CZ202693A3 - Immunoanalysis of isothiazolones - Google Patents
Immunoanalysis of isothiazolones Download PDFInfo
- Publication number
- CZ202693A3 CZ202693A3 CZ932026A CZ202693A CZ202693A3 CZ 202693 A3 CZ202693 A3 CZ 202693A3 CZ 932026 A CZ932026 A CZ 932026A CZ 202693 A CZ202693 A CZ 202693A CZ 202693 A3 CZ202693 A3 CZ 202693A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibodies
- isothiazolone
- isothiazolones
- hybridoma
- cells
- Prior art date
Links
- JLHMJWHSBYZWJJ-UHFFFAOYSA-N 1,2-thiazole 1-oxide Chemical class O=S1C=CC=N1 JLHMJWHSBYZWJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 97
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 16
- DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N chloromethylisothiazolinone Chemical compound CN1SC(Cl)=CC1=O DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 15
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 5
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 claims description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N methylisothiazolinone Chemical group CN1SC=CC1=O BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 23
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- -1 isothiazolone compound Chemical class 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 7
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 6
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- DKQYKQNEEYKIDM-UHFFFAOYSA-N methyl 4-(3-oxo-1,2-thiazol-2-yl)butanoate Chemical compound COC(=O)CCCN1SC=CC1=O DKQYKQNEEYKIDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNWGRCYCKMOLQW-UHFFFAOYSA-N 4-(5-chloro-3-oxo-1,2-thiazol-2-yl)butanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCN1SC(Cl)=CC1=O JNWGRCYCKMOLQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical class [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 2
- MHGPTTDXFIMHMY-UHFFFAOYSA-N methyl 4-(5-chloro-3-oxo-1,2-thiazol-2-yl)butanoate Chemical compound COC(=O)CCCN1SC(Cl)=CC1=O MHGPTTDXFIMHMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 2
- JPMIIZHYYWMHDT-UHFFFAOYSA-N octhilinone Chemical compound CCCCCCCCN1SC=CC1=O JPMIIZHYYWMHDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N pentachlorophenol Chemical compound OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 125000006702 (C1-C18) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVMSWPWPYJVYKY-UHFFFAOYSA-N 2-Methylpropyl formate Chemical compound CC(C)COC=O AVMSWPWPYJVYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004189 3,4-dichlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(Cl)C([H])=C1* 0.000 description 1
- YCLSOMLVSHPPFV-UHFFFAOYSA-N 3-(2-carboxyethyldisulfanyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSSCCC(O)=O YCLSOMLVSHPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORQOHRXAJJKGK-UHFFFAOYSA-N 4,5-dichloro-2-n-octyl-3(2H)-isothiazolone Chemical compound CCCCCCCCN1SC(Cl)=C(Cl)C1=O PORQOHRXAJJKGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006283 4-chlorobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1Cl)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004217 4-methoxybenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1OC([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004172 4-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(OC([H])([H])[H])=C([H])C([H])=C1* 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 125000004648 C2-C8 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000237074 Centris Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 235000005018 Pinus echinata Nutrition 0.000 description 1
- 241001236219 Pinus echinata Species 0.000 description 1
- 235000011334 Pinus elliottii Nutrition 0.000 description 1
- 235000017339 Pinus palustris Nutrition 0.000 description 1
- 235000008566 Pinus taeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- UVSPVEYCSVXYBB-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-amino-3-oxopropanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(N)=O UVSPVEYCSVXYBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000005555 metalworking Methods 0.000 description 1
- KVQGGLZHHFGHPU-UHFFFAOYSA-N methyl 4-aminobutanoate Chemical compound COC(=O)CCCN KVQGGLZHHFGHPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/141111—Diverse hetero atoms in same or different rings [e.g., alkaloids, opiates, etc.]
Description
Tento vynález se vztahuje k metodám zjišťování nízkých koncentrací sloučenin izothiazolonu užitím metod imunoanalýzy.
Dosavadní stav techniky
Sloučeniny izothiazolonu jsou široce užívány jako biocidy u mnoha aplikací, kde je přítomna voda či vlhkost. U mnoha těchto postupů je třeba určit správné dávkování a stabilitu izothiazolonu v systému. V současné době se používá metod HPLC, které jsou náročné na čas, nevhodné a nákladné. Westinghouse Electric Corporation EP 260829 A objevila monoklonální protilátky, které reagují s chlorovanými fenoly, zejména pentachlorofenolem, dále hybridomy, které takové protilátky produkují a dále imunoanalýzu pro tyto chlorované fenoly. Ačkoli nalezení metod pro mnohé sloučeniny by vývoji metody imunoanalýzy prospělo, je velmi obtížné vytvořit vhodné buněčné linie.
Hunterův americký vynález číslo 4,865,972 odhalil test na bázi protilátky pro chemické látky podporující tvorbu enzymů (jako jsou dibenzodioxiny).Izothiazolony nepodporují tvorbu enzymů. Kohler a Milstein, Nátuře 265:495 (1975) poprvé popsali, že monoklonální protilátky proti ovčím červeným krvinkám lze připravit fúzováním B-lymfocytů produkujících protilátky s buňkami tumoru, z čehož vzniká nesmrtelný samoreprodukující hybridní klon (neboli hybridom), který může syntetizovat v buněčné struktuře ( in vitro ) nebo ve zvířeti (in vivo ) jednu určitou monoklonální protilátku.
Podstata vvnálezu
Předmětem tohoto vynálezu je vývoj další metody stanoveni izothiazolonových sloučenin.
Odhalili jsme nové protilátky, které vyhovují rozhodujícím potřebám, které nedokázala uspokojit analytická technologie.
Tyto protilátky umožňují stanovení izothiazolonu škálou rychlých, jednoduchých a nenákladných technik imunoanalýzy. Nové protilátky jsou užitečné zejména pro analyzování izothiazolonové sloučeniny ve vodě, protože izothiazolon nemusí být extrahován jako první.
Současně tento vynález obsahuje metodu výroby monoklonálních protilátek reagujících s izothiazolony a obsahuje přípravu imunogenního konjugátu izothiazolonů a makromolekulárního nosiče pomocí chemického řetězce kovalentně vázaného ke zmíněnému makromolekulárnímu nosiči a kovalentně vázaný derivát izothiazolonu obsahující reaktivní skupinu uvedeného chemického řetězce; imunizování živočichů uvedeným imunogenním konjugátem;získáni buněk produkujících protilátky z daného zvířete; fúzování těchto buněk s buňkami tumoru pro vznik hybridomft; z daných hybridomft selektování alespoň jednoho, který tvoří protilátky reagující s danými izothiazolony; a dále získání vytvořených protilátek ze selektovaného hybridomu.
Vynález je také zaměřen na imunogenní konjugáty izothiazolonft a makromolekulárního nosiče a na metody
Přípravy takových konjugátů.
Vynález dále obsahuje metodu přípravy polyklonálních protilátek reagujících s izothiazolony,která zahrnuje získání imunogenního konjugátu jak je výše popsáno;
imunizaci zvířete daným konjugátem; odebrání krve z tohoto zvířete; separaci séra z této krve; dále pak získání polyklonálních protilátek z tohoto séra.
Vynález se zaměřuje na proti látky,proces přípravy protilátek, analytické, diagnostické, výzkumné, separační a ostatní metody užití protilátek a sloučenin obsahujících protilátky pro taková užití. Dále se vynález zaměřuje na hybridomy, které produkují monoklonální protilátky a na metody přípravy těchto hybridomů.
Graf 1 znázorňuje procentuální inhibici vázání čtyř různých druhů izothiazolonů při imunoanalýze podle tohoto návrhu.
Izothiazolony jako třída jsou velmi reaktivní elektroíily mající poměrnou konstantu prvního řádu pro reakci s thioly 1053x103mol./sek. (P.J.Collier et al.,J.Appl.Bacteriol., 69 : 578-584, 1991). Také 5-chloro-2-methy1-3-izothiazolon má schopnost dalšího reagování po reakci za otevření kruhů s thioly. Je známo, že krevní sérum a červené krvinky obsahuji vysokou hladinu glutathionu, redukované thiolové sloučeniny.
Bezprostředně po vnesení izothiazolonů do bovinniho séra nejsou izothiazolony detegovatelné bioanalýzou, UV spektroskopii nebo HPLC (ProclinR 300 product bulletin, Rohm and Haas Company, Philadelphie, PA), zahrnující reakci izothiazolonu s nukleofilem a destrukci struktury inertního kruhu. Tato rychlá reakce izothiazolonů s nukleofily, o které ge ví, že je přítomna v séru, by vedla k předpokladu, že netečný izothiazolon vnesený do živočicha za účelem vyvolání tvorby protilátek by nevydržel netečný dostatečně dlouho, aby mohl reagovat s vhodnými prvky imunitního systému. Je proto zcela neočekávané, že protilátky proti izothiazolonftm mohou být indukovány.
Užití polyklonálních protilátek je možné, avšak monoklonální protilátky jsou vysoce preferovány. Monoklonální protilátky jsou odvozeny z klonu jednoho B-lymfocytu (hybridomu) diky čemuž jsou velmi specifické a homogenní.Takový hybridom je ve skutečnosti samoreprodukující buněčná továrna, která může vyrábět potenciálně neomezenou zásobu protilátky s jedinečnou předem definovanou specifikací.
I když monoklonální protilátka podle tohoto objevu byla vyvinuta proti 5-chloro-2-methyl-3-izothoazolonu(651), má zkříženou reaktivitu s ostatními izothiazolony, např.2-methy1-3-izothiazolonem (573), např.-dichloro-2-n-octy1-3-izothiazolonem (287) a 2-n-octyl-3-izothiazolonem (893) jak je vidět na obr.l.
