
りである］で表される化合物を合成することができる。

【００５５】II−１−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ８）の化合物から式（Ｚ９）を合成する場合と同
様の反応操作で、式（Ｚ２０）の化合物を還元すること
により、以下の式（Ｚ２３）：

【化５９】 ［式中、Ｐ、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。

【００５６】この式（Ｚ２３）の化合物を、アルカリ加
水分解などで加水分解することにより、以下の式（Ｚ２
４）：

【化６０】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。

【００５７】この式（Ｚ２４）の化合物に以下の式：

【化６１】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物を、式（Ｚ７）の化合物から式（Ｚ８）の化合
物を合成する場合と同様の操作で反応させることによ
り、式（Ｚ２５）：

【化６２】 ［式中、Ｘ'、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００５８】II−２ Ｘが−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−の場合 II−２−１ Ｒが−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場合 式（Ｚ２１）の化合物の中で、Ｘ'が−Ｏ−または−Ｎ
Ｈ−の化合物に以下の式：

【化６３】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を、式（Ｚ３）の化合物から式
（Ｚ５）の化合物を合成する場合と同様の反応条件で反
応させることにより式（Ｚ２６）：

【化６４】 ［式中、Ｘ”は−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、
そして、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りで
ある］で表される化合物を合成することができる。

【００５９】式（Ｚ２６）の化合物を精製後、式（Ｚ
８）の化合物から式（Ｚ１０）の化合物の合成と同様の
操作で、式（Ｚ２７）：

【化６５】 ［式中、Ｒ”、Ｘ”、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通り
である］で表される化合物を合成することができる。

【００６０】II−２−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ２４）の化合物の中で、Ｘ'が−Ｏ−または−Ｎ
Ｈ−の化合物に、以下の式：

【化６６】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物を、式（Ｚ３）の化合物から式（Ｚ５）の化合
物を合成する場合と同様の反応操作で反応させることに
より、式（Ｚ２８）：

【化６７】 ［式中、Ｘ”、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００６１】III Ａが

【化６８】 である式（２）の化合物は、例えば以下のように作製す
ることができる。

【００６２】III−１ Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または−ＮＨＣＯ−の場
合 III−１−１ Ｒが−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場合 以下の式（Ｚ２９）：

【化６９】 ［式中、Ｘ'及びＬは先に定義した通りである］で表さ
れる化合物を、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロ
ロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチ
ルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の不活性溶媒
中、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の無機塩
基、トリエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチ
ルアミン等の有機塩基の存在下に、以下の式（Ｚ４）：

【化７０】 ［式中、Ｐ及びＬは先に定義した通りである］で表され
る化合物と反応させ、式（Ｚ３０）：

【化７１】 ［式中、Ｐ、Ｘ'，Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。

【００６３】次に式（Ｚ３０）の化合物を精製後、特開
昭５３−２８１７０号公報に記載されたα−１Ｈ−１,
２,４−トリアゾール−１−イル−ピナコロンと特開昭
５３−１３０６６１号公報に記載された合成方法と同様
の操作で反応させ、式（Ｚ３１）：

【化７２】 ［式中、Ｐ、Ｘ'，Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。

【００６４】式（Ｚ３１）の化合物を精製後、アルカリ
加水分解などで加水分解することにより、式（Ｚ３
２）：

【化７３】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。

【００６５】式（Ｚ３２）の化合物を、以下の式：

【化７４】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物と、式（Ｚ７）から式（Ｚ８）を
合成する場合と同様の操作で反応させ、式（Ｚ３３）：

【化７５】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｘ'、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した
通りである］で表される化合物を合成する。

【００６６】式（Ｚ３３）の化合物を、例えば、特開昭
５５−１２４７７１号に記載された方法で還元し、式
（Ｚ３４）：

【化７６】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ、Ｘ'、ｍ及びｎは先に定義した
通りである］で表される化合物を合成する。

【００６７】この式（Ｚ３４）の化合物から、式（Ｚ
９）から式（Ｚ１０）の合成法と同様の操作で保護基の
Ｐ'を除去し、式（Ｚ３５）：

【化７７】 ［式中、Ｒ”は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または
−ＳＨであり；そして、Ｌ、Ｘ'、ｍ及びｎは先に定義
した通りである］で表される化合物を合成することがで
きる。

【００６８】III−１−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ３１）の化合物を、例えば特開昭５５−１２４７
７１号に記載された方法で還元し、以下の式（Ｚ３
６）：

【化７８】 ［式中、Ｐ、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成する。

【００６９】この式（Ｚ３６）の化合物を、アルカリ加
水分解などで加水分解することにより、以下の式（Ｚ３
７）：

【化７９】 ［式中、Ｘ'、Ｌ及びｍは先に定義した通りである］で
表される化合物を合成する。

【００７０】この式（Ｚ３７）の化合物に以下の式：

【化８０】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物を、式（Ｚ７）の化合物から式（Ｚ８）の化合
物を合成する場合と同様の操作で反応させることによ
り、式（Ｚ３８）：

【化８１】 ［式中、Ｘ'、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００７１】III−２ Ｘが−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−の場合 III−２−１ Ｒが−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場合 式（Ｚ３２）の化合物の中で、Ｘ'が−Ｏ−または−Ｎ
Ｈ−の化合物に以下の式：

【化８２】 ［式中、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を、式（Ｚ５）の化合物を合成す
る場合と同様の反応条件で反応させることにより式（Ｚ
３９）：

【化８３】 ［式中、Ｘ”は−ＣＯＯ−または−ＣＯＮＨ−であり、
そして、Ｐ'、Ｒ'、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りで
ある］で表される化合物を合成することができる。

【００７２】式（Ｚ３９）の化合物を、式（Ｚ３３）の
化合物から式（Ｚ３５）の化合物を合成する場合と同様
の操作で反応させることにより、式（Ｚ４０）：

【化８４】 ［式中、Ｘ"、Ｒ"、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りで
ある］で表される化合物を合成することができる。

