BR112021005655A2 - ligantes à base de sulfomaleimida e conjugados correspondentes - Google Patents

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BR112021005655A2
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Frédéric Marion
Jean-François Haeuw
Cyrille Dreyfus
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Pierre Fabre Medicament
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Abstract

a presente invenção refere-se a um ligante da seguinte fórmula (i) ou um sal do mesmo: (i). a presente invenção refere-se a um conjugado ligante-fármaco da seguinte fórmula (ii) ou um sal do mesmo: (ii). a presente invenção também se refere a um conjugado unidade de ligação-fármaco, tal como um conjugado anticorpo-fármaco, da seguinte fórmula (iii) ou (iv) ou um sal do mesmo: bem como uma composição farmacêutica compreendendo um tal conjugado unidade de ligação-fármaco e seu uso no tratamento do câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LIGANTES À BASE DE SULFOMALEIMIDA E CONJUGADOS CORRESPON- DENTES".
CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a um ligante à base de sul- fomaleimida útil na preparação de conjugados, tais como conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), por ligação covalente de molécula(s) de fármaco a uma unidade de ligação, que é vantajosamente um anticor- po.
ANTECEDENTE
[002] ADCs são todas as misturas controladas de diferentes es- pécies carregadas com fármacos (de O a 8 moléculas de fármacos por anticorpo = DAR) e têm um DAR médio típico de 3,5 ou 4. As espécies não conjugadas geralmente não são ativas e estão em competição com as espécies carregadas com fármaco para ligação ao antígeno. Além disso, as espécies que têm um DAR de mais de 4 mostraram levar a uma tolerabilidade mais baixa, taxas de depuração plasmática mais altas e eficácia diminuída. A maioria dos ADCs que estão atual- mente no mercado e em ensaios clínicos compartilham características estruturais comuns, como uma ligação de tiossuccinimida, que é for- mada por meio da reação de tióis e alquil maleimidas. Este tipo de química é amplamente utilizado porque a reação de maleimidas e tióis é muito rápida em condições fisiológicas e é quantitativa (sem um grande excesso de ambas as espécies originais). No entanto, a forma- ção de tiossuccinimida é lentamente reversível em condições fisiológi- cas. Os ADCs que contêm alquil maleimidas podem resultar em perda mensurável do medicamento durante a circulação prolongada. As con- sequências farmacológicas desta eliminação de maleimida dos ADCs (por meio de uma reação retro-Michael) incluem atividade antitumoral diminuída devido à exposição reduzida à forma conjugada de anticor-
po do fármaco e maior toxicidade, que surge da liberação não direcio- nada do fármaco, e o ligante. Isso foi descrito igualmente para ADCs ligados à cisteína e ADCSs ligados à lisina por meio do ligante de tioéter SMCC (succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato).
[003] A presente invenção refere-se, portanto, a compostos úteis para a conjugação de fármaco a unidades de ligação, sendo os conju- gados obtidos mais estáveis e mais eficientes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] A presente invenção, portanto, refere-se a um ligante da seguinte fórmula (1): (9) x; S q Treo Mans sea. (), preferivelmente, da seguinte fórmula (la): X1 Neo TJ rea “o (la), ou um sal do mesmo, em que: — X e»X representam, independentemente um do outro, H, um átomo de halogênio, um (C1-Cs)alcóxi, um arilóxi opcionalmente substituído, ou -O-(CH2CH20).,H (-O-PEG), contanto que X; e X> não representem H ao mesmo tempo; — L, representa um grupo de fórmula Ly'-(CO-Z')- com Ly sendo -(CH2)n-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>-, arileno, heteroarileno, cicloal- canodiila, -(CH2),-arileno-, -(CH2),-heteroarileno-, -(CH>2)n-cicloalcano- diil-, -arileno-(CH>2)p-, -heteroarileno-(CH2)p-, -cicloalcanodiil-(CH2),p-, -
(CH>2),-arileno-(CH>2)p-, -(CH2)n-heteroarileno-(CH2),-, -(CH2)n-cicloalca- nodiil-(CH2))-, -(CH2CH2O0 )m-CH2-CH>-arileno-(CH2),-, -(CH2CH20)nm- CH2-CH>-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-cicloalcanodiil- (CH2)p-, -(CH2)n-arileno-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH>2)n-heteroarileno- CH7-CH2-(OCH2CH>2)m-, ou -(CH>2),-cicloalcanodiil-CH2-CH2-(OCH2CH>)m-;
— cada W independentemente representa uma unidade de aminoácido;
— Y é -PAB-CO-(Z)--, com PAB sendo Due. (o oxigênio da unidade de PAB sendo ligado a CO-(Z)-);
— Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, ou ainda mais -NR4-(CH2).)-NR5-CO-(CH>2),- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2),-CO- (o grupo NR. sendo ligado ao grupo CO de PAB-CO);
— Z' é -NR+-(CH2)u-NR5- ou -NR4-(CH2)uy-NR5-CO-(CH2),- (o grupo NR, sendo ligado ao grupo CO de CO-Z');
— R1 e Rs são independentemente H ou um grupo (C1- Cse)alquila;
— cé 0 ou 1, preferivelmente, 1;
—- mé um número inteiro de 1 a 15;
— né um número inteiro de 1 a 6;
— pé um número inteiro de 1 a 6;
— gé 0,1 ou 2, preferivelmente, 2;
— ré um número inteiro de 1 a 24, notavelmente de 1 a 12;
—- ué um número inteiro de 1 a 6;
— vé um número inteiro de 1 a 6;
— wé um número inteiro de O a 5, preferivelmente, O ou 2;
— yé O ou 1 (preferivelmente, y é O quando w for O e y for O ou 1 quando w for um número inteiro de 1 a 5);
—- zéOoul; — z é O ou 1, notavelmente 0; e — X3 representa H quando y = z= 1 e Z é -NR4-(CH>2).-NRs5- ou quando c= w=y=0,2=1eZ é -NR+(CH2).-NRs5- e nos outros casos, X; representa OH, NH2 ou um grupo de saída.
[005] O grupo de saída é mais particularmente um átomo de ha- logênio, um sulfonato de fórmula -OSO>2-Rue, N-succinimidilóxi, 4-nitro- fenilóxi, pentafluorofenóxi ou N-benzotriazolóxi, R.e representando um grupo (C1-C6)alquila, arila, aril-(C1-C6)alquila ou (C1-C6)alquil-arila, sendo o referido grupo opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halogênio, como átomos de flúor.
[006] Preferivelmente, o composto de fórmula (1) não é um com- posto de fórmula (1) para o qual: = % Ss - XéCclXxéH gqéo0,Lié ,céO0,wéo,yé DeXxécCl; & | - XIÉ6Cl,X2éCl,gqéo,L16 “E .céo,wéo,yé DeXxécCl; & : - XI6ClX6H,géo, Li A .céO,wéo,yé DeXxécCl; : Ho --C A + - XMéCclXéH géo, Lié ,céO0,wéo,
yéceXxécCl - XéClXéH qéo Lié / ,céO,wéo,yé DeXxécCl; - XéClXéH qéo Lié / ,céO,wéo,yé 0 eX:;é Br; - XéClXéH qéo Lié / ,céO,wéo,yé DOeXxél; 1 Ho
O - XxéH,X é Cl, qé 0, Li é ,céO,wéo, yéceXxécCl « Ha Or - XxéH, XéBr,gqé 0, Li é ,céO0,wéo, yéceXxécCl - XxéH,XéBr,géO0,Lié / ,céO,wéo,yé DeXxécCl; 1 Ho
O - X é Cl XéCl,gé 0, Li é ,céO,wéo, yéceXxécCl - XéC,XéClgéo, Lié / ,céO0,wéo,yé DeXxécCl; % - XéClXéClgéo Lié O csouenyso eXxécCl;
1 Ha O: — XéCl,X éBr,géO0,L1 é ,céO0,wéo, yéceXxécCl 1 Ho Ho - XéCl X éBr, géO0, Li é ,céo,w é 0,yÉ6 0e X3 é CI; - XéCl,XéBr,gé 0,L1é / ,céO0,wéo,yé 0 e X;é CI; ou : Ho
O - X é Br, Xcé Br, qé 0, Ly é ,céO0,wéo, yéceXxécCl em que a linha tracejada indica o ponto de ligação de L, ao átomo de (9) Xi 89 | No Xs nitrogênio de O , e a linha ondulada indica o ponto de fixa- ção de L1 a Xs.
[007] Estes compostos são descritos em WO 2007/001932 ou na Patente Norte-americana 4.127.687, porém, não como um ligante que se destina mais particularmente à preparação de conjugados, tais co- mo ADCs.
[008] A presente invenção também se refere a um conjugado |i- gante-fármaco da seguinte fórmula (Il): (9) XX 8 A rico, oço X2 o (11),
preferivelmente, da seguinte fórmula (lla): x o.
NL pririeo-m.-0nro Xz ( (Ila) ou um sal do mesmo, em que: — X1 e X> representam, independentemente um do outro, H, um átomo de halogênio, um (C1-Cs)alcóxi, um arilóxi opcionalmente substituído, ou -O-(CH2CH20)-H, contanto que X: e X2> não represen- tem H ao mesmo tempo; — L, representa um grupo de fórmula Ly'-(CO-Z')- com Ly sendo -(CH2)n-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>-, arileno, heteroarileno, cicloal- canodiila, -(CH2),-arileno-, -(CH2),-heteroarileno-, -(CH>2)n-cicloalcano- diil-, -arileno-(CH>2)p-, -heteroarileno-(CH2)p-, -cicloalcanodiil-(CH2),p-, - (CH>2)rn-arileno-(CH2),-, -(CH2),-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2),-cicloalca- nodiil-(CH2)p-, -(CH2CH20)n-CH2-CH>2-arileno-(CH2)y-, -(CH2CH20O)m- CH2-CH>-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-cicloalcanodiil- (CH2),-, —-(CH2),-arileno-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, — -(CH2),-heteroarileno- CH7-CH2-(OCH2CH>2)m-, ou -(CH>2),-cicloalcanodiil-CH2-CH2-(OCH2CH>)m-; — cada W independentemente representa uma unidade de aminoácido; - Y é -PAB-CO(Z;, com PAB sendo Due. (o oxigênio da unidade de PAB sendo ligado a CO-(Z)-); — Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, ou ainda mais -NR4-(CH2)u)-NR5-CO-(CH>2),- ou -NR4-(CH2))-NR5-CO-(CH2),-CO- (o grupo NR. sendo ligado ao grupo CO de PAB-CO);
— Z é -NR4-(CH2)J-NRs5- ou -NR4-(CH2)J-NR5-CO-(CH>2),- (0 grupo NR, sendo ligado ao grupo CO de CO-Z'); — Ria e Rs são independentemente H ou um grupo (C1- C6)alquila; — Q representa uma porção de fármaco; — cé 0 ou 1, preferivelmente, 1; —- mé um número inteiro de 1 a 15; — né um número inteiro de 1 a 6; — pé um número inteiro de 1 a 6; — gé 0,1 ou 2, preferivelmente, 2; — ré um número inteiro de 1 a 24, notavelmente de 1 a 12; —- ué um número inteiro de 1 a 6; — vé um número inteiro de 1 a 6; — wé um número inteiro de O a 5, preferivelmente, O ou 2; — yé O ou 1 (preferivelmente, y é O quando w for 0 ey é O ou 1 quando w for um número inteiro de 1 a 5); - zéOoutie — z é O ou 1, notavelmente O.
[009] A presente invenção refere-se também a um conjugado unidade de ligação-fármaco da seguinte fórmula (III) ou (IV): Unidade de SH (EsYogana) “om L (CO) -(W),-(Y), -Q v s (IV) ou um sal do mesmo, preferivelmente, um sal farmaceuticamente acei-
tável do mesmo, em que:
— a unidade de ligação é um peptídeo, uma proteína (por exemplo, uma proteína modificada), um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;
— L, representa um grupo de fórmula Ly'-(CO-Z')- com Ly sendo -(CH2)n-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>-, arileno, heteroarileno, cicloal- canodiila, -(CH2),-arileno-, -(CH2),-heteroarileno-, -(CH>2)n-cicloalcano- diil-, -arileno-(CH>2)p-, -heteroarileno-(CH2)p-, -cicloalcanodiil-(CH2),p-, - (CH>2)rn-arileno-(CH2),-, -(CH2),-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2),-cicloalca- nodiil-(CH2)p-, -(CH2CH20)n-CH2-CH>2-arileno-(CH2)y-, -(CH2CH20O)m- CH2-CH>-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-cicloalcanodiil- (CH2)p-, -(CH2),-arileno-CH2-CH2-(OCH2CH2a)m-, -(CH2)n-heteroarileno- CH2-CH2-(OCH2CH>2)nm-, ou -(CH>),-cicloalcanodiil-CH2-CH2-(OCH2CH>)n-;
— cada W independentemente representa uma unidade de aminoácido;
- Y é -PAB-CO(Z;, com PAB sendo
Due. (o oxigênio da unidade de PAB sendo ligado a CO-(Z)z;
— Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, ou ainda mais -NR4-(CH2)u)-NR5-CO-(CH>2),- ou -NR4-(CH2))-NR5-CO-(CH2),-CO- (o grupo NR. sendo ligado ao grupo CO de PAB-CO);
— Z é -NR+-(CH2)i-NR5- ou -NRa4-(CH2)J-NR5-CO-(CH2),- (o grupo NR, sendo ligado ao grupo CO de CO-Z');
— Ria e Rs são independentemente H ou um grupo (C1- C6)alquila;
— Q representa uma porção de fármaco;
— cé 0 ou 1, preferivelmente, 1; —- mé um número inteiro de 1 a 15; — né um número inteiro de 1 a 6; — pé um número inteiro de 1 a 6; —- sé um número inteiro de 1 a 8; —- ué um número inteiro de 1 a 6; — vé um número inteiro de 1 a 6; — wé um número inteiro de O a 5, preferivelmente, O ou 2; — yé O ou 1 (preferivelmente, y é O quando w for 0 ey é O ou 1 quando w for um número inteiro de 1 a 5); - zéOoutie — z é O ou 1, notavelmente O.
[0010] De acordo com uma modalidade preferida, a unidade de ligação é um anticorpo IGF-1R, um anticorpo HER2 (por exemplo, tras- tuzumabe) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0011] A presente invenção também se refere ao uso de um ligan- te de fórmula (1) ou um conjugado fármaco-ligante de fórmula (Il), pre- ferivelmente, em que q = 2, para ligar covalentemente um fármaco a uma unidade de ligação, como um anticorpo (por exemplo, um anticor- po monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Uma tal ligação covalente é assim feita por meio de uma porção de ligante.
[0012] Na verdade, os compostos de fórmula (1) ou (II), preferivel- mente, para os quais q = 2, são úteis para ligar covalentemente um fármaco a uma unidade de ligação, tal como um anticorpo (por exem- plo, um anticorpo monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo.
[0013] Os compostos de fórmula (1) ou (Il) para os quais q = 0 ou 1 também podem ser usados como intermediários de síntese para a preparação de compostos de fórmula (1) ou (Il) para os quais q = 2. Em consequência, a presente invenção refere-se também aos compostos de fórmula (1) ou (Il) como definido acima, para os quais q = O ou 1, como intermediário de síntese.
[0014] A presente invenção também se refere a métodos para preparar o ligante de fórmula (1) ou os conjugados de fórmula (II), (Ill) ou (IV).
[0015] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado unidade de ligação- fármaco de fórmula (III) ou (IV) e pelo menos um excipiente farmaceu- ticamente aceitável.
[0016] A presente invenção também se refere a um conjugado unidade de ligação-fármaco de fórmula (III) ou (IV) ou uma composi- ção farmacêutica compreendendo um conjugado unidade de ligação- fármaco de fórmula (III) ou (IV) e pelo menos um excipiente farmaceu- ticamente aceitável para uso no tratamento do câncer.
[0017] A presente invenção também se refere ao uso de um con- jugado unidade de ligação-fármaco de fórmula (III) ou (IV) para a fabri- cação de um medicamento destinado a ser usado no tratamento do câncer.
[0018] A presente invenção também se refere a um método para o tratamento do câncer que compreende a administração a uma pessoa em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um conjuga- do unidade de ligação-fármaco de fórmula (III) ou (IV) ou de uma com- posição farmacêutica compreendendo um conjugado unidade de liga- ção-fármaco de fórmula (Ill) ou (IV) e pelo menos um excipiente far- maceuticamente aceitável.
DEFINIÇÕES
[0019] Para o propósito da invenção, o termo "farmaceuticamente aceitável" se destina a significar o que é útil para a preparação de uma composição farmacêutica, e o que é geralmente seguro e não tóxico para um uso farmacêutico.
[0020] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" pretende signifi- car, na estrutura da presente invenção, um sal de um composto que é farmaceuticamente aceitável, conforme definido acima, e que possui a atividade farmacológica do composto correspondente.
[0021] Os sais farmaceuticamente aceitáveis compreendem: (1) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgâni- cos, tais como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico e fosfórico e similares; ou formados com ácidos orgânicos, tais como ácido acéti- co, benzenossulfônico, fumárico, glico-heptônico, glicônico, glutâmico, glicólico, hidroxinaftoico, 2-hidroxietanossulfônico, lático, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, mucônico, 2-naftalenossulfônico, propiô- nico, succínico, dibenzoil-L-tartárico, tartárico, p-toluenossulfônico, tri- metilacético e trifluoroacético e similares, e (2) sais formados quando um próton ácido presente no composto é substituído por um íon de metal, tal como um íon de metal alcalino, um íon de metal alcalino-terroso ou um íon de alumínio; ou coordenado com uma base orgânica ou inorgânica. As bases orgâni- cas aceitáveis compreendem dietanolamina, etanolamina, N-metilglica- mina, trietanolamina, trometamina e similares. As bases inorgânicas aceitáveis compreendem hidróxido de alumínio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio e hidróxido de sódio.
[0022] O termo "halogênio", conforme usado na presente inven- ção, refere-se a um átomo de flúor, bromo, cloro ou iodo.
[0023] O termo "(C1-Cs) alquila", conforme usado na presente in- venção, refere-se a uma cadeia monovalente de hidrocarboneto satu- rada linear ou ramíificada contendo de 1 a 6 átomos de carbono inclu- indo, porém, não se limitando a, metila, etila, n-propila, iso-propila, n- butila, iso-butila, sec-butila, t-butila, n-pentila, n-hexila e similares.
[0024] O termo "(C1-Cs)alcóxi", conforme usado na presente in-
venção, refere-se a um grupo (C1-Cs)alquila como definido acima liga- do à molécula por meio de um átomo de oxigênio, incluindo, porém, não se limitando a, metóxi, etóxi , n-propóxi, iso-propóxi, n-butóxi, iso- butóxi, sec-butóxi, t-butóxi, n-pentóxi, n-hexóxi e similares.
[0025] O termo "(C2-Cs)alquenila", conforme usado na presente invenção, refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto monovalente in- saturada linear ou ramificada contendo de 2 a 6 átomos de carbono e compreendendo pelo menos uma ligação dupla incluindo, porém, não se limitando a, etenila, propenila, butenila, pentenila, hexenila e simila- res.
[0026] O termo "cicloalcanodiila", conforme usado na presente in- venção, refere-se a um anel hidrocarboneto saturado bivalente tendo vantajosamente de 4 a 10 átomos de carbono, notavelmente 5 ou 6 átomos de carbono incluindo, porém, não se limitando a, ciclopentano- diila, ciclo-hexandiila e similares. Preferivelmente, é um grupo ciclo- hexanodiila.
[0027] O termo "arila", conforme usado na presente invenção, refe- re-se a um grupo hidrocarboneto aromático monovalente compreen- dendo preferivelmente, 6 a 10 átomos de carbono e compreendendo um ou mais anéis fundidos, como, por exemplo, um grupo fenila ou naftila. Vantajosamente, será um grupo fenila.
[0028] O termo "aril-(C1-C6) alquila", conforme usado na presente invenção, refere-se a um grupo (C1-C6)alquila como definido acima substituído com um grupo arila como definido acima. Em particular, pode ser um grupo benzila.
[0029] O termo "(C1-C6) alquil-arila", conforme usado na presente invenção, refere-se a um grupo arila como definido acima substituído com um grupo (C1-C6)alquila como definido acima. Em particular, po- de ser um grupo tolila (CH3Ph).
[0030] O termo "arilóxi", conforme usado na presente invenção,
refere-se a um grupo arila conforme definido acima ligado à molécula por meio de um átomo de oxigênio, incluindo, porém, não se limitando a fenilóxi.
[0031] O termo "arileno", conforme usado na presente invenção, refere-se a um grupo hidrocarboneto aromático bivalente compreen- dendo preferivelmente, 6 a 10 átomos de carbono e compreendendo um ou mais anéis fundidos, como, por exemplo, um grupo fenileno ou naftileno. Vantajosamente, será um grupo fenileno.
[0032] O termo "heteroarileno", conforme usado na presente in- venção, refere-se a um grupo aromático bivalente compreendendo um ou vários, notavelmente um ou dois, ciclos de hidrocarbonetos fundi- dos em que um ou vários, notavelmente um a quatro, vantajosamente um a três, átomos de carbono, cada um foi substituído por um heteroá- tomo selecionado dentre um átomo de enxofre, um átomo de oxigênio e um átomo de nitrogênio, preferivelmente, selecionado dentre um átomo de oxigênio e um átomo de nitrogênio, mais preferivelmente, um átomo de nitrogênio. Vantajosamente, é um 1,2,3-triazol bivalente, tal como um 1H-1,2,3-triazol bivalente.
[0033] O termo "grupo de saída", conforme usado na presente in- venção, refere-se a um grupo químico que pode ser facilmente substi- tuído por um nucleófilo (tal como uma amina ou um álcool, respecti- vamente, carregando um grupo funcional NH ou OH) durante uma rea- ção de substituição de nucleófilo. Esse grupo de saída pode ser, em particular, um átomo de halogênio, um sulfonato, N-succinimidilóxi, 4- nitro-fenilóxi, pentafluorofenóxi ou N-benzotriazolóxi. O sulfonato é, em particular, um grupo -OSO>2-Rie com Rue representando um grupo (C1- C6) alquila, arila, aril-(C1-C6)alquila ou (C1-C6)alquil-arila, o referido grupo sendo opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halogênio, como átomos de flúor. O sulfonato pode ser notavelmente um mesilato (OMs, CH3-S(02)O-), um triflato (OTf, CF3-S(0)20-) ou um tosilato (OTs, p-Me-CesH4-S(O0)2O0-). O grupo de saída pode ser em par- ticular CI, Br, 1, OTf, OMs, OTf, N-succinimidilóxi, 4-nitro-fenilóxi ou N- benzotriazolóxi.
[0034] O termo "grupo trialquilsilila", conforme usado na presente invenção, refere-se a um grupo -SIAIKAIk2Alks em que Alki, Alk2 e Alksa, idênticos ou diferentes, representam um grupo (C1-Cs)-alquila como definido acima. Por exemplo, pode ser um grupo trimetilsilila ou trietilsílila.
[0035] O termo "forma protegida" de uma molécula significa que pelo menos uma função OH ou NH presente na referida molécula é protegida com um grupo de proteção O ou um grupo de proteção N, respectivamente.
[0036] O termo "grupo de proteção", conforme usado na presente invenção, refere-se a um grupo químico que bloqueia seletivamente um sítio reativo em um composto multifuncional de modo a permitir a realização seletiva de uma reação química em outro sítio reativo des- protegido.
[0037] O termo "grupo de proteção O", conforme usado na presen- te invenção, refere-se a um substituinte que protege os grupos hidroxi- la (OH) contra reações indesejáveis durante os procedimentos sintéti- cos, como os grupos O-protetor descritos em "Greene's Protective Groups In Organic Sintesis", 4" edition, 2007, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey. Um grupo hidroxila protegido por um grupo de proteção O pode ser, por exemplo, um éter, um éster, um carbonato, um acetal e similares. Em particular, os grupos de proteção O podem ser uma (C1-Cs)alquila opcionalmente substituídos com um ou vários (notavelmente 1 a 3) átomos de halogênio (como átomos de cloro), tal como metila, etila, terc-butila ou 2,2,2-tricloroetila; uma aril-(C1-Cs) al- quila, tal como uma benzila, a porção arila sendo opcionalmente subs- tituída com um ou vários grupos metóxi, tal como benzila (Bn) ou p-
metoxibenzila (PMB); um derivado de tritila de fórmula -CArAr2Ar;, tal como trifenilmetila (também chamado de tritila - Tr), (4-metoxifenil)dife- nilmetila (também chamado de metoxitritila - NMT) ou bis-(4-metoxi- fenil)fenilmetila (também chamado de dimetoxitritila - DMT); um grupo metila substituído de fórmula -CH2ORcr2 ou -CH2SRer2 (em particular - CH2ORGçr2), por exemplo, metoximetila (MOM), benziloximetila, 2-me- toxietoximetila (MEM), 2-(trimetilsili)etoximetila ou metiltiometila; um grupo etila substituído de fórmula -CH2CH2ORcr2 ou -CH2CH2SRer2 (em particular -CH2CH2ORGr2), por exemplo, etoxietila (EE); um grupo silila de fórmula -SiRcraRcPaRGPs, por exemplo, trimetilsilila (TMS), trie- tilsilila (TES), t-butildimetilsilila (TBS ou TBDMS) e t-butildifenilsílila (TBDPS); um grupo carbonilado de fórmula -CO-Reps, tal como acetila (Ac), pivaloíla (Piv ou Pv) ou benzoíla (Bz) ou de fórmula -CO>2-Rerr7, tal como aliloxicarbonila (Alloc) ou 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc); Ox ou um tetra-hidropiranila o! ) (THP) ou grupo tetra-hidrofuranila O, à
C DD com Ari, Ar? e Ar; representando, independentemente um do outro, uma arila, tal como uma fenila, opcionalmente substituída com um ou vários grupos metoxila; Rer2 representando uma (C1-Cs)alquila (tal como metila ou etila) opcionalmente substituída com uma arila (tal co- mo fenila), um (C1-Cse)alcóxi (tal como metóxi) ou um grupo trialquilsilila (tal como SiMes); Rep3, Rerpa e Reps representando, independentemen- te um do outro, um grupo (C1-Cs)alquila ou arila (tal como fenila); e Rer6s e Rep7 representando, independentemente um do outro, um gru- po (C1-Cs)alquila, (C2-Ce)alquenila, uma arila, uma aril-(C1-Ce)alquila ou um grupo 9-fluorenilmetila.
[0038] O termo "grupo de proteção N", conforme usado na presen- te invenção, refere-se aos grupos destinados a proteger uma função amina (notavelmente uma função amina primária) contra reações in-
desejáveis durante os procedimentos sintéticos. Grupos de proteção N comumente usados são descritos em "Greene's Protective Groups In Organic Sintesis", 4!" edition, 2007, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey. Uma função amina protegida por um grupo de proteção N po- de ser um carbamato, uma amida, uma sulfonamida, um derivado de N-alquila, um derivado de aminoacetal, um derivado de N-benzila, um derivado de imina, um derivado de enamina ou um derivado de N- heteroátomo. Em particular, os grupos de proteção N podem ser formi- la; uma arila, tal como um fenila, opcionalmente substituídos com um ou vários grupos metoxila, tal como p-metoxifenila (PMP); uma aril-(C1- Cs) alquila, tal como uma benzila, uma porção arila sendo opcional- mente substituída por um ou vários grupos metóxi, tal como benzila (Bn), p-metoxibenzila (PMB) ou 3,4-dimetoxibenzila (DMPM); -CO-Rer1 tal como acetila (Ac), pivaloíla (Piv ou Pv), benzoíla (Bz) ou p- metoxibenzilcarbonila (Moz); -CO>-Rer: tal como fbutiloxicarbonila (Boc), tricloroetoxicarbonila (TROC), aliloxicarbonila (Alloc), benziloxi- carbonila (Cbz ou Z) ou 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc); -SO2-Rer'1 tal como fenilsulfonila, tosila (Ts ou Tos) ou 2-nitrobenzenossulfonila (também denominado nosila - Nos ou Ns); e similares, com Rer1 representando uma (C1-Cs)alquila opcionalmente substituída com um ou vários átomos de halogênio, tal como F ou Cl; uma (C2- Cse)alquenila, tal como uma alila; uma arila, tal como uma fenila, opcio- nalmente substituída com um ou vários grupos escolhidos entre OMe (metóxi) e NO, (nitro); uma aril-(C1-Cs)alquila, tal como uma benzila, a porção arila sendo opcionalmente substituída com um ou vários gru- pos metóxi; ou um grupo 9-fluorenilmetila.
[0039] Os termos "anticorpo", "anticorpos", "ab", "Ab", "MAb" ou "imunoglobulina" são usados alternadamente no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais, isolados, modificados ou anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos monoclonais inteiros ou intac-
tos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes ou anticorpos mul- tiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e também frag- mentos de anticorpos dos mesmos, desde que exibam a atividade bio- lógica desejada.
[0040] O termo "anticorpo recombinante" refere-se a um anticorpo que resulta da expressão de DNA recombinante em células vivas. Um anticorpo recombinante de acordo com a invenção é obtido usando métodos laboratoriais de recombinação genética, bem conhecidos por alguém versado na técnica, criando sequências de DNA que não seri- am encontradas em organismos biológicos.
[0041] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticor- po de acordo com a invenção se destina a indicar qualquer peptídeo, polipeptídeo ou proteína que mantém a capacidade de se ligar ao alvo (também geralmente referido como antígeno) do anticorpo.
[0042] Por "ligação", "liga-se" ou similares, pretende-se que o anti- corpo, ou qualquer fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, forme um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condi- ções fisiológicas. A ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 1 x 106 M. Os métodos para determinar se duas moléculas se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície, ensaios radiomarcados e simi- lares. Para evitar dúvidas, isso não significa que o referido anticorpo não possa se ligar ou interferir, em um nível baixo, com outro antígeno. No entanto, como uma modalidade, o referido anticorpo liga-se apenas ao referido antígeno.
[0043] Conforme usado no presente relatório descritivo, a expres- são "anticorpo IGF-1R" deve ser interpretada como similar a "anticorpo anti-|GF-1R" e significa um anticorpo capaz de se ligar ao IGF-1R.
[0044] Conforme usado no presente relatório descritivo, a expres-
são "anticorpo HER2" deve ser interpretada como similar a "anticorpo anti-HER2" e significa um anticorpo capaz de se ligar a HER2.
[0045] O termo metade da concentração efetiva máxima (ECso) corresponde à concentração de um fármaco, anticorpo ou tóxico que induz uma resposta a meio caminho entre a linha de base, e o máximo após algum tempo de exposição especificado. É comumente usado como uma medida da potência de fármaco. A EC5o de uma curva de dose-resposta graduada representa, portanto, a concentração de um composto onde 50 % do seu efeito máximo é observado. À ECso de uma curva de dose-resposta representa a concentração de um com- posto onde 50 % da população exibe uma resposta, após a duração de exposição especificada. As medidas de concentração normalmente seguem uma curva sigmoidal, aumentando rapidamente ao longo de uma mudança relativamente pequena na concentração. Isso pode ser determinado matematicamente pela derivação da linha de melhor ajus- te.
[0046] Como uma modalidade preferida, a ECso, determinada na presente invenção, caracteriza a potência do anticorpo para se ligar ao IGF-1R ECD exposto em células tumorais humanas. O parâmetro de ECs5o é determinado usando análise FACS. O parâmetro de ECro refle- te a concentração de anticorpo para a qual é obtida 50% da ligação máxima no IGF-1R humano expresso em células tumorais humanas. Cada valor de ECrso foi calculado como o ponto médio da curva de do- se-resposta usando um programa de ajuste de curva de regressão de quatro parâmetros (Software Prism). Este parâmetro foi selecionado para ser representativo das condições fisiológicas/patológicas.
[0047] O termo "epitopo" é uma região de um antígeno que é liga- da por um anticorpo. Os epitopos podem ser definidos como estrutu- rais ou funcionais. Os epitopos funcionais são geralmente um subcon- junto dos epitopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epitopos também po- dem ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não linea- res. Em certas modalidades, os epitopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de molécu- las, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas de carga.
[0048] O termo "anticorpo monoclonal" ou "Mab", conforme aqui usado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos indivi- duais da população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantida- des. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo di- recionados contra um único epitopo. Esse anticorpo monoclonal pode ser produzido por um único clone de células B ou hibridoma. Os anti- corpos monoclonais também podem ser recombinantes, isto é, produ- zidos por modificação de proteínas ou síntese química. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fago. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem vários anticorpos direcionados contra vários determinantes, ou epitopos, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único epitopo do antígeno. O anticorpo mono- clonal aqui inclui anticorpo de murino, quimérico e humanizado.
[0049] O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo contendo uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) derivada de um anticorpo de uma determinada espécie em combina- ção com regiões constantes da cadeia leve, e da cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga à referida determinada espécie. Os anticorpos quiméricos podem ser preparados usando técnicas de genética recombinante. Por exemplo, o anticorpo quimérico pode ser produzido por clonagem de DNA recombinante contendo um promotor e uma sequência que codifica para a região variável de um anticorpo monoclonal não humano, notavelmente murino, e uma sequência que codifica para a região constante do anticorpo de espécie heteróloga, preferivelmente, humana. Um anticorpo quimérico de acordo com a invenção codificado por um tal gene recombinante pode ser, por exemplo, uma quimera camundongo-humano, a especificidade deste anticorpo sendo determinada pela região variável derivada do DNA de murino e seu isótipo determinado pela região constante derivada do DNA humano.
[0050] O termo "anticorpos humanizados" significa um anticorpo que contém regiões CDR derivadas de um anticorpo de origem não humana, as outras partes da molécula de anticorpo sendo derivadas de um (ou vários) anticorpos humanos. Além disso, alguns dos resí- duos do segmento de esqueleto (chamados FR) podem ser modifica- dos para preservar a afinidade de ligação. Os anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos podem ser preparados por técnicas co- nhecidas por uma pessoa versada na técnica. Esses anticorpos hu- manizados são preferidos para seu uso em métodos envolvendo diag- nósticos in vitro ou tratamento preventivo e/ou terapêutico in vivo. Ou- tras técnicas de humanização, também conhecidas por alguém versa- do na técnica, tal como, por exemplo, a técnica de "enxerto de CDR" descrita por PDL em patentes e pedidos de patente EP 0 451 216, EP O 682 040, EP O 939 127, EP O 566 647, US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089, US 5.693.761. As patentes Norte-americanas
5.639.641, 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293 também podem ser cita- das.
[0051] Sem especificação contraditória no presente relatório des- critivo, regiões de determinação da complementaridade ou CDRs sig-
nificam as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves de imu- noglobulinas conforme definido de acordo com o sistema de numera- ção IMGT.
[0052] No entanto, as CDRs também podem ser definidas de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., Sequen- ces of proteins of immunological interest, 5!" Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, e edições posteriores). Exis- tem três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve. Aqui, os termos "CDR" e "CDRs" são usados para indicar, dependendo do ca- so, uma ou mais, ou mesmo todas, as regiões contendo a maioria dos resíduos de aminoácidos responsáveis pela afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno ou epitopo que ele reconhece. Para simplifi- car a leitura do presente pedido, as CDRs de acordo com Kabat não são definidas. No entanto, seria óbvio para a pessoa versada na técni- ca, usando a definição das CDRs de acordo com IMGT, definir as CDRs de acordo com Kabat.
[0053] No sentido da presente invenção, a "identidade" ou "por- centagem de identidade" entre duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a porcentagem de nucleotídeos idênticos ou resíduos de aminoácidos entre as duas sequências a serem compara- das, obtida após o alinhamento ideal, esta porcentagem sendo pura- mente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo dis- tribuídas randomizadamente ao longo de seu comprimento. A compa- ração de duas sequências de ácido nucleico ou de aminoácidos é tra- dicionalmente realizada comparando as sequências após tê-las ali- nhado de forma otimizada, a referida comparação podendo ser condu- zida por segmento ou usando uma "janela de alinhamento". O alinha- mento ideal das sequências para comparação pode ser realizado, além da comparação à mão, por meio do algoritmo de homologia local de Smit e Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por meio do algo-
ritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], por meio do método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ou por meio de software de computador usando esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Gene- tics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou pelo software de comparação BLAST NR ou BLAST P).
[0054] A identidade percentual é calculada determinando o número de posições nas quais o nucleotídeo de aminoácido ou resíduo é idêntico entre as duas sequências, preferivelmente, entre as duas sequências completas, dividindo o número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de alinhamento e multiplicando o resultado por 100 para obter a identidade percentual entre as duas sequências.
[0055] Por exemplo, o programa BLAST, "sequências BLAST 2" (Tatusova et al., " Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250) disponível no site http://www .ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, pode ser usado com os parâmetros padrão (notadamente para os parâmetros "penalidade de intervalo aberto": 5 e "penalidade de intervalo de exten- são": 2 ; sendo a matriz selecionada por exemplo a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa); a porcentagem de identidade entre as duas sequências a serem comparadas é calculada diretamente pelo progra- ma.
[0056] Pelas expressões "mutação-reversa" ou "mutação reversa" entende-se uma mutação ou substituição do resíduo humano presente na linha germinativa pelo resíduo correspondente inicialmente presen- te na sequência de murino.
[0057] Os termos "ácido nucleico", "sequência de nucleotídeo", "sequência de ácido nucleico", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", "sequência de polinucleotídeo" e "sequência de nucleotídeo", usados alternadamente na presente descrição, significam uma sequência pre- cisa de nucleotídeos, modificado ou não, definindo um fragmento ou uma região de um ácido nucleico, contendo nucleotídeos não naturais ou não, e sendo um DNA de fita dupla, um DNA de fita simples ou produtos de transcrição dos referidos DNAs.
[0058] O termo "peptídeo" refere-se a uma cadeia de monômeros de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas (ami- da). As ligações peptídicas covalentes (amidas) são formadas pela re- ação do grupo carboxila (COOH) de um aminoácido com o grupo ami- no (NH>2) de outro aminoácido. O termo peptídeo inclui oligopeptídeo e polipeptídeo.
[0059] O termo "proteína" é um conjunto de um ou vários peptí- deos, conforme definido acima, que foram submetidos a modificações pós-tramslacionais e dobramento de proteínas, de modo que sejam arranjados de uma forma biologicamente funcional.