Izothiazolony přednostně použitelné pro tento objev mají vzorec ,0
Y
Kde R1 a R2 jsou nezávislý vodík, halogen nebo (C1-C4) alkylová skupina. Tyto skupiny lze alternativně spojit, a tak vytvořit nasycený, nenasycený nebo. aromatický 5- či
6-členný uzavřený uhlíkový kruh; Y je vodík, nesubstituovaná nebo halogenem substituovaná (Ci-Cig) alkylová skupina, nesubstituovaná nebo halogenem substituovaná alkenylová nebo alkynylová skupina se 2 až 8 uhlíky, nesubstituovaná nebo halogenem substituovaná (Cg-Cg) cykloalkýlová, (C?-Cio) aralkylová nebo halo-, (C1-C4) alkyl- nebo (C1-C4) alkoxysubstituovaný (C?-Cio) aralkyl, nebo aryl nebo halo-, (C1-C4) alkyl- nebo (C1-C4) alkoxy-substituovaná arylová skupina z až 10 uhlíkových atomů.
Vzorové substituenty Y zahrnují methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, hexyl, oktyl, cyklohexyl, 4-methoxyfeny1,
4-chlorofeny1, 3,4-dichlorofenyl, benzyl, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzy1, fenethyl, 4-f enylbuty 1, chloromet-hyl, chloropropy1, vodík a pod.
Nejvhodnějéí z izothiazolonů je 5-chloro-2-methy1-3-izothiazolon.
Monoklonální protilátky vznikají postupem, který se skládá z následujících kroků : příprava imunogenního konjugátu izothiazolonů a makromolekulárního nosiče, imunizování zvířete konjugátem, získání buněk produkujících protilátky z tohoto zvířete, fúze buněk s buňkami tumoru ke vzniku hybridomů, vyselektování alespoň jednoho z hybridomů produkujícího protilátky reagující s izothiazolony a získání vyprodukovaných protilátek z vyselektovaného hybridomu.
Metoda in vivo produkování monoklonálních protilátek reagujících s izothiazolony zahrnuje intraperitoneální aplikaci hybridomu, který produkuje tyto protilátky, do hostitele, který je histokompatibilní nebo má potlačenou imunitu. Dále metoda zahrnuje získání vyprodukovaných protilátek z ascitu hostitele. Kontinuální buněčná linie, která produkuje monoklonální protilátky proti izothiazolonům se připravuje vytvořením imunogenního konjugátu izothiazolonů a makromolekulárního nosiče, imunizováním zvířete tímto konjugátem, získáním buněk produkujících protilátky z tohoto zvířete, fúzováním buněk produkujících protilátky s buňkami tumoru za účelem vytvoření hybridomu, vyselektováním hybridomu produkujícího protilátky reagující s izothiazolony a vytvořením buněčné linie pomocí klonování selektovaného hybridomu. Protilátky vytvořené touto buněčnou linií jsou označovány jako protilátky anti-651.
Ke zjištění přítomnosti nebo koncentrace izothiazolonů ve vzorku se přidávají monoklonální protilátky reagující s izothiazolony a přítomnost nebo koncentrace izothiazolonů je stanovena pomocí imunoanalýzy, kdy monoklonální protilátky jsou užity jako činidlo.
Monoklonální protilátky je vhodné vázat na přijatelný nosič. Protilátka anti-651 může být konjugována s enzymem křenovou peroxydázou (HRP) za užití standardního postupu. Tento komplex enzym-protilátka lze použít jako imunologické barvivo k určení lokalizace izothiazolonů v pevných látkách jako je dřevo, kůže a plasty. Hmota určená ke zkoumání je rozdělena na tenké řezy podle příslušné metody, a pak inkubována s komplexem enzym-protilátka po dobu, po kterou reaguje s izothiazolonem nebo izothiazolony. Po inkubaci je nenavázaný komplex enzym-proti látka odstraněn vymytím v pufru, jako je PBS-Tween. Dále je vzorek látky inkubován se substrátem enzymu, k němuž je komerčně dostupná řada chromogenních sloučenin. Vzorek je inkubován se substrátem v takovém objemu, aby obarvený produkt nedifundoval z reakčniho místa. Alternativně může být substrát zabudován do membrány, která překrývá zpracovávaný substrát. Příkladem takovéhoto produktu je Enzygraphic Web od International Biotechnologies lne. (IBZ). Izothiazolon je lokalizován vizuálním nebo mikroskopickým vyšetřením vzorku nebo membrány impregnované substrátem.
Alternativou k užití protilátky konjugované s enzymem je užiti feritinu nebo zlatém značené protilátky nebo použiti radioaktivně značených protilátek. Tyto protilátky vyžadují expozici zpracovávaného vzorku na fotografický film.
Protilátku lze také použít ke stanovení obsahu a koncentrace izothiazolonů v pevných látkách, jako je například dřevo, plastická hmota nebo kůže. Pevnou látku lze testovat na přítomnost izothiazolonů prosycením řezů této látky tekutinou obsahující činidlo blokující bílkoviny, jako je odtučněné mléko nebo bovinní sérový albumin (BSA) po dobu 30-60 minut. Sezy jsou pak krátce vymyty v PBS-Tween (PBS-T) pufru a 15 min. exponovány protilátkou anti-651, která je kovalentně vázaná s křenovou peroxidázou. Poté jsou řezy po určitou dobu dvakrát vymyty v PBS-T pufru. Vazbu komplexu anti-651-HRP lze zviditelnit v kyvetě obsahující HRP substrát, jako např. ABTS (2, 2 -azino-bis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina). Alternativně lze substrát enzymu aplikovat na povrch dřeva buď jako roztok nebo jako substrát vázaný na pevný nosič, jako je obchodně dostupný Enzygraphic Web (IBI). Zabarvení indikuje přítomnost izothiazolonu a intenzita zbarvení se vztahuje ke koncentraci izothiazolonu.
K odstraněni nebo k izolaci izothiazolonft ze směsi lze užít postupu na bázi selektivní imunologické reakce, ve které je jako protilátka užita monoklonální protilátka reagující s izothiazolony.
Kompozice k izolaci či odstranění izothiazolonu ze směsi obsahuje účinné množství monoklonální protilátky reagující s izothiazolonem vázaným na vzorek nebo ve směsi s nosičem.
Polyklonální protilátky reagující s izothiazolony jsou produkovány postupem skládajícím se z přípravy imunogenního konjugátu izothiazolonu a makromolekulárního nosiče, imunizace zvířete konjugátem, odběru krve zvířeti, separace séra z krve a získání protilátek ze séra.
Imunogenní kovalentně kovalentním konjugát obsahující izothiazolonovou sloučeninu vázanou na makromolekulám! nosič vzniká připojením chemického řetězce chemického k makromolekulárnímu nosiči a kovalentním připojením derivátu izothiazolonu, který obsahuje reaktivní skupinu, k chemickému řetězci, a tudíž vytváří imunogenní konjugát.
V daných souvislostech mají monoklonálni protilátky v tomto vynálezu vlastnosti monoklonálnich protilátek tvořených buněčnou linií hybridomu ATCC HB 11435 nebo jeho mutantQ či variant. ATCC HB 11435 je biologicky čistá kultura dostupná ze stálé sbírky American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Park Lawn Drive,Rockvi11e,Mary1and USA 20852 a byla uložena 14.5.1991. ATCC HB 11435 byla vytvořena fúzí myšího B lymíocytu a buňky myšího plasmocytomu. Imunoglobuliny (protilátky) vytvořené těmito hybridomy jsou třídy IgG. Monoklonálnost ATCC HB 11435 protilátek byla zjištěna reklonováním hybridomů, z nichž vznikly.
Monoklonálni protilátky ATCC HB 11435 zabrání jiným monoklonálním protilátkám, které byly vytvořeny jinými hybridomy, v reakci s 5-chloro-2-methyl-3-izothiazolonem.
Hybridomy a kontinuální buněčné linie lze připravit:
a) vytvořením imunogenního konjugátu makromolekulárního nosiče a daných izothiazolonft proti kterým je protilátka požadována;
b) imunizováním zvířete tímto konjugátem;
c) získáním buněk produkujících protilátku ze zvířete
d) fúzí buněk produkujících protilátku s buňkami tumoru za účelem vzniku hybridomu;
e) vyhledáním mezi hybridomy toho, který produkuje protilátky reagující s imunogenními konjugáty podle
a) k vytvoření buněčné linie; í) vyhledáním mezi hybridomy toho, který produkuje protilátky reagující s volnými izothiazolony; g) klonováním.
Monoklonální protilátky lze získat ze selektovaného hybridomu nebo hybridomů předtím nebo poté, co jsou klonováním rozšířeny do buněčné linie.
Alternativně lze buňky, kromě slezinných, užit ke tvorbě protilátek proti izothiazolonům. Takto vzniklé hybridomy lze použít k vytvoření monoklonálních protilátek podle vynálezu kultivováním ve vhodném mediu a získáním protilátek z media.
Látky s molekulární váhou 1000 nebo méně, jako je
5-chloro-2-methy1-3-izothiazolon (molekulární váha 152), nevyvolávají běžně tvorbu protilátek, t.j. jsou neimunogenní. Takové látky mohou však být často chemicky vázány na větší imunogenní molekulární nosič jako je j
sacharid nebo bílkovina, aby vyvolaly tvorbu protilátek proti menší substanci, známé jako hapten. Obecné techniky pro tvorbu imunogenního konjugátu haptenu a makromolekulárního nosiče jsou v oboru známy. Například viz patent US 4,456,691 udělený Stárkovi, vydaný 26.6.1984 a
Albro et.al., Toxicol Appl. Pharmacol, 50. 137-146 (1979).