【００７３】III−２−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ３７）の化合物の中で、Ｘ'が−Ｏ−または−Ｎ
Ｈ−の化合物に、以下の式：

【化８５】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物を、式（Ｚ３）の化合物から式（Ｚ５）の化合
物を合成する場合と同様の反応操作で反応させることに
より、式（Ｚ４１）：

【化８６】 ［式中、Ｘ"、Ｌ、ｍ及びｎは先に定義した通りであ
る］で表される化合物を合成することができる。

【００７４】式（１）の化合物も式（２）の化合物と同
様の方法により合成することができる。

【００７５】ＩＶ 式（４）の化合物は、例えば以下のように合成すること
ができる。

【００７６】ＩＶ−１ Ｒが、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂または−ＳＨの場
合 式（Ｚ４２）：

【化８７】 ［式中、Ｌ、Ａ及びｍは先に定義した通りである］で表
される化合物を、例えばジエチルエーテル、ジブチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１,２−ジ
メトキシエタンまたはその１８−クラウン−６−エーテ
ルもしくはベンゾ−１８−クラウン−６−エーテルとの
混合物、あるいはジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピ
ロリドン等の溶媒中、水素化ナトリウム、水素化リチウ
ム、ブチルリチウム、メチルマグネシウムクロリド、メ
チルマグネシウムブロミド、ナトリウムメトキシド等の
塩基の存在下、以下の式：

【化８８】 ［式中、Ｐ'はＲの保護基であり；Ｒ'は−ＣＯＯ−、−
Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−であり；そしてＬ及びｎは
先に定義した通りである］で表される化合物と反応さ
せ、式（Ｚ４３）：

【化８９】 ［式中、Ａ、Ｌ、Ｐ'、Ｒ'、ｎ及びｍは先に定義した通
りである］で表される化合物を得る。反応は−８０℃か
ら溶媒の沸点の温度、好ましくは０℃−６０℃で、５分
−２０時間、好ましくは１−１５時間行う。

【００７７】次に、式（Ｚ４３）の化合物からＰ'で表
される保護基を除去することにより、式（Ｚ４４）：

【化９０】 ［式中、Ａ、Ｌ、Ｒ”、ｎ及びｍは先に定義した通りで
ある］で表される化合物を製造できる。保護基の除去
は、製造方法Ｉ−ＩＩＩにおいて記載したのと同様の方
法で行うことができる、ＩＶ−２ Ｒが−ＣＨＯの場合 式（Ｚ４２）の化合物に、以下の式：

【化９１】 ［式中、Ｌ及びｎは先に定義した通りである］で表され
る化合物を、式（Ｚ４２）の化合物から式（Ｚ４３）の
化合物を合成する場合と同様の反応操作で反応させるこ
とにより、式（Ｚ４５）：

【化９２】 ［式中、Ａ、Ｌ、ｎ及びｍは先に定義した通りである］
で表される化合物を合成することができる。

【００７８】式（３）の化合物も式（４）の化合物と同
様の方法により合成することができる。

【００７９】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶
操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とする
ことができる。

【００８０】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００８１】ビテルタノール類縁化合物誘導体と高分子
化合物との結合体の作製 上述のように合成されたビテルタノール類縁化合物誘導
体を適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原と
して使用する。

【００８２】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。

【００８３】ビテルタノール類縁化合物誘導体と高分子
化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（B.F.Erla
nger et al.:J.Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)）、
または活性化エステル法（A.E. KARU et al.:J. Agric.
Food Chem. 42 301-309 (1994)）等の公知の方法によ
って行うことができる。

【００８４】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基
性化合物としては例えば、Ｎ−メチルモルホリン、トリ
エチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、Ｎ,Ｎ−
ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有
機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリ
ウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられ
る。該反応は、通常マイナス２０℃−１００℃、好まし
くは０℃−５０℃において行われ、反応時間は５分−１
０時間、好ましくは５分−２時間である。得られた混合
酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０
℃−１５０℃、好ましくは０℃−１００℃において行わ
れ、反応時間は５分−１０時間、好ましくは５分−５時
間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。
溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれ
の溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジク
ロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸イソブチル、クロロ蟻酸メチル、
ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００８５】一方活性化エステル法は、一般に以下のよ
うに行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶
媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキ
シこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸
イミドエステルを生成する。

【００８６】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ
−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：
１０−１０：１、より好ましくは、１：１−１：１０、
最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃−１０
０℃、好ましくは５℃−５０℃、より好ましくは２２℃
−２７℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３
０分−６時間、より好ましくは１−２時間である。反応
温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができ
る。

【００８７】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０℃−６０℃、
好ましくは５℃−４０℃、より好ましくは２２℃−２７
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは１−１６
時間、より好ましくは１−２時間である。反応物を、透
析、脱塩カラム等によって精製して、ビテルタノール類
縁化合物誘導体と高分子化合物との結合体を得ることが
できる。

【００８８】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をビテルタノール類縁化合物誘導体に結合させ
たものを、免疫測定法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以
下、「ＨＲＰ」と言う）やアルカリフォスファターゼ等
の酵素、フルオレセインイソチオシアネートやローダミ
ン等の発色物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質などがあ
る。

【００８９】ポリクローナル抗体の作製 ビテルタノール類縁化合物誘導体と高分子化合物との結
合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリ
クローナル抗体を作製することができる。例えば、ビテ
ルタノール類縁化合物誘導体−ＫＬＨ結合体をリン酸緩
衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント
完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいは
ミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原と
して動物に免疫することによって行う。免疫される動物
としては当該分野で常用されるものをいずれも使用でき
るが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等
を挙げることができる。

【００９０】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。投与は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で複数回行うことができる。

【００９１】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、ビテルタノール類縁化合物と反応
するポリクローナル抗体の存在を評価することができ
る。

