ES2852052T3 - Péptidos citotóxicos y conjugados de fármaco anticuerpo de los mismos - Google Patents

Péptidos citotóxicos y conjugados de fármaco anticuerpo de los mismos Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula IV: **(Ver fórmula)** o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que, independientemente cada vez que aparece, W es **(Ver fórmula)** o R1 es **(Ver fórmula)** Y es alquileno C2-C20- o heteroalquileno C2-C20, carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10- arileno-, -arilen-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-; Z'' es **(Ver fórmula)** Z''' es **(Ver fórmula)** R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8; R3A y R3B se definen como cualquiera de los siguientes: (i) R3A es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8 o halógeno; y R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8 o halógeno; o (ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8, o heteroalquileno C1-C8; R5 es **(Ver fórmula)** heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1- C8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', - S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10 o R5 es **(Ver fórmula)** o **(Ver fórmula)** opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', - OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquilen C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10; R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8; R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14; R13 es heterociclilo C1-C10; y X es O.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos citotóxicos y conjugados de fármaco anticuerpo de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se dirige a nuevos compuestos a base de péptidos útiles como cargas útiles en los conjugados fármaco-anticuerpo (ADC) y compuestos útiles de carga útil-engarce junto con los ADC. La presente invención se refiere además a composiciones que incluyen las cargas útiles anteriormente mencionadas, a cargas útiles-engarces y ADC y a procedimientos para usar estas cargas útiles, cargas útiles-engarces y ADC, para tratar afecciones patológicas incluyendo cáncer.
Antecedentes
La conjugación de fármacos a anticuerpos, bien directamente o bien a través de engarces, implica una consideración de una diversidad de factores, incluyendo la identidad y la localización del grupo químico para la conjugación del fármaco, el mecanismo de liberación del fármaco, los elementos estructurales que proporcionan la liberación del fármaco y la modificación estructural al fármaco libre liberado. Además, si el fármaco ha de liberarse después de la internalización de los anticuerpos, el mecanismo de liberación del fármaco debe ser consonante con el tráfico intracelular del conjugado.
Aunque se ha intentado un número de diferentes clases de fármacos para el transporte a través de los anticuerpos, solamente unas pocas clases de fármacos han demostrado ser efectivos como conjugados de fármaco anticuerpo, teniendo un perfil de toxicidad adecuado. Una de dichas clases son las auristatinas, derivados del producto natural dolastatina 10. Las auristatinas representativas incluyen (N-metilvalina-valina-dolaisoleucin-dolaproin-norefedrina) y (N-metilvalina-valina-dolaisoleucin-dolaproin-fenilalanina). Sin embargo, se mantiene una necesidad de auristatinas adicionales con propiedades mejoradas.
Sumario
La presente invención se refiere a pentapéptidos citotóxicos y conjugados de anticuerpo fármaco de los mismos representados por la fórmula:
Figure imgf000002_0001
IV
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000002_0002
R1 es
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Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-, carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C-10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z'' es
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o NHZ"
Z''' es
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R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
r 3A y r 3B se definen como cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8 o halógeno; y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8 o halógeno; o
(ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8, o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000004_0001
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C 8-C(O)R', -alquil G ,-C 8-C(O)R' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R5 es
Figure imgf000004_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil G i-C 8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', - s R' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8;
R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R13 es heterociclilo C1-C10; y
X es O.
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad eficaz de uno cualquiera de los compuestos anteriormente mencionados y/o uno cualquiera de los conjugados fármaco anticuerpo anteriormente mencionados y un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a los compuestos anteriormente mencionados y/o uno cualquiera de los conjugados fármaco anticuerpo anteriormente mencionados para su uso en el tratamiento de cáncer administrando a un paciente en necesidad de la misma una cantidad de dicho compuesto y/o conjugado.
Otro aspecto de la invención se refiere a los compuestos anteriormente mencionados y/o uno cualquiera de los conjugados fármaco anticuerpo anteriormente mencionados para su uso en el tratamiento de cáncer en el que dicho cáncer incluye un tumor, metástasis u otra enfermedad o trastorno caracterizados por el crecimiento celular descontrolado en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinomas de la vejiga, mama, cuello de útero, colon, gliomas, endometrio, riñón, pulmón, esófago, ovario, próstata, páncreas, melanoma, estómago y testículos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa un gráfico de la actividad antitumoral de cuatro conjugados (cada uno administrado a 1 mg/kg, Q4dx4) representado como volumen tumoral en el tiempo.
La Figura 2 representa un gráfico de la actividad antitumoral de seis conjugados (cada uno administrado a 1 mg/kg, Q4dx4) representado como volumen tumoral tratado con fármaco/volumen tumoral tratado con vehículo en el tiempo.
La Figura 3 representa los resultados del ensayo de H(C)-#D54 y H(C)-vcMMAE a 1 mg/kg s
Las figuras 4A, 4B y 4C representan[A ] los resultados del ensayo de H(C)-#D54 y H(K)-MCC-DM1 en un modelo de detección in vivo de xenoinjerto de ratón MDA-MB-361-D YT2 ; [B] los resultados del ensayo de H(C)-vcMMAE y H(C)-mcMMAF en un modelo de detección in vivo de xenoinjerto de ratón MDA-MB-361-D Y T2 ; y [C] una comparación de T/C calculado para los cuatro conjugados. Los ratones se trataron con q4dx4 , empezando el día 1.
Las figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E y 5F representan los resultados de respuesta a dosis del ensayo de [A ] H(C)-#D 54, [B] H(C)-vcMMAE, [C] H(C)-mcMMAF y [D] H(K)-MCC-DM1 en un modelo in vivo de xenoinjerto de ratón N87; [E] una comparación de H(C)-#D54 y H(C)-vcMMAE; y [F] una comparación de T/C calculado para los cuatro conjugados. Los ratones se trataron con q4dx4 , empezando el día 1.
La Figura 6 representa los resultados de respuesta a dosis del ensayo de H(C)-#A115 a 1 mpk, 3 mpk y 10 mpk, en un modelo in vivo de xenoinjerto de ratón N87. Los ratones se trataron con q4dx4 , empezando el día 1.
La Figura 7 muestra datos que comparan el anticuerpo hu08 humanizado conjugado a vc-0101 o mc-3377, ensayados en un modelo in vivo de xenoinjerto con células P C 3MM2 , una línea celular de cáncer de próstata humano que expresa el receptor IL-13Ra2.
Las Figuras 8A a E muestran[A ] la efectividad de ADC anti-Notch quiméricos de rata-humano dosificados a 5 mg/kg en xenoinjertos de pulmón H C C2429; [B y C] la efectividad de ADC anti-Notch quiméricos de rata-humano dosificados a 5mg/kg en xenoinjertos de mama MDA-MB-468; [D y E] la efectividad de ADC anti-Notch quiméricos de rata-humano dosificados a 5mg/kg en xenoinjertos gástricos N87.
Descripción detallada
La presente invención se dirige a pentapéptidos citotóxicos, a conjugados de fármaco anticuerpo que comprenden dichos pentapéptidos citotóxicos y a procedimientos para el uso de los mismos para tratar cáncer y otras afecciones patológicas. La invención se refiere también a procedimientos para el uso de dichos compuestos y conjugados in vitro, in situ e in vivo para la detección, el diagnóstico o el tratamiento de células de mamíferos, o afecciones patológicas asociadas.
Definiciones y abreviaturas
Salvo que se indique lo contrario, pueden usarse los siguientes términos y frases en el presente documento y se destinan a tener los siguientes significados. Cuando se usan marcas comerciales en el presente documento, la marca comercial incluye la formulación del producto, el fármaco genérico y el principio o principios farmacéuticos activos del producto de la marca comercial, salvo que se indique lo contrario por contexto.
El término "anticuerpo" (o "Ac") en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo que exhiben la actividad biológica deseada. Un anticuerpo intacto tiene principalmente dos regiones: una región variable y una región constante. La región variable se une a e interacciona con un antígeno diana. La región variable incluye una región determinante de la complementariedad (CDR) que reconoce y se une a un sitio de unión específico en un antígeno particular. La región constante puede reconocerse por e interaccionar con el sistema inmune (véase, por ejemplo, Janeway y col., 2001, Immuno. Biology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo o clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase (por ejemplo, IgG, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgA1 e IgA2). El anticuerpo puede derivar de cualquier especie adecuada. En algunas realizaciones, el anticuerpo es de origen humano o murino. Un anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano, humanizado o quimérico.
Las expresiones "se une específicamente" y "unión específica" se refieren a la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1x107 M'1 y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado.
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obteniéndose a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no ha de construirse requiriendo la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular.
La expresión "anticuerpos monoclonales" incluye específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homóloga a la secuencia correspondiente de anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que lo que queda de la cadena o cadenas es idéntico a, u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada.
Como se usa en el presente documento, "H(C)-" se refiere a trastuzumab (marca comercia1HERCEPTIN ®) que es un anticuerpo monoclonal que interfiere con el receptor H ER2/neu, unido a través de una de sus cisteínas al compuesto de la invención. Como se usa en el presente documento, "H(K)-" se refiere a trastuzumab que es un anticuerpo monoclonal que interfiere con el receptor HER2/neu, unido a través de una de sus lisinas al compuesto de la invención.
Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de unión a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (C i) y dominios constantes de cadena pesada, C h1, C h2, C h3 y C h4, según sea apropiado para la clase de anticuerpo. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencias de aminoácidos de los mismos.
Un anticuerpo intacto puede tener una o más "funciones efectoras", que se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (por ejemplo, una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras de anticuerpos incluyen la citotoxicidad dependiente de complemento, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno o la variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, molécula de anticuerpos de cadena simple, scFv, scFv-Fc, fragmentos de anticuerpo multiespecíficos formados a partir de fragmento o fragmentos de anticuerpo, un fragmento o fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab o unos fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno diana (por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno vírico o un antígeno microbiano).
El término "variable" en el contexto de un anticuerpo se refiere a ciertas porciones de los dominios variables del anticuerpo que difieren extensamente en secuencia y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Esta variabilidad se concentra en tres segmentos denominados "regiones hipervariables" en los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se denominan las regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada una cuatro FR conectadas por tres regiones hipervariables.
La frase "región hipervariable" cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende generalmente restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los restos 24-34 (L1), 50­ 56 (L2 ) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (L3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y col. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (142) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901- 917). Los restos FR son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable como se define en el presente documento.
Un fragmento de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprende los dominios V.sub.H y V.sub.L de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Típicamente, el polipéptido Fv comprende además un engarce polipeptídico entre los dominios V.sub.H y V.sub.L que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs.
269-315 (1994).
El término "diacuerpo" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (Vh) conectado a un dominio ligero variable (Vi) en la misma cadena de polipéptido. Usando un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, el documento EP 0404 097; documento WO 93/11161; y Hollinger y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. e E.UU. 90:6444Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en cuyos restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Por otro lado, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar además el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones y col., 1986, Nature 321:522- 525; Riechmann y col., 1988, Nature 332:323- 329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593- 596.
Como se usa en el presente documento, "aislado" significa separado de otros componentes de (a) una fuente natural, tales como una célula vegetal o animal o un cultivo celular, o (b) una mezcla de reacción química orgánica sintética. Como se usa en el presente documento, "purificado" significa que cuando se aísla, el aislado contiene al menos un 95 % y en otro aspecto al menos un 98 % , de un compuesto (por ejemplo, un conjugado) en peso del aislado.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95 % en peso de anticuerpo según se determina por el procedimiento de Lowry y más preferentemente más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos W-terminales o internos mediante el uso de un secuenciador de copa de giro o (3) a homogeneidad por SD S-P A G E en condiciones reductoras o no reductoras usando azul Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De forma ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada según se determina por la unión de la anexina V, la fragmentación de ADN, la contracción celular, la dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación y/o la formación de las vesículas de membrana (denominados cuerpos apoptóticos). La célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de mama, de ovario, estómago, de endometrio, de glándula salival, de pulmón, de riñón, de colon, de tiroides, pancreática o de vejiga. Diversos procedimientos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados a la apoptosis. Por ejemplo, la traslocación de fosfatidilserina (PS) puede medirse por la unión de anexina; la fragmentación de ADN puede evaluarse a través de formación de escalera de ADN; y la condensación nuclear/de la cromatina junto con la fragmentación del ADN puede evaluarse por cualquier aumento en las células hipodiploides.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de las células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en algún grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en algún grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados al cáncer. Hasta el grado que el fármaco puede inhibir el crecimiento y/o matar las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la efectividad puede, por ejemplo, medirse evaluando el tiempo para el avance de la enfermedad (TTP, por sus siglas en inglés) y determinar la tasa de respuesta (RR, por sus siglas en inglés).
La expresión "cantidad sustancial" se refiere a una mayoría, es decir, más del 50 % de una población, de una mezcla o una muestra.
La expresión "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto que resulta de un procedimiento metabólico o una reacción dentro de una célula o un conjugado fármaco-anticuerpo (ADC). El procedimiento o la reacción metabólicos pueden ser un procedimiento enzimático tal como la escisión proteolítica de un engarce peptídico del ADC. Los metabolitos intracelulares incluyen, pero no se refieren a, anticuerpos y el fármaco libre que se han sometido a escisión intracelular después de la entrada, la difusión, la toma o el transporte en una célula.
Las expresiones "intracelularmente escindido" y "escisión intracelular" se refiere a un procedimiento o una reacción metabólicos dentro de una célula o un ADC o similares, por los que la fijación covalente, por ejemplo, el engarce, entre el resto farmacológico y el anticuerpo se rompe, dando como resultado el fármaco libre u otro metabolito del conjugado disociado del anticuerpo dentro de la célula. Los restos escindidos del ADC son de esta manera metabolitos intracelulares.
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles de sangre/plasma) de una cantidad dada de un fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición tanto del tiempo (velocidad) y la cantidad total (grado) de fármaco que alcanza la circulación general de una forma de dosificación administrada.
La expresión "actividad citotóxica" se refiere a un efecto de muerte celular, uno citostático o uno anti-proliferativo de un ADC o un metabolito intracelular de dicho ADC. La actividad citotóxica puede expresarse como el valor CI50, que es la concentración (molar o en masa) por volumen unitario en el que las células sobreviven.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con un fármaco o un conjugado fármacoanticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen a un mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratarse en el presente documento incluyen cánceres benignos y mutantes; leucemia y malignancias linfoides, neuronales, gliales, astrocíticos, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunogénicos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección o el trastorno fisiológicos en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular sin regular. Un "tumor" comprende una o más células cancerosas.
Los ejemplos de un "paciente" incluyen, pero no se refieren a, un ser humano, rata, ratón, cobaya, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, ave y ave de corral. En una realización ejemplar, el paciente es un ser humano. Los términos "tratar" o "tratamiento", salvo que se indique lo contrario por contexto, se refiere al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas para prevenir la recaída, en el que el objeto es inhibir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como el desarrollo de la extensión del cáncer. Para los fines de la presente invención, los beneficios o resultados clínicos deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, el estado estabilizado (es decir, que no empeore) de la enfermedad, el retraso o la ralentización en la evolución de la enfermedad, la mejora o el alivio del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que tienen la afección o el trastorno así como aquellos propensos a tener la afección o el trastorno.
En el contexto del cáncer, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de inhibir el crecimiento de las células tumorales, células cancerosas, o de un tumor; inhibir la replicación de las células tumorales o las células cancerosas, disminuir la carga global del tumor o disminuir el número de células cancerosas y mejorar uno o más síntomas asociados a la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmune, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de inhibir la replicación de las células asociadas a un estado de la enfermedad autoinmune incluyendo, pero no limitado a, células que producen un anticuerpo autoinmune, disminuir la carga del anticuerpo autoinmune y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad autoinmune.