[0060] O termo "aminoácido", conforme usado na presente inven- ção, refere-se a a-aminoácidos naturais (por exemplo, Alanina (Ala), Arginina (Arg), Asparagina (Asn), Ácido Aspártico (Asp), Cisteína (Cys), Glutamina (Gln), Ácido Glutâmico (Glu), Glicina (Gly), Histidina (His), Isoleucina (Ile), Leucina (Leu), Lisina (Lys), Metionina (Met), Fe- nilalanina (Phe), Prolina (Pro), Serina (Ser), Treonina (Thr), Triptofano (Trp), Tirosina (Tir) e Valina (Val)) na forma D ou L, bem como amino- ácido não natural (por exemplo, B-alanina, alilglicina, terc-leucina, áci- do 3-amino-adípico, ácido 2-aminobenzoico, ácido 3-aminobenzoico, ácido 4-aminobenzoico, ácido 2-aminobutanoico, 4-amino-1-carboxi- metil piperidina, ácido 1-amino-1-ciclobutanecarboxílico, ácido 4-amino- ciclo-hexanoacético, ácido 1-amino-1-ciclo-hexanocarboxílico, ácido (1R,2R)-2-aminociclo-hexanocarboxílico, ácido (1R,2S)-2-aminociclo- hexanocarboxílico, ácido (1S8,2R)-2-aminociclo-hexanocarboxílico, áci- do (18,2S)-2-aminociclo-hexanocarboxílico, ácido 3-aminociclo-hexa-
nocarboxílico, ácido 4-aminociclo-hexanocarboxílico, ácido (1R,2R)-2- aminociclopentanocarboxílico, ácido (1R,2S)-2-aminociclopentanocar- boxílico, ácido 1-amino-1-ciclopentanocarboxílico, ácido 1-amino-1-ci- clopropanocarboxílico, ácido 4-(2-aminoetóxi)-benzoico, ácido 3-ami- nometilbenzoico, ácido 4-aminometilbenzoico, ácido 2-aminobuta- noico, ácido 4-aminobutanoico, ácido 6-amino-hexanoico, ácido 1- aminoindano-1-carboxílico, ácido 4-aminometil-fenilacético, ácido 4-a- minofenilacético, ácido 3-amino-2-naftoico, ácido 4-aminofenilbuta- noico, ácido 4-amino-5-(3-indolil)-pentanoico, ácido (4R,58)-4-amino- b5-metil-heptanoico, ácido (R)-4-amino-5-metil-hexanoico, ácido (R)-4- amino-6-metiltio-hexanoico, ácido (S)-4-amino-pentanoico, ácido (R)-4- amino-5-fenilpentanoico, ácido 4-aminofenilpropiônico, ácido (R)-4- aminopimérico, ácido (4R,5R)-4-amino-5-hiróxi-hexanoico, ácido (R)-4- amino-S5-hidroxipentanoico, ácido (R)-4-amino-5-(p-hidroxifenil)-penta- noico, ácido 8-aminooctanoico, ácido (2S,4R)-4-amino-pirrolidina-2- carboxílico, ácido (2S,4S)-4-amino-pirrolidina-2-carboxílico, ácido aze- tidina-2-carboxílico, ácido (2S,4R)-4-benzil-pirrolidina-2-carboxílico, ácido (S)-4,8-diaminooctanoico, ácido terc-butilglicina, y-carboxigluta- mato, B-ciclo-hexilalanina, citrulina, ácido 2,3-diamino propiônico, ácido hipúrico, homociclo-hexilalanina, moleucina, homofenilalanina, 4-hidro- xiprolina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido isonipecótico, a-metil- alanina, ácido nicopético, norleucina, norvalina, ácido octa-hidroindol- 2-carboxílico, ornitina, penicilamina, fenilglicina, ácido 4-fenil-pirroli- dina-2-carboxílico, ácido pipecólico, propargilglicina, 3-piridinilalanina, 4-piridinilalanina, ácido 1-pirrolidina-3-carboxílico, sarcosina, estatinas, ácido tetra-hidroisoquinolina-1-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetra-hidroiso- quinolina-3-carboxílico, ou ácido tranexâmico).
DESCRIÇÃO DETALHADA Porção ligante
[0061] A porção ligante de acordo com a presente invenção permi-
te ligar covalentemente um anticorpo a pelo menos uma porção de fármaco.
[0062] A porção ligante pode ser "não clivável" ou "clivável".
[0063] Em uma modalidade preferida, consiste em uma porção ligante "clivável" facilitando a liberação do fármaco na célula.
[0064] Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossomo ou caveolas). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo, porém, não se limitando a, uma protease lisossômica ou endossômica. Nor- malmente, o ligante de peptidila compreende pelo menos dois aminoá- cidos sucessivos ou pelo menos três aminoácidos sucessivos. Os agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, todas as quais são conhecidas por hidrolisar derivados de fármacos dipeptí- dicos, resultando na liberação de fármaco ativo dentro das células al- vo. Por exemplo, um ligante de peptidila que é clivável pela protease dependente de tiol catepsina-B, que é altamente expresso em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligante compreendendo Phe-Leu ou Gly-Phe-Leu-Gly). Em modalidades específicas, o ligante de peptidila clivável por uma protease intracelular compreende ou é Val-Cit, Phe-Lys ou Val-Ala. Uma vantagem de usar a liberação pro- teolítica intracelular do fármaco é que o fármaco é tipicamente atenua- do quando conjugado e as estabilidades séricas dos conjugados são tipicamente altas.
[0065] O grupo -L1-(CO).- representa a unidade extensora da por- ção de ligante, que está necessariamente presente. O grupo -L1-(CO).- é um grupo de fórmula -Ly-(CO-Z');-(CO).- com Z' e c sendo O ou 1, como um grupo -L1-(CO).- quando Zz' for O. Preferivelmente, quando pelo menos um dentre w e y não for O, então z' será O e, nos outros casos, z' será O ou 1.
[0066] Ly representa -(CH2)n-, -(CH2CH2O0 )m-CH2-CH>-, arileno, he- teroarileno, cicloalcanodiila, -(CH2)n-arileno-, -(CH2)n-heteroarileno-, - (CH>2)r-cicloalcanodiil-, -arileno-(CH2),-, -heteroarileno-(CH2),-, -cicloal- canodiil-(CH2),y-, -(CH2),-arileno-(CH>2)p-, -(CH2),-heteroarileno-(CH>2),p-, -(CH2)r-cicloalcanodiil-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-arileno-(CH2)p-, -(CH2CH20)n-CH2-CH>a-heteroarileno-(CH2),-, -(CH2CH20)m-CH2-CH2- cicloalcanodiil-(CH2)p-, -(CH2)n-arileno-CH2-CH2-(OCH2CHa)m-, -(CH>2),- heteroarileno-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, ou -(CH>)rn-cicloalcanodiil-CH2- CH2-(OCH2CH>2)m-. Mais particularmente, o arileno é um fenileno; a ci- cloalcanodiila é uma ciclo-hexanodiila, tal como uma para-ciclo-hexa- nodiila; e o heteroarileno é um 1,2,3-triazol bivalente, tal como um 1H- 1,2,3-triazol bivalente.
[0067] De acordo com uma modalidade particular, Ly' representa - (CH2)n-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>2-, arileno, -cicloalcanodiil-, -(CH>2),-ari- leno-, -arileno-(CH2)n-, -(CH2)»-cicloalcanodiil-, -cicloalcanodiil-(CH>2)»n-,
NAN NAN NAN DSI, YA, Co)ÁAN A n n m no ATT, Ns AT, Mais particularmente, o arileno é um fenileno; e a cicloalcanodiila é uma ciclo-hexanodiila, tal como uma para-ciclo-hexanodiila.
[0068] De acordo com outra modalidade particular, Ly'' representa - (CH2))- ou -(CH2CH2O0)n-CH2-CH>2-, notavelmente -(CH>2)"- tal como - (CH2)5-.
[0069] Ly', porção de unidade extensora, pode ser concluída com a porção de unidade extensora, CO-Z' com Z' sendo -CO-NR4a-(CH>2).- NR5- ou -CO-NR4-(CH2)u)-NR5-CO-(CH>2),-, quando Z' = 1. Ra e R5 são independentemente H ou (C1-Cs)alquila, tal como H ou Me. u e v são independentemente um número inteiro de 1 a 6, tal como de 1 a 4, no- tavelmente 1 ou 2, por exemplo, 2.
[0070] (W)y representa a unidade de aminoácido do ligante.
[0071] A unidade de aminoácido do ligante pode ser enzimatica- mente clivada por uma enzima incluindo, porém, não se limitando a, uma protease associada a tumor para liberar o fármaco.
[0072] A unidade de aminoácido pode ser projetada e otimizada em sua seletividade para clivagem enzimática por uma protease asso- ciada a um tumor particular. As unidades adequadas são aquelas cuja clivagem é catalisada pelas proteases, catepsina B, C e D e plasmina.
[0073] (W)w pode estar ausente (w = 0) ou pode ser uma unidade de dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo ou pentapeptídeo (w = 1,2,3, 4 ou 5), em que os aminoácidos que formam o peptídeo podem ser diferentes um do outro.
[0074] Assim, (W)w pode ser representado pela seguinte fórmula: (W1)Jw1(W2)w2(W3)“w3(W4).va(W5)uws, EM que cada W1 a W5B5 representa, independentemente um do outro, uma unidade de aminoácido e cada w|aw5éOou!1.
[0075] Em algumas modalidades, a unidade de aminoácido (W)w pode compreender resíduos de aminoácidos, como aqueles que ocor- rem naturalmente, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos de ocorrência não natural, como citrulina.
[0076] Os resíduos de aminoácidos da unidade de aminoácido (W)w incluem, sem limitação, alanina, valina, leucina, isoleucina, meti- onina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina protegida ou não com ace- tila ou formila, arginina, arginina protegida ou não com grupo(s) tosila ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetila ou formila e citrulina. Componentes ligantes de aminoácidos exemplares incluem preferivelmente, um dipeptídeo ou um tripeptídeo.
[0077] Dipeptídeos exemplares incluem: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala,
Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-Nº-tosil-Arg, e Phe-Nº-Nitro-Arg, preferivelmente, Val-Cit ou Val-Ala.
[0078] Tripeptídeos exemplares incluem: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.
[0079] Tetrapeptídos exemplares incluem: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO. 54).
[0080] Pentapeptídeos exemplares incluem: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO. 55).
[0081] De acordo com uma modalidade particular, (W)w pode ser um dipeptídeo (isto é, w = 2), tal como Val-Cit ou Val-Ala, preferivel- mente, Val-Cit, ou o ligante não possui uma unidade de aminoácido (w = 0). Quando o ligante carece de uma unidade de aminoácido, preferi- velmente, também carece de uma unidade espaçadora Y (y = O).
[0082] De acordo com uma modalidade preferida, w = O (isto é, (W)w é uma ligação simples) ou w = 2 (isto é, (W)w é um dipeptídeo) e (W)w pode, assim, ser selecionado a partir de: o RO : ES: 2 7 Ô (Ala-Ala), o RO . O 2 A O (vatAla,e H2aN o) sf o
OO AO º (Val-Cit),
e em particular é Val-Cit, em que o asterisco indica o ponto de fixação à unidade espaçadora Ye a linha ondulada indica o ponto de ligação a -L1-(CO).- (CO sec=1ouLl;sec=0).
Y representa a unidade espaçadora do ligante.
[0083] As unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: autoi- molativas e não autoimolativas. Uma unidade espaçadora não autoi- molativa é aquela em que parte ou toda a unidade espaçadora perma- nece ligada ao fármaco após a clivagem enzimática de uma unidade de aminoácido do conjugado anticorpo-fármaco. Exemplos de uma unidade espaçadora não autoimolativa incluem, porém, não estão limi- tados a uma unidade espaçadora (glicina-glicina) e uma unidade es- paçadora de glicina. Para liberar o fármaco, uma reação de hidrólise independente deve ocorrer dentro da célula alvo para clivar a ligação da unidade glicina-fármaco.
[0084] Uma unidade espaçadora autoimolativa pode liberar a fár- mMaco sem a necessidade de uma etapa de hidrólise separada. Nessas modalidades, (Y) é um resíduo da unidade de álcool p-aminobenzílico (PAB) que está ligado a (W)v através do átomo de nitrogênio do grupo PAB, e conectado diretamente ao fármaco através de um grupo éster, carbonato, carbamato ou éter. Tal ligante compreendendo uma porção PAB também pode ser considerado como um ligante sem rastros.
[0085] Na presente invenção, a unidade espaçadora (Y) é -PAB- CO-(Z);-- com PAB sendo Du: (o oxigênio da unidade PAB sendo ligado à carbonila), também denominado -para-amino- benzil-O-CO-, e y = 1 ou o ligante não possui uma unidade espaçadora
(y=0).
[0086] O espaçador -para-aminobenzil-O-CO- pode ser completa- do com um espaçador Z que é -NR4-(CH2)u-NRs5- ou -NRa-(CH>2)u-NRs5- CO- ou ainda -NR4-(CH2)J-NR5-CO-(CH>2),-or -NRa4-(CH2)u-NR5-CO- (CH2),-CO-, quando z = 1. Ra e R5 são independentemente H ou (C1- Cse)alquila, tal como H ou Me. u e v são independentemente um núme- ro inteiro de 1 a 6, tal como de 1 a 4, notavelmente 1 ou 2, por exem- plo, 2.
[0087] Vantajosamente, y é O quando w for O e y é O ou 1 quando w for um número inteiro de 1 a 5, o que significa que a unidade espa- çadora Y pode estar presente apenas quando uma unidade de amino- ácido W está presente.
[0088] Preferivelmente, y é O quando w for O e y é 1 quando w for um número inteiro de 1 a 5, o que significa que a unidade espaçadora Y está presente quando uma unidade de aminoácido (W)v está pre- sente e está ausente quando a unidade de amino (W), está ausente.
[0089] De acordo com uma modalidade particular, o grupo -L1- (CO)--(W)w-(Y),- representa -(CH2)n-, -(CH2))-CO-, -(CH2CH20)m-CH2- CH2, -(CHCCH2O0)nm-CH2-CH2-CO-, -CH>a-para-ciclo-hexil-CO-, -aril- (CH2)n-, -(CH2)n-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit- para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2CH20)n-CH2-CH2-Val-Cit-para-amino- benzil-O-CO-, -(CH2CH2O0)nm-CH2-CH2-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O- CO-, -CH>-para-ciclo-hexil-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-, -aril- (CH2),-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-, — -aril-CO-Val-Cit-para-amino- benzil-O-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2))-CO- Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2CH2O0)m-CH2-CH2-Val-Ala-para- aminobenzil-O-CO-, — -(CH2CH20)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-para-amino- benzil-O-CO-, — -CH>-para-ciclo-hexil-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O- CO-, -aril-(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-, — -aril-CO-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH-
(CH2))-NH-, — -(CH2))-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH>).- NH-, -(CH2CH20)nm-CH2-CH2-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH- (CH2))-NH-, — -(CH2CH2O0)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O- CO-NH-(CH2)J-NH-, -CHa-para-ciclo-hexil-CO-Val-Cit-para-aminoben- Zil-O-CO-NH-(CH2)J-NH-, -aril-(CH2),-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO- NH-(CH2)J-NH-, — -aril-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH>2).- NH-, -(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2).-NH-, -(CH>2)n- CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2).-NH-, -(CH2CH20O)m- CH2-CH2-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2CH20 )m- CH2-CH2-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2)|-NH-, — -CH>2- para-ciclo-hexil-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, - aril-[(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2).-NH-, — -aril-CO- Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2).-NH-, -(CH>2)n-Val-Cit-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)uy-NCH3-CO-, -(CH2)J-CO-Val-Cit-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-, — -(CH2CH20 )m-CH2-CH>- Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u|-NCH3-CO-, -(CH2CH2O0)m -CH2-CH2-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u|-NCH3-CO- ; -CH>-para-ciclo-hexil-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3- (CH2)|-NCH3-CO-, — -aril-(CH2),-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH;3- (CH2)|-NCH3-CO-, -aril-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3- (CH2)|-NCH3-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCHs3- (CH2)|-NCH3-CO-, -(CH2))-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH;3- (CH2)I|-NCH3-CO-, — -(CH2CH2O0)m-CH2-CH>-Val-Ala-para-aminobenzil- O-CO-NCH3-(CH2)uy-NCH3-CO-, — -(CH2CH20 )m-CH2-CH2-CO-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u!-NCH3-CO-, -CH>-para-ciclo- hexil-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)!-NCH3-CO-, — - aril-(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-, - aril-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)!-NCH3-CO- N=N NAN N=N IE DE IA,
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[0090] O grupo -L1-(CO)--(W)w(Y)y- pode também representar - (CH2))-CO-NCH3-(CH2)!-NCH3-CO-(CH2),-, — -(CH2))h-CO-NCH3-(CH>2).- NCH5-CO-(CH2),-CO-, -(CHsCH2O)m-CH2-CH2-CO-NCHs-(CH2)i-NCHs- CO-(CH2).-, -(CH2CH20)n-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)i-NCH3-CO- (CH2),-CO-, -CH>-para-ciclo-hexil-CO-NCH3-(CH2)u|-NCH3-CO-(CH>),-, -CH>2-para-ciclo-hexil-CO-NCH3-(CH2).|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -aril- (CHo))-CO-NCH3-(CH2)I-NCH3-CO-(CH2), — — caril -(CHo))-CO-NCH3- (CHo)I-NCH3-CO-(CH2)-CO-, — -(CHa))-CO-NCH3-(CHo)-NCH3-, — - (CH2))-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-, -(CH2CH20 )nm-CH2-CH2-CO-NCH3- (CH2)|-NCH3-, — -(CH2CH2O0)nm-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2).-NCH3-, — - (CH2CH20)n-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)-NCH3-CO-, — -CH>-para-ciclo- hexil-CO-NCH3-(CH2).-NCH3-, -CH2-para-ciclo-hexil-CO-NCH3-(CH2).- NCH3-CO-, -aril-(CH2))-CO-NCHs-(CH2)u-NCHs-, -aril-(CH2))-CO-NCHs- (CH2)|-NCH3-, -aril-(CH2))-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-, -(CH2)1-CO-
NH-(CHo)i-NH-, -(CHo))-CO-NH-(CHo)J-NH-CO-, -(CH2CH2O)m-CHo- CH2-CO-NH-(CH2).|-NH-, — -(CH2CH20 )m-CH2-CH2-CO-NH-(CH>2).-NH- CO-, -CH>2-para-ciclo-hexil-CO-NH-(CH2))-NH-, -CH2-para-ciclo-hexil- CO-NH-(CHo)U-NH-CO-, -aril-(CHo))-CO-NH-(CHo)I-NH-, -aril-(CHo)n- CO-NH-(CH2)J-NH-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH;3- (CH2).|-NCH3-CO-(CH>2),-, -(CH2),-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO- NCH3-(CH2)u|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2).-, — -(CH2))-CO-Val- Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)./-NCH3-CO-(CH>2),-CO-, - (CH2CH20)nm-CH2-CH>2-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH>2)u- NCH3-CO-(CH2),-, -(CH2CH20)nm-CH2-CH2-Val-Cit-para-aminobenzil-O- CO-NCH3-(CH2).|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -(CHCH20)n-CH2-CH2-CO- Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)uy-NCH3-CO-(CH>2),-, - (CH2CH20)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH;3- (CH2)I|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -CHa-para-ciclo-hexil-CO-Val-Cit-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-, — -CHa-para-ciclo- hexil-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2).-NCH3-CO- (CH2))-CO-, -aril-(CH2))-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2).- NCH3-CO-(CH2).-, — -aril-(CH2))-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3- (CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -aril-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO- NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-, — -aril-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O- CO-NCH3-(CH2)I-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -(CH2)n-Val-Ala-para-amino- benzil-O-CO-NCH3-(CH2)u|-NCH3-CO-(CH>2),-, -(CH2)n-Val-Ala-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -(CH2))-CO- Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u|-NCH3-CO-(CH>2).-, - (CH2))-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO- (CH2))-CO-, — -(CH2CH20 )nm-CH2-CH>2-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO- NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2),-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>2-Val-Ala-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)i-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -(CH2CH2O)m- CH2-CH2-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-
(CH2))-, — -(CH2CH2O0)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO- NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -CHa-para-ciclo-hexil-CO-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2).-, — -CH>-para- ciclo-hexil-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3a- CO-(CH2),-CO-, -aril-[(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3- (CH2).|-NCH3-CO-(CH>2),-, -aril-(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO- NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -aril-CO-Val-Ala-para-aminoben- Zil-O-CO-NCH3-(CH2)uy-NCH3-CO-(CH2))- ou -aril-CO-Val-Ala-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-.
[0091] De acordo com outra modalidade particular, o grupo -L1- (CO)-(W)w-(Y),y- representa -(CH2)")-, -(CH2)J-CO-, -(CH2)1-Val-Cit- para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2),-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2))-CO-Val-Ala-para- aminobenzil-O-CO-, -(CH2),-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH- (CH2))-NH-, — -(CH2))-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH>).- NH-, -(CH2))-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2).-NH-, -(CH>2)n- CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2))-NH-, — -(CH2)1n-Val-Cit- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u!-NCH3-CO-, -(CH>2)n-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2).-NCH3-CO-, ou -(CH2))-CO-Val- Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-, com n e u como definido previamente e notavelmente com n= 5eu=2.
[0092] O grupo -L1-(CO)--(W)w-(Y),- pode também representar - (CH2))-CO-NH-(CH2)J-NH-, -(CH2))-CO-NH-(CH2)u|-NH-CO-, -(CH>2)n- CO-NCH3-(CH2)I-NCH3-, -(CH2))-CO-NCH3-(CH2)I|-NCH3-CO-, -(CH2)»n- CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)(-, — -(CH2))-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3- CO-(CH2),-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH>2).- NCH3-CO-(CH>),-, -(CH2)n-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH3- (CH2).|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O- CO-NCH3-(CH2)I-NCH3-CO-(CH2),-, — -(CH2))-CO-Val-Cit-para-amino-
benzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-, — -(CH2)n-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -(CH>2)»- CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)-NCH3-CO-(CH>2).-, ou -(CH2)J-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCHa- CO-(CH2),-CO-, com n, u e v como definido previamente e notavel- mente com n= 5eu=v=2.
[0093] De acordo com uma modalidade preferida, o grupo -L1- (CO)c-(W)w-(Y),- representa -(CH2))-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para-ami- nobenzil-O-CO-, -(CH2))-CO-Val-Ala-para-aminobenzil-O-CO-, -(CH2),- CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2))-NH-, — -(CH2))-CO-Val- Ala-para-aminobenzil-O-CO-NH-(CH2)|-NH-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para- aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)uy-NCH3-CO-, ou -(CH2)J-CO-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2).-NCH3-CO-, com n e u como de- finido previamente e notavelmente com n= 5eu=2.
[0094] O grupo -L1-(CO)--(W)w-(Y),- pode também representar - (CH2))-CO-NH-(CH2)J-NH-, -(CH2))-CO-NH-(CH2)u|-NH-CO-, -(CH>2)n- CO-NCH3-(CH2)I-NCH3-, -(CH2))-CO-NCH3-(CH2)I|-NCH3-CO-, -(CH2)»n- CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)(-, — -(CH2))-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3- CO-(CH2),-CO-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO-NCH;3- (CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-, -(CH2))-CO-Val-Cit-para-aminobenzil-O-CO- NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, — -(CH2))-CO-Val-Ala-para-amino- benzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-, ou -(CH2))-CO-Val-Ala- para-aminobenzil-O-CO-NCH3-(CH2)|-NCH3-CO-(CH2),-CO-, com n, u e v como definido previamente e notavelmente com n= 5eu=v=2.
xi (2) q x: 20 | Nº | No >. >.
[0095] O grupo O , preferivelmente, O ,ÉOo grupo funcional que irá reagir com a unidade de ligação, como um an-
ticorpo, para ligar uma porção de fármaco a ela, graças aos grupos sulfidrila presentes na referida unidade de ligação. Os grupos sulfidrila podem ser gerados por redução das ligações dissulfeto intramolecula- res da unidade de ligação, se presente, em particular em anticorpos. Alternativamente, os grupos sulfidrila podem ser gerados pela reação de um grupo amino de uma porção lisina da unidade de ligação com 2- iminotiolano ou outros reagentes geradores de sulfidrila. Em modalida- des específicas, a unidade de ligação, como um anticorpo, é modifica- da para transportar uma ou mais lisinas. Mais preferivelmente, a uni- dade de ligação, como um anticorpo, pode ser modificada para trans- portar uma ou mais cisteínas (cf. ThioMabs).
[0096] X1 e X> representam, independentemente um do outro, H, um átomo de halogênio, tal como CI ou Br, um (C1-Ce)alcóxi, um arilóxi opcionalmente substituído ou -O-(CH2CH2O).H, desde que X: e X> não representem H ao mesmo tempo. O arilóxi é mais particularmente op- cionalmente substituído com um ou vários grupos (por exemplo, um) selecionado a partir de halogênio, CN, NO, e um arilóxi (por exemplo, fenilóxi) opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halo- gênio, como átomos de flúor. Em particular, o arilóxi é opcionalmente substituído com um ou vários (por exemplo, um) grupos selecionados a partir de CN, NO,» e pentafluorofenilóxi, notavelmente opcionalmente substituído com CN. O arilóxi pode ser em particular um fenilóxi.
[0097] De acordo com uma modalidade particular, X1 e X> repre- sentam, independentemente um do outro, H, um átomo de halogênio, tal como CI ou Br, um (C1-Ce)alcóxi ou um arilóxi opcionalmente substi- tuído, desde que X, e X> não representem H ao mesmo tempo. O ari- lóxi é mais particularmente opcionalmente substituído com um ou vá- rios grupos (por exemplo, um) selecionado a partir de halogênio, CN, NO,» e um arilóxi (por exemplo, fenilóxi) opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halogênio, como átomos de flúor. Em particu-
lar, o arilóxi é opcionalmente substituído com um ou vários (por exem- plo, um) grupos selecionados a partir de CN, NO» e pentafluorofenilóxi, notavelmente opcionalmente substituído com CN. O arilóxi pode ser em particular um fenilóxi.
[0098] De acordo com outra modalidade particular, X; e X> repre- sentam, independentemente um do outro, H, CI, Br, um metóxi ou um fenilóxi substituído com CN, notavelmente H, CI ou Br, desde que X; e X2 não representem H ao mesmo tempo.
[0099] Vantajosamente, X; e X> são idênticos e não H ou um den- tre X1 e Xo é H, e o outro não é H. Quando X1 e/ou X2 não é H, é um átomo de halogênio, como CI ou Br, um (C1- Ce)alcóxi, um arilóxi opci- onalmente substituído ou -O-(CH2CH2O0).,H; em particular, um átomo de halogênio, tal como CI ou Br, um (C1-Cs)alcóxi ou um arilóxi opcio- nalmente substituído; preferivelmente, CI, Br, um metóxi ou um fenilóxi substituído com CN; em particular CI ou Br.
[00100] qrepresenta O, 1 ou 2. Preferivelmente, q representa 2.
[00101] X; representa um grupo funcional (opcionalmente com o nitrogênio terminal de Z quando y = z= 1 e Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou com o nitrogênio terminal de Z' quando c= w=y=0ez=1eZé- NR4-(CH2).-NR5-) que visa reagir com o fármaco (QH ou Q-OH) a fim de ligar covalentemente o fármaco à unidade de ligação, como um an- ticorpo.
[00102] “Também pode ser considerado introduzir primeiro a unida- de espaçadora Y, e a unidade de aminoácido (W)w, quando presente, na porção do fármaco, antes de ligar a unidade extensora com a fun- ção sulfomaleimida. Neste caso, um composto de fórmula (1) com w = y = O (isto é, compreendendo apenas a unidade extensora, e a função sulfomaleimida) será usado e X; representa, neste caso, um grupo funcional que irá reagir com a unidade de aminoácido (W)w ou a uni- dade espaçadora Y já ligada na unidade de fármaco.
[00103] X; representa H quando y = z=1eZ é -NR+-(CH2)u-NRs- ou quando c = w=y=0,2=1eZ é -NR+-(CH2)!-NR5-(e forma um grupo funcional NH com o nitrogênio terminal do grupo Z ou Z') e nos outros casos, X; representa OH, NH2 ou um grupo de saída, tal como OH ou um grupo de saída. O grupo de saída pode ser um átomo de halogênio (por exemplo, Cl, Br, 1), um sulfonato (por exemplo, OT, OMs, OTs), N-succinimidilóxi, 4-nitro-fenilóxi, pentafluorofenilóxi ou N- benzotriazolóxi. Em particular, X; representa H quando y=z= 1eZzZé -NR4-(CH2)|-NR5- ou quando c = w=y=0,2=1eZ' é -NR+-(CH>2)- NRs5- e nos outros casos, X;3 pode ser mais particularmente OH, CI ou N-succinimidilóxi. Porção de fármaco
[00104] A porção do fármaco (Q) é um resíduo de um fármaco QH ou de um fármaco Q-OH.
[00105] O fármaco de acordo com a presente invenção pode ser qualquer fármaco útil em terapia humana ou veterinária, notavelmente para o tratamento do câncer. Pode ser notavelmente um agente citotó- xico. Vantajosamente, esse fármaco compreende um grupo funcional capaz de ligar este fármaco à porção de ligante. Também pode ser considerado adicionar esse grupo funcional ao fármaco para realizar a ligação. Este grupo funcional pode ser, por exemplo, OH, SH, NH ou COOH e reagirá com a extremidade X; do ligante para ligar o fármaco à porção ligante. A reação de acoplamento pode ser, por exemplo, uma substituição nucleofílica (por exemplo, reação de OH, SH, NH ou COOH com X;3 = grupo de saída), um acoplamento de peptídeo (por exemplo, reação de COOH com X; = NH2 ou ZX; ou Z'X; terminando em NH), uma esterificação (reação entre COOH e OH), uma reação de Mitsunobu, etc.
[00106] A porção do fármaco Q pode ser, por exemplo: — um resíduo de um derivado de auristatina, como um resíduo de mo-
nometil auristatina F (MMAF) (ligado por seu grupo NH ou COOH ter- minal), monometil auristatina E (MMAE) (ligado por seu grupo NH ou OH terminal), monometil dolastatina-10 (ligado pelo seu grupo NH ter- minal) ou um derivado deste, tal como uma porção de fármaco de fór- mula (C) como definido abaixo; H o HN NO, N Nr. A | O
MMAF À SÍ NH
HOOC nH o HN NA, N o PS | À O
MMAE À NH O oH H o m o N
O À O O Monometil —— > q Dolastatina-10 SS Ni No Ss — um resíduo de uma antraciclina, como um resíduo de daunorrubici- na, doxorrubicina, epirrubicina ou idarrubicina (ligada por um grupo NH>2 ou o grupo OH de -COCH2O0H), ou um derivado do mesmo, tal como 2-pirrolinodoxorrubicina ou pro-2-pirrolinodoxorrubicina (ligado pelo grupo OH de -COCH2O0H), ou PNU-159682 (ligado pelo grupo OH de -COCH2O0H) ou um derivado do mesmo; em particular, um resíduo de doxorrubicina (ligado por um grupo NH2 ou o grupo OH de - COCH2O0H), 2-pirrolinodoxorrubicina, pro-2-pirrolinodoxorrubicina (li- gado pelo grupo OH de -COCH2O0H) ou PNU-159682 (ligado pelo gru- po OH de -COCH2O0H) ou um derivado de PNU-159682, notavelmente como ilustrado abaixo; preferivelmente, um resíduo de PNU-159682 (ligado pelo grupo OH de -COCH2O0H) ou um resíduo de um derivado de PNU-159682 como ilustrado abaixo (ligado por COOH); o oH O Daunorrubicina : O OH om "on O OH o
OH
SOPOL Doxorrubicina 20 O OH o! o o. NH, O OH o Ho
COSORA Epirrubicina COCORA CcHO O OH Ô
GY H,N o oH 28 GCOSOO * Idarrubicina dd ô.. o. CX. NH; o OH o
OH 2-Pirrolino- Ê Oo O OH O o A doxorrubicina Oo
N “O o OH o
OH (COI OSe: Pro-2-pirrolino- â
O O OH O o Pá doxorrubicina
O OAcC
NH OAC
OH o OH o
OH Oo Oo OH Ô, O. PNU-159682 É “om o N— / Co
O o OH o oH “oH Derivado de O O OH ô, O. PNU-159682 | o
NÉ CI
O —- um resíduo de camptotecina ou um derivado da mesma, como SN- 38 (ligado por seu grupo OH); ES o
N Nó Camptotecina Y / D Da"
HO O HO. SS o > N SN-38 N N ”
O Du]
HO O — um resíduo de uma tubulisina, como tubulisina A, tubulisina B, tubu- lisina C ou tubulisina D (ligada por um grupo COOH ou um grupo OH quando presente);
À O o o Non 1 RU o o N N A) Tubulisina A N Y Li
ROSA
CA A. cooH
À O o o Nor í H o Tubulisina B AAA A UU o Õ LL. sl N ÁS 'cooH
À FAL, t PO? Po H o 2 Tubulisina C As OÁ CS Õ “o so H Á 'cooH o QI ; Tubulisina D O PÁ NS. Õ L, s/ AA 'cooH —- um resíduo de uma caliqueamicina, tal como esperamicina ou cali- queamicina y1, ou um seu derivado do mesmo tal como N-acetil dimetil hidrazida caliqueamicina (ligada pela sua porção hidrazida); o HO, H Oo
LEY , o o SGÉTF= S Caliqueamicina Id Pe Roo HA qto )
AL AIR 1 o o” OH " o noZ7o7 o. AL27 ? om ST oo HN. O.
HO Va Esperamicina no PA o SFA, e o o " % mA Rats OoH o x ro) TE”
O cH,; CH; K am Ds HO o N-acetil dimetil HO Ss RL 1 3-0 hidrazida Fa em o Eme com o CH3 OH INSIRA caliqueamicina | EH:7 27 Sen, CH;ÇH o nos OCH. q xo 3 OH en. N MM OCH; (o) —- um resíduo de um maitansinoide, como maitansina (também cha- mada maitansina) ou um derivado do mesmo, como DM1 ou DMA (li- gado por um grupo SH); em particular, um resíduo de DM1 ou DM4 (ligado por um grupo SH); o— Dá : >dDdÉ o , , iu o Maitansina N o ve .
Í A o o NA / o H OH * E :; CANA O. e. O DMI w N o
SA NC q É ) É o
Õ N / H
——
H OH EO i Po O. o. Q Pá N o DM4 Po vd A o o N / sH —- um resíduo de uma duocarmicina, como duocarmicina A, duocarmi- cina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duo- carmicina D duocarmicina SA ou CC-1065 (ligada por um grupo CONH;>2); em particular, um resíduo de CC-1065 (ligado por um grupo CONH>); NHz2
N ft oHKo o 7 “%
N N
H OH CC-1065 e ENO 2? DA Ny É o
N
H o — um resíduo de uma amanitina (ligada por um grupo OH, NH, COOH ou CONH>, em particular um grupo OH), tal como a-amanitina, B- amanitina, y-amanitina ou e-amanitina; em particular, um resíduo de a- amanitina (ligado notavelmente por um grupo CH2O0H);
OH h "o o 7) NA
HN T NONO oi H a-Amanitina o / NH Ho" O=s PA Tn NENT A on é Nº o o eo NA NA o o H NH, oH ú "os o 2 NU HN Y No oi H B-Amanitina o h NH HO": N Oss AN
ENA o YO NÁ o o H
OH h “ou o 7) ND
HN ST NONE oi TH o h NH y-Amanitina HO" Os O N HÁ HN õ OH ny” NO? o o NAS NA o o H NH,
h "ou o 1) NA HN TF N o o DA " o h NH e-Amanitina HO!" Ozg Í N HN OH “uy 7 Hb o o NA NA o o o H
OH — um resíduo de uma pirrolobenzodiazepina (PBD), tal como antrami- cina (ligada por seu grupo OH ou NH2) ou SGD-1882 (ligada por seu grupo NH>2); em particular, um resíduo de SGD-1882 (ligado pelo seu grupo NH>2);
OH HO N H
O Antramicina — tz O te o A NHz2 4 OPEL CO % SGD-1882 DIAS FO HaN > o o NÃo — um resíduo de um ativador de ponto de checagem imune, como um resíduo de um agonista STING (estimulador de genes de interferon) vantajosamente de fórmula (D) conforme definido abaixo (ligado por OH, SH ou NH) ou um resíduo de um inibidor de IDO (indolamina 2,3- dioxigenase), como epacadostate (INCB024360) ou BMS-986205.
[00107] Vantajosamente, a porção de fármaco Q é: - um resíduo de um derivado de auristatina, como um resíduo de MMAF (ligado por seu grupo NH ou COOH terminal), MMAE (ligado por seu grupo NH ou OH terminal), ou monometil dolastatina-10 (liga- do por seu grupo NH terminal) ou uma porção de fármaco de fórmula (C) como definido abaixo; —- um resíduo de um agonista STING, notavelmente de fórmula (D) conforme definido abaixo; ou —- um resíduo de uma antraciclina, como definido acima e, preferivel- mente, um resíduo de PNU-159682 ou um derivado do mesmo, con- forme ilustrado abaixo: o OH o O.
SOCO Resíduo de PNU-159682 — [O O OM % O o No
O
O o OH o Resíduo de um derivado de 2 O OH ô, O. PNU-159682
S NS CI
[00108] A porção de fármaco Q é, em particular, um resíduo de uma antraciclina, como definido acima e, preferivelmente, um resíduo de PNU-159682 ou um derivado do mesmo, conforme ilustrado abaixo:
O OH O o.
SOCO Resíduo de PNU-159682 — [O O OM % O o No
O oO O OH o Resíduo deum derivado de 2O O OH ô, O. PNU-159682 | o
NE Es o
[00109] De acordo com uma primeira modalidade, o resíduo de um derivado de auristatina tem a seguinte fórmula (C): t HO? NON a " RT R& O A | Ao,
À NH o R: (C) onde: — R1 é H ou OH, — Ré uma (C1-Cs)alguila (por exemplo, metila), COOH, COO-((C1-Cs)alquil) (tal como COOMe) ou uma tiazolila (tal como ti-
azol-2-ila), — R3 é H ou uma (C1-Cs)alquila (tal como metila), em parti- cular um grupo (C1-Cse)alquila, — X1 é O ou NR, — Rs é H ou (C1-Cs)alquila (tal como metila), e —- té um número inteiro de 1 e 8, em particular de 1 a 6, vantajosamente de 1 a 4, preferivelmente, é 1 ou 2.
[00110] De acordocom uma modalidade particular: — Ré OH e R2 é (C1-Cs)alquila tal como metila; ou - RéHe Ré tiazolila tal como tiazol-2-ila, COO-(C1- Cs)alquila tal como COOMe, ou COOH.
[00111] Vantajosamente, R: é H e R2 é tiazolila tal como tiazol-2-ila, COO-(C1-Cs)alquila tal como COOMe, ou COOH. Preferivelmente, R1 é H e Rz é COOH ou COOMEe, em particular COOH.
[00112] té um número inteiro de 1 e 8, em particular de 1 a 6, van- tajosamente de 1 a 4, preferivelmente, é 1 ou 2.
[00113] Vantajosamente, Ra é um grupo (C1-Cs)alquila e preferivel- mente, um grupo metila.
[00114] De acordo com uma modalidade particular, R: é H, Ra é COOH ou COOMEe (preferivelmente, COOH), R3 é metila e té 1 ou 2.
[00115] Vantajosamente, Xa é NRg com Rg sendo H ou (C1-Cs) alqui- la, preferivelmente, sendo H ou metila.
[00116] Em uma modalidade preferida: — Ré H, Ra é COOH, R;3 é metila, X1a é NRs9, Ro é metila e t é 1 ou 2, ou — Rr é H, Ra é COOH, R; é metila, Xa é NRo, Reé He té 1 ou 2.
[00117] De acordo com uma modalidade preferida, o grupo X, é lo- calizado no anel fenila em uma posição para em relação ao grupo (CH2):.
[00118] Vantajosamente, o resíduo de uma auristatina de fórmula (C) é escolhido dentre as segundas porções: |
N * Ds S À NM. A | NO À -. NH No As ú MSUDOs AA, N OA ao,
VZN o Ox ; ú “ O o”
RA OA lo,
VAN O: OH ; o
H H *. LAI OA oo, |V SZNH No ss o
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A IESDOS Io A ld oo o | ÂNH o Ox ;
o AA, õ ALT o Á | oo o º À o NH N= ss o
H H < LAILA IS o Al oo o | AN Ho o
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N OU KIA
N NA N ! A ! x o
V ZNA o. Ox , oe
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VZANH o OH :
[00119] A preparação de um tal derivado de auristatina é descrita em WO2014/174064 ou WO2015/162293, por exemplo.