Metody Albro haptenu k chemického dvoufunkční et.al. a Stark se zabývají kovalentním vázáním makromolekulárnímu nosiči prostřednictvím můstku nebo řetězce. Chemický řetězec je molekula, jež obsahuje reaktivní skupiny na g
.1 opačných koncích. Reaktivní skupiny dovolují chemickému řetězci reagovat a reaktivními skupinami na mokromolekule a na haptenu, takže jeden konec chemického řetězce je k haptenu kovalentně vázán. Chemický řetězec je nejdříve připojen k haptenu a výsledná sloučenina se připojí k makromolekulárnímu nosiči prostřednictvím reaktivní skupiny na opačném konci chemického řetězce.
Je známo, že protilátky utvořené proti malým chemickým sloučeninám konjugované s bílkovinným nosičem mají tendenci rozpoznat nejen strukturu sloučeniny, ale také struktury řetězce mezi sloučeninou a bílkovinou a dokonce struktury bílkoviny blízké místu připojení řetězce. Výsledkem takového rozpoznávání pomocných struktur je neschopnost nebo značně snížená schopnost protilátky vázat se na volné sloučeniny. To je zejména problém monoklonálních protilátek. Tento problém je třeba překonat mají-li být monoklonální protilátky proti chemickým sloučeninám užitečné pro kvantitativní analýzu. Překvapivě jsme odhalili protilátky, které vykazují tuto íunkci s izothiazolonovými sloučeninami a tím se vyřešil dlouhodobý požadavek v oboru.
Poté co byl imunogenní konjugát vytvořen, je užíván k imunizování hostitelského zvířete známými technikami. Tyto techniky obvykle vyžadují naočkování, ale mohou vyžadovat i jiné zpftsoby aplikace. K vytvoření imunogenní odpovědi u hostitelského zvířete je aplikováno dostatečné množství konjugátu.
K tvorbě protilátek proti konjugátu lze použít kteréhokoli hostitele. Obecně užívaná zvířata zahrnují králíky a hlodavce jako jsou krysy a myši. V tomto vynálezu jsou přednostně užívány myši a krysy.
Poté, co bylo zvíře imunizováno, a uběhla dostatečně dlouhá doba potřebná k tvorbě protilátek proti konjugátu je možno získat protilátky známými technikami. Běžná metoda zahrnuje odběr krve ze zvířete a oddělení séra. Sérum, které obsahuje protilátky proti izothiazolonům, užívaným jako hapten při přípravě konjugátu, lze použít jako antisérum proti izothiazolonům. Alternativně lze ze séra získat protilátky. Aíinitní puriíikace je přednostně užívaná technika pro získání purifikovaných polyklonálních protilátek proti izothiazolonům ze séra.
Buňky produkující monoklonální protilátky se získávají z imunizovaného zvířete. Ačkoli lze použít kterékoli buňky produkující protilátky, je dávána přednost B lymfocytům získaným ze sleziny zvířete.
Pro vznik hybridomů jsou fúzovány buňky produkující protilátky s buňkami tumoru. Pojem buňka tumoru zde znamená jakoukoli buňku schopnou fúzování s buňkou produkující protilátku za účelem vytvořeni hybridní nesmrtelné buňky, tedy buňky, která je schopna trvalého růstu in vitro. Přednostně užívané buňky tumoru jsou buňky produkující protilátky, které jsou transformovány a které ztratily svou schopnost vyrábět imunoglobulin. Patří mezi ně buňky krysího myelomu a buňky myšího plasmocytomu. Preferovány jsou zejména tyto dva typy buněk, které jsou deficitní v enzymu hypoxanthinguaninfosforibosy1 transferáze (HGPRT), který umožňuje selekci hybridomů z ne fúzovaných buněk produkujících protilátku nebo buněk plasmocytomu či myelomu při pěstování v médiu obsahujícím hypoxanthin, aminopterin a thymidin.
Jsou známy a dostupné různé buňky tumoru použitelné pro fúzováni s buňkami produkujícími protilátku. Jedním takovým typem je buněčná linie myšího plasmocytomu P3-X63-Ag8.653., kterou popsal Kearney, J. Immunology, 123. 1548 (1979). Jiná buněčná linie je linie krysího myelomu YB2.0, kterou popsal Milstein, J.Cell Biology, 93:576-582 (1982). Tyto buněčné linie jsou dostupné z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, kde jsou vedeny pod značkou ATCC CRL 1580, respektive ATCC CRL 1662.
Je třeba poznamenat, že buňka produkující protilátku a buňka tumoru mohou pocházet z odlišného živočišného druhu. Viz například Nowinski et.al., Science, 210: 537 (1980).
Jak již bylo dříve zmíněno, poté co jsou buňky zfázovány je třeba oddělit hybridomy od nezfúzovaných buněk. Buňky produkující protilátku normálně umírají po několika dnech v kultuře, ale buňky tumoru jsou nesmrtelné. Avšak použitím buněk tumoru, které jsou deficitní na HGPRT a při pěstování fúzovaných buněk na mediu obsahujícím hypoxanthin, aminopterin a thymidin se budou hybridomy přirozeně selektovat, protože buňky tumoru nejsou schopny v takovém mediu přežít. Lze však také užít jiné známé selekční techniky.
Poté,co jsou hybridomy vyselektovány, jsou vyhodnoceny pro stanovení, které z nich produkují protilátky proti izothiazolonům. K vyhodnocení supernatantu hybridomů lze užít různé imunoanalýzy známé v odborných kruzích. Je třeba pečlivě identifikovat hybridomy, které produkují monoklonální protilátky pouze proti izothiazolonům na rozdíl od těch, které produkují protilátky proti komplexu izothiazolon-makromolekulární nosič. Monoklonální protilátky, které jsou žádané a užitečné a které popisuje tento vynález jsou ty, které reagují s volnými, to je nekonjugovanými a nevázanými izothiazolony.
Přednostně užívanou selekční technikou je prvotní vySetření k identifikaci hybridomů konjugátu nebo proti pak vySetřeny kompetitivní enzymovou imunoanalýzou (EIA) tvořících protilátky proti izothiazolonům. Hybridomy jsou inhibiční enzymovou imunoanalýzou (CIEIA), která hodnotí schopnost volného izothiazolonu jako je 5-chloro-2-methyl-3-izothiazolon inhibovat vazbu monoklonálních protilátek proti izothiazolonu a/nebo bílkovinnému nosiči. ZkouSka CIEIA je prováděna metodou podle Huntera et.al., FEBS Lett. 149:147-151 (1892).
Poté,co hybridomy produkující monoklonální protilátky jsou vyselekt.ovány, lze protilátky získat z těchto hybridomů známými technikami. Obecně se osvědčuje klonování jednoho nebo více hybridomů produkujících monoklonální protilátku a jejich namnožení do souvislé buněčné linie, kterou lze použít k produkci monoklonálnich protilátek ve velkém.
Výš© zmíněné metody produkce monoklonálních protilátek jsou metodami in vitro. Postup in vivo k produkci monoklonálních protilátek proti izothiazolonům zahrnuje naočkování hybridomu produkujícího protilátky intraperitoneálně do histokompatibilniho hostitele nebo do hostitele s potlačenou imunitou. To zapříčiní, če hostitel vytváří ascitální tumory, které pak produkují tekutinu obsahující monoklonální protilátky vytvořené hybridomem. Po uplynutí dostatečně dlouhé doby, aby se vytvořily protilátky v dostatečném množství, lze tyto získat již známými technikami. Například lze ascitální tekutinu odebrat a získat monoklonální protilátky v čisté formě aíinitní purifikací. Tato metoda je zejména vhodná pro tvorbu monoklonálních protilátek v množstvích pro komerční účely.
Tak jako je možno vyvinout řadu odlišných systémů pro tvorbu monoklonálních protilátek reagujících s izothiazolony, může z těchto metod vzniknout škála monoklonálních protilátek odlišných od protilátky popsané v příkladech níže. Avšak monoklonální protilátky, jejichž tvorba je umožněna zde uvedenými technikami, zcela jasně spadají do tohoto vynálezu. Významným rysem těchto protilátek pro účely našeho vynálezu je kromě jejich monoklonálnosti jakákoli reaktivita s izothiazolony bez ohledu na druh a původ, izotyp, molekulární specificitu, afinitu, metodu produkce a nebo na daný typ hybridomu vyvinutý při jejich tvorbě.
Monoklonální a polyklonální protilátky lze ušít k identifikaci izothiazolonů, konkrétně
5-chloro-2-methyl-3- izothiazolonů v látkách a ke stanovení koncentrace sloučeniny v těchto látkách. Mezi tyto materiály patři například půda, voda, potraviny a tělesné tekutiny. Při použití jako reagens v různých metodách imunoanalýzy ke stanoveni koncentrace izothiazolonů poskytuje tento vynález zlepšenou analýzu. Detekce je vhodná, rychlá, citlivá a specifická. Imunoanalýzy, při kterých lze užít protilátky z tohoto vynálezu, zahrnuji - nikoli vSak výhradně - radioimunoanalýzu, kompetitivní imunoprecipitační imunoanalýzu, enzymově značenou imunoabsorbční analýzu a imunofluorescenční analýzu. Obecně preferovanými protilátkami jsou monoklonální protilátky z tohoto vynálezu, ačkoli při jistých postupech je dávána přednost polyklonálním protilátkám.