En el contexto de una enfermedad infecciosa, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de: inhibir el crecimiento, la multiplicación o la replicación del patógeno que provoca la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad infecciosa.
El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de la indicación o indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias que conciernen al uso de dichos productos terapéuticos.
Como se usa en el presente documento, Los términos "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan intercambiablemente y todas estas designaciones incluyen a la descendencia. Las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula del sujeto primaria y los cultivos o la descendencia derivados de la misma sin importar el número de transferencias. También se entiende que toda la descendencia no tiene por qué ser precisamente idéntica en cuanto a contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se detectó en la célula originalmente transformada. Cuando se entiendan distintas designaciones, estarán claras a partir del contexto.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro término se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificado, saturado que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, alquilo "C-i-Cs' se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono). Cuando el número de átomos de carbono no está indicado, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los alquilos C-i-Ca de cadena lineal representativos incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, nheptilo y n-octilo; mientras que los alquilos C i-C a ramificados incluyen, pero sin limitación, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -ferc-butilo, -isopentilo y -2-metilbutilo; los alquilos C2-C8 insaturados incluyen, pero sin limitación, vinilo, alilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2 ,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo y 3-metil-1-butinilo.
A menos que se indique lo contrario, "alquileno", por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un radical hidrocarburo saturado, lineal o ramificado o cíclico del número indicado de átomos de carbono, típicamente 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radical monovalente obtenidos mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos diferentes de un alcano precursor. Los radicales alquileno típicos incluyen, pero sin limitación: metileno (-CH2-), 1,2-etileno (-CH2CH2-), 1,3-propileno (-CH2CH2CH2-), 1,4-butileno (-CH2CH2CH2CH2-) y similares. Un alquileno "C1-C10" de cadena lineal es un grupo hidrocarburo saturado de cadena lineal de la fórmula -(CH2)mo-. Los ejemplos de un alquileno C1-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
A menos que se indique lo contrario, el término "heteroalquilo", por sí mismo o junto con otro término, significa, a menos que se indique otra cosa, un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada estable o combinaciones de los mismos, totalmente saturado o que contiene de 1 a 3 grados de insaturación, que consiste en el número indicado de átomos de carbono y de uno a tres heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en O, N, Si y S, y en el que los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El heteroátomo o heteroátomos O, N y S pueden estar situados en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo. El heteroátomo Si puede estar situado en cualquier posición del grupo heteroalquilo, incluyendo la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos.
A menos que se indique lo contrario, el término "heteroalquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa un grupo divalente derivado de un heteroalquilo (como se ha descrito anteriormente). Para grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena.
A menos que se indique lo contrario, "arilo", por sí mismo o como parte de otro término, significa un radical hidrocarburo aromático, carbocíclico, monovalente, sustituido o no sustituido de 6-20, preferentemente de 6- 14, átomos de carbono obtenidos mediante la retirada de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático precursor. Los grupos arilo típicos incluyen, pero sin limitación, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares. Un grupo aromático carbocíclico sustituido (por ejemplo, un grupo arilo) puede estar sustituido con uno o más, preferentemente de 1 a 5, de los siguientes grupos: alquilo C1-C8, -O-(alquilo C r Ca), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, - n H(R'), -N(R')2 y -CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre -H, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido. En algunas realizaciones, un grupo aromático carbocíclico sustituido puede incluir adicionalmente uno o más de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR'. "Arileno" es el resto divalente correspondiente.
"Alquilo sustituido" significa un alquilo en el que uno o más átomos de hidrógeno están cada uno reemplazado independientemente con un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen, pero sin limitación, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN , -N=C=O, -N CS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO32-, PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2 o -C(=NR)NR2, en los que cada X es independientemente un halógeno: -F, -Cl, -Br o -I; y cada R es independientemente -H, alquilo C1-C20, heteroalquilo C1-C20, arilo C6-C20, heterociclilo C1-C10, un grupo protector o un resto de profármaco. Los grupos arilo, alquileno y heteroalquileno como se han descrito anteriormente también pueden estar sustituidos de forma similar.
A menos que se indique lo contrario, "aralquilo", por sí mismo o como parte de otro término, significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, sustituido con un grupo arilo, como se ha definido anteriormente.
A menos que se indique lo contrario, "heterociclilo C1-C10", por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un sistema de anillo monovalente, sustituido o no sustituido, aromático o no aromático, monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene de 1 a 10, preferentemente de 3 a 8, átomos de carbono (también denominados miembros de anillo) y de uno a cuatro miembros de anillo de heteroátomo seleccionados independientemente entre N, O, P o S, y obtenidos mediante la retirada de un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un sistema de anillo precursor. Uno o más átomos de N, C o S en el heterociclilo pueden estar oxidados. El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se indique otra cosa, el heterociclilo está unido a su grupo pendiente en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable. Los ejemplos representativos de un heterociclilo C1-C10 incluyen, pero sin limitación, tetrahidrofuranilo, oxetanilo, piranilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, benzofuranilo, benzotiofeno, benzotiazolilo, indolilo, benzopirazolilo, pirrolilo, tiofenilo (tiofeno), furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo incluyendo restos, tales como 1,2 ,3,4tetrahidro-quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, tetrazolilo, epóxido, oxetano y BODIPY (sustituido o no sustituido). Un heterociclilo C1-C10 puede estar sustituido con hasta siete grupos incluyendo, pero sin limitación, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8, -OR', arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(O)R', halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre -H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8 y arilo. En algunas realizaciones, un heterociclilo sustituido también puede incluir uno o más de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR'. "Heterociclo" "heterociclo C1-C10" es el resto divalente correspondiente.
A menos que se indique lo contrario, "heteroaralquilo", por sí mismo o como parte de otro término, significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, sustituido con un grupo heterociclilo aromático, como se ha definido anteriormente. Heteroaralquilo es el resto divalente correspondiente.
A menos que se indique lo contrario, "carbociclilo C3-C8", por sí mismo o como parte de otro término, es un anillo carbocíclico, monocíclico o bicíclico, no aromático, saturado o insaturado, sustituido o no sustituido, monovalente de 3, 4 , 5, 6, 7 u 8 miembros obtenido mediante la retirada de un átomo de hidrógeno de un átomo de anillo de un sistema de anillo precursor. Los carbociclilos C3-C8 representativos incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentadienilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 1,3-ciclohexadienilo, 1,4-ciclohexadienilo, cicloheptilo, 1,3-cicloheptadienilo, 1,3,5-cicloheptatrienilo, ciclooctilo, ciclooctadienilo, biciclo(1,1,1)pentano y biciclo(2 ,2 ,2)octano. Un grupo carbociclilo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con hasta siete grupos incluyendo, pero sin limitación, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8, -OR', arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(=O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre -H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8 y arilo. "carbociclo C3-C8" es el resto divalente correspondiente.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superimposición del compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles sobre sus compañeros de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero se diferencian con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares la una de la otra. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Pueden separarse mezclas de diastereómeros en procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía.
Las definiciones estereoquímicas y convenciones usadas en el presente documento siguen generalmente S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, McGraw-Hill Book Company, Nueva York (1984); y Eliel y Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994). Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada en el plano. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el signo de la rotación de la luz polarizada en el plano por el compuesto, significando (-) o 1 que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto porque son imágenes especulares el uno del otro. Un estereoisómero específico también puede denominarse como un enantiómero, y una mezcla de tales isómeros se llama frecuentemente una mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina como una mezcla racémica o un racemato, lo que puede suceder donde no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o procedimiento químico. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, sin actividad óptica.
Un "derivado" de aminoácido incluye un aminoácido que tiene sustituciones o modificaciones mediante unión covalente de un aminoácido precursor, tales como, por ejemplo, por alquilación, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Se incluye adicionalmente dentro de la definición de "derivado", por ejemplo, uno o más análogos de un aminoácido con engarces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica.
Un "aminoácido natural" se refiere a arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptófano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutámico, ácido aspártico, treonina, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina y valina, a menos que se indique otra cosa por el contexto.
"Grupo protector" se refiere a un resto que cuando se une a un grupo reactivo en una molécula enmascara, reduce o previene esa reactividad. Pueden encontrarse ejemplos de grupos protectores en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a edición, John Wiley & Sons, Nueva York, 1999, y Harrison and Harrison y col., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971- 1996), que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Los grupos protectores de hidroxi representativos incluyen grupos acilo, bencil y tritil éteres, tetrahidropiranil éteres, trialquilsilil éteres y alil éteres. Los grupos protectores de amino representativos incluyen, formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo (CBZ), terc-butoxicarbonilo (Boc), trimetil sililo (TMS), 2-trimetilsilil-etanosulfonilo (SES), tritilo y grupos tritilo sustituidos, aliloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), nitro-veratriloxicarbonilo (NVOC), y similares.
Los ejemplos de un "grupo protector de hidroxilo" incluyen, pero sin limitación, metoximetil éter, 2-metoxietoximetil éter, tetrahidropiranil éter, bencil éter, p-metoxibencil éter, trimetilsilil éter, trietilsilil éter, triisopropil silil éter, tbutildimetil silil éter, trifenilmetil silil éter, éster de acetato, ésteres de acetato sustituidos, pivaloato, benzoato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede sustituirse por otro grupo funcional. Tales grupos salientes son bien conocidos en la materia, y los ejemplos incluyen, pero sin limitación, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanosulfonilo (mesilo), p-toluenosulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto. El compuesto típicamente contiene al menos un grupo amino, y en consecuencia pueden formarse sales de adición de ácidos con este grupo amino. Las sales ejemplares incluyen, pero sin limitación, las sales sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, malato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula, tal como un ion de acetato, un ion de succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabiliza la carga en el compuesto precursor. Por otro lado, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Algunos casos en los que átomos múltiplemente cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. De este modo, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
"Solvato farmacéuticamente aceptable" o "solvato" se refiere a una asociación de una o más moléculas de disolvente y un compuesto o conjugado de la invención. Los ejemplos de disolventes que forman solvatos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina.
Las expresiones "carga" o "carga de fármaco" o "carga útil" representan o se refieren al número promedio de cargas útiles ("carga útil" y "cargas útiles" se usan de forma intercambiable en el presente documento con "fármaco" y "fármacos") por anticuerpo en una molécula de ADC. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos por anticuerpo. Esto a veces se denomina la DAR o la relación de fármaco a anticuerpo. Las composiciones de los ADC descritos en el presente documento tienen típicamente DAR de 1-20 y en determinadas realizaciones de 1- 8, de 2- 8, de 2-6, de 2-5 y de 2-4. Los valores de DAR típicos son 2 , 4 , 6 y 8. El número promedio de fármacos por anticuerpo, o valor DAR, puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía UV/visible, espectrometría de masas, ensayo ELISA y HPLC. El valor cuantitativo de DAR también puede determinarse. En algunos casos, la separación, la purificación y la caracterización de ADC homogéneos que tienen un valor DAR particular pueden lograrse por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis. La DAR puede estar limitada por el número de sitios de fijación en el anticuerpo. Por ejemplo, donde la fijación es un tiol de cisteína, un anticuerpo puede tener solamente uno o varios grupos tiol de cisteína, o pueden tener solamente uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los que puede fijarse una unidad conectora. En algunas realizaciones, el tiol de cisteína es un grupo tiol de un resto de cisteína que forma un enlace disulfuro intracatenario. En algunas realizaciones, el tiol de cisteína es un grupo tiol de un resto de cisteína que no forma un enlace disulfuro intracatenario. Típicamente, menos del máximo teórico de restos farmacológicos se conjugan a un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos de lisina que no reaccionan con un engarce o un intermedio engarce. Solamente los grupos de lisina más reactivos pueden reaccionar con un reactivo engarce reactivo.
Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos, en caso de haberlos, grupos tiol de cisteína libres y reactivos que pueden conectarse con un fármaco a través de un engarce. La mayoría de restos tiol de cisteína en los anticuerpos existe como puentes disulfuro y debe reducirse con un agente reductor tales como ditiotreitol (DTT). El anticuerpo puede someterse a condiciones desnaturalizantes para revelar grupos nucleófilos reactivos tales como lisina y cisteína. La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de varias diferentes maneras, incluyendo: (i) limitar el exceso molar de fármaco-engarce con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación y (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación de tiol de cisteína. Cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un fármaco-engarce después el producto resultante es una mezcla de ADC con una distribución de uno o más restos farmacológicos por anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla por, por ejemplo, ensayo ELISA de anticuerpo dual, específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Los ADC individuales pueden identificarse en la mezcla por espectroscopía de masas y separarse por HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba.
A continuación hay una lista de abreviaturas y definiciones que pueden no definirse de otra manera o describirse en la presente solicitud: DMSO (se refiere a dimetilsulfóxido), HRMS (se refiere a espectrometría de masas de alta resolución), DAD (se refiere a detección de disposición de diodos), TFA (se refiere a ácido 2,2 ,2-trifluoroacético o ácido trifluoroacético), T FF (se refiere a filtración de flujo tangencial), EtOH (se refiere a etanol), MW (se refiere a peso molecular), HPLC (se refiere a cromatografía líquida de alto rendimiento), HPLC prep (se refiere a cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa), etc. (se refiere a etcétera), tritilo (se refiere a 1,1',1"-etan-1,1,1 -triiltribenceno), THF (se refiere a tetrahidrofurano), n Hs (se refiere a 1 -hidroxi-2 ,5-pirrolidindiona), Cbz (se refiere a carboxibencilo), eq. (se refiere a equivalente), n-BuLi (se refiere a n-butillitio), OAc (se refiere a acetato), MeOH (se refiere a metanol), i-P r (se refiere a isopropilo o propan-2-ilo), NMM (se refiere a 4-metilmorfolina) y "-" (en una tabla se refiere a datos no disponibles en este momento).
Compuestos y conjugados fármaco anticuerpo de los mismos
Se desvelan compuestos de fórmula I:
Figure imgf000012_0001
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000012_0002
R1 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R3A y R3B son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; o
(ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000013_0001
heterociclilo C 1-C 10, carbociclilo C 3-C 8 y arilo C 6-C 14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, - n Hc (=n H)NH2, -N h c O n H2, -S(=O)2R' y - s R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R5 es
Figure imgf000013_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH,
halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquilen C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10;
R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8;
R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R13 es heterociclilo C1-C10; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Se desvelan compuestos de fórmula lia:
Figure imgf000014_0001
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000014_0003
R1 es
Figure imgf000014_0002
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-; -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C6-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C 1-C 10-(heterociclo C 3-C 8)- o -(heterociclo C 3-C 8)-alquileno C 1-C 10-;
Z es
Figure imgf000015_0001
o -NH2; G es halógeno, -OH, -SH o -S-alquilo C1-C6;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
r 3A y r 3B son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B es alquilo C i-C 8, haloalquilo C i-C 8, carbociclilo C 3-C 8 heterociclilo C i -C i0, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; o
(ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000016_0001
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C 8-C(O)R', -alquil G ,-C 8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R5 es
Figure imgf000016_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', - s R' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquilen C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10;
R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8;
R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R13 es heterociclilo C1-C10; y
R7 se selecciona independientemente cada vez que aparece entre el grupo que consiste en F, Cl, I, Br, NO2, CN y C F 3;
R10 es hidrógeno, -alquilo C1-C10, -carbociclilo C3-C8, arilo, -heteroalquilo C1-C10, -heterociclo C3-C8, -alquilen C1-C10-arilo, -arileno-alquilo C1-C10, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8), -(carbociclo C3-C8)-alquilo C1-C10, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8) y -(heterociclo C3-C8)-alquilo C1-C10, en los que el arilo en los R10 que comprenden arilo está opcionalmente sustituido con [R7]h;
h es 1, 2 , 3, 4 o 5; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Se divulgan compuestos de fórmula Illa:
Figure imgf000016_0003
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000017_0002
R 1 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R3A y R3B son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o
(ii) R3Ay R3B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C 1-C 8, haloalquilo C 1-C 8, carbociclilo C 3-C 8, heterociclilo C 1-C 10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C 1-C 8, haloalquilo C 1-C 8, carbociclilo C 3-C 8, heterociclilo C 1-C 10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4Ay R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000017_0001
o
Figure imgf000018_0001
opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido;
R11 es
Figure imgf000018_0002
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-, carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z es
Figure imgf000018_0003
o -NH2;
R7 se selecciona independientemente cada vez que aparece entre el grupo que consiste en F, Cl, I, Br, NO2, CN y CF3;
R10 es hidrógeno, -alquilo C1-C10, -carbociclo C3-C8, arilo, -heteroalquilo C1-C10, -heterociclo C3-C8, -alquilen C1-C10-arilo, -arilen-alquilo C1-C10, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8), -(carbociclo C3-C8)-alquilo C1-C10, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8) y -(heterociclo C3-C8)-alquilo C1-C10, en los que el arilo en los R10 que comprenden arilo está opcionalmente sustituido con [R7K
h es 1, 2, 3, 4 o 5; y
X es O o S.