【００９２】本発明のビテルタノール類縁化合物誘導体
と高分子化合物との結合体により免疫感作させたマウス
の抗血清は、後述する間接競合ＥＬＩＳＡ法において、
ビテルタノールの量を０.００１−１００μｇ／ｍｌ、
好ましくは０.０１−１０μｇ／ｍｌの範囲で測定でき
る（実施例５、図１）。

【００９３】モノクローナル抗体の作製 ビテルタノール類縁化合物誘導体と高分子化合物との結
合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクロー
ナル抗体を作製することができる。

【００９４】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００９５】（ａ）免疫用抗原として使用するビテルタ
ノール類縁化合物誘導体と高分子化合物との結合体の作
製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養または動物へのハイブリド
ーマの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等

【００９６】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００９７】以下、上述の本発明のビテルタノール類縁
化合物−ジメチル−１−（１−Ｈ−１,２,４−トリアゾ
ール−１−イル）ブタン−２−オール類に対するモノク
ローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限され
ないことは当業者によって明らかであろう。

【００９８】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００９９】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液またはこれらの組み合わせから得ることができる
が脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【０１００】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Natur
e，25 6, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ
１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Microbiology and
Immunology, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519
(1976)）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Natu
re 276, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno.Meth., 3
5, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ
１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ３）（Nature 277, 1
31-133, (1979)）等を使用できる。

【０１０１】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ
改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当
日に１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【０１０２】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルシュタイン（Milstein）らの方法（Methods in
Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うことがで
きる。現在最も一般的に行われているのは、融合作業も
簡単なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法
である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、
山下修二ら（上述）に記載されている。その他の融合方
法としては、電気処理（電気融合）による方法等を適宜
採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．
１３１５−１９、１９８７）。また、細胞の使用比率も
公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対し
て脾細胞を３−１０倍程度用いればよい。脾細胞とミエ
ローマ細胞とが融合し、抗体産生能及び増殖能を獲得し
たハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞
株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭ
ＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行う
ことができる。

【０１０３】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、ビテルタノール類縁化合物に対する
抗体活性を測定する。さらに、測定によりビテルタノー
ル類縁化合物に反応する抗体を産生することが判明した
ハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞ク
ローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個
のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界
希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マ
イクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す
方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソ
ータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単
でありよく用いられる。

【０１０４】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法により細胞クローニングを１−４回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗ビテルタノー
ル類縁化合物モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

【０１０５】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度中の恒
温器中）で培養するのが好ましい。

【０１０６】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。または、同系統のマウス（例えば、上述のＢａ
ｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブ
リドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも
可能である。

【０１０７】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗ビテルタノール類縁化合物モノクローナル抗
体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アン
モニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗
体画分を集め精製することにより抗ビテルタノール類縁
化合物モノクローナル抗体を得ることができる。さらに
精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、オープン
カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を使用して抗
体画分を集める操作を１回、または複数回行うことによ
り実施できる。

【０１０８】以上のようにして得られた抗ビテルタノー
ル類縁化合物モノクローナル抗体は、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、
抗体価等を決定することができる。

【０１０９】抗体によるビテルタノール類縁化合物の測
定 本発明で使用する抗体によるビテルタノール類縁化合物
の測定方法としては、放射性同位元素免疫測定方法（Ｒ
ＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth. Ensymol.,
70, 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、ス
ポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏ
ｎｙ）法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の
方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株
式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭
和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観
点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【０１１０】ビテルタノール類縁化合物の測定は各種Ｅ
ＬＩＳＡ法のうち、例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に
より、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）まず、抗原であるビテルタノール類縁化合物誘導
体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係
な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）
これに各種濃度のビテルタノール類縁化合物を含む試料
及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び遊離ビテ
ルタノール類縁化合物に競合的に反応させて、固相化抗
原−抗体複合体及び遊離ビテルタノール類縁化合物−抗
体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体
の量を測定することにより、予め作成した検量線から試
料中の遊離ビテルタノール類縁化合物の量を決定するこ
とができる。

【０１１１】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【０１１２】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えばリン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗
原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１−
１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.０５−１０μｇ
／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマ
イクロタイタープレートを使用する場合には、３００μ
ｌ／ウェル以下で５０−１５０μｌ／ウェル程度が望ま
しい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限は
ないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適し
ている。

【０１１３】（ｂ）工程のブロッキングは、ビテルタノ
ール類縁化合物誘導体と高分子化合物との結合体を固相
化した担体において、ビテルタノール類縁化合物誘導体
部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在
する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。
ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク
溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌ
ｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−
２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているもの
を使用することもできる。具体的には、限定されるわけ
ではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロッキ
ング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ
ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８.
０）］を適量加え、約４℃で、一晩インキュベーション
した後、緩衝液で洗浄することにより行われる。洗浄液
としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳが適してい
る。

【０１１４】次いで（ｃ）工程において、ビテルタノー
ル類縁化合物を含む試料と抗体を固相化抗原と接触さ
せ、抗体を固相化抗原及び遊離ビテルタノール類縁化合
物と反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及
び遊離ビテルタノール類縁化合物−抗体複合体が生成す
る。

【０１１５】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のビテルタノール類縁化合物に対する抗体を加
え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に
対する抗体を順次加えて反応させる。

【０１１６】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、
ＰＢＳが好ましい。

【０１１７】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼ等）を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるの
が適当である。担体に結合した第一抗体に最終吸光度が
４以下で、好ましくは０．５−３.０となるように希釈
した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝
液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で
約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応
により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識し
た第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要
である。

【０１１８】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からビテルタノール類縁
化合物の量を算出することができる。

【０１１９】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば発色基質として過酸
化水素、オルトフェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」
と言う）を使用する。限定されるわけではないが、発色
基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの
硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。ＯＰＤ
を使用する場合、４９０ｎｍの吸光度を測定する。一
方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファタ
ーゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵
素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が
適している。