Činidlo pro stanovení přítomnosti nebo koncentrace izothiazolonů v látce obsahuje určitou koncentraci protilátek proti chemickému agens ke stanovení přítomnosti sloučeniny nebo k vyhodnocení jejího množství. Protilátky lze míchat s a nebo navázat na jakýkoli vhodný nosič, jako jsou částice latexu nebo plastiková mikrotitrační destička. Protilátky lze také konjugovat s enzymem nebo barvit nebo radioaktivně značit v závislosti na tom, jaká imunologická metoda je použita. Současně jakýkoli testovací systém, který užívá monoklonální nebo polyklonální protilátky proti izothiazolonům včetně 5-chloro-2-methy1-3-izothiazolonu je zahrnut do tohoto vynálezu.
Monoklonální a polyklonální protilátky lze také užít k izolaci, purifikaci, neutralizaci a/nebo získání izothiazolonů z imunologické s izothiazolony komplexních směsí roztoků na bázi selektivní reakce. Užití protilátek reagujících Představuje zlepšení známých metod.
protilátkám před specifičnosti a množstvích lze průmyslovém nebo monoklonálnim
Přednost je dávána polyklonálními. Vzhledem ke své velké dostupnosti ve skutečně neomezených monoklonální protilátky užít v širokém obchodním měřítku. Například protilátky anti-651 jsou užitečné k separaci a purifikaci 5-chloro-2-methyl-3-izothiazolonu ze směsi jiných izothiazolonů nebo podobných organických sloučenin. Směs je kontaktována s imobilizovanými monoklonálnimi protilátkami proti 5-chloro-2 -methyl-3-izothiazolonu, které separují 5-chloro-2-methy1 -3-izothiazolon ze směsi tvořením zmobilizovaných komplexů 5-chloro-2-methyl-3-izothiazolonu navázaného na protilátku. Poté co je směs odstraněna, je 5-chloro-2-methy1-3-izothiazolon oddělen od protilátek a získán v čistém stavu pomocí známých technik.
Kompozice užívaná k purifikaci nebo získání izothiazolonů z komplexní směsi obsahuje účinné množství monoklonální protilátky zmobilizované na vhodné hmotě nebo ve směsi s vhodným nosičem, aby byla umožněna reakce a vazba s izothiazolony. Avšak pro některé směsi mohou být preferovány polyklonální protilátky.
Monoklonální použi telnými a funkcí protilátky podle tohoto vynálezu jsou tedy činidly pro výzkum zabývající se strukturou izothiazilonů, zejména 5-chloro-2-methy1-318
-izothiazolonu. Jejich specificita dovoluje je užít pro analýzy imunochemické a strukturní aktivity těchto látek, a činí je použitelnějšími pro tyto aplikace než méně specifické polyklonální protilátky.
Kompozice jsou také použitelné jako činidla ve výzkumu.
Následující neomezující příklady ilustrují několik možnosti využití tohoto vynálezu.
Příklady, provedení, .yy.nálg,au
Příklad 1 : Syntéza imunizačnich konjugátfit
Thionyl chlorid (71.38 <3, 0.6 mol) a pyridin (0.5 ml) byly přidány k 3.3-dithiodipropionové kyselině (21.03 g,0.1 mol) za vnějSího chlazení. Tato směs byla míchána při laboratorní teplotě přes noc. Přebytek thionyl chloridu byl odstraněn ve vakuu, aby byl získán 3.3 -dithiodipropiony1 chlorid ve formě světle jantarového oleje (23.7 <3, 100 sé výtěžek), který byl užit v dalSím kroku bez purifikace.
Směs methyl 4-aminobutyrátu.HC1 (37.2 g, 0.242 mol) a triethylaminu (67.8 ml, 0.486 mol) v ethylen dichloridu (EDC, 300 ml) byla míchána po 30 minut při laboratorní teplotě. 3.3 -dithiodipropiony1 chlorid byl rozpuštěn v 50ml EDC a přidán po kapkách za chlazení k míchanému roztoku. Teplota byla udržována přibližně na 25 »C. Směs byla pak míchána přes noc. Směs byla pak nalita do vody a organická vrstva byla separována. Organická vrstva byla pak promyta nasyceným roztokem NaHCOa, vodou a pak vysolena. Roztok byl pak vysušen a zkoncsntrován na polotuhý hnědý zbytek. Tento zbytek byl triturován v ethyl acetátu za chlazení, aby byl získán 3.3 -dithio-di-N-(3-methoxykarbonylpropy1)propionamid (sloučenina I) jako bělavá pevná látka, která byla odfiltrována a vysušena (20.4 g).
Sloučenina I byla cyklizována na izothiazolon. 3.3'-dithio-di-N-(3-methoxykarbonylpropy1)propionamid (12.0 g, 0.029 mol) a sulfuryl chlorid (19.8 g, 0.147 mol) byly vloženy současně na jednu hodinu do láhve obsahující chlazený (0’C) a míchaný ethyl acetát (120 ml). Amid a sulfuryl chlorid byly přidávány ve 24 stejných dávkách po 0.5 g respektive 0.5 ml vždy po 2.5 minutách. Během 3míchávání vznikala sraženina. Poté co bylo přidávání skončeno, byla směs míchána při 0°C po dobu 30 minut a pak ponechána, aby se zahřála na laboratorní teplotu. Směs byla míchána jednu hodinu při laboratorní teplotě, ochlazena na 0°C a zfiltrována. Pevný podíl byl rozpuštěn ve vodě a extrahován CHCI3. Vrstva CHCI3 byla promyta vodou a pak vysolena, Poté co byl CHCI3 vysušen, bylo rozpouštědlo odstraněno, aby byl získán 5-chloro-2-(3-methoxykarbonylpropyl)-3-izothiazolon jako bílá pevná látka (výtěžek 8.9 g, bod tání 54-56 ”C).
Při přípravě 2-(3-methoxykarbonylpropy1)-3-izothiazolonu byla sloučenina I rozpuštěna v 25 ml destilovaného ethyl acetátu a ochlazena na 0°C. Sulfuryl chlorid (1.04 g, 7.75 mmol) byl přidáván pomalu po kapkách a žlutý roztok byl míchán při 0’C po dobu jedné hodiny. Během této doby se vytvořila bílá sraženina (5-chloro-220 (3—methoxykarbonyIpropy1)—3—isothiazolonu (200 mg), která byla odstraněna filtrací. Výsledný filtrát byl zkoncentrován a ze zbytku byl chromatograficky ( 10 % aceton-chloroform) získán 2-(3-methoxykarbonyIpropy1)-3-izothiazolon (120 mg) ve formě čirého oleje.
Methylester izothiazolonů byl hydrolyzován na volné kyseliny. 5-chloro-2-(3-methoxykarbonyIpropy1)-3-izothiazolon (4.0 g) byl převeden do 6 ml kyseliny octové. K tomuto roztoku byl za stálého míchání při laboratorní teplotě přidán 6 M vodný roztok HC1 (7 ml). Tento roztok byl pak míchán při laboratorní teplotě po dobu 24 hodin. Během této doby se vytvořila bílá sraženina. Roztok byl zfiltrován a filtrát dále koncentrován, aby bylo získáno více této bílé sraženiny (5-chloro-2-(3-hydroxykarbony1propyl)-3-izothiazolon). Celkový výtěžek byl 2.95g (b.t.158-161eC).
2-(3-methoxykarbonyIpropy1)-3-izothiazolon byl rozpuštěn v roztoku 4 ml ledové kyseliny octové a 2 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové a míchán při 85 »C jednu hodinu. Roztok byl zkoncentrován ve vakuu a zbytek byl nadvakrát rozdělen ve vodě a ethylacetátu. Vrstvy ethylacetátu byly spojeny, vysušeny a zkoncentrovány. Výsledná pevná látka byla rekrystalizována z ethylacetátu jako světle žlutý prášek.
Volné kyselé izothiazolony byly pak navázány na bovinní sérový albumin (BSA) a thyroglobulin (THY). 5-chloro-2-(3-hydroxykarbonylppropyl)-3-izothiazolon (0.45 g, 0.002 mol) a n-BugN (0.95 g, 0.0051 mol) byly přidány k dioxanu (5 ml). K této suspenzi byl za stálého míchání přidán izobutyIchloroíormát (0.77 g, 0.0056 mol) po kapkách při teplotě 0 °C. Během přidáváni izobutyIchloroíormátu se suspendovaný materiál rozpustil. Tento roztok byl míchán při laboratorní teplotě po dobu jedné hodiny. Byl získán směsný anhydrid izothiazolonu a izobuty1 formátu, který byl užit bez izolace. BSA byl rozpuštěn v deionizované vodě (20 ml), načež bylo přidáno malé množství dioxanu (1 ml). K tomuto roztoku BSA míchanému při 0 ’C byl po kapkách přidán roztok směsného anhydridu izothiazolonu a izobuty1 formátu. Poměr přidávání byl takový,aby reakční teplota byla udržena na 0’C. Poté co přidávání bylo ukončeno byla směs míchána při 0°C po dobu jedné hodiny, pak zahřáta na laboratorní teplotu a následně míchána při laboratorní teplotě 1 hodinu. Směs byla pak přenesena do dializačního vaku a dializována 24 hodin, a pak lyofilizována, aby byla odstraněna voda. Tak byl získán světlý bílý prášek (651-BSA konjugát)(2.9 g). Konjugáty 651 s THY (651-THY), 573 s BSA (573-BSA) a 573 s THY (573-THY) byly připraveny podobným způsobem.
