JPH07294522A - イソチアゾロン類の免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 イソチアゾロン化合物を検出する改良された
方法を開発する。 【構成】 本発明のイソチアゾロン類と高分子キャリヤ
の免疫原性複合体の製造方法は、高分子キャリアを、反
応性基を有するイソチアゾロン類に共有結合させること
を含んでなることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】Ｉ．発明の背景 Ａ．発明の分野 本発明は、免疫検定法を用いた低濃度イソチアゾロン化
合物の検出方法に関する。

【０００２】Ｂ．従来技術の説明 イソチアゾロン化合物は、水又は湿気が存在する多くの
適用場所において、殺生物剤として広く使用されてい
る。これらの多くの適用場所においては、系中のイソチ
アゾロンの適切な用量及び安定性を決定することが必要
である。現状の技術では、時間がかかり、不便で、かつ
費用もかかるＨＰＬＣ分析方法を使用することになって
いる。

【０００３】ウエスティングハウス・エレクトリック・
コーポレーション(Westinghouse Electric Corporatio
n) の１９８８年３月２３日に公表されたヨーロッパ特
許出願番号０２６０８２９号（発明者：ケネス・ダブリ
ュ・ハンター(Kenneth W. Hunter) ）には、塩素化フェ
ノール類、特にペンタクロロフェノールと反応するモノ
クローナル抗体、及び該抗体を産生するハイブリドー
マ、更に該塩素化フェノール類の免疫検定法が開示され
た。多くの化合物の検出方法は、免疫検定法の発達によ
って大きな恩恵を被ったけれども、適切な細胞系を製造
することは非常に困難である。

【０００４】米国特許４，８６５，９７２号（ハンター
(Hunter)）には、酵素誘導化学物質（例えば、ジベンゾ
ジオキシン類）に関する抗体に基づいた検定が開示され
ている。イソチアゾロン類は、酵素誘導化合物ではな
い。コーラー(Kohler)とミルシュタイン(Milstein)は、
Nature ２６５：４９５(1975)において、初めて、羊の
赤血球に関するモノクローナル抗体を、特定の抗体産生
Ｂ−リンパ球と腫瘍細胞とを融合して、細胞培地(in vi
tro)又は動物(in vivo )中で単一のモノクローナル抗体
を合成することができる「不滅」自己再生型ハイブリッ
ドクローン（又は「ハイブリドーマ」）を得ることによ
って、どのようにして調製することができるかを述べ
た。

【０００５】ＩＩ．発明の概要 本発明の目的は、イソチアゾロン化合物を検出する改良
された方法を開発することである。更なる目的は、イソ
チアゾロン類を検出するための免疫検定法に有用であろ
う細胞系を製造することである。

【０００６】これらの目的及び以下の開示から明らかに
なるであろう他の目的は本発明によって達成され、その
一態様には、３−イソチアゾロン類、特に、５−クロロ
−２−メチル−３−イソチアゾロンとの反応性を有する
モノクローナル抗体を産生する新規な細胞系を含む。本
発明はまた、該イソチアゾロン類と反応するモノクロー
ナル抗体及びポリクローナル抗体に関する。本発明は、
かかる抗体、該抗体の製造方法、該抗体を用いる分析
法、診断法、調査法、分離法及び他の方法、並びにそれ
らに使用する抗体を含む組成物に関する。さらに、本発
明は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及
び該ハイブリドーマの製造方法に関する。最後に、本発
明は、イソチアゾロン類と高分子キャリヤとの免疫原性
複合体、並びに該複合体の製造方法に関する。

【０００７】ＩＩＩ．図面の説明 図１は、本発明による免疫検定法においてイソチアゾロ
ン類の４つの異なる種の結合阻害率を示すグラフであ
る。

【０００８】ＩＶ．発明及び好ましい実施態様の詳細な
説明 ある種類のイソチアゾロン類は、チオール類との反応に
おいて1.053 ×10³ モル／sec の一次速度定数（ピー・
ジェイ・コリア(P.J. Collier)等、J.Appl. Bacteriol
、69:578〜584 ，1991) を有する非常に反応性の高い
求電子試薬である。また、５−クロロ−２−メチル−３
−イソチアゾロンは、チオール類との開環反応後、さら
に反応する能力を有している。血清及び赤血球が、還元
されたチオール化合物であるグルタチオンを高レベルで
含むということはよく知られている。ウシ血清中にイソ
チアゾロン類を導入後すぐに、該イソチアゾロン類は、
生物検定法、紫外線分光法又は高速液体クロマトグラフ
ィ（Proclin （商標）３００製品広報、ローム・アンド
・ハース・カンパニー(Rohm and Haas Company，Philad
elphia, PA）のいずれによっても検出できなくなる。こ
れは、求核試薬とのイソチアゾロンの反応及び完全環構
造の破壊を意味する。血清中に存在することが知られて
いる求核試薬とイソチアゾロン類との実証されたこの高
速反応は、抗体配合物を誘導する目的で動物中に導入さ
れた未処理のイソチアゾロンが、免疫系の適切な構成要
素と相互作用するのに十分なほど長くは、完全なままで
存在しないということを予測する一つの示唆である。し
たがって、イソチアゾロン類に対する抗体が誘導され得
るということは、全く予期し得ない。

【０００９】我々は、既存の分析技術によって実現され
てない多くの批判的要求を満足させる新規な抗体を発見
した。該抗体は、高速、簡易、及びコスト的に有利な種
々の免疫検定法技術による殺生物剤の検出を可能とす
る。該新規抗体は、イソチアゾロンを最初に抽出する必
要がないので、特に、水中でイソチアゾロン化合物を分
析するのに有用である。

【００１０】ポリクローナル抗体の使用も可能である
が、しかしモノクローナル抗体の使用が非常に好まし
い。モノクローナル抗体は、それらを非常に特異的かつ
均質にする単一のＢ−リンパ球クローン（「ハイブリド
ーマ」）から誘導される。かかるハイブリドーマは、実
際的に、単一のあらかじめ定められた特異性をもって、
抗体の、潜在的に無限の補給材料を産生できる自己再生
型細胞「工場」である。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体は２−メチル
−３−イソチアゾロン（「５７３」）に対して開発され
たが、図１に示すように、他のイソチアゾロン類、例え
ば、５−クロロ−２−メチル−３−イソチアゾロン
（「６５１」) 、４，５−ジクロロ−２−ｎ−オクチル
−３−イソチアゾロン（「２８７」) 及び２−ｎ−オク
チル−３−イソチアゾロン（「８９３」）と交差反応性
を有する。

【００１２】本発明で有用なイソチアゾロン類は、次式

【化１】 ［式中、Ｒ¹ とＲ² は独立して、水素、ハロゲン若しく
は（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）アルキル群から選ばれるか、又は代わ
りに一緒になって飽和、不飽和若しくは芳香族５若しく
は６員融合炭素環式環を形成することができ；Ｙは水
素、非置換若しくはハロ−置換（Ｃ₁ 〜Ｃ₁₈）アルキル
基、炭素数２〜８の非置換若しくはハロ−置換アルケニ
ル若しくはアルキニル基、非置換若しくはハロ−置換
（Ｃ₃ 〜Ｃ₈ ）シクロアルキル、炭素原子数１０までの
アラルキル若しくはハロ−、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）アルキル
−、若しくは（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）アルコキシ−置換アラルキ
ル、又は炭素原子数１０までのアリール若しくはハロ
−、（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）アルキル、若しくは（Ｃ₁ 〜Ｃ₄ ）
アルコキシ−置換アリール基である］で示される。

【００１２】代表的なＹ置換基としては、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシル、オク
チル、シクロヘキシル、４−メトキシフェニル、４−ク
ロロフェニル、３，４−ジクロロフェニル、ベンジル、
４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェネチ
ル、４−フェニルブチル、クロロメチル、クロロプロピ
ル、水素などが含まれる。

【００１３】モノクローナル抗体は、イソチアゾロン類
と高分子キャリヤの免疫原性複合体を製造し、該複合体
で動物に免疫性を付与し、該動物から抗体産生細胞を
得、腫瘍細胞と該細胞を融合してハイブリドーマを産生
し、該ハイブリドーマの中からイソチアゾロン類との反
応性を有する抗体を産生する少なくとも一つを選択し、
選択されたハイブリドーマから産生された抗体を回収す
ることによって製造される。

【００１４】in vivo においてイソチアゾロン類と反応
性を有するモノクローナル抗体を製造する方法は、該抗
体を産生するハイブリドーマを、組織親和性の宿主(hos
t)又は免疫反応が抑制された宿主の腹膜組織中に配置
し、該宿主の腹水液から抗体を回収することを包含す
る。イソチアゾロン類に対するモノクローナル抗体を産
生する無限増殖性細胞系は、イソチアゾロン類と高分子
キャリヤの免疫原性複合体を製造し、該複合体で動物に
免疫性を付与し、該動物から抗体産生細胞を得、該抗体
産生細胞を、腫瘍細胞と融合してハイブリドーマ類を製
造し、該ハイブリドーマの中からイソチアゾロン類との
反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、選択されたハイブリドーマを、細胞系へ、クローン
伸長させることによって製造される。選択された無限増
殖性細胞系によって産生された抗体は、「抗−６５１」
抗体と命名する。