【０１２０】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のモノクローナル抗体６Ｄ１６−６−１は、
ビテルタノールを０.０００１−１０μＭ、好ましくは
０.００１−１μＭの範囲で測定できる。６Ｄ１６−６
−１はさらに、トリアジメノール（０.０１−１０μ
Ｍ）、ジクロブトラゾル（１−１００μＭ）及びトリア
ジメホン（１０−１００μＭ）等のビテルタノール以外
のトリアゾール系化合物に対してもより低い感度で反応
する（実施例７（１）、図２）。また、本発明の別のモ
ノクローナル抗体７Ｃ１−１−１は、ビテルタノールを
０.００１−１００μＭ、好ましくは０.０１−１０μＭ
の範囲で測定できる（実施例７（２）、図３）。モノク
ローナル抗体７Ｃ１−１−１は、ビテルタノールに特異
的に反応し、他のトリアゾール系化合物とはほとんど反
応しなかった。

【０１２１】あるいは、ビテルタノール類縁化合物の測
定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナ
ル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行う
こともできる。

【０１２２】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のビテルタノール類
縁化合物を含む試料に、ビテルタノール類縁化合物誘導
体と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物
を調製する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のビテルタノール類縁化合物の量を決定する。

【０１２３】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。

【０１２４】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のビテルタノ
ール類縁化合物及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応と
は無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、
それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法
は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採
用できる。

【０１２５】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、ビテルタノール類縁化合物誘導体を酵素に
結合する方法であれば、特に制限なくいかなる方法で行
ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用
することができる。調製した酵素結合ハプテンは、ビテ
ルタノール類縁化合物を含む試料と混合する。

【０１２６】（ｄ）工程において当該混合物を抗体固相
化担体に接触させ、混合物中のビテルタノール類縁化合
物と酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これら
と固相化抗体との複合体が生成する。ビテルタノール類
縁化合物を含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用す
る。限定されるわけではないが、反応は例えば室温でお
よそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、
未反応の酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例え
ばＰＢＳを採用することができる。

【０１２７】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からビテルタノール類縁化合物の量を算出す
ることができる。

【０１２８】本発明のモノクローナル抗体６Ｄ１６−６
−１は、物理吸着法を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法
において０.０１−１０００ｎｇ／ｍｌ，好ましくは
０．１−１００ｎｇ／ｍｌの範囲で、７Ｃ１−１−１
は、０.１−１,０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１−１,
０００ｎｇ／ｍｌの範囲でビテルタノールを測定できる
（実施例９、図４）。また、アミノプレートを使用した
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法では、６Ｄ１６−６−１及び
７Ｃ１−１−１は、０．０００１−１００ｎｇ／ｍｌ、
好ましくは０．００１−１０ｎｇ／ｍｌの範囲でビテル
タノールを測定できる（実施例１０ 図５）。

【０１２９】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１３０】

【実施例】実施例１ ビテルタノール誘導体−１の合成

【化９３】

【０１３１】３,３−ジメチル−１−［４−(４−ヒドロ
キシフェニル)フェニル］−２−ブタノン（２）の合成 エタノール２００ｍｌに４,４−ビフェノール（１）８.
５ｇ（４６ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム７.６ｇ（５５
ｍｍｏｌ）を加え、この混合物に１−ブロモ−−３,３
−ジメチル−２−ブタノン８.２ｇ（４６ｍｍｏｌ）を
室温下に加えて、室温で１時間、還流下に２時間撹拌反
応させた。この反応混合物を濃縮後、水５０ｍｌを加え
トルエンで抽出した。トルエン層を水、５％水酸化ナト
リウム水溶液、水の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、トルエンを留去した。残渣をシリカゲルクロ
マトグラフィー（ジクロロメタン）で精製し、６.５g
（収率４７％）の３,３−ジメチル−１−［４−(４−ヒ
ドロキシフェニル)フェニル］−２−ブタノン（２）を
得た。

【０１３２】４−［４−(３,３−ジメチル−２−ブタノ
ン−１−イルオキシ)フェニル］フェニルアセテート
（３）の合成 トルエン１２０ｍｌに３,３−ジメチル−１−［４−(４
−ヒドロキシフェニル)フェニル］−２−ブタノン
（２）６.０ｇ（２０ｍｍｏｌ）及び塩化アセチル１.７
ｇ（２２ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶液に氷水冷却下、
１５℃−２０℃でトリエチルアミン２.３ｇ（２３ｍｍ
ｏｌ）を滴下し、室温下に１時間撹拌した。反応混合物
に水を加え、トルエン層を水洗い後、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、トルエンを留去した。残渣をシリカゲル
クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：
１）で精製し、６.３ｇ（収率９７％）の４−［４−
(３,３−ジメチル−２−ブタノン−１−イルオキシ)フ
ェニル］フェニルアセテート（３）を得た。

【０１３３】４−［４−（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ
−１,２,４−トリアゾール−１−イル )−２−ブタノン
−１−イルオキシ）フェニル］フェニルアセテート
（５）及び４−［４−（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ−
１,２,４−トリアゾール−１−イル )−２−ブタノン−
１−イルオキシ）フェニル］フェノール（６）の合成 四塩化炭素２０ｍｌに４−［４−(３,３−ジメチル−２
−ブタノン−１−イルオキシ)フェニル］フェニルアセ
テート（３）６.３ｇ（１９ｍｍｏｌ）を溶解し、この
溶液に塩化スルフリル２.９ｇ（２１ｍｍｏｌ）を室温
下に滴下し、還流下に２時間反応させた。反応混合物を
濃縮した。残渣をアセトン３０ｍｌに溶解し、この溶液
に１Ｈ−１,２,４−トリアゾール１.５ｇ（２２ｍｍｏ
ｌ）及び炭酸カリウム３.３ｇ（２４ｍｍｏｌ）を加
え、還流下に１時間撹拌反応させた。反応混合物に水を
加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水洗い
後、無硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシ
リカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン次にｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、４−［４−
（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾー
ル−１−イル)−２−ブタノン−１−イルオキシ）フェ
ニル］フェニルアセテート（５）２.５ｇ（収率３３
％）及び４−［４−（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ−
１,２,４−トリアゾール−１−イル)−２−ブタノン−
１−イルオキシ）フェニル］フェノール（６）１.４ｇ
（収率１３％、融点２０３℃−２０５℃）を得た。