Příklad IA : Imunizace
Myši BALB/σ byly získány od Taconic Farma, New York, USA a byly imunizovány konjugáty 651-BSA, 651-THY, 573-BSA nebo 573-THY připravenými v předchozím příkladu podle schématu uvedeného v Tabulce I, ve které CFA je kompletní Freudovo adjuvans, IFAM nekompletní Freudovo adjuvans, PBS je pufrovaný fyziologický roztok, sc je podkožní a ip je intraperitoneálni .
sc je podkožní a i
Tabulka I
Den | Datum | Množství | Adjuvans | Cesta |
1 | 7.12.88 | 300ug | CFA | sc |
63 | 8.2.89 | l50ug | IFA | sc |
119 | 5.4.89 | 100ug | IFA | sc |
314 | 17.10.89 | 100ug | IFA | sc |
403 | 14.1.90 | 50ug | IFA | sc |
499 | 20.4.90 | 30ug | PBS | iP |
499 | 20.4.90 | 20ug | PBS | sc |
573 | 3.7.90 | 100ug | PBS | ip |
Příklad 1B : | Vyšetření na | antiséra | proti izothiazolonu | |
Vzorky krve | byly odebrány z imunizovaných | myši z výše | ||
uvedeného příkladu. Séra | byla oddělena od červených krvinek | |||
centri fugací. | Byla vyšetřena aktivita sér | za použití | ||
kompetitivně | inhibiční | ELISA | (CIEIA). | 96-jamkové |
polystyrénové ElA (enzymatická inhibiční analýza) destičky byly pokryty 100 μΐ 651 konjugované s BSA (651-BSA), 651 konjugované s THY (651-THY), 573 konjugované s BSA (573-BSA) nebo 573 konjugované s THY (573-THY) po dobu nejméně dvou hodin při laboratorní teplotě nebo po 16 hodin při 4 °C. Nenavázaný materiál byl z jamek vymyt pětinásobným promytím PBS-T. Do jamek bylo přidáno 50 μΐ samotného pufru (PBS-T) nebo inhibitorft, buď 651 nebo 573, vždy ředěných na 2 ppm v pufru. Pak bylo do jamek přidáno 50 μΐ myšího séra, takže každé sérum reagovalo buď s pufrem nebo 651 nebo 573 (inhibitory). Kombinace stejných objemů séra a inhibitorů nebo pufru vyústila v konečnou koncentraci inhibitoru 1 ppm. Jamky byly inkubovány po 30-60 minut při laboratorní teplotě, pak byly promyty 5x PBS-T, aby byl odstraněn nenavázaný materiál a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ roztoku 1 gg/1 ml biotinilovaného koňského protimyšího IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a analýza pokračovala jak je výše popsáno pro ELISA.
Pokud by byly protilátky v séru reaktivní s jedním nebo s oběma inhibitory v roztoku v jamkách, molekuly protilátek nebo určité procento těchto molekul by se vázalo k inhibitorům, a tak by vytvořilo komplex inhibitor-protilátka, který by zůstal v roztoku a byl by odstraněn z destičky během promývání. V takovém případě by vazba protilátky na inhibitor snížila počet molekul protilátky schopných vázat se ke krycím antigenům 651-BSA. Protože na 651-BSA je vázáno méně molekul protilátek, dochází k redukci v počtu vázaných molekul biotinilovaných koňských protimyších IgG, z čehož vyplývá, že je vázáno méně molekul komplexu avidin- -peroxydáza. 2 toho dále vyplývá snížení hydrolýzy substrátu vedoucí nakonec k nižší absorbanci. Údaje jsou uvedeny v Tabulce IB. Ve všech případech byla koncentrace inhibitoru 10~4M.
Tabulka 1B
Myš číslo | Imunogen m | Krycí konjugát | X inhibice | |
651 | 573 | |||
2A | 651-BSA | 651-THY | 6 | 0 |
2A | II | 573-THY | 0 | 0 |
3A | li | 651-THY | 0 | 0 |
3A | 1« | 573-THY | 0 | 0 |
1B | 651-THY | 651-BSA | 0 | 0 |
. 1B | II | 573-BSA | 0 | 0 |
2B | II | 651-BSA | 0 | 0 |
2B | II | 573-BSA | 0 | 0 |
1C | 573-BSA | 651-THY | 6 | 7 |
1C | 1« | 573-THY | 0 | 0 |
2C | II | 651-THY | 0 | 18 |
2C | II | 573-THY | 14 | 4 |
ID | 573-BSA | 651-THY | 10 | 0 |
ID | II | 573-THY | 0 | 12 |
2D | 41 | 651-THY | 12 | 0 |
IE | 573-THY | 651-BSA | 34 | 28 |
IE | II | 573-BSA | 44 | 21 |
2E | II | 651-BSA | 7 | 12 |
2E | II | 573-BSA | 12 | 10 |
Tyto výsledky naznačují. | že myš IE | imunizovaná 573-THY | ||
produkuje | sérum s protilátkami reagujícími jak | s 651 tak s |
573.
— 3R —
Příklad 2 : Fúze byla usmrcena Slezina byla
Všechny techniky byly prováděny asepticky a se sterilními chemikáliemi. Myš IE, produkující polyklonální protilátky předávkováním anestetika (RompumR/KetamineR). vyňata a umístěna do 100 mm Petriho misky obsahující přibližně 20 ml ABC media (Cell Enterprises, Harrisonburg, VA). Slezina byla pak períundována 10 ml ABC media, aby byla odstraněna většina slezinných lymfocytů. Zbylé buňky byly z pouzdra sleziny získány separací 21 bioptickými jehlami. Objem byl zvýšen na 50 ml přidáním ABC media a byl odebrán vzorek o objemu 0,1 ml a zředěn 1 : 50 v
ABC mediu. Zředěné buňky byly spočítány hemocytometrem , aby bylo možno odhadnout počet lymfocytů získaných ze sleziny. Současně byly buňky zkoncentrovány centrifugací při
200xg po 5 minut při laboratorní teplotě.
Ze sleziny bylo získáno přibližně 1,2 χ 10® lymfocytů. Ty byly smíchány s 1,2 χ 107 buněk myelomu (SP2/0-Agl4, ATCC Cat CRL1581). Buňky byly pak zkoncentrovány centrifugací (250 xg po 10 min při laboratorní teplotě). Supernatant byl odstraněn téměř do sucha a buňky byly resuspendovány jemným poklepáváním centrifugační zkumavkou, aby byl uvolněn buněčný sediment.
Buňky byly pak smíchány s 1 ml 50 % polyethylénglykolu, m.v. 1500 (PEG), který byl předehřát na 36 »C. PEC byl přidáván pomalu (po kapkách) během přibližně 75 sekund za neustálé
- 26 rotace centriíugační zkumavkou, aby bylo zajištěno, že buňky zůstanou dobře rozmíchány během kontaktu s PEG.
Centriíugační zkumavka obsahující buňky byla pak umístěna ve vodní lázni při 37 °C na 1 minutu. Zkumavky byla pak vyjmuta z vodní lázně a byl do ní přidán 1 ml teplého ABC media po kapkách během následujících 60-75 sekund za stálé rotace centrifugační zkumavkou, aby bylo zajištěno, že buňky a PEG byly dobře smíchány s mediem. Buňky byly pak přeneseny do 37 ®C teplé vodní lázně na 1 minutu, načež byly z této lázně vyjmuty. Během následujících 75 sekund byly přidány 2 ml ABC media opět za neustálé rotace zkumavkou jako dříve a buňky byly pak přeneseny opět do vodní lázně 37 ®C teplé na 1 min. Zkumavka byla vyjmuta z lázně a byly do ni přidány 4 ml teplého ABC media za neustálé rotace jako dříve. Buňky byly inkubovány 1 min při laboratorní teplotě, načež bylo přidáno 8ml teplého ABC media za stálé rotace zkumavkou jako dříve. Buňky byly inkubovány 1 min při laboratorní teplotě, načež bylo přidáno 12 ml teplého ABC media za stálé rotace zkumavkou jako dříve. Konečně byl objem upraven na 50 ml přidáním ABC media.
Buňky byly zkoncentrovány centriíugací jak je popsáno výše. Medium bylo odstraněno odsátím a buňky byly resuspendovány v 60 ml HM. Tyto buňky byly pak rozděleny na dva stejné díly po 30 ml. Do jednoho byl přidán endothelial cell growth supplement (ECGS (Sigma, katalog.č.Z2759), 5 pg/ml) a do druhého nebyla přidána žádná další přísada.
Buňky byly umístěny do reakčnich destiček s 96 pozicemi v množství 100 μΐ/jamku. Destičky označené A,B,C obsahovaly buňky bez ECGS, buňky s ECGS byly v destičkách označených D,E,F. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2 ve vzduchu.
Jeden den po fúzi bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ IX HAT media připraveného v HM s nebo bez ECGS jak bylo třeba. (HAT je směs hypoxanthinu. aminopterinu a thymidinu. Konečné koncentrace užité v kultivačním mediu jsou 5.10™3M hypoxanthinu, 2.10-eM aminopterinu a 1.10~4M thymidinu.). Buňky byly pak nerušeně inkubovány po dobu 144 hodin, po kterých bylo přidáno 50 μΐ HM bez HAT, ale s nebo bez ECGS jak bylo třeba, do každé jamky.
Asi 14 dní po fúzi byly destičky vyšetřeny na přítomnost rostoucích kolonií hybridomů. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce II.