【００１５】試料中でイソチアゾロン類の存在又は濃度
を測定するため、イソチアゾロン類との反応性を有する
モノクローナル抗体を試料に添加し、イソチアゾロン類
の存在又は濃度を、モノクローナル抗体を試薬として用
いる免疫検定法によって測定する。モノクローナル抗体
は、好ましくは許容されるキャリヤ中に与えられる。

【００１６】前記抗−６５１抗体を、標準的な手順を使
用してセイヨウワサビペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）
酵素に結合することができる。この結合酵素／抗体を、
免疫学的着色剤として使用して、木材、皮革及びプラス
チックのような固形マトリクス中におけるイソチアゾロ
ン類の位置を測定することができる。試験すべきマトリ
クスを、適当な方法によって薄いスライスに分割し、所
定時間、結合酵素／抗体と共にインキュベートする。こ
の間、抗体がイソチアゾロン又はイソチアゾロン類と反
応する。インキュベーション後、非結合酵素／抗体を、
ＰＢＳ−ツイーンのような緩衝剤で洗浄することによっ
て除去する。次に、処理されたマトリクス物質を酵素基
質と共にインキュベートするが、該酵素基質としては多
数の商業的に入手可能な発色性化合物を利用できる。該
マトリクスを、着色された生成物が反応部位から離れて
拡散しないような量の基質で処理する。また、該基質
を、処理された基質上を被覆する膜中に導入することも
できる。このような製品の一例としては、インターナシ
ョナル・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド
(International Biotechnologies Inc（「ＩＢＩ」）製
のエンザイグラフィック・ウエブ(Enzygraphic Web) が
挙げられる。イソチアゾロンを、マトリクス又は基質含
浸膜の視覚的検査又は顕微鏡検査によって局在化する。

【００１７】抗体に結合する酵素を使用することにかえ
て、フェリチン若しくは金で標識された抗体、又は放射
線で標識された抗体を使用できる。放射線標識抗体は、
写真フィルムへ処理されたマトリクスを露光することが
必要である。

【００１８】また、前記抗体を使用して、木材、プラス
チック又は皮革のような固形マトリクス中におけるイソ
チアゾロン類の存在及び濃度を測定することができる。
脱脂乳又はウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin
（「ＢＳＡ」））のようなたん白質ブロック剤の溶液中
に該マトリクスのウエハーを３０〜６０分間浸漬するこ
とによって、イソチアゾロンの存在に関して該固形マト
リクスを試験することができる。次に、該ウエハーをＰ
ＢＳ−ツイーン（ＰＢＳ−Ｔ）緩衝剤で簡単にすすぎ、
セイヨウワサビペルオキシダーゼに共有結合させた前記
抗−６５１抗体に１５分間暴露する。次に、該ウエハー
を、それぞれＰＢＳ−Ｔ緩衝剤中において、所定時間で
２回洗浄する。次に、結合抗−６５１−ＨＲＰ錯体を、
ＨＲＰ基質、例えばＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス
−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）の入
っているバイアル中に該ウエハーを置くことによって視
認化することができる。また、酵素基質を、溶液として
又は商業的に入手可能なエンザイグラフィック・ウエブ
（ＩＢＩ）のような固形支持体に付着された基質とし
て、木材の表面上に置くことができる。色の出現がイソ
チアゾロンの存在を示し、色の強度がイソチアゾロンの
濃度を示す。

【００１９】免疫学的手順は、イソチアゾロン類との反
応性を有するモノクローナル抗体を抗体として使用する
選択的免疫学的反応に基づいて混合物からイソチアゾロ
ン類を単離又は分離するために使用できる。

【００２０】前記化合物を含有する混合物からイソチア
ゾロン化合物を単離又は分離するための組成物は、イソ
チアゾロン化合物との反応性を有する有効量のモノクロ
ーナル抗体を含み、マトリクス上に又はキャリヤ中に添
加されて固定されている。

【００２１】イソチアゾロン化合物との反応性を有する
ポリクローナル抗体は、該イソチアゾロンと高分子キャ
リヤの免疫原性複合体を製造し、該複合体で動物に免疫
性を付与し、該動物から血液を採取し、該血液から血清
を分離し、該血清から抗体を回収することによって製造
される。

【００２２】高分子キャリヤに共有結合したイソチアゾ
ロン化合物を含む免疫原性複合体は、高分子キャリヤに
化学結合剤(chemical linker )を共有結合させ、該化学
結合剤へイソチアゾロンの誘導体（反応性基を有する誘
導体）を共有結合させ、それによって、該免疫原性複合
体を形成することによって製造される。

【００２３】特に好ましい実施態様においては、本発明
のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣ
Ｃ ＨＢ１１４３５又はその変種若しくは変異体によっ
て産生されるモノクロナール抗体の特質を有するもので
ある。ＡＴＣＣ ＨＢ１１４３５は、アメリカ合衆国
20852 メリーランド州、ロックビル、パークローン・ド
ライブ 12301のAmerican Type Culture Collection（Ａ
ＴＣＣ）の永久型コレクションから入手可能な生物学的
に純粋な培養体であり、１９９１年５月１４日に寄託さ
れている。ＡＴＣＣ ＨＢ１１４３５は、マウスＢ−リ
ンパ球とマウス血漿のう腫細胞(plasmacytoma)との融合
によって製造された。これらのハイブリドーマ類によっ
て産生される免疫グロブリン（抗体）は、ＩｇＧクラス
に属する。ＡＴＣＣ ＨＢ１１４３５抗体のモノクロー
ナル性は、それらを産生したハイブリドーマを再クロー
ン化することにより立証された。

【００２４】ＡＴＣＣ ＨＢ１１４３５によって産生さ
れたモノクローナル抗体は、他のハイブリドーマから産
生される。そうでなければ５−クロロ−２−メチル−３
−イソチアゾロンと反応する他のモノクローナル抗体が
そのように反応することを妨げるであろう。

【００２５】前記ハイブリドーマ及び無限増殖性細胞系
は； （ａ）高分子キャリヤと、それに対してモノクローナル
抗体が求められる特定のイソチアゾロン類との免疫原性
複合体を製造し； （ｂ）該複合体で動物に免疫性を付与し； （ｃ）該動物から抗体産生細胞を得； （ｄ）該抗体産生細胞を腫瘍細胞と融合してハイブリド
ーマを製造し； （ｅ）該ハイブリドーマの中から、上記工程（ａ）で製
造された免疫原複合体との反応性を有する抗体を産生す
るハイブリドーマをスクリーニングして細胞系を製造
し； （ｆ）該ハイブリドーマの中から、遊離のイソチアゾロ
ン類との反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマ
をスクリーニングし； （ｇ）クローニングする； ことによって製造することができる。

【００２６】該モノクローナル抗体は、クローニングす
ることにより無限増殖性細胞系に伸長させる前又は後
で、選択された一種又は複数のハイブリドーマから回収
することができる。

【００２７】また、脾臓細胞以外の細胞を使用して、イ
ソチアゾロン類に対する抗体を製造することができる。
この態様によって製造されたハイブリドーマを使用し、
それらを適当な培地中で培養し、該培地から抗体を回収
することによって本発明のモノクローナル抗体を製造す
ることができる。

【００２８】分子量およそ１０００以下の物質、例え
ば、５−クロロ−２−メチル−３−イソチアゾロン（分
子重量１５２）は、抗体の産生を通常は誘発しない。す
なわち、それらの物質は非免疫原性である。しかしなが
らしばしば、ハプテンとして知られているより小さな物
質に対する抗体の産生を誘発するために、かかる物質を
より大きな免疫原性キャリヤ分子、例えば炭水化物やた
ん白質に化学的に結合させることができる。ハプテンと
高分子キャリヤの免疫原性複合体を製造する一般的な手
段は、当該技術において知られている。例えば、１９８
４年６月２６日に発行されたスターク(Stark) の米国特
許第４，４５６，６９１号及びアルブロ(Alblo) 等のTo
xicol Appl. Pharmacol ，５０．１３７〜１４６（１９
７９）を参照のこと。

【００２９】アルブロ等及びスタークの方法は、ハプテ
ンを、化学的橋架又は結合剤を介して高分子キャリヤに
共有結合させることを含んでいる。該化学結合剤は、反
対側の端部に反応性基を有する二官能価分子である。反
応性基により、化学結合剤が高分子及びハプテン上の反
応性基と反応し、化学結合剤の一端がハプテンに共有結
合することを可能にする。該化学結合剤は、最初にハプ
テンに付加され、次に得られた化合物を化学結合剤の他
端の反応性基を介して高分子キャリヤに付加する。