R6 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8 y
h es 1, 2 , 3, 4 o 5.
Se desvelan compuestos de fórmula Ilb:
Figure imgf000019_0001
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
o
Figure imgf000019_0002
R1 es
Figure imgf000019_0003
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z es
Figure imgf000020_0001
o -NHL;
L es un anticuerpo;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
r 3a y r 3b son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o
(ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C 1-C 8, haloalquilo C 1-C 8, carbociclilo C 3-C 8, heterociclilo C 1-C 10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C 8-C(O)R', -alquil G ,-C 8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R5 es
Figure imgf000021_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil G i-C 8-C(O)R', -alquil C i-C 8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH,
halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquilen C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10;
R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8;
R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R13 es heterociclilo C1-C10; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Otro aspecto de la invención se refiere un compuesto de fórmula IlIb:
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000022_0002
R1 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
r 3a y r 3b son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o
(ii) R3Ay R3B tomados juntos son alquileno C 2-C 8 o heteroalquileno C 1-C 8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C 1-C 8, haloalquilo C 1-C 8, carbociclilo C 3-C 8, heterociclilo C 1-C 10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4Ay R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000022_0001
o
Figure imgf000023_0001
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR, en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido;
R11 es
Figure imgf000023_0002
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z es
Figure imgf000023_0003
o -NHL;
L es un anticuerpo;
X es O o S.
Se divulgan compuestos de fórmula IIc:
Figure imgf000024_0001
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
R 1' es
Figure imgf000024_0002
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C6-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z' es
Figure imgf000024_0003
o -NH-;
L es un anticuerpo;
D es -C (R 4A)(R4B) o está ausente;
R2’ es hidrógeno, alquilo C-i-Cs, haloalquilo C-i-Cs, o está ausente si
Figure imgf000024_0004
está presente;
R3A' y R3B' son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A' es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno;
y R3B' es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo o R3B’ es alquileno C2-C4 y forma un anillo saturado de 5 a 7 miembros como se Indica mediante o
(ii) R3A' y R3B' tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000025_0001
heterociclilo C 1-C 10, carbociclilo C 3-C 8 y arilo C 6-C 14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C 8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R5 es
Figure imgf000026_0001
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C t C 8-N(R')2, -alquil C i-C 8-C(O)R', -alquil G i-C 8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -Nh C(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', - s R' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquilen C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C 1-C 10;
R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8;
R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R13 es heterociclilo C1-C10; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Se divulgan compuestos de fórmula IIIc:
Figure imgf000026_0002
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000026_0003
R1 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R3A y R3B son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o
(i) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000027_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido;
R11' es
Figure imgf000027_0001
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20-, -carbociclo C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z' es
Figure imgf000028_0001
o -NH-;
L es un anticuerpo;
X es O o S.
Se divulgan compuestos de fórmula lid :
Figure imgf000028_0002
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
L es un anticuerpo;
[engarce] es un engarce divalente;
D es -C (R 4A')(R4B') o está ausente;
R2’ es hidrógeno, alquilo C-i-Cs, haloalquilo C-i-Cs o está ausente s i \ está presente;
R3A' y R3B' son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A' es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B' es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo o R3B’ es alquileno C 2- C 4 y forma un anillo saturado de 5 a 7 miembros según se indica mediante
(ii) R3A' y R3B' tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R5 es
Figure imgf000029_0001
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C 8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R5 es
Figure imgf000029_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquil C1-C8-N(R')2, -alquil C1-C8-C(O)R', -alquil C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', - s R' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1-C 8, heterociclilo C 1-C 8, alquileno C 1-C 10-heterociclilo C 3-C 8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10;
R6 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, -alquenilo C2-C8, -alquinilo C2-C8 o -haloalquilo C1-C8;
R12 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R13 es heterociclilo C1-C10; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Otro aspecto de la invención se refiere un compuesto de fórmula IlId:
Figure imgf000030_0001
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000030_0002
R1 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R2 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R3A y R3B son cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R3B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o
(ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:
(i) R4A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo y
R4B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o
(ii) R4A y R4B tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
(i) R5 es
Figure imgf000031_0003
opcionalmente sustituido con 1, 2 , 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR , en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido;
[engarce] es un engarce divalente;
L es un anticuerpo;
X es O o S.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que el compuesto está representado por
Figure imgf000031_0001
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que W es
Figure imgf000031_0002
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que W es
Figure imgf000032_0001
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que W es
Figure imgf000032_0002
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que W es
Figure imgf000032_0003
En ciertas realizaciones de la divulgación W es:
Figure imgf000032_0004
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R1 es hidrógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R1 es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R1 es alquilo C1-C8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R1 es metilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R2 es hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 o haloalquilo C 1 - C8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R2 es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R2 es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R2 es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R1 es hidrógeno; y R2 es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R1 es metilo; y R2 es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R3A es hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 , haloalquilo C 1 -C 8 o carbociclilo C 3-C8, heterociclilo C 1 -C 10 , arilo, heteroaralquilo, o aralquilo; y R3B es alquilo C 1 -C 8, haloalquilo C 1 -C 8, carbociclilo C 3-C 8 , heterociclilo C 1 -C 10 , arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R3A es hidrógeno, alquilo C 1 -C 8, haloalquilo C 1 -C 8, carbociclilo C 3 -C 8, heterociclilo C 1 -C 10 , arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R3B es alquilo C 1 -C 8, haloalquilo C 1 -C 8 , carbociclilo C 3-C 8, heterociclilo C 1 -C 10 , arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en las que R3A es halógeno.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R3A es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A es metilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3B es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3B es metilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3B es isopropilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3B es carbociclilo C 3-C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3B es ciclohexilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A es alquilo C 1 -C 8 ; y R3B es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A es metilo; y R3B es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R3A es hidrógeno y R3B es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R3A es hidrógeno y R3B es isopropilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A y R3B tomados juntos son alquileno C 2 -C 8 o heteroalquileno C 1 -C8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A y R3B tomados juntos son alquileno C 2 -C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A y R3B tomados juntos son -C H 2 CH 2 -.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A y R3B tomados juntos son -C H 2 CH 2 CH 2 -.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A y R3B tomados juntos son -C H 2 CH 2 CH 2 CH 2 -En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3A y R3B tomados juntos son heteroalquileno C -C8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R3Ay R3B tomados juntos son -C H 2 O CH 2 -.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 , haloalquilo C 1 -C 8 o carbociclilo C 3-C8, heterociclilo C 1 -C 10 , arilo, heteroaralquilo, o aralquilo y R4B es alquilo C 1 -C 8, haloalquilo C 1 -C 8 , carbociclilo C 3 -C 8, heterociclilo C 1 -C 10 , arilo, heteroaralquilo o aralquilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4B es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4B es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4B es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es alquilo C 1 -C 8 y R4B es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es metilo y R4B es metilo.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es hidrógeno y R4B es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A es hidrógeno y R4B es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A y R4B tomados juntos son alquileno C 2-C 8 o heteroalquileno C 1 -C8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4Ay R4B tomados juntos son alquileno C 2-C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A y R4B tomados juntos son -C H 2 CH 2-.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A y R4B tomados juntos son -C H 2 CH 2 CH 2-.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A y R4B tomados juntos son -C H 2 CH 2 CH 2 CH 2-.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A y R4B tomados juntos son heteroalquileno C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R4A y R4B tomados juntos son -C H 2 O CH 2-.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000035_0001
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000035_0002
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000035_0003
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000035_0004
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000035_0005
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0001
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0002
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0003
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0004
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0005
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0006
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000036_0007
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000037_0001
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000037_0002
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000037_0003
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000037_0004
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R5 es
Figure imgf000037_0005
correspondientes, en los que R6 es hidrógeno.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R6 es alquilo C 1 -C 8.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que R6 es metilo.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que X es O.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que X es S.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, y las definiciones correspondientes, en los que el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en:
N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxM-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
W2-[(1-Aminocidopentil)carbonil]-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metiM-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalaml-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxM-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida;
N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metioxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N2-[(1-Aminocidopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N2-[(1-Aminocidopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
1 - Amino-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2 - il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]ciclohexanocarboxamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N -metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il] - N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(cidohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N2-[(3-Aminooxetan-3-il)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida;
N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-[[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenil-propan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)aiTimo]propil}pirrolidin-1-ii]-5-iTietiM-oxoheptan-4-il}-N-iTietil-L-valinaiTiida;
2-Metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biddo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)-2-metoxi-2-oxoetil] amino}-1 - metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2 - Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[biciclo [4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il(carboxi)metil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalaml-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-femletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(lS)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3 oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-femletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-metilalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc-butoxi-1-oxo-3-femlpropan-2-il]aiTiino}-1-iTietoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato de metilo;
N,2-dimetilalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc-butoxi-1-oxo-3-femlpropan-2-il]airiino}-1-iTietoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenil-propan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
2 - metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxM-femlpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3 - oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(metilamino)-2-oxoetil] amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2-amino-1-bencil-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(lS)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-oxo-2-(propilamino)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(dietilamino)-2-oxoetil] amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalaml-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(ferc-butilamino)-2-oxoetil] amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
3-metil-D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
3-metil-L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
1.2 - d¡met¡l-L-prol¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-femlet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-D-prol¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-femlet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡md¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N-2-[2,2-d¡met¡l-3-(met¡lam¡no)propano¡l]-N-{(1S,2R)-2-metox¡-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da; N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-d¡met¡l-3-(met¡lam¡no)propano¡l]-L-val¡l}(met¡l)am¡no]-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
N-{(2R,3R)-3-Metox¡-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-4-[met¡l(N-{[(2S)-2-met¡lp¡pend¡n-2-¡l]carboml}-L-val¡l)am¡no]heptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
N-{(2R,3R)-3-Metox¡-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-4-[met¡l(N-{[(2R)-2-met¡lp¡pend¡n-2-¡l]carboml}-L-val¡l)am¡no]heptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
N-{(2R,3R)-3-metox¡-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-4-[met¡l(N-{[(2S)-2-met¡lp¡pend¡n-2-¡l]carboml}-L-val¡l)am¡no]heptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡na;
N-{(2R,3R)-3-metox¡-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-4-[met¡l(N-{[(2R)-2-met¡lp¡pend¡n-2-¡l]carboml}-L-val¡l)am¡no]heptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡na;
N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carbon¡l}-L-val¡l)(met¡l)am¡no]-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carboml}-L-val¡l)(met¡l)am¡no]-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
(2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ddohepta-2,4,6-tnen-1-¡l)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l](met¡l)am¡no}-3-met¡l-1-oxobutan-2-¡l]-2-met¡lp¡per¡d¡n-2-carboxam¡da;
(2R)-N-[(2S)-H[(3R,4S,5S)-1-(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ddohepta-2,4,6-tnen-1-¡l)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l](met¡l)am¡no}-3-met¡l-1-oxobutan-2-¡l]-2-met¡lp¡per¡d¡n-2-carboxam¡da;
2-met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ddohepta-2,4,6-tnen-1-¡l)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ddohepta-2,4,6-tr¡en-1-¡l)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-2-{[(3R)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carbon¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ddohepta-2,4,6-tr¡en-1-¡l)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-2-{[(3S)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carbon¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
(2S)-N-[(2S)-{[(3R,4S,5S)-3-metoxM-{2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-femM-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l](met¡l)am¡no}-3-met¡l-1-oxobutan-2-¡l]-2-met¡lp¡per¡d¡n-2-carboxam¡da;
(2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxM-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-femM-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l](met¡l)am¡no}-3-met¡l-1-oxobutan-2-¡l]-2-met¡lp¡per¡d¡n-2-carboxam¡da;
N-2-{[(3R)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carbon¡l}-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N-2-{[(3S)-3-fluorop¡md¡d¡n-3-¡l]carboml}-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-am¡nofen¡l)-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-am¡nofen¡l)-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-(1,2,3,4 tetrah¡droqumol¡n-6-¡l)propan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-valinamida;
1.2 - d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-am¡nofeml)-1-metoxM-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-femlpropan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-valmam¡da;
N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carboml}-L-val¡l)(met¡l)am¡no]-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡na;
N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-fluorop¡rrol¡d¡n-3-¡l]carboml}-L-val¡l)(met¡l)am¡no]-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡na;
2-met¡lalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2R,4S)-4-carbox¡-1-femlpentan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-(b¡ddo[1,1,1]pent-1-¡lam¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(1R)-2-metox¡-2-oxo-1-(1-fen¡lc¡doprop¡l)et¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalaml-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(1S)-2-metox¡-2-oxo-1-(1-fen¡lc¡doprop¡l)et¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1R)-1-[(7R)-b¡c¡clo[4,2,0]octa- 1,3,5-tr¡en-7-¡l]-2-metox¡-2-oxoet¡l}am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da; 2-met¡lalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)-1-[(7S)-b¡ddo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-¡l]-2-metox¡-2-oxoet¡l}am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da; N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-fen¡l-propan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)-1-[(7R)-b¡c¡clo[4,2,0]octa-1,3,5-tr¡en-7-¡l]-2-metox¡-2-oxoet¡l}am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da; N, N,2-tr¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l] -N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N,N,2-tr¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)-carbox¡(1-fen¡lc¡cloprop¡l)met¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
d¡fluoro{2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(3R,4R,7S)-7-benc¡l-15-{2-[(3,5-d¡met¡l-1H-p¡rrol-2-¡l-kappaN)met¡l¡deno]-2H-p¡rrol-5-¡l-kappaN}-4-met¡l-5,8,13-tr¡oxo-2-oxa-6,9,12-tr¡azapentadecan-3-¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡dato}boro;
2-met¡l-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N -met¡l-L-val¡nam¡da;
N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(3-am¡nooxetan-3-¡l)carbon¡l]-L-val¡l}(met¡l)am¡no]-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l}p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
2-met¡lalaml-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S,12S)-7-bendM4-[3-doro-4-(propan-2-¡lox¡)feml]-4-met¡l-12-[4-(8-met¡l¡m¡dazo[1,2-a]p¡r¡d¡n-2-¡l)benc¡l]-5,8,14-tr¡oxo-2,9-d¡oxa-6,13-d¡azatetradecan-3-¡l}p¡rrol¡d¡n-1-¡l]-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[4-(5-fluoro-1,3-benzot¡azol-2-¡l)-2-met¡lfen¡l]am¡no}-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l] -N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-¡ndol-3-¡l)-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fen¡l-1-(prop-2-en-1-¡lox¡)propan-2-¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
2-met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc-butox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-({(2S)-1-oxo-3-fen¡l-1-[(1H-1,2,3-tr¡azol-4-¡lmet¡l)am¡no]propan-2-¡l}am¡no)prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da; N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fen¡l-1-(prop-2 - ¡n-1-¡lam¡no)propan-2-¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-¡m¡dazol-4-¡l)-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1 - metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N -met¡l-L-val¡nam¡da;
N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-h¡drox¡fen¡l)-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1R)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fen¡l-1-(p¡peraz¡n-1-¡l)propan-2-¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da;
1.2 - d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-am¡no-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3 - oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l] -N-met¡l-L-val¡nam¡da; y
2 - met¡l-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(c¡clohepta-2,4,6-tr¡en-1-¡l)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l] -N-met¡l-L-val¡nam¡da.