Tabulka II
Procentuální zastoupení | jamek s | rostoucími koloniem | |||
Destička Jamek s | Pokryté | ECGS | % j amek | ||
koloniemi | jamky | j/kol | |||
A | 39 | 96 | - | 40.6 | |
B | 51 | 96 | - | 53.1 | |
C | 30 | 96 | - | 31.3 | |
D | 44 | 96 | + | 45.8 | |
E | 47 | 96 | 49.0 | ||
F | 40 | 94 | + | 41.2 | |
Průměrné | procento | kolonií/destičku, | A-C : 41.6 | ||
Průměrné | procento | kolonií/destičku, | D-F : 45.5 | ||
Průměrné | procento | kolonií/destičku. | A-F : 43.6 |
Příklad 3 : Vyšetření supernatantu na přítomnost protilátek
Supernatanty z jamek s rostoucími koloniemi hybridomů byly vyšetřeny za užití imunoanalýzy se značením enzymy (EIA). Reakční polystyrénové EIA destičky s 96 pozicemi byly pokryty 100 μΐ/jamku 651 konjugované s BSA (651-BSA) na dobu nejméně dvou hodin při laboratorní teplotě nebo na 16 hodin při 4 ®C. Nenavázaný materiál byl vymyt z jamek 5x opakovaným vymytím PBS-T a pak bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ PBS-T. Padesát μΐ supernatantu nebo kultivačního media samotného (negativní kontrola) bylo pak přidáno do jamek a ty byly inkubovány 30-60 minut při laboratorní teplotě. Jamky byly pak promyty 5x PBS-T, aby byl odstraněn nenavázaný materiál a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ roztoku biotini 1ováného proti-myšího IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) v koncentraci lmg/ml. Jamky byly pak inkubovány při laboratorní teplotě po dobu 30-60 minut a pak promyty 5x PBS-T, aby byl odstraněn nenavázaný materiál. Do každé jamky bylo pak přidáno 100 μΐ komplexu avidin-biotin-křenová peroxydáza (AB complex, Vector Laboratories. Avidinová čá.st AB komplexu se váže s mimořádně vysokou afinitou k biotinové části biotini 1ováného koňského proti-myšího IgG za vzniku stabilního komplexu obsahujícího enzym.).Po inkubační době 30-60 minut při laboratorní teplotě byly nenavázané sloučeniny vymyty z jamek PBS-T a do každé jamky bylo přidáno 100 μ.1 substrátu ABST (K&P) . Absorbance (414 nm) byla stanovena o 30-60 minut později za užití FLOW Titertek Multiscan 340 EIA Plate reader.
Vyšetření supernatantu hybridomů prokázalo dvě kolonie produkující protilátky reagující s krycím antigenem. Tyto kolonie byly označeny 89-147EH9 a 89-147EC2. Tyto kultury byly namnoženy a konzervovány zmrazením a další hodnocení bylo provedeno kompetitivně inhibiční ELISA (enzyme linked immunosorbtive assay) jak je popsáno níže.
Příklad 4 : Kompetitivně inhibiční ELISA (CIEIA)
Supernatanty z jamek s rostoucími koloniemi hybridomů byly vyšetřeny za užití CIEIA. Reakční EIA polystyrénové destičky s 96 pozicemi byly pokryty 100 μΐ 651 konjugovaného s BSA (651-BSA) po dobu nejméně dvou hodin při laboratorní teplotě nebo 16 hodin při 4 °C. Nenavázaný materiál byl z jamek vymyt pětinásobným promytim PBS-T. Do jamek bylo pak přidáno 50 μΐ samotného pufru (PBS-T) nebo inhibitorů, buď 651 nebo 573, každý zředěný na 2 ppm v pufru. Do jamek pak bylo přidáno 50 μΐ supernatantu z každé buněčné kultury, takže každý supernatant reagoval jak s pufrem, tak i s 651 nebo 573 (inhibitory). Výsledkem kombinace stejných objemů supernatantů a inhibitorů nebo pufru bylo konečné ředění supernatantů 1:2 a konečná koncentrace inhibitorů 1 ppm. Jamky byly inkubovány po 30-60 minut při laboratorní teplotě. Pak byly pětinásobně promyty PBS-T, aby byl odstraněn nenavázaný materiál a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ roztoku biotinilovaného koňského proti-myěího IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) o koncentraci 1 μg/ml. Analýza pokračovala, jak je popsáno pro ELISA výSe.
Pokud by byly protilátky v supernatantu reaktivní s jedním nebo s oběma inhibitory v roztoku v jamkách, molekuly protilátky nebo určité procento molekul protilátky by se by proto komplex v roztoku a byl takovém případě by vázalo k inhibitorům, a tvořilo protilátka-inhibitor, který by zůstal odstraněn z destičky během promýváni. V vazba protilátky na inhibitor snížila počet molekul protilátky, které jsou k dispozici pro vazbu na krycí antigen, 651-BSA.Protože je méně molekul protilátky vázáno na 651-BSA,je snížen počet vázaných biotini 1ováných molekul koňských proti-myěích IgG. Výsledkem je méně vázaných molekul komplexu avidin-peroxydáza a z toho plyne snížení hydrolýzy substrátu, vedoucí konečně k nižěím absorbancím.
Je možno provádět CIEIA tak, aby bylo dosaženo větší inhibice změnou koncentrací krycího antigenu, protilátek a detekčních molekul (jako například koňského proti.myšího IgG a komplexu avidin-peroxydáza). Taková optimalizace CIEIA je užita k získání vyšší úrovně citlivosti a dovoluje užití nižších koncentrací (t.j. vyšších ředění monoklonálních protilátek.
Při testu metodou CIEIA byla pouze buněčná kultura 89-147EH9 shodně reaktivní s krycím antigenem a inhibovatelná sloučeninami 651 a 573. Reprezentativní údaje CIEIA jsou uvedeny v Tabulce III.
Tabulka III - CIEIA | supernatantů kultur | |||
Kultura ID | Sedění | Inhibitory (Absorbance) | ||
m | supernat. | Žádný | 1 ppm 651 | 1 ppm 573 |
CF10 | 1:2 | 0.485 | 0.419 | 0.479 |
EH9 | 1 :2 | 0.170 | 0.150 | 0.117 |
EC2 | 1 :2 | 0.847 | 0.652 | 0.520 |
Kult.med. | 0.291 | 0. 300 | 0.305 | |
EC2 | 1:12 | 0. 917 | 0.910 | 0. 872 |
EH9 | 1:2.5 | 0.386 | 0. 122 | 0. 135 |
CF10 | 1:2.5 | 0. 121 | 0.119 | 0. 099 |
EC2 IB8* | 1:6 | 0. 169 | 0.124 | 0. 121 |
Kult.med. | 0.108 | 0.100 | 0.098 | |
EH9 | 1 :4 | 0.515 | 0.186+ | 0.504+ |
* klon 89-147EC2 + testováno proti 0.4 ppm inhibitoru
K průkazu, že protilátky produkované buněčnou kulturou 89-147EH9 reagují především se sloučeninou 651, byla provedena CIEIA jak je popsáno výše s tou výjimkou, že supernatant obsahující protilátky se nechal reagovat se čtyřmi různými inhibitory, s každým při několika různých koncentracích. Výsledky tohoto procesu jsou uvedeny v Tabulce IV. Protilátky podle tohoto vynálezu reagují mnohem silněji s 651 než s jinými testovanými sloučeninami, jak je prokázáno vyšší hladinou inhibice s 651 než s podobnými koncentracemi jiných biocidů.
Tabulka IV - Detekce biocidů pomocí CIEIA
Koncentr. 10 min. absorbance xlOOO
inhibitoru (ppm) | 651 | 573 | NMA | 893 |
50 | ND* | 191 | 490 | 516 |
10 | 106 | 344 | 518 | 589 |
2 | 185 | 504 | 496 | 514 |
0.4 | 338 | 461 | 519 | ND |
0.08 | 448 | 590 | 429 | ND |
0.016 | 491 | ND | ND | ND |
nulová 515,n=3 * ND = neurčeno
NMA = kyselina N-methyl malonamidovát
Příklad 5 - Klonování hybridomů
Abychom ověřili, že protilátky reagující se sloučeninou 651 byly produkovány buňkami stejné genetické konstituce, bylo nutné vytvořit klony z buněčné kultury 89-147EH9. Klonování bylo provedeno nejprve stanovením celkového počtu životaschopných buněk v populaci buněk 89-147EH9. Buněčná populace byla pak zředěna na hustotu 4-5 buněk na ml kultivačního media. Do každé jamky ve čtyřech kultivačních destičkách o 96 jamkách označených I-IV bylo vloženo 200 μ.1 této buněčné suspenze. 0 14 dní později byla každá jamka mikroskopicky zkontrolována a byly zjištěny rostoucí kolonie buněk. Ty ve kterých bylo pouze jedno ložisko buněk, byly označeny za monoklonálni. Výsledky klonování jsou uvedeny v Tabulce V níže.
Tabulka | V - Klonování | buněčné kultury | 89-147EH9 |
Destička | Jamky | Jamky s | % s |
ID | s kolon. | 1 ložiskem | 1 ložiskem |
I | 15 | 11 | 73.3 |
II | 17 | 12 | 70.6 |
III | 19 | 17 | 89.5 |
IV | 18 | 13 | 72.2 |
Celkem 17. | 25+/-1.7 | 13.25+/-2.6 | 76.4+/-8.8 |
Dále byla každá kolonie testována na reaktivitu v ELISA, jak je popsáno výše. 2 kolonií bylo několik vybráno pro rozmnoženi a opětné testování CIEIA na reaktivitu s 651 a 573. Výsledky této analýzy jsou uvedeny v Tabulce VI níže.
Tabulka IV - CIEIA
Reaktivita klonů 89-147EH9 se sloučeninami 651 a 573.