【００３０】キャリヤたん白質と複合した小さな化学化
合物に対して作用する抗体は、化合物の構造だけでな
く、化合物とたん白質との間の結合剤の構造も、更には
結合剤の付加部位に隣接するたん白質の構造までも、識
別する傾向があるということが知られている。補助的な
構造をこのように識別する結果、非結合の化合物に結合
する抗体としての能力が無いか、又は著しくその能力を
低下させていた。このことは、特に、モノクローナル抗
体にとって問題である。この問題は、化合物に対するモ
ノクローナル抗体が、定量分析のために有用でなければ
ならない場合には、克服しなければならないことであ
る。驚くべきことに、我々は、当該技術において長く要
求されていたことを解決する、イソチアゾロン化合物に
対してかかる作用を行なう抗体を発見した。

【００３１】免疫原性複合体を製造したら、それを使用
して、公知手段によって動物宿主に免疫性を付与する。
かかる手段には、通常、接種を含むが、しかし、他の投
与方法も含むこともできる。十分な量の複合体を投与
し、動物宿主中において免疫原性反応物を製造する。

【００３２】複合体に対する抗体を産生するいかなる宿
主でも使用することができる。一般に使用されている動
物には、ウサギ及びラットやマウスのようなネズミを含
む。マウス及びラットが本発明にとって好ましい。

【００３３】動物に免疫性を付与し、動物が複合体に対
する抗体を産生し始めるのに十分な時間が経過したら、
ポリクローナル抗体を当該技術において公知の手段によ
って回収することができる。その一般的な方法として
は、動物から血液を採取し、該血液から血清を分離する
ことが挙げられる。該複合体の製造においてハプテンと
して使用されるイソチアゾロン類に他する抗体を含む血
清は、イソチアゾロン類に対する抗血清として使用でき
る。また、該抗体を血清から回収することができる。ア
フィンティー精製は、血清からイソチアゾロン類に対す
る精製されたポリクローナル抗体を回収するために好ま
しい技術である。

【００３４】モノクローナル抗体産生細胞は、免疫性を
付与された動物から回収される。任意の抗体産生細胞を
使用することができるが、動物の脾臓から得られたＢ−
リンパ球が好ましい。

【００３５】抗体産生細胞を腫瘍細胞と融合させハイブ
リドーマを製造する。本明細書においては、用語「腫瘍
細胞」には、抗体産生細胞と融合させてハイブリッド
「不滅」細胞、すなわちin vitroで連続成長できるもの
を製造することができるいかなる細胞も含む。好ましい
腫瘍細胞は、変性され免疫グロブリンを産生する能力を
失った抗体産生細胞である。かかる細胞には、ラット骨
髄腫細胞及びマウス血漿のう腫細胞(plasmacytoma)を含
む。特に、好ましくは、ヒポキサンチングアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）酵素中にお
いて欠失のあるマウス血漿のう腫細胞(plasmacytoma)又
はラット骨髄腫細胞であり、これらを用いると、ヒポキ
サンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む媒体上で
成長させると、非融合の抗体産生細胞又は血漿のう腫細
胞(plasmacytoma)若しくは骨髄種細胞からハイブリドー
マを選択することが可能になる。

【００３６】抗体製造細胞と融合させるのに有用な種々
の腫瘍細胞が知られており、容易に入手可能である。そ
の一つの典型的な細胞として、ケアニー(Kearney) ，J.
Immunology ，１２３．１５４８（１９７９）に記載さ
れているマウス血漿のう腫細胞系(plasmacytoma)Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３がある。他の細胞系としては、
ミルシュタイン(Milstein)，J.Cell Biology，９３：５
７６〜５８２（１９８２）に記載されているラット骨髄
種細胞系ＹＢ２．０ｄがある。これらの細胞系は、メリ
ーランド州、ロックビルのAmerican Type Culture Coll
ction から入手可能であり、それぞれＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５８０及びＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２と命名され
ている。

【００３７】抗体産生細胞と腫瘍細胞とを異なった動物
宿主から得ることができることに留意すべきである。例
えば、ノウインスキ(Nowinski)等のScience ，２１０：
５３７（１９８０）を参照。

【００３８】前記したように、該細胞を融合したら、非
融合細胞からハイブリドーマを分離する必要がある。抗
体産生細胞は標準的には培養体中で２〜３日後に死滅す
るが、腫瘍細胞は「不滅」である。しかしながら、ＨＧ
ＰＲＴ中で欠失のある腫瘍細胞を使用し、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地上で融合細
胞を成長させることにより、腫瘍細胞はかかる培地上で
生き残ることができないため、ハイブリドーマが、自然
に選択されるであろう。しかしながら、他の公知の選択
手段もまた使用することができる。

【００３９】ハイブリドーマを選択した後、それらを評
価してどれがイソチアゾロン類に対する抗体を産生して
いるかを測定する。当該技術における当業者に知られて
いる種々の免疫検定法を該ハイブリドーマの培養体上澄
み液を評価するために使用することができる。イソチア
ゾロン−高分子キャリヤに対するものよりもイソチアゾ
ロン類だけに対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを確認するということに注意を払う必要があ
る。すなわち、要求されており、有用で、かつ本発明に
よって製造されるモノクローナル抗体は、遊離すなわち
非共役又は非結合のイソチアゾロン類と反応するもので
ある。

【００４０】好ましい選択手段は、複合体又はイソチア
ゾロン類に対する抗体を産生するハイブリドーマを確認
するための、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）による初期スク
リーニングである。次に、かかるハイブリドーマを、５
−クロロ−２−メチル−３−イソチアゾロンのような遊
離イソチアゾロンの活性を評価する拮抗的阻害酵素免疫
検定法（ＣＩＥＩＡ）によってスクリーニングし、イソ
チアゾロン／たん白質キャリヤへのモノクローナル抗体
の結合を阻害する。ＣＩＥＩＡは、ハンター(Hunter)等
のFEBS Lett.１４９：１４７〜１５１に開示された方法
に従って行われる。

【００４１】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを
選択したら、該抗体を公知の手段によって該ハイブリド
ーマから回収することができる。一般的には、１以上の
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニング
して、それを、モノクローナル抗体を多量に産生するた
めに使用することができる無限増殖性細胞系に伸長させ
ることが有利である。

【００４２】モノクローナル抗体を産生する前記方法
は、in vitroにおける方法である。イソチアゾロン類に
対するモノクローナル抗体を産生するin vivo 方法に
は、組織適合性又は免疫反応の抑制された宿主中の腹膜
組織中に抗体を産生するハイブリドーマを配置すること
が含まれている。これにより、宿主に、ハイブリドーマ
によって産生されるモノクローナル抗体を含む液体を代
わるがわる製造する腹水症腫瘍を製造させる。抗体が十
分な量製造されるのに足りる時間の経過後、それらを公
知の手段によって回収することができる。例えば、腹水
液を採取し、モノクローナル抗体をアフィニティー精製
によって純粋な形態で回収することができる。この方法
は、特に商業的に有用な量でモノクローナル抗体を製造
するのに適している。

【００４３】種々の異なった系及び方法を使用して、イ
ソチアゾロン類との反応性を有するモノクローナル抗体
を製造し、種々のモノクローナル抗体を、以下の実施例
で示された抗体とは異なる手段によって得ることができ
る。しかしながら、ここに教示されている内容によって
製造することができる該モノクローナル抗体は、依然と
して明らかに本発明の範囲内のものである。本発明の目
的に関する該抗体のこの顕著な特徴は、それらのモノク
ローン性の他に、これらの製造に使用されるハイブリド
ーマの起源、アイソタイプ、分子特異性、親和性、製造
方法又は特定のタイプを問わず、いずれの手段において
も、イソチアゾロン類に対する反応性を有することであ
る。

【００４４】該モノクローナル抗体及びポリクローナル
抗体を使用して、イソチアゾロン類、特に５−クロロ−
２−メチル−３−イソチアゾロンを材料中で同定し、こ
れらの材料中の化学物質の濃度を測定することができ
る。該材料としては、例えば、土壌、水、食物及び体液
が挙げられる。イソチアゾロン類の存在又は濃度を測定
するため、種々の免疫検定法において試薬として使用す
ると、本発明の抗体は改良された検定法を提供する。検
出は便利、迅速、敏感、かつ特異的である。本発明の抗
体を使用することができる免疫検定法には制限はない
が、放射免疫検定法、競合免疫沈降検定法、酵素結合免
疫吸着検定法、及び免疫蛍光検定法が含まれる。本発明
のモノクローナル抗体が一般的に好ましい抗体であるけ
れども、ポリクローナル抗体もある種の用途においては
好ましい。