[00120] De acordo com uma segunda modalidade, o agonista STING tem a seguinte fórmula (X): Yo e An so (O Q Se Ao ot % onde: — X11 e X21 são independentemente O ou S, preferivelmen- te, O, — X12 e X» são independentemente OH ou SH, preferivel- mente, SH, — A11 e Az; são independentemente um grupo de fórmula: Zz, Oo Z1 o ns Ex Zs NE Ex ATI AL? AP Ar a AN a NON o AN Nm NM | ou Po T o NÓS * a. PS O 2d preferivelmente, | ou 1, onde: e Z1 é OR11 ou NR11R12, com R11 e R12 sendo independen- temente H, R13 ou COR3, com R13 sendo (C1-Cs)alquila, arila ou aril(C1-Cçs)alquila, + Z2 É H ou NR21R22, com R21 e R22 sendo independentemen- te H, R23 ou COR>23, com R23 sendo (C1-Cs)alquila, arila ou aril(C1-Cs) al- quila,
e Z3 É N ou CR33, preferivelmente, N, com R33 sendo H ou um átomo de halogênio tal como F ou CI, e * Z. é H ou uma (C1-C6)alquila, — A12 e Az são independentemente H, OH ou F, e — Az é H ou A? e Az são ligados juntamente com Az sendo CH>2 e A22 sendo O.
[00121] “Quando, Z: é OH ou 71 é H, as seguintes formas de tautô- mero podem ser obtidas:
OH O NÓS HN & Z N RA Zz7 N RA Í o
[00122] De acordo com uma modalidade particular, o agonista STING tem uma das seguintes fórmulas: '. UV x2do A xen—o E 2 J o. |” Ar Ao Ala Ae O Aro A o | o | Ao e À om ta (X-1); Xi (X-2);
TV Xi p—o o q
O Por At? Ao b o Í Ao om Xoi (X-3) onde X11, X21, X12, X22, A11, A21, A12, A22 E A2 são como definidos acima ou abaixo.
[00123] De acordo com outra modalidade particular, o agonista STING tem uma das seguintes fórmulas:
TV Xn —P— 1 Xi2—t—o Fal Xig—P— Am = Lo) ne Lo) ANS É Pia oi ô As “ARO
PT FC kt (X-1a); Xa (X-2a); v Ki2—P——O- An = Lo] Ar oa *' (X-3a) onde X11, X21, X12, X22, A11, A21, A12, A22 E A2 são como definidos acima ou abaixo.
[00124] Vantajosamente, X1; e X»; são ambos O. Vantajosamente, pelo menos um dentre X12 e X>> é SH e preferivelmente, X12 e X22 são ambos SH. Preferivelmente, X11 e X»: são ambos O e X12 e X»> são ambos SH.
[00125] Em particular, Ri e Ri2 são ambos H e vantajosamente R11, R12, R21 e R22 são cada qual H.
[00126] Z;3em particular é N. Vantajosamente, Z; é OH ou NH>z; Z2 é H ou NHo; Zg é N; e Za É H.
[00127] —Preferivelmente, A:; e Az; são independentemente selecio- NH No — e No q
DOS CS x Nexo Ne nados a partir de “1 (citosina), TO, TT, o
NH ? NH NT N
LD LI Ná A L- N | — (adenina), “1 (adenina-6-benzamida),
NH? o F
DX N
DO TO HoN nÊ o Sq o | (2,6-diaminopurina), [NM o F o e o e o DS mM N
SEI SNI NINO SN NM E o | (hi o o
N O i O
À S HAN SNI o NON poxantina), | — (guanina) e ! (guanina-2-isobutiramida); mais preferivelmente, selecionados dentre citosina, adenina, adenina-6-benzamida, 2,6-diaminopurina, hipoxanti- na, guanina e guanina-2-isobutiramida; mais preferivelmente, selecio- nados dentre adenina, hipoxantina e guanina.
[00128] Pode ser em particular ADU-S100 da seguinte fórmula: HoN ==N
N o C À 2? 1 N so N or O To) a OH ôó N O——P— SH IO i e N=, NH,
[00129] —Alternativamente, pode ser em particular um dos compostos especificamente descritos em Lioux et al. J. Med. Chem., 2016, 59 (22), pp 10253-10267.
[00130] A preparação de um tal agonista STING é descrita em WOZ2014/179335, WO2016/096174, WO2016/145102, WO2017/106740 ou WOZ2018/100558, por exemplo.
[00131] O referido agonista STING está ligado à porção ligante por um grupo SH, OH ou NH presente na molécula, isto é, pelo grupo X12 (OH ou SH), X22 (OH ou SH), Z1 quando pelo menos um dentre R11 e R12 é H (OH, NHR11 ou NHR12), ou Z2 quando pelo menos um den- tre R21 e R22 é H (NHR21 ou NHR22). Preferivelmente, pelo menos um dentre X12 e X2> é SH, e o agonista STING está ligado a este grupo SH.
[00132] Em consequência, o resíduo do agonista STING tem vanta- josamente a seguinte fórmula (D), (D-1), (D-2), (D-3), (D-1a), (D-2a) ou (D-3a): (e BA o An Are?
W K f A Sa o |
A TEA * (OD) Xu Xu || 1 Xi2—P— O: o An ig o o. An d Ap O Azo Aiz A O Aja A O o | o | À AT Ai A Xi (D-1); *a1 (D-2);
Y Xi2—P—O: A. 12 | O. 1 o Az2 Atz Ab o | À o *1 — (D+) ( Y xao Av x. Pest dx O E Az O To) PA ô Aro PA Aa O Ai A A e “1 (D-1a); Xe (D-2a); Yo ta A o se o] HA Â Po ê ê PA Ao ô Az Ae * — (D-3a), onde: — X11 e X21 são como definidos acima, — X12 e X22 são como definidos acima ou O ou S, — A e Az; são como definidos acima, isto é, independen- temente um grupo de fórmula: Zz, o Zz fo) Za [er ax NOR Za >N Zs N N JdAdL2 NIDA S dy Pá DS
ZON NR NONO ON E [NM | ou | ;
Z o
Z
XI DOS Z7 NÃ NO “77 SN No preferivelmente, | ou | , onde: e Z1 é como definido acima ou O ou NR11, e Z> é como definido acima ou NRa1, e Z3 é como definido acima, e e Z1 É como definido acima, — A12 e A22 são como definidos acima, e — Az é como definido acima, em que: “ quando X12 for O ou S, em seguida X>> não será O e não será S, Z1 não será O e não será NR11, Z2 não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por X12; “ quando X22 for O ou S, em seguida, X12 não será O e não será S, Z1 não será O e não será NR11, Z2 não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por X22; “ quando Z1 for O ou NR11, em seguida X12 não será O e não será S, X>> não será O e não será S, Z2 não será NR2, e o resi- duo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por Z1; “ quando Z> é NR21, em seguida X12 não será O e não será S, X22 não será O e não será S, Z1; não será O e não será NR, e o resíduo do agonista STING é ligado ao resto da molécula por Z2. Porção da unidade de ligação
[00133] A unidade de ligação é um peptídeo, uma proteína (por exemplo, uma proteína modificada), um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00134] Preferivelmente, a unidade de ligação de acordo com a in- venção é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e, assim, o conjugado unidade de ligação-fármaco de acordo com a invenção é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção consiste em um anticorpo re- combinante. Em outra modalidade, o anticorpo do ADC da invenção consiste em um anticorpo sintetizado quimicamente.
[00135] Mais particularmente, uma tal molécula consiste em uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada ca- deia pesada compreende uma região variável (ou domínio) da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação da complementaridade (CDR), intercaladas com re- giões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranja- das do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FRA4. As regiões variáveis das cadei- as pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, inclu- indo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efeto- ras), e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clás- sico.
[00136] Em uma modalidade, os "fragmentos de ligação ao antíge- no" são selecionados a partir do grupo que consiste em fragmentos Fv, scFv (sc de cadeia única), Fab, F(ab')a, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento do qual o tempo de meia-vida teria sido aumenta- do por modificação química, como a adição de poli(alquileno)glicol, como poli(etileno)glicol ("PEGuilação") (fragmentos peguilados cha- mados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab- PEG, F(ab')-PEG ou Fab'-PEG) ("PEG" para Poli(Etileno Glicol), ou por incorporação em um liposso- ma, os referidos fragmentos tendo pelo menos uma das CDRs carac- terísticas do anticorpo de acordo com a invenção. Preferivelmente, os referidos "fragmentos de ligação ao antígeno" serão constituídos ou compreenderão uma sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo a partir do qual eles são derivados, a referida se- quência parcial sendo suficiente para reter a mesma especificidade de ligação que o anticorpo a partir do qual é descendente e tem uma afi- nidade suficiente, preferivelmente, pelo menos igual a 1/100, de forma mais preferida a pelo menos 1/10, da afinidade do anticorpo do qual é descendente, em relação ao alvo. Mais preferivelmente, os referidos "fragmentos de ligação ao antígeno" serão constituídos ou compreen- derão pelo menos as três CDRs CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da ca- deia variável pesada e as três CDRs CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia variável leve do anticorpo do qual são derivados.
[00137] De acordo com uma modalidade preferida, a unidade de ligação é um anticorpo IGF-1R, um anticorpo HER2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00138] O anticorpo HER?2 é mais particularmente trastuzumabe.
[00139] Em uma modalidade do presente pedido, o anticorpo é um anticorpo IGF-1R, e o epitopo do anticorpo é preferencialmente locali- zado no domínio extracelular do IGF-1R humano (também referido como IGF-1R ECD).
[00140] Em uma modalidade particular, o anticorpo, ou qualquer fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é capaz de se ligar a IGF-1R com uma ECso compreendida entre 10 x 10º a 1 x 10º, e mais preferencialmente entre 8 x 10º a 2 x 10º.
[00141] A competição pela ligação ao IGF-1R pode ser determinada por quaisquer métodos ou técnicas conhecidas pelos versados na téc- nica, tais como, sem limitação, radioatividade, Biacore, ELISA, citome- tria de fluxo, etc. Como "que compete pela ligação ao IGF- 1R" signifi- ca uma competição de pelo menos 20 %, preferencialmente pelo me- nos 50 % e mais preferencialmente pelo menos 70 %.
[00142] A determinação da ligação ao mesmo epitopo pode ser de- terminada por quaisquer métodos ou técnicas conhecidas pelos versa- dos na técnica, tais como, sem limitação, radioatividade, Biacore, ELI- SA, citometria de fluxo, etc. Como "que se ligam ao mesmo epitopo de IGF-1R" significa uma competição de pelo menos 20 %, preferencial- mente pelo menos 50 % e mais preferencialmente pelo menos 70 %.
[00143] “Como mencionado acima, e ao contrário do conhecimento geral, a presente invenção se concentra em anticorpos IGF-1R especí- ficos que apresentam uma alta capacidade para serem internalizados após a ligação de IGF-1R. Quando usado neste documento, um anti- corpo que "é internalizado" ou que "internalizado" (as duas expressões sendo semelhantes) é aquele que é absorvido (o que significa que "en- tra") na célula ao se ligar a IGF-1R em uma célula de mamífero. Esse anticorpo é interessante como parte do ADC, portanto, ele aborda ou direciona o citotóxico ligado às células cancerosas alvo. Uma vez in- ternalizado, o citotóxico provoca a morte das células cancerosas.
[00144] Vantajosamente, os anticorpos IGF-1R de acordo com a invenção apresentam todas as mesmas sequências para CDR-H2, CDR-H3 e CDR-L2, sendo as outras 3 CDRs diferentes. Esta observa- ção parece coerente por fazer parte do conhecimento geral que, no que diz respeito à especificidade de ligação de um anticorpo, a CDR- H3 é descrita como a mais importante, e a mais implicada no reconhe- cimento do epitopo.
[00145] Acredita-se que as chaves importantes para o sucesso da terapia com ADC sejam a especificidade do antígeno alvo, e a interna- lização dos complexos antígeno-anticorpo nas células cancerosas. Obviamente, os antígenos não internalizantes são menos eficazes do que os antígenos internalizantes para distribuir agentes citotóxicos. Os processos de internalização são variáveis entre os antígenos e depen- dem de vários parâmetros que podem ser influenciados por anticorpos.
[00146] No ADC, a porção do fármaco confere a atividade citotóxi- ca, e o anticorpo utilizado é responsável pela especificidade contra as células cancerosas, além de ser um vetor para entrar nas células para endereçar corretamente o citotóxico. Assim, para melhorar o ADC, o anticorpo pode exibir alta capacidade de internalizar nas células can- cerosas direcionadas. A eficiência da internalização mediada por anti- corpos difere significativamente dependendo do epitopo direcionado. À seleção de anticorpos IGF-1R de internalização potentes requer vários dados experimentais estudando não apenas a regulação negativa de IGF-1R, mas também após a internalização de anticorpos IGF-1R nas células.
[00147] Em uma modalidade, a internalização do anticorpo do ADC de acordo com a invenção pode ser avaliada por imunofluorescência ou FACS (citometria de fluxo) (conforme exemplificado a seguir no presente pedido) ou qualquer método ou processo conhecido pela pessoa versada na técnica específico para o mecanismo de internali- zação. Em uma modalidade preferida, o anticorpo do ADC de acordo com a invenção pode induzir internalização após ligação a IGF-1R de pelo menos 30 %, preferencialmente 50 % e mais preferencialmente 80 %.
[00148] O complexo IGF-1R/anticorpo é internalizado após a liga- ção do anticorpo ao ECD do referido IGF-1R e é induzida uma redução na quantidade de IGF-1R na superfície das células. Esta redução pode ser quantificada por qualquer método conhecido pelos versados na técnica, como exemplos não limitativos de western-blot, FACS e imu- nofluorescência.
[00149] Em uma modalidade, esta redução, refletindo assim a inter- nalização, pode ser preferencialmente medida por FACS e expressa como a diferença ou delta entre a Intensidade de Fluorescência Média (MFI) medida a 4 ºC com a MFI medida a 37 ºC após 4 horas de incu- bação com o anticorpo.
[00150] Como exemplo não limitativo, este delta é determinado com base em MFIls obtidas com células não tratadas e células tratadas com o anticorpo usando i) células de câncer de mama MCF7 após um perí- odo de incubação de 4 horas com o anticorpo aqui descrito e ii) um anticorpo secundário marcado com Alexa488. Este parâmetro é defini- do como calculado com a seguinte fórmula: À (MFla º«c- MFl37 “c).
[00151] Esta diferença entre as MFIs reflete a regulação negativa de IGF-1R, uma vez que as MFIs são proporcionais ao IGF-1R ex- presso na superfície celular.
[00152] Em um aspecto vantajoso, os anticorpos consistem em an- ticorpos que desencadeiam um A(MFla -«c-MFl37 «c) em MCF-7 de pelo menos 280, de preferência de pelo menos 400.
[00153] Em mais detalhes, o delta acima mencionado pode ser me- dido de acordo com o seguinte processo, que deve ser considerado como um exemplo ilustrativo e não limitativo: a) Tratamento e incubação de células tumorais de interesse com o anticorpo da invenção em meio de cultura completo frio (4 ºC) ou quente (37 ºC); b) Tratamento das células tratadas da etapa a) e, em para- lelo, as células não tratadas com um anticorpo secundário; c) Medição da MFI (representativo da quantidade de IGF- 1R presente na superfície) para as células tratadas e não tratadas com um anticorpo secundário marcado capaz de se ligar ao anticorpo da invenção; e d) Cálculo do delta como a subtração da MFI obtida com as células tratadas da MFI obtida com as células não tratadas.
[00154] A partir desta MFI delta, uma porcentagem de internaliza- ção pode ser determinada como: 100X(MFI 4 ºc-MFI 37 cc)/MFI a ºc.
[00155] Os anticorpos do ADC de acordo com a invenção, apresen- tam, preferencialmente, no MCF7 uma porcentagem de internalização compreendida entre 50 % e 99 %, 70 % e 90 %, preferencialmente en- tre 75% e 87 %.
[00156] Uma vantagem particular dos anticorpos aqui descritos ba- seia-se na sua taxa de internalização.
[00157] É geralmente conhecido que, para um ADC, é desejável que os anticorpos usados exibam uma taxa rápida de internalização, preferencialmente dentro de 24 horas a partir da administração do an- ticorpo e, mais preferencialmente dentro de 12 horas e, ainda mais preferencialmente, dentro de 6 horas.
[00158] Na presente invenção, a taxa de internalização, também referida como diminuição do anticorpo ligado à superfície celular ou decadência do anticorpo da superfície celular, é expressa como t1/2 (meia-vida) e corresponde ao tempo necessário para obter uma dimi- nuição de 50 % do À MFI (este aspecto será claramente compreendido em relação aos exemplos a seguir).
[00159] Uma vantagem particular é que os anticorpos do ADC da invenção têm uma t1/2 compreendida entre 5 e 25 minutos, e prefe- rencialmente entre 10 e 20 minutos.
[00160] De acordo com uma modalidade particular da invenção, o anticorpo compreende as três CDRs de cadeia pesada das sequências SEQ ID Nos. 1, 2e 3 e as três CDRs de cadeia leve das sequências
SEQ ID Nos. 4,5 e 6.
[00161] De acordo com uma modalidade particular da invenção, o anticorpo compreende as três CDRs de cadeia pesada compreenden- do ou consistindo nas sequências SEQ ID Nos. 1, 2 e 3, ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID Nos. 1, 20u 3; e os três CDRs de cadeia leve compreendendo ou consistindo nas sequências SEQ ID Nos. 4, 5 e 6, ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID Nos. 4,5 0u6.
[00162] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a unidade de ligação é um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo, capaz de se ligar ao IGF-1R humano selecionado a partir de: i) um anticorpo que compreende três CDRs de cadeia pe- sada com CDR-H2 de sequência SEQ ID No. 2 e CDR-H3 de sequên- cia SEQ ID No. 3, e três CDRs de cadeia leve com CDR-L2 de se- quência SEQ ID No. 5; ii) um anticorpo que compete pela ligação a IGF-1R com o anticorpo de i); e iii) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo de IGF-1R que o anticorpo de i).
[00163] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a unidade de ligação é um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo, capaz de se ligar ao IGF-1R humano selecionado a partir de: i) um anticorpo que compreende as três CDRs de cadeia pesada da sequência SEQ ID No. 1, 2e 3 e as três CDRs de cadeia leve da sequência SEQ ID No. 4, 5€e 6; ii) um anticorpo que compete pela ligação a IGF-1R com o anticorpo de i); e iii) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo de IGF-1R que o anticorpo de i).
[00164] Em outra modalidade, o anticorpo, ou qualquer fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende as três CDRs de ca- deia pesada compreendendo as sequências SEQ ID Nos. 1,2e 3; e as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID Nos.4,5e6.
[00165] A numeração única de IMGT foi definida para comparar os domínios variáveis qualquer que seja o receptor de antígeno, o tipo de cadeia ou a espécie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. Na numeração única de IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo, cisteína 23 (1º-CYS), trip- tofano 41 (CONSERVADO-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (20-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J-TRP). A nu- meração única de IMGT fornece uma delimitação padronizada das re- giões estruturais (FR1I-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determi- nantes de complementaridade: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. Como as lacunas representam posi- ções desocupadas, os comprimentos de CDR-IMGT (mostrados entre colchetes e separados por pontos, por exemplo, [8,8,13]) tornam-se informações cruciais. A numeração única IMGT é usada em represen- tações gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., Inmunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. e Lefranc, M .-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], e em estrutu- ras 3D em IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. e Lefranc, M.-P.,
T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208- D210 (2004)].
[00166] Paraa sequência de aminoácidos exibindo pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência, os exemplos preferidos in- cluem aqueles contendo a sequência de referência, certas modifica- ções, nomeadamente uma deleção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, truncamento ou extensão. No caso de substi- tuição de um ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, as substituições são preferidas em que os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos "equivalentes". Aqui, a expressão "aminoácidos equivalentes" se destina a indicar quaisquer aminoáci- dos susceptíveis de serem substituídos por um dos aminoácidos estru- turais sem, no entanto, modificar as atividades biológicas dos anticor- pos correspondentes e dos exemplos específicos definidos abaixo.
[00167] Os aminoácidos equivalentes podem ser determinados pela sua homologia estrutural com os aminoácidos para os quais são subs- tituídos ou pelos resultados de testes comparativos de atividade bioló- gica entre os vários anticorpos que podem ser gerados.
[00168] “Como um exemplo não limitativo, a tabela 1 abaixo resume as possíveis substituições que provavelmente serão realizadas sem resultar em uma modificação significativa da atividade biológica do an- ticorpo modificado correspondente; substituições inversas são natu- ralmente possíveis nas mesmas condições. Tabela 1
[00169] “Um aspecto particular da invenção é que o anticorpo não se liga ao receptor de insulina (IR). Este aspecto é de interesse, pois o anticorpo aqui descrito não terá nenhum impacto negativo no IR, isto é, no metabolismo da insulina.
[00170] Em outramodalidade, ainda outro aspecto vantajoso do an- ticorpo é que ele é capaz de se ligar não apenas ao IGF-1R humano, mas também ao IGF-1R de macaco e, mais particularmente, ao IGF- 1R de cinomolgo. Este aspecto também é de interesse, pois facilitará a avaliação da toxicidade necessária para os ensaios clínicos.
[00171] Em ainda outra modalidade, o anticorpo consiste em um anticorpo monoclonal. O anticorpo monoclional aqui inclui anticorpo murino, quimérico e humanizado, tal como descrito a seguir.
[00172] O anticorpo é preferencialmente derivado de um hibridoma de origem murina arquivado na coleção francesa para culturas de mi-
croorganismos (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), sendo o referido hibridoma obtido pela fusão de esplenócitos/linfócitos de camundongos imunizados Balb/C e células da linhagem celular Sp 2/O-Ag 14 de mieloma.
[00173] Em uma modalidade, o anticorpo IGF-1R consiste em um anticorpo murino, então referido como m [nome do anticorpo].
[00174] Em uma modalidade, o anticorpo IGF-1R consiste em um anticorpo quimérico, então referido como c [nome do anticorpo].
[00175] Em uma modalidade, o anticorpo IGF-1R consiste em um anticorpo humanizado, então referido como hz [nome do anticorpo].
[00176] Para evitar dúvidas, na especificação a seguir, as expres- sões "anticorpo IGF-1R" e "[nome do anticorpo]" são semelhantes e incluem (sem especificação contrária) as versões murina, quimérica e humanizada do referido anticorpo IGF-1R ou do referido "[nome do an- ticorpo]". Quando necessário, o prefixo m- (murino), c- (quimérico) ou hz- (humanizado) é usado.
[00177] Para maior clareza, a seguinte tabela 2 ilustra as sequên- cias CDR, definidas de acordo com IMGT, para os anticorpos preferi- dos. Tabela 2 [Jesse [ementas Tssainte | em — | q gor — Co e ea
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[00178] Será óbvio para a pessoa versada na técnica que qualquer combinação de 6 CDRs como descrito acima deve ser considerada como parte da presente invenção.
[00179] “Como pode ser observado a partir desta tabela 2, todos os anticorpos aqui descritos têm as mesmas sequências para CDR-H2, CDR-H3 e CDR-L2, sendo esta propriedade de particular interesse conforme descrito acima.
[00180] De acordo com um aspecto específico, o anticorpo é um anticorpo murino caracterizado pelo referido anticorpo também com- preender regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada deri- vadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga com o camundon- go, notavelmente o homem.
[00181] De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo é um anticorpo quimérico (c) caracterizado pelo referido anticorpo também compreender regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga com o camun- dongo, notavelmente humana.
[00182] Um anticorpo quimérico é aquele que contém uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) derivada de um anticor- po de uma dada espécie em combinação com regiões constantes da cadeia leve, e a cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie hete- róloga à referida espécie dada.
[00183] Os anticorpos quiméricos podem ser preparados usando técnicas de genética recombinante. Por exemplo, o anticorpo quiméri- co poderia ser produzido por clonagem de DNA recombinante conten- do um promotor e uma sequência que codifica para a região variável de um anticorpo monoclonal não humano, notavelmente murino, e uma sequência que codifica para a região constante do anticorpo de espécie heteróloga, de preferência humana. Um anticorpo quimérico do ADC de acordo com a invenção codificado por um tal gene recom- binante poderia ser, por exemplo, uma quimera camundongo-humano, a especificidade deste anticorpo sendo determinada pela região variá- vel derivada do DNA murino e seu isótipo determinado pelo região constante derivada de DNA humano.
[00184] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7, 2e 3 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 5 e 11; b) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7, 2e 3 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 10,5 e 11; c) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7, 2e 3 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 56 12; e d) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 8, 2e 3 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 5 e 11.
[00185] Em uma modalidade preferida, porém não limitativa, o anti- corpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 13 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 13 e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11; b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 14 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 14 e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 10, 5 e 11; c) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 15 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 15e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 12; d) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 16 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 16 e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 9, 5e 11; e e) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 17 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 17 e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 12.
[00186] Por"qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, prefe- rivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No. 13 a 17", destina-se a designar as sequências que exibem as três CDRs de cadeia pesada SEQ ID Nos. 1, 2e 3 e, além disso, que exi- bem pelo menos 80 %, preferivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com a sequência completa SEQ ID No. 13 a 17 fora das sequências correspondentes às CDRs (isto é, SEQ ID No. 1,2 e3).
[00187] De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 13 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 5 e 11; b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 14 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 10,5 e 11; c) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 15 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 5 e 12; d) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 16 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 5e 11; e e) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 17 e as três CDRs de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 9, 5 e 12.
[00188] Em outra modalidade preferida, porém não limitativa, o an- ticorpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 18 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 18 e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 7, 2e 3; b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 19 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 19 e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 7, 2e 3; c) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 20 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 20 e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 7, 2e 3; d) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 21 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 21 e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 8,2e 3; e e) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 22 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 22 e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 7, 2e 3.
[00189] —Por"qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, prefe- rivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No. 18 a 22", destina-se a designar respectivamente, as sequências que exibem as três CDRs de cadeia leve SEQ ID Nos. 4, 5e 6 e, além dis- so, que exibem pelo menos 80 %, preferivelmente, 85 %, 90 %, 95% e 98 % de identidade com a sequência completa SEQ ID No. 18 a 22 fora das sequências correspondentes às CDRs (isto é, SEQ ID No. 4, 5e6).
[00190] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 18 e as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7,2 e 3; b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 19 e as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7,2 e 3; c) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 20 e as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7,2 e 3; d) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 21 e as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 8,2e 3; e e) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 22 e as três CDRs de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 7,2 e 3.
[00191] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é um anticorpo selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 13 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 13 e um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 18 ou qual- quer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 18; b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 14 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 14 e um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 19 ou qual- quer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID NO. 19; c) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 15 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 15 e um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 20 ou qual- quer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 20; d) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 16 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 16 e um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 21 ou qual- quer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 21; e e) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 17 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 17 e um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID No. 22 ou qual- quer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 22.
[00192] Os anticorpos quiméricos aqui descritos também podem ser caracterizados pelo domínio constante e, mais particularmente, os re- feridos anticorpos quiméricos podem ser selecionados ou concebidos como, sem limitação, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD ou IgE. Mais pre- ferencialmente, no contexto da presente invenção, os referidos anti- corpos quiméricos são IgG1 ou IgG4.
[00193] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é um anticorpo quimérico compreendendo os domínios variáveis VH e VL como descrito acima no formato I9gG1. Mais preferencialmente, o referido anticorpo quimérico compreende um domínio constante para o VH da sequência SEQ ID No. 43 e um domínio Capa para o VL da se- quência SEQ ID No. 45.
[00194] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é a chimeric anticorpo compreendendo domínio variáveis VH e VL como acima descrito no formato I9gG4. Mamis preferivelmente, o referido an-
ticorpo quimérico compreende um domínio constante para o VH de sequência SEQ ID No. 44 e um domínio Capa para o VL de sequência SEQ ID No. 45.
[00195] Em outra modalidade preferida, porém não limitativa, o an- ticorpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 23 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 23 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 28 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 28; b) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 24 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 24 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 29 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 29; c) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 25 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 25 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 30 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 30; d) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 26 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 26 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 31 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 31; e e) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 27 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 27 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 32 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 32.
[00196] Para mais clareza, a seguinte tabela 3 ilustra as sequências dos VH e VL, respectivamente, para os anticorpos quiméricos preferidos. Tabela 3 [ TcasiaPesada “Tcadeiateve — —[sEalDNo | Dominio variável (VA [Bo cana Domino variável (VD) Comprimento toa — | = 3 Po eemamenona Dominio vanáver VAR [qm eae Domino variável (VD) Comprimento tia — | = Tx Po eemamenona Dominio vanáver VAR [5 ca ar Domino variável (VD) Comprimento toa — | = 25 Po eemamenona Dominio vanáver VAR [q ea as Domino variável (VD) Comprimento tia — | =x Po eemamenona Domino variável VA [mr ea ao Domino variável (VD) Comprimento toa — | = 2 [Lo [eenrmeno na
[00197] De acordo com outro aspecto específico da presente inven- ção, o anticorpo é um anticorpo humanizado caracterizado pelo fato de as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas do anticorpo humano serem, respectivamente, a região lambda ou capa e a região gama-1, gama-2 ou gama-4.
[00198] Os anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos podem ser preparados por técnicas conhecidas por um especialista na técnica. Esses anticorpos humanizados são preferidos para a sua utili- zação em métodos envolvendo diagnósticos in vitro ou tratamento pre- ventivo e/ou terapêutico in vivo. Outras técnicas de humanização, também conhecidas por alguém versado na técnica, tais como, por exemplo, a técnica de "enxerto de CDR" descrita por PDL nas patentes
EP 0 451 216, EP O 682 040, EP O 939 127, EP O 566 647 ou US
5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089 e US 5.693.761. As patentes US 5.639.641 ou 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293 também podem ser citadas.
[00199] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) tendo: i) as CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências SEQ ID Nos. 7, 2 e 3, respectivamente, e ii) as FR1, FR2 e FR3 derivadas da linha germinativa hu- mana IGHV1-46*01 (SEQ ID No. 46), e iii) a FR4 derivada da linha germinativa humana IGHJ4*01 (SEQ ID No. 48).
[00200] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) tendo: i) as CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11, respectivamente, e ii) as FR1, FR2 e FR3 derivadas da linha germinativa hu- mana IGKV1-39*01 (SEQ ID No. 47), e iii) a FR4 derivada da linha germinativa humana IGKJ4*01 (SEQ ID No. 49).
[00201] Em uma modalidade preferida, mas não limitativa, da in- venção, o anticorpo compreende: a) uma cadeia pesada com CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências SEQ ID Nos. 7, 2 e 3, respectivamente, e FR1, FRA e FR3 derivadas da linha germinativa humana IGHV1-46*01 (SEQ ID No. 46), e a FR4 derivada da linha germinativa humana IGHJ4*01 (SEQ ID No. 48); e b) uma cadeia leve tendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11, respectivamente, e FR1, FRA e FR3 derivadas da linha germinativa humana IGKV1-39*01 (SEQ ID
No. 47), e a FR4 derivada da linha germinativa humana IGKJ4*01 (SEQ ID No. 49).
[00202] Em uma modalidade, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) da sequência SEQ ID No. 33 e um domínio variável de cadeia leve (VL) da sequência SEQ ID No. 35. O referido anticorpo humanizado será denominado daqui em diante hz208F2 ("Variante 1 "ou" Var. 1").
[00203] Em outra modalidade, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) da sequência SEQ ID No. 33, em que a referida sequência SEQ ID No. 33 compreende pelo menos 1 muta- ção reversa selecionada a partir dos resíduos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82e O5.
[00204] Em outra modalidade, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) da sequência SEQ ID No. 33, em que a referida sequência SEQ ID No. 33 compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 mutações reversas selecionadas dos resí- duos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76,77, 719, 82 e 95.
[00205] Para maior clareza, a seguinte tabela 4 ilustra as mutações reversas preferidas. Tabela 4 e kw kN em Es) o e e a x ls lv x rr) Faseo ja fm e Tr rs v je yo
[00206] Em uma modalidade, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) da sequência SEQ ID No. 35, em que a referida sequência SEQ ID No. 35 compreende pelo menos 1 mutação reversa selecionada a partir dos resíduos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 177 e 87.
[00207] Em uma modalidade, o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) da sequência SEQ ID No. 35, em que a referida sequência SEQ ID No. 35 compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 mu- tações reversas selecionadas de os resíduos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 ou 87.
[00208] Em outramodalidade, o anticorpo compreende: a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) da sequência SEQ ID No. 33, em que a referida sequência SEQ ID No. 33 compreende pelo menos 1 mutação reversa selecionada a partir dos resíduos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76,77, 79,82e 95; e b) um domínio variável de cadeia leve (VL) da sequência SEQ ID No.
35, em que a referida sequência SEQ ID No. 35 compreende pelo me- nos 1 mutação reversa selecionada a partir dos resíduos 22, 53, 55, 65, 71,72, 77 e 87.
[00209] Para maior clareza, a seguinte tabela 5 ilustra as mutações reversas preferidas.
Tabela 5 ro Ts e dr e vs ro meo 7 ds ja | | 7 ds 1
[00210] Em tal modalidade, o anticorpo compreende todas as muta- ções reversas acima mencionadas e corresponde a um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) da se- quência SEQ ID No. 34 e um domínio variável de cadeia leve (VL) da sequência SEQ ID No 36. O referido anticorpo humanizado será de- nominado daqui em diante hz208F2 ("Variante 3" ou "Var. 3").
[00211] Em outra modalidade, todas as formas humanizadas com- preendidas entre a Variante 1, e a Variante 3 também estão abrangi- das pela presente invenção. Em outras palavras, o anticorpo corres-
ponde a um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) de sequência de "consenso" SEQ ID No. 41 e um domí- nio variável de cadeia leve (VL) de sequência de "consenso" SEQ ID No. 42. O referido anticorpo humanizado, como um todo, será denomi- nado daqui em diante hz208F2 ("Variante2" ou "Var. 2").
[00212] Em uma modalidade preferida, mas não limitativa, o anti- corpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada da sequência SEQ ID No. 33 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No. 33 e as três CDRs de cadeia leve das sequências SEQ ID Nos. 9, 5e 11; e b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada da sequência SEQ ID No. 34 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No. 34 e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11.
[00213] Por "qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com a SEQ ID No. 33 ou 34", pretende-se designar as sequências que exibem as três CDRs de cadeia pesada SEQ ID No. 1,2 e 3 e, além disso, exibindo pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identi- dade com a sequência completa SEQ ID No. 33 ou 34 fora das se- quências correspondentes aos CDRs (isto é, SEQ ID Nos. 1,2 e3).
[00214] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo é seleciona- do a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada da sequência SEQ ID No. 33 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 33 e as três CDRs de cadeia leve das sequências SEQ ID No. 9, 56 11; e b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada da sequência SEQ ID No. 34 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 34 e as três CDRs de cadeia leve das sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11.
[00215] Se não for indicado nos parágrafos em questão, na presen- te descrição, por qualquer sequência ou por uma sequência que exibe pelo menos 80 % com uma sequência particular, deve ser entendido que a referida sequência exibe pelo menos 80 % e de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com a sequência referenciada. Quer essas sequências contenham sequências de CDR, pretende-se designar que as sequências que exibem pelo menos essas CDRs de forma idêntica às CDRs da sequência de referência, 80 %, de prefe- rência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com a sequência com- pleta tendo a ser calculado para a sequência restante localizada fora das sequências correspondentes a essas CDRs.
[00216] Em uma modalidade preferida, mas não limitativa, o anti- corpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve da sequência SEQ ID No. 35 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No. 35 e as três CDRs de cadeia pesada das sequências SEQ ID Nos. 7, 2e3;e b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve da sequência SEQ ID No. 36 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No. 36 e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 7, 2 e 3.
[00217] Por "qualquer sequência que exibe pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com a SEQ ID No.
ou 36", pretende-se designar as sequências que exibem as três
CDRs de cadeia leve SEQ ID Nos. 4, 5e 6 e, além disso, exibindo pe- lo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com a sequência completa SEQ ID No. 35 ou 36 fora das sequências correspondentes aos CDRs (isto é, SEQ ID Nos. 4, 5€6).
[00218] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo é seleciona- do a partir de: a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve da sequência SEQ ID No. 35 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 35 e as três CDRs de cadeia pesada das sequências SEQ ID No. 7, 2e 3; e b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada da sequência SEQ ID No. 36 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 36 e as três CDRs de cadeia pesada das sequências SEQ ID Nos. 7,2 e 3.
[00219] Os anticorpos humanizados aqui descritos também podem ser caracterizados pelo domínio constante e, mais particularmente, os referidos anticorpos humanizados podem ser selecionados ou conce- bidos como, sem limitação, I9G1, IgG2, 19G3, IgM, IgA, IgD ou IgE. Mais preferencialmente, no contexto da presente invenção, os referi- dos anticorpos humanizados são IgG1 ou IgG4.
[00220] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é um anticorpo humanizado compreendendo os domínios variáveis VH e VL como descrito acima no formato I9gG1. Mais preferencialmente, o referido anticorpo humanizado compreende um domínio constante pa- ra o VH da sequência SEQ ID No. 43 e um domínio Capa para o VL da sequência SEQ ID No. 45.
[00221] “De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo é um anticorpo humanizado compreendendo os domínios variáveis VH e VL como descrito acima no formato I9G4. Mais preferencialmente, o referido anticorpo humanizado compreende um domínio constante pa-
ra o VH da sequência SEQ ID No. 44 e um domínio Capa para o VL da sequência SEQ ID No. 45.
[00222] “De acordo com ainda outra modalidade da invenção, o anti- corpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesa- da da sequência SEQ ID No. 37 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 37 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID No. 39 ou qualquer sequência que exibe pelo me- nos 80 % de identidade com SEQ ID No. 39; e b) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesa- da da sequência SEQ ID No. 38 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 38 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID No. 40 ou qualquer sequência que exibe pelo me- nos 80 % de identidade com a SEQ ID No. 40.
[00223] Para maior clareza, a seguinte tabela 6a ilustra exemplos não limitativos de sequências de VH e VL para a variante 1 (Var. 1), e a variante 3 (Var. 3) do anticorpo humanizado hz208F2. Também compreende a sequência de consenso para a variante 2 (Var. 2). Tabela 6a [O [esestesao — Testeieve — Tesainne | [Domo Ra ag ET e at comi 186 [Domo sara ag Er e oa gar a Teorema gg comprime 0 [ra o osso 2
[00224] Em outra modalidade preferida, porém não limitativa, o an- ticorpo é selecionado a partir de:
a) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 e 80 ou qualquer sequência com pelo menos 80 %, preferivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID No,56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, T8 e 80; e as três CDRs de cadeia leve de sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11; b) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 57 ou 60 ou qualquer sequência com pelo menos 80 %, preferivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID Nos. 57 ou 60; e as três CDRs de cadeia pesada de sequências SEQ ID Nos. 7, 2e3;e c) um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 e 80 ou qualquer sequência com pelo menos 80 %, preferivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID Nos. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 e 80; e um do- mínio variável de cadeia leve de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 57 ou 60 ou qualquer sequência com pelo menos 80 %, preferivelmente, 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com SEQ ID Nos. 57 ou 60.
[00225] “De acordo com ainda outra modalidade da invenção, o anti- corpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de sequência SEQ ID Nos. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 e 80 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 ou 80, e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 57 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 57; e b) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de sequência SEQ ID Nos. 56, 64, 68 e 78 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 56, 64, 68 ou 78 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 60, ou qualquer se- quência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No.
60.
[00226] “De acordo com ainda outra modalidade da invenção, o anti- corpo é selecionado a partir de: a) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 58 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 58 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59; b) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 58 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 58 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 61 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 61; c) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 63 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 63 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59; d) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 65 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 65 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59; e) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 65 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 65 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 61 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 61;
f) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma ca- deia pesada de sequência SEQ ID No. 67 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 67 e uma ca- deia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exi- be pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59;
g) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 69 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 69 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59;
h) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 69 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 69 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 61 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 61;
i) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma ca- deia pesada de sequência SEQ ID No. 71 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 71 e uma ca- deia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exi- be pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59;
j) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma ca- deia pesada de sequência SEQ ID No. 73 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 73 e uma ca- deia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exi- be pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59;
k) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 75 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 75 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59; |) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma ca- deia pesada de sequência SEQ ID No. 77 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 77 e uma ca- deia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exi- be pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59; m) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 79 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 79 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59; n) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 79 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 79 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 61 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 61; e o) um anticorpo compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada de sequência SEQ ID No. 81 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 81 e uma cadeia leve de sequência SEQ ID No. 59 ou qualquer sequência que exibe pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID No. 59.