En determ¡nadas real¡zac¡ones, la d¡vulgac¡ón se ref¡ere a cualqu¡era de los compuestos menc¡onados anter¡ormente y las def¡n¡c¡ones correspondentes, en los que R1 es
Figure imgf000042_0001
En determ¡nadas real¡zac¡ones, la d¡vulgac¡ón se ref¡ere a cualqu¡era de los compuestos menc¡onados anter¡ormente y las def¡n¡c¡ones correspond¡entes, en los que R1 es
Figure imgf000042_0002
En determ¡nadas real¡zac¡ones, la d¡vulgac¡ón se ref¡ere a cualqu¡era de los compuestos menc¡onados anter¡ormente y las def¡n¡c¡ones correspond¡entes, en los que R1 es
Figure imgf000042_0003
En determ¡nadas real¡zac¡ones, la presente ¡nvenc¡ón se ref¡ere a los compuestos y las def¡n¡c¡ones correspond¡entes, en los que Y es alqu¡leno C 2-C 20.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Y es -(CH 2 )p-; y p es 1-10.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 1. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 2. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 3. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 4. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 5. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 6. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 7. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 8. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 9. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que p es 10.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a los compuestos y las definiciones correspondientes, en los que Y es heteroalquileno C 2 -C 20.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Y es -(CH 2 CH 2 O)qCH2 CH 2 -; y q es 1-10.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 1. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 2. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 3. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 4. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 5. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 6. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 7. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 8. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 9. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que q es 10.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000043_0001
En determinadas realizaciones, la divulgación se
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de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000043_0003
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000043_0004
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000044_0001
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000044_0002
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000044_0003
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R7 es F o Cl; y h es 4 o 5.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R7 es F; y h es 3, 4 o 5.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que R7 es F; y h es 5.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es -NH2.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que G es Cl. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que G es Br. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que G es I.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en los compuestos de la Tabla 18B.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000045_0004
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000045_0001
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000045_0002
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000045_0003
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es -NHL.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000046_0001
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que Z es
Figure imgf000046_0002
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente y las definiciones correspondientes, en los que L es H(C)-.
En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a cualquiera de los compuestos anteriormente mencionados y definiciones adjuntas, en las que L es un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo murino para el tratamiento de cáncer de ovarios tales como oregovomab (OVAREx ®); un anticuerpo IgG2 a murino para el tratamiento de cáncer colorrectal tales como edrecolomab (PANOREX®); un anticuerpo quimérico IgG anti-EGFR para el tratamiento de cánceres positivos de factor de crecimiento epidérmico, tales como cáncer de cabeza y cuello, por ejemplo cetuximab (ERBITUX®); un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sarcoma, tales como el Anticuerpo Monoclonal Humanizado al Receptor de Vitronectina (ayp3 ) como Vitaxin®; un anticuerpo IgGi humanizado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL) tales como alemtuzumab (CAMPATH I/H®); SMART ID10 que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; 131I Lym-1 (ONCOLYM®) que es un anticuerpo anti-HLA-DrlO murino radiomarcado para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; un mAc anti-CD2 humanizado para el tratamiento de Enfermedad de Hodgkin o un linfoma no hodgkiniano tal como ALLOMUNE®; labetuzumab (CEACIDE®) que es un anticuerpo anti-CEA humanizado para el cáncer colorrectal; bevacizumab (AVASTIN®) que es un mAb anti-VEGF-A humanizado para el tratamiento de cáncer de cerebro, de colon, de riñón o de pulmón; Tiuxetano de ibritumomab (ZEVALIN®) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; ofatumumab (ARZERRA®) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica; panitumumab (VECTIBIX®) que es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR humano para el tratamiento de cáncer de colon; rituximab (RITUXAN®) que es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20 para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica y linfoma no hodkiniano; tositumomab (BEXXAR®) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; trastuzumab (HERCEPTIN®) que es un anticuerpo monoclonal anti-receptor HER2 para el tratamiento de cáncer de mama y de estómago; ipilimumab (YERVOY®) que es un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA4 para el tratamiento de melanoma; gemtuzumab y ozogamicina inotuzumab.
En otra realización específica, L incluye anticuerpos seleccionados de anticuerpos anti-I-13, incluyendo anticuerpos anti-I-13 usados en el tratamiento de cáncer, por ejemplo anticuerpos anti-IL-13Ra2.
En todavía otra realización específica, L incluye anticuerpos seleccionados de anticuerpos anti-Notch, incluyendo anticuerpos anti-Notch usados en el tratamiento de cáncer.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo L se une al engarce a través de un enlace sulfuro o a través de un enlace sulfuro-sulfuro.
Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado fármaco anticuerpo que comprende cualquiera de los compuestos reivindicados.
Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado fármaco anticuerpo que comprende un anticuerpo y uno cualquiera de los compuestos reivindicados.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados fármaco anticuerpo anteriormente mencionados y definiciones adjuntas, en los que el compuesto se une covalentemente al anticuerpo. En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados anticuerpo fármaco anteriormente mencionados y definiciones adjuntas, en los que en dicho conjugado fármaco anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los compuestos de la Tabla 18B
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En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados anticuerpo fármaco anteriormente mencionados y definiciones adjuntas, en los que el conjugado fármaco anticuerpo comprende entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 compuestos de la invención.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados fármaco anticuerpo anteriormente mencionados y definiciones adjuntas, en los que el conjugado fármaco anticuerpo comprende 3 o 4 compuestos de la invención.
La unidad de anticuerpo (Ac)
Como se ha indicado anteriormente, el término "anticuerpo" (o "Ac") en el presente documento se usa en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo que exhiben la actividad biológica deseada. Además, aunque ciertos aspectos de la invención descritos en el presente documento se refieren a conjugados fármaco anticuerpo, se prevé además que la porción del anticuerpo del conjugado pueda reemplazarse por cualquier cosa que se una específicamente o se asocie reactivamente o se compleje con un receptor, un antígeno u otro resto receptivo asociado a una población celular diana dada. Por ejemplo, en lugar de contener un anticuerpo un conjugado de la invención podría contener una molécula que marque como diana que se une a, compleja con o reacciona con un receptor, un antígeno u otro resto receptor de una población buscado ser terapéuticamente o de otra forma biológicamente modificado. Los ejemplos de tales moléculas incluyen proteínas de menor peso molecular, polipéptidos o péptidos, lectinas, glucoproteínas, distintos de péptidos, vitaminas, moléculas transportadoras de nutrientes (tales como, pero no limitadas a, transferrina) o cualquier otra molécula o sustancias de unión a células. En ciertos aspectos, el anticuerpo u otra de dichas moléculas de marcaje como diana actúan transportando un fármaco a la población de células diana particular con la que interactúa el anticuerpo u otra molécula de marcaje como diana.
Los heteroátomos que pueden estar presentes en una unidad de anticuerpo incluyen azufre (en una realización, de un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo), oxígeno (en una realización, de un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un anticuerpo) y nitrógeno (en una realización, de un grupo amino primario o secundario de un anticuerpo). Estos heteroátomos pueden estar presentes en el anticuerpo en el estado natural del anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo de origen natural, o puede introducirse en el anticuerpo a través de modificación química.
En una realización, una unidad de anticuerpo tiene un grupo sulfhidrilo y la unidad de anticuerpo se une a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otra realización, el anticuerpo tiene restos de lisina que pueden reaccionar con ésteres activados (dichos ésteres incluyen, pero no se limitan a, ésteres de A/-hidrosuccinimida, de pentafluorofenilo y de p-nitrofenilo) y de esta manera forman un enlace amida que consiste en el átomo de nitrógeno de la unidad de anticuerpo y un carbonilo. En otro aspecto más, la unidad de anticuerpo tiene uno o más restos de lisina que pueden modificarse químicamente para introducir uno o más grupos sulfhidrilo. Los reactivos que pueden usarse para modificar lisinas incluyen, pero no se limitan a, S-acetiltioacetato de W-succinimidilo (SATA) y clorhidrato de 2-iminotiolano (Reactivo de Traut). En otra realización, la unidad de anticuerpo puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden modificarse químicamente para tener uno o más grupos sulfhidrilo.
En otra realización más, la unidad de anticuerpo puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden oxidarse para proporcionar un grupo aldehido (véase, por ejemplo, Laguzza, y col., 1989, J. Med. Chem. 32(3):548-55). El aldehido correspondiente puede formar un enlace con un sitio reactivo tal como, por ejemplo, hidrazina e hidroxilamina. Otros protocolos para la modificación de proteínas para la fijación o asociación de fármacos se describen en Coligan y col., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002).
Cuando los conjugados comprenden proteínas no inmunorreactivas, polipéptidos o unidades peptídicas en lugar de un anticuerpo, las proteínas no inmunorreactivas, los polipéptidos o unidades peptídicas útiles incluyen, pero no se limitan a, transferrina, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, factores de crecimiento transformante ("TOP"), tales como T G F -a y TGF-p, factor de crecimiento de vaccinia ("VGF"), factores de crecimiento de insulina y tipo insulina I y II, somatostatina, lectinas y apoproteína de lipoproteína de baja densidad.
Los anticuerpos policlonales útiles son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales útiles son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un determinante antigénico particular (por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno vírico, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un carbohidrato, un químico, un ácido nucleico, o fragmentos de los mismos). Un anticuerpo monoclonal (mAc) para un antígeno de interés puede prepararse usando cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpo o anticuerpos monoclonales quiméricos. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden fabricarse por cualquiera de numerosas técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, Teng y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. e E.UU. 80:7308-7312; Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4:72-79; y Olsson y col., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo específico. Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica se analizan a continuación.
El anticuerpo puede ser un fragmento funcionalmente activo, un derivado o análogo de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a células diana (por ejemplo, antígenos de células cancerosas, antígenos víricos o antígenos antimicrobianos) u otros anticuerpos que se unen a las células tumorales o a la matriz. A este respecto, "funcionalmente activo" significa que el fragmento, el derivado el análogo es capaz de provocar anticuerpos anti-antiidiotipo que reconocen el mismo antígeno que el anticuerpo del que el fragmento, el derivado o el análogo se reconoce derivado. Específicamente, en una realización ejemplar la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede potenciarse por la eliminación de las secuencias marco y CDR que son C-terminales a la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar qué secuencias CDR se unen al antígeno, pueden usarse péptidos sintéticos que contienen secuencias CDR en ensayos de unión con el antígeno por cualquier procedimiento de ensayo de unión conocido en la técnica (por ejemplo, el ensayo BIA core) (para la localización de las secuencias CDR véase, por ejemplo, Kabat y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, National Institutes of Health, Bethesda, Md. Kabat E y col., 1980, J. Immunology 125(3):961-969).
Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, pero no limitado a, fragmentos F(ab')2 , fragmentos Fab, Fv, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, scFv, scFv-Fv o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo.
Además, anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que pueden fabricarse usando técnicas de ADN recombinante convencionales, son anticuerpos útiles. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones derivan de diferentes especies animales, tales como por ejemplo, aquellos que tienen una región variable derivada de regiones constantes de una inmunoglobulina monoclonal murina y una humana. (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 4.816.567; y la patente de EE.UU. n.° 4.816.397, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, la patente de E E .u U. n.° 5.585.089, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando procedimientos descritos en la Publicación Internacional n.° WO 87/02671; la Publicación de Patente Europea n.° 0 184 187; la Publicación de Patente Europea n.° 0 171 496; la Publicación de Patente Europea n.° 0173 494; la Publicación Internacional n.° WO 86/01533; la patente de EE.UU. n.° 4.816.567; la Publicación de Patente Europea n.° 012 023; Berter y col., 1988, Science 240:1041-1043; Liu y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:3439-3443; Liu y col., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:214-218; Nishimura y col., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood y col., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw y col., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi y col., 1986, BioTechniques 4:214; la patente de EE.UU. n.° 5.225.539; Jones y col., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan y col., 1988, Science 239:1534; y Beidler y col., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables y pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas endógenas, pero que pueden expresar genes de cadenas pesada y ligera humanas. Los ratones transgénicos se inmunizan de forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todos o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se redisponen durante la diferenciación de los linfocitos B y posteriormente se someten a cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión global de esta tecnología para anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol.
13:65-93. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806. Otros anticuerpos humanos pueden obtenerse en el mercado de, por ejemplo, Abgenix, Inc. (now Amgen, Freemont, Calif.) y Medarex (Princeton, N.J.).
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se use para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Véase, por ejemplo, Jespers y col., 1994, Biotechnology 12:899-903). Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de visualización de fagos (véase, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks y col., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan y Carter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, en Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu y Fick, eds., Marcel Dekker, Nueva York, N.Y., Capítulo 20, págs. 427-469).
En otras realizaciones, el anticuerpo es una proteína de fusión de un anticuerpo o un fragmento funcionalmente activo del mismo, por ejemplo en el que el anticuerpo se condensa a través de un enlace covalente (por ejemplo un enlace peptídico), bien en el W-terminal o el C-terminal de una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o una porción de la misma, preferentemente al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína) que no es de un anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento del mismo se une covalentemente a la otra proteína en el W-terminal del dominio constante.
Los anticuerpos incluyen análogos y derivados que están ya sea modificados, es decir, por la fijación covalente de cualquier tipo de molécula siempre que tal fijación covalente permita que el anticuerpo retenga su inmunoespecificidad de unión a antígeno. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de los anticuerpos incluyen aquellos que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una unidad de anticuerpo celular u otra proteína, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas incluyendo, pero no limitado a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el análogo o el derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales.
Los anticuerpos pueden tener modificaciones (por ejemplo, sustituciones, eliminaciones o adiciones) en restos de aminoácidos que interactúan con receptores Fc. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en los restos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional n.°W O 97/34631.
Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa pueden obtenerse en el mercado o producirse por cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia tales como, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o una base de datos como ella, publicaciones de bibliografía o por clonación y secuenciación rutinarias.
En una realización específica, pueden usarse anticuerpos conocidos para el tratamiento de cáncer. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerígena pueden obtenerse en el mercado o producirse por cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia tales como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerígena puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o una base de datos como ella, publicaciones de bibliografía o por clonación y secuenciación rutinarias. Los ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, O VAREX® que es un anticuerpo murino para el tratamiento de cáncer de ovarios; p A n o R e X ® (Glaxo Wellcome, NC) que es un anticuerpo IgG2 a murino para el tratamiento de cáncer colorrectal; Cetuximab ERBITUX® (Imclone Systems Inc., NY) que es un anticuerpo quimérico IgG anti-EGFR para el tratamiento de cánceres positivos de factor de crecimiento epidérmico, tales como cáncer de cabeza y cuello; Vitaxin® (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sarcoma; CAMPATH I/H® (Leukosite, MA) que es un anticuerpo IgG1 humanizado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL); SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; ONCOLYM® (Techniclone, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DrlO murino radiomarcado para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; ALLOMUNE® (BioTrasplant, CA) que es un mAc anti-CD2 humanizado para el tratamiento de Enfermedad de Hodgkin o un linfoma no hodgkiniano; CEACID E® (Immunomedics, NJ) que es un anticuerpo anti-CEA humanizado para el cáncer colorrectal; AVASTIN® (Genentech/Roche, CA) que es un mAb anti-VEGF-A humanizado para el tratamiento de cáncer de cerebro, de colon, de riñón o de pulmón; ZEVALIN® (Spectrum Pharmaceuticals, NV) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; ARZERRA® (GSK, UK) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica; VECTIBIX® (Amgen, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR humano para el tratamiento de cáncer de colon; RITUXAN® (Genentech/BioGen, CA) que es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20 para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica y linfoma no hodkiniano; BEXXAR® (GSK, UK) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no hodkiniano; H ERCEPTIN ® (Genentech, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-receptor HER2 para el tratamiento de cáncer de mama y de estómago; YER VO Y® (BMS, NJ) que es un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA4 para el tratamiento de melanoma; M YLOTARG® (Wyeth/Pfizer, NY) que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD33 conjugado a calicheamicina para el tratamiento de leucemia mielógena aguda; y inotuzumab ozogamicin (Wyeth/Pfizer, Ny ) que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD22 conjugado a calicheamicina para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica y linfoma no hodkiniano.