【０１３４】４−［４−（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ
−１,２,４−トリアゾール−１−イル )−２−ブタノン
−１−イルオキシ）フェニル］フェノール（６）の合成 エタノール３０ｍｌに４−［４−（３,３−ジメチル−
１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル)−２−
ブタノン−１−イルオキシ）フェニル］フェニルアセテ
ート（５）２.５ｇ（６.４ｍｍｏｌ）を溶解し、この溶
液に水１０ｍｌに溶かした水酸化ナトリウム１.５ｇ
（３７ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹拌反応させ
た。反応混合物を濃縮し、残渣に水３０ｍｌ及びトルエ
ン３０ｍｌを加え、分液し、水層を希塩酸で弱酸性に
し、析出した結晶を濾過し、水洗い後、乾燥して４−
［４−（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ−１,２,４−トリ
アゾール−１−イル)−２−ブタノン−１−イルオキ
シ）フェニル］フェノール（６）２.２ｇ（収率８２
％）を得た。

【０１３５】４−［４−（４−（３,３−ジメチル−１
−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル)−２−ブ
タノン−１−イルオキシ）フェニル）フェノキシ］ブタ
ノエート（７）の合成 エタノール１００ｍｌに４−［４−（３,３−ジメチル
−１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル)−２
−ブタノン−１−イルオキシ）フェニル］フェノール
（６）１.９ｇ（５.４ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム１.
１ｇ（８.０ｍｍｏｌ）を加え、この混合物に４−ブロ
モブタン酸エチルエステル２.１ｇ（１.１ｍｍｏｌ）を
室温下に加えて、室温で１時間、還流下に２時間撹拌反
応させた。この反応混合物を濃縮後、水５０ｍｌを加え
ジエチルエーテルで抽出した。エーテル層を水洗い後、
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝１：１）で精製し、１.８ｇ（収率７２％）のエチル
４−［４−（４−（３,３−ジメチル−１−(１Ｈ−１,
２,４−トリアゾール−１−イル)−２−ブタノン−１−
イルオキシ）フェニル）フェノキシ］ブタノエート
（７）を得た。

【０１３６】４−［４−（４−（３,３−ジメチル−２
−ヒドロキシ−１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−
１−イル)ブトキシ）フェニル）フェノキシ］ブタノエ
ート（８）の合成 メタノール２０ｍｌにエチル ４−［４−（４−（３,
３−ジメチル−１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−
１−イル)−２−ブタノン−１−イルオキシ）フェニ
ル）フェノキシ］ブタノエート（７）１.６ｇ（３.４ｍ
ｍｏｌ）を溶解し、この溶液に９０％水酸化ホウ素ナト
リウム０.１４ｇ（３.３ｍｍｏｌ）を氷水冷却下５℃−
１０℃で加えた後、室温下で１時間撹拌反応させた。次
にメタノールを濃縮留去し、残渣に２Ｎの塩酸１０ｍｌ
を加え、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸マ
グネシウムで乾燥後、濃縮し、１.４ｇ（収率８８％）
のエチル ４−［４−（４−（３,３−ジメチル−２−
ヒドロキシ−１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１
−イル)ブトキシ）フェニル）フェノキシ］ブタノエー
ト（８）を得た。

【０１３７】４−［４−（４−（３,３−ジメチル−２
−ヒドロキシ−１−(１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−
１−イル)ブトキシ）フェニル）フェノキシ］ブタン酸
（ビテルタノール誘導体−１）（９）の合成 エタノール４０ｍｌにエチル ４−［４−（４−（３,
３−ジメチル−２−ヒドロキシ−１−(１Ｈ−１,２,４
−トリアゾール−１−イル)ブトキシ）フェニル）フェ
ノキシ］ブタノエート（８）１.４ｇ（３.０ｍｍｏｌ）
を溶解し、この溶液に、水１０ｍｌに溶かした水酸化ナ
トリウム１.０ｇ（２５ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１
時間撹拌反応させた。反応混合物を濃縮し、残渣に水３
０ｍｌを加え、希塩酸でｐＨ６にしてエーテルで抽出し
た。エーテル層を水洗い後、無水硫酸マグネシウムで乾
燥、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、０.
９ｇ（収率６９％）の４−［４−（４−（３,３−ジメ
チル−２−ヒドロキシ−１−(１Ｈ−１,２,４−トリア
ゾール−１−イル)ブトキシ）フェニル）フェノキシ］
ブタン酸（ビテルタノール誘導体−１）（９）を得た。

【０１３８】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） ０.９１、０.９４（９Ｈ，ｓ，ｓ） １.９５（２Ｈ，ｍ） ２.３９（２Ｈ，ｔ） ３.５６（２Ｈ，ｍ） ４.００（２Ｈ，ｔ） ６.３３，６.３８（１Ｈ，ｄ，ｄ） ６.９７（２Ｈ，ｄ） ７.０６（２Ｈ，ｍ） ７.５１（４Ｈ，ｍ） ８.０４（１Ｈ，ｄ） ８.７５（１Ｈ，ｄ） １２.１８（１Ｈ，ｂｒ）