Absorbance xlOOO
Klon | PBS | 651 | X * | 573 | X I |
ID | 1 ppm | 1 ppm | |||
IA5 | 528 | 348 | 34. 1 | 471 | 10.8 |
IID1 | 060 | 055 | <1.0 | 057 | <1.0 |
ID5 | 584 | 429 | 26.5 | 671 | 0.0 |
IVF12 | 090 | 065 | 27.8 | 073 | 18.9 |
ID8 | 746 | 807 | 0.0 | 1068 | 0. 0 |
IVE1 | 818 | 452 | 44.7 | 539 | 34. 1 |
IIIH6 | 647 | 471 | 27. 2 | 705 | 0. 0 |
IVE4 | 595 | 361 | 39. 3 | 539 | 9.4 |
IVH2 | 680 | 366 | 46.2 | 632 | 7.0 |
Jen medium | 063 | 059 | <1.0 | 058 | <1.0 |
*XI = procento inhibice, které je získáno dělením absorbance získané z každým inhibitorem (651 nebo 573) absorbanci bez inhibice (PBS) a odečtením koeficientu od 1 a vynásobením rozdílu 100. Negativní hodnoty jsou vyjádřené jako 0,0.
Na základě této a následujících analýz byla klonová linie 89-147EH9 namnožena, pěstována jako ascites, purifikována a užita v následujících analýzách.
Příklad 6 - Kvantitativní CIEIA sloučeniny 651
Pro demonstraci vhodnosti CIEIA pro stanovení koncentrace 651 v neznámých vzorcích byla vyvinuta kvantitativní imunoanalýza. Tato analýza je prováděna jak je popsáno v příkladu 4, mimo to, že dublované vzorky protilátky reagují se sérií známých koncentrací sloučeniny 651, jakož i s různými ředěními vzorků obsahujících neznámá množství 651. Jak je popsáno v příkladu 4, při nejvyšších koncentracích 651 se vyskytuje maximální interakce protilátky s 651. To nakonec vede k redukci hodnot absorbance. Střední hladiny 651 způsobují mírnou redukci hodnot absorbance a nízké hladiny 651 způsobují malou nebo žádnou redukci hodnot absorbance.
Při kvantitativní CIEIA je standardní křivka vytvořena vynesením hodnot absorbance proti logaritmu koncentrace 651. Body jsou upraveny za užití regresní analýzy, čtyřparametrové logistické křivky nebo jiných statistických metod. Koncentrace 651 v neznámém vzorku je pak stanovena srovnáním hodnot absorbance v jamkách, ve kterých neznámé vzorky reagovaly s protilátkou, s hodnotami získanými pro standardní křivku.
Tyto postupy byly užity k odhadu koncentrace 651 v laboratorně připravených vzorcích papírenské kapaliny, vody z chladících věží a tekutiny z kovozpracujíčího průmyslu (MWF), vše užito zředěné. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v Tabulce VII, společně s aktuální koncentraci ve j
I vzorku. Tyto výsledky naznačují, že tato analýza může být j úspěšně užita k odhadu hladiny 651 ve vzorku.
Tabulka VII : Odhad koncentrace 651
Vzorek
Nominál 651 HPLC
CIEIA (ppm)2 (ppm)3
Papírna 7.5
2.25 0.375
Chladicí věž 7.5
2. 25 0.375
Kovoprfim. 22.5
11.25 3.75
8.4
2.5 0.41
8.4
2.5 0.41 21.2 9.9 3.3
5.4
3.2
1.3
6.5
2.3
1.3 20
11.2
0.74
1. Nominál je směrná hodnota pro vzorek.
2. HPLC je standardní,běžně užívaná analytická metoda.
3. CIEIA - vzorky byly ředěny l-’4 před analýzou.
Druhá sada laboratorně připravených vzorků vody z chladicích věží byly analyzována na obsah 651 dvojmo metodou CIEIA a následně postupem naznačeným v Příkladu 4 výše. Tyto výsledky jsou uvedeny v Tabulce VIII.
Tabulka VIII
Odhad koncentrace 651 ve vodě z chladicích věží
Nominál HPLC
9.3
2.8
0.5 0.46 nd = nedetegován
CIEIA
Jednoduchá
10.4 3. 3 nd*
Dvoj itá 11.7
6.5
0.46
Příklad 7 - Souprava ELISA
A. Forma detekčního proužku
Při užití detekční soupravy ve formě detekčního proužku je plastikový pásek upevněn ve víčku lahvičky, takže do ní volně visí. Na povrchu proužku je 2 cm2 velká detekční ploška, na které je naneseno 100 ng protilátky anti-651. Vzorek je zředěn v lahvičce obsahující roztok konjugátu 651-BSA (200 ng). Víčko s proužkem je našroubováno na lahvičku a inkubováno 15-30 minut.Proužek je pak vyjmut a opláchnut vodou nebo pufrem a našroubován na lahvičku obsahující komplex avidin-HRP (křenová peroxydáza), inkubován 15 minut a pak opláchnut. Proužek je pak umístěn do lahvičky obsahující substrát HRP, jako je kyselina azinobis-ethylbenzthiazolino-sulfonová (ABTS). Koncentrace izothiazolonu je pak odhadnuta stanovením intenzity modré barvy v lahvičce po určené době inkubace.
B. Forma membrány
Protilátka anti-651 je nanesena na membránu a tato membrána (2 cm2 obsahující 100 ng protilátky) je umístěna nad malým pohárkem. Vzorek je smíchán s konjugátem 651-BSA-biotin (složeným ze vzorku zředěného 1:3, celkové množství konjugátu je 200 ng) a tento roztok se nalije na membránu. Gravitace protlačí roztok skrze membránu. Dále je na membránu nalit roztok avidin-HRP, opláchnut a pak je aplikován detekční roztok (substrát HRP). Koncentrace izothiazolonů je pak odhadnuta stanovením intensity modré barvy na membráně.
Příklad 8 - Kolorimetrické stanovení izothiazolonů ve dřevě
Jižní žlutá borovice, která byla pod tlakem prosycena roztokem obsahujícím 4,5-dichloro-2-n-octy1-3-izothiazolon za užití běžné metody, byla nařezána na plátky (0,5x2,5 cm). Tyto dřevěné plátky byly namočeny do roztoku 3 5¾ odtučněného mléka na 30 minut. Plátky byly pak krátce opláchnuty PBS-T, a pak vystaveny protilátce anti-651, která je kovalentně vázaná na křenovou peroxydázu (koncentrace 500 ng/ml) dobu 15 minut. Plátky byly pak promyty 2x na po 30 min.
v PBS-T puíru.
Navázaný komplex anti-65i-HRP byl viz ualizován substrát HRP indikovalo do lahvičky obsahující se modré barvy v roztoku 4,5-dichloro-2-n-octy1umístěním plátků (ABTS). Objevení přítomnost
-3-izothiazolonu. Byl odebrán 200 ml alikvotní podíl roztoku v lahvičce a byla stanovena jeho absorbance při 405 nm.
Tento vzorek zpracovaným izothiazolon.
vzhledem k pozadí.
byl srovnán s kontrolním stejným způsobem, ale
Hodnoty absorbance byly dřevěným plátkem neobsahuj ícim pak korigovány v,zor«?k_&4os
Kontrola 0.002
Prosycený 0. 165
Tato data ukazují, že tato metoda může být užita pro stanovení koncentrace izothiazolonu ve dřevě nebo jiné pevné
Claims (10)
1. Metoda přípravy imunogenní ch konjugátů izothiagolonuf-% makromolekulárního nosiče vyznačujíc L tím, že zahrnuje makromolekulární nosič kovalentně vázaný na izothiazolon obsahující reaktivní skupinu, a to přednostně prostřednictvím chemického řetězce.
2. Metoda produkce monoklonálních protilátek reagujících s izothiazolony vyznačující se tím, že zahrnuje imunizování živočicha imunogenním konjugátem produkovaným podle nároku 1; získání buněk produkujících protilátky z tohoto živočicha; fúzi těchto buněk s buňkami tumoru k produkci hybridomů; selekci z množství těchto hybridomů alespoň jednoho, který produkuje protilátky schopné specifické vazby s těmito izothiazolony; a získání těchto produkovaných protilátek z tohoto vyselektováného hybridomu.
3. Metoda podle nároku 2, vyznačující se tím, že daný živočich je hlodavec a dané tumorové buňky jsou přednostně buňkami myšího plasmocytomu nebo krysího myelomu.
4. Metoda podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že hybridomy mají všechny identifikační charakteristiky ATCC HB 11435 nebo jeho mutantů či variant.
5. Metoda podle nároků 3 nebo 4, vyznačující se t i m, Se příslušný živočich je myš a daná metoda obsahuje kroky k získáni buněk produkujících protilátky z její sleziny, fúzi těchto buněk s buňkami myšího plasmocytomu nebo krysího myelomu deficitními v enzymu hypoxantin guanin fosforibosyl transferáze k vytvoření hybridomů, alespoň jeden z nich je vyselektován růstem v mediu obsahujícím hypoxanthin,aminopterin a thymidin; je identifikován alespoň jeden z těchto hybridomů, který produkuje protilátky proti izothiazolonu ve volné nebo nekonjugované formě; kultivování tohoto identifikovaného hybridomu pro produkci uvedené protilátky odebíratelném množství; a získání protilátek produkovaných uvedeným kultivovaným hybridomem.
Metoda podle nároku 2,3 nebo 4, vyznačuj ící se t í m. Se protilátky reagující s izothiazolony jsou získávány z hybridomu intraperitoneálni aplikací tohoto hybridomu do histokompatibilního hostitele nebo do hostitele s potlačenou imunitou protilátek z ascitu tohoto hostitele.
odebíráním
Metoda podle některého z vyznačující se tí namnožení tohoto hybridomu kontinuální buněčné linie.
nároků m, že dále metodou
2 až 6, obsahuje krok klonování do
Metoda produkce polyklonálních protilátek izothiazolony, vyznačující se reagujících s tím. Se zahrnuje získání imunogenního konjugátu podle nároku i;
imunizaci živočicha tímto konjugátem; odběr krve z tohoto živočicha; separaci séra z řečené krve a získání protilátek z tohoto séra.