【００４５】材料中のイソチアゾロン類の存在又は濃度
を測定するための組成物としては、該化学物質の存在を
検出し又はその量を定量するのに有効な該化学物質に対
する抗体の濃縮物が含まれる。該抗体は、ラテックス粒
子やプラスチック微量滴定プレートのような任意のキャ
リヤに混合し、又は結合させることができる。それらは
また、何に免疫学的方法を使用するかによって、酵素又
は色素若しくは放射線標識体と複合させることができ
る。したがって、５−クロロ−２−メチル−３−イソチ
アゾロンを含むイソチアゾロン類と共に、モノクローナ
ル抗体又はポリクローナル抗体を使用するいずれの検定
システムも本発明に含まれる。

【００４６】モノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体はまた、選択的免疫学的反応に基づく溶液の錯体混合
物からのイソチアゾロン類の単離、精製、中和及び／又
は除去に有用である。イソチアゾロン類との反応性を有
する抗体の使用は、公知方法における改良を示す。

【００４７】モノクローナル抗体はポリクローナル抗体
よりも好ましい。大きな特異性及び実質的に無制限量で
入手可能であることのために、モノクローナル抗体は大
きな工業的又は商業的スケールで使用することができ
る。例えば、抗−６５１抗体は、他のイソチアゾロン類
又は類似有機化合物の混合物から５−クロロ−２−メチ
ル−３−イソチアゾロンを分離及び精製するのに有用で
ある。該混合物を５−クロロ−２−メチル−３−イソチ
アゾロンに対する固定化モノクローナル抗体と接触さ
せ、５−クロロ−２−メチル−３−イソチアゾロンを、
抗体に結合した該５−クロロ−２−メチル−３−イソチ
アゾロンの固定化錯体を形成することによって該混合物
から分離する。混合物を除去した後、５−クロロ−２−
メチル−３−イソチアゾロンを該抗体から分離し、公知
の手段によって純粋な形態で回収する。

【００４８】錯体混合物からイソチアゾロン類を精製し
又は除去するために有用な組成物としては、イソチアゾ
ロン類との反応及び結合を起こさせるのに有効な量の許
容されるマトリクス上に又は許容されるキャリヤに混合
して固定化されたモノクローナル抗体を含む。しかしな
がら、ある種の混合物に関しては、ポリクローナル抗体
が好ましい可能性がある。

【００４９】本発明のモノクローナル抗体はまた、イソ
チアゾロン類、特に５−クロロ−２−メチル−３−イソ
チアゾロンの構造及び機能に関する研究用試薬として有
用である。これらの特筆すべき特異性により、モノクロ
ーナル抗体をこれら化学物質の免疫化学的分析及び構造
活性分析に使用することが可能になり、より特異性の低
いポリクローナル抗体よりも、これらの用途においてよ
り有用となっている。該組成物は調査用試薬として有用
である。以下に示される実施例は本発明のいくつかの実
施態様を説明するものであり、本発明を何ら限定するも
のではない。

【００５０】実施例 実施例１−免疫付与性複合体の合成 塩化チオニル（７１．３８ｇ，０．６モル）及びピリジ
ン（０．５ｍｌ）を、３，３’−ジチオジプロピオン酸
（２１．３ｇ，０．１モル）に、外部冷却を行いながら
添加した。この混合物を室温で一晩攪拌した。過剰の塩
化チオニルを真空下で除去し、３，３’−塩化ジチオプ
ロピオニルを淡琥珀色の油状物（２３．７ｇ，収率１０
０％）として得て、これを精製することなく次の工程で
使用した。

【００５１】メチル４−アミノ酪酸エステル・ＨＣｌ
（３７．２ｇ，０．２４２モル）とトリエチルアミン
（６７．８ｍｌ，０．４８６モル）との混合物を、二塩
化エチレン（ＥＤＣ，３００ｍｌ）中において室温で３
０分間攪拌した。３，３’−塩化ジチオプロピオニル
を、５０ｍｌのＥＤＣ中に溶解し、約２５℃の温度に維
持されている攪拌溶液に冷却しながら滴下した。その混
合物を室温で一晩撹拌した。次に、該混合物を水中に注
ぎ、有機層を分離した。次に、該有機層を、飽和ＮａＨ
ＣＯ₃ 溶液、水及び次に食塩水で洗浄した。そして、該
溶液を乾燥し濃縮して、半固体状の褐色の残留物を得
た。この残留物を冷却しながらエチルアセテート中で摩
砕し、３，３’−ジチオ−ジ−Ｎ−（３−メトキシカル
ボニルプロピル）プロピオンアミド（化合物Ｉ）を、灰
白色固体として得、これをろ過し乾燥した（２０．４
ｇ）。

【００５２】化合物Ｉをイソチアゾロンへ環化した。
３，３’−ジチオ−ジ−Ｎ−（３−メトキシカルボニル
プロピル）プロピオンアミド（１２．０ｇ，０．０２９
モル）及び塩化スルフリル（１９．８ｇ，０．１４７モ
ル）を、冷却され（０℃）かつ撹拌されたエチルアセテ
ート（１２０ｍｌ）が入っているフラスコに一時間かけ
て同時に加えた。該アミド及び塩化スルフリルを、２．
５分ごとに、それぞれ、０．５ｇ及び０．５ｍｌで２４
回に分けて同じ分量で加えた。添加している間に、沈殿
物が生成した。添加終了後、混合物を０℃で３０分間撹
拌し、そして室温まで暖めた。該混合物を室温で一時間
撹拌し、０℃まで冷却してろ過した。その固形物を水中
に溶解し、ＣＨＣｌ₃ で抽出した。ＣＨＣｌ₃ 層を水、
次に食塩水で洗浄した。ＣＨＣｌ₃ を乾燥したら、溶媒
を除去して、５−クロロ−２−（３−メトキシカルボニ
ルプロピル）−３−イソチアゾロンを、白色固体（収率
８．９ｇ，ｍ．ｐ．５４〜６℃）として得た。

【００５３】２−（３−メトキシカルボニルプロピル）
−３−イソチアゾロンを製造するため、化合物Ｉ（１．
０２ｇ，２．５ミリモル）を蒸留エチルアセテート２５
ｍｌ中に溶解し、０℃まで冷却した。塩化スルフリル
（１．０４ｇ，７．７５ミリモル）をゆっくり滴下し、
０℃で１時間黄色の溶液を撹拌した。この間に、白色沈
殿物（５−クロロ−２−（３−メトキシカルボニルプロ
ピル）−３−イソチアゾロン（２００ｍｇ））が生成
し、これをろ過によって除去した。得られたろ液を濃縮
して、残留物をフラッシュ−クロマトグラフィ（１０％
アセトン−クロロホルム）にかけ、２−（３−メトキシ
カルボニルプロピル）−３−イソチアゾロン（１２０ｍ
ｇ）を明澄な油状物として得た。

【００５４】該イソチアゾロンのメチルエステルを、遊
離酸に加水分解した。５−クロロ−２−（３−メトキシ
カルボニルプロピル）−３−イソチアゾロン（４．０
ｇ）を酢酸６ｍｌ中に溶解した。室温で撹拌されたこの
溶液に、６ＭのＨＣｌ水溶液（７ｍｌ）を添加した。次
に、この溶液を室温で２４時間撹拌したところ、その間
に白色沈殿物が生成された。該溶液をろ過し、さらにそ
のろ液を濃縮して、より多くの同じ沈殿物（５−クロロ
−２−（３−ヒドロキシカルボニルプロピル）−３−イ
ソチアゾロン）を得た。合計の収量は２．９５ｇ（ｍ．
ｐ．１５８〜１６１℃）であった。

【００５５】２−（３−メトキシカルボニルプロピル）
−３−イソチアゾロンを、氷酢酸４ｍｌ及び６Ｎ塩酸２
ｍｌの溶液に溶解した。これを８５℃で１時間撹拌し
た。この溶液を減圧下で濃縮し、残留物を水とエチルア
セテートとの間で２回分配した。エチルアセテート層を
合わせて、乾燥し、濃縮した。得られた固形物をエチル
アセテートから再結晶化させ、明黄色の粉末を得た。