En otra realización específica, pueden usarse anticuerpos anti-IL13, incluyendo anticuerpos anti-IL13 usados en el tratamiento de cáncer.
En otra realización específica, pueden usarse anticuerpos anti-Notch, incluyendo anticuerpos anti-Notch usados en el tratamiento de cáncer.
En intentos para descubrir dianas celulares eficaces para terapia y diagnóstico del cáncer, los investigadores han tratado de identificar los polipéptidos transmembrana o asociados con tumores que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, estos polipéptidos asociados a tumores se expresan más abundantemente en la superficie de las células cancerosas que en la superficie de las células no cancerosas. La identificación de tales antígenos polipéptidos de superficie celular asociados a tumores ha dado lugar a la capacidad de dirigirse específicamente a las células cancerosas para su destrucción mediante terapias basadas en anticuerpos.
Síntesis de compuestos y conjugados de anticuerpo fármaco de los mismos
Los compuestos y conjugados de la invención pueden prepararse usando los procedimientos sintéticos indicados más adelante en los Ejemplos.
Como se describe con mayor detalle más adelante, los compuestos y conjugados de la invención pueden prepararse usando una sección de una unidad de engarce que tiene un sitio reactivo para unión al compuesto.
Engarce
Un engarce (denominado algunas veces en el presente documento como "[engarce]") es un compuesto bifuncional que puede usarse para conectar un fármaco y un anticuerpo para formar un conjugado de anticuerpo fármaco (ADC). Tales conjugados son útiles, por ejemplo, en la formación de inmunoconjugados dirigidos contra antígenos tumorales asociados. Tales conjugados permiten la entrega selectiva de fármacos citotóxicos a las células tumorales.
En una realización, el engarce tiene la fórmula: es
Figure imgf000051_0001
en la que
Y es alquileno C 2 -C 20 o heteroalquileno C 2-C 20 ; carbociclo C 3-C 8-, -arileno-, -heterociclo C 3-C 8-, -alquilen C arileno-, -arileno-alquileno C 1 -C 10 -, -alquilen C 1 -C 10 -(carbociclo C 3-C 8)-, -(carbociclo C 3-C 8)-alquileno C 1 -C 10 -, -alquilen C 1 -C 10 -(heterociclo C 3-C 8)- o -(heterociclo C 3-C 8)-alquileno C 1 -C 10 -;
Z es
Figure imgf000051_0002
o -NH 2 ;
R7 se selecciona independientemente cada vez que aparece entre el grupo que consiste en F, Cl, I, Br, NO2 , CN
y C F 3 ;
R10 es hidrógeno, -alquilo C 1 -C 10 , -carbociclo C 3-C 8 , arilo, -heteroalquilo C 1 -C 10 , -heterociclo C 3-C 8 , -C 10 -arilo, -arileno-alquilo C 1 -C 10 , -alquileno C 1 -C 10 -(carbociclo C 3-C 8), -(carbociclo C 3-C 8)-alquilo C 1 -C 10 , -alquilen
C 1 -C 10 -(heterociclo C 3-C 8) y -(heterociclo C 3-C 8 )-alquilo C 1 -C 10 , en los que el arilo en los R 10 que comprenden arilo está opcionalmente sustituido con [R7 K y
h es 1, 2, 3, 4 o 5.
En un ADC el engarce sirve para unir la carga útil al anticuerpo.
En un aspecto, se introduce una segunda sección de unidad de engarce que tiene un segundo sitio reactivo, por ejemplo, un grupo electrófilo que es reactivo a un grupo nucleófilo presente en una unidad de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo). Los grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo electrófilo en una unidad de engarce y forma un enlace covalente a una unidad de engarce. Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero sin limitación, grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrófilo proporciona un sitio conveniente para la unión de anticuerpo.
En otra realización, una unidad de engarce tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo a un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, grupos aldehido y cetona carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de una unidad de engarce puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y forma un enlace covalente al anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en una unidad de engarce incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a una unidad de engarce.
Los grupos funcionales amino también son sitios reactivos útiles para una unidad de engarce puesto que pueden reaccionar con ácido carboxílico, o ésteres activados de un compuesto para formar un engarce de amida.
Típicamente, Los compuestos basados en péptidos de la invención pueden prepararse formando un enlace de péptidos entre dos o más fragmentos de aminoácidos y/o péptidos. Tales enlaces de péptidos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (véase, por ejemplo, Schroder y Lubke, "The Peptides", volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos.
Como se describe con mayor detalle más adelante, los conjugados pueden prepararse usando una sección del engarce que tiene un sitio reactivo para unión a un compuesto de la invención e introduciendo otra sección de la unidad de engarce que tiene un sitio reactivo para un anticuerpo. En un aspecto, una unidad de engarce tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo con un grupo nucleófilo presente en una unidad de anticuerpo, tal como un anticuerpo. El grupo electrófilo proporciona un sitio conveniente para la unión de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo electrófilo en una unidad de Engarce y forma un enlace covalente a una unidad de engarce. Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero sin limitación, grupos maleimida y haloacetamida.
En otra realización, una unidad de engarce tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo con un grupo electrófilo presente en una unidad de anticuerpo. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a una unidad de engarce. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, grupos aldehído y cetona carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de una unidad de engarce puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y forma un enlace covalente al anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en una unidad de engarce incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
Como se usa en el presente documento, "mc-" conocido previamente como "MalC-" se refiere a
Figure imgf000052_0001
Como se usa en el presente documento, "mcValCitPABC-" conocido previamente como "MalCValCitPABC-" se refiere a
Figure imgf000052_0002
Como se usa en el presente documento, "AmPegXC2-" se refiere a
Figure imgf000052_0003
Como se usa en el presente documento, "mcValCitPABCAmPegXC2-"se refiere a
Figure imgf000052_0004
Como se usa en el presente documento, "MalPegXC2ValCitPABC-" se refiere a
Figure imgf000053_0001
Como se usa en el presente documento, "2BrAcPegXC2" se refiere a
Figure imgf000053_0002
Como se usa en el presente documento, "mv-" se refiere a
Figure imgf000053_0003
Como se usa en el presente documento, "mb-" se refiere a
Figure imgf000053_0004
Como se usa en el presente documento, "me-" se refiere a
Figure imgf000053_0005
Como se usa en el presente documento, "MalC6-" se refiere a
Figure imgf000053_0006
Como se usa en el presente documento, "PFPCOPegXC2ValCitPABC-" se refiere a
Figure imgf000053_0007
Figure imgf000054_0001
Como se usa en el presente documento, "PFPCOPegXC2-" se refiere a
Figure imgf000054_0002
Como se usa en el presente documento, "PFPCOPegXC2Am PegYC2PABC-" se refiere a
Figure imgf000054_0003
Como se usa en el presente documento, "AzCOC2Ph4AmCOPeg2C2-" se refiere a
Figure imgf000054_0004
Como se usa en el presente documento, "AzCOC2Ph4Am Peg1C1-" se refiere a
Figure imgf000054_0005
Como se usa en el presente documento, "AcLysValCitPABC-" se refiere a
Figure imgf000054_0006
Conjugación con Transglutaminasa
En determinadas realizaciones, un compuesto de la invención puede reticularse covalentemente a un polipéptido que contiene Fc o que contiene Fab diseñado por ingeniería genética con una etiqueta que contiene glutamina donadora (por ejemplo, etiquetas peptídicas que contienen Gln o etiquetas Q) o una glutamina endógena hecha reactiva (es decir, la capacidad de formar un enlace covalente como un donador acilo en presencia de una amina y una transglutaminasa) por ingeniería genética de polipéptidos (por ejemplo, a través de eliminación, sustitución, mutación de aminoácidos o cualquier combinación de los mismos en el polipéptido), en presencia de transglutaminasa, con la condición de que el compuesto de la invención comprende un agente donador de amina (por ejemplo, una molécula pequeña que comprende o está fijada a una amina reactiva), formando por lo tanto una población estable y homogénea de un conjugado polipeptídico que contiene Fc diseñado por ingeniería genética con el agente donador de amina estando específicamente conjugado en sitio al polipéptido que contiene Fc o que contiene Fab a través de la etiqueta que contiene glutamina donadora de acetilo o la glutamina endógena expuesta/accesible/reactiva. Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden conjugarse como se describe en la Solicitud de Patente Internacional n.° de serie PCT/IB2011/054899. En determinadas realizaciones, para facilitar la conjugación del compuesto de la invención y el polipéptido que contiene Fc o que contiene Fab diseñado por ingeniería con una etiqueta que contiene glutamina donadora de acilo o una glutamina endógena hecha reactiva por diseño por ingeniería de polipéptido en presencia de transglutaminasa, Z es NR2.
Conjugación a la región constante del dom inio kappa de cadena ligera humana
En determinadas realizaciones, un compuesto de la invención puede estar covalentemente unido al lado de la cadena de K188 de la región constante del dominio kappa de cadena ligera humana (CLk) (numeración de cadena de longitud completa de acuerdo con Kabat). K188 también puede denominarse C L k K80, cuando se cuenta solamente la región constante kappa humana, por ejemplo, de SEQ ID NO: 1,2 , 3 y 4).
Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden conjugarse como se describe en la Solicitud de Patente de E E .u U. con Número de Serie 13/180.204 o el documento WO2012/007896. En determinadas realizaciones, para facilitar la conjugación a K188 C L k (CLk-K 80), Z es
Figure imgf000055_0001
cada R7 se selecciona independientemente cada vez que está presente del grupo que consiste en F, Cl, I, Br, NO2 , CN y C F 3 ; y h es 1, 2, 3, 4 o 5.
En determinadas realizaciones, para facilitar la conjugación a K188 C L k (CLk-K 80), Z es
Figure imgf000055_0002
La presente invención proporciona además conjugados fármaco anticuerpo que comprende un anticuerpo, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un dominio kappa constante conjugado covalentemente a una toxina de la invención, caracterizado porque al menos una toxina de la invención se conjuga covalentemente a K80 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, S E C ID NO: 3 o S E C ID NO: 4 (tabla 1). En algunos aspectos, el número de toxinas de la invención conjugadas covalentemente a la K80 puede ser un intervalo cuyo límite inferior se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9 y aproximadamente 2,0 y cuyo límite superior se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5. En algunos aspectos, p es aproximadamente 2.
La conjugación de la toxina con el dominio ligero constante de un anticuerpo es particularmente deseable para minimizar o prevenir, cualquier interferencia con la unión de la porción Fc del anticuerpo a los receptores Fc (tales como F cyR y FcRn) o la unión del anticuerpo a su diana respectiva. A la inversa, la conjugación de la toxina respectiva a la porción Fc de un anticuerpo puede disminuir la vida media in vivo del anticuerpo y/o su capacidad para interactuar con el sistema inmune (función efectora). La conjugación de la toxina en la región de la cadena pesada variable (VH) o de la cadena ligera variable (VL) del anticuerpo lleva un riesgo de disminuir la unión del antígeno del anticuerpo a su cognato.
Adicionalmente, mientras que la conjugación a C L k-K 80 es confiable y robusta, la conjugación a otras lisinas de la superficie del anticuerpo, cada una de reactividad y pI ligeramente diferentes pueden dar como resultado una muestra heterogénea de anticuerpos conjugados que pueden liberar moléculas conjugadas a tiempos inoportunos o irregulares, tales como durante la circulación y antes del transporte del Resto Efector a la diana por el reconocimiento del anticuerpo.
Además, la presente invención proporciona polimorfismos conocidos de la cadena kappa V/A en la posición 45 y A/L en la posición 83 (dando los 3 polimorfismos kappa constantes humanos conocidos Km(1):V45/L83 (SEQ ID NO: 2), Km (1,2): A45/L83 (SEQ ID NO: 3) y Km(3) A45/V83 (SEQ ID NO: 4)). La variabilidad de los restos en las posiciones 45 y 83 en SEQ ID NO: 1 puede seleccionarse de tal manera que solamente proporcione uno cualquiera, dos o los tres de los polimorfismos Km(1), Km(1,2) y Km(3).
Tabla 1
Figure imgf000056_0002
En determinadas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de la invención conjugado covalentemente a un anticuerpo (o una porción de unión a antígeno del mismo), en el que al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % del compuesto de la invención en la composición se conjuga al anticuerpo o a la porción de unión a antígeno del mismo en K188 C L k.
Los compuestos desvelados
Figure imgf000056_0001
y
Figure imgf000057_0001
pueden conjugarse al sitio de combinación de un anticuerpo catalítico, tales como anticuerpos de aldolasa o una porción de unión a antígeno de los mismos. Los anticuerpos de aldolasa contienen porciones de sitios de combinación que, cuando no tienen cargas (por ejemplo por conjugación), catalizan una reacción de adición de aldol entre un donador de cetona alifática y un aceptor de aldehído. Los contenidos de la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° US 2006/205670, en particular las páginas 78 -118 que describen engarces y los párrafos [0153]-[0233] que describen anticuerpos, fragmentos útiles, variantes y modificaciones de los mismos, h38C2, sitios de combinación y regiones determinantes de complementariedad (CDR) y tecnología de anticuerpos relacionados (Tabla 2 y los compuestos ejemplares a continuación):
Figure imgf000057_0002
La expresión "sitio de combinación" incluye las CD R y los restos marco adyacentes que están implicados en la unión a antígeno.
Tabla 2
Figure imgf000057_0003
continuación
Figure imgf000058_0001
Conjugación con engarces que comprenden succinimidas, incluyendo versiones de anillo abierto
En determinadas realizaciones, la presente invención incluye un compuesto de la invención conjugado mediante un engarce basado en succinimida o un engarce basado en succinimida de anillo abierto. La estabilidad del engarce de succinimida-cisteína se ha vuelto un área de interés creciente. Las succinimidas pueden transferirse tanto in vitro como in vivo a nucleófilos de tiol exógenos, presumiblemente a través de una reacción de retro-Michael, dando como resultado una maleimida que posteriormente se une mediante un tiol. Se cree que la hidrólisis del anillo da como resultado una especie que es resistente a reacción de retro-Michael. Esto hace que el conjugado resultante sea más estable y potencialmente más eficaz. Las condiciones pueden ser optimizadas para abrir a la fuerza el anillo succinimida en el conjugado. Las condiciones básicas resultaron en una sencilla hidrólisis del anillo. Por ejemplo, los engarces que contienen una cadena de polietilenglicol (PEG) pueden hidrolizarse a pH 9,2 a 37 °C en aproximadamente 12 h, y los engarces que contienen una cadena de alquilo, tal como "mc" pueden requerir una temperatura más alta y un tiempo de reacción más largo para llevar a finalización la apertura de anillo.