【０１３９】実施例２ ビテルタノール誘導体−２の合
成

【化９４】

【０１４０】エチル ６−［３,３−ジメチル−１−
（４−フェノキシフェニル）−１−（１Ｈ−１,２,４−
トリアゾール−１−イル)エトキシ］ヘキサノエート
（２）の合成 テトラヒドロフラン１５ｍｌに６０％水素化ナトリウム
０.３３ｇ（８.３ｍｍｏｌ）を懸濁し、これに１−
（３,３−ジメチル−２−ヒドロキシ−１−(４−フェニ
ルフェノキシ)ブチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール
（１）（ビテルタノール）１.７ｇ（５.０ｍｍｏｌ）を
氷水冷却下に加え、室温下に４時間撹拌した。次にこれ
をエチル ６−ブロモヘキサノエート１.２ｇ（5．５ｍ
ｍｏｌ）を氷水冷却下５℃−１０℃で加え、室温下に１
６時間撹拌反応させた。この反応混合物を濃縮後、残渣
をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸
エチル＝４：１）で精製し、０.５ｇ（収率２０％）の
エチル ６−［３,３−ジメチル−１−（４−フェノキ
シフェニル）−１−（１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−
１−イル)エトキシ］ヘキサノエート（２）を得た。

【０１４１】６−［３,３−ジメチル−１−（４−フェ
ノキシフェニル）−１−（１Ｈ−１,２ ,４−トリアゾー
ル−１−イル)エトキシ］ヘキサン酸（ビテルタノール
誘導体−２）（３）の合成 エタノール２０ｍｌにエチル ６−［３,３−ジメチル
−１−（４−フェノキシフェニル）−１−（１Ｈ−１,
２,４−トリアゾール−１−イル)エトキシ］ヘキサノエ
ート（２）０.２ｇ（０.４２ｍｍｏｌ）を溶解し、この
溶液に水５ｍｌに溶かした水酸化ナトリウム０.２ｇ
（５.０ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹拌反応さ
せた。反応混合物を濃縮し、残渣を水３０ｍｌに溶解
し、希塩酸でｐＨ６に調製した。析出した結晶を濾過
し、水、ヘキサンで洗い、０.１５ｇ（７９％）の６−
［３,３−ジメチル−１−（４−フェノキシフェニル）
−１−（１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル)エ
トキシ］ヘキサン酸（ビテルタノール誘導体−２）
（３）を得た。融点１２４℃−１２６℃

【０１４２】 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） ０.８９（９Ｈ，ｓ） １.２９（２Ｈ，ｍ） １.４７（４Ｈ，ｍ） ２.１６（１Ｈ，ｔ） ３.２２（１Ｈ，ｍ） ３.４０（１Ｈ，ｍ） ３.５７（１Ｈ，ｄ） ６.４５（１Ｈ，ｄ） ７.０９（２Ｈ，ｄ） ７.３２（１Ｈ，ｔ） ７.４２（２Ｈ，ｔ） ７.５９（４Ｈ，ｄ） ８.１１（１Ｈ，ｓ） ８.８１（１Ｈ，ｓ） １１.９５（１Ｈ，ｂｒ）

【０１４３】実施例３ 免疫用抗原の調製 免疫用抗原として、ビテルタノール誘導体とＢＳＡとの
結合体を混合酸無水物法を用いて調製した。実施例１及
び２で調製したビテルタノール誘導体−１または−２を
１２ｍｇ秤量し、無水ジオキサン１ｍｌに溶解した後、
Ｎ−メチルモルフィリン２５μｌを添加し、室温で２０
分間撹拌した。次に、クロロギ酸イソブチル１０μｌを
添加し、室温で２０分間撹拌した（これを、以下、「Ａ
液」と言う）。

【０１４４】一方、蒸留水２ｍｌにＢＳＡ ４０ｍｇを
溶解し、０.５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを８.０に調整
したＡ液をｐＨ８．０になるように調整しながら滴下し
た。４℃にて４時間反応させた後、蒸留水に対して４℃
で透析を行い、凍結乾燥してビテルタノール誘導体−Ｂ
ＳＡ結合体を得た。また、ＢＳＡの代わりにＲＳＡとの
結合体も同様に方法で調製した。

【０１４５】このようにして得られた結合体を免疫用抗
原として用いた。

【０１４６】実施例４ 免疫感作 免疫用抗原５０μｇ又は１００μｇを１４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）１００μｌに溶解
し、等量のフロイント完全アジュバントと混合して、Ｂ
ａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種した。さらに、２週間及
び４週間後にフロイント不完全アジュバントを用いて調
製した免疫用抗原を、前記と同様にマウスの皮下に追加
免疫した。また、５週間目にＰＢＳ６０μｌに溶解した
免疫用抗原３０μｇをマウスの尾静脈又は腹腔内に最終
免疫した。

【０１４７】実施例５ 抗血清によるビテルタノールの
測定 実施例４におけるマウス尾静脈又は腹腔内への接種前に
採血し、抗血清を希釈調製して、以下に記述する間接競
合阻害ＥＬＩＳＡ法にてビテルタノールを測定した。

【０１４８】免疫用抗原としてビテルタノール誘導体−
ＢＳＡ結合体を用いた場合には、ビテルタノール−ＲＳ
Ａ結合体の溶液（０.１μｇ／ｍｌ）を、また、免疫用
抗原としてビテルタノール誘導体−ＲＳＡ結合体を用い
た場合には、ビテルタノール誘導体−ＢＳＡ結合体の溶
液（０.１μｇ／ｍｌ）を、５０μｌ／ウェルの量で９
６ウェルプレートにコーティングした。４倍希釈したブ
ロックエース（雪印乳業社製）でブロッキングした後、
抗血清希釈液と、各種濃度のビテルタノールを溶解した
２０％メタノール−ＰＢＳ溶液とを等量混合し、その５
０μｌをウェルに入れ、室温で１時間反応させた。

【０１４９】反応後ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍希
釈のブロックエースを用いて２,０００倍に希釈したペ
ルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ
社製）を５０μｌずつ各ウェルに入れ、室温で１時間反
応させた。

【０１５０】反応後、ＰＢＳで５回洗浄の後、２ｍｇ／
ｍｌのＯＰＤ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍ
クエン酸−ＰＢＳ（ｐＨ５.０）を５０μｌずつ各ウェ
ルに入れ、室温で１０分間ずつ静置して発色反応を行っ
た。