【００５６】次に、遊離酸イソチアゾロンをウシ血清ア
ルブミン（「ＢＳＡ」）及びチログロブリン（「ＴＨ
Ｙ」）に結合させた。５−クロロ−２−（３−ヒドロキ
シカルボニルプロピル）−３−イソチアゾロン（０．４
５ｇ，０．００２モル）及びｎ−Ｂｕ₃ Ｎ（０．９５
ｇ，０．００５１モル）をジオキサン（５ｍｌ）に添加
した。この撹拌懸濁液に、イソブチルクロロホルメート
（０．７７ｇ，０．００５６モル）を０℃で滴下した。
イソブチルクロロホルメートを加えたら、懸濁している
物質が溶解した。この溶液を室温で１時間撹拌した。こ
れにより、イソチアゾロン−イソブチルホルメート混合
無水物が得られ、それを単離することなく使用した。Ｂ
ＳＡを脱イオン水（２０ｍｌ）中に溶解し、続いて少量
のジオキサン（１ｍｌ）を添加した。この撹拌ＢＳＡ溶
液に、０℃で、イソチアゾロン−イソブチルホルメート
混合無水物溶液を滴下した。添加速度は、反応温度が０
℃で維持されるように行った。添加終了後、該混合物を
０℃で１時間撹拌し、そして室温まで暖め、続いて室温
で１時間撹拌した。次に、該混合物を透析バッグに移
し、２４時間透析し、さらに凍結乾燥して水を除去し
た。明白色の粉末（６５１−ＢＳＡ 複合体）（２．９
ｇ）が得られた。６５１のＴＨＹに対する複合体（６５
１−ＴＨＹ）、５７３のＢＳＡに対する複合体（５７３
−ＢＳＡ）及び５７３のＴＨＹに対する複合体（５７３
−ＴＨＹ）を同様の方法で製造した。

【００５７】実施例１Ａ−免疫化 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、アメリカ合衆国、ニューヨーク
のタコニックファーム(Taconic Farms) から取得し、表
１に示された項目にしたがって、前記実施例において製
造された６５１−ＢＳＡ、６５１−ＴＨＹ、５７３−Ｂ
ＳＡ又は５７３−ＴＨＹ複合体で免疫性を与えた。表１
中、ＣＦＡは「完全フロイントアジュバント」であり、
ＩＦＡＭは「不完全フロイントアジュバント」であり、
ＰＢＳは「生理的緩衝食塩水」であり、「ｓｃ」は皮下
であり、及び「ｉｐ」は腹膜組織内である。

【００５８】

【表１】日 数 日 付 量 アジェバント 経路 １ １２／７／８８ ３００ｕｇ ＣＦＡ ｓｃ ６３ ２／８／８９ １５０ｕｇ ＩＦＡ ｓｃ １１９ ４／５／８９ １００ｕｇ ＩＦＡ ｓｃ ３１４ １０／１７／８９ １００ｕｇ ＩＦＡ ｓｃ ４０３ １／１４／９０ ５０ｕｇ ＩＦＡ ｓｃ ４９９ ４／２０／９０ ３０ｕｇ ＰＢＳ ｉｐ ４９９ ４／２０／９０ ２０ｕｇ ＰＢＳ ｓｃ ５７３ ７／３／９０ １００ｕｇ ＰＢＳ ｉｐ

【００５９】実施例１Ｂ−イソチアゾロン抗血清用のス
クリーニング 血液試料を、上記実施例で免疫性を付与したマウスから
採取した。血清を、遠心分離によって赤血球から分離し
た。次に、血清を、競合阻害ＥＬＩＳＡ（ＣＩＥＩＡ）
を使用して活性に関してスクリーニングした。９６ウエ
ルのポリスチレンＥＩＡ（酵素阻害検定法）プレート
を、少なくとも室温で２時間又は４℃で１６時間、ＢＳ
Ａに複合した６５１（６５１−ＢＳＡ）、ＴＨＹに複合
した６５１（６５１−ＴＨＹ）、ＢＳＡに複合した５７
３（５７３−ＢＳＡ）又はＴＨＹに複合した５７３（５
７３−ＴＨＹ）の１００μｌで被覆した。非結合物質を
ＰＢＳ−Ｔの５回洗浄でウエルから洗い落とした。そし
てウエルに、緩衝剤（ＰＢＳ−Ｔ）を単独で、又は緩衝
剤中でそれぞれ２ｐｐｍに希釈された６５１か５７３の
いずれかの阻害剤を、５０μｌ収容した。次に、該ウエ
ルにマウス血清５０μｌを収容し、各血清を、緩衝剤、
６５１又は５７３（阻害剤）のいずれかと反応させた。
血清及び阻害剤又は緩衝剤との同量での組み合わせによ
り、阻害剤の最終濃度は１ｐｐｍであった。該ウエルを
室温で３０〜６０分間インキュベートした。次に、それ
らをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄して、非結合物質を除去し、
さらに、各ウエルに、ビオチニル化ウマ抗−マウスＩｇ
Ｇ（ベクター・ラボラトリーズ，Burmingame, CA））の
１μｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ収容し、上述のＥＬＩＳ
Ａ等に関する部分で説明したようにして、検定を続行し
た。

【００６０】血清中の抗体が、ウエル内の溶液中で阻害
剤の一方又は両方と反応したならば、該抗体分子又はあ
る率の該抗体分子が、阻害剤と結合し、そのために、溶
液中に安定して、洗浄工程中にプレートから除去される
抗体／阻害剤錯体を形成する。かかる場合、阻害剤への
抗体の結合によって、被覆抗原６５１−ＢＳＡに結合さ
せるために利用可能な抗体分子の数を減少させる。より
少数の抗体分子しか６５１−ＢＳＡに結合していないた
め、結合するビオチニル化ウマ抗−マウスＩｇＧ分子の
数が減少し、結合するアビジン−ペルオキシダーゼ錯体
の分子がより少なくなり、基質の加水分解が低下し、つ
いには吸光度が低くなってしまう。このデータを表２に
示す。全ての場合、阻害剤濃度は１０^-4Ｍであった。

【００６１】

【表２】 マウス 阻害率（％） ナンバー 免疫原 被覆複合体 ６５１ ５７３ ２Ａ ６５１−ＢＳＡ ６５１−ＴＨＹ ６ ０ ２Ａ 〃 ５７３−ＴＨＹ ０ ０ ３Ａ 〃 ６５１−ＴＨＹ ０ ０ ３Ａ 〃 ５７３−ＴＨＹ ０ ０ １Ｂ ６５１−ＴＨＹ ６５１−ＢＳＡ ０ ０ １Ｂ 〃 ５７３−ＢＳＡ ０ ０ ２Ｂ 〃 ６５１−ＢＳＡ ０ ０ ２Ｂ 〃 ５７３−ＢＳＡ ０ ０ １Ｃ ５７３−ＢＳＡ ６５１−ＴＨＹ ６ ７ １Ｃ 〃 ５７３−ＴＨＹ ０ ０ ２Ｃ 〃 ６５１−ＴＨＹ ０ １８ ２Ｃ 〃 ５７３−ＴＨＹ １４ ４ １Ｄ ５７３−ＢＳＡ ６５１−ＴＨＹ １０ ０ １Ｄ 〃 ５７３−ＴＨＹ ０ １２ ２Ｄ 〃 ６５１−ＴＨＹ １２ ０ １Ｅ ５７３−ＴＨＹ ６５１−ＢＳＡ ３４ ２８ １Ｅ 〃 ５７３−ＢＳＡ ４４ ２１ ２Ｅ 〃 ６５１−ＢＳＡ ７ １２ ２Ｅ 〃 ５７３−ＢＳＡ １２ １０

【００６２】これらの結果から、５７３−ＴＨＹで免疫
性を付与されたマウス１Ｅが、６５１と５７３の両方に
対して抗体反応性を有する血清を産生したことがわか
る。

【００６３】実施例２−融合 全ての方法を無菌で行ない、かつ殺菌試薬を用いて行な
った。ポリクローナル抗体を産生するマウスＩＥへ過剰
に麻酔（Ｒｏｍｐｕｍ（登録商標）／Ｋｅｔａｍｉｎｅ
（登録商標））をかけることによって殺害した。その脾
臓を取り出し、ＡＢＣ培地（バージニア州、ハリソンバ
ーグのセル・エンタープライゼズ(CellEnterpraise
s））約２０ｍｌが入っている１００ｍｍのペトリ皿に
入れた。該脾臓をＡＢＣ培地１０ｍｌに散布し、ほとん
どの脾臓細胞を採取した。残りの細胞は２１番ゲージの
針で脾臓膜から細かく切り離すことによって得た。その
量はＡＢＣ培地を含めて約５０ｍｌであり、０．１ｍｌ
の試料を取り出して、ＡＢＣ培地中、１：５０に希釈し
た。該希釈細胞をヘモサイトメータで計数して、脾臓か
ら得られたリンパ球の概算数を得た。この間、該細胞を
室温で５分間、約２００×ｇの遠心分離によってペレッ
ト状にした。

【００６４】約１．２×１０⁸ のリンパ球を脾臓から得
た。これらを１．２×１０⁷ の骨髄種細胞（ＳＰ２／０
−Ａｇ１４，ＡＴＣＣ Ｃａｔ ＣＲＬ１５８１）と混
合した。かかる細胞を再び遠心分離（室温で１０分間約
２５０×ｇ）によってペレット状にした。その上澄み液
をほぼ乾燥状態まで除去し、さらに、その細胞を、遠心
管を静かにたたいて細胞ペレットをほぐすことによって
再懸濁した。