[00227] Em outras palavras, o anticorpo pode ser um anticorpo compreendendo: a) uma cadeia pesada de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 e 81 ou qualquer sequência com pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID Nos. 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73,75, 77, T9e 81; e b) uma cadeia leve de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 59 e 61 ou qualquer sequência com pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID Nos. 59 e 61.
[00228] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo é seleciona- do a partir de: a) uma cadeia pesada de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 e 81 ou qualquer sequência com pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID Nos. 58, 63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 198 ou bl; e b) uma cadeia leve de sequência selecionada a partir de SEQ ID Nos. 59 e 61 ou qualquer sequência com pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID Nos. 59 ou 61.
[00229] Para maior clareza, a seguinte tabela 6b ilustra exemplos não limitativos de sequências de VH e VL (domínio variável e compri- mento total) para diferentes variantes do anticorpo humanizado hz208F2. Tabela 6b [ear — esentes — stato | Domínio variável (VH) 56 hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO037/L018 Comprimento total 58 Comprimento total 59 Domínio variável (VH) 56 Hz208F2 Domínio variável (VL) 60 HO037/L021 Comprimento total 58 Comprimento total 61 Domínio variável (VH) 62 Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO047/L018 Comprimento total 63 Comprimento total 59 Domínio variável (VH) 64 Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO049/L018 Comprimento total 65 Comprimento total 59 Domínio variável (VH) 64 caa Tammersanen o | a | EEETAAS — Tostes — Tampro | H049/L021 Comprimento total 65 rs Toma ds
Domínio variável (VH) 66
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO51/L018 Comprimento total 67 Comprimento total 59
Domínio variável (VH) 68
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO52/L018 Comprimento total 69 Comprimento total 59
Domínio variável (VH) 68
Hz208F2 Domínio variável (VL) 60 HO52/L021 Comprimento total 69 Comprimento total 61
Domínio variável (VH) 70
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO57/L018 Comprimento total rá Comprimento total 59
Domínio variável (VH) 72
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO68/LO018 Comprimento total 73 Comprimento total 59
Domínio variável (VH) 74
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO070/L018 Comprimento total 75 Comprimento total 59
Domínio variável (VH) 76
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO071/L018 Comprimento total 77 Comprimento total 59
Domínio variável (VH) 78
Hz208F2 Domínio variável (VL) 57 HO076/LO018 Comprimento total 79 Comprimento total 59
[estarei — estes — smatvo | E al Hz208F2 Domínio variável (VL) 60 H076/L021 Comprimento total 79 Comprimento total 61 Domínio variável (VH) 80 Sm fome fm dE | HO077/L018 Comprimento total 81 Comprimento total 59
[00230] “De acordo com outro aspecto da presente invenção, o anti- corpo é um anticorpo selecionado a partir de i) um anticorpo produzido pelo hibridoma 1-4757, 1-4773, 1-4775, 1-4736 ou 1-4774 depositado no CNCM, Institut Pasteur France em 30 de maio de 2013, 26 de junho de 2013, 26 de junho de 2013, 24 de abril de 2013 e 26 de junho de 2013, respectivamente, ou ii) um anticorpo que compete pela ligação ao IGF- 1R com o anticorpo de i); ou iii) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo de IGF-1R que o anticorpo de i).
[00231] “De acordo com um aspecto particular, a unidade de ligação é um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito acima para uso como um veículo de endereçamento para a liberação de um agente citotóxico em um sítio alvo hospedeiro, o referido sítio alvo hospedeiro consistindo em um epitopo localizado em IGF-1R, de preferência o domínio extracelular IGF-1R, mais prefe- rencialmente o IGF-1R humano (SEQ ID No. 50) e ainda mais prefe- rencialmente o domínio extracelular IGF-1R humano (SEQ ID No. 51), e ainda mais preferencialmente o N-terminal do domínio extracelular de IGF-1R humano (SEQ ID No. 52), ou qualquer sequência de varian- te natural do mesmo.
[00232] Em uma modalidade preferida, o referido sítio alvo hospe- deiro é um sítio alvo de uma célula de mamífero, mais preferencial- mente de uma célula humana, mais preferencialmente células que na-
turalmente ou por meio de recombinação genética, expressam IGF-1R.
[00233] Em uma modalidade adicional, o referido sítio alvo hospe- deiro é um sítio alvo de uma célula de paciente, preferencialmente humano, com um câncer, preferencialmente um câncer que expressa IGF-1R, ou cânceres relacionados a IGF-1R.
[00234] Os cânceres que expressam IGF-1R ou cânceres relacio- nados com IGF-1R incluem particularmente cânceres em que as célu- las tumorais expressam ou sobre-expressam todo ou parte do IGF-1R na sua superfície.
[00235] Os anticorpos IGF-1IR que podem ser usados como unida- de de ligação na presente invenção são descritos em particular em WOZ2015/162291, WO2015/162292 ou WO2015/162293. Molécula Ligante
[00236] O ligante de fórmula (|) de acordo com a presente invenção, de preferência em que q = 2, é útil para ligar covalentemente um fár- maco a uma unidade de ligação, tal como um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00237] Paraisso,a porção de sulfomaleimida do ligante pode rea- gir com porções tiol presentes na unidade de ligação, enquanto a ex- tremidade X;3 do ligante pode reagir com um grupo funcional presente no fármaco (QH ou Q-OH).
[00238] A molécula de ligação pode ser preparada de acordo com vários métodos de síntese que são exemplificados na parte experi- mental.
[00239] “Quando X: e X> são escolhidos independentemente entre H e Cl, pelo menos um sendo Cl, o ligante de acordo com a invenção pode ser preparado a partir de um composto dissulfeto de fórmula L- NHCO-CH2CH2-SS-CH2CH2-CONH-L, com L representando L1-(CO).- (W)w-(Y),-X3, opcionalmente em uma forma protegida, por reação com um agente de cloração, como SO2Cl>.
[00240] “Quando X: e X> são escolhidos independentemente entre H e Br, pelo menos um sendo Br, o ligante de acordo com a invenção (9a Cm pode ser preparado a partir de um composto de fórmula O ,comL representando L1-(CO)-c-(W)w-(Y)y-X3, opcionalmente em uma forma protegida, por reação com um agente de bromação como Br».
[00241] “Quando pelo menos um de X: e X2> é um (C1-C6) alcóxi, um arilóxi opcionalmente substituído ou -O-(CH2CH2O0).H, o ligante de acordo com a invenção pode ser preparado a partir do ligante corres- pondente de fórmula (|) com pelo menos um de X; e X> sendo CI ou Br, opcionalmente em uma forma protegida, por uma reação de substi- tuição nucleofílica com um álcool de fórmula R.--OH com Ra represen- tando um (C1-Cs) alquila, um arila opcionalmente substituída, ou- (CH2CH20)-H.
[00242] “Pode-se considerar também a formação da porção de sul- fomaleimida com uma porção ligante truncada (por exemplo, com L = L1-(CO).-X6 com o grupo funcional Xs, como NH2, OH ou um grupo de saída, opcionalmente em uma forma protegida) enxertado nele e para completar a síntese do ligante após a formação da porção de sulfoma- leimida, como ilustrado notavelmente abaixo para a síntese do conju- gado fármaco-ligante.
[00243] Além disso, uma etapa de oxidação pode ser realizada para converter o grupo S(O), no estado de oxidação necessário (isto é, de preferência q = 2). Tal etapa de oxidação é bem conhecida dos versa- dos na técnica. O oxidante usado pode ser mCPBA, RuO. ou RuCl3/NalO2, por exemplo.
[00244] Etapas de proteção/desproteção adicionais podem ser rea- lizadas nos processos descritos acima, tais etapas e suas condições de reação sendo bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00245] O ligante obtido pode ser separado do meio de reação por métodos bem conhecidos dos versados na técnica, tais como por ex- tração, evaporação do solvente ou por precipitação ou cristalização (seguida por filtração).
[00246] O ligante também pode ser purificado, se necessário, por métodos bem conhecidos da pessoa versada na técnica, tais como por recristalização, por destilação, por cromatografia em uma coluna de sílica gel ou por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Conjugados fármaco-ligante
[00247] O conjugado fármaco-ligante de fórmula (II) de acordo com a presente invenção, de preferência em que q = 2, é útil para ligar co- valentemente um fármaco a uma unidade de ligação, como um anti- corpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00248] Paraisso,a porção de sulfomaleimida do conjugado fárma- co-ligante pode reagir com porções tiol presentes na unidade de liga- ção.
[00249] Os conjugados fármaco-ligante podem ser preparados de acordo com vários métodos de síntese. Na verdade, o ligante de fór- mula (1) pode reagir com o fármaco (QH ou Q-OH) para formar o con- jugado. No entanto, outras possibilidades podem ser consideradas nas quais o ligante é formado progressivamente na molécula de fármaco, isto é, uma primeira parte do ligante é primeiro enxertada no fármaco, o composto resultante sendo reagido com uma molécula ligante trun- cada para formar o conjugado fármaco-ligante .
[00250] As seguintes vias sintéticas não limitativas podem assim ser utilizadas para a preparação dos conjugados fármaco-ligante de fórmula (Il) de acordo com a presente invenção, mesmo que outras vias sintéticas possam ser consideradas.
[00251] Em todas essas vias sintéticas, outras etapas de prote- ção/desproteção/substituição podem ser realizadas, tais etapas e suas condições de reação sendo bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00252] O conjugado fármaco-ligante obtido pode ser separado do meio de reação por métodos bem conhecidos da pessoa versada na técnica, tais como por extração, evaporação do solvente ou por preci- pitação ou cristalização (seguida por filtração).
[00253] O conjugado fármaco-ligante também pode ser purificado, se necessário, por métodos bem conhecidos pelos versados na técni- ca, tais como por recristalização, por destilação, por cromatografia de coluna de sílica gel ou por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Rota sintética | representada no Esquema |: o Issa + 2 HNL(CO)-(W),-(Y),-Q O : | o AMFC tr Ss 6 Ao ctco)-(WI-0,-A o ts 2 KT irícos-tm. a “A | opcionalmente x 2. 2 NX grimicos-tmi ma “ Esquema |
[00254] A porção de sulfomaleimida terminal pode ser formada a partir de um grupo já presente no fármaco enxertado com um precur- sor da porção ligante, conforme detalhado abaixo.
[00255] Etapa 1: Cloreto de 3-(2-clorocarbonil-etildissulfanil)-propio- nila é reagido com uma molécula de fórmula HaN-L1-(CO)e-(W)w(Y),-Q
(isto é, uma molécula de fármaco na qual uma parte do ligante já foi enxertado). Tal reação pode ser realizada na presença de uma base como a trimetilamina. A reação pode ser realizada em um solvente como DCM, notavelmente a uma temperatura entre O ºC, e a tempera- tura ambiente.
[00256] O cloreto de 3-(2-clorocarbonil-etildissulfanil)-propionila po- de ser preparado a partir do ácido 3,3'-ditiodipropiônico por um método bem conhecido para formar um cloreto de acila, tal como por reação com (COCI)». A reação pode ser realizada em um solvente, como DCM, principalmente em temperatura ambiente. Uma quantidade cata- lítica de DMF pode ser adicionada.
[00257] Pode-se considerar também a reação do cloreto de 3-(2- clorocarbonil-etildissulfanil)-propionila com uma molécula de fórmula H2N-L1-(CO).-X3 opcionalmente em uma forma protegida, por exemplo, e para completar a síntese da porção ligante enxertada com Q em uma etapa posterior, notavelmente de acordo com uma das outras ro- tas sintéticas descritas abaixo.
[00258] Etapa 2:A molécula obtida na etapa 1 pode ser ciclizada e clorada na presença de SO2CL, presente notavelmente em um grande excesso (por exemplo, 5 a 10 eq., como cerca de 9 eq.). A reação po- de ser realizada em um solvente, como DCM, principalmente em tem- peratura ambiente.
[00259] O átomo de cloro pode ser convertido em outro grupo X: ou X2 (diferente de H) por métodos bem conhecidos, como por uma subs- tituição nucleofílica.
[00260] Etapa 3:Se necessário, a molécula obtida na etapa 2 será oxidada para proporcionar um fármaco-ligante de fórmula (lla). Tal etapa de oxidação pode ser realizada em condições bem conhecidas por aqueles versados na técnica, notavelmente na presença de mCPBA (por exemplo, 10 eq.). A reação pode ser realizada em um solvente, como DCM, principalmente em temperatura ambiente. Rota sintética Il representada no Esquema Il: x Ba x Ba IT riricor-tmm on + OH —> IT rico-tmçNa %X “ Esquema ||
[00261] Pode ser realizado um acoplamento direto entre um fárma- co (QH ou Q-OH), e o ligante de fórmula (I), cujas condições depen- dem da natureza de X; e do grupo funcional presente no fármaco.
[00262] Este acoplamento pode ser uma substituição, tal como uma substituição nucleofílica ou uma reação de Mitsunobu, sendo as condi- ções de reação de tais reações químicas bem conhecidas da pessoa versada na técnica.
[00263] “Quando X;= OH e pelo menos y = 1, wÉ 0 ouc=1 (isto é, o grupo funcional terminal do ligante de fórmula (1) é COOH) e QH compreende uma função de NH, o acoplamento entre o ligante de fór- mula (l), e o fármaco (QH) pode ser um acoplamento de peptídeo bem conhecido por alguém versado na técnica. A função de COOH terminal também pode ser convertida em um cloreto de acila COCI, que poderia então reagir com uma função nucleofílica presente no fármaco (QH) (por exemplo, NH ou OH).
[00264] “Quando X3= NH>z; ou Xa=H,y=z2=1eZ=-NR+-(CH>2)- NR5-; ou Xg= H, c=w=y=0,2=1eZ é -NR+-(CH2)J-NRs5- (isto é, O grupo funcional terminal do ligante de fórmula (1) é NH) e Q-OH com- preende uma função de COOH, o acoplamento entre o ligante de fór- mula (I), e o fármaco (Q-OH) pode ser um acoplamento de peptídeo conhecido por aqueles versados na técnica. A função de COOH termi- nal do fármaco também pode ser convertida em um cloreto de acila COCI, que poderia então reagir com a função de NH.
[00265] Se necessário, uma etapa adicional de oxidação pode ser realizada para converter o grupo S(O), no estado de oxidação neces- sário (isto é, de preferência q = 2). Tal etapa de oxidação é bem co- nhecida dos versados na técnica. O oxidante usado pode ser mCPBA, RuO., ou RuCl3/NalOa, por exemplo. Rota sintética Ill representada nos Esquemas llla e Illb: o o Xi ( 9a Xi (e NX prireoor + H-(WXM),-A —> K prtmeomam ora Ko Ko o O Esquema Illa (com c = 1) o o Xi ( 2) q Xi Í 2) q K rea os + H-(),-Q —> KT prea-m-oça x KZ o o Esquema Illb (com w É 0)
[00266] Um acoplamento de peptídeo também pode ser realizado entre um ligante truncado com uma função de COOH e uma porção de fármaco enxertada com a outra parte do ligante como ilustrado nos Esquemas llla e Illb. A função de COOH terminal do ligante truncado também pode ser convertida em um cloreto de acila COCI, que poderia então reagir com a função de NH do outro reagente. As condições de reação de tais reações são bem conhecidas da pessoa versada na técnica.
[00267] Se necessário, uma etapa adicional de oxidação pode ser realizada para converter o grupo S(O), no estado de oxidação neces- sário (isto é, de preferência q = 2), por exemplo, na presença de MCPBA, RuO. ou RuCl3/NalOa. Rota sintética IV representada no Esquema IV: o o Xi ( 9a Xi (e KI" + XL (COL-M,-00,-Q — K prio moça x KZ o o
Esquema IV
[00268] Um acoplamento entre a porção de sulfomaleimida, e o fármaco no qual o resto do ligante já foi enxertado também pode ser realizado como ilustrado no Esquema IV no qual Xs representa OH ou um grupo de saída como definido anteriormente.
[00269] O acoplamento pode ser uma substituição, como uma subs- tituição nucleofílica.
[00270] Se necessário, uma etapa adicional de oxidação pode ser realizada para converter o grupo S(O), no estado de oxidação neces- sário (isto é, de preferência q = 2), por exemplo, na presença de MCPBA, RuO. ou RuCl3/NalOa. Rota sintética V representada nos Esquemas Va e Vb: o x 2 KI e= + Na-La-(CO)c-(Whw-(Y),-Q
KZ o | (o) Xi 89 NºN
NE ps 2 UN L5-(CO)o-(M)=00,-0
O Esquema Va o x Jet + ==—L3-(CO)-(W),,-V), -Q Ko o | (9)
XN CS AN | netaon TM “x Ne L3-(CO)-(W)-00),-Q a. Esquema Vb
[00271] “Quando o ligante compreende uma porção de heteroarileno com é um 1H-1,2,3-triazol bivalente, este grupo heteroarileno pode ser formado por química de clique entre uma azida e um alcino em condi-
ções bem conhecidas por aqueles versados na técnica, conforme ilus- trado em Esquemas Va e Vb acima, onde L> representa-(CH>2)n- ou- (CH2CH20)n-CH2-CH>2- e L3 representa -(CH2),- ou -(CH2CH20)m-CH>2- CH>2-, L2 e La sendo não ao mesmo tempo um grupo -(CH2CH20O)m- CH2-CH>-.
[00272] Se necessário, uma etapa adicional de oxidação pode ser realizada para converter o grupo S(O), no estado de oxidação neces- sário (isto é, de preferência q = 2), por exemplo, na presença de MCPBA, RuO. ou RuCl3/NalOa. Conjugados unidade de ligação-fármaco
[00273] Os conjugados unidade de ligação-fármaco, tais como con- jugados anticorpo-fármaco, podem ser preparados por: 1) formação de funções de tiol na unidade de ligação, nomeadamente por redução da (s) ligação (ões) dissulfeto; e 2) reação da referida unidade de ligação com funções de tiol com con- jugado (s) fármaco-ligante de modo a ligar covalentemente porção (ões) de fármaco à unidade de ligação por reação da função de sulfo- maleimida com funções de tiol.
[00274] Talmétodo é ilustrado no Esquema VI abaixo. Unidade de Vs Unidade de )-/su x O (EX (= Ç no | Unidade de (Ex - (Skx) o s s Esquema VI Composição farmacêutica
[00275] Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende um conjugado unidade de ligação-fármaco de fórmula (Ill) ou (IV) e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00276] As composições farmacêuticas da invenção podem ser des- tinadas à administração enteral (por exemplo, oral) ou parenteral (por exemplo, intravenosa), preferencialmente administração oral ou intra- venosa. O ingrediente ativo pode ser administrado em formas unitárias para administração, misturado com excipientes farmacêuticos conven- cionais, a animais, preferencialmente mamíferos incluindo seres hu- manos.
[00277] Para administração oral, a composição farmacêutica pode estar na forma sólida ou líquida (solução ou suspensão).
[00278] Uma composição sólida pode estar na forma de comprimi- dos, cápsulas de gelatina, pós, grânulos e semelhantes. Em comprimi- dos, o ingrediente ativo pode ser misturado com veículo (s) farmacêu- tico (s), tais como gelatina, amido, lactose, estearato de magnésio, tal- co, goma arábica e semelhantes antes de ser comprimido. Os com- primidos podem ser ainda revestidos, nomeadamente com sacarose ou com outros materiais adequados, ou podem ser tratados de forma a terem uma atividade prolongada ou retardada. Em pós ou grânulos, o ingrediente ativo pode ser misturado ou granulado com agentes dis- persantes, agentes umectantes ou agentes de suspensão e com corre- tores de sabor ou adoçantes. Em cápsulas de gelatina, o ingrediente ativo pode ser introduzido em cápsulas de gelatina mol ou dura na forma de um pó ou grânulos, como mencionado anteriormente, ou na forma de uma composição líquida, como mencionado abaixo.
[00279] Uma composição líquida pode conter o ingrediente ativo juntamente com um adoçante, um intensificador de sabor ou um agen- te de coloração adequado em um solvente como a água. A composi- ção líquida também pode ser obtida suspendendo ou dissolvendo um pó ou grânulos, como mencionado acima, em um líquido como água, suco, leite, etc. Pode ser, por exemplo, um xarope ou um elixir.
[00280] Para administração parentérica, a composição pode estar na forma de uma suspensão ou solução aquosa que pode conter agentes de suspensão e/ou agentes umectantes. A composição é van- tajosamente estéril. Pode estar na forma de uma solução isotônica (em particular em comparação com o sangue).
[00281] Essas composições parentéricas conterão vantajosamente um meio fisiologicamente aceitável, geralmente baseado em uma so- lução salina isotônica, isto é, solução aquosa de NaCl a 0,9 % (solu- ção salina normal). O cossolvente não aquoso miscível em água, co- mo etanol, glicerina, propileno glicol ou n-lactamida, também pode ser usado.
[00282] A composição parenteral da invenção também pode com- preender um ou mais aditivo (s), tais como agentes de suspensão, agentes umectantes, conservantes, antioxidantes, agentes quelantes, agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade, etc. Esses adi- tivos são convencionais para aqueles versados na técnica.
[00283] Os agentes de suspensão podem ser um alginato, carboxi- metil celulose de sódio, metil celulose, hidroxilmetil celulose, hidroxietil celulose, hidroxipropilmetil celulose, celulose microcristalina, uma go- ma como acácia, goma tragacanto ou xantana, gelatina, uma carrage- nina, polivinil pirrolidona, etc.
[00284] Os agentes umectantes podem ser glicerina, propilenoglicol ou também tensoativos não iônicos, como uma lecitina, um polissorba- to ou um poloxâmero.
[00285] Os conservantes podem ser álcool benzílico, fenol, cresol, clorobutanol, um parabeno, como metilparabeno, propilparabeno ou propilparabeno, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, etc.
[00286] Os antioxidantes podem ser ácido ascórbico, ácido cítrico,
acetilcisteína, sais de ácido sulfuroso (bissulfito, metabissulfito), mono- tioglicerol, sulfoxilato de formaldeído de sódio, tioureia, tocoferol, etc.
[00287] Os agentes quelantes podem ser um sal de ácido etilenodi- aminotetracético (EDTA).
[00288] Os agentes tamponantes podem ser acetato, citrato, tarta- rato, fosfato, trietanolamina (TRIS), etc.
[00289] Os agentes de ajuste de tonicidade podem ser dextrose, glicerol, cloreto de sódio, glicerina, manitol, etc.
[00290] O conjugado unidade de ligação-fármaco da invenção pode ser usado em uma composição farmacêutica em uma dose que varia de 0,01 mg a 1000 mg por dia, administrada em apenas uma dose uma vez ao dia ou em várias doses ao longo do dia, por exemplo, du- as vezes ao dia em doses iguais. A dose diária administrada está van- tajosamente compreendida entre 5 mg e 500 mg, e mais vantajosa- mente entre 10 mg e 200 mg. No entanto, pode ser necessário usar doses fora destas faixas, o que pode ser notado pela pessoa versada na técnica. Tratamento de câncer
[00291] O conjugado unidade de ligação-fármaco de fórmula (Ill) ou (IV) ou uma composição farmacêutica compreendendo uma unidade de ligação de fórmula (Ill) ou (IV) pode ser usado para o tratamento de câncer, em particular quando compreende uma porção de fármaco (Q) que é um resíduo de um fármaco (QH) útil no tratamento do câncer, como um agente citotóxico.
[00292] “Conjugados unidade de ligação-fármaco, como conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) combinam a especificidade de ligação de uma unidade de ligação, como um anticorpo, com a potência de fár- macos, como, por exemplo, agentes citotóxicos.
[00293] O uso de conjugados unidade de ligação-fármaco, como ADCSs, permite a distribuição local de fármacos que, se administradas como fármacos não conjugados, podem resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais. Em outras palavras, a eficácia má- xima com toxicidade mínima é buscada desse modo.
[00294] O câncer pode ser exemplificado, mas não limitado a, cân- cer de próstata, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, glioblastoma, cólon, câncer, câncer gástrico, cân- cer renal, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço ou qual- quer outro câncer associado com a expressão do antígeno direcionado pelo anticorpo nas células tumorais.
[00295] A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos e figuras não limitativos.
FIGURAS
[00296] As Figuras 1A, 2, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 21 e 22A represen- tam espectros de massa de conjugados fármaco-ligante de acordo com a invenção.
[00297] As Figuras 1B,3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8 e 9 representam es- pectros de *H-RMN de conjugados fármaco-ligante de acordo com a invenção.
[00298] As Figuras 10 e 11 representam os espectros de massa de conjugados fármaco-somatostatina de acordo com a invenção.
[00299] A Figura 12 representa a análise por SDS-PAGE do anti- corpo Ab1 (1) e ADCs purificados de acordo com a invenção (ADC1-A (2), ADC1-B (3), ADC1-C (4), ADC1-D (5), ADC1-E (6), ADC1-F (7) e ADC1-G (8)) sob condições redutoras e não redutoras. As bandas ob- servadas nos géis correspondem a anticorpos completamente em pon- te (isto é, LHHL); parcialmente em ponte (isto é, HHL, HH, HL) e sem ponte (isto é, He L).
[00300] A Figura 13 representa a análise por SEC do anticorpo Ab1 e ADCs de acordo com a invenção (ADC1-A, ADC1-B, ADCT1-C, ADC1-D, ADC1-E, ADC1-F e ADC1-G).
[00301] As Figuras 14A, 14B, 14C e 14D representam espectros de m/z de ADC antes da deconvolução de ADCs de acordo com a in- venção: (A) ADC1-A, (B) ADC1-B, (C) ADC1-C e (D) ADC-1D, respec- tivamente.
[00302] As Figuras 15A, 15B e 15C representam a distribuição de DAR após a deconvolução Maxent para (A) ADC1-A, (B) ADC1-B e (C) ADC1-D, respectivamente.
[00303] As Figuras 16A e 16B representam uma análise por espec- trometria de massa nativa de ADCs: (A) um ADC Ref-A de referência e (B) ADC1-C de acordo com a invenção.
[00304] As Figuras 17A, 17B e 17C representam os resultados do estudo de estabilidade in vitro, apresentando a porcentagem de anti- corpo total (100 %) e ADC em cada ponto de tempo (DO, D3, D7 e D14) em soros de (1) humano, (2) cinomolgo, (3) camundongo e (4) rato para (A) uma referência ADC Ref-B, (B) ADC1-C e (C) ADCT1-E, respectivamente.
[00305] As Figuras 18A e 18B representam a avaliação da citotoxi- cidade celular in vitro de diferentes ADCs em células NCI-H2122 (A) e MCF-7 (B), respectivamente.
[00306] As Figuras 19 e 20 representam a atividade in vivo de ADC1-C e referência ADC Ref-A em um modelo de câncer de ovário.
[00307] A Figura 22B representa um espectro de TOF-MS de um conjugado fármaco-ligante de acordo com a invenção.
[00308] A Figura 23A representa a análise por SEC do anticorpo Ab1 e ADCs de acordo com a invenção que são sintetizados com os derivados PNU-159682.
[00309] A Figura 23B representa a análise por SEC do anticorpo Ab2 e ADCs de acordo com a invenção que são sintetizados com os derivados PNU-159682.
[00310] As Figuras 24: 24A, 24B, 24C e 24D representam espec-
tros de m/z ADC antes da deconvolução dos ADCs de acordo com a invenção: (A) hz208F2-F562524, (B) c9G4-F562524, (C) hz208F2- F562616 e (D) c9G4-F562646, respectivamente.
[00311] As Figuras 25: 25A, 25B, 25C e 25D representam a distri- buição de DAR, após a deconvolução Maxent, para ADCs de acordo com a invenção: (A) hz208F2-F562524, (B) c9G4-F562524, (C) hz208F2-F562616 e (D) c9G4- F562646, respectivamente.
[00312] As Figuras 26: 26A e 26B representam a avaliação da cito- toxicidade celular in vitro do ADC hz208F2-F562524 e do ADC contro- le correspondente c9G4-F562524, em células NCI-H2122 (A) e MCF-7 (B), respectivamente.
[00313] As Figuras 27: 27A e 27B representam a avaliação da cito- toxicidade celular in vitro do ADC hz208F2-F562646 e do ADC contro- le correspondente c9G4-F562646, em células NCI-H2122 (A) e MCF-7 (B), respectivamente.
[00314] A Figura 28 representa a atividade in vivo do ADC hz208F2-F562524, e do ADC controle correspondente c9G4-F562524, em um modelo de câncer de ovário.
EXEMPLOS Abreviações ACN : Acetonitrila ADC : Conjugado Anticorpo-Fármaco aq : aquoso BBO : Banda Larga Observa BCA : Ácido bicinconínico CDR : Região de Determinação Complementar DAR : Relação Fármaco para Anticorpo DCM : Diclorometano DIPEA : N,N-Diisopropiletilamina DMF : Dimetilformamida DMSO : Dimetilsulfóxido EDCI : 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida EDTA : Ácido etilenodiaminatetraacético eq : equivalente
ES : Eletrovaporização ES| : lonização por eletrovaporização HATU : Hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H- 1,2,3-triazolo[4,5-b]piridínio HOBt : I-Hidroxibenzotriazol HIC : Cromatografia de Interação Hidrofóbica HPLC : Cromatografia líquida de alto desempenho HRMS : Espectrometria de Massa de Alta Resolução LBA : Ensaio de Ligação de Ligante LC : Cromatografia liquida LCMS : Cromatografia Líquida - Espectrometria de Massa mCPBA : Ácido meta-cloroperoxibenzoico Ms : Mesila MS : Espectro de Massa RMN : Ressonância Magnética Nuclear PBS : Solução Salina tamponada com fosfato Q-TOF : Tempo de trajetória quadripolar Rf : Fator de retardo ta : Temperatura ambiente sat. : saturado SDS-PAGE : Eletroforese em gel de Dodecil Sulfato de Sódio-Poliacrilamida SEC : Cromatografia de exclusão por tamanho TBME : Terc-butil metil éter TCEP : Tris(2-carboxietil)fosfina TEA : Trietilamina TFA : Ácido trifluoroacético THF : Tetra-hidrofurano TLC : Cromatografia em camada fina TOF : Tempo de trajetória Ts : Tosila UV : Ultravioleta Procedimentos experimentais:
[00315] Todas as reações que requerem condições anidrosas foram conduzidas em um aparelho seco em estufa sob uma atmosfera de nitrogênio. Os solventes anidrosos foram recebidos em frascos sela- dos sob atmosfera inerte. Todos os reagentes foram usados como re- cebidos. A cromatografia de coluna foi realizada em Colunas com síli- ca gel puriFlashO (50 um) em um Interchim puriFlashO 430 e um Gra-
ce RevelerisO X2. A TLC foi realizada em folhas de alumínio pré- revestidas com sílica (sílica gel 60 F251 da Merck) que foram visualiza- das com uma lâmpada UV de 254 nm. Os espectros de RMN de pró- ton (*H) e carbono (ºC) foram registrados em CDCI3 e DMSO em tem- peratura ambiente com Bruker 500 MHz Ascend'Y equipado com uma sonda BBO Prodigy (5 mm). Os espectros foram interpretados usando o software Topspin'!VY 3.2. Os desvios químicos (õx e õc) são relatados em partes por milhão (ppm) e são referenciados em relação a CDCI3 ('H RMN 7,26, *ºC RMN 77,0, sinal central do tripleto) ou DMSO (*H RMN 2,50, *?ºC RMN 37,9, sinal central do septupleto). As atribuições foram auxiliadas por experimentos COSY e HSQC. As constantes de acoplamento (J: prótons vicinais, Jcis: prótons vicinais na posição cis, Jo: prótons na posição orto, Jm: prótons na posição meta) são dadas em Hertz com aproximação de + 0,1 Hz. As multiplicidades são dadas como singular (s), dupleto (d), tripleto (t), quarteto (q), tripleto de triple- to (t. de t.), Multipleto (m) e amplo (b) quando aplicável. Os espectros de massa (m/z) foram registrados em um espectrômetro Waters& ZQ Mass Detector usando a técnica de ionização por eletrovaporização (ES+), temperatura da fonte: 120 ºC, temperatura de dessolvatação: 350 ºC, voltagem capilar: 3,20 kV, voltagem do cone: 25 V, tensão do extrator: 5 V, tensão da lente Rf: 0,5 V, faixa de varredura MS: 100-
2000. As análises de HPLC foram realizadas usando uma coluna Wa- ters& X-Bridge Shield RP18 de 3,5 um (3,0 mm x 30 mm) e uma pré- coluna Waters& X-Bridge Shield RP18 de 3,5 um (3,0 mm x 20 mm) em uma HPLC WatersO Alliance 2695 com software MassLinx 4.1 e um Waters 2996 PDA Dectector UV/vis no comprimento de onda apro- priado para a amostra em análise. Os tempos de retenção (R;) são da- dos em minutos com aproximação de 0,01 min. Dois métodos de elu- ição foram usados: Tabela 7. Método 1 de eluição para LC
Tempo (min.) Solvente A (Água+O0,1 % | Solvente B (ACN+0,1 % P ' de ácido fórmico) % de ácido fórmico) % ao ana BR Tabela 8. Método 2 de eluição para LC Tempo (min.) Solvente A (Água+O0,1 % | Solvente B (ACN+0,1 % P * | de ácido fórmico) % de ácido fórmico) % [900 5a DB [225 oo 1000 [260 000
[00316] Os tempos de retenção dados pelo Método 1 são indicados por R:1 e aqueles dados pelo Método 2 por Rt.2.
1. Síntese dos ligantes Exemplo de uma via sintética para oxoisotiazolonas: o Pope or (CCIO),, DMF (cat.) DCM, ta N, o Impas a o oo o 084 )— gno/A AAA Ha 8
TEA DCM, 0ºC to ta, N,, 66%
o HW o no AAA As AÇDAÇE | SO,CL, 9 eq. DCM, ta, N,, 30% o o x N oBn mMCPBA 10 eq. DO oBn o———> + AA DCM, rt, 48h, N2, 65% 2 ão OS RuCl, cat., NalO, 3 eq, | MeSO3H 10 eq. H;O:DCM:ACN (2:1:1), ta.1h, N2, 65% DCM, ta., 24h, N,, 80% o Do. oH
Y 2 o
1.1. cloreto de 3,3'-dissulfanodiildipropanoíla o Issa o
[00317] 1.2. ácido 3,3'-dissulfanodiildipropiônico (4 g, 0,019 mol, 1 eq.) foi suspenso em DCM anidroso (100 mL) e DMF anidroso (300 uL) foi adicionado, seguido por cloreto de oxalila (7,24 g, 0,057 mol, 3 eq.) a 0 ºC sob atmosfera inerte. A solução ficou mais clara. A mistura foi deixada por 3 h em temperatura ambiente até que clarificou e ne- nhuma formação de gás foi mais observada. O produto bruto foi eva- porado e mantido sob pressão reduzida por mais 30 min para remover os restos de cloreto de oxalila. Foi obtido um óleo amarelo (4,70 g, 100 %). O produto bruto foi usado sem purificação adicional; R.1 (em MeOH): 2,13; MS ES+ m/z: 206,86.
1.3. 6,6'-((3,3'-dissulfanodiilbis(propanoil))bis(azanodiil))di-hexano- ato de dibenzila o o gro ss A EO o o
[00318] 4-metilbenzenossulfonato de 6-(benzilóxi)-6-oxo-hexan- 1-amínio (12,20 g, 0,031 mol, 2,2 eq.) foi suspenso sob agitação vigo- rosa em DCM anidroso (75 mL) em um banho de gelo a 0 ºC sob at-
mosfera inerte. TEA (15,72 mL, 0,113, 8 eq.) foi adicionado à solução. Uma solução de cloreto de 3,3'-dissulfanodipropanoíla recém- preparado (3,88 g, 0,014 mol, 1 eq.) em DCM (25 mL) foi lentamente gotejada na solução mantida a O ºC. A agitação continuou por 24 ho- ras enquanto a solução foi deixada chegar à temperatura ambiente. Foi adicionada água (50 mL), e a mistura transferida para um funil de separação. A camada orgânica foi separada e lavada com salmoura (1xX100 mL) e depois lavada com HCI 1M (1xX100 mL), solução satura- da de sal de NaHCO; (2 x 100 mL) e salmoura (1 x 100 mL) novamen- te. As camadas aquosas combinadas foram extraídas com DCM (2 x 100 mL). As camadas orgânicas foram secadas com MgSO:, filtradas e evaporadas até a secura, proporcionando um sólido amarelo que foi triturado em MeOH para produzir 6,6'-((3,3'-dissulfanodiilbis(propa- noil))bis(azanodiil))di-hexanoato de dibenzila como um pó amarelo claro (6,0 g, 66 %). *H RMN (500 MHz, CDCI3), 5 7,35 (m, 10 H), 6,0 (s, 2H), 5,11 (s, 4 H), 3,25 (q, J = 5,9 Hz, 4 H), 3,00 (t, J = 7,0 Hz, 4 H), 2,55 (t, J = 7,10 Hz, 4 H), 2,36 (t, J = 7,30 Hz, 4 H), 1,66 (tdet., J= 8,10 Hz, 4 H), 1,52 (t de t., J = 8,10 Hz, 4 H), 1,35 (t de t, J = 8,52 Hz, 4H); *?9C RMN (500 MHz, CDCI3), 5 173,5 (2 -NH-C=O), 170,9 (-O- C=O), 136,0 (2 Cava: de ciclos aromáticos), 128,6 (2 H-Caromático), 128,3 (H-Caromático), 128,2 (2 H-Caromático), 66,2 (2 -CH2-O-), 39,4 (2 -CH2-N), 35,8 (2 -CH2-COO-), 34,3 (2 -CH2-S-), 34,1 (2 -CH2-CNO-), 29,1 (2C), 26,3 (2 C), 24,4 (2C); Rt1 (em MeOH): 2,50; MS ES+ M/Z: 617,00.
1.4. 6-(5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila Oo
OA Cl
[00319] 6,6'-((3,3'-dissulfanodiilbis(propanoil))bis(azanodiil))di- hexanoato de dibenzila (2,50 g, 4,05 mmol, 1 eq.) foi dissolvido em DCM anidroso (20,3 mL). SO2CI2 (pur. de 97 %, 2,96 mL, 0,036 mol, 9 eq.) foi adicionado gota a gota à solução, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 5 h sob atmosfera inerte. A solução cla- rificou e tornou-se amarelo pálido. Posteriormente, a solução foi lavada com água (2 x 100 mL) e salmoura (1 x 100 mL). As camadas aquosas combinadas foram extraídas com DCM (2 x 100 mL). As camadas or- gânicas foram secadas com MgSO;. e filtradas, depois concentradas sob pressão reduzida e purificadas usando uma coluna de cromatogra- fia. 6-(5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila (0,824 9, 29,9 %) foi obtido como um óleo amarelo claro juntamente com 6-(3- oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila. *H RMN (CDCI3), 5 7,35 (m, 5 H), 6,25 (s, 1 H), 5,11 (s, 2H), 3,72 (t, J = 7,34 Hz, 2H), 2,37 (t, J = 7,39 Hz, 2 H), 1,69 (m, 4 H), 1,38 (m, 2H); ºC RMN (500 MHz, CDCI3), à 173,2 (-O-C=O), 166,9 (-N-C=O), 145,6 (CI-HC = CH-), 136,0 (Cauat. de ciclo aromático), 128,6-128,3 (5 H-Caromático), 114,8 (Cl- HC = CH-), 66,2 (-CH2-O-), 43,5 (-CH2-N-), 34,0 (-CH2-C=O), 29,4, 25,9, 24,4; Rt1 (em ACN): 2,35; MS ES+ m/z: 339,84.