【０１５１】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。その一例を図１に示す。図１より、マウスの抗血
清（ポリクローナル抗体）を使用することにより、ビテ
ルタノールの量を０.０１−１０μｇ／ｍｌの範囲で測
定することができた。

【０１５２】実施例６ ハイブリドーマ細胞の作製 実施例４に続いて、血清中の抗ビテルタノール抗体の活
性が高くなったマウスの脾細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞化
学：日本組織細胞化学会編：学際企画 １９８６年）に
従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養し
た。細胞の増殖が見られた培養液につき、ビテルタノー
ルに対する抗体活性を以下の方法で調べた。

【０１５３】免疫用抗原としてビテルタノール誘導体−
ＢＳＡ結合体を用いた場合には、ビテルタノール−ＲＳ
Ａ結合体の溶液（０.１μｇ／ｍｌ）を、また、免疫用
抗原としてビテルタノール誘導体−ＲＳＡ結合体を用い
た場合には、ビテルタノール誘導体−ＢＳＡ結合体の溶
液（０.１μｇ／ｍｌ）を、５０μｌ／ウェルの量で９
６ウェルプレートにコーティングした。これを４倍希釈
したブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキングし
た後、融合細胞の培養上清液を５０μｌずつ各ウェルに
入れ、室温で１時間反応させた。

【０１５４】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、１０倍
希釈のブロックエースを用いて２,０００倍に希釈した
ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇ
ｏ社製）を５０μｌずつ各ウェルに入れ、室温で１時間
反応させた。

【０１５５】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後、２μｇ
／ｍｌのＯＰＤ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.１
Ｍクエン酸−ＰＢＳ（ｐＨ５.０）を５０μｌずつ各ウ
ェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行っ
た。

【０１５６】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍ吸光度を測定し
て反応性を示す細胞を選抜した。

【０１５７】次に各ウェルのビテルタノールとの反応性
を実施例５に記載した方法で調べ、目的の抗体を産生し
ている細胞について限界希釈法によりクローニングを行
った。その結果、十数株のハイブリドーマ細胞が抗ビテ
ルタノール抗体を産生する細胞株としてクローン化され
た。その一部である６Ｄ１６−６−１及び７Ｃ１−１−
１を平成８年１２月４日に、各々寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１５９７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９７７で工業技術院
生命工学工業技術研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東
１丁目１番３号）に寄託した。

【０１５８】実施例７ モノクローナル抗体の評価 （１）６Ｄ１６−６−１抗体の反応性 クローン化したハイブリドーマ６Ｄ１６−６−１に由来
するモノクローナル抗体６Ｄ１６−６−１について、そ
の培養上清を用いて実施例５に記載した方法でアゾール
系化合物に対する吸光度を測定した。得られた吸光度か
ら以下の式：

【化９５】 で阻害率を算出し、アゾール系化合物に対する反応性を
調べた。この結果を図２に示す。図２より、この抗体は
ビテルタノールの量を０.００１−１μＭの範囲で測定
できることを確認した。また、この抗体はトリアジメノ
ール、トリアジメホン、ジクロブトラゾルに対しても反
応した。

【０１５９】（２）７Ｃ１−１−１抗体の反応性 クローン化したハイブリドーマ７Ｃ１−１−１に由来す
るモノクローナル抗体７Ｃ１−１−１について、（１）
と同様にしてアゾール系化合物に対する反応性を調べ
た。この結果を図３に示す。図３より、この抗体はビテ
ルタノールに対して特異的に反応し、ビテルタノールの
量を０.０１−１０μＭの範囲で測定できることを確認
した。

【０１６０】実施例８ ビテルタノール誘導体と西洋わ
さびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）との結合体の調製 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を行うために必要な酵素結合
ビテルタノール誘導体を調製するため、活性化エステル
法を用いてビテルタノール誘導体とＨＲＰとの結合を行
った。

【０１６１】ビテルタノール誘導体−１または−２を
０.０５ｍｍｏｌ秤量し、無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムア
ミド ０.２５ｍｌに溶解した。次に、Ｎ−ヒドロキシこ
はく酸イミド０.０５ｍｍｏｌ、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド０.０５ｍｍｏｌを添加し、室温にて３.５時
間撹拌し、反応させた。反応後、１０,０００ｒｐｍで
１５分間遠心し、上清と沈殿とに分離した。

【０１６２】一方、ＰＢＳ２.５ｍｌにＨＲＰ２５ｍｇ
を溶解した後、無水ＤＭＦ０.５ｍｌを添加した溶液を
調製しておき、その溶液に前記の上清０.１２５ｍｌを
加え、４℃にて一晩撹拌し、反応させた。反応後、ＨＲ
Ｐ結合ビテルタノール誘導体をＰＢＳによる透析によっ
て精製した。

【０１６３】実施例９ 物理吸着法を用いた直接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によるビテルタノールの測定 （１）６Ｄ１６−６−１抗体による測定 実施例６で得られたハイブリドーマ細胞６Ｄ１６−６−
１をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得られた
腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体を
分取し、以下の試験法（直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法）に
てビテルタノールの量を測定した。

【０１６４】モノクローナル抗体溶液（１０μｇ／ｍ
ｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルプレートに入
れ、４℃で一晩静置してコーティングした。これを４倍
希釈したブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキン
グした後、各種濃度のビテルタノール及び実施例８で調
製したＨＲＰ結合ビテルタノール誘導体−１を溶解した
１０％メタノール−ＰＢＳ溶液を５０μｌずつ各ウェル
に入れ、２５℃で１時間反応させた。

【０１６５】反応後、ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍ
ｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０.０２％の過酸化水素を含む０.
１Ｍ クエン酸−ＰＢＳ（ｐＨ５.０）を５０μｌずつ
各ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行
った。