【００６５】次に、該細胞を、３６℃に予め加温した５
０％のポリエチレングリコール１ｍｌ（ｍｗ１５００
（ＰＥＧ））で処理した。該ＰＥＧを約７５秒間かけ
て、遠心管を一定に回転させながらゆっくりと（滴状
で）添加し、ＰＥＧと接触している間、残留した細胞が
十分に混合するようにした。

【００６６】次に、該細胞の入っている遠心管を、３７
℃の水槽に１分間入れた。さらに、該管を水槽から取り
出し、１ｍｌの加温ＡＢＣ媒体を、次の６０〜７５秒間
に、遠心管を一定に回転させながら滴下し、細胞及びＰ
ＥＧが該培地と十分混合するようにした。該細胞を再び
１分間３７℃の水槽に移して、さらに該水槽から取り出
した。次の６０〜７５秒をかけて、２ｍｌのＡＢＣ培地
を、前記と同様に遠心管を一定に回転させながら添加
し、その細胞を再び１分間３７℃の水槽に移した。遠心
管を水槽から取り出し、さらに４ｍｌの加温ＡＢＣ培地
を、前記と同様に遠心管を一定に回転させながら添加し
た。該細胞を室温で１分間インキュベートし、その後、
８ｍｌの加温ＡＢＣ培地を、前記と同様に遠心管を一定
に回転させながら添加した。該細胞を室温で１分間イン
キュベートし、その後、１２ｍｌの加温ＡＢＣ培地を、
前記と同様に遠心管を一定に回転させながら添加した。
最終的に、その量は、ＡＢＣ培地の添加によって約５０
ｍｌとなった。

【００６７】該細胞を上記したように遠心分離器によっ
てペレット状にした。培地を吸引によって取り除き、細
胞をＨＭ６０ｍｌ中で再び懸濁した。次に、これらの細
胞を３０ｍｌずつ２つのアリコートに分割し、一方には
内皮細胞成長添加剤（ＥＣＧＳ（Ｓｉｇｍａから入手可
能，カタログNo. Ｅ２７５９），５μｇ／ｍｌ）を加え
て、他方には更なる添加剤は何も加えなかった。

【００６８】細胞を１００μｌ／ウエルの９６ウエルの
皿に入れて培養した。Ａ，Ｂ，Ｃを表示した皿にはＥＣ
ＧＳを加えない細胞を入れ；ＥＣＧＳを加えた細胞は
Ｄ，Ｅ，Ｆを表示した皿に入れた。その細胞を空気中Ｃ
Ｏ₂ ５％の湿潤雰囲気中でインキュベートした。

【００６９】融合後１日目、各ウエルに、適当にＥＣＧ
Ｓを加え又は加えずにＨＭ中で調製した１×ＨＡＴ培地
１００μｌを収容した。（ＨＡＴはヒポキサンチン、ア
ミノプテリン及びチミジンの混合物である。該培地で使
用した最終濃度は、５×１０^-3Ｍヒポキサンチン、２×
１０^-5Ｍアミノプテリン及び１×１０^-4Ｍチミジンであ
る。）該細胞を１４４時間休みなくインキュベートし、
その後、ＨＭ５０μｌを、ＨＡＴを加えずに、適当にＥ
ＣＧＳを加え又は加えずに、各ウエルに添加した。

【００７０】融合後約１４日目、該プレートをハイブリ
ドーマの成長コロニーの存在に関して評価した。結果は
表３に示されるとおりである。

【００７１】

【表３】 成長ハイブリドーマを有するウェルのパーセンテージ コロニー を有する 培養した ウェルの％プレート ウェル ウェル ＥＣＧＳ ウェル／コロニー Ａ ３９ ９６ − ４０．６ Ｂ ５１ ９６ − ５３．１ Ｃ ３０ ９６ − ３１．３ Ｄ ４４ ９６ ＋ ４５．８ Ｅ ４７ ９６ ＋ ４９．０ Ｆ ４０ ９４ ＋ ４１．２ 平均パーセンテージ コロニー／プレート，Ａ−Ｃ：
４１．６ 平均パーセンテージ コロニー／プレート，Ｄ−Ｆ：
４５．５ 平均パーセンテージ コロニー／プレート，Ａ−Ｆ：
４３．６

【００７２】実施例３−抗体用上澄み液のスクリーニン
グ ハイブリドーマの成長コロニーを有するウエルからの上
澄み液を、酵素結合免疫検定法（ＥＩＡ）を使用してス
クリーニングした。９６ウエルのポリスチレンＥＩＡプ
レートを、少なくとも室温で２時間又は４℃で１６時
間、ＢＳＡに複合した６５１（６５１−ＢＳＡ）の１０
０μｌ／ウエルで被覆した。非結合物質をＰＢＳ−Ｔの
５回洗浄でウエルから洗い落とし、そしてウエルに５０
μｌのＰＢＳ−Ｔを収容した。５０μｌの上澄み液又は
単独の培地（陰性対照物）をウエルに添加し、室温で３
０〜６０分間インキュベートした。次に、該ウエルをＰ
ＢＳ−Ｔで５回洗浄し、非結合物質を除去し、各ウエル
に、ビオチニル化抗−マウスＩｇＧ（ベクター・ラボラ
トリーズ(Vector Laboratories，Burmingame, CA））の
１ｍｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ収容した。該ウエルを３
０〜６０分間室温で再びインキュベートし、次に、ＰＢ
Ｓ−Ｔで５回洗浄して、非結合物質を除去した。次に、
各ウエルに１００μｌのアビジンビオチニル化セイヨウ
ワサビペルオキシダーセ錯体（ＡＢ錯体；ベクター・ラ
ボラトリーズ。ＡＢ錯体のアビジン部分は異常に高い親
和力で、安定な酵素含有錯体を形成するビオチニル化ウ
マ抗−マウスＩｇＧのビオチン部分に結合する。）を収
容した。室温で３０〜６０分間のインキュベーション
後、非結合試薬を再びＰＢＳ−Ｔでウエルから洗い落と
し、各ウエルに１００μｌのＡＢＴＳ培地（Ｋ＆Ｐ）を
収容した。吸光度（４１４ｎｍ）をフロータイターテッ
クマルチスキャン３４０ＥＩＡプレートリーダ(FLOWTit
ertek Multiscan 340 EIA Plate reader)を使用して３
０〜６０分後測定した。

【００７３】ハイブリドーマ上澄み液のスクリーニング
により、被覆抗原との反応性を有する抗体を産生する２
つのコロニーが認められた。これらのコロニーを８９−
１４７ＥＨ９及び８９−１４７ＥＣ２と命名した。これ
らの培養体を伸長させ、低温保存し、さらに下記で述べ
るように、競合阻害ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定
法）によって評価した。

【００７４】実施例４−競合阻害ＥＬＩＳＡ（ＣＩＥＩ
Ａ） ハイブリドーマの成長コロニーを有するウエルからの上
澄み液を、ＣＩＥＩＡを使用してスクリーニングした。
９６ウエルのポリスチレンＥＩＡ（酵素阻害検定法）プ
レートを、少なくとも室温で２時間又は４℃で１６時
間、ＢＳＡに複合した６５１（６５１−ＢＳＡ）１００
μｌで被覆した。非結合物質をＰＢＳ−Ｔの５回洗浄で
ウエルから洗い落とした。そしてウエルに、緩衝剤（Ｐ
ＢＳ−Ｔ）を単独で、又は緩衝剤中でそれぞれ２ｐｐｍ
に希釈された６５１か５７３のいずれかの阻害剤を、５
０μｌ収容した。次に、該ウエルに各細胞培養体からの
上澄み液５０μｌを収容し、各上澄み液を、緩衝剤、６
５１又は５７３（阻害剤）のいずれかと反応させた。上
澄み液及び阻害剤又は緩衝剤との同量での組合せによ
り、上澄み液の最終希釈度は１：２であり、阻害剤の最
終濃度は１ｐｐｍであった。該ウエルを室温で３０〜６
０分間インキュベートした。次に、それらをＰＢＳ−Ｔ
で５回洗浄して、非結合物質を除去し、さらに、各ウエ
ルに、ビオチニル化ウマ抗−マウスＩｇＧ（ベクター・
ラボラトリーズ，Burmingame, CA））の１μｇ／ｍｌ溶
液を１００μｌ収容し、上述のＥＬＩＳＡ等に関する部
分で説明したようにして、検定を続行した。

【００７５】上澄み液中の抗体が、ウエル内の溶液中で
阻害剤の一方又は両方と反応したならば、該抗体分子又
はある率の該抗体分子が、阻害剤と結合し、そのため
に、溶液中に安定して、洗浄工程中にプレートから除去
される抗体／阻害剤錯体を形成する。かかる場合、阻害
剤への抗体の結合によって、被覆抗原６５１−ＢＳＡに
結合させるために利用可能な抗体分子の数を減少させ
る。より少数の抗体分子しか６５１−ＢＳＡに結合して
いないため、結合するビオチニル化ウマ抗−マウスＩｇ
Ｇ分子の数が減少し、結合するアビジン−ペルオキシダ
ーゼ錯体の分子がより少なくなり、基質の加水分解が低
下し、ついには吸光度が低くなってしまう。