Figure imgf000059_0001
Ejemplo de hidrólisis forzada de conjugados basados en maleimida
Para asegurar la estabilidad de estos conjugados y priorizar las muestras para evaluación in vivo, se desarrolló un ensayo que implica el tratamiento de los conjugados unidos a maleimida con exceso de glutationa acuosa (GSH) o plasma. Se analizaron alícuotas de la mezcla de reacción en diversos momentos de tiempo para determinar la carga del conjugado, usando la metodología descrita anteriormente. Los resultados (Tabla 24) indican que el engarce de fármaco-anticuerpo se escinde lentamente de una manera dependiente de GSH. Como era de esperar, la tasa de escisión depende en gran medida de la hidrólisis del anillo succinimida. De forma importante, estos resultados parecen traducirse en una exposición a PK mejorada, según se midió por un aumento en el área bajo la curva (ABC) del conjugado y por un aumento en la tasa de exposición a conjugado/Ab.
Procedimiento para evaluar la estabilidad de ADC
La muestra de ADC (30 |jg) en PBS se mezcla con una solución de glutationa (GSH) para producir una concentración final de GSH de 0,5 mM y una concentración de proteína de 3 mg/ml. Una mezcla de control (sin GSH) se preparó del mismo modo a partir de 30 jg de ADC diluido a 3 mg/ml en PBS. La muestra de ADC tratada con GSH y la muestra de ADC de control se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras a los 0, 3 y 6 días. Se redujeron alícuotas con exceso de TCEP, se acidificaron añadiendo una solución al 0,1 % de ácido fórmico con acetonitrilo al 10 % y se analizó su carga por CL/EM como se describe a continuación.
Análisis de muestra: El análisis se realizó usando una HPLC capilar Agilent 1100 acoplada con un espectrómetro de masas Xevo G2 Q-TOF de Waters. Los analitos se cargaron en una columna Poroshell 300SB C8 de Zorbax (0,5 mm x 75 mm, mantenida a 80 °C) con ácido fórmico al 0,1 % y se eluyeron usando un gradiente de 20 -40 % de tampón B (acetonitrilo al 80 % , 1-propanol al 18 % , agua al 2 % con ácido fórmico al 0,1 % ) a un caudal de 20 jl/min durante 5,5 minutos. La detección de espectrometría de masas se realizó en modo de sensibilidad positivo con una tensión capital ajustada a 3,3 kV. El análisis de datos se realizó con la función MaxEnt 1 en MassLynx y las intensidades se usaron para el cálculo de carga basado en la fórmula descrita anteriormente.
Composiciones y procedimientos de administración
En otras realizaciones, otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad eficaz de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo y un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, las composiciones son adecuadas para la administración veterinaria o humana.
Las presentes composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un sólido o un líquido. Las vías típicas de administración incluyen, sin limitación, parenteral, ocular e intra-tumoral. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular o intraesternal o técnicas de infusión. En un aspecto, las composiciones se administran parenteralmente. En una realización específica, las composiciones se administran intravenosamente.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de tal manera que permitan que un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificación unitaria y un envase de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo en forma líquida puede mantener una pluralidad de unidades de dosificación.
Los materiales usados en la preparación de las composiciones farmacéuticas pueden ser no tóxicos en las composiciones usadas. Será evidente para aquellos expertos ordinarios en la materia que la dosificación óptima del principio o principios activos en la composición farmacéutica dependerá de una diversidad de factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo, ser humano), la forma particular de un compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo, la manera de la administración y la composición empleada.
El trasportador o vehículo farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o particulados, de tal manera que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimido o en polvo. El vehículo o vehículos pueden ser líquidos. Además, el vehículo o vehículos pueden ser particulados.
La composición puede estar en forma de un sólido o un líquido, por ejemplo, una solución, emulsión o suspensión. En una composición para la administración por inyección, también pueden incluirse uno o más de un tensioactivo, un conservante, un agente humectante, un agente dispersante, un agente de suspensión, un tampón, un estabilizante y un agente isotónico.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones o formas similares distintas, también pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro sódico isotónico, aceites fijados tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como medio disolvente o de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos, fosfatos o aminoácidos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. Una composición parenteral se puede encerrar en ampollas, una jeringa desechable o un vial de dosis múltiples hecho de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante ejemplar. Una composición inyectable es preferentemente estéril.
La cantidad de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y puede determinarse por técnicas clínicas convencionales. Además, los ensayos in vitro o in vivo pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplearse en las composiciones dependerá también de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos aproximadamente un 0,01 % de una composición de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo en peso de la composición. En una realización ejemplar, las composiciones farmacéuticas se preparan de tal manera que una unidad de dosificación parenteral contenga de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2 % en peso de la cantidad de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo.
Para la administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo por kg del peso corporal del paciente. En un aspecto, la composición puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo por kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto, la cantidad administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo.
Generalmente, la dosificación de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del miso administrada a un paciente es típicamente aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente. En un aspecto, la dosificación administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto, la dosificación administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto más, la dosificación administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto más la dosificación administrada está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto más, la dosificación administrada está entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente.
Un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo. La administración puede ser sistémica o local. Se conocen diversos sistemas de administración, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc. y pueden usarse para administrar un compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo. En determinadas realizaciones, se administra más de un compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo a un paciente.
En realizaciones específicas, puede ser deseable administrar uno o más compuestos de la invención y/o conjugados fármaco anticuerpo de los mismos localmente al área en necesidad de tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo y no a modo de limitación, por infusión local durante la cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para heridas después de la cirugía; por inyección; por medio de un catéter; o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas silásticas o fibras. En una realización, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o el primer sitio) de un cáncer, un tumor o un tejido neoplásico o pre-neoplásico. En otra realización, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o el primer sitio) de una manifestación de una enfermedad autoinmune.
En otra realización más, el compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo pueden administrarse en un sistema de liberación controlada, tal como pero no limitado a, pueden usarse una bomba o diversos materiales poliméricos. En otra realización más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en la proximidad de la diana del compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo, por ejemplo, el hígado, requiriendo de esta manera solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citada anteriormente, vol. 2, págs. 115 -138 (1984)). Pueden usarse otros sistemas de liberación controlada analizados anteriormente en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, un adyuvante o un excipiente, con el que se administra un compuesto o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos cuyo origen es petróleo, animal, vegetal o sintético. Los vehículos pueden ser solución salina y similares. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes y otros. En una realización, cuando se administran a un paciente, el compuesto o el conjugado y los vehículos farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un vehículo ejemplar cuando el compuesto o el conjugado se administran por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las presentes composiciones, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Las presentes composiciones pueden tomar la forma de soluciones, gránulos, polvos, formulaciones de liberación sostenida o cualquier otra forma adecuada para su uso. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.
En una realización, el compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo se formulan de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa para animales, particularmente seres humanos. Típicamente, los transportadores o vehículos para la administración intravenosa son soluciones tampón acuosas isotónicas estériles. En caso necesario, las composiciones pueden incluir también un agente solubilizante. Las composiciones para la administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran bien separadamente o bien mezclados juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un saquito que indica la cantidad de principio activo. Cuando un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo ha de administrarse por infusión, puede dispensarse, por ejemplo, con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o solución salina. Cuando el compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo ha de administrarse por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de tal manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
La composición puede incluir diversos materiales que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una capa de revestimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la capa de revestimiento son típicamente inertes y pueden seleccionarse de, por ejemplo, azúcar, goma laca y otros agentes de revestimiento entérico. Como alternativa, los principios activos pueden encerrarse en una cápsula de gelatina.
Ya sea en forma sólida o líquida, las presentes composiciones pueden incluir un agente farmacológico usado en el tratamiento del cáncer.
Usos terapéuticos de compuestos y conjugados fármaco anticuerpo de los mismos
Otro aspecto de la invención se refiere a los compuestos de la invención y los conjugados fármaco anticuerpo de los mismos para tratar cáncer.
Los compuestos de la invención y/o los conjugados fármaco anticuerpo de los mismos son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o una célula cancerosa, provocando la apoptosis en un tumor o una célula cancerosa, o para tratar cáncer en un paciente. Los compuestos de la invención y/o los conjugados fármaco anticuerpo de los mismos pueden usarse en consecuencia en una diversidad de ajustes para el tratamiento de cánceres animales. Dichos conjugados pueden usarse para transportar un compuesto de la invención a una célula tumoral o una célula cancerosa. Sin quedar ligado a teoría alguna, en una realización, el anticuerpo del conjugado se une a o se asocia al antígeno asociado a célula cancerosa o a célula tumoral y el conjugado puede captarse (internalizarse) dentro de una célula tumoral o una célula cancerosa a través de endocitosis mediada por receptor u otro mecanismo de internalización. El antígeno puede fijarse a una célula tumoral o una célula cancerosa o puede ser una proteína de la matriz extracelular asociada a la célula tumoral o a la célula cancerosa. En determinadas realizaciones, una vez dentro de la célula, una o más secuencias peptídicas específicas se escinden enzimática o hidrolíticamente por una o más proteasas asociadas a la célula tumoral o a la célula cancerosa, dando como resultado la liberación de un compuesto de la invención a partir del conjugado. El compuesto liberado de la invención es entonces libre para migrar dentro de la célula e inducir actividades citotóxicas o citostáticas. El conjugado también puede escindirse por una proteasa intracelular para liberar un compuesto de la invención. En una realización alternativa, el compuesto de la invención se escinde desde el conjugado fuera de la célula tumoral o la célula cancerosa y el compuesto de la invención posteriormente penetra en la célula.
En determinadas realizaciones, los conjugados proporcionan marcaje como diana del fármaco de conjugación específica de tumor o de cáncer, reduciendo de esta manera la toxicidad general de los compuestos de la invención. En otra realización, la unidad de anticuerpo se une a la célula tumoral o la célula cancerosa.
En otra realización, la unidad de anticuerpo se une a un antígeno de célula tumoral o de célula cancerosa que está en la superficie de la célula tumoral o la célula cancerosa.
En otra realización, la unidad del anticuerpo se une a un antígeno de célula tumoral o de célula cancerosa que es una proteína de la matriz extracelular asociada a la célula tumoral o a la célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de anticuerpo para una célula tumoral o una célula cancerosa particulares puede ser importante para determinar aquellos tumores o cánceres que se tratan más eficazmente.
Los tipos particulares de cánceres que pueden tratarse con un compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo, incluyen pero no se limitan a, carcinomas de la vejiga, de mama, de cuello de útero, de colon, de endometrio, de riñón, de pulmón, de esófago, de ovario, de próstata, de páncreas, de piel, de estómago y de testículos; y cánceres nacidos en la sangre incluyendo pero no limitados a leucemias y linfomas.
Terapia multimodal para el cáncer. Los cánceres, incluyendo, pero no limitados a, un tumor, una metástasis u otra enfermedad o trastorno caracterizados por el crecimiento celular incontrolado, pueden tratarse o inhibirse mediante la administración de un compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo.
En otras realizaciones, se proporcionan procedimientos para tratar cáncer, incluyendo administrar a un paciente en necesidad de la misma una cantidad eficaz de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo y un agente quimioterapéutico. En una realización el agente quimioterapéutico es aquel con el que el tratamiento del cáncer no se ha encontrado ser refractario. En otra realización, el agente quimioterapéutico es aquel con el que se ha descubierto que el tratamiento del cáncer es refractario. Un compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo pueden administrarse a un paciente que se ha sometido además a cirugía como tratamiento para el cáncer.
En algunas realizaciones, el paciente también recibe un tratamiento adicional, tal como terapia de radiación. En una realización específica, el compuesto de la invención y/o el conjugado fármaco anticuerpo del mismo se administra concurrentemente con el agente quimioterapéutico o con terapia de radiación. En otra realización específica, el agente quimioterapéutico o la terapia de radiación se administra antes de o posteriormente a la administración de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo.
Un agente quimioterapéutico puede administrarse durante una serie de sesiones. Puede administrarse uno cualquiera o una combinación de los agentes quimioterapéuticos, tales como un patrón de agente o agentes quimioterapéuticos para el cuidado.
Además, se proporcionan procedimientos de tratamiento de cáncer con un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo como una alternativa a la quimioterapia o la terapia de radiación donde la quimioterapia o la terapia de radiación ha demostrado o puede demostrar ser demasiado tóxica, por ejemplo, resulta en efectos secundarios inaceptables o que no son llevables, para el sujeto a tratar. El paciente a tratar puede, opcionalmente, tratarse con otro tratamiento para el cáncer tal como cirugía, terapia de radiación o quimioterapia, dependiendo de qué tratamiento se encuentra ser aceptable o llevable.
Los compuestos de la invención y/o los conjugados fármaco anticuerpo de los mismos pueden usarse también de una manera in vitro o ex vivo, tal como para el tratamiento de ciertos cánceres, incluyendo, pero no limitado a leucemias y linfomas, implicando dicho tratamiento trasplantes de células madre autólogas. Esto puede implicar un procedimiento multietapa en el que las células madre hematopoyéticas autólogas del animal se cosechan y se purgan de todas las células cancerosas, después la población celular de la médula ósea que queda en el animal se erradica a través de la administración de una alta dosis de un compuesto de la invención y/o un conjugado fármaco anticuerpo del mismo con o sin terapia de radiación de dosis alta acompañante y el injerto de células madre se infunde de nuevo al animal. Después se proporciona cuidado de soporte mientras que la función de la médula ósea se restaura y el paciente se recupera.
Especies liberadas
La invención se refiere a compuestos de fórmula IV:
Figure imgf000063_0001
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que, independientemente cada vez que está presente,
W es
Figure imgf000063_0002
R1 es
Figure imgf000063_0003
Y es alquileno C 2-C 20 o heteroalquileno C 2-C 20; carbociclo C 3-C 8-, -arileno-, -heterociclo C 3-C 8-, -alquilen C 1-C 10-arileno-, -arileno-alquileno C 1 -C 10 -, -alquilen C 1 -C 10 -(carbociclo C 3-C 8)-, -(carbociclo C 3-C 8)-alquileno C 1 -C 10 -, -alquilen C 1 -C 10 -(heterociclo C 3-C 8)- o -(heterociclo C 3-C 8)-alquileno C 1 -C 10 -;
Z" es
Figure imgf000063_0004
Z'" es
R2 es hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 o haloalquilo C 1 -C 8 ;
R3A y R3B se definen como cualquiera de los siguientes:
(iii) R3A es alquilo C 1 -C 8, haloalquilo C 1 -C 8 , carbociclilo C 3-C 8 o halógeno; y
R3B es alquilo C 1 -C 8 , haloalquilo C 1 -C 8 , carbociclilo C 3-C 8 o halógeno; o
(iv) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C 2 -C 8 o heteroalquileno C 1 -C 8;
R5 es
Figure imgf000064_0001
heterociclilo C 1 -C 10 , carbociclilo C 3-C 8 y arilo C 6-C 14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C 1 -C 8 , -alquil C r C 8-N(R')2 , -alquil C 1 -C8-C(O)R', -alquil C 1 -C 8-C(O)OR' -O-(alquilo C 1 -C 8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2 , -NHC(O)R', -S(O)2 R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N 3 , -N(R')2 , -CN, -NHC(=NH)NH2 , -NHCONH 2 , -S(=O)2 R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1-C 8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C 1 -C 10 ;
o R5 es
Figure imgf000064_0002
opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C 1 -C 8 , -alquil C |-C 8-N(R')2 , -alquil C 1 -C 8-C(O)R', -alquil C 1 -C 8-C(O)OR', -O-(alquilo C 1 -C 8 ), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', - o h ,
halógeno, -N 3 , -N(R')2 , -CN, -NHC(=NH)NH2 , -NHCONH 2 , -S(=O)2 R', -SR' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 , y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C 1 -C 10 ;
R6 es hidrógeno, -alquilo C 1 -C 8, -alquenilo C 2-C 8, -alquinilo C 2 -C 8 o -haloalquilo C 1 -C 8;
R12 es hidrógeno, alquilo C 1 -C 4 , heterociclilo C 1 -C 10 o arilo C 6-C 14 ;
R13 es heterociclilo C 1 -C 10 ; y
X es O.