1.5. 6-(5-cloro-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila cl E o Cras,
O
[00320] 6-(5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila (802 g, 3,58 mmol) foi diluído em DCM anidroso (25 mL). É adicionado ácido 3-clorobenzoperoxoico (1,2 eq.). A solução foi agitada durante 48 h em temperatura ambiente sob atmosfera inerte. A solução foi en- tão diluída com DCM e tratada por Na2S2O;3 aq. 10 %. A fase orgânica foi então extraída sucessivamente por uma solução saturada de sal de NaHCO; (2 x 100 mL), seguida por salmoura (1 x 100 mL). As cama- das aquosas combinadas foram extraídas com DCM (2 x 100 mL). As camadas orgânicas foram secadas em MgSO:, filtradas, depois con- centradas sob pressão reduzida e purificadas usando uma coluna de cromatografia. Foi então obtido 6-(5-cloro-1-óxido-3-oxoisotiazol- 2(3H)-il)hexanoato de benzila (753 mg) como um óleo incolor.
1.6. 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila
EO
AXO Procedimento padrão para a oxidação de compostos de monocloreto:
[00321] 6-(5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila (1,11 g, 0,0036 mol, 1 eq.) foi diluído em DCM anidroso (7 mL). É adi- cionado ácido 3-clorobenzoperoxoico (2,69 g, 0,0109 mol, 3 eq.). À solução foi agitada durante 48 h em temperatura ambiente sob atmos- fera inerte. A solução foi então diluída com DCM e tratada por Na2S2O;3 aq. 10 %. A fase orgânica foi então extraída sucessivamente por uma solução saturada de sal de NaHCO; (2 x 100 mL), seguida por salmou- ra (1 x 100 mL). As camadas aquosas combinadas foram extraídas com DCM (2 x 100 mL). As camadas orgânicas foram secadas em MgSO:, filtradas, depois concentradas sob pressão reduzida e purifi- cadas usando uma coluna de cromatografia. 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3- oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila foi obtido como um óleo amarelo claro (0,760 g, 64,3 %). *H RMN (CDCI3), 5 7,36 (m, 5 H), 6,68 (s, 1 H), 5,11 (s, 2H), 3,67 (t, J = 7,68 Hz, 2 H), 2,37 (tl J =7,27 Hz, 2H), 1,78 (t de t, J =7,73 Hz, 2H), 1,70 (t det, J = 7,38 Hz, 2 H), 1,40 (m, 2H); 13C RMN (500 MHz, CDCI3), 5 173,2 (-O-C=O), 157,0 (-N-C=O), 144,6 (CI-HC = CH-), 136,0 (Cavar de ciclo aromático), 128,6-128,2 (H- Caromáticos), 123,6 (CI-HC = CH-), 66,2 (-CH2-O), 40,3 (-CH2-N-), 34,0 (- CH2-C=O), 27,9, 26,0, 24,2; Rt1 (em ACN): 2,49; MS ES+ M/Z: 371,83. Exemplo 1. Ácido 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) hexanoico CI o
CA d N oH
[00322] Ácido 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)he- xanoico foi obtido como um pó branco claro seguindo o procedimento padrão de desproteção de benzil ésteres a partir de 6-(5-cloro-1,1- dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila (0,445 9, 77 %). *H RMN (CDCI3), 5 10,89 (br. s, 1 H), 6,70 (s, 1 H), 3,70 (t, J = 7,43 Hz, 2 H), 2,38 (t, J = 7,38 Hz, 2 H), 1,81 (t de t., J = 7,60 Hz, 2H), 1,69 (t de t, J=7,71 Hz, 2H), 1,43 (t dividido de t, J = 7,75 Hz, J = 3,31 Hz, 2H); 13C RMN (500 MHz, CDCI3), 5 178,7 (O = C-O H), 157,1 (-N-C=O), 144,7 (CI-HC = CH-), 123,6 (CI-HC = CH-), 40,2 (-CH>N), 33,5 (-CH2-C=O), 27,9, 25,9, 23,9; Rt1 (em ACN): 1,98; MS ES+ m/z: 349,89.
1.7. 6-(4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila Oo
AE Cl
[00323] 6,6'-((3,3'-dissulfanodiilbis(propanoil))bis(azanodiil))di- hexanoato de dibenzila (3,21 g, 0,0052 mol, 1 eq.) foi dissolvido em DCM anidroso (26 mL). SO2CI2 (pur. de 97 %, 3,80 mL, 0,047 mol, 9 eq.) foi adicionado gota a gota à solução, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 24 h sob atmosfera inerte. A solução clarifi- cou e tornou-se amarelo pálido. Posteriormente, a mistura foi lavada com água (2 x 100 mL) e salmoura (1 x 100 mL). As camadas aquosas combinadas foram extraídas com DCM (2 x 100 mL). As camadas or- gânicas foram secadas com MgSO:; e filtradas, em seguida, concen- tradas sob pressão reduzida e purificadas usando uma coluna de cro- matografia. 6-(4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de ben- zila foi obtido como um óleo amarelo claro (1,391 g, 35,7 %). 1H RMN (CDCI3), 5 7,35 (m, 5 H), 5,11 (s, 2 H), 3,79 (t, J = 7,18 Hz, 2 H), 2,37 (t, J = 7,33 Hz, 2 H), 1,70 (m, 4 H), 1,38 (m, 2H); *?C RMN (500 MHz, CDCI3), 5 173,2 (-O-C=O), 161,9 (-N-C=O), 138(-CH2-O-),3 (CI-C-S-), 135,6 (Cauat. de ciclo aromático), 128,6-128,3 (5 H-Caromático), 115,1 (Cl- C-C=O), 66,2, 44,9 (-CH2-N-), 33,9 (-CH2-C=O), 29,1, 25,9, 24,3; Ru (em ACN): 2,50; MS ES+ m/z: 373,75.
1.8. 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila. o
FIA ce 5º Procedimento padrão para a oxidação de compostos diclorados:
[00324] Tricloreto de rutênio mono-hidratado (16 mg, 0,07 mmol, 0,013 eq.) foi adicionado em uma porção a uma solução agitada de 6- (4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)exanoato de benzila (1,94 9, 0,0052 mol, 1 eq.) em água: DOCM:ACN (2: 1: 1, 1 ml). Periodato de só- dio (3,33 g, 0,0156 mol, 3 eq.) foi então adicionado ao longo de 5 min, e a mistura resultante agitada em temperatura ambiente por 90 minu- tos sob atmosfera inerte. Os sólidos foram filtrados, e o filtrado foi dilu- ído com água (50 mL), extraído com EtOAc (2 x 100 mL), secado com MgSO:, filtrado e concentrado sob pressão reduzida. O sólido cinza obtido foi então purificado usando uma coluna de cromatografia e 6- (4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila foi obtido como um óleo amarelo pálido (0,930 g, 44,2 %). '*H RMN (CDCI3), 5 7,36 (m,5 H), 5,12 (s, 2H), 3,72 (t, J = 7,53 Hz, 2H), 2,73 (t, J = 7,50 Hz, 2 H), 1,80 (t de t J = 7,53 Hz, 2 H), 1,70 (t de t, J = 7,70 Hz), 1,41 (m, 2H); ??9C RMN (500 MHz, CDCI3), 5 173,1 (-O-C=O-), 154,1 (N- C=O), 138,0 (CI-C-SO>2-), 136,0 (Cauat. de ciclo aromático), 130,7 1 (CI-C- C=O), 128,6-128,3 (5 H-Caromático), 66,2 (-CH2-O-), 41,1 (-CH2-N-), 33,9 (- CH2-C=O), 27,9, 26,0, 24,2; Rt1 (em ACN): 2,59; MS ES+ m/z: 405,76. Exemplo 2. Ácido 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazo|-2(3H)- il)hexanoico Cl o d oH Procedimento padrão de desproteção de benzil ésteres:
[00325] —6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila (0,930 g, 2,23 mmol, 1 eq.) foi diluído em DCM anidroso (11,5 mL). Foi adicionado ácido metanossulfônico (1,5 mL, 0,023 mol, eq.). A solução foi agitada durante 24 horas em temperatura ambi- ente sob atmosfera inerte. A solução foi então diluída com DCM e tra- tada com água (50 mL). A camada orgânica foi extraída com água (2 x 100 mL) e depois com salmoura (1 x 100 mL). As camadas aquosas combinadas foram extraídas com DCM (2 x 100 mL). As camadas or- gânicas foram secadas em MgSO;. e concentradas sob pressão redu- zida, depois purificadas usando uma coluna de cromatografia. Ácido 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)Nexanoico foi ob- tido como um pó branco claro (0,563 g, 78 %). '*H RMN (500 MHz, CDCI3), 5 = 3,76 (t, J = 7,34 Hz, 2 H), 2,38 (t, J = 7,32 Hz, 2H), 1,83 (t de t, J = 7,65 Hz, 2 H), 1,70 (t de t, J = 7,77 Hz, 2H), 145 (tde t, J = 7,54 Hz, J = 3,31 Hz, 2H); **C RMN (500 MHz, CDCI3), 5 178,2(O = C- O H), 154,2 (N-C=O), 138,1 (CI-C-SO>z-), 130,9 (CI-C-C=O), 41,1 (- CH2-N-), 33,4 (-CH2-C=O), 27,9, 25,9, 23,9; Rt1 (em ACN): 2,09; MS ES+ m/z: 315,76.
1.9. 6-(4-bromo-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila FS 1, Bra, CCL, 75ºC à o
O BON
[00326] A uma solução de 6-(1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)he- xanoato de benzila (obtido seguindo o procedimento padrão para a oxidação de compostos de monoclioreto a partir de benzil 6-(3-0x0iso- tiazol- 2(3H)-il)hexanoato) (3 g, 8,89 mmol, 1,00 equiv) em CCla (40 mL) foi adicionado Br2 (1,2 mL, 19,58 mmol, 2,2 equiv) gota a gota com agitação em temperatura ambiente durante 30 min e agitado du- rante a noite a 75 ºC. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e diluída com CHCI3 (40 mL), a que se seguiu a adição de piridina (0,9 g). A solução resultante foi agitada durante 30 min em temperatura ambiente e então extinta pela adição de 50 ml de solução saturada de NaHCO;. A mistura resultante foi lavada com carbonato de sódio satu- rado (2 x 50 mL) e 50 mL de salmoura. A mistura resultante foi con- centrada sob vácuo, e o resíduo foi purificado por uma coluna de sílica gel com acetato de etila/éter de petróleo (1:5) para proporcionar 0,4 g (10,8 %) de 6-(4-bromo-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila como um óleo amarelo claro. LC-MS (ES, m/z): 416 [M+H]], 433[M+NH4] *; *H-RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) 5 7,42 - 7,28 (m, 2 H), 5,12 (s, 1 H), 3,69 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 2,38 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 1,86 - 1,64 (m, 2 H), 1,47 - 1,34 (m, 1H).
Exemplo 3. Ácido 6-(4-bromo-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoico o. o OBn OH qo HCl (con.) / Dioxano: TA FR ta. 2dias Fá Br Br
[00327] A uma solução de 6-(4-bromo-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol- 2(3H)-il)hexanoato de benzila (1 g, 2,40 mmol, 1,00 equiv) em dioxa- no (10 mL) foi adicionado HCI 4N (10 mL) gota a gota com agitação a O ºC. A solução resultante foi agitada durante 2 dias em temperatura ambiente. A mistura resultante foi concentrada sob vácuo e extraída com diclorometano (3 x 50 mL). A camada orgânica combinada foi la- vada com salmoura (2 x 100 mL), secada em sulfato de sódio anidroso e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por meio de uma coluna de sílica gel com DCM/MeOH (10: 1) para proporcionar 100 mg (13 %) de ácido 6-(4-bromo-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)he- xanoico como um sólido branco. LC-MS (ES, m/z): 308[M+NH,] *, 326/328[M+H]*; *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 7,58 (s, 1 H), 3,75
(t, J=7,4 Hz, 2H), 2,41 (t, J= 7,4 Hz, 2 H), 1,78 (da, J = 34,6, 7,4 Hz, 4 H), 1,47 (t, J=7,7 Hz, 2H). Exemplo de uma via sintética para a síntese de um ligante com X1=OR: o
LR er, a o OBn o | Base
ROH RA so o CN) Oxidação Desproteção RA Ro o Co,
1.10. 6-(5-(4-cianofenóxi)-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila N= dg o Cias, Oo
[00328] A solução de 4-hidroxibenzenocarbonitrila (76 mg, 0639 mmol) em THF (2 mL) foi adicionado a O ºC a uma mistura de NaH (0,639 mmol) em THF (2 mL). Após 30 minutos sob agitação, foi adici- onado 6-(5-cloro-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de ben- zila (250 mg, 0,703 mmol) em THF (2 mL). A mistura de reação foi en- tão agitada em temperatura ambiente durante 18 h. A mistura de rea- ção foi diluída com AcOEt e NHaCI (10 % aquoso) foi adicionado. À fase orgânica foi então lavada com salmoura e secada em MgSO:, fil- trada e concentrada. O produto em bruto foi purificado em coluna de sílica gel usando uma mistura de DOCM/MeOH (80/20) para proporcio-
nar 6-(5-(4-cianofenóxi)-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila (210 mg, 75 % de rendimento) como um óleo incolor. LC- MS (ES, m/z): 439,0 [M+H]+; *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 7,79 (m, 2 H), 7,35 (m, 7 H), 5,59 (s, 1 H), 5,12 (s, 2 H), 3,69 (m, 2 H), 2,37 (m, 2 H), 1,71 (m, 4 H), 1,39 (m, 2H).
1.11. 6-(5-(4-cianofenóxi)-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexa- noato de benzila Ci oa, o
[00329] “Obtido como um óleo incolor seguindo o procedimento pa- drão para a oxidação de compostos de mono-cloreto (136 mg, 48 % de rendimento) a partir de 6-(5-(4-cianofenóxi)-1-óxido-3-oxoisotiazol- 2(3H)-il)hexanoato de benzila. LC-MS (ES, m/z): 455,0 [M+H]+; *H- RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 7,82 (m, 2 H), 7,40 (m, 2 H), 7,35 (m, H), 5,63 (s, 1 H), 5,12 (s, 2 H), 3,65 (m, 2 H), 2,38 (m, 2 H), 1,79 (m, 2H), 1,70 (m, 2 H), 1,41 (m, 2H). Exemplo 4. Ácido 6-(5-(4-cianofenóxi)-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol- 2(3H)-il)hexanoico Dt Fio, o
[00330] Obtido como um sólido branco seguindo o procedimento padrão para desproteção de benzil ésteres (38 mg, rendimento de 35 %) a partir de 6-(5-(4-cianofenóxi)-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoato de benzila. LC-MS (ES, m/z): 365,0 [M+H]+; *H-MR (300 MHz, Clorofórmio-d) 7,82 (m, 2 H), 7,41 (m, 2 H), 5,65 (s, 1 H), 3,67 (m, 2 H), 2,38 (m, 2 H), 1,80 (m, 2 H), 1,69 (m, 2 H), 1,44 (m, 2H).
1.12. 6-(5-metóxi-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de ben- zila
H3C-O Lo o Cias,
O
[00331] Uma mistura de 6-(5-cloro-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoato de benzila (270 mg, 0,759 mmol) em metanol (5 mL) e trietilamina (113 ul, 0,835 mmol) foi agitada em temperatura ambiente durante 18 h. Os voláteis foram então removidos sob vácuo, e o resí- duo purificado sobre uma coluna de sílica ciclo-hexano/AcOEt (1/1) para proporcionar 6-(5-metóxi-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexa- noato de benzila (107 mg, 40 %) como um óleo amarelo. LC-MS (ES, m/z): 352,0 [M+H]+; *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 7,36 (m, 5H), 5,57 (s, 1 H), 5,11 (s, 2 H), 4,04 (s, 3 H), 3,60 (m, 2 H), 2,37 (m, 2H), 1,75 (m, 2 H), 1,69 (m, 2 H), 1,39 (m, 2H).
1.13. 6-(5-metóxi-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila Ha Fo o Á 1 Cos, Oo
[00332] “Obtido como um sólido branco seguindo o procedimento padrão para a oxidação de compostos de mono-cloreto (62 mg, 36 % de rendimento) a partir de 6-(5-metóxi-1-óxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoato de benzila. LC-MS (ES, m/z): 368,0 [M+H]+; *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 7,36 (m, 5 H), 5,57 (s, 1 H), 5,11 (s, 2H), 4,04 (s, 3 H), 3,60 (m, 2 H), 2,37 (m, 2 H), 1,75 (m, 2 H), 1,69 (m, 2H), 1,39 (m, 2H). Exemplo 5. Ácido 6-(5-metóxi-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoico HáC-O Ro o Cio, o
[00333] Obtido como um sólido branco seguindo o procedimento padrão para desproteção de benzil ésteres (37 mg, 67 % de rendimen- to) a partir de 6-(5-metóxi-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexa- noato de benzila. HRMS (ES, m/z): [M+H] encontrado 278,0691 para 278,0698 calculado; *H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) 5 5,60 (s, 1 H), 4,05 (s, 3 H), 3,62 (m, 2 H), 2,36 (m, 2 H), 1,77 (m, 2 H), 1,68 (m, 2H), 1,42 (m, 2H).
1.14. 4-(aminometil)ciclo-hexano-1-carboxilato 4-metilbenzenossul- fonato de benzila RN or HoN LIS * OO o
[00334] Uma mistura de ácido 4-(aminometil)ciclo-hexanocarbo- xílico (10 g, 63,61 mmol, 1 eg), fenilmetanol (55,03 g, 508,87 mmol, 52,91 mL, 8 eg) e TSOH.H2O (12,70 g, 66,79 mmol, 1,05 eg) em tolue- no (50 mL) foi agitada a 140 ºC durante 16 horas usando um aparelho Dean e Stark para coletar a água de condensação e do mono-hidrato de ácido toluenossulfônico. A reação tornou-se clara após refluxo du- rante várias horas. A mistura de reação límpida foi vertida em TBME (500 mL), e o sólido branco resultante removido por filtração, lavado com TBME (200 mL) e secado em vácuo. Benzil 4-(aminometil)ciclo- hexanocarboxilato; Ácido 4-metilbenzenossulfônico (26,6 g, 63,40 mmol, 99,68 % de rendimento) foi obtido como um sólido branco; *H RMN (400 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 7,71 (d, J = 8,16 Hz, 2H) 7,28 - 7,40 (m, 5 H) 7,23 (d, J = 7,94 Hz, 2 H) 5,11 (s, 2 H) 2,77 (d, J = 7,06 Hz, 2 H) 2,29 - 2,39 (m, 4 H) 1,99 - 2,08 (m, 2 H) 1,85 (br d, J = 11,25 Hz, 2 H) 1,53 - 1,65 (m, 1 H) 1,43 (qd, J = 12,97, 3,20 Hz, 2 H) 1,06 (qd, J = 12,75, 3,20 Hz, 2H).
1.15. 4,4'-(((3,3'-dissulfanodiilbis(propanoil))bis(azanodiil))bis (me- tileno))bis(ciclo-hexano-1-carboxilato) de dibenzila o o SO so LIT Oo
[00335] A uma solução de ácido 3-(2-carboxietildissulfanil) pro- panoico (6,64 g, 31,58 mmol, 1 eq), HOBt (9,39 g, 69,48 mmol, 2,2 eq) e TEA (12,78 g, 126,33 mmol, 17,58 mL, 4 eq) em DCM (300 mL) foi adicionado EDCI (13,32 g, 69,48 mmol, 2,2 eq) a 0ºC. Em seguida, 4-(aminometil)ciclo-hexanocarboxilato de benzila; ácido 4-metil- benzenossulfônico (26,5 g, 63,17 mmol, 2 eg) foi adicionado a esta temperatura. A mistura foi agitada a 0-20 ºC durante 4 horas. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, Rk = 0,5) indicou que a reação foi concluída. A mistura foi vertida em NaHCO;3 (100 mL) e H2O (100 mL), e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com DCM (200 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lava- das com H2O (100 mL), salmoura (100 mL), secadas em Na>2SO:, fil- tradas e concentradas em vácuo. O resíduo foi dissolvido em DCM (50 mL), adicionado éter de petróleo muito lentamente até o precipitado branco ser formado. Filtrado e lavado com éter de petróleo, secado sob vácuo. 4-[[3-[[3-[(4-benziloxicarbonilciclo-hexil)metilamino]-3- oxo-propil]dissulfanil]propanoilamino]metil]ciclo-hexanocarboxi- lato de benzila (19 g, 28,40 mmol, 89,94 % de rendimento) foi obtido como um sólido branco; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,27 - 7,41 (m,10 H) 6,05 (br s, 2 H) 5,11 (d, J = 1,54 Hz, 4 H) 3,10 - 3,17 (m, 4 H) 2,96 - 3,02 (m, 4 H) 2,54 - 2,63 (m, 4 H) 2,30 (td, J = 12,24, 1,76 Hz, 2 H) 2,04 (br d, J = 12,57 Hz, 4 H) 1,85 (br d, J = 12,79 Hz, 4 H) 1,38 - 1,54 (m, 6 H) 0,99 (q, J = 12,72 Hz, 4 H).
1.16. 4-((5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) metil)ciclo-hexano-1-carbo- xilato de benzila o o
117. 4-((4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) metil)ciclo-hexano-1- carboxilato de benzila & o
[00336] A uma solução de 4-[[3-[[3-[(4-benziloxicarbonilciclo-he- xil)metilamino]-3-oxo-propil]dissulfanil]propanoilamino]metil] ci- clo-hexanocarboxilato de benzila (10 g, 14,95 mmol, 1 eq) em DCM (100 mL) foi adicionado gota a gota cloreto de sulfurila (10,09 g, 74,75 mmol, 7,47 mL, 5 eq) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-20 ºC durante 12 horas. A solução límpida foi obtida após a adição do cloreto de sul- furila. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, Rf. (Principal) = 0,5) indicou que a reação foi concluída. A mistura foi vertida em H2O (30 mL) e extraída com DCM (50 mL * 2). As camadas orgânicas com- binadas foram lavadas com H2O (50 mL), salmoura (50 mL), secadas em Na>2SO:, filtradas e concentradas em vácuo. A purificação em colu- na de sílica gel proporcionou 4-[(3-oxoisotiazol-2-il) metil]ciclo-hexa- nocarboxilato de benzila (2,1 g, 3,42 mmol, 11,44 % de rendimento, 54 % de pureza) obtido como um sólido marrom, 4-[(5- cloro-3-0x0- isotiazol-2-il) metil]ciclo-hexanocarboxilato de benzila (7,1 g, 18,82 mmol, 62,96 % de rendimento, 97 % de pureza) obtido como um sólido esbranquiçado e 4-[(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazol-2-il)metil]ciclo- hexanocarboxilato de benzila (0,4 g, 869,31 umol, 2,91 % de rendi- mento, 87 % de pureza) obtido como um óleo marrom.
1.18. 4-((5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) metil)ciclo-he- xano-1-carboxilato de benzila da o o
FT TO
N o
[00337] A uma mistura de 4-[(5-cloro-3-oxo-isotiazol-2-il)metil] ciclo-hexanocarboxilato de benzila (2 g, 5,01 mmol, 1 eq) em HO (20 mL), ACN (10 mL) e DCM (10 mL) foram adicionados RuCl3.H2O0 (22,58 mg, 100,14 umol, 0,02 eq) e NalO. (6,43 g, 30,04 mmol, 1,66 mL, 6 eq) em uma porção a O ºC sob N>. A mistura foi então aquecida a 20 ºC e agitada durante 16 horas. A TLC mostrou que a reação es- tava completa (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, RE-p1 = 0,6) À mistura foi filtrada, o filtrado foi concentrado por fluxo de nitrogênio, e o sólido que apareceu novamente foi filtrado, o filtrado foi concentrado por nitrogênio. O resíduo foi purificado por TLC preparativa (altura da coluna: 250 mm, diâmetro: 100 mm, sílica gel de malha 100-200, éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1) para proporcionar 4-[(5-cloro- 1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il) metil]ciclo-hexanocarboxilato de benzila (1,4 g, 3,17 mmol, 63,25 % de rendimento, 90 % de pureza) como um sólido branco. Exemplo 6. Ácido 4-((5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) metil)ciclo-hexano-1-carboxílico c E A, Cho
OH
[00338] A uma mistura de 4-[(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazo|-2-il) metil]ciclo-hexanocarboxilato de benzila (0,1 g, 226,20 umol, 1 eq) em DCM (5 mL) foi adicionado MsSOH (217,39 mg, 2,26 mmol, 161,03 uL, 10 eq) em uma porção a 30 ºC sob N>. A mistura foi agitada a 30 ºC durante 16 horas. A TLC mostrou que a reação estava completa. LCMS (ET17992-54-P1A) mostrou a MS desejada detectada. A mistu- ra foi vertida em água gelada (5 mL) e agitada durante 5 min. A fase aquosa foi extraída com DCM (3 mL * 2). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (3 mL), secada com Na2SO;. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por TLC preparativa (altura da coluna: 250 mm, diâmetro: 100 mm, sílica gel de malha 100- 200, éter de petróleo:/acetato de etila = 2: 1) para fornecer Ácido 4-[(5- cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il )]metil|ciclo-hexanocarboxílico (0,02 g, 64,99 umol, rendimento de 28,73 %) como um óleo incolor; LC-MS (ES, m/z): 306,0 [M-H]-; *H-RMN (300 MHz, DMSO-D6) 5 12,01 (bs, 1 H), 7,62 (s, 1 H), 3,45 (m, 2 H), 2,11 (m, 1 H), 1,90 (m, 2 H), 1,76 (m, 2 H), 1,73 (m, 1 H), 1,23 (m, 2 H), 0,96 (m, 2H).
119 4-((4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)metil)ciclo- hexano-1-carboxilato de benzila cd o o
ALTO TO o
[00339] A uma mistura de 4-[(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazol|-2-il) me- till]ciclo-hexanocarboxilato de benzila (1,2 g, 2,70 mmol, 1 eq) em H2O (20 mL), DOM (10 mL) e ACN (10 mL) foram adicionados RuCl3.H20 (12,16 mg, 53,96 umol, 0,02 eq) e NalO. (3,46 g, 16,19 mmol, 896,96 uL, 6 eq) em uma porção a O ºC sob N>2. A mistura foi agitada a 20 ºC durante 2 horas. A TLC mostrou que a reação estava completa (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, RE-p1 = 0,7). A mis- tura foi vertida em água gelada (30 mL) e agitada durante 5 min. A fa- se aquosa foi extraída com acetato de etila (20 mL * 2). As fases orgâ- nicas combinadas foram lavadas com salmoura (20 mL), secadas com Na2SOa. anidroso, filtradas e concentradas em vácuo. O resíduo foi pu- rificado por cromatografia em sílica gel (altura da coluna: 250 mm, di- âmetro: 100 mm, sílica gel de malha 100-200, éter de petróleo: acetato de etila = 5: 1 a 3: 1) para proporcionar 4-[(4, 5-dicloro-1,1,3-trioxo- isotiazol-2-il) metil]ciclo-hexanocarboxilato de benzila (0,8 9, 1,67 mmol, 61,73 % de rendimento, 90 % de pureza) como um sólido bran- Co. Exemplo 7. Ácido 4-((4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazo|-2(3H)- il)metil)ciclo-hexano-1-carboxílico 2 eo OH
[00340] A uma mistura de 4-[(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol|-2- il)metil|ciclo-hexanocarboxilato de benzila (0,8 g, 1,67 mmol, 1 eq) em DCM (20 mL) foi adicionado MsOH (1,60 g, 16,65 mmol, 1,19 mL, eq) em uma porção a 30 ºC sob N>. A mistura foi agitada a 30 ºC durante 16 horas. LCMS mostrou que a reação foi concluída. A mistura foi vertida em água gelada (5 mL) e concentrada sob pressão reduzi- da, em seguida, apareceu um sólido. A solução foi filtrada e triturada por EtOAc (2 mL * 3), e a massa filtrante foi secada em vácuo para proporcionar ácido 4-[(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazo|-2-il)metil] ciclo-hexanocarboxílico (0,170 g, 486,86 umol, 29,23 % de rendi- mento, 98 % de pureza) como um sólido branco; LC-MS (ES, m/z): 364,0 [M+Na]* ; *H-RMN (300 MHz, DMSO-D6) 5 11,99 (bs, 1 H), 3,49 (m, 2 H), 2,11 (m, 1 H), 1,88 (m, 2 H), 1,79 (m, 2 H), 1,66 (m, 1 H), 1,23 (m, 2 H), 0,96 (m, 2H).
1.20 3,3'-(((3,3'-dissulfanodiilbis(propanoil))bis(azanodiil))bis(4,1- fenileno))dipropionato de dibenzila o nu fo] Sem
IA BnoO. O Oo
[00341] A uma solução de ácido 3-(2-carboxietildissulfanil) pro- panoico (651,56 mg, 3,10 mmol, 1 eq), HOBt (921,15 mg, 6,82 mmol, 2,2 eq) e TEA (1,25 g, 12,39 mmol, 1,73 mL, 4 eq) em DCM (50 mL) foi adicionado EDCI (1,31 g, 6,82 mmol, 2,2 eq) a 0 ºC. Depois, 4-(amino- metil)ciclo-hexanocarboxilato de benzila; Ácido 4-metilbenze- nossulfônico (2,6 g, 6,20 mmol, 2 eq) foi adicionado a esta tempera- tura. A mistura foi agitada a 0-20 ºC durante 12 horas. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, R$ = 0,5) indicou que a reação foi con- cluída. A mistura foi vertida em NaHCO; (20 mL) e HO (2O mL), e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com DCM (50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com H2O (50 mL), salmoura (50 mL), secadas em Na>2SO;, filtradas e con- centradas em vácuo. 4-[[3-[[3-[(4-benziloxicarbonilciclo-hexil)meti- lamino]-3-oxo-propil]dissulfanil]propanoilamino] metillciclo-hexa- nocarboxilato de benzila (1,1 g, 1,684 mmol, 53,07 % de rendimento) foi obtido como um sólido branco; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓR- MIO-d) 5 ppm 7,28 - 7,41 (m, 10 H) 5,96 (br s, 2 H) 5,10 (s, 4 H) 3,13 (t, J = 6,39 Hz, 4 H) 2,98 (t, J = 6,84 Hz, 4 H) 2,57 (t, J = 6,95 Hz, 4 H) 2,23 - 2,34 (m, 2 H) 2,03 (br d, J = 12,79 Hz, 4 H) 1,84 (br d, J = 12,13 Hz, 4 H) 1,37 - 1,63 (m, 6 H) 0,91 - 1,05 (m, 4 H).
1.21. 3-(4-(5-cloro-3-ox0oisotiazol-2(3H)-il)fenil)Dropanoato de benzi- la hs
QRO Oo OBn
[00342] A uma solução de 3-[4-[3-[[3-[4-(3-benzilóxi-3-oxo-propil) anilino]-3-oxo-propil]dissulfanil]propanoilamino]fenil]propanoato de benzila (10 9, 14,60 mmol, 1 eq) em DCM (200 mL) foi adicionado cloreto de sulfurila (5,91 g, 43,80 mmol, 4,38 mL, 3 eq) gota a gota a ºC sob N>. A solução foi agitada a 25 ºC durante 8 horas. A cor da solução mudou de incolor para preto quando o cloreto de sulfurila foi adicionado e depois mudou para amarelo após 1 hora. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, Rf = 0,60) mostrou que o material de partida foi consumido e dois novos pontos principais foram gerados. O resíduo foi vertido em água gelada (200 ml) e depois concentrado em vácuo para remover DCM. Após concentração, a fase aquosa foi extra- ída com acetato de etila (200 mL * 3) e, em seguida, a fase orgânica combinada foi lavada com água (200 mL * 1), secada com Na2SO, anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (SiO>, éter de petróleo: acetato de etila = 5: 1 a 1:1) para obter 3-[4-(3-oxoisotiazol-2-il)fenil]propanoato de benzi- la (2,5 g, 7,37 mmol, 50,47 % de rendimento) *H RMN (400 MHz, ME- TANOL-d4) 5 = 8,56 (d, J = 6,2 Hz, 1 H), 7,44 - 7,39 (m, 2 H), 7,37 - 7,26 (m, 7 H), 6,30 (d, J = 6,4 Hz, 1 H), 5,09 (s, 2 H), 2,98 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 2,78 - 2,66 (m, 2H); e 3-[4-(5-cloro-3-ox0o-isotiazol|-2-il) fe- nil]propanoato de benzila (5 g, 13,37 mmol, 91,60 % de rendimento) como um sólido amarelo; *H RMN (ET17992-22-P2A) confirmou ET17992-22-P2. *H RMN (400 MHz, METANOL-d4) à = 7,42 - 7,36 (m, 2H), 7,35 - 7,25 (m, 7 H), 6,49 - 6,45 (m, 1 H), 5,08 (s, 2 H), 2,99 - 2,91 (m, 2 H), 2,69 (t, J = 7,5 Hz, 2H).
1.22. —3-(4-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)fenil)propa- noato de benzila cl Ro
RO Oo OBn
[00343] A uma mistura de 3-[4-(5-cloro-3-oxo-isotiazol|-2-il)fenil] propanoato de benzila (1,4 g, 3,74 mmol, 1 eq) em H2O (12 mL), DCM (6 mL) e ACN (6 mL) foi adicionado NalOa. (4,81 g, 22,47 mmol, 1,25 mL, 6 eq) em uma porção a 25 ºC e, em seguida, a mistura foi purgada com N, três vezes. Em seguida, RuCl3.H2O (42,21 mg, 187,24 umol, 0,05 eq) foi adicionado sob N2. A mistura foi agitada a 25 ºC du- rante 12 horas. A mistura ficou turva, e a cor tornou-se cinza. O resí- duo foi vertido em acetato de etila (100 ml) e depois filtrado. O filtrado foi concentrado em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (SiO,, éter de petróleo: acetato de etila = 10: 1 a 4: 1) para produzir 3- [4-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)fenil]propanoato de benzila (460 mg, 1,08 mmol, 28,75 % de rendimento, 95 % de pureza) como um sólido amarelo; '"H RMN (ET17992-63-P1A) confirmou ET17992-63-P1. *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 = 7,41 - 7,30 (m, 7 H), 6,84 (s, 1 H), 5,13 (s, 2 H), 3,04 (t, J = 7,6 Hz, 2 H), 2,72 (t, J=7,7 Hz, 2H). Exemplo 8. Ácido 3-(4-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) fenil)propanoico o Cc ELI" “AU
[00344] A solução de 3-[4-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol|-2-il)fenil] propanoato de benzila (460 mg, 1,13 mmol, 1 eq) em DCM (15 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (1,09 g, 11,33 mmol, 806,87 uL, eq) gota a gota a 10 ºC. Em seguida, a solução foi aquecida a 35 ºC e agitada durante 12 horas. O resíduo foi lavado com água (15 mL * 3), secado com Na2SO,. anidroso, filtrado e concentrado em vácuo. O resíduo foi vertido em água (20 ml) e depois filtrado. A massa filtrante foi dissolvida em DCM (5 ml) e, em seguida, éter de petróleo (30 ml) foi vertido no resíduo, a solução foi agitada a 10 ºC durante 2 min e, em seguida, filtrada, a massa filtrante foi secada em vácuo para pro- duzir ácido 3-[4-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)fenil]propanoico (162 mg, 501,81 umol, 44,27 % de rendimento, 97,8 % de pureza) co- mo um sólido branco; LC-MS (ES, m/z): 313,9 [M-H]-; *H-RMN (300 MHz, DMSO-D6) 5 12,18 (bs, 1 H), 7,81 (s, 1 H), 7,45 (m, 2 H), 7,37 (m, 2 H), 2,89 (m, 2 H), 2,58 (m, 2H).
1.23. 3-(4-(4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)fenil)Dropanoato de benzila
Cs
RO DS OBn
[00345] A uma mistura de 4-[(3-oxoisotiazol-2-il)metil]ciclo- hexanocarboxilato de benzila (1,2 9, 3,32 mmol, 1 eq) em H2O (20 mL), ACN (10 mL) e DCM (10 mL) foram adicionados RuCl3.H2O0 (14,95 mg, 66,33 umol, 0,02 eq) e NalO. (4,26 g, 19,90 mmol, 1,10 mL, 6 eq) em uma porção a O ºC sob N>. A mistura foi então aquecida a 20 ºC e agitada durante 16 horas. A mistura foi filtrada, e o filtrado foi concentrado por fluxo de nitrogênio, e um sólido apareceu novamente e filtrado, o filtrado foi concentrado por nitrogênio. O resíduo foi purifi- cado por TLC prep. (altura da coluna: 250 mm, diâmetro: 100 mm, síli- ca gel de malha 100-200, éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1) para obter 4-[(1,1,3-trioxoisotiazol-2-il) metil]ciclo-hexanocarboxilato de benzila (0,45 9, 1,11 mmol, 33,60 % de rendimento, 90 % de pureza) como um óleo incolor; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 = 7,53 (dd, J = 3,2, 8,7 Hz, 2 H), 7,17 (ddd, J = 3,2, 7,6, 9,0 Hz, 2 H), 6,97 - 6,89 (m, 2 H), 5,56 (br s, 1 H), 4,12 - 4,06 (m, 4 H), 3,92 (s, 5H), 3,55 (q, J= 5,1 Hz, 5H).
1.24. 3-(4-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)fenil)pro- panoato de benzila Cc! o LR Ore o OBn
[00346] A uma mistura de 3-[4-(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazol-2- i)fenil]propanoato de benzila (650 mg, 1,59 mmol, 1 eq) e NalO. (1,36 g, 6,37 mmol, 352,86 uL, 4 eq) em H2O (10 mL), DOM (5 mL), ACN (5 mL) foram adicionados RuCl3.H2O (7,18 mg, 31,84 umol, 0,02 eq) em uma porção a 0 ºC sob N>. A mistura foi agitada a 20 ºC duran- te 2 horas. O resíduo foi extraído com acetato de etila (80 mL * 2) A fase orgânica combinada foi secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (SiO>, Éter de petróleo: Acetato de etila = 30:1 a 5:1) para pro- duzir 3-[4-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)fenilJpropanoato de benzila (180 mg, 25,68 % de rendimento) como um sólido amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 = 7,43 - 7,29 (m, 9 H), 5,13 (s, 2 H), 3,05 (t, J = 7,6 Hz, 2 H), 2,73 (t, J = 7,6 Hz, 2H). Exemplo 9. Ácido 3-(4-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H) -“il)fenil)propanoico o
SLI
A co
[00347] A solução de 3-[4-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol|-2-il)- fenil]propanoato de benzila (180 mg, 408,81 umol, 1 eq) em DCM (5 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (392,89 mg, 4,09 mmol, 291,03 uL, 10 eq) gota a gota a 10 ºC. A solução foi agitada a 35 ºC durante 12 horas. O resíduo foi vertido em água (5 ml) e depois filtra- do. A massa filtrante foi lavada com água (10 ml * 3) e depois secada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano: metanol (5,5 ml, v/v = 10: 1) e, em seguida, purificado por TLC prep. (acetato de etila, Rf = 0,26) para produzir ácido 3-[4-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol- 2-il)fenil]propanoico (57,64 mg, 156,83 umol, 38,36 % de rendimen- to, 95,278 % de pureza) como um sólido branco; LC-MS (ES, m/z): 347,9 [M-H]-; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 12,22 (br s, 1 H), 7,51 - 7,40 (m, 4 H), 2,90 (brt, J = 7,6 Hz, 2 H), 2,60 (brt, J = 7,6 Hz, 2H).