【００７６】ＣＩＥＩＡを操作して、被覆抗原、抗体、
及び検出分子（例えば、ウマ抗−ネズミＩｇＧ及びアビ
ジン−ペルオキシダーゼ錯体）の濃度を変化させること
によって、より大きな阻害を達成することができる。Ｃ
ＩＥＩＡのかかる「最適化」を使用して、高レベルの感
度を得て、モノクローナル抗体の低濃度（すなわち、高
希釈度）での使用が可能となる。

【００７７】ＣＩＥＩＡによる検定において、細胞培養
体８９−１４７ＥＨ９は唯一、一貫して被覆抗原と反応
性を有し、化合物６５１及び５７３によって阻害するこ
とができた。代表的なＣＩＥＩＡのデータを表４に示
す。

【００７８】

【表４】 培養体上澄み液のＣＩＥＩＡ 阻害剤（吸光度） 上澄み液 １ＰＰＭ １ＰＰＭ培養体ＩＤ 希釈率 なし ６５１ ５７３ ＣＦ１０ 1:2 0.485 0.419 0.479 ＥＨ９ 1:2 0.170 0.150 0.117 ＥＣ２ 1:2 0.847 0.652 0.520 培地 0.291 0.300 0.305 ＥＣ２ 1:12 0.917 0.910 0.872 ＥＨ９ 1:2.5 0.386 0.122 0.135 ＣＦ１０ 1:2.5 0.121 0.119 0.099 ＥＣ２ＩＢ８* 1:6 0.169 0.124 0.121 培地 0.108 0.100 0.098 ＥＨ９ 1:4 0.515 0.186+ 0.504+ ＊８９−１４７ＥＣ２のクローン ＋０．４ｐｐｍの阻害剤に対して試験した

【００７９】細胞培養体８９−１４７ＥＨ９によって産
生された抗体が、化合物６５１と選択的に反応したこと
を立証するため、ＣＩＥＩＡを、抗体含有上澄み液を４
つの異なる阻害剤とそれぞれいくつかの異なる濃度で反
応させたということを除いては、上記と同じように行っ
た。この処理結果を表５に示す。本発明の抗体は、同量
の他の殺生物剤よりも、６５１との阻害レベルが高いこ
とから明らかなように、他の試験された化合物よりも、
６５１と非常に強い反応性を有している。

【００８０】

【表５】 殺生物剤の検出用ＣＩＥＩＡ 阻害剤濃度 １０分 吸光度×１０００（ｐｐｍ） ６５１ ５７３ ＮＭＡ ８９３ ５０ ＮＤ* １９１ ４９０ ５１６ １０ １０６ ３４４ ５１８ ５８９ ２ １８５ ５０４ ４９６ ５１４ ０．４ ３３８ ４６１ ５１９ ＮＤ ０．０８ ４４８ ５９０ ４２９ ＮＤ ０．０１６ ４９１ ＮＤ ＮＤ ＮＤ なし ５１５，ｎ＝３ ＊ＮＤ＝測定不能 ＮＭＡ＝Ｎ−メチルマロンアミック酸

【００８１】実施例５−ハイブリドーマのクローニング 化合物６５１と反応性を有する抗体が遺伝子組成の同じ
細胞によって産生されたことを立証するためには、細胞
培養体８９−１４７ＥＨ９のクローンを発生させること
が必要であった。クローニングは、最初に８９−１４７
ＥＨ９細胞の個体群における生存可能細胞の合計数を測
定することによって行った。次に、該細胞個体群を細胞
培地１ｍｌ当り４〜５細胞の密度に希釈した。この細胞
懸濁液２００μｌを、Ｉ−ＩＶを表示した４つの９６ウ
エル細胞培養皿の各ウエル中に接種した。１４日後、顕
微鏡的評価で、細胞のコロニーの成長について各ウエル
を検査した。唯一つの細胞中心点を有するものをモノク
ローナルとした。クローニング処理の結果を下記の表６
に示す。

【００８２】

【表６】 細胞培養体８９−１４７ＥＨ９のクローンニング プレート クローンを有する 一つの中心点 一つの中心点をＩＤ ウェル を有するウェル 有する率（％） Ｉ 15 11 73.3 ＩＩ 17 12 70.6 ＩＩＩ 19 17 89.5ＩＶ 18 13 72.2 合計 17.25+/1.7 13.25+/-2.6 76.4+/-8.8

【００８３】その後、各コロニーを前記したＥＬＩＳＡ
における反応性について試験した。コロニーのうちいく
つかを、伸長のため選択し、ＣＩＥＩＡによって６５１
と５７３双方との反応性について再試験した。この試験
の結果を下記の表７に示す。

【００８４】

【表７】 化合物６５１及び５７３と８９−１４７ＥＨ９クローンとの反応性 吸光度×１０００ クローン ６５１ ５７３ＩＤ ＰＢＳ １ＰＰＭ ％Ｉ* １ＰＰＭ ％Ｉ ＩＡ５ 528 348 34.1 471 10.8 ＩＩＤ１ 060 055 <1.0 057 <1.0 ＩＤ５ 584 429 26.5 671 0.0 ＩＶＦ１２ 090 065 27.8 073 18.9 ＩＤ８ 746 807 0.0 1068 0.0 ＩＶＥ１ 818 452 44.7 539 34.1 ＩＩＩＨ６ 647 471 27.2 705 0.0 ＩＶＥ４ 595 361 39.3 539 9.4 ＩＶＨ２ 680 366 46.2 632 7.0培地のみ 063 059 <1.0 058 <1.0 ＊％Ｉ＝阻害率［各阻害剤（６５１又は５７３）で得ら
れた吸光度を、阻害剤を含まない吸光度（ＰＢＳ）で割
り、かつ１からその商を引きその差に１００を乗じるこ
とによって求められる。負数値は０．０として示す。］

【００８５】これら及びその後の検定結果に基づき、ク
ローン性細胞系８９−１４７ＥＨ９ＩＩＩＨ６を伸長
し、腹水として成長させ、精製し、及び次の検定で使用
した。

【００８６】実施例６−６５１用の定量ＣＩＥＩＡ 未知の試料における６５１の濃度を測定するためのＣＩ
ＥＩＡの有用性を立証するため、定量免疫検定法を展開
した。この検定法は、抗体の複製試料を一連の知られて
いる濃度の化合物６５１及び未知量の６５１を含有する
種々の希釈度の試料と反応させることを除いては、実施
例４で述べたように行われる。実施例４で述べたよう
に、６５１の最も高い濃度で、６５１と抗体との最大限
の相互作用が生じ、ついには吸光度値を減少させる。６
５１の中間レベルでは、吸光度値の適度の減少を引き起
こし、そして６５１の低レベルでは吸光度値の減少を僅
かに引き起こすか全く生じさせない。

【００８７】定量ＣＩＥＩＡにおいて、吸光度値と６５
１濃度の対数とをプロットすることにより標準曲線が得
られる。回帰分析法（４パラメータ論理曲線適合法）又
は他の統計的方法を使用して、その点を合わせる。次
に、未知試料における６５１の濃度を、未知試料を抗体
と反応させたウエル中の吸光度と標準曲線に関して得ら
れた値とを比較することによって、測定した。

【００８８】これらの手段を使用して、使用希釈度にお
ける製紙工場処理液(papermill fluid) 、冷却塔液及び
金属作用流体（ＭＷＦ）の実験室で得られた試料中にお
ける６５１の濃度を測定した。これらの試験の結果を、
試料中の実際の濃度と共に表７に示す。これらの結果
は、この検定法が試料中の６５１のレベルを測定するた
めに有効に使用できることを示すものである。

【００８９】

【表８】 ６５１の濃度測定値試料 みかけ６５１(ppm)¹ ＨＰＬＣ(ppm)² ＣＩＥＩＡ(ppm)³ 製紙工場 ７．５ ８．４ ５．４ ２．２５ ２．５ ３．２ ０．３７５ ０．４１ １．３ 冷却塔 ７．５ ８．４ ６．５ ２．２５ ２．５ ２．３ ０．３７５ ０．４１ １．３ ＭＷＦ ２２．５ ２１．２ ２０ １１．２５ ９．９ １１．２ ３．７５ ３．３ ０．７４ 1.みかけ（Nominal)は試料の視準値である。 2.ＨＰＬＣは一般的に使用されている標準分析方法であ
る。 3.ＣＩＥＩＡ試料は分析前に１：４に希釈した。

【００９０】冷却塔液の実験室で準備した試料の２組目
を、ＣＩＥＩＡによって、さらに上記実施例４で概説し
た手段によって２重に６５１の分析をした。これらの結
果を表９に示す。