Son de interés particular compuestos de fórmula IV que tienen las estructuras:
Figure imgf000065_0001
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos y ejemplos de referencia.
Ejemplos
Los experimentos se llevaron a cabo de forma general en una atmósfera inerte (nitrógeno o argón), especialmente en los casos en los que se emplearon reactivos o intermedios sensibles al oxígeno o a la humedad. Generalmente se usaron disolventes y reactivos comerciales sin purificación adicional, que incluyen disolventes anhidros donde sea apropiado (generalmente productos Sure-Seal™ de la Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin). De forma general, los productos se secaron al vacío antes de iniciar reacciones posteriores, o enviarse para ensayos biológicos. Los datos de espectrometría de masas se indican tanto para la cromatografía líquida-espectrometría de masas (CLEM), la ionización química a presión atmosférica (APCI) o el instrumento de cromatografía de gasesespectrometría de masas (CGEM). Los desplazamientos químicos en los datos de resonancia magnética nuclear (RMN) se expresan en partes por millón (ppm, 8) referidos a los picos residuales de los disolventes deuterados utilizados.
Para las síntesis que hagan referencia a los procedimientos de otros Ejemplos o Procedimientos, el protocolo de reacción (duración de la reacción y la temperatura) puede variar. En general, las reacciones fueron seguidas por cromatografía en capa fina (TLC) o espectrometría de masas, y se sometieron a tratamiento cuando fue adecuado. Las purificaciones pueden variar entre experimentos: por lo general, los disolventes y las proporciones de disolventes usadas para los eluyentes/gradientes se seleccionaron para proporcionar RfS o tiempos de retención adecuados.
Se realizaron rotaciones ópticas en un polarímetro 343 de Perkin-Elmer (Número de serie 9506).
Se realizaron HRMS en un Agilent 6220 TOF CL/EM.
Los nombres de compuestos se generaron con software de ACD Labs.
Condiciones de HPLC y CL-EM usadas para análisis
Protocolo A: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 |jm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 1,5 minutos, 5 % a 100 % de B durante 8,5 minutos, después B al 100 % durante 1 minuto; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo B: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 50 % durante 1,5 minutos, 50 % a 100 % de B durante 6,5 minutos, después B al 100 % durante 3 minutos; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo C: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02 % en metanol (v/v); Gradiente: B del 50 % al 100 % durante 10 minutos; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo D: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0 ,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0 ,02 % en metanol (v/v); Gradiente: B del 5 % al 100 % durante 8 minutos; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo E: Columna: Phenomenex Lux Amylose-2, 250 x 4,6 mm, 5 jm ; Fase móvil A: heptano; Fase móvil B: etanol (desnaturalizado); Gradiente: B del 5 % al 100 % durante 10 minutos; Caudal: 1,5 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-1500 daltons; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
Protocolo F: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 jm ; Fase móvil A : ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5 % de B durante 0,1 minutos, 5 % a 95 % de B durante 0,7 minutos, 95 % de B durante 0,1 minutos; Caudal: 1,25 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: 200-450 nm; intercalo de EM (+) 100-1200 daltons; Volumen de inyección: 5 jl; Instrumento: Waters Acquity.
Protocolo G: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 0 % al 100 % durante 8,5 minutos; Caudal: 1,5 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo H: Columna: Phenomenex Gemini-NX, C18, 4,6 x 50 mm, 3 jm , 110 A; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0 % a 100 % de B durante 4,10 minutos, lineal después 100 % de B durante 0,4 minutos; Caudal: 1,5 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: DAD 200-450 nm; intercalo de EM (+) 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 jl; Instrumento: Agilent.
Protocolo I: Columna: Atlantis T3, 75 x 3,0 mm, 3 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,05 % en agua (v/v); Fase móvil B: acetonitrilo; Gradiente: B del 5 % al 95 % durante 5,75 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 230 nm, 254 nm; intervalo de EM (+): 150-1200 daltons; Volumen de inyección: 5 jl; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
Protocolo J: Columna: Phenomenex Luna Fenil-Hexilo, 150 x 3,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 1,5 minutos, 5 % a 100 % de B durante 8,5 minutos, después 100 % de B durante 1 minuto; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 jl; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo K: Columna: Symmetry-C18, 50 x 2,1 mm, 3,5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en metanol (v/v); Gradiente: B del 10 % al 90 % durante 6,5 minutos; Caudal: 0,7 ml/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detección: DAD 215 nm; intercalo de EM (+) 100­ 1500 daltons; Volumen de inyección: 3 jl; Instrumento: Waters 996 PDA.
Protocolo L: Columna: XBridge C-18, 150 x 4,6 mm, 3,5 jm ; Fase móvil A: solución acuosa 5 mM de acetato amónico; Fase móvil B: acetonitrilo; Gradiente: 10 % de B durante 3 minutos después de 10 % a 80 % de B durante 14 minutos; Caudal: 0,7 ml/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detección: DAD 215 nm; intercalo de EM (+) 100-1500 daltons; Volumen de inyección: 3 jl; Instrumento: Waters 996 PDA.
Protocolo M: Columna: Phenomenex Luna, 150 x 3,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en metanol (v/v); Gradiente: B al 50 % durante 1,5 minutos, 50 % a 8 0 % de B durante 8,5 minutos, después B al 80 % durante 10 minutos; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 90-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pl; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo N: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 0 % al 10 0 % durante 23,5 minutos; Caudal: 1,5 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm; Volumen de inyección: 10 pl; Instrumento: Agilent 1100 HPLC
Protocolo O: Columna: Columna: Agilent Poroshell 300SB-C8, 75 x 2,1 mm, 2,6 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: de 20 % de B a 45 % de B durante 4 minutos; Caudal: 1,0 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: 220 nm; intervalo de EM (+) 400­ 2000 Da; Volumen de inyección: 10 pl; Instrumento: Agilent 1100 LC, Waters Micromass ZQ m S. La desconvolución se realizó usando MaxEnt1.
Protocolo P: Columna: Columna: TSK-gel G3000SWxl, 300 x 7,8 mm, 10 pm; Fase móvil: Solución salina tamponada con fosfato (PBS, IX), pH 7,4 con acetonitrilo al 2 % ; Isocrático; Caudal: 1 ml/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Volumen de inyección: 5 pl; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo Q: Columna: Waters Acquity UPLC H SS T3, C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5 % de B durante 0,1 minutos, 5 % a 95 % de B durante 2,5 minutos, 95 % de B durante 0,35 minutos; Caudal: 1,25 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: 200-450 nm; intercalo de EM (+) 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 pl; Instrumento: Waters Acquity.
Protocolo Q 1: Columna: Waters Acquity UPLC H SS T3, C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5 % de B durante 0,1 minutos, 5 % a 95 % de B durante 1,5 minutos, 95 % de B durante 0,35 minutos; Caudal: 1,25 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: 200-450 nm; intercalo de EM (+) 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 pl; Instrumento: Waters Acquity.
Protocolo Q 2: Columna: Xtimate C18, 2,1 x 30 mm, 3 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 10 % a 80 % de B durante 0,9 minutos, 80 % de B durante 0,6 minutos; 100 % de B durante 0,5 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Detección: DAD 220 nM; Temperatura: 25 °C; Volumen de inyección: 1 pl; Instrumento: Agilent.
Protocolo Q3: Columna: Xtimate C18, 2,1 x 30 mm, 3 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente de 0 % a 60 % de B durante 0,9 minutos, 60 % de B durante 0,6 minutos; 100 % de B durante 0,5 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Detección: DAD 220 nM; Temperatura: 25 °C; Volumen de inyección: 1 pl; Instrumento: Agilent.
Protocolo R: Columna: Phenomenex Luna, 150 x 3,0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en metanol (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 1,5 minutos, 5 % a 100 % de B durante 8,5 minutos, después 100 % de B durante 1 minuto; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pl; Instrumento: 305 RP Agilent 1200 LCMS.
Protocolo S: Columna: Phenomenex Luna, 150 x 3,0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 1,5 minutos, 5 % a 95 % de B durante 8,5 minutos, después 100 % de B durante 1 minuto; Caudal: 1,0 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pl; Instrumento: 305 RP Agilent 1100 HPLC.
Protocolo T: Columna: Atlantis dC18, 50 x 4,6 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,05 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,05 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 5 % al 95 % durante 4,0 minutos; después parada a 95 % de B durante 1 minuto; Caudal: 2 ml/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detección: DAD 215 nm; intervalo de EM (+) 160 -1000 daltons; Volumen de inyección: 3 pl; Instrumento: Waters 996 PDA.
Protocolo U: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 1,5 minutos, 5 % a 100 % de B durante 8,5 minutos, después B al 100 % durante 1 minuto; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pl; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo V: Columna: H PLC-V Ultimate XB -C18, 50 x 3,0 mm, 3 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,225 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,225 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 30 % al 90 % durante 6 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Temperatura: 40 °C; Detección: DAD 220 nm; Volumen de inyección: 1 pl; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo W: Columna: H PLC-V Ultímate XB -C18, 50 x 3,0 mm, 3 |jm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 10 % al 8 0 % durante 6 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Temperatura: 40 °C; Detección: DAD 220 nm; Volumen de inyección: 3 jl; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo X : Columna: YMC-pack ODS-A, 150 x 4,6 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 10 % al 80 % durante 6 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Detección: DAD 220 nm. Temperatura: 40 °C; Volumen de inyección: 3 jl; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo Y: Columna: YMC-pack ODS-A, 150 x 4,6 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0 % a 95 % de B durante 10 minutos, después 95 % de B durante 5 minutos; Caudal: 1,5 ml/minuto; Detección: DAD 220 nm; Instrumento: Agilent 1100.
Protocolo Z: Columna: Xtimate C18, 2,1 x 30 jm , 3 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 0 % al 60 % durante 2 minutos; Caudal: 1,2 ml/min. Temperatura: 50 °C; Detección: 220 nm, intervalo de EM (+) 100 -1000 daltons; Volumen de inyección: 1 jl; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo AB: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 2,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5 % a 100 % de B durante 10 minutos, después B al 100 % durante 2 minuto; Caudal: 0,5 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 jl; Instrumento: Agilent 1100 LCMS. Protocolo BB: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 2,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 2,0 minutos, de 5 % a 100 % de B durante 12 minutos y 100 % de B durante 2 minutos, después de 100 % a 5 % de B durante 1,5 min; Caudal: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 jl; Instrumento: Agilent.
Protocolo CB : Columna: Waters XBridge C18, 4,6 x 50 mm, 5 jm ; Fase móvil A: hidróxido de amonio al 0,03 % en agua (v/v); Fase móvil B: hidróxido de amonio al 0,03 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5 % a 95 % de B durante 4,0 minutos, después B al 95 % durante 1 minuto; Caudal: 2 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, intercalo de EM (+) 160-1000 daltons; Volumen de inyección: 4 jl; Instrumento: Waters ZQ/Alliance 2795 HPLC.
Protocolo DB: Columna: Waters Atlantis dC18, 4,6 x 50 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,05 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,05 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: de 5,0 % a 95 % de B durante 4,0 minutos, después 95 % de B durante 1 minuto. Caudal: 2 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, intercalo de EM (+) 160-1000 daltons; Volumen de inyección: 4 jl; Instrumento: Waters ZQ/Alliance 2795 HPLC.
Protocolo E B : Columna: XBridge RP18, 2,1 x 50 mm, 5 jm ; Fase móvil A: hidróxido de amonio al 0,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: hidróxido de amonio al 0,02 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente de 10 % a 80 % de B % durante 6 minutos, después 80 % durante 2 minutos; Caudal: 1,2 ml/minuto. Detección: DAD 220 nm.; Temperatura: 50 °C.
Protocolo FB : Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 2,0 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B al 5 % durante 2,0 minutos, de 5 % a 100 % de B durante 10 minutos y B al 100 % durante 2 minutos; Caudal: 0,50 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 jl; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
En algunos casos se hicieron algunas alteraciones menores para análisis CL-EM y HPLC, tales como, pero sin limitación, un cambio en el gradiente o caudal que se indica mediante el símbolo *
Condiciones de HPLC usadas para purificación
Procedimiento A: Columna: Phenomenex Lux Amylose-2, 250 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: Heptano; Fase móvil B: Etanol (desnaturalizado); Gradiente: de 5 % a 100 % de B durante 6 min; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Procedimiento B: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido acético al 0,02 % en agua; Fase móvil B: ácido acético al 0,02 % en acetonitrilo; Gradiente: B al 5 % durante 1,5 minutos, B del 5 % al 45 % durante 8,5 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Procedimiento C : Columna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 10 |jm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02 % en metanol (v/v); Gradiente: B del 10 % al 90 % durante 20 minutos; Caudal: 20 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; Volumen de inyección: variable; Instrumento: Gilson.
Procedimiento D: Columna: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21,2 mm, 4 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo; Gradiente: 30 % de B durante 1,5 minutos, 30 % a 60 % de B durante 8,5 minutos, de 60 a 100 % de B durante 0,5 minutos después 100 % de B durante 2 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Procedimiento E 1 : Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo; Gradiente: 40 % de B durante 1,5 minutos, 40 % a 80 % de B durante 8,5 minutos, de 80 a 100 % de B durante 0,5 minutos después 100 % de B durante 2 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Procedimiento E 2: Columna: Phenomenex Luna Fenil-hexilo, 150 x 21,2 mm, 5 jm . El resto de los protocolos son idénticos a los descritos para el Procedimiento E1.
Procedimiento F: Columna: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21,2 mm, 4 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en metanol; Gradiente: 44 % de B durante 1,5 minutos, 44 % a 77 % de B durante 8,5 minutos, después B al 77 % durante 10 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Procedimiento G: Columna: PrincetonSFC 2-etilpiridina, 250 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: heptano; Fase móvil B: etanol (desnaturalizado); Gradiente: 1 % de B durante 1,5 minutos, B del 1 % al 50 % durante 8,5 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Procedimiento H: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido acético al 0,02 % en agua; Fase móvil B: ácido acético al 0,02 % en acetonitrilo; Gradiente: B al 20 % durante 1,5 minutos, B del 20 % al 60 % durante 10,5 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Procedimiento I: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en metanol; Gradiente: B al 40 % durante 1,5 minutos, de 40 % a 70 % de B durante 8,5 minutos después 70 % de B durante 10 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Procedimiento J: Columna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: B del 10 % al 90 % durante 20 minutos; Caudal: 20 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; Volumen de inyección: variable; Instrumento: Gilson.
Procedimiento K: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo; Gradiente: 20 % de B durante 1,5 minutos, 20 % a 50 % de B durante 8,5 minutos, de 50 a 100 % de B durante 0,5 minutos después 100 % de B durante 2 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters Fraction Lynx LCMS.
Procedimiento L: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21,2 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo; Gradiente: 30 % de B durante 1,5 minutos, 30 % a 50 % de B durante 8,5 minutos, de 50 a 100 % de B durante 0,5 minutos después 100 % de B durante 2 minutos; Caudal: 27 ml/minuto; Detección: Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters Fraction Lynx LCMS.
Procedimiento M: Columna: Waters Sunfire, C18, 19 x 100 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,05 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,05 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: de 0 a 100 % durante 8,5 minutos. Caudal 25 ml/minuto. Detección: DAD 215 nm; intervalo de E m (+) 160-1000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Procedimiento N: Columna: Waters Sunfire, C18, 19 x 100 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,05 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0 ,05 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: de 0 a 100 % durante 8,5 minutos. Caudal 25 ml/minuto. Detección: DAD 215 nm; intervalo de EM (+) 160-1000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Procedimiento O: Columna: Phenomenex Luna C18, 21,2 x150 mm, 5 jm ; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua (v/v) ácido en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente (v/v); Gradiente 20 % de B durante 1,5 minutos, 20 % a 40 % de B durante 8,5 minutos, de 40 a 100 % de B durante 0,5 minutos, después parada a 100 % de B durante 1,5 minutos. Caudal: 27 ml/minuto. Detección: DAD 210-360 nm; intercalo de EM (+) 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Procedimiento P: Columna: Phenomenex Gemini C18, 21,2 x 250 mm, 5 pm; Fase móvil A: hidróxido de amonio al 0,225 % en agua (pH 10) (v/v); Fase móvil B: hidróxido de amonio al 0,225 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: de 45 % a 85 % de B durante 10 minutos. Caudal 35 ml/minuto. Detección: DAD 220 nm; intervalo de EM (+) 100-1200 daltons; Instrumento: Shimadzu MS Trigger.