1.25. 4,4'-((3,3'-dissulfanodiilbis(propanoil))bis(azanodiil)) dibenzo- ato de dibenzila o " o [SI
LO IA BnO. O
O
[00348] A uma solução de ácido 3-(2-carboxietildissulfanil) pro- panoico (6,01 g, 28,60 mmol, 1 eq) e piridina (14,93 g, 188,77 mmol, 15,24 mL, 6,6 eq) em DMF (120 mL) foram adicionados EDCI (12,06 9, 62,92 mmol, 2,2 eq) e 4-aminobenzoato de benzila (13 g, 57,20 mmol, 2 eq) a 10 ºC. Em seguida, a mistura foi agitada a 50 “ºC durante 12 horas. O resíduo foi vertido em água gelada (200 mL) e agitado duran- te 20 min. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (200 mL * 3). A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl (200 mL * 3), secada com Na2SOa. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. Em seguida, o resíduo foi recristalizado de éter de petróleo: DOM = 50: 1 para obter o sólido. O sólido foi lavado com petróleo três vezes (150 ml * 3) e, em seguida, secado em vácuo para produzir 4-[3-[[3-(4-benziloxicarbonila- nilino)-3-oxo-propil]dissulfanil]Jpropanoilamino]benzoato de benzila (14 g, bruto) como um sólido branco; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 10,37 (s, 2 H), 8,02 - 7,83 (m, 4 H), 7,72 (d, J = 8,8 Hz, 4 H), 7,48 - 7,32 (m, 10 H), 5,31 (s, 4 H), 3,05 - 2,98 (m, 4 H), 2,81 - 2,75 (m, 4 h).
1.26. 4-(5-cloro-3-ox0oisotiazol-2(3H)-il)benzoato de benzila o
O O co A,
1.27. 4-(4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)benzoato de benzila o O“ O
AX Oo
[00349] A uma solução de 4-[3-[[3-(4-benziloxicarbonilanilino)-3- oxo-propil]dissulfanil]propanoilamino]benzoato de benzila (9,4 9, 14,95 mmol, 1 eq) em DCM (120 mL) foi adicionado gota a gota cloreto de sulfurila (10,09 g, 74,75 mmol, 7,47 mL, 5 eq) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-20 ºC durante 12 horas. A mistura tornou-se límpida após agitação durante vários minutos. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1) indicou que a reação foi concluída. A mistura foi vertida em H2O (200 mL), extraída com DCM (200 mL * 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com H2O (200 mL * 2), secadas em Na>2SOs,, filtradas e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (éter de petróleo: acetato de etila = 5: 1 a 1: 1) para produzir 4-(3-oxoisotiazo|-2-il) benzoato de benzila (1,2 g, 3,43 mmol, rendimento de 11,47 % , 89 % de pureza) foi obtido como um sólido esbranquiçado; *H RMN (400 MHz, CLO- ROFÓRMIO-d) 5 ppm 8,09 - 8,27 (m, 3 H) 7,63 - 7,82 (m, 2 H) 7,32 - 7,52 (m, 5 H) 6,34 (br d, J = 6,36 Hz, 1 H) 5,39 (s, 2 H); 4-(5-cloro-3- oxo-isotiazol-2-il)Denzoato de benzila (3,5 g, 10,01 mmol, 33,49 % de rendimento, 98,92 % de pureza) foi obtido como um sólido esbran- quiçado; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 8,15 (d, J = 8,60 Hz, 2 H) 7,69 (d, J = 8,82 Hz, 2 H) 7,33 - 7,49 (m, 4 H) 6,38 (s, 1 H) 5,38 (s, 2 H) e 4-(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazol-2-il)Denzoato de benzila (2,8 g, 7,19 mmol, 24,06 % de rendimento, 97,68 % de pure- za) foi obtido como um sólido esbranquiçado; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 8,18 (d, J = 8,60 Hz, 2 H) 7,71 (d, J = 8,60 Hz, 2 H) 7,33 - 7,50 (m, 4 H) 5,39 (s, 2H).
1.28. 4-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)benzoato de benzi- la o e *
AR o
[00350] A uma mistura de 4-(5-cloro-3-oxo-isotiazol-2-il)Denzoato de benzila (1 g, 2,89 mmol, 1 eq) em H2O (10 mL) , ACN (5 mL) e DCM (5 mL) foram adicionados RuCl3.H2O (13,04 mg, 57,84 umol,
0,02 eq) e NalO. (2,47 g, 11,57 mmol, 640,97 uL, 4 eq) em uma por- ção a 0 ºC sob N>. A mistura foi então aquecida a 20 ºC e agitada du- rante 2 horas. O resíduo foi filtrado, e o filtrado foi vertido em água (40 ml). A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (50 mL * 1). A fase orgânica foi lavada com NaCl (30 mL * 3), secada com Na2SO. anidro- so, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cro- matografia de coluna (SiO,, éter de petróleo: acetato de etila = 15: 1 a 5: 1) para fornecer 4-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)benzoato de benzila (500 mg, 1,32 mmol, 45,77 % de rendimento) como um óleo amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) ô = 8,27 - 8,21 (m, 2 H), 7,61 - 7,55 (m, 2 H), 7,49 - 7,34 (m, 5 H), 6,87 (s, 1 H), 5,40 (s, 2H).
Exemplo 10. Ácido 4-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) benzoico o cr EST * “A
[00351] A solução de 4-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)Denzo- ato de benzila (450 mg, 1,19 mmol, 1 eq) em DCM (20 mL) foi adicio- nado ácido metanossulfônico (1,14 g, 11,91 mmol, 847,94 uL, 10 eq) gota a gota a 10 ºC. A solução foi agitada a 35 ºC durante 10 horas. O resíduo foi concentrado em vácuo para remover DCM. Em seguida, o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (10 mL), e a fase orgânica foi lavada com água (20 mL * 5), secada com Na2SO,. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em metanol (3 ml) e, em seguida, éter de petróleo (30 ml) foi vertido no resíduo, a solução foi agitada a 10 ºC durante 2 min e, em seguida, filtrada, a massa fil- trante foi secada em vácuo para produzir ácido 4-(5-cloro-1,1,3- trioxo-isotiazol-2-il)benzoico (112,56 mg, 379,48 umol, 31,86 % de rendimento, 96,986 % de pureza) como um sólido branco; LC-MS (ES,
m/z): 285,9 [M-H]-; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 13,33 (br s, 1 H), 8,17 - 8,11 (m, 2 H), 7,87 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 7,67 - 7,61 (m, 2H).
1.29. 4-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)Denzoato de benzila o oo aa. S-
A cl o
[00352] A uma mistura de 4-(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazol-2-il)ben- zoato de benzila (1 g, 2,63 mmol, 1 eq) em H2O (10 mL), ACN (5 mL) e DCM (5 mL) foram adicionados RuCl3.H2O (11,86 mg, 52,60 umol, 0,02 eq) e NalO. (2,25 g, 10,52 mmol, 582,91 uL, 4 eq) em uma por- ção a 0 ºC sob N>. A mistura foi então aquecida a 20 ºC e agitada du- rante 2 horas. O resíduo foi filtrado, e o filtrado foi concentrado em vá- cuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (SiO,, éter de petróleo: acetato de etila = 20: 1 a 5: 1) para fornecer benzil 4-(4,5- dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)benzoato (130 mg, 315,35 umol, 11,99 % de rendimento) como um sólido branco; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) õ = 8,25 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 7,58 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,49 - 7,34 (m, 5 H), 5,41 (s, 2H). Exemplo 11. Ácido 4-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il) benzoico o
OH e EST
A eo
[00353] A solução de 4-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)ben- zoato de benzila (130 mg, 315,35 umol, 1 eq) em DCM (5 mL) foi adi- cionado ácido metanossulfônico (303,07 mg, 3,15 mmol, 224,49 uL, 10 eq) gota a gota a 10 ºC. A solução foi agitada a 10 ºC durante 5 min,
depois a solução foi aquecida a 35 ºC e agitada durante 10 horas. À cor da solução mudou de incolor para amarelo. A solução de reação foi vertida em água (20 ml) e depois filtrada. A massa filtrante foi lava- da com água (10 ml * 3) e DOM (10 ml * 3) três vezes respectivamen- te. Em seguida, a massa filtrante foi secada em vácuo. O resíduo foi disperso com DCM (10 ml) e, em seguida, éter de petróleo (30 ml) foi vertido no resíduo, a mistura foi agitada a 10 ºC durante 2 min e, em seguida, filtrada, a massa filtrante foi secada em vácuo para produzir ácido 4-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)Denzoico (934 mg, 282,97 umol, 89,73 % de rendimento, 97,590 % de pureza) como um sólido branco; LC-MS (ES, m/z): 319,9 [M-H]-; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 8,16 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,68 (d, J = 8,4 Hz, 2H).
1.30. 3-(2-(2-(2-aminoetóxi)etóxi)etóxi)propanoato 4-metilbenze- nossulfonato de benzila toe, o"
OO
[00354] Uma mistura de ácido 3-[2-[2-(2-aminoetóxi)etóxi] etó- xilpropanoico (4 g, 18,08 mmol, 1 eq), fenilmetanol (15,64 g, 144,63 mmol, 15,04 mL, 8 eq) e TSOH.H2O (3,61 g, 18,98 mmol, 1,05 eq) em tolueno (30 mL) foi agitada a 140 ºC durante 8 horas usando um apa- relho Dean e Stark para coletar a água de condensação. A reação tor- nou-se clara após refluxo durante várias horas. TLC (Diclorometano: Metanol = 10: 1, Rf = 0,3) indicou que a reação estava completa. À mistura de reação límpida foi vertida em TBME: éter de petróleo (1: 1, 50 mL) e removida a solução límpida. O resíduo foi lavado com TBME: éter de petróleo (1: 1, 50 mL) por 2 vezes e secado em vácuo. O pro- duto bruto 3-[2-[2-(2-aminoetóxi)etóxi]etóxilpropanoato de benzila; ácido 4-metilbenzenossulfônico (8,9 g, bruto) foi obtido como um óleo amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,76 (br d, J = 8,07 Hz, 2 H) 7,33 - 7,38 (m, 5H) 7,15 (d, J = 7,95 Hz, 2 H) 5,11
(s, 2 H) 3,72 (q, J = 6,11 Hz, 4 H) 3,53 - 3,64 (m, 8 H) 3,11 - 3,24 (m, 2 H) 2,53 - 2,69 (m, 2 H) 2,30 - 2,41 (m, 1 H) 2,34 (s, 3 H).
1.31. 3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-benzilóxi-3-oxo-propóxi)etóxi]etóxi] etilamino]-3-oxopropil]dissulfanil]propanoilamino]etóxi]etóxiletóxi] propanoato de benzila OQ. o uv o AAA OG II NO)
[00355] A uma mistura de ácido 3-(2-carboxietildissulfanil) pro- panoico (1,90 g, 9,04 mmol, 1 eq), HOBt (2,69 g, 19,88 mmol, 2,2 eq) e TEA (4,57 g, 45,18 mmol, 6,29 mL, 5 eq) em DCM (100 mL) foi adi- cionado EDCI (3,81 g, 19,88 mmol, 2,2 eq) a 20ºC. Em seguida, 3-[2- [2-(2-aminoetóxi)etóxi]letóxilpropanoato de benzila; ácido 4-metil- benzenossulfônico (8,74 g, 18,07 mmol, 2 eq) foi adicionado à solu- ção acima. A mistura foi agitada a 20 ºC durante 12 horas. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 2: 1, Rf = 0,25) indicou que a reação es- tava completa. MeOH foi adicionado, e a solução foi concentrada sob pressão reduzida e secada sob vácuo. O resíduo foi vertido em H2O (20 mL) e extraído com EtOAc (50 mL). A camada orgânica foi secada em Na>zSO:;, filtrada e concentrada em vácuo. O produto em bruto foi purificado por TLC prep. (éter de petróleo: acetato de etila = 1: 1, Rá = 0,5) para produzir 3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-benzilóxi-3-0x0-pro- póxi)etóxiletóxiletilamino]-3-oxo-propil]dissulfanil]propanoilami- no]Jetóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (6,52 g, 7,94 mmol, 87,81 % de rendimento, 97 % de pureza) como um óleo amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,29 - 7,42 (m, 10 H) 6,42 (br s, 2 H) 5,15 (s, 4 H) 3,79 (t, J = 6,42 Hz, 4 H) 3,53 - 3,69 (m, 18 H) 2,92 - 3,00 (m, 4 H) 2,62 - 2,71 (m, 4 H) 2,53 - 2,62 (m, 4 H).
1.32. 3-(2-(2-(2-(5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi)pro- panoato de benzila a SWAP OBn “A AD
[00356] A uma solução de 3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-benzilóxi-3- oxo-propóxi)etóxiletóxiletilamino]-3-oxopropil]dissulfanil]propa- noilamino]Jetóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (6,4 g, 8,03 mmol, 1 eq) em DCM (50 mL) foi adicionada gota a gota a solução de cloreto de sulfurila (4,34 g, 32,12 mmol, 3,21 mL, 4 eq) em DCM (10 mL) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-10 ºC durante 12 horas. TLC (éter de petróleo: acetato de etila = 0: 1, R$ = 0,15, 0,35) indicou que a rea- ção estava completa. A mistura foi vertida em gelo/água (100 mL), ex- traída com DCM (200 mL * 2). As camadas orgânicas combinadas fo- ram lavadas com H2O (100 mL * 2), salmoura (100 mL), secadas em Na2SO2. Filtração e concentração em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (éter de petróleo: acetato de etila = 1: 1 a 0: 1) para produzir 3-[2-[2-[2-(3-ox0oisotiazo|-2-il)etóxi] etóxiletóxilpropanoato de benzila (820 mg, 1,66 mmol, 10,33 % de rendimento, 80 % de pureza) como um óleo marrom; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 8,06 (d, J = 6,17 Hz, 1 H) 7,30 - 7,41 (m, 5 H) 6,24 (d, J = 6,39 Hz, 1 H) 5,15 (s, 2 H) 3,95 - 4,03 (m, 2 H) 3,79 (t, J = 6,39 Hz, 2 H) 3,68 - 3,75 (m, 2 H) 3,59 - 3,68 (m, 8 H) 2,63 - 2,70 (m, 2 H) e 3-[2-[2-[2-(5-cloro-3-ox0o-isotiazo]|-2-il)etóxiletóxi] etóxilpropanoato de benzila (2,5 g, 4,30 mmol, 26,79 % de rendi- mento, 74 % de pureza) como um óleo incolor; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,28 - 7,43 (m, 5 H) 6,25 (s, 1 H) 5,15 (s, 2 H) 3,92 - 3,98 (m, 2 H) 3,77 - 3,81 (m, 2 H) 3,59 - 3,71 (m, 10 H) 2,66 (t, J = 6,39 Hz, 2H).
1.33. 3-(2-(2-(2-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi) etóxi)etóxi)propanoato de benzila x AVANÇA O. oBn A o “X o
[00357] A uma mistura de 3-[2-[2-[2-(5-cloro-3-ox0o-isotiazo]l-2- il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1 g, 2,33 mmol, 1 eq) e NalO. (1,99 g, 9,30 mmol, 515,57 uL, 4 eq) em H2O (20 mL), DOM (10 mL) e ACN (10 mL) foi adicionado RuCl3.H2O (26,22 mg, 116,30 umol, 0,05 eq) em uma porção a 20 ºC sob N2. Em seguida, a mistura foi agi- tada a 20 ºC durante 1 hora. O resíduo foi extraído com acetato de eti- la (20 mL * 2). A fase orgânica combinada foi secada com Na2SO, ani- droso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (SiO,», éter de petróleo: acetato de etila = 5: 1 a 1: 1) para produzir 3- [2- [2- [2-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol|-2-il) etóxi] etóxiletóxilpropanoato de benzila (560 mg, 1,21 mmol, 52,12 % de rendimento, 100 % de pureza) como um óleo roxo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 = 7,42 - 7,29 (m, 5 H), 6,70 (s, 1 H), 5,15 (s, 2 H), 3,92 - 3,86 (m, 2 H), 3,77 (td, J = 6,0, 11,9 Hz, 4 H), 3,68 - 3,58 (m, 8 H), 2,67 (t, J = 6,5 Hz, 2H).
Exemplo 12. Ácido 3-(2-(2-(2-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol- 2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi)propanoico x O. O. SION oH
AX A A
[00358] A solução de 3-[2-[2-[2-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol|-2- il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (560 mg, 1,21 mmol, 1 eq) em DCM (30 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (1,17 g, 12,12 mmol, 863,06 uL, 10 eq) gota a gota a 10 ºC. A mistura foi aquecida a ºC e agitada durante 10 horas. A cor da solução mudou para ama- relo. O resíduo foi lavado com água (30 mL * 3), e a fase orgânica foi secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O re- síduo foi purificado por TLC prep. (acetato de etila: acetato de etila:
metanol: ácido acético = 40: 8: 1, RF = 0,77) para produzir ácido 3-[2- [2-[2-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazo|-2- il)etóxiletóxiletóxilpropanoico (95,61 mg, 240,16 umol, 19,81 % de rendimento, 93,389 % de pureza) como um óleo incolor; LC-MS (ES, m/z): 372,1 [M+H]* ; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 12,13 (br s, 1 H), 7,64 (s, 1 H), 3,86 - 3,74 (m, 2 H), 3,61 (td, J = 6,0, 16,9 Hz, 4 H), 3,54 - 3,46 (m, 8 H), 2,43 (t, J = 6,4 Hz, 2H).
1.34. 3-(2-(2-(2-(4,5-dicloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi) propanoato de benzila a RIDE cl o
[00359] A uma solução de 3-[2-[2-[2-(5-cloro-3-ox0o-isotiazo]l-2- il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1,6 9, 3,72 mmol, 1 eq) em DCM (30 mL) foi adicionado gota a gota cloreto de sulfurila (1,00 9, 7,44 mmol, 744,17 ul, 2 eq) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-10 ºC durante 12 horas. Uma solução límpida amarelo pálido foi obtida após a adição de cloreto de sulfurila. TLC (acetato de etila: éter de petróleo = 2: 1, RF = 0,5) indicou que a reação estava completa. A mistura foi concentrada em vácuo para produzir um produto em bruto. O resíduo foi vertido em H2O (50 mL), extraído com DCM (50 mL * 2). As cama- das orgânicas combinadas foram lavadas com H2O (50 mL), secadas em Na>SO;, filtradas e concentradas em vácuo. O resíduo foi purifica- do por cromatografia de coluna em sílica gel (acetato de etila: éter de petróleo = 1: 2 a 2: 1) para produzir 3-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-3-o0x0- isotiazol-2-il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1,06 9, 1,76 mmol, 47,17 % de rendimento, 76,9 % de pureza) como um óleo inco- lor; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,28 - 7,40 (m, 4 H) 5,13 (s, 2 H) 3,98 - 4,04 (m, 2 H) 3,77 (t, J = 6,39 Hz, 2 H) 3,67 - 3,72 (m, 2 H) 3,57 - 3,67 (m, 8 H) 2,65 (t, J = 6,39 Hz, 2H).
1.35. 3-(2-(2-(2-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-
il)etóxi)etóxi) etóxi)propanoato de benzila “E
AA OA cl 9º
[00360] A uma mistura de 3-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-3-ox0o-isotiazo]|-2- il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1 g, 2,15 mmol, 1 eq) e NalO. (1,84 g, 8,61 mmol, 477,32 uL, 4 eq) em H2O (20 mL), CH3;CN (10 mL) e DCM (10 mL) foi adicionado RuCl3.H2O (7,28 mg, 32,30 umol, 0,015 eq) sob N2 a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-10 durante 2 horas. A TLC indicou que a reação estava completa. A mistura foi dilu- ída com EtOAc (50 mL) e filtrada para remover o sólido insolúvel. À camada orgânica foi separada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por TLC preparativa (éter de petróleo: acetato de etila = 1: 1, Rf = 0,6) para produzir 3-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol|-2- il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (830 mg, 1,61 mmol, 74,96 % de rendimento, 96,533 % de pureza) como um óleo incolor; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,28 - 7,41 (m, 5 H) 5,15 (s, 2 H) 3,91 - 3,97 (m, 2 H) 3,75 - 3,83 (m, 4 H) 3,59 - 3,68 (m, 8 H) 2,66 (t, J = 6,50 Hz, 2H). Exemplo 13. Ácido 3-(2-(2-(2-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotia- zol-2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi)propanoico x o
UM OA co
[00361] A solução de 3-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol- 2-il)etóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (820,00 mg, 1,65 mmol, 1 eq) em DCM (10 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (1,59 9, 16,52 mmol, 1,18 mL, 10 eq) gota a gota a 10 ºC. Em seguida, a solu- ção foi aquecida a 35 ºC e agitada durante 10 horas. O resíduo foi dilu- ído por DCM (20 mL) e em seguida a solução foi lavada com água (15 mL * 3), a fase orgânica foi secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por TLC prep. (acetato de etila: ácido acético = 250:1, Rf = 0,55) até ácido 3-[2-[2-[2-(4,5- dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)etóxiletóxiletóxilpropanoico (249,4 mg, 602,76 umol, 36,49 % de rendimento, 98,180 % de pureza) como um óleo amarelo; LC-MS (ES, m/z): 406,0 [M+H]*; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 12,16 (br s, 1 H), 3,85 (t, J = 5,5 Hz, 2 H), 3,65 (br t, J = 5,4 Hz, 2 H), 3,61 - 3,45 (m, 10 H), 2,43 (t, J = 6,3 Hz, 2H).
1.36. 1-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxa-henicosan-21-0ato 4-metil- benzenossulfonato de benzila Dano so o
[00362] Uma mistura de fenilmetano!l (2,45 g, 22,64 mmol, 2,35 mL, 8 eq), ácido 3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetóxi)etóxiletóxiletóxi] etó- xiletóxilpropanoico (1 g, 2,83 mmol, 1 eq) e TSOH.H2O (565,16 mg, 2,97 mmol, 1,05 eq) em tolueno (30 mL) foi agitada a 140 ºC com uma armadilha Dean-Stark durante 14 horas. A mistura foi alterada de turva para clara várias horas depois. O resíduo foi concentrado em vácuo para remover o tolueno e, em seguida, TBME (50 mL) foi vertido no resíduo e agitado durante 1 min. Em seguida, o sobrenadante foi re- movido e secado para produzir 3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-aminoetóxi)etóxi] etóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila; ácido 4-metilbenz- enossulfônico (1,45 g, bruto) como um óleo amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 = 7,80 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,67 - 7,46 (m, 2H), 7,39 - 7,31 (m, 5H), 7,15 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,13 (s, 2 H), 3,96 - 3,83 (m, 2 H), 3,75 - 3,50 (m, 22 H), 3,24 - 3,14 (m, 2 H), 2,63 (tl, J = 6,2 Hz, 2 H), 2,34 (s, 3H).
1.37. 23,30-dioxo-4,7,10,13,16,19,34,37,40,43,46,49-dodecaoxa- 26,27-ditia-22,31-diazadopentacontanodioato de dibenzila ta Ato
[00363] A uma mistura de ácido 3-(2-carboxietildissulfanil) pro- panoico (47,41 mg, 225,47 umol, 1 eq) e TEA (91,26 mg, 901,86 umol, 125,53 uL, 4 eq), HOBt (91,40 mg, 676,40 umol, 3 eq), EDCI (129,67 mg, 676,40 umol, 3 eq) em DCM (5 mL) foi adicionado 3-[2-[2- [2-[2-[2-(2-aminoetóxi)etóxi]etóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila; ácido 4-metilbenzenossulfônico (277,65 mg, 450,93 umol, 2 eq) gota a gota a 25 ºC. Após a adição, a mistura foi agitada a 25 ºC durante 8 horas. TLC (acetato de etila: metanol = 3: 1, Rf = 0,33) mos- trou que o material de partida foi consumido e um novo ponto principal foi gerado. O resíduo foi vertido em NaCl (10 ml) e agitado durante 2 min. Em seguida, a fase aquosa foi extraída com DCM (5 mL * 3)| A fase orgânica combinada foi lavada com NaCl (10 mL * 2), secada com Na2SOa. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purifi- cado por HPLC preparativa (coluna: Waters Xbridge 150*25 5 u; fase móvel: [água(10 mM NH4 hCO3)-ACNJ;B %: 32 %-62 %,12 min) para produzir 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-benzilóxi-3-0x0- propóxi)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletilamino]-3-oxo-propil] dissul- fanil]propanoilamino]Jetóxi]etóxiletóxiletóxiletóxiletóxi]l propanoa- to de benzila (70 mg, 65,96 umol, 29,25 % de rendimento) como um óleo incolor; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) à = 7,41 - 7,29 (m, 10 H), 6,50 (br s, 2 H), 5,14 (s, 4 H), 3,78 (t, J = 6,5 Hz, 4 H), 3,67 - 3,61 (m, 40 H), 3,59 - 3,55 (m, 4 H), 3,45 (q, J = 5,1 Hz, 4 H), 2,97 (t, J =7,2 Hz, 4 H), 2,66 (t, J = 6,5 Hz, 4 H), 2,60 (t, J=7,1 Hz, 4h).
1.38. 1-(5-cloro-3-oxoisotiazol-2(3H)-11)-3,6,9,12,15,18-hexaoxa- henicosan-21-0ato de benzila ci EPA aa aan o
[00364] A uma solução de 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2- (3-benzilóxi-3-oxo-propóxi)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletilamino]- 3-oxo-propil]dissulfanil] propanoilamino]Jetóxi]letóxiletóxiletóxi] etóxiletóxil-propanoato de benzila (5,5 g, 5,18 mmol, 1 eq) em DCM (60 mL) foi adicionado gota a gota cloreto de sulfurila (3,50 g, 25,91 mmol, 2,59 mL, 5 eq) a 0 ºC. A mistura foi agitada a 0-20 ºC durante 12 horas. TLC (acetato de etila: metanol = 10: 1, Rf = 0,3, 0,5) indicou que a reação estava completa. A mistura foi vertida em gelo/água (10 mL), extraída com DCM (20 mL * 2). As camadas orgânicas combina- das foram lavadas com H2O (20 mL * 2), salmoura (20 mL), secadas em NazSO2. Filtração e concentração em vácuo. O resíduo foi purifica- do por cromatografia de coluna em sílica gel (éter de petróleo: acetato de etila = 1: 1 a 0:1) para produzir 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-oxoisotiazo]- 2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1,4 9, 2,29 mmol, 22,05 % de rendimento, 86,148 % de pureza) como um óleo marrom; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 8,02 (d, J = 6,17 Hz, 1 H) 7,22 - 7,32 (m, 5 H) 6,17 (br d, J = 6,17 Hz, 1 H) 5,07 (s, 2 H) 3,92 (br t, J = 4,30 Hz, 2 H) 3,51 - 3,73 (m, 24 H) 2,58 (t, J = 6,39 Hz, 2 H) e 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-cloro-3-ox0o-isotiazo|-2-il)etóxi] etóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (3,1 9, 4,44 mmol, 42,85 % de rendimento, 80,532 % de pureza) como um óleo incolor; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 ppm 7,30 - 7,40 (m, H) 6,26 (s, 1 H) 5,15 (s, 2 H) 3,93 - 3,99 (m, 2 H) 3,78 (t, J = 6,50 Hz, 2H) 3,60 - 3,72 (m, 23 H) 2,66 (t, J = 6,50 Hz, 2H).
139 —1-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-i1)-3,6,9,12,15,18- hexaoxa-henicosan-21-0ato de benzila oo o NT o A EIN)
O
[00365] A uma mistura de 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-cloro-3-ox0-isotia- zol-2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1
9, 1,78 mmol, 1 eq) e NalO. (1,52 g, 7,12 mmol, 394,34 uL, 4 eq) em H2O (20 mL), DCM (10 mL), ACN (10 mL) foram adicionados RuCl3.H2O0 (20,05 mg, 88,96 umol, 0,05 eq) em uma porção a 20 ºC sob N2>. Em seguida, a mistura foi agitada a 20 ºC durante 1 hora. O resíduo foi extraído com acetato de etila (20 mL * 2). A fase orgânica combinada foi secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (SiO,, éter de petróleo: acetato de etila = 1: 1 para acetato de etila: metanol = 10: 1) para proporcionar 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol- 2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (520 mg, 849,06 umol, 47,72 % de rendimento, 97 % de pureza) como um óleo amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) à = 7,44 - 7,29 (m, 5 H), 6,72 (s, 1 H), 5,14 (s, 2 H), 3,92 - 3,86 (m, 2 H), 3,80 - 3,73 (m, 4 H), 3,69 - 3,59 (m, 20 H), 2,66 (t, J = 6,4 Hz, 2H). Exemplo 14. Ácido 1-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxa-henicosan-21-0ico oo OH Cc AUT a ao o
[00366] A solução de 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isoti- azol-2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (520 mg, 875,32 umol, 1 eq) em DCM (30 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (841,23 mg, 8,75 mmol, 623,13 uL, 10 eq) gota a gota a 10 ºC. A solução foi aquecida a 35 ºC e agitada durante 10 ho- ras. O resíduo foi lavado com água (30 mL * 3), e a fase orgânica foi secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O re- síduo foi purificado por TLC prep. (acetato de etila: metanol: ácido acé- tico = 40: 8: 1, Rf = 0,58). O resíduo foi purificado novamente por HPLC preparativa (coluna: Nano-micro Kromasil C18 100 * 350 mm 5 um; fase móvel: [água(0,05 % de HCI)-ACNJI;B %: 1 %-30 %,10 min) para produzir ácido 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-cloro-1,1,3-trioxo-isotiazol-
2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoico (55,93 mg, 106,24 umol, 12,14 % de rendimento, 95,726 % de pureza) como um óleo in- color; LC-MS (ES, m/z): 504,2 [M+H]*; *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) = 12,30 - 11,96 (m, 1 H), 7,64 (s, 1 H), 3,83 - 3,76 (m, 2 H), 3,65 - 3,58 (m, 4 H), 3,54 - 3,52 (m, 2 H), 3,52 - 3,48 (m, 18 H), 2,44 - 2,42 (m, 2H).
1.40 Benzil 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazo|-2-il)etóxi] etóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato % o A o. o. o. o
SP A O DO ONDE o
[00367] A solução de 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-cloro-3-ox0-isotiazo]|-2- il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (1,3 9, 2,31 mmol, 1 eq) em DCM (30 mL) foi adicionado cloreto de sulfurila (624,34 mg, 4,63 mmol, 462,47 uL, 2 eq) gota a gota a 20 ºC. A solu- ção foi agitada a 20 ºC durante 2 horas. A solução ficou amarela. O resíduo foi vertido em água gelada (30 ml) e agitado durante 30 min. À fase de DCM foi lavada com água (50 mL * 6), secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por TLC prep. (acetato de etila: metanol = 10: 1, Rf = 0,50) para produzir 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-3-oxo-isotiazo|-2- il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (800 mg, 1,21 mmol, 52,19 % de rendimento, 90 % de pureza) como um óleo amarelo; *H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) à = 7,40 - 7,29 (m, 5 H), 5,15 (s, 2 H), 4,04 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 3,78 (t, J = 6,4 Hz, 2 H), 3,72 (t, J = 4,7 Hz, 2 H), 3,69 - 3,63 (m, 16 H), 3,62 (s, 4 H), 2,66 (t, J =6,5 Hz, 2H). 141 1-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-i1)-3,6,9,12,15, 18-hexaoxa-henicosan-21-0ato de benzila x? ? e ATO AA A A NO co
[00368] A uma mistura de 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-3-0x0- isotiazol-2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de ben- zila (600 mg, 1,01 mmol, 1 eq) e NalOa (860,56 mg, 4,02 mmol, 222,94 uL, 4 eq) em H2O (20 mL), DOM (10 mL), ACN (10 mL) foi adicionado RuCl3.H20 (11,34 mg, 50,29 umol, 0,05 eq) em uma porção a O ºC sob N>2. A mistura foi agitada a O ºC durante 2 min, depois aquecida a 25 ºC e agitada durante 1 hora. O resíduo foi vertido em acetato de etila (30 ml) e depois filtrado. O filtrado foi extraído com acetato de etila (30 mL * 3). A fase orgânica combinada foi concentrada em vácuo. O resí- duo foi purificado por TLC prep. (acetato de etila, Rf = 0,50) para pro- duzir 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo-isotiazo|-2-il)etóxi] etóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de benzila (220 mg, 350,03 umol, 34,80 % de rendimento, 100 % de pureza) como um óleo incolor; 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) 5 = 7,40 - 7,27 (m, 4 H), 5,15 (s, 2 H), 3,99 - 3,90 (m, 2 H), 3,78 (t, J = 6,2 Hz, 4 H), 3,70 - 3,58 (m, H), 2,66 (t, J = 6,4 Hz, 2H). Exemplo 15. Ácido 1-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazo|-2(3H)- 11)-3,6,9,12,15,18-hexaoxa-henicosan-21-o0ico o? oH A o Aa ao co
[00369] A solução de 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-dicloro-1,1,3-trioxo- isotiazol-2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxilpropanoato de ben- zila (220 mg, 350,03 umol, 1 eq) em DCM (5 mL) foi adicionado ácido metanossulfônico (504,60 mg, 5,25 mmol, 373,78 uL, 15 eq) gota a gota a 10 ºC. Em seguida, a solução foi aquecida a 40 “C e agitada durante 20 horas. O resíduo foi diluído por DOM (20 mL) e em seguida a solução foi lavada com água (15 mL * 3), a fase orgânica foi secada com Na2SO. anidroso, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa (coluna: Nano-micro Kromasil C18 100 * 30 mm 5 um; fase móvel: [água (0,05 % de HCI)-ACN]; B %: 25 % - 55 %, 10 min) para produzir ácido 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-dicloro- 1,1,3-trioxo-isotiazol-2-il)etóxiletóxiletóxiletóxiletóxiletóxil propa- noico (53,79 mg, 98,63 umol, 28,18 % de rendimento, 98,724 % de pureza) como um óleo amarelo; LC-MS (ES, m/z): 538,2 [M+H]* ; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 12,13 (br s, 1 H), 3,89 - 3,81 (m, 2 H), 3,65 (t, J = 5,5 Hz, 2 H), 3,59 (t, J = 6,4 Hz, 2 H), 3,56 - 3,48 (m, 20 H), 2,43 (t, J = 6,4 Hz, 2H). Exemplo 16. Ps o
É Cc Po
[00370] Em um frasco sob argônio foi adicionado o produto ácido 6- (5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoico (12,58 mg, 0,045 mmol), DOM (2 mL) e DMF (10 ul). A mistura foi resfriada a 0 ºC, em seguida dicloreto de oxalila (11,65 ul, 0,436 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e foi agi- tada até a conversão completa ser observada por LCMS (acompa- nhamento por LCMS por adição à alíquota de MeOH seco para formar o éster metílico). O produto bruto foi evaporado sob vácuo. O resíduo foi empregado em DCM e secado novamente sob vácuo para produzir um sólido amarelo. O material bruto foi usado sem purificação adicio- nal para a próxima etapa.
2. Síntese dos conjugados fármaco-ligante Exemplo A. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,48S,58S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(5- cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)-N-metil-hexanamido) fe- netil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3- metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-
L-fenilalanina. 3 ú ES DAS, eo A OMeO 5d o DSO o oH Procedimento padrão para a síntese de fármaco-ligantes:
[00371] Em um frasco sob nitrogênio, foram adicionados em tempe- ratura ambiente ácido 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoico (205 mg, 0,73 mmol) (Exemplo 1), diclorometano (10 mL) e DMF (100 JUL). A mistura foi resfriada a O ºC utilizando um banho de gelo, em seguida foi adicionado cloreto de oxalila (190,4 ul, 2,18 mmol). A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e foi agitada durante 2 h. A mistura de reação foi evaporada sob vácuo. O resíduo foi empregado em CH2Cl> e secado novamente sob vácuo para produ- zir cloreto de 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoíla como um sólido amarelo. Em um frasco sob N? em temperatura ambi- ente foram introduzidos ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4- ((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil) ami- no)butanamido)butanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin- 2-i1)-3-metóxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, = composto de ácido (8S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,48,58)-4-((S)-N,3-dimetil-2- ((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamido) bu- tanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2- metilpropanamido)-3-fenilpropanoico com ácido 2,2,2-trifluoroa- cético (1: 1) (111 mg, 0,102 mmol) e diclorometano (3,7 mL). A mistu- ra foi resfriada a O ºC e DIPEA (70,9 ul, 0,406 mmol) foi adicionado. À mistura de reação foi agitada durante 10 min a O ºC, em seguida, clo- reto de 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoíla (36,6 mg, 0,122 mmol) foi adicionado gota a gota como uma solução em
DCM (248 mg de cloreto de ácido em 2 mL de DCM). A mistura foi agi- tada a 0 ºC durante 1h15. A reação foi interrompida adicionando ácido trifluoroacético (32,9 ul, 0,426 mmol), acetonitrila (2,1 mL) e água (0,3 mL) à mistura a O ºC. O material em bruto foi concentrado em vácuo, e o resíduo purificado por HPLC preparativa (Coluna X-Bridge C18 (100 * 30) usando um gradiente de ACN e água com 0,1 % de TFA como uma fase móvel) para produzir ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2- ((8)-2-((4-(6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)-N-metil- hexanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dime- tilbutanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi- 2-metilpropanoil)-L-fenilalanina. O espectro de massa, e o espectro de '*H-RMN deste conjugado fármaco-ligante são representados res- pectivamente nas Figuras 1A e 1B. Exemplo B. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,48,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(4,5- dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)-N-metil-hexanamido) fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)- 3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpro- panoil)-L-fenilalanina. G 4 c NODIDOI QD. o " DSO
O OH
[00372] Foisintetizado seguindo o procedimento padrão para a sín- tese de fármaco-ligantes usando ácido 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3- oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoico (Exemplo 2) e ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R, 48,58)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino) fene- til)amino)butanamido)butanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil) pir- rolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina composto com ácido 2,2,2-trifluoroacético (1: 1) como materiais de partida.
[00373] O espectro de massa deste conjugado fármaco-ligante é representado na Figura 2. Exemplo C. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,48,58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4- ((8)-2-((S)-2-(6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexana- mido)-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)(metil) amino)fenetil)(metil) amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metóxi-5- metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-L-feni- lalanina Gg Vea OTA, Ô Fos ' A sl Eve ox! SÊ Na CE O
[00374] Foi obtido seguindo o procedimento padrão para a síntese de fármaco-ligantes usando ácido 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3- oxoisotiazol-2(3H)-il))exanoico (Exemplo 1) e ((2R,3R)-3-((S)-1- ((3R,48,58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3- metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)(metil)amino)fenetil) (me- til)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metóxi-5- metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-L-fenila- lanina como materiais de partida.
[00375] O espectro de massa, e o espectro de *H-RMN deste con- jugado fármaco-ligante são representados respectivamente nas Figu- ras 3A e 3B. Exemplo D. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,48S,58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S) -2-((S)-2-(6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexana- mido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)óxi) carbo- nil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-di- metilbutanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-i1)-3-me-
tóxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina o o o o bi ADIA. / ALIAS ' E. o 1 o Ó É q já N OMe o J AX po Que? j e OA, 2 A em CO
[00376] Foi obtido seguindo o procedimento padrão para a síntese de fármaco-ligantes usando ácido 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-ox0- isotiazol-2(3H)-il)hexanoico (Exemplo 2) e ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S, 58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)- B5-ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)(metil) amino)fenetil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metó- xi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-L- fenilalanina como materiais de partida.
[00377] O espectro de massa, e o espectro de *H-RMN deste con- jugado fármaco-ligante são representados respectivamente nas Figu- ras 4A e 4B. Exemplo E. sal de ácido 2,2,2-trifluoroacético de ((2R,3R)-3-((S)-1- ((3R,48,5S8)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2-(5-cloro- 1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi)propanamido)- 3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil)óxi) carbonil) (metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dime- tilbutanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi- 2-metilpropanoil)-L-fenilalanina. Voe H LAI As Ned À N, UE o o. AP A EO e Y Nona, NA, ! o HR F OH À + NHK Fo uno
[00378] Sintetizado seguindo o procedimento padrão para a síntese de fármaco-ligantes usando ácido 3-(2-(2-(2-(5-cloro-1,1-dióxido-3- oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi)propanoico (Exemplo 12) e ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)- 2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5 — ureidopentanamido)benzil) óxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido) -N,3-dimetilbutanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)- 3-metóxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico como materiais de partida.