【０１６６】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍ吸光度を測定し
た。この結果を図４に示した。図４より直接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法においても、本発明のモノクローナル抗体６
Ｄ１６−６−１はビテルタノールの量を０.１−１００
ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができた。

【０１６７】（２）７Ｃ１−１−１抗体による測定 実施例６で得られたハイブリドーマ細胞７Ｃ１−１−１
を用いて、（１）と同様にしてモノクローナル抗体を分
取した。そのモノクローナル抗体及び、実施例８で調製
したＨＲＰ結合ビテルタノール誘導体−２を用いた以外
は（１）と同様にして、ビテルタノールを測定した。こ
の結果を図４に示した。図４より直接競合阻害ＥＬＩＳ
Ａ法においても、本発明のモノクローナル抗体７Ｃ−１
−１はビテルタノールの量を１−１，０００ｎｇ／ｍｌ
の範囲で測定することができた。

【０１６８】実施例１０ 化学結合法を用いた直接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法によるビテルタノールの測定 （１）６Ｄ１６−６−１抗体による測定 ２％グルタルアルデヒド水溶液を１００μｌ／ウェルの
量でアミノ基結合型９６ウェルプレート（住友ベークラ
イト社製「ＥＬＩＳＡ用プレートＡ」、品番：ＭＳ−８
６９６Ｆ）に入れ、２５℃で２時間反応させた。反応
後、ＰＢＳで２回洗浄した後、実施例９で得られたモノ
クローナル抗体６Ｄ１６−６−１（１０μｇ／ｍｌ）を
５０μｌずつウェルに入れ、４℃で一晩静置してコーテ
ィングした後、４倍希釈したブロックエース（雪印乳業
社製）でブロッキングしてプレートを調製した。

【０１６９】このプレートを使用して、実施例７に記載
した方法でビテルタノールを測定した。この結果を図５
に示した。図５より、アミノ基結合型プレートを使用し
た化学結合法によって、本発明のモノクローナル抗体６
Ｄ１６−６−１は、高感度でビテルタノールの量が測定
できることを確認した。

【０１７０】（２）７Ｃ１−１−１抗体による測定 実施例９で得られたモノクローナル抗体７Ｃ１−１−１
を用いて（１）と同様にしてプレートを調製し、そのプ
レートを用いた以外は（１）と同様にしてビテルタノー
ルを測定した。この結果を図５に示した。図５より、ア
ミノ基結合型プレートを使用した化学結合法によって、
本発明のモノクローナル抗体７Ｃ１−１−１は、高感度
でビテルタノールの量が測定できることを確認した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、マウス抗血清を用いた、間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によるビテルタノールの測定を示す。

【図２】 図２は、本発明のモノクローナル抗体６Ｄ１
６−６−１のアゾール系化合物に対する感度を間接競合
阻害ＥＬＩＳＡ法によって調べた結果を示す。

【図３】 図３は、本発明のモノクローナル抗体７Ｃ１
−１−１のアゾール系化合物に対する感度を間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によって調べた結果を示す。

【図４】 図４は、本発明のモノクローナル抗体６Ｄ１
６−６−１及び７Ｃ１−１−１を用いた、物理吸着法を
用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるビテルタノール
の測定の結果を示す。

【図５】 図５は、本発明のモノクローナル抗体６Ｄ１
６−６−１及び７Ｃ１−１−１を用いた、化学結合法を
用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるビテルタノール
の測定の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 鎌田 良雄 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−155266（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−205390（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−100377（ＪＰ，Ａ) Ｂｕｌｌ．Ｅｎｖｉｏｒｏｎ．Ｃｏｎ ｔａｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，Ｖｏｌ．36 （Ｎｏ．１）ｐ９−14（1986) 「酵素免疫測定法」（蛋白質核酸酵素 別冊Ｎｏ．31、共立出版1987年９月) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 249/08 C07K 16/44 C12N 5/10 C12N 15/02 C12P 21/08 G01N 33/53 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（Ｉ）： 【化１】 ［式（Ｉ）中、 Ｒは、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシル基、
   アミノ基又はメルカプト基であり； Ｘは、以下の式： 【化２】 からなる群より選択された基であるか、あるいは直接結
   合であり； Ｌは、ハロゲン原子であるか、あるいは無置換であり； ｎは、１−１０の整数であり；そしてｍは、１−４の整
   数である］で表される構造を有する化合物。
2. 【請求項２】Ｒがカルボキシル基であり、Ｘが−Ｏ−で
   あり、Ｌが無置換である、請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
   合物若しくは標識物質との結合体。
4. 【請求項４】請求項１又は２に記載の化合物に高分子化
   合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を
   用いることにより、以下の式（ＩＩ）： 【化３】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（ＩＩ）の化合物と反応性
   を示す抗体またはそのフラグメントの製造方法。
5. 【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（ＩＩ）の化合物と反応性
   を示す抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項５に記
   載の抗体又はフラグメント。
7. 【請求項７】アミノ基結合型プレートを用いた免疫学的
   測定方法において、式（ＩＩ）で表される化合物を０．
   ００１ｎｇ／ｍｌないし１０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定可
   能な、請求項５又は６に記載の抗体又はフラグメント。
8. 【請求項８】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５９７６で寄託
   されているハイブリドーマから産生されるモノクローナ
   ル抗体６Ｄ１６−６−１である、請求項５ないし７のい
   ずれか１項に記載の抗体又はフラグメント。
9. 【請求項９】請求項５ないし８のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメント産生するハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５９７６で寄
    託されている、請求項９に記載のハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】請求項５ないし８のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメント、並びに所望により請求項１又
    は２において式（Ｉ）で表される化合物を用いることを
    特徴とする、式（ＩＩ）で表される化合物の免疫学的測
    定方法。
12. 【請求項１２】アミノ基結合型プレートを用い、式（Ｉ
    Ｉ）で表される化合物を０．００１ｎｇ／ｍｌないし１
    ０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することを特徴とする、請求
    項１１に記載の免疫学的測定方法。