【００９１】

【表９】 冷却水における６５１の濃度の測定値 ＣＩＥＩＡ みかけ ＨＰＬＣ １回目 ２回目 １０ ９．３ １０．４ １１．７ ３ ２．８ ３．３ ６．５ ０．５ ０．４６ ｎｄ* ０．４６ ｎｄ＝未検出

【００９２】実施例７−ＥＬＩＳＡキット Ａ．ディップスティックの構成 ディップスティックキットの構成においては、プラスチ
ックストリップをバイアルキャップに取り付け、バイア
ル中にたれ下げる。該ディップスティックの表面には、
１００ｎｇの抗−６５１抗体を付着させる２ｃｍ² の検
出領域がある。試料を６５１−ＢＳＡ複合体（２００ｎ
ｇ）溶液が入っているバイアル中に希釈した。ディップ
スティックの付いたバイアルキャップをバイアル上に螺
合させ、約１５〜３０分間インキュベートする。該ディ
ップスティックを取り外し、水又は緩衝剤ですすぎ、そ
して、アビジン−ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ）錯体の入っているバイアル上に螺合させて、１５
分間インキュベートし、さらにすすぐ。次に、該ディッ
プスティックをアジノ−ビス−エチルベンズチアゾリン
スルホン酸（「ＡＢＴＳ」）のようなＨＲＰ基質の入っ
たバイアル中に入れる。そして、イソチアゾロン濃度
を、所定のインキュベーション時間の経過後、バイアル
中の青色の強度を測定することによって評価する。

【００９３】Ｂ．膜の構成 抗−６５１抗体を膜に付着させ、該膜（１００ｎｇの抗
体を含有する約２ｃｍ² のもの）を小カップ上に置く。
試料を６５１−ＢＳＡ−ビオチン複合体（希釈度１：２
の試料からなり、複合体の合計量は２００ｎｇである）
と混合し、この溶液を該膜上に注ぐ。重力によって該溶
液が膜を通過する。次に、アビジン−ＨＲＰ溶液を該膜
上に注いで、すすぎ、さらに検出溶液（ＨＲＰ基質）を
該膜上に注ぐ。そして、イソチアゾロン濃度を、該膜上
の青色の強度を測定することによって評価する。

【００９４】実施例８−木材中のイソチアゾロン類の比
色測定 商業的方法を使用して４，５−ジクロロ−２−ｎ−オク
チル−３−イソチアゾロンを含有する溶液で圧縮処理さ
れた南部イエローパイン(Southern Yellow pine)を、ウ
エハー状（０．５×２．５ｃｍ）にカットした。これら
の木材ウエハーを、３％の脱脂乳溶液中に３０分間浸漬
した。次に、該ウエハーをＰＢＳ−Ｔで簡単にすすぎ、
さらに、５００ｎｇ／ｍｌでセイヨウワサビペルオキシ
ダーゼに共有結合している抗−６５１抗体に１５分間暴
露した。そして、該ウエハーをＰＢＳ−Ｔ緩衝剤中でそ
れぞれ３０分間２回洗浄した。該結合抗−６５１−ＨＲ
Ｐ錯体を、ＨＲＰ基質（ＡＢＴＳ）が入っているバイア
ル中にウエハーを置くことによって視認した。溶液中に
青色が現れたことから、４，５−ジクロロ−２−ｎ−オ
クチル−３−イソチアゾロンの存在が確認された。バイ
アル中の溶液の２００μｌのアリコートをとり、４０５
ｎｍで吸光度を測定した。これを、イソチアゾロンを含
有していないことを除いては同じ方法で処理した対照木
材ウエハーと比較した。次に、その吸光度値をバックグ
ラウンドに関して補正した。

【００９５】試料 Ａ₄₀₅ 対照物 ０．００２ 処理後 ０．１６５

【００９６】これらのデータは、この方法が木材又は固
形マトリクス中におけるイソチアゾロン濃度の測定に利
用可能であることを示している。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明による免疫検定法においてイソチアゾロ
ン類の４つの異なる種の結合阻害率を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチャード・ファーレル・シューマン アメリカ合衆国メリーランド州20878、ノ ース・ポトマック、ナイト・ホーク・ウェ イ 14317 (72)発明者 チャン−シエン・ファング アメリカ合衆国メリーランド州20853、ロ ックビル、ウッドクレスト・ドライブ 14535 (72)発明者 ジョン・スティーブン・チャップマン アメリカ合衆国ペンシルバニア州19002、 アンブラー、ホフマン・ロード 1272

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高分子キャリヤを、反応性基を有するイ
   ソチアゾロン類に共有結合させることを含んでなる、イ
   ソチアゾロン類と高分子キャリヤの免疫原性複合体の製
   造方法。
2. 【請求項２】 前記イソチアゾロンが２−メチル−３−
   イソチアゾロンである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 請求項１により製造された免疫原性複合
   体で動物に免疫性を付与し；該動物から抗体産生細胞を
   得て；該細胞を腫瘍細胞と融合させてハイブリドーマを
   製造し；該ハイブリドーマから、該イソチアゾロン類に
   特異的に結合することのできる抗体を産生する少なくと
   も一つのハイブリドーマを選択し；該選択されたハイブ
   リドーマから産生された抗体を回収することを含む、イ
   ソチアゾロン類との反応性を有するモノクロナール抗体
   を製造する方法。
4. 【請求項４】 前記動物がネズミである請求項３記載の
   方法。
5. 【請求項５】 前記腫瘍細胞が、マウス血漿のう腫細胞
   (plasmacytoma)又はラット骨髄腫細胞である請求項３記
   載の方法。
6. 【請求項６】 ハイブリドーマが、ＡＴＣＣ ＨＢ１１
   ４３５を識別する特性の全てを有することを特徴とする
   請求項３記載の方法。
7. 【請求項７】 前記動物がマウスである請求項３記載の
   方法であって；該マウスの脾臓から抗体産生細胞を回収
   し；ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフ
   ェラーゼ酵素中において、該抗体産生細胞を欠失のある
   マウス血漿のう腫細胞(plasmacytoma)又はラット骨髄腫
   細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成し；ハイポキ
   サンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む媒体中で
   成長させることによって、該ハイブリドーマの少なくと
   も一つを選択し；遊離又は非共役形態の５−クロロ−２
   −メチル−３−イソチアゾロンに対する抗体を産生する
   前記ハイブリドーマの少なくとも一つを同定し；該同定
   したハイブリドーマを培養して、回収可能量の範囲で前
   記抗体を製造し；該培養されたハイブリドーマによって
   産生された抗体を回収することを含む前記方法。
8. 【請求項８】 前記抗体を産生するハイブリドーマを、
   組織親和性の宿主(host)又は免疫反応が抑制された宿主
   の腹膜組織中に配置し、該宿主の腹水液から抗体を回収
   することを含む請求項３記載の方法。
9. 【請求項９】 前記選択されたハイブリドーマを、無限
   増殖性細胞系へ、クローン伸長させることを含む請求項
   ３記載の方法。
10. 【請求項１０】 試料と請求項３により製造されたモノ
    クローナル抗体とを、一定時間接触させ、その後、かか
    る接触によって得られた抗原／抗体コンプレックスの量
    を測定することによって該試料中の抗原の濃度を測定す
    ることを含んでなる、組成物中のイソチアゾロン類の存
    在又は濃度を測定する方法。
11. 【請求項１１】 さらに、混合物からの前記イソチアゾ
    ロン類の単離又は分離を含む請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 精製形態で前記イソチアゾロン類を回
    収することを含む請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 さらに、前記複合体で動物に免疫性を
    付与し；該動物から血液を採取し；該血液から血清を分
    離し；該血清からポリクローナル抗体を回収することを
    含む請求項１記載の方法。
14. 【請求項１４】 イソチアゾロン類に特異的に結合する
    ことのできるモノクローナル抗体を産生するハイブリド
    ーマを含む組成物。
15. 【請求項１５】 前記イソチアゾロンが５−クロロ−２
    −メチル−３−イソチアゾロンである請求項１４記載の
    組成物。
16. 【請求項１６】 前記ハイブリドーマが、ＡＴＣＣ Ｈ
    Ｂ１１４３５を識別する特性の全てを有する請求項１４
    記載の組成物。
17. 【請求項１７】 イソチアゾロン類に特異的に結合する
    ことのできるモノクローナル抗体又はポリクローナル血
    清を含む組成物。
18. 【請求項１８】 前記モノクローナル抗体が無限増殖性
    細胞系又はハイブリドーマから回収されたものである請
    求項１７記載の組成物。
19. 【請求項１９】 前記ハイブリドーマが、ＡＴＣＣ Ｈ
    Ｂ１１４３５を識別する特性の全てを有する請求項１８
    記載の組成物。
20. 【請求項２０】 マトリクス上に固定されている請求項
    １８記載の組成物。
21. 【請求項２１】 請求項１の方法によって製造された免
    疫原性複合体を含む組成物。