[00379] O espectro de massa, e o espectro de *H-RMN deste con- jugado fármaco-ligante são representados respectivamente nas Figu- ras SAe 5B. Exemplo F. ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2- (3-(2-(2-(2-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi)etóxi) etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-metilpropanamido) fe- netil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3- metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)- D-fenilalanina & o 2oN, oe to 1 1 o (É oo o Ó TF Yor Y a A, “o nn o E o: V
[00380] Sintetizado seguindo o procedimento padrão para a síntese de fármaco-ligantes usando ácido 3-(2-(2-(2-(5-cloro-1,1-dióxido-3- oxoisotiazol-2(3H)-il)etóxi)etóxi)etóxi)propanoico (Exemplo 12) e ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3- metilbutanamido)-N-metilpropanamido)fenetil)(metil)amino)-3- metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metóxi-5-metil- heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-D-fenilalanina como materiais de partida.
[00381] O espectro de massa, e o espectro de *H-RMN deste con-
jugado fármaco-ligante são representados respectivamente nas Figu- ras GA e 6B. Exemplo G. ((2R,3R)-3-(1-((S3R,4R,58)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)- 2-(6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanamido)-3- metilbutanamido)-N-metilpropanamido)fenetil)(metil)amino)-3- metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metóxi-5-metil-hepta- noil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2-metilpropanoil)-D-fenilalanina a o 1? | omeot A í ão 9 HO Qt o * IL, o o Ho E
[00382] Sintetizado seguindo o procedimento padrão para a síntese de fármaco-ligantes usando ácido 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisoti- azol-2(3H)-il)nexanoico (Exemplo 1) e ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,58S)-4- ((8)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-metilpro- panamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbu- tanamido)-3-metóxi-5-metil-heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metóxi-2- metilpropanoil)-D-fenilalanina como materiais de partida.
[00383] O espectro de massa, e o espectro de *H-RMN deste con- jugado fármaco-ligante são representados respectivamente nas Figu- ras 7Ae7B. Exemplo H. (2-((28,48S)-2,5,12-tri-hidróxi-7-metóxi-4-(((1S8,3R,4aS, 9S,9aR,10aS)-9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5] oxa- zolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa-hidrote- traceno-2-carboxamido)etil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-cloro -1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanamido)-3-metilbutanami- do)-5-ureidopentanamido)benzila
Ox NHo o H = O H o O OH o " LTS NEON ANO NSÇO o o o-S4 oHH à Ó O OH “OK o . , (o o
[00384] O Exemplo H foi sintetizado de acordo com a seguinte via sintética: o or o o om o oH H “OH oO. or y PP " ; P 9,0. 2eq Á H Ô, - comercial É t In F Sm Ko o Nt q e e Sã o LS o or o " IP Ho 143 q on noso
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142. Ácido (28,48)-2,5,12-tri-hidróxi-7-metóxi-4-(((18,3R,4aS,9S, 9aR,10aS)-9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5Joxazolo [2,3-c][1,4]oxazin-3-il)Óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6, 11-hexa-hidrotetra- ceno-2-carboxílico
[00385] Em um frasco foi adicionado PNU-159682 (52 mg, 0,081 mmol) em uma mistura de metanol (15 mL) e água (10 mL). Uma solu- ção de Nal0O, (34,7 mg, 0,162 mmol) em água (5 mL) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente até a conver- são completa ser observada por LCMS. Os solventes foram removidos sob vácuo para produzir 1.42 como um sólido vermelho que foi usado diretamente na próxima etapa.
1.43 ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-aminoetil)carbamoil)óxi)metil)fenil) ami- no)-1-o0x0-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)car- bamato de (9H-fluoren-9-il) metila
[00386] “Em um frasco sob argônio foram adicionados ((S)-1-(((S)-1- ((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-0x0-5- ureidopentan-2-il)amino)-3-metil- 1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (1 g, 1,662 mmol) e bis(4-nitrofenil)carbonato (1,011 g, 3,32 mmol) em DMF (0,443 mol/L). Em seguida, a mistura foi resfriada a O ºC e DIPEA (639 uL, 3,66 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura de reação foi aqueci- da em temperatura ambiente e agitada durante 18 h. A mistura crua foi concentrada sob vácuo. O produto em bruto foi tomado em uma mistu- ra 1: 1 de EtO/EtOAc e filtrado. O precipitado foi lavado com Et2O, ácido cítrico 5 %, H2O e depois EthO novamente para obter um sólido amarelo. Este sólido foi purificado por cromatografia de coluna auto- mática em sílica gel (100DCM:O0 MeOH a 80DCM:20 MeOH) para produ- zir 345 mg de ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-(((((4-nitrofenóxi)carbonil)óxi) me- til)fenil)>amino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il) carba- mato de (9H-fluoren-9-il)]metila (sólido branco), rendimento de 27,1 %.
[00387] A uma solução do produto anterior (150 mg, 0,196 mmol) em
DMF (6 mL) foram adicionados HOBt (34,4 mg, 0,254 mmol) e piridina (63,3 ul, 0,782 mmol) a O ºC. Após 5 min, terc-butil (2-aminoetil) car- bamato 1-2 (40,7 mg, 0,254 mmol) em DMF (1,5 mL) foi adicionado à mistura, seguido por DIPEA (102 ul, 0,587 mmol). A mistura foi aque- cida em temperatura ambiente e agitada durante 2h. O produto bruto foi concentrado sob vácuo para produzir um sólido branco que foi puri- ficado por cromatografia de coluna automática em sílica gel (100 DCM:0 MeOH a 80 DCM:20 MeOH) para produzir 129 mg de terc-butil etano-1,2-diildicarbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(((((9H-fluoren-9-il)metóxi) carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzila (só- lido branco), 84 % de rendimento.
[00388] “Em um frasco foi colocado o produto anterior (154 mg, 0,195 mmol) em DCM (6 mL). A mistura foi resfriada a O ºC e TFA (753 uL, 9,77 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada a O ºC até a conversão completa ser observada por LCMS. A mistura crua foi concentrada em vácuo para produzir 1.43 como um sólido branco (rendimento quantitativo). 144 (2-((28,48)-2,5,12-tri-chidróxi-7-metóxi-4-(((18,3R,4aS,9S,9aR, 10aS)-9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5]oxazolo[2,3-c] [1,4]oxazin-3-il) óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa-hidrotetraceno-2- carboxamido)etil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbuta- namido)-5-ureidopentanamido)benzila
[00389] Em um | frasco foram adicionados 1.42 (50,9 mg, 0,081 mmol), 1,43 (78,0 mg, 0,097 mmol) e DMF (8 mL) seguido por HATU (30,8 mg, 0,081 mmol) e DIPEA (56,7 ul, 0,324 mmol) . A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 18 h. A esta mis- tura foi então adicionada piperidina (80 ul, 0,811 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1 h (até a conversão completa ser observada por LCMS). A mistura foi concentrada sob vácuo. O produto em bruto obtido foi imediatamente purificado por cromatografia de coluna automá- tica em sílica gel (100DCM:O MeOH/NH;3 aq a 85DCM:25MeOH/NH;
aq) para produzir 20 mg de 1.44 (óleo vermelho), rendimento de 23 %. Exemplo H.
[00390] Em um frasco sob N, foi adicionado ácido 6-(5-cloro-1,1- dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoico (exemplo 1) (7,86 mg, 0,028 mmol) em DCM (1 mL) e DMF (10 ul). A mistura foi resfriada a 0 ºC, em seguida cloreto de oxalila (7,28 ul, 0,085 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e foi agitada até a conversão completa ser observada por LCMS (acompanhamento por LCMS por adição à alíquota de MeOH seco para formar o éster metílico). A mistura crua foi evaporada sob vácuo. O resíduo foi em- pregado em DCM e secado novamente sob vácuo para produzir clore- to de 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hnexanoíila como um sólido amarelo (rendimento quantitativo). O material bruto foi usado sem purificação adicional para a próxima etapa.
[00391] Em um frasco sob N? foram introduzidos em temperatura ambiente 1.44 (20 mg, 0,019 mmol) em DCM (2 mL). A mistura foi res- friada a O ºC e DIPEA (12,96 ul, 0,074 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada a O *C durante 10 min, em seguida, o produto da etapa anterior (8,40 mg, 0,028 mmol) diluído em DCM (1 mL) foi adiciona- do. A mistura foi então agitada a O ºC durante 2h (até a conversão completa ser observada por LCMS). A mistura crua foi concentrada sob vácuo e purificada por cromatografia de coluna automática, sílica gel (100DCM:O MeOH a 85DCM:15MeOH) para produzir 6,85 mg do exemplo H (também denominado composto F562524) como um sólido vermelho, rendimento de 27 %.
[00392] O espectro de "H-RMN deste conjugado fármaco-ligante é representado na Figura 8. Exemplo |. (2-0x0-2-((28,48S)-2,5,12-tri-hidróxi-7-metóxi-4-(((1S,3R, 4aS,98,9aR,10aS)-9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5] oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)Óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa-
hidrotetracen-2-il)etil)etano-1,2-diilbis(metilcarbamato) de 4-((S)-2- ((8)-2-(6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanamido)- 3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzila O, õo O OH o o " O é
COCSETA OR S O O OH Ó. 0 H o S&S " So o NH, o
[00393] O Exemplo | foi sintetizado de acordo com a seguinte via sintética: o om o om F. À FF 1 F o ow o F
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[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)Óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa-hidrote- tracen-2-il)etil(perfluorofenil)carbonato
[00394] Em um frasco sob argônio foram adicionados PNU-159682 (12 mg, 0,0180 mmol) e DMF (1,5 mL). A mistura foi resfriada a 0 ºC e foi adicionado bis(perfluorofenil)|carbonato (36,9 mg, 0,094 mmol). Em seguida, uma solução de DIPEA (9,80 ul, 0,056 mmol) em DMF (0,5 mL) foi adicionada lentamente ao longo de um período de 5 min. À mistura foi finalmente agitada durante 3h a O ºC (conversão observada por LCMS). A mistura crua foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna automática, sílica gel (100DCM:0 [80DCM:20 MeOH] a 50DCM:50 [80DCM:20 MeOH]) para produzir 5,52 mg de 1.45 como um óleo vermelho, 36 % de rendimento.
1.46 ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenóxi)carbonil)óxi)metil) fe- nil)amino)-1-o0x0-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)car- bamato 2,2,2-trifluoroacetato de (9H-fluoren-9-il)metila
[00395] Em um frasco sob argônio foram adicionados ((S)-1-(((S)-1- ((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-0x0-5- ureidopentan-2-il)amino)-3-metil- 1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (1g, 1,662 mmol) e bis(4-nitrofenil)carbonato (1,0119g, 3,32 mmol) em DMF (0,443 mol/L) em seguida, a mistura foi resfriada a O ºC e DIPEA (639 uL, 3,66 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 18 h. A mistura crua foi con- centrada sob vácuo, empregada em Et20/EtOAc (1/1) e filtrada. O pre- cipitado foi lavado com Et2O, ácido cítrico 5 %, H2O e depois Et2O no- vamente para obter um sólido amarelo. Este sólido foi purificado por cromatografia de coluna automática, sílica gel (100DCM:0 MeOH a 80DCM:20 MeOH) para produzir 345 mg de um sólido branco, 27,1 % de rendimento. A uma solução deste composto (118 mg, 0,154 mmol) em DMF (6 mL) foram adicionados HOBt (27,0 mg, 0,200 mmol) e piri- dina (49,8 ul, 0,616 mmol) a 0 ºC. Após 5 min, metil (2-(metilamino)etil)
carbamato de terc-butila (37,7 mg, 0,200 mmol) em DMF (1,5 mL) foi adicionado à mistura, seguido por DIPEA (81,0 ul, 0,462 mmol). A mis- tura foi então aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 2h (até a conversão completa ser observada por LCMS). A mistura crua foi concentrada sob vácuo para produzir um óleo amarelo que foi puri- ficado por cromatografia de coluna automática, sílica gel (100DCM:0 MeOH a 80DCM:20 MeOH) para produzir 103 mg de um sólido bran- co, rendimento de 82 %.
[00396] Em um frasco foi colocado este produto (198 mg, 0,243 mmol) em DCM (12 mL). A mistura foi resfriada a O ºC e TFA (935 ul, 12,13 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante 4 h a 0 ºC (até a conversão completa ser observada por LCMS). A mistura crua foi concentrada sob vácuo para produzir 220 mg de 1.46 como um sóli- do amarelo claro (rendimento quantitativo). 147 4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanami- do)benzil — (2-0x0-2-((28,48S)-2,5,12-tri-hidróxi-7-metóxi-4-(((1S,3R, 4aS,98,9aR,10aS)-9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5] oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)Óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa- hidrotetracen-2-il)etil)etano-1,2-diilbis(metilcarbamato)
[00397] A uma solução do produto 1.45 (19 mg, 0,022 mmol) em DMF (1 mL) foi adicionada em temperatura ambiente uma solução do produto 1.46 (22,2 mg, 0,027 mmol) e DIPEA (15,59 ul, 0,089 mmol) em DMF (1 mL)) A mistura de reação foi agitada em temperatura am- biente durante 3h (até a conversão completa ser observada por LCMS). Em seguida, à mistura foi adicionada piperidina (22,09 ul, 0,223 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1 h (conversão completa observada por LCMS). A mistura crua foi concentrada sob vácuo e purificada por cromatografia de coluna automática, sílica gel (100DCM:0 MeOH/NH3 (9/1) a 75DCM:25MeOH/NH;3 (9/1)) para pro- duzir 10 mg de 1.47 como um óleo vermelho, Rendimento de 39 %.
Exemplo |.
[00398] Em um frasco sob N, foi adicionado ácido 6-(5-cloro-1,1- dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoico (exemplo 1) (7,86 mg, 0,028 mmol) em DCM (1 mL) e DMF (10 ul). A mistura foi resfriada a 0 ºC, em seguida cloreto de oxalila (7,28 ul, 0,085 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e foi agitada até a conversão completa ser observada por LCMS (acompanhamento por LCMS por adição à alíquota de MeOH seco para formar o éster metílico). A mistura crua foi evaporada sob vácuo. O resíduo foi em- pregado em DCM e secado novamente sob vácuo para produzir clore- to de 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hnexanoíila como um sólido amarelo (rendimento quantitativo). O material bruto foi usado sem purificação adicional para a próxima etapa.
[00399] Em um frasco sob N, em temperatura ambiente foi introdu- zido o produto 1.47 (10 mg, 0,0086 mmol) em DCM (2 mL). A mistura foi resfriada a O ºC e DIPEA (6,0 ul, 0,034 mmol) foi adicionado. A mis- tura foi agitada a O ºC durante 10 min, em seguida, adição do produto anterior (3,90 mg, 0,013 mmol) diluído em DCM (1 mL). A mistura foi então agitada a O ºC durante 2h (até a conversão completa ser obser- vada por LCMS). O produto bruto foi concentrado em vácuo e purifica- do por cromatografia de coluna automática, sílica gel (100DCM:0 MeOH a 85DCM:15MeOH) para produzir 2,45 mg do exemplo | como um sólido vermelho, 19 % de rendimento.
[00400] O espectro de *H-RMN deste conjugado fármaco-ligante é representado na Figura 9. Exemplo J.
TV
N cl "s do
COCO
COCO MTC A AX ; o O o 70 O OH O, | o O. o 'OMe
[00401] O Exemplo J foi sintetizado de acordo com a seguinte via sintética:
o OH o o À o F. Í F COCORF: Yv IA + mA No 2X 2 O OM ô,. K A Y
1.52 153 ow.
OH Cx» | Ty LIA,
COS YIN SAX IVC 5 o Apoie - 1.54 ow | Morfolina o ow of o 4 rs COCO TI AAA, A oõó “O 1.55 *Y TT" s o. Lowe o 16 o é TR ão E o e XL uv SOPOnaaanaeNTs DADOS & ; TÁ ow
[00402] O Composto 1.50 foi preparado de acordo com a seguinte via sintética:
oe po mm 50 a 90 Õ “ PS 148 DIPEA A 149 et A a 20 TEA, tolueno e 1.50 oa Composto 1.48:
[00403] Em um frasco sob argônio foram adicionados 2-([1,1"- bifenil]-4-il)propan-2-ol (1 g, 4,71 mmol) e piridina (0,465 mL, 5,75 mmol) em DCM (5 mL) . Em seguida, a mistura foi resfriada a 0 ºC e cloroformiato de fenila (0,662 mL, 5,28 mmol) em DCM seco (2,4 mL) foi adicionado gota a gota. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 18 h (verificação por LCMS). O produto bruto foi concentrado em vácuo. A mistura sólida foi dissol- vida em DCM e lavada com salmoura 3 vezes. A camada orgânica foi secada em Na>SO:, filtrada e concentrada em vácuo para produzir o composto 1.48 desejado, Rendimento 880 mg, 56 % como um sólido branco. LCMS (ESI): 333,40 (MH +). Composto 1.49:
[00404] Em um frasco sob argônio contendo N,N'-dimetil-1,2-eta- nodiamina (2791 ul, 26,2 mmol), N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (305 ul, 1,748 mmol) e DMF (4 mL), uma solução de fenil carbonato de 2-([1,1'-bifenil]-4-il)Dropan-2-ila (581 mg, 1,748 mmol) em DMF (1,5 mL) foi adicionada a O ºC. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 24 h (verificação por LCMS). O produto bruto foi concentrado em vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna automática (Interchim, depósito sólido): DCM/MeOH: 9/1. As porções desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o composto 1.49 desejado, Rendimento 433 mg, 76 %
como óleo amarelo. LCMS (ESI): 327,43 (MH+). Composto 1.50:
[00405] Em um frasco sob argônio contendo bis(triclorometil) car- bonato (157 mg, 0,531 mmol) e tolueno (4,3 mL), uma solução de 2- ([1,1'-bifenil]-4-il)propan-2-il metil / (2-(metilamino)etil)carbamato (433 mg, 1,326 mmol) e trietilamina (368 ul, 2,65 mmol) em tolueno (2,9 mL) foram adicionados a O ºC. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 1 h (verificação por LCMS). A solução foi filtrada, e o solvente foi concentrado em vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna automática (Inter- chim, depósito sólido): ciclo-hexano/acetato de etila: 7/3. As frações desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o composto
1.50 desejado, Rendimento de 166 mg, 33 % como um sólido branco. LCMS (ES): 405,60 (MH+).
[00406] O Composto |.52 foi preparado de acordo com a seguinte via sintética: AA do O rs di do O ão
A SA OS do NoPXoMe | DMAP, DCM AAA do AX A SODOcCA: oO >oMMove | CI;CHCOOH, DCM 9 om o | COOSSE Ar o o & “e 152
NO Dove Composto 1.51:
[00407] Em um frasco sob argônio contendo (8S,10S)-6,8,11-tri- hidróxi-8-(2-hidroxiacetil)-1-metóxi-10-(((18,3R,4aS,98S,9aR,10aS)- 9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5]Joxazolo[2,3-c][1,4] oxazin-3-il)Óxi)-7,8,9,10-tetra-hidrotetraceno-5,12-diona (50 mg, 0,078 mmol), 4-dimetilaminopiridina (47,6 mg, 0,390 mmol), peneiras moleculares de 0,4 nm (33 mg) e DOM (1mL), uma solução de 2-([1,1*- bifenil]-4-il)propan-2-il — (2-((clorocarbonil)(metil)amino)etil)(metil) carbamato (91 mg, 0,234 mmol)) em DCM (0,5mL) foi adicionada. Es- ta mistura foi agitada no escuro a 25 ºC durante 5 dias. A solução foi filtrada, e o solvente foi concentrado em vácuo, e o resíduo foi usado sem purificação adicional na etapa seguinte. Composto 1.52:
[00408] A uma solução do produto 1.51 em DCM (1 mL) em banho de gelo, foi adicionada uma solução de ácido dicloroacético (96 ul, 1,169 mmol) em 0,5 mL de DCM. A solução foi agitada em temperatu- ra ambiente por 2 h. O solvente foi concentrado em vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna automática (Interchim, depó- sito sólido): DOM/MeOH: 9/1. As porções desejadas foram concentra- das em vácuo para produzir o composto 1.52 desejado, Rendimento 13 mg, 22 % como sólido vermelho. LCMS (ESI): 756,76 (MH+). Composto 1.53:
[00409] Em um frasco sob argônio foram adicionados ((S)-1-(((S)-1- ((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)»amino)-3-metil-1- oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metil (250 mg, 0,485 mmol), bis(perfluorofenil)carbonato (382 mg, 0,970 mmol) e DMF (4 mL). Em seguida, a mistura foi resfriada a O ºC e N-etil-N- isopropilpropan-2-amina (127 ul, 0,727 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 2 h (verificação por LCMS). O produto bruto foi con- centrado em vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna automática (Interchim, depósito sólido): DOM/MeOH: 9/1. As porções desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o composto 1.53 desejado, Rendimento 281 mg, 80 % como um óleo amarelo. LCMS (ESI): 726,65 (MH+). Composto 1.54:
[00410] Em um frasco sob argônio foram adicionados metil(2- (metilamino)etil)carbamato de 2-0x0-2-((28,4S)-2,5,12-tri-hidróxi-7- metóxi-4-(((18,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metóxi-1-metilocta-hidro- 1H-pirano[4',3':4,5]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il)óxi)-6,11-dioxo- 1,2,3,4,6,11-hexa-hidrotetracen-2-il)etil (78 mg, 0,103 mmol), 1- hidroxibenzotriazol (27,9 mg, 0,206 mmol), N,N'-diisopropiletilamina (35,1 ul, 0,206 mmol) e DMF (2 mL). Em seguida, a mistura foi resfíria- da a 0 ºC e ((S)-3-metil-1-0x0-1-(((S)-1-0x0-1-((4-((((perfluorofenóxi) carbonil)óxi)metil)fenil)amino)propan-2-il)amino)butan-2-il)carba- mato de (9H-fluoren-9-il)metila (112 mg, 0,155 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambien- te e agitada durante 2 h (verificação por LCMS). O produto bruto foi concentrado em vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatogra- fia de coluna automática (Interchim, depósito sólido): DOM/MeOH: 9/1. As porções desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o composto 1.54 desejado, Rendimento de 77 mg, 58 % como óleo vermelho. LCMS (ESI): 1298,0 (MH+). Composto 1.55:
[00411] Em um frasco sob argônio foram adicionados etano-1,2- diilbis(metilcarbamato) de 4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il) metóxi) carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil (2-0x0-2- ((28,48)-2,5,12-tri-hidróxi-7-metóxi-4-(((18,3R,4aS,98,9aR,10aS)-9- metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5]Joxazolo[2,3-c][1,4] oxazin-3-il)Óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa-hidrotetracen-2-il) eti- la) (77,7 mg, 0,060 mmol) e DMF (2 mL). Em seguida, a mistura foi resfriada a O ºC e morfolina (259 ul, 2,99 mmol) foi adicionada gota a gota. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 2 h (verificação por LCMS). O produto bruto foi con- centrado em vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna automática (Interchim, depósito sólido): DOM/MeOH: 9/1. As porções desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o composto 1.55 desejado, Rendimento de 32 mg, 50 % como óleo vermelho. LCMS (ESI): 1075,80 (MH+). Exemplo J:
[00412] Em um frasco sob argônio a 25 ºC foram introduzidos 4- ((8)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)benzil (2-0xo- 2-((28,48)-2,5,12-tri-hidróxi-7-metóxi-4-(((18,3R,4aS,98,9aR,10aS)- 9-metóxi-1-metilocta-hidro-1H-pirano[4',3':4,5]Joxazolo[2,3-c][1,4] oxazin-3-il)Óxi)-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexa-hidrotetracen-2-il)etil) etano-1,2-diilbis(metilcarbamato) (32 mg, 0,030 mmol, 1 eq) em di- clorometano (2 mL). A mistura foi resfriada a O ºC e foi adicionada N- etil-N-isopropilpropan-2-amina (20,74 ul, 0,119 mmol). A mistura foi agitada a O ºC durante 10 min, em seguida, adição do Exemplo 16 diluído em diclorometano (2 mL). A mistura foi então agitada a 0 ºC durante 2h (até a conversão completa ser observada por LCMS). O produto em bruto foi concentrado em vácuo e purificado por cromato- grafia de coluna automática (Interchim, 129, depósito sólido): DCM/MeOH: 9/1. As porções desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o Exemplo J desejado (também denominado compos- to F562646), Rendimento 17,4 mg, 40 % como óleo vermelho. LCMS (ESI): 1338,41 (MH+).
[00413] O espectro de massa deste conjugado fármaco-ligante é representado na Figura 21.
Exemplo K.
À do o H Z À e DX o | dt ". J N. S. NO AN so + TX A N 6 co O%
[00414] O Exemplo K foi sintetizado de acordo com a seguinte via sintética:
À À Foo 2 2 a oH P o A o TRL SEA Meda
ET SO VTC AA Gu IE TEO am e > em FE Xe so Me da no OT EX x << && o —r > ed TS Jus TT << Ls A Ne Y fr A W x Da a. f” A o E ” ' ta. & ” - ' AL d o a E Ão . $ Da Ya FX do, FM o Tr Iecsdaa o RASSSSSSS. Composto 1.56:
[00415] Em um frasco sob argônio foi adicionado material de partida SM1 (100 mg, 0,135 mmol) e DMF (1 ml). A mistura foi resfriada a O ºC, em seguida, uma solução de ácido 3-bromopropanoico (22,79 mg, 0,149 mmol) e 2,3,4,6,7,8,9,10-octa-hidropirimido[1,2-aJazepina (40,5 ul, 0,271 mmol) em DMF (0,5 mL) foi adicionado gota a gota. Em se-
guida, a mistura foi aquecida em temperatura ambiente e foi agitada até a conversão completa ser observada por LCMS. O produto bruto foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna au- tomática (Interchim, 12 g, depósito sólido): DOM/MeOH: 80/20. As por- ções desejadas foram concentradas em vácuo para produzir o com- posto 1.56 desejado, Rendimento 108 mg, 98 % como um sólido bran- co. LCMS (ESI): 811,35 (MH+). Composto 1.57:
[00416] Em um frasco sob argônio foram adicionados o composto
1.56 (87,0 mg, 0,107 mmol) e DCM (2 mL). Em seguida, a mistura foi resfriada a O ºC, N-hidroxissuccinimida (13,59 mg, 0,118 mmol) e clo- ridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (30,9 mg, 0,161 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi aquecida em tempe- ratura ambiente e agitada durante 2 h (CHECK LCMS). O produto bru- to foi concentrado em vácuo. O material bruto foi usado sem purifica- ção adicional para a próxima etapa. Composto 1.58:
[00417] Em um frasco sob argônio foi adicionado o composto 1.57 (97 mg, 0,107 mmol) e DCM (1 mL), em seguida, uma solução do com- posto 1.49 em 1 mL de DCM e N N'-diisopropiletilamina (37,3 ul, 0,214 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada até a conversão completa ser observada por LCMS. O produto bruto foi concentrado em vácuo e usado sem purificação adicional para a próxima etapa. Composto 1.59:
[00418] Em um frasco sob argônio foi adicionado o composto 1.58 (58 mg, 0,052 mmol) e DCM (1 mL). A mistura foi resfriada a 0 ºC, em seguida ácido dicloroacético (86 ul, 1,037 mmol) foi adicionado gota a gota. Em seguida, a mistura foi aquecida em temperatura ambiente e foi agitada até a conversão completa ser observada por LCMS. O pro- duto bruto foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna automática (Interchim, 12g, depósito sólido: DCM/MeOH: 80/20. As porções desejadas foram concentradas em vácuo para pro- duzir o composto 1.59 desejado, Rendimento 39 mg, 86 % como um sólido branco. LCMS (ESI): 882,6 (MH+). Exemplo K:
[00419] Em um frasco sob argônio a 25 ºC foi introduzido o com- posto 1.59 em diclorometano (1 mL). A mistura foi resfriada a 0 ºC e N- etil-N-isopropilpropan-2-amina (15,83 ul, 0,091 mmol) foi adicionada. À mistura foi agitada a O ºC durante 10 min, em seguida, adição do Exemplo 16 diluído em diclorometano (2 mL). A mistura foi então agi- tada a O º*C durante 2h (até a conversão completa ser observada por LCMS). O produto em bruto foi concentrado em vácuo e purificado por HPLC preparativa (condições HCOOH) para produzir o Exemplo K desejado, Rendimento de 6 mg, 22 % como um sólido branco. LCMS (ESI): 1165,37 (M + Na) +.
[00420] O espectro de massa, e o espectro de TOF-MS deste con- jugado fármaco-ligante são representados respectivamente nas Figu- ras 22A e 22B.
3. Conjugação com Somatostatina VI1. Reação da Somatostatina com 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-ox0iso- tiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe bo, gd & ” í =[— AT | HO-Cys -Ser-Thr-Phe-Thr PA | yr Bro O HO-Cys “sermnePhe-lhe Fórmula Química: CoH123N19022S2 » 9 ' o08n Massa Exata ;: 1909,853
CEA o Tampão (NaH2PO, 20 mM, pH=8), 40% MeCN, 2,5% DMF), 37º*C
[00421] 1mgde somatostatina liofilizada (Mexata = 1636,72) foi solu-
bilizado em 4 mL de tampão (57,5 % de NaH2PO, 20 mM, pH 6,5, 40 % de ACN, 2,5 % de DMF) para produzir uma concentração de 153 UM (0,25 mg/mL). 33,5 mg de TCEP foram dissolvidos em 4 mL de tampão (57,5 % de NaH2PO. 20 mM, pH 6,5, 40 % de ACN, 2,5 % de DMF). A 300 uL de solução de somatostatina (1 eq.) foram adiciona- dos 3 ul de solução de TCEP (1,1 eq.). A solução é agitada a 37 ºC durante 1 h. Somatostatina comercial: Rt1 (em ACN): 1,57; MS ES+: M*3/3 = 546,4, M*2/2 = 819,2. Somatostatina com ligação dissulfeto reduzida: Ri (em ACN): 1,50; MS ES+: M*3/3 = 547,2, M*2/2 = 820,3. mg de 6-(5-cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila (1.6) foram solubilizados em 800 ul de ACN. 3 ul de 6-(5- cloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)-il)hexanoato de benzila (1,1 eq.) em solução foram adicionados à solução de somatostatina. A so- lução foi agitada em 37ºC. Ri. (em ACN): 1,66; MS ES+: M*3/3 = 637,6, M*2/2 = 956,0.
[00422] A mesma reação foi realizada em tampão pH 8 (57,5 % de NaH2PO, 20 mM, pH 8, 40 % de ACN, 2,5 % de DMF).
[00423] O espectro de massa do conjugado obtido é representado na Figura 10. VI2. Reação da somatostatina com 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3- oxoisotiazol-2(3H)-il)nexanoato de benzila: ao os ts AsneneTio asas. SH Trp 2? o Í Tp HO-Cys -Ser-Thr-Phe-Thr Pa | Ly Bno > OH-Cys sermn-ene-hr 1 C Fórmula Química: CoaH12,N19022S, o Massa Exata: 1907,837 2) LDO co Tampãeo (NaH2PO, 20 mM, pH=8), 40% MeCN, 2,5% DMF), 37ºC
[00424] 1mgde somatostatina liofilizada (Mexata = 1636,72) foi solu-
bilizado em 4 mL de tampão (57,5 % de NaH2PO, 20 mM, pH 6,5, 40 % de ACN, 2,5 % de DMF) para produzir uma concentração de 153 UM (0,25 mg/mL). 33,5 mg de TCEP foram dissolvidos em 4 mL de tampão (57,5 % de NaH2PO. 20 mM, pH 6,5, 40 % de ACN, 2,5 % de DMF). A 300 uL de solução de somatostatina (1 eq.) foram adiciona- dos 3 ul de solução de TCEP (1,1 eq.). A solução é agitada a 37 ºC durante 1 h. Somatostatina comercial: Rt1 (em ACN): 1,57; MS ES+: M*3/3 = 546,4, M*2/2 = 819,2. Somatostatina com ligação dissulfeto reduzida: Ri (em ACN): 1,50; MS ES+: M*3/3 = 547,2, M*2/2 = 820,3. 5,4 mg de 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoato de benzila (1.7) foram solubilizados em 800 ul de ACN. 3 ul de benzil 6-(4,5-dicloro-1,1-dióxido-3-oxoisotiazol-2(3H)- il)hexanoato (1,1 eq.) em solução foram adicionados à solução de so- matostatina. A solução foi agitada a 37ºC. Ru (em ACN): 1,65; MS ES+: M*3/3 = 637,3, M*2/2 = 955,5.
[00425] A mesma reação foi realizada em tampão pH 8 (57,5 % de NaH2PO, 20 mM, pH 8, 40 % de ACN, 2,5 % de DMF).
[00426] O espectro de massa do conjugado obtido é representado na Figura 11.
4. Conjugação com Anticorpos monoclonais
4.1. Síntese, purificação e caracterização de ADC
[00427] O procedimento descrito abaixo aplica-se às formas IgG quimérica, humanizada e humana. Deve ser entendido que para quaisquer outras formas, como IgG2, IgG4, etc., a pessoa versada na técnica seria capaz de adaptar este procedimento usando o conheci- mento geral.
[00428] O anticorpo Abi é um anticorpo monoclional anti-|GF1IR IgG1. Este anticorpo corresponde ao anticorpo 208F2 de WO2015 162291 (veja, tabela 3, página 36) para o qual as três CDRs de cadeia leve têm sequências SEQ ID Nos. 9, 5 e 11; as três CDRs de cadeia pesada têm sequências SEQ ID Nos. 7, 2 e 3; o domínio variável de cadeia leve tem a sequência SEQ ID No. 18; e o domínio variável de cadeia pesada tem a sequência SEQ ID No. 13.
[00429] O anticorpo Ab2 é um anticorpo quimérico irrelevante (I9G1) direcionado a uma proteína bacteriana, que é a proteína A da membrana externa de E. coli, e chamada c9G4 (Haeuw JF e Beck A. Proteomics for development of immunotherapies, In Proteomics: Bio- medical and Pharmaceutical Applications, Kluwer Academic Publis- hers, Ed. Hondermarck H., 2014, páginas 243-278; WO2015162291).
[00430] Os anticorpos (1-5 mg/ml) foram parcialmente reduzidos com cloridrato de TCEP em tampão de borato 10 mM pH 8,4 contendo NaCl 150 mM e EDTA 2 mM durante 2-4 horas a 37 ºC. Normalmente, 6-20 equivalentes molares de TCEP foram usados para direcionar um DAR de cerca de 4. A redução parcial do anticorpo foi confirmada por análise por SDS-PAGE em condições não redutoras. A concentração de anticorpo foi então ajustada para 1 mg/ml com tampão de borato 10 mM pH 8,4 contendo NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, sacarose 6 % e um excesso molar de 5-20 de conjugado fármaco-ligante ao anticorpo foi adicionado a partir de uma solução 10 mM em DMSO. Sete exemplos de conjugado fármaco-ligante de acordo com a invenção foram aco- plados a Ab1: - Exemplo A e Exemplo B dando respectivamente ADC1-A e ADC1-B (ligantes não cliváveis); - Exemplo C, Exemplo D, Exemplo E, Exemplo F e Exemplo G dando respectivamente ADC1-C, ADC1-D, ADC1-E, ADC1-F e ADC1-G (ligantes cliváveis).
[00431] A concentração final de DMSO foi ajustada para 10 % para manter a solubilidade do fármaco no meio aquoso durante o acopla- mento. A reação foi realizada durante 1-4 h em temperatura ambiente ou 37 ºC. O excesso de fármaco foi extinto pela adição de 2,5 mols de
N-acetilcisteína por mol de fármaco e incubação por 1 h em temperatu- ra ambiente. Após diálise contra tampão His 25 mM pH 6,5 contendo NaCl 150 mM e sacarose 6 % durante a noite a 4 ºC, os conjugados anticorpo-fármaco religados com ponte foram purificados usando mé- todos conhecidos pelos versados na técnica com colunas comerciais de cromatografia e unidades de ultrafiltração. Os ADCs purificados fo- ram armazenados a 4 ºC após filtração estéril em filtro de 0,2 um.
[00432] Eles foram ainda analisados por SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras para confirmar a conjugação do fármaco e por SEC em coluna analítica TSK G3000 SWXL para determinar o teor de monômeros e formas agregadas. O conteúdo das formas agrega- das deduzidas dos cromatogramas SEC (Figura 13) foi inferior a 5 %, conforme mostrado na Tabela 9. Tabela 9. Conteúdo de formulários agregados 8 es — era ag — [Aereas —
[00433] As análises de SDS-PAGE confirmam a formação do anti- corpo H2L2 totalmente ligados em ponte (Figura 12). No entanto, ou- tras espécies (H2L, H2 e HL), correspondendo ao anticorpo parcial- mente ligados em ponte, também foram detectadas. É importante no- tar que essas espécies eram visíveis quando as amostras foram trata- das termicamente em condições de redução antes da execução para garantir a dissociação completa das cadeias pesadas e leves (He L),
não conectadas por uma ponte intercadeia intacta.
[00434] As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio BCA com IgG como padrão. O DAR foi estimado para cada ADC purificado por HIC usando uma coluna TSK-Butil-NPR. Foi com- preendida entre 3,5 e 4,3 (Tabela 10). Os perfis de HIC revelaram que nenhum DARO e um pico principal de DAR 4 foram observados para a maioria dos ADCs sintetizados. Na verdade, apenas ADC1-C e E mos- tram vestígios de DARO. Além disso, para ADC1-A, B, C e G apenas DAR3, DAR4 e DARS5 foram observados. Exceto para ADC1-D, o pico principal é um DAR4. Compare com um ADC de segunda geração, esses ADCs são mais homogêneos, conforme mostrado na Tabela 10. Tabela 10. Distribuição de DAR estimada por HIC usando uma coluna TSK-Butil-NPR DAR % DARO | DARI DAR2 DAR3 DAR4 DARS DARG6 DAR7 DARS Adcetris 6,0 1.34 25.2 3.7 32.9 o 22.5 15 69 ADCI-A o o o o 64.9 351 o o o ADCL-B o o o 39.8 47.6 12.5 o o o ADCI-C 06 1.0 0.8 8.2 63.1 26.3 o o o ADCI-D o o o 44,6 39.5 10.6 3,8 18 o ADCLI-E 21 4.5 4.0 11.9 56.3 211 o o o ADCL-F o o.5 32 226 737 o o o o ADC1I-G o1 0.4 2.6 18.6 68.1 10.2 o o o
[00435] —Adcetris& (brentuximabe vedotina) tem sido usado como referência, uma vez que usa um ligante maleimida de segunda gera- ção conjugado às cisteínas do anticorpo. É o melhor exemplo repre- sentativo de ADC de segunda geração; a tecnologia descrita nesta demanda pode ser considerada de terceira geração.
4.2. Análise de ADC por espectrometria de massa nativa
[00436] Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma- Aldrich: acetato de amônio (A1542), iodeto de césio (21004), 2-
propanol (19516). A enzima IgGZERO (A0-IZ1-010) foi obtida da Ge- novis. Soluções aquosas foram preparadas usando um sistema de água ultra-pura (Sartorius, Gôóttingen, Germany).