9. Imunogenní koncentrát, vyznačující se tím, že obsahuje derivát izothiazolonu kovalentně vázaný prostřednictvím reaktivní skupiny k chemickému řetězci, který je sám kovalentně vázán k makromolekulárnímu nosiči.
10. Hybridom, vyznačující se tím, že produkuje monoklonální protilátku schopnou vázat se specificky na izothiazolony.
11. Hybridom podle nároku 10, vyznačující se t í m, že má všechny identifikační charakteristiky ATCC
kontinuální buněčné linie nebo z hybridomu, přednostně z hybridomu jak je definován v nároku 11.
14. Metoda pro stanovení přítomnosti nebo koncentrace izothiazolond ve směsi, vyznačující se tím, že využívá imunoanalýzy užívající jako reagens monoklonálni nebo polyklonálni protilátku produkovanou podle některého z nároků 2 až 8.
15. Metoda izolace nebo získání izothiazolonů ze směsi, vyznačující se tím, že zahrnuje zkontaktování vzorku této směsi a monoklonálni protilátky produkované podle některého z nároků 2 až 8 na určitou dobu a potom měření koncentrace antigenu v uvedeném vzorku stanovením množství komplexu antigen-
izothiazolon je 2-methy1-3-izothiazolon nebo 5-chloro2-methy1-3-izothiazolon.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US92776592A | 1992-09-28 | 1992-09-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ202693A3 true CZ202693A3 (en) | 1994-04-13 |
Family
ID=25455220
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ932026A CZ202693A3 (en) | 1992-09-28 | 1993-09-28 | Immunoanalysis of isothiazolones |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5554542A (cs) |
EP (1) | EP0592127B1 (cs) |
JP (1) | JPH07294522A (cs) |
KR (1) | KR940006604A (cs) |
CN (1) | CN1090929A (cs) |
AT (1) | ATE165009T1 (cs) |
AU (1) | AU675802B2 (cs) |
BR (1) | BR9303898A (cs) |
CA (1) | CA2106693A1 (cs) |
CZ (1) | CZ202693A3 (cs) |
DE (1) | DE69317976T2 (cs) |
DK (1) | DK0592127T3 (cs) |
ES (1) | ES2115022T3 (cs) |
HU (1) | HU214700B (cs) |
IL (1) | IL107055A0 (cs) |
MY (1) | MY109450A (cs) |
SG (1) | SG81877A1 (cs) |
TW (1) | TW258789B (cs) |
ZA (1) | ZA937028B (cs) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6218181B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-04-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Retroviral packaging cell line |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
NZ532151A (en) * | 2004-04-06 | 2007-09-28 | George William Mason John Brod | A method of quantitation of chemical preservatives within wood using enzyme linked immunosorbent assay technology combined with chromatographic analysis |
WO2007001192A1 (en) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Matthews, John, Brodie | Method of determining biocides within wood |
BRPI0619249A2 (pt) | 2005-11-30 | 2011-09-20 | Abbott Lab | anticorpos anti-globulÈmeros-aß, frações que se ligam a antìgeno destes, hibridomas correspondentes, ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras, métodos de produzir os ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos de usar os ditos anticorpos |
CN101506236B (zh) | 2005-11-30 | 2012-12-12 | 雅培制药有限公司 | 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途 |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
EP2486928A1 (en) | 2007-02-27 | 2012-08-15 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
MX360403B (es) | 2010-04-15 | 2018-10-31 | Abbvie Inc | Proteinas de union a amiloide beta. |
JP6147665B2 (ja) | 2010-08-14 | 2017-06-14 | アッヴィ・インコーポレイテッド | アミロイドベータ結合タンパク質 |
US8912003B2 (en) | 2011-08-26 | 2014-12-16 | General Electric Company | Methods and devices for detecting isothiazolones |
CN113453724A (zh) * | 2018-09-27 | 2021-09-28 | 皮埃尔法布雷医药公司 | 基于磺酰基马来酰亚胺的连接子和相应的偶联物 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4456691A (en) * | 1983-02-28 | 1984-06-26 | Suad Stark | Antigen for PCB, antibody raised by same, and method of making same |
US4652530A (en) * | 1985-07-15 | 1987-03-24 | Rohm And Haas Company | Monitoring method for isothiazolones in aqueous systems |
US4865972A (en) * | 1986-08-22 | 1989-09-12 | Westinghouse Electric Corp. | Antibody-based bioassay for enzyme-inducing chemicals |
IL83419A0 (en) * | 1986-09-15 | 1988-01-31 | Westinghouse Electric Corp | Antibodies reactive with chlorinated phenols,their preparation and their use |
GB9017880D0 (en) * | 1990-08-15 | 1990-09-26 | Cambridge Innovation Brokers | Assay |
US5094957A (en) * | 1990-12-10 | 1992-03-10 | Rohm And Haas Company | Quantitative method for determining concentration of 3-isothiazolone |
-
1993
- 1993-09-01 TW TW082107115A patent/TW258789B/zh active
- 1993-09-21 IL IL93107055A patent/IL107055A0/xx unknown
- 1993-09-22 CA CA002106693A patent/CA2106693A1/en not_active Abandoned
- 1993-09-22 AU AU47524/93A patent/AU675802B2/en not_active Ceased
- 1993-09-23 AT AT93307558T patent/ATE165009T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-23 ES ES93307558T patent/ES2115022T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-23 SG SG9604229A patent/SG81877A1/en unknown
- 1993-09-23 ZA ZA937028A patent/ZA937028B/xx unknown
- 1993-09-23 EP EP93307558A patent/EP0592127B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-23 DE DE69317976T patent/DE69317976T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-23 DK DK93307558T patent/DK0592127T3/da active
- 1993-09-24 BR BR9303898A patent/BR9303898A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-09-25 MY MYPI93001955A patent/MY109450A/en unknown
- 1993-09-27 HU HU9302736A patent/HU214700B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-09-28 JP JP5264302A patent/JPH07294522A/ja active Pending
- 1993-09-28 US US08/128,451 patent/US5554542A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-28 CN CN93119841A patent/CN1090929A/zh active Pending
- 1993-09-28 KR KR1019930020143A patent/KR940006604A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-09-28 CZ CZ932026A patent/CZ202693A3/cs unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0592127A1 (en) | 1994-04-13 |
DK0592127T3 (da) | 1999-01-04 |
CN1090929A (zh) | 1994-08-17 |
US5554542A (en) | 1996-09-10 |
ZA937028B (en) | 1994-03-29 |
AU675802B2 (en) | 1997-02-20 |
MY109450A (en) | 1997-01-31 |
ES2115022T3 (es) | 1998-06-16 |
BR9303898A (pt) | 1994-06-14 |
IL107055A0 (en) | 1993-12-28 |
HUT67054A (en) | 1995-01-30 |
SG81877A1 (en) | 2001-07-24 |
DE69317976T2 (de) | 1998-11-12 |
ATE165009T1 (de) | 1998-05-15 |
JPH07294522A (ja) | 1995-11-10 |
CA2106693A1 (en) | 1994-03-29 |
AU4752493A (en) | 1994-04-14 |
HU9302736D0 (en) | 1994-01-28 |
KR940006604A (ko) | 1994-04-25 |
EP0592127B1 (en) | 1998-04-15 |
HU214700B (hu) | 1998-08-28 |
DE69317976D1 (de) | 1998-05-20 |
TW258789B (cs) | 1995-10-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ202693A3 (en) | Immunoanalysis of isothiazolones | |
Abad et al. | Production of monoclonal antibodies for carbaryl from a hapten preserving the carbamate group | |
JP3884586B2 (ja) | イミダクロプリドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
EP0363041A1 (en) | Monoclonal antibody to morphine, preparation of monoclonal antibody, assaying kit and assaying method of morphine | |
EP0260829A2 (en) | Antibodies reactive with chlorinated phenols and methods of preparing and using same | |
JP3188641B2 (ja) | ミクロブタニルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
JPH04218366A (ja) | メトラクロルの免疫学的検出 | |
JPH05317085A (ja) | 免疫学的検出方法 | |
EP0258006A2 (en) | Monoclonal antibodies reactive with chlorinated dibenzo-p-dioxins and method of preparing and using same | |
CA2150497C (en) | Inhibitor and anti-inhibitor monoclonal antibodies specific for horseradish peroxidase | |
JP3188642B2 (ja) | イマザリルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
JP2000095769A (ja) | プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
US6465194B2 (en) | Monoclonal antibodies to 4,4′-dinitrocarbanilide and a method for analyzing for the drug nicarbazin | |
JP4221119B2 (ja) | ドウモイ酸に対する特異的抗体及びドウモイ酸の免疫学的分析方法 | |
AU588573B2 (en) | An antibody preparation and processes for its manufacture and use | |
Bonwick et al. | Production of murine monoclonal antibodies against sulcofuron and flucofuron by in vitro immunisation | |
JP3161513B2 (ja) | ピラゾスルフロン誘導体、抗ピラゾスルフロンエチル抗体、それを分泌するハイブリドーマ、及びピラゾスルフロンエチルの分析方法 | |
KR910002851B1 (ko) | 체외면역에 의한 항황우독소 단일클론성 항체의 제조방법과 황우독소의 분석방법 | |
JP2605418B2 (ja) | ハプテンである抗原に対し高親和性を持つ抗体 | |
JPH09176197A (ja) | 2−エチルチオメチルフェニル メチルカルバマートに特異的な抗体及びその製造方法 | |
JPH0543358B2 (cs) | ||
SU1726511A1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L, используемый дл получени моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи | |
JPH0549494A (ja) | 免疫学的検出方法 | |
JP2001039953A (ja) | ピリミノバックメチルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
WO1986004331A1 (en) | Carrier-bound histamine, its manufacture and its use |