[00437] —ADCI1-A a ADC1-G foram desglicosilados antes dos expe- rimentos de MS nativos. Isso foi realizado incubando uma unidade de IgGZERO por micrograma de ADC por 30 min a 37 ºC. Em seguida, os ADCs foram trocados por tampão contra uma solução de acetato de amônio 150 mM (pH 6,9) usando seis ciclos de concentração/diluição usando um microconcentrador (Vivaspin, cutoff de 10 kD, Sartorius, Góttingen, Germany). A concentração de proteína foi determinada por absorbância de UV usando um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, France). A espectrometria de massa não desnaturan- te (nativa) de ADCs foi realizada em um espectrômetro de massa Q- TOF (Synapt G2 HDMS, Waters, Manchester, UK) operando no modo de íon positivo, ambos acoplados a um dispositivo de nanoeletrovapo- rização baseado em chip automatizado (Triversa Nanomato, Advion, Itaca, USA). As análises foram realizadas no intervalo de m/z 1000-10
000. As amostras foram diluídas em 150 mM de NH.OAc a pH 6,9 e infundidas a 10 UM. A calibração externa foi realizada usando íons com carga única produzidos por uma solução de iodeto de césio a 2 g/L em 2-propanol/água (50/50 v/v).
[00438] A voltagem do nanoeletrovaporização foi ajustada em 1,75 kV, e o nanofluxo de nitrogênio em 0,053 kg/cm? (0,75 psi). A voltagem do cone foi ajustada para 180 volts, e a pressão de apoio para 6 mbar.
[00439] A Figura 14 apresenta exemplos de espectro de MS não deconvoluído.
[00440] A distribuição de DAR (Figura 15) foi determinada após a deconvolução usando o algoritmo MaxEnt"y de Mass Lynx 4,1 (Wa- ters, Manchester, Reino Unido). Os parâmetros do software foram oti- mizados para cada espectro.
[00441] Os valores médios de DAR (Figura 15) foram calculados usando a seguinte equação (onde j é o número máximo de carga de fármaco). e É * intensidade Di DAR = Ea,
[00442] Os resultados foram derivados das intensidades de pico relativas de cada estado de carga no espectro bruto e são apresenta- dos na Tabela 11 abaixo. Tabela 11. Distribuição de DAR calculada usando o algoritmo Ma- xEnt'!V do Mass Lynx 4.1 pes Ta e) pe rr E ese
[00443] A Figura 16 compara a distribuição de DAR, determinada a partir de espectros crus após a deconvolução em massa, para 2 ADCs diferentes, ou seja: - ADC1-C de acordo com a invenção preparado a partir do anticorpo Ab1, e o conjugado fármaco-ligante C (Fig. 16B) e - um ADC Ref-A de referência que é um ADC comparativo sintetizado a partir do mesmo anticorpo (Ab1) e de um conjugado fár- maco-ligante correspondente ao conjugado fármaco-ligante C no qual
CI NV q a porção sulfomaleimida ( P ) foi substituída por uma porção ma- Oo & leimida( O (Fig. 16A).
[00444] “Uma distribuição heterogênea de DAR O a DAR 8 é obser-
vada para o ADC sintetizado usando a química clássica da maleimida para ligar o fármaco ao anticorpo (Fig. 16A), enquanto o ADC gerado pelo uso da química da sulfomaleimida de acordo com a invenção é altamente homogêneo com 75 % de DAR 4 e nenhuma DAR 0/2 e 6/8 espécies (Fig. 16B). Esses resultados estão resumidos na Tabela 12 abaixo. Tabela 12. Distribuição de DAR calculada usando o algoritmo Ma- xEnt'!V do Mass Lynx 4.1 pesa a po
4.3. Estudo de estabilidade in vitro de ADCs em 4 soros de mamí- feros usando um método de Ensaio de Ligação de Ligante
[00445] Para estabelecer o ganho de estabilidade, um estudo de estabilidade in vitro foi conduzido. Consiste na incubação dos ADCs a 37 ºC por um período de 14 dias. As amostras foram coletadas no dia O, 3, 7 e 14. As várias amostras (DO, D3, D7 e D14) foram então anali- sadas por LBA para determinar a concentração de anticorpo total ver- sus a concentração de ADC. Na prática, uma solução de cada ADC é preparada a 100 pg/ml em 4 soros (humano, cinomolgo, camundongo e rato) e incubada a 37 ºC por um máximo de 14 dias. Em seguida, as alíquotas são coletadas em DO, D3, D7 e D14, e armazenadas a -80 ºC até a dosagem. Para a quantificação total de Ab e ADC, as placas são descongeladas em temperatura ambiente com agitação e ambos os ensaios LBA são executados em paralelo. Resumidamente, placas de microtitulação padrão (MSD, Gaitersburg, USA) são revestidas usando 50 ul de uma solução de anticorpo anti-His a 2 ug/ml prepara- da em PBS 1x. Após uma incubação durante a noite a 4 ºC, as placas de ensaio são tratadas com tampão de bloqueio (Bloqueador A MSD 3 % (MSD, Gaitersburg, USA)) durante 1 hora a 37 ºC. Em seguida, o antígeno marcado com His recombinante é adicionado durante 1 hora a 37 “C na concentração de 2,5 ug/ml em tampão de ensaio. Após uma etapa de lavagem, as amostras são analisadas como duplicatas na diluição de 1/5000 º e incubadas por 1 hora a 37 ºC enquanto os ADCs padrão são carregados em duplicata na placa de ensaio. A eta- pa de detecção é realizada usando uma solução de marcador sulfo de lg Capa de cabra anti-humana a 1 pg/ml para a detecção de Ab total ou um anticorpo monoclonal anti-fármaco de camundongo marcado com marcador sulfo para detecção de ADC. Após um período de incu- bação de 1 hora a 37 ºC, a detecção é realizada usando 150 ul de um tampão T de leitura MSD 2x contendo tensoativo (MSD, Gaitersburg, USA) imediatamente antes da leitura usando o MSD Sector Imager.
[00446] As concentrações totais de anticorpos e ADC são determi- nadas em cada ponto de tempo e transformadas em porcentagem, considerando 100 % como a quantidade de ADCs ou anticorpos totais em cada ponto de tempo.
[00447] Os dados são ilustrados nas Figuras 17A, 17B e 17C para 3 ADCs: ADC1-C (Fig. 17B) e ADC1-E (Fig. 17C) em que o fármaco foi ligado ao anticorpo Ab1 usando a química da sulfomaleimida de acor- do com a invenção (por meio do conjugado fármaco-ligante C ou E, respectivamente), em comparação com um ADC Ref-B de referência em que o fármaco foi ligado ao anticorpo usando uma química clássica de maleimida (Fig. 17A). g | e E OO e,
OQ OMEÊ o TD O: oH
Porção de ligação de fármaco usada para preparar ADC Ref-B de refe- rência
[00448] “Como um comparador, um fármaco-ligante usando a mes- ma carga útil e um ligante não clivável foi escolhido (fármaco-ligante de ADC Ref-B). Foi conjugado ao mesmo anticorpo usando uma quí- mica de maleimida. A escolha deste comparador limita "a instabilidade" do ADC de referência no soro por desconjugação do anticorpo por meio de uma reação retro-Michael. Em comparação com nossas cons- truções baseadas em um ligante clivável, este comparador é, portanto, favorecido, o que torna a melhoria da estabilidade de nossos fármaco- ligantes ainda mais espetacular.
[00449] “Como esperado, uma diminuição na concentração de ADC é observada para o ADC sintetizado usando química de maleimida clássica (ADC Ref-B), enquanto os ADCs gerados usando química de sulfomaleimida de acordo com a invenção (ADC1-C e ADC1-E) são surpreendentemente muito mais estáveis ao longo o período de 14 di- as.
4.4. Citotoxicidade in vitro de ADCS
[00450] A citotoxicidade in vitro do ADC de acordo com a invenção foi avaliada. A fim de avaliar a citotoxicidade não específica, os com- postos também foram acoplados a um anticorpo quimérico irrelevante (Ab2), denominado c9G4, no mesmo DAR e usando os mesmos con- jugados fármaco-ligante para produzir ADC2-C com Exemplo C, ADC2- E com Exemplo E e ADC2-F com Exemplo F.
[00451] As células MCF-7 e NCI-H2122 foram semeadas em placas de 96 cavidades (2500 células por cavidade) em meio de crescimento completo. No dia seguinte, diluições em série dos ADCs testados fo- ram adicionadas às cavidades correspondentes e incubados a 37 ºC por 6 dias. Seis dias após a adição dos ADCs, um ensaio Cell Titer Glo (PROMEGA) foi realizado nas placas para verificar a viabilidade das células.
[00452] Os resultados obtidos, expressos em porcentagem de viabi- lidade, são mostrados nas Figuras 18A e 18B. Como esperado, os ADCs sintetizados com o anticorpo irrelevante mostraram nenhuma ou modesta atividade citotóxica em ambas as células MCF-7 e NCI- H2122. Por outro lado, os ADCs da invenção: ADC1-C, ADC1-E e ADC1-F diminuíram drasticamente a viabilidade celular. Valores de EC5so de 7,61,10-11, 7,16,10-11 e 3,64,10-11M foram obtidos para ADC1-C, ADC1-E e ADC1-F respectivamente em valores NCI-H2122 e EC50 de 1,04,10-11, 1, 33,10-11 e 7,39,10-11M foram obtidos para ADC1-C, ADC1-E e ADC1-F respectivamente em MCF7, indicando atividade citotóxica potente.
4.5. In Vivo
[00453] Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Pierre Fabre's Institutional Animal Care and use Committee.
[00454] Para o modelo de câncer de ovário, camundongos SCID fêmeas com 7 semanas de idade (Charles RIVER Laboratories) foram enxertados subcutaneamente com 10,10º células CaoV3 (6 animais por grupos).
[00455] O tratamento por administração intravenosa de ADC1-C de acordo com a invenção, ADC Ref-A de referência ou veículo ADC foi iniciado quando os tumores atingiram aproximadamente 150 mmº?. Os animais foram tratados com uma injeção (Q1d1) ou com 3 injeções (uma vez por semana) (Q7d3). O volume do tumor (comprimento x lar- gura x altura x 0,52) foi medido por paquímetro eletrônico pelo menos duas vezes por semana durante aproximadamente 25 dias após a pri- meira injeção. Os resultados são apresentados na Figura 19 (animais tratados em Q1d1) e na Figura 20 (animais tratados em Q7d3).
[00456] Como pode ser visto nas Figuras 19 e 20, os ADCs de acordo com a invenção têm uma grande eficácia com uma regressão completa do tumor, mesmo após uma única injeção.
5. Conjugação de derivados de PNU-159682 com anticorpos mo- noclonais
5.1. Síntese, purificação e caracterização de ADC
[00457] Dois derivados de PNU-159682, nomeadamente F562524 (exemplo J) e F562646 (exemplo H), foram acoplados aos anticorpos 208F2 (Ab1) e c9G4 (Ab2), nas condições previamente descritas no exemplo 4.208F2 (Ab1) e c9G4 (Ab2) são como descritos no exemplo
4. Resumidamente, os anticorpos (1-5 mg/ml) foram parcialmente re- duzidos com 6-20 equivalentes de cloridrato de TCEP em tampão de borato 10 mM pH 8,4 contendo NaCl 150 mM e EDTA 2 mM por 2-4 horas a 37 ºC. A concentração de anticorpo foi então ajustada para 1 mg/ml com tampão de borato 10 mM pH 8,4 contendo NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, sacarose 6 % e um excesso molar de 5-20 de conjugado fármaco-ligante ao anticorpo foi adicionado a partir de uma solução 10 mM em DMSO. A reação foi realizada durante 1-4 h em temperatura ambiente ou 37 ºC na presença de DMSO a 10 %. O excesso de fár- maco foi extinto pela adição de 2,5 mols de N-acetilcisteína por mol de fármaco e incubação por 1 h em temperatura ambiente. Após diálise contra tampão His 25 mM pH 6,5 contendo NaCl 150 mM e sacarose 6 % durante a noite a 4 ºC, os ADCs foram purificados por cromatografia ou ultrafiltração. As concentrações de ADC foram determinadas usan- do o ensaio BCA com IgG como padrão e os ADCs purificados foram armazenados a 4 ºC após filtração estéril em filtro de 0,2 uin.
[00458] Os ADCs foram ainda analisados por SDS-PAGE e SEC (coluna TSK G3000 SWXL), conforme descrito anteriormente no exemplo 4, para confirmar a conjugação, e a religação com ponte do fármaco e para determinar o teor de monômeros e agregados. O teor de monômeros era de cerca de 95 % (Figura 23 e tabela 13).
Tabela 13. Teor de monômeros
5.2 Análise de ADC por LC-MS nativa
[00459] Os ADCs foram analisados por cromatografia líquida- espectrometria de massa nativa em um sistema UPLC Acquity H Class Bio acoplado a um espectrômetro de massa Synapt G2Si (Waters). A separação por LC foi realizada em 2 colunas Polyhydroxyethyl A (Poli- LC, 150 x 1 mm, 300 A, 5 um) conectadas em série. As amostras fo- ram diluídas para 0,2 mg/ml com o tampão eluente (acetato de amônio 150 mM). Quatro ug de amostra foram injetados e eluídos a uma taxa de fluxo de 40 uL/min. O espectrômetro de massa foi operado em mo- do positivo com uma tensão capilar de 2,9 kV. O cone da amostra foi ajustado para 150 V. As análises foram realizadas na faixa de m/z 1000-8000 com um tempo de varredura de 1 seg. A Figura 24 mostra os espectros de m/z antes da deconvolução. A distribuição de DAR foi determinada após a deconvolução dos espectros de MS usando o al- goritmo MaxEnt'"Y do software Mass Lynx (Waters) (Figura 25). Os va- lores médios de DAR foram calculados usando a seguinte equação (onde j é o número máximo de carga de fármaco): (El, 1 * intensidade Di) DAR & =————————————> es intensidade Di
[00460] Os resultados são apresentados na Tabela 14 abaixo.
o foneo posa [oa [on one [048 [06 [nr [66 | vce asas O o de fe je de de e e e 11 21 41 F562524 ass E o e je e da e e a e 79 21 4,2 F562646 co nu 67 23 41 rasa [do Je de fe de de e de e se o o je e de e e e e) 82 18 4,2 F562646 Tabela 14. Análise de ADC por análise por LC-MS nativa: distribuição de DAR e DAR média
5.3. Estabilidade in vitro
[00461] O ADC hz208F2-F562524 foi incubado a 200 pug/mL em so- ro de cinomolgo a 37 ºC por um período de 14 dias. As amostras fo- ram coletadas nos dias 0, 3, 7 e 14 e armazenadas a -80 ºC até a aná- lise por LC-MS para determinar a DAR média.
[00462] Antes da análise por LC-MS, as amostras foram imunopuri- ficadas usando contas magnéticas de estreptavidina (M-280, Invitro- gen) revestidas com um conjugado de IgG-Biotina anti-humano Captu- re Select (Life Technologies, 8 ug de anticorpo/200 uL de contas). As amostras foram incubadas com as contas revestidas com anti-lgG du- rante 2 h em temperatura ambiente (100 ul de amostra/200 uL de con- tas) antes da eluição ácida com 40 uL de ácido trifluoroacético a 0,4 %. O pH foi aumentado pela adição de 4 ul de uma solução 3 M Tris/HCL pH 8,8. As amostras imunopurificadas foram incubadas com 2 ul de IgGZero durante 30 minutos a 37 ºC antes da análise por LC- MS em condições nativas como descrito acima. A distribuição de DAR foi determinada após a deconvolução dos espectros de MS usando o algoritmo MaxEnt"!"Y do software Mass Lynx (Waters), e os valores mé- dios de DAR foram calculados usando a seguinte equação (onde j é o número máximo de carga de fármaco):
DáRis (El-,51 * intensidade Di) E., intensidade Di
[00463] Os resultados são apresentados na Tabela 15 abaixo. O ADC hz208F2-F562524 mostrou ser altamente estável até 14 dias após a incubação in vitro em soro de cinomolgo. e e O a a A e a a o a e e a a a NA ee e o e RA o o o a Tabela 15. Estudo de estabilidade in vitro de hz208F2-F562524: distri- buição de DAR e DAR média
5.4 Citotoxicidade in vitro
[00464] A citotoxicidade dos ADCSs foi avaliada em células MCF-7 e NCI-H2122. As células foram colocadas em placas de 96 cavidades (2500 células por cavidade) em meio de crescimento completo. No dia seguinte, diluições em série dos ADCs testados foram adicionadas às cavidades correspondentes e incubados a 37 ºC por 6 dias. A viabili- dade celular foi determinada medindo ATP usando o kit Cell Titer Glo (Promega). A luminescência foi lida usando o leitor de placas Mithras da Berthold Company. Os resultados obtidos, expressos em porcenta- gem de viabilidade, são apresentados nas Figuras 26 e 27. A viabili- dade nas cavidades não tratadas foi considerada como 100 %.
[00465] “Como esperado, os ADCs hz208F2-F562524 e hz208F2- F562646 diminuíram drasticamente a viabilidade celular. Os valores de ECs5o de 2,48,10* e 1,92,102 M foram determinados em células NCI- H2122 para hz208F2-F562524 e hz208F2-F562646, respectivamente, e os valores de ECs5o de 5,86,10? e 9,45,103 M foram obtido em célu- las MCF-7 para hz208F2-F562524 e hz208F2-F562646, respectiva- mente, indicando atividade citotóxica potente. Por outro lado, os ADCs correspondentes sintetizados com o anticorpo irrelevante mostraram uma atividade citotóxica modesta em células MCF-7 e NCI-H2122.
5.5. Atividade antitumoral in vivo
[00466] “Camundongos SCID fêmeas com sete semanas de idade (Charles River Laboratories) foram enxertados subcutaneamente com
10.106 células Caov3 (6 animais por grupos). O tratamento por admi- nistração intravenosa (Q7d2) do ADC hz208F2-F562524 (0,3 mg/kg), o ADC controle correspondente c9G4-F562524 (0,3 mg/kg) ou o veículo foi iniciado quando os tumores atingiram aproximadamente 150 mm3. O volume do tumor (comprimento x largura x altura x 0,52) foi medido por paquímetro eletrônico duas vezes por semana durante aproxima- damente 50 dias após a primeira injeção. Os resultados são apresen- tados na Figura 28. Uma regressão tumoral completa pode ser obser- vada após 2 injeções do ADC hz208F2-F562524 enquanto nenhum efeito antitumoral foi observado com o ADC controle ou o veículo.
5.6. Conclusão
[00467] Os ADCs sintetizados com derivados de PNU-159682 usando a tecnologia de sulfomaleimida-ligante são altamente homogê- neos e estáveis no soro. Sua eficácia foi demonstrada em diferentes modelos in vitro e in vivo.
6. Conclusões Gerais
[00468] No geral, a tecnologia de ligante à base de sulfomaleimida descrita nesta invenção dá uma melhor estabilidade no plasma de dife- rentes espécies e uma melhor eficácia em modelos in vitro em compa- ração com ligantes à base de maleimida usuais usados para compos- tos no mercado, como Adcetris. Essas propriedades se traduziram em uma clara melhoria da eficácia in vivo em diferentes linhagens celula- res e mais notavelmente para linhagens celulares com uma expressão mais baixa do antígeno (CAOV3).
[00469] Uma melhor tolerabilidade também é esperada uma vez que os ADCs de acordo com a invenção são mais estáveis na circula- ção associados a uma eficácia melhorada e margem de segurança no tratamento humano.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Ligante caracterizado pelo fato de que apresenta a se- guinte fórmula (1): (9) Xi 89 Treo ao Xz o (O), ou um sal do mesmo, em que: — X1 e X> representam, independentemente um do outro, H, um átomo de halogênio, um (C1-Cs)alcóxi, um arilóxi opcionalmente substituído, ou -O-(CH2CH20)-H, contanto que X: e X2> não represen- tem H ao mesmo tempo; — L, representa um grupo de fórmula Ly'-(CO-Z')- com Ly sendo -(CH2)n-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>-, arileno, heteroarileno, cicloal- canodiila, -(CH2),-arileno-, -(CH2),-heteroarileno-, -(CH>2)n-cicloalcano- diil-, -arileno-(CH>2)p-, -heteroarileno-(CH2)p-, -cicloalcanodiil-(CH2),p-, - (CH>2)rn-arileno-(CH2),-, -(CH2),-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2),-cicloalca- nodiil-(CH2)p-, -(CH2CH20)n-CH2-CH>2-arileno-(CH2)y-, -(CH2CH20O)m- CH2-CH>-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-cicloalcanodiil- (CH2)p-, -(CH2),-arileno-CH2-CH2-(OCH2CH2a)m-, -(CH2)n-heteroarileno- CH2-CH2-(OCH2CHa)m-, ou -(CH2)n-cicloalcanodiil-CH2-CH2-(OCH2CH>2)m-; — cada W independentemente representa uma unidade de aminoácido; — Y é PAB-CO-(Z)--, com PAB sendo Du: o oxigênio da unidade de PAB sendo ligado a CO-(Z)z; — Z é -NR4-(CH2)J-NR5-,-NR4-(CH2)u-NR5-CO-, -NR1-(CH>).- NR5-CO-(CH2),-, ou -NRa-(CH2)J-NR5-CO-(CH2),-CO-, o grupo NR sendo ligado ao grupo CO de PAB-CO;
— Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2).-, o grupo NR, sendo ligado ao grupo CO de CO-Z';
— R1 e Rs são independentemente H ou um grupo (C1- Cse)alquila;
— cé 0 ou 1, preferivelmente, 1;
—- mé um número inteiro de 1 a 15;
— né um número inteiro de 1 a 6;
— pé um número inteiro de 1 a 6;
— gé 0,1 ou 2, preferivelmente, 2;
— ré um número inteiro de 1 a 24, notavelmente de 1 a 12;
—- ué um número inteiro de 1 a 6;
— vé um número inteiro de 1 a 6;
— wé um número inteiro de O a 5, preferivelmente, O ou 2;
— yéOoul;
—- zéOoul;
- zéOoutie
— Xa representa H quando y = z = 1 e Z é -NR4-(CH2)u-NRs5- ou quando c= w=y=0,2=1eZ é -NR+(CH2).-NRs5- e nos outros casos, X; representa OH, NH2 ou um grupo de saída, em que o grupo de saída é um átomo de halogênio, um sulfonato de fórmula -OSO>- Rue, N-succinimidilóxi, 4-nitro-fenilóxi, pentafluorofenóxi ou N-benzotri- azolóxi, R'e representando um grupo (C1-Cs)alquila, arila, aril-(C1-Cs6) alquila ou (C1-Cs)alquil-arila, o referido grupo sendo opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halogênio tais como átomos de flúor,
com a condição que não seja um composto de fórmula (1) para o qual:
-* Ss - XéCclXxéH gqéo0,Lié ,céO0,wéo,yé DeXxécCl; & XIÉ6C,X2é Cl, géo,Li16 E .céo,wéo,yé DeXxécCl; & - XI6ClX6H,géo, L1é é .céO,wéo,yé DeXxécCl; 1 Ho
O - X é Cl, X2é H, qé 0, Lt é ,céO,wéo, yéceXxécCl - XéClXéH qéo Lié / ,céO,wéo,yé DeXxécCl; - XéClXéH qéo Lié / ,céO,wéo,yé 0 eX:;é Br; - XéClXéH qéo Lié / ,céO,wéo,yé DOeXxél; 1 Ho
O - XxéH,X é Cl, qé 0, Li é ,céO,wéo,
yéceXxécCl 1 Ho O: - XxéH, XéBr,gqé 0, Li é ,céO0,wéo, yéceXxécCl - XxéH,XéBr,géO0,Lié / ,céO,wéo,yé DeXxécCl; : Ho
O - MéClXéClagéo, Lé ,céo,wéo, yéceXxécCl - XéC,XéClgéo, Lié / ,céO0,wéo,yé DeXxécCl; - X é Cl, X2é Cl, qé 0, Li é OD cs0ue0yso eXxécCl; : Ho O: — XéCl,X éBr,géO0,L1 é ,céO0,wéo, yéceXxécCl 1 Ho Ho Cc -C A + - XéCl X éBr, géO0, Li é ,céo,w é 0,yÉ6 0e X3 é CI; - XéCl,XéBr,gé 0,L1é / ,céO0,wéo,yé 0 e X;é CI; ou : Ho
O - X é Br, Xcé Br, qé 0, Ly é ,céO0,wéo, yéceXxécCl em que a linha tracejada indica o ponto de ligação de L: ao (9) Xi 89 x Xo átomo de nitrogênio de o e a linha ondulada indica o pon- to de ligação de L1 a Xz.
2. Ligante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a seguinte fórmula (la): x Seo IL rc am 00 “o (la) ou um sal do mesmo, em que: — X1, X2, Xa, L1, W, Y, ce w são como definidos na reivindicação 1, e — yé O quando w for O e y é O ou 1 quando w for um número inteiro de 1ao5.
3. Ligante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos X: ou X> representa um átomo de halo- gênio.
4. Ligante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos X: ou X> representa Br ou Cl.
5. Ligante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que um dentre X, e X> representa Br ou Cl e o outro grupo representa H, CI ou Br.
6. Ligante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que Ly' representa -(CH2)n-, -(CH2CH20 )m- CH2-CH>2-, arileno, -cicloalcanodiil-, -(CH>2),-arileno-, -arileno-(CH>2)»-, -
NAN Ou (CH>2)r-cicloalcanodiil-, -Cicloalcanodiil-(CH>2)»n-, ”, P NEN, NAN N=N AOS US a a — =N NH, O m Ou :
7. Ligante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que Ly' é -(CH2)n- ou -(CH2CH2O0 )m-CH2-CH2-, notavelmen- te -(CH2)n-, tal como -(CH>)s-.
8. Ligante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que cada W é selecionado a partir de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina, lisina protegida com acetila ou formila, arginina, arginina protegida com grupo(s) tosila ou nitro, histidina, ornitina, ornitina prote- gida com acetila ou formila, e citrulina.
9. Ligante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: — w=0 e (W), é uma ligação, ou - w=2e(W), é Val-Cit ou Val-Ala, preferivelmente, Val- Cit.
10. Ligante, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1,2e6a9, caracterizado pelo fato de que: — X1 e X7 são idênticos e são selecionados a partir de CI, Br, (C1-Ce6)alcóxi e um arilóxi opcionalmente substituído com um ou vários grupos selecionados a partir de halogênio, CN, NO> e um arilóxi opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halogênio tais como átomos de flúor, ou
7IN7 — um dentre X, e Xo é H e o outro é selecionado a partir de CI, Br, (C1-Ce6)alcóxi e um arilóxi opcionalmente substituído com um ou vários grupos selecionados a partir de halogênio, CN, NO> e um arilóxi opcionalmente substituído com um ou vários átomos de halogênio tais como átomos de flúor.
11. Ligante, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que X; é H quando y =z=1e Z é -NR+-(CH2)J-NR5- ou quando c = w=y=0,2=1eZ é -NR+- (CH2)/-NRs5- e nos outros casos, X; é OH, CI ou N-succinimidilóxi.
12. Conjugado ligante-fármaco caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (Il): x. (a Ki rico:-tm 0a “o (1), ou um sal do mesmo, em que: — X1 e X> representam, independentemente um do outro, H, um átomo de halogênio, um (C1-Cs)alcóxi, um arilóxi opcionalmente substituído, ou -O-(CH2CH20)-H, contanto que X: e X2> não represen- tem H ao mesmo tempo; — L, representa um grupo de fórmula Ly'-(CO-Z')- com Ly sendo -(CH2)n-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>-, arileno, heteroarileno, cicloal- canodiila, -(CH2),-arileno-, -(CH2),-heteroarileno-, -(CH>2)n-cicloalcano- diil-, -arileno-(CH>2)p-, -heteroarileno-(CH2)p-, -cicloalcanodiil-(CH2),p-, - (CH>2)rn-arileno-(CH2),-, -(CH2),-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2),-cicloalca- nodiil-(CH2)p-, -(CH2CH20)n-CH2-CH>2-arileno-(CH2)y-, -(CH2CH20O)m- CH2-CH>-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-cicloalcanodiil- (CH2)p-, -(CH2),-arileno-CH2-CH2-(OCH2CH2a)m-, -(CH2)n-heteroarileno- CH2-CH2-(OCH2CH>2)nm-, ou -(CH2),-cicloalcanodiil-CH2-CH2-(OCH2CH>2)m-; — cada W independentemente representa uma unidade de aminoácido;
— Y é PAB-CO-(Z)--, com PAB sendo Due: o oxigênio da unidade de PAB sendo ligado a CO-(Z)z; — Z é -NR+-(CH2)u-NR5-,-NR4-(CH2)u)-NR5-CO-, -NR4-(CH2)u- NR5-CO-(CH2),-, ou -NRa-(CH2)J-NR5-CO-(CH2),-CO-, o grupo NR sendo ligado ao grupo CO de PAB-CO; — Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2).-, o grupo NR, sendo ligado ao grupo CO de CO-Z'; — Ra e R5 são independentemente H ou um grupo (C1-Cs6) alquila; — Q representa uma porção de fármaco; — cé 0 ou 1, preferivelmente, 1; —- mé um número inteiro de 1 a 15; — né um número inteiro de 1 a 6; — pé um número inteiro de 1 a 6; — gé 0,1 ou 2, preferivelmente, 2; — ré um número inteiro de 1 a 24, notavelmente de 1 a 12; —- ué um número inteiro de 1 a 6; — vé um número inteiro de 1 a 6; — wé um número inteiro de O a 5, preferivelmente, O ou 2; — yéOoul; - zéOoutie - zéboul.
13. Conjugado ligante-fármaco, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizado pelo fato de que tem a seguinte fórmula (lla): x Ro KT prirea-m--a “ (Ia) ou um sal do mesmo, em que:
— X1, X2, Lat, W, Y, Q, ce w são como definidos na reivindi- cação 12, e — yé O quando w for O e y é O ou 1 quando w for um núme- ro inteiro de 1 a 5.
14. Conjugado ligante-fármaco, de acordo com a reivindica- ção 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que L1', W, w, X: e X> são como definidos em qualquer uma das reivindicações 3 a 10.
15. Conjugado ligante-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que Q é um resíduo de uma auristatina, uma antraciclina, camptotecina, SN-38, uma tubulisina, uma caliqueamicina, um maitansinoide, uma duocar- micina, uma amanitina, uma pirrolobenzodiazepina, ou um ativador do ponto de checagem imune tal como um resíduo de um estimulador de agonistas do gene de interferon (STING) ou um resíduo de um inibidor de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO).
16. Conjugado ligante-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que Q é: —- um resíduo de monometil auristatina F (MMAF), mono- metil auristatina E (MMAE), ou monometil dolastatina-10 ou um resí- duo de um derivado do mesmo tendo a seguinte fórmula (C): t H 9 U ”P Rg O AA, 0 O o À o NH R; R$ SÉ (C) em que: — Rr é H ou OH, — R2 é uma (C1-Cs)alquila, COOH, COO-((C1-Cs)alquila) ou uma tiazolila,
— R3 é H ou uma (C1-Cs)alquila, em particular uma (C1-C6) alquila, — X1 é O ou NR, — Rs é H ou (C1-Cs)alquila, e —- té um número inteiro de 1 e 8, em particular de 1 a 6, vantajosamente de 1 a 4, preferivelmente, é 1 ou 2; um resíduo de daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, pro-2-pirrolinodoxorrubicina, ou PNU-159682 ou um resíduo da seguinte fórmula (A) ou (B): o OH o o.
COCSÊ 2O O OH Or. o. Ss
NE (CX o (A) o OH o
COCO 2O O OH Or. o. Ss
NE (CX o (B); — um resíduo de camptotecin ou SN-38; —- um resíduo de tubulisina A, tubulisina B, tubulisina C ou tubulisina D; —- um resíduo de esperamicina, caliqueamicina y1, ou N- acetil dimetil hidrazida caliqueamicina;
— um resíduo de maitansina, DM1 ou DMA; —- um resíduo de duocarmicina A, duocarmicina B1, duo- carmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, ou CC-1065; —- um resíduo de a-amanitina, B-amanitina, y-amanitina ou e-amanitina; — um resíduo de antramicina ou SGD-1882; — um resíduo da seguinte fórmula (D): Xu 2 A Azo O
HH J AX O Az Aos ox, & O em que: — X11 e X21 são independentemente O ou S, preferivelmen- te, O, — X12 e X22 são independentemente OH, SH, O ou S, — A11 e Az; são independentemente um grupo de fórmula: Z1 [9] Z1 o NR Za Dx, Z NnÊ Ex AL? RL? A | 1)
ZON NO NON ON SN Nm NM “TT ou NEN onde: e Z1 é OR, NR1R12, O ou NR11, com Ru e Ri2 sendo in- dependentemente H, R13 ou COR13, com R13 sendo (C1-Cs)alquila, ari- la ou aril(C1-Ce)alquila, * Z2 É H, NR21R22 ou NR21, com R21 e R22 sendo indepen- dentemente H, R23 ou COR23, com R23 sendo (C1-Cs)alquila, arila ou aril(C1-Cçs)alquila, e Z3 É N ou CR33, com R33 sendo H ou um átomo de halo- gênio, e * Z. é H ou uma (C1-C6)alquila, — A12 e Az são independentemente H, OH ou F, e — Az é H ou A? e Az são ligados juntamente com Az sendo CH>2 e Az2 sendo O, em que: “ quando X12 for O ou S, em seguida, X2> não será O e não será S, Z1 não será O e não será NR11, Z2 não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por X12; “ quando X22 for O ou S, em seguida, X12 não será O e não será S, Z1 não será O e não será NR11, Z2 não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por X22; “ quando Z1 for O ou NR11, em seguida X12 não será O e não será S, X>> não será O e não será S, Z2 não será NR2, e o resi- duo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por Z1; “ quando Z> é NR21, em seguida X12 não será O e não será S, X22 não será O e não será S, Z1; não será O e não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por Z2.
17. Conjugado ligante-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que Q tem: o OH o o.
COS —2o O OH ô,. o. *º No Co — a seguinte fórmula (A): O (A);
o oH o
A LÁ
CÁ Y O O OH Ô,. O.
SS inte f CI — a seguinte fórmula (B): o (B); — a seguinte fórmula (C): t H 9 NOTA º XT) Ro A | % O À o pd à R$ (C) em que: — Rr é H ou OH, —- R2 é uma (C1-C6)alguila, COOH, COO-((C1-Cs)alquila) ou uma tiazolila, — R3 é H ou uma (C1-C6)alquila, em particular uma (C1-C6) alquila, — X1 é O ou NR, — Rs é H ou (C1-Cs)alquila, e —- té um número inteiro de 1 e 8, em particular de 1 a 6, vantajosamente de 1 a 4, preferivelmente, é 1 ou 2; ou — a seguinte fórmula (D): q tao o. Av se q Po tas o | Por A e Koi (D) em que:
— X11 e X21 são independentemente O ou S, preferivelmen- te, O, — X12 e X22 são independentemente OH, SH, O ou S, — A11 e Az; são independentemente um grupo de fórmula: o Z, o
Z
AA ONA O OX PP, [NM | ou Po onde: e Z1 é OR, NR1R12, O ou NR11, com Ru e Ri2 sendo in- dependentemente H, R13 ou COR13, com R13 sendo (C1-Cs)alquila, ari- la ou aril(C1-Ce)alquila, * Z2 É H, NR21R22 ou NR21, com R21: e R22 sendo indepen- dentemente H, R23 ou COR23, com R23 sendo (C1-Cs)alquila, arila ou aril(C1-Cçs)alquila, e Z3 É N ou CR33, com R33 sendo H ou um átomo de halo- gênio, e * Z. é H ou uma (C1-C6)alquila, — A12 e Az são independentemente H, OH ou F, e — Az é H ou A? e Az são ligados juntamente com Az sendo CH> e Az2 sendo O, em que: “ quando X12 for O ou S, em seguida, X2> não será O e não será S, Z1 não será O e não será NR11, Z2 não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por X12; “ quando X22 for O ou S, em seguida, X12 não será O e não será S, Z1 não será O e não será NR11, Z2 não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por X22; “ quando Z1 for O ou NR11, em seguida X12 não será O e não será S, X>> não será O e não será S, Z> não será NR», e o resí-
duo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por Z1; “ quando Z> é NR21, em seguida X12 não será O e não será S, X22 não será O e não será S, Z1; não será O e não será NR, e o resíduo do agonista STING será ligado ao restante da molécula por Z2.
18. Uso de um ligante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou um conjugado fármaco-ligante, como de- finido em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de ser para ligar covalentemente um fármaco a uma unidade de ligação selecionada a partir de um peptídeo, uma proteína, um anti- corpo e um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em particular selecionado a partir de um anticorpo e um fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que q é 2.
20. Conjugado unidade de ligação-fármaco caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula (III) ou (IV): Unidade de SH Ligação | teamo O E) (11) Unidade de ES ETF (CO)(WWw-MY),-Q Ligação | pas Ss (IV) ou um sal do mesmo, preferivelmente, um sal farmaceuticamente acei- tável do mesmo, em que: — a unidade de ligação é um peptídeo, uma proteína, um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;
— L, representa um grupo de fórmula Ly'-(CO-Z')- com Ly sendo -(CH2)n-, -(CH2CH20 )n-CH2-CH>-, arileno, heteroarileno, cicloal- canodiila, -(CH2),-arileno-, -(CH2),-heteroarileno-, -(CH>2)n-cicloalcano- diil-, -arileno-(CH>2)p-, -heteroarileno-(CH2)p-, -cicloalcanodiil-(CH2),p-, - (CH>2)rn-arileno-(CH2),-, -(CH2),-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2),-cicloalca- nodiil-(CH2)p-, -(CH2CH20)n-CH2-CH>2-arileno-(CH2)y-, -(CH2CH20O)m- CH2-CH>-heteroarileno-(CH2)p-, -(CH2CH20 )m-CH2-CH>-cicloalcanodiil- (CH2)p-, -(CH2),-arileno-CH2-CH2-(CH2CH20)m-, -(CH2)n-heteroarileno- CH27-CH2-(CH2CH2O)m-, ou -(CH>),-cicloalcanodiil-CH2-CH2-(CH2CH2O)m-;
— cada W independentemente representa uma unidade de aminoácido;
— Y é PAB-CO-(Z)--, com PAB sendo ue. (o oxigênio da unidade de PAB sendo ligado a CO-(Z)z;
— Z é -NR4-(CH2)J-NR5-,-NR4-(CH2)u-NR5-CO-, -NR1-(CH>).- NR5-CO-(CH2),-, ou -NRa-(CH2)J-NR5-CO-(CH2),-CO-, o grupo NR sendo ligado ao grupo CO de PAB-CO;
— Z é -NR4+-(CH2)J-NR5- ou -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2).-, o grupo NR, sendo ligado ao grupo CO de CO-Z';
— R1 e Rs são independentemente H ou um grupo (C1- Cse)alquila;
— Q representa uma porção de fármaco;
— cé 0 ou 1, preferivelmente, 1;
—- mé um número inteiro de 1 a 15;
— né um número inteiro de 1 a 6;
— pé um número inteiro de 1 a 6;
—- sé um número inteiro de 1 a 8;
—- ué um número inteiro de 1 a 6;
— vé um número inteiro de 1 a 6; — w é um número inteiro de O a 5, preferivelmente, O ou 2; — yéOoul; - zéOoutie —- zéloul.
21. Conjugado unidade de ligação-fármaco, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que L', W e w são como definidos em qualquer uma das reivindicações 6 a 9, e/ou Q é como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
22. Conjugado unidade de ligação-fármaco, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a unidade de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
23. Conjugado unidade de ligação-fármaco, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IGF-1R ou um anticorpo HER?2.
24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado unidade de ligação-fármaco, como de- finido em qualquer uma das reivindicações 20 a 23, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
25. Conjugado unidade de ligação-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, ou composição farmacêuti- ca, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento do câncer, tal como câncer de próstata, os- teossarcoma, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, glioblastoma, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer renal, câncer de pâncreas ou câncer de cabeça e pescoço.
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