Procedimiento Q: Columna: Columna: Phenomenex Synergi C18, 50 x 250 mm, 10 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: Acetonitrilo; Gradiente de 10 % a 40 % de B durante 25 minutos. Caudal 100 ml/minuto. Detección: UV/Vis 220 nm; Instrumento: Shimadzu LC-8A.
Procedimiento R: Columna: Phenomenex Luna C 18 (2), 250 x 21,2 mm, 5 pm; Fase móvil A: TFA al 0,1 % en agua (v/v); Fase móvil B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: del 10 % al 100 % durante 30 minutos; Caudal variable. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; intervalo de EM (+) 150 - 2000 daltons; Volumen de inyección: 1,8 ml: Instrumento: Agilent 1100 Prep HPLC.
En algunos casos se hicieron algunas alteraciones menores para las condiciones de purificación, tales como, pero sin limitación, un cambio en el gradiente o caudal que se indica mediante el símbolo *.
Procedimientos generales
Procedimiento General A: Retirada de Fmoc usando dietilamina o piperidina. A una solución del compuesto que contenía Fmoc en diclorometano o A/,W-dimetilformamida (también denominada DMF), se añadió un volumen igual de dietilamina o piperidina. El progreso de la reacción se controló por CL-EM (o HPLC o TLC). Los disolventes se retiraron al vacío y en algunos casos el residuo se destiló azeotrópicamente de una a cuatro veces con heptano. Normalmente, el residuo se diluyó con diclorometano y una pequeña cantidad de metanol antes de reducirse sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con metanol en diclorometano (u otra mezcla de disolventes adecuada) para proporcionar el material deseado (o se usó el material en bruto según estaba).
Procedimiento General B: Retirada de Boc o escisión de t-Bu éster usando ácido trifluoroacético. A una solución del compuesto que contenía Boc o el compuesto que contenía terc-butil éster en diclorometano a 0 °C (o a temperatura ambiente) se añadió ácido trifluoroacético, para proporcionar una relación 1:4 de ácido trifluoroacético:diclorometano. El progreso de la reacción se controló por CL-EM (o HPLC o TLC). Los disolventes se retiraron al vacío. El residuo se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano para proporcionar el material deseado.
Procedimiento General C : Retirada de Boc o escisión de terc-butil éster (también se refiere a t-Bu éster) usando ácido clorhídrico en dioxano. A una solución del compuesto que contenía Boc o compuesto que contenía tercbutil éster en dioxano (o en algunos casos sin solución, u otro disolvente pertinente) se añadió una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano. El progreso de la reacción se controló por CL-EM (o HPLC o TLC). La reacción se concentró al vacío y en algunos casos se destiló azeotrópicamente de una a cuatro veces con heptanos. Procedimiento General D: Acoplamiento con hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,W,W',W-tetrametiluronio (HATU). A una solución en agitación de la amina (1,0 equiv.) y ácido (1,0-2,0 equiv.) en diclorometano, A/,W-dimetilformamida (también denominada DMF), o una mezcla de ambas, se añadió HATU (1,0-2,0 equiv.) seguido de trietilamina (2,0-4,0 equiv.) o diisopropiletilamina (2,0-4,0 equiv., también denominada base de Hunig). El progreso de la reacción se controló por CL-EM (o HPLC o TLC); la reacción se completó normalmente en tres horas. Los disolventes se retiraron al vacío. El residuo se purificó por gel de sílice o cromatografía de fase inversa o en algunos casos se destiló azeotrópicamente tres veces con heptanos, se diluyó con una pequeña cantidad de acetato de etilo antes de reducirse sobre sílice o sílice enlazado C 18 y se purificó mediante gel de sílice o cromatografía de fase inversa.
Procedimiento General E: Acoplamiento con A/-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-W-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP). A una mezcla de la carga útil amina (1 equiv.) y W-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-W-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP, Solicitud de patente europea (1994), EP624377, 1,0-2,0 equiv.) en A/,W-dimetilformamida o dimetilacetamida (también denominada DMA), se añadieron piridina (0,0-4,0 equiv.), diisopropiletilamina (0,0-4,0 equiv.), 2,6-dimetilpiridina (0,0-4,0 equiv., también denominada 2,6-Luditina) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (0,01-1,1 equiv. también denominado HOBT) o 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-ol (0,01-1,1 equiv., también denominado h Oa T). Después de agitar a 40 °C-50 °C durante 1-48 horas, la mezcla de reacción se concentró al vacío y se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano. El material en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa de acuerdo el procedimiento especificado para proporcionar el material deseado.
Procedimiento general F: Conjugación de anticuerpo H ERCEPTIN ® comercial con carga útil de engarce mediante disulfuros internos. Se dializó anticuerpo HERCEPTIN ® disponible en el mercado (Genentech Inc) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Lonza). El anticuerpo dializado se redujo con la adición de x equivalentes de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 5 mM en agua destilada) y se diluyó a una concentración de anticuerpo final de 15 mg/ml usando DPBS, ácido 2,2',2”,2”'-(etano-1,2-diildinitrilo)tetraacético 5 mM (EDTA), pH 7,0-7,4 (Tampón A). La reacción se incubó a 37 °C durante 1-2 horas y después se enfrió a temperatura ambiente. La conjugación se realizó mediante la adición de y equivalentes de carga útil de engarce (5-10 mM en dimetilacetamida (DMA)). Se añadió DMA para alcanzar un 10-20 % (v/v) de componente de disolvente orgánico total en la mezcla de reacción final, y se añadió el Tampón A para alcanzar una concentración de anticuerpo final de 10 mg/ml. La reacción se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Después, se cambió el tampón de la mezcla de reacción en DPBS (pH 7,4) usando columnas de intercambio de tampón G E Healthcare Sephadex G -25 M según las instrucciones del fabricante. El material en bruto se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) usando un sistema G E AKTA Explorer con una columna G E Superdex y eluyente de PBS (pH 7,4).
Procedimiento general G: Las reacciones de conjugación se realizaron en la porción superior de un dispositivo de ultrafiltración centrífugo, tal como filtros Amicon Ultra 50k Ultracel ( n ° de pieza UFC805096, GE). Se preparó una solución madre 132 mM de L-cisteína en PBS que contenía EDTA 50 mM. Esta solución (50 pl) se añadió a una mezcla del anticuerpo mutante respectivo (5 mg) en 950 pl de PBS que contenía EDTA de 50 mM. La concentración de cisteína final en la mezcla de reacción fue 6,6 mM. Después de permitir que la reacción reposara a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) durante 1,5 horas, el tubo de reacción se centrifugó para concentrar el material a aproximadamente 100 pl. La mezcla se diluyó a 1 ml con PBS que contenía EDTA 50 mM. Este procedimiento se repitió 4 veces para retirar todo el reductor de cisteína. El material resultante se diluyó a 1 ml en PBS que contenía EDTA 50 mM y se trató con 16 pl de una solución 5 mM de la carga útil de engarce de maleimida (de la Tabla 18A) en dimetil acetamida (DMA) (aproximadamente 5 equivalentes). Después de reposar a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) durante 1,5 horas, el tubo de reacción se centrifugó para concentrar el material a aproximadamente 100 pl. La mezcla se diluyó a 1 ml con PBS. Este procedimiento se repitió 2 veces para retirar el exceso de reactivo de maleimida. Los conjugados de anticuerpo se purificaron generalmente cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) usando un sistema G E AKTA Explorer con una columna G E Superdex200 y un eluyente de PBS (pH 7,4). La carga del fármaco en el sitio de conjugación pretendido se determinó usando una diversidad de procedimiento, incluyendo espectrometría de masas (EM), HPLC de fase inversa y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), como se describe en cualquier otra parte. El valor indicado (en las Tablas 19A y 19B) se obtiene generalmente por CL-EM en condiciones de reducción.
Procedimiento general H: Una solución 20 mM de T C EP (generalmente de 50 a 100 equivalentes molares) se añadió al anticuerpo (típicamente 5 mg) de manera que la concentración final de anticuerpo fue 5 mg/ml en PBS que contenía EDTA 50 mM. Después de dejar que la reacción reposara a 37 °C durante 1,5 horas, se cambió el tampón del anticuerpo en PBS que contenía EDTA 50 mM usando un dispositivo de concentración por centrifugación de separación a 50 kD MW (lavados de 3 x 3 ml, 10 x concentración por ciclo). En circunstancias particulares, también son útiles procedimientos alternativos, tales como TFF o diálisis. El anticuerpo resultante se resuspendió en 1 ml de PBS que contenía EDTA 50 mM y se trató con una solución 50 mM recién preparada de DHA (deshidroascorbato) en 1:1 de PBS/EtOH (la concentración final de DHA es típicamente 1 mM) y se dejó reposar a 4 °C durante una noche. Se cambió el tampón de la mezcla de anticuerpo/DHA en PBS que contenía EDTA 50 mM usando un dispositivo de concentración por centrifugación de separación a 50 kD MW (lavados de 3 x 3 ml, 10 x concentración por ciclo). El anticuerpo resultante se resuspendió en 1 ml de PBS que contenía EDTA 50 mM y se trató con carga útil de engarce de maleimida 10 mM en DMA (típicamente 5-10 equivalentes). Después de reposar durante 1,5 horas, se cambió del tampón del material (como anteriormente) en 1 ml de PBS (lavados de 3 x 3 ml, 10x concentración por ciclo). La purificación por S E C (como se ha descrito previamente) se realizó según se necesitó para retirar cualquier material agregado.
Procedimiento general I: La conjugación inicial de la carga útil de engarce se realizó usando el procedimiento descrito previamente (Procedimiento General F). Se cambió el tampón del conjugado de anticuerpo-fármaco resultante en un tampón borato 50 mM (pH 9,2) usando un dispositivo de ultrafiltración (separación 50 kd MW). La solución resultante se calentó a 37 °C durante 24 horas (para los engarces de maleimida-Peg) o a 45 °C durante 48 horas (para los engarces de maleimida-caproílo). La solución resultante se enfrió, se cambió su tampón a PBS y se purificó por S E C (como se ha descrito previamente) para retirar cualquier material agregado. El análisis de CLEM del material indicó que el anillo de succinimida se había abierto por completo (90 % o más). Obsérvese que en los ejemplos en los que un éster metílico está presente en la carga útil, el éster se hidroliza en el ácido carboxílico en las condiciones descritas.
Procedimiento general J: Los ésteres de pentafluorofenilo se conjugaron con el anticuerpo mostrado siguiendo el procedimiento indicado previamente en el documento WO2012007896 A1.
Procedimiento general K: La conjugación de engarces de amino-alquilo son completó mediante una ligadura mediada por enzima como se describe en el documento WO2012059882 A2.
P ro ce d im ie n to G e n e ra l L. Se acopló N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carbox¡-1-metox¡prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (preparada de la m¡sma manera que el n.° 136) al resto de am¡na o am¡noác¡do pert¡nente usando HATU (1,0-2,0 equ¡v.) en presenc¡a de base de Hun¡g (1-5,0 equ¡v.) en una soluc¡ón de DMF, d¡clorometano, o en algunos casos una soluc¡ón de ambos (o una soluc¡ón de uno o más d¡solventes). La reacc¡ón se controló por CL-EM (o TLC o HPLC). La reacc¡ón se concentró al vacío y se pur¡f¡có normalmente med¡ante cromatografía de síl¡ce o por HPLC prep. Después, se ret¡ró la protecc¡ón de Fmoc como se ha descr¡to en el proced¡m¡ento general A, segu¡do de concentrac¡ón al vacío y se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce o por HPLC prep.
P ro ce d im ie n to G e n e ra l M. El n.° 151 se acopló a la am¡na pert¡nente usando HATU (1,0-2,0 equ¡v., u otro react¡vo de acoplam¡ento adecuado) en presenc¡a de base de Hun¡g (1,0-5,0 equ¡v.) en una soluc¡ón de DMF, d¡clorometano, o en algunos casos una soluc¡ón de ambos (o una soluc¡ón de uno o más d¡solventes). La reacc¡ón se controló por CL-EM (o TLC o HPLC). La reacc¡ón se concentró al vacío. Después, se real¡zó la desprotecc¡ón de Boc como se ha descr¡to en el proced¡m¡ento general B, se concentró al vacío y se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce o por HPLC prep.
P ro c e d im ie n to G e n e ra l N. Se acopló ác¡do 1-(9H-fluoren-9-¡l)-3-oxo-2,7,10,13,16,19,22-heptaoxa-4-azapentacosan-25-o¡co (u otro Fmoc-AmPegXC2-COOH adecuado) al pentapépt¡do c¡totóx¡co pert¡nente (o el pentapépt¡do c¡totóx¡co que cont¡ene un grupo protector en un resto react¡vo d¡st¡nto del térm¡no N) usando HATU (1,0-2,0 equ¡v., u otro react¡vo de acoplam¡ento adecuado) en presenc¡a de base de Hun¡g (1,0-5,0 equ¡v. u otra base adecuada) en una soluc¡ón de DMF, d¡clorometano, o en algunos casos una soluc¡ón de ambos (o una soluc¡ón de uno o más d¡solventes). La reacc¡ón se controló por CL-EM (o TLC o HPLC). La reacc¡ón se concentró al vacío. La desprotecc¡ón de Fmoc se real¡zó de acuerdo con proced¡m¡ento general A. En algunos casos se real¡zó una segunda desprotecc¡ón para ret¡rar a grupo protector en un resto react¡vo en el pentapépt¡do c¡totóx¡co usando el proced¡m¡ento general B (u otro proced¡m¡ento pert¡nente conoc¡do en las referenc¡as basado en el grupo protector). La reacc¡ón se concentró al vacío y se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce o por HPLC prep.
P ro c e d im ie n to G e n e ra l O. El Fmoc-AmPegXC2-COOH adecuado se acopla al pentapépt¡do c¡totóx¡co pert¡nente (o el pentapépt¡do c¡totóx¡co que cont¡ene un grupo protector en un resto react¡vo d¡st¡nto del térm¡no N) y la desprotecc¡ón de Fmoc se real¡za de acuerdo con el proced¡m¡ento general N. La reacc¡ón se concentra al vacío y después se pur¡f¡ca por cromatografía de síl¡ce o HPLC prep. (o el mater¡al en bruto puede usarse según está). Después, se ¡nstala la secuenc¡a de PABC adecuada (tal como mcValC¡tPABC, o un der¡vado) de acuerdo con el proced¡m¡ento general E. En algunos casos, s¡ está presente un grupo protector en una porc¡ón de pentapépt¡do c¡totóx¡co de la molécula, se real¡za después la desprotecc¡ón usando el proced¡m¡ento general A o el proced¡m¡ento general B (u otro proced¡m¡ento pert¡nente conoc¡do en las referenc¡as basado en el grupo protector). La reacc¡ón se concentra al vacío y se pur¡f¡ca por cromatografía de síl¡ce o por HPLC prep.
P ro ce d im ie n to G e n e ra l P. Se s¡gu¡ó el proced¡m¡ento general E reemplazado mcValC¡tPABC-PNP, con M alPeg3C2ValC¡tPABC-PNP (preparado de una manera s¡m¡lar a mcValC¡tPABC-PNP).
P ro c e d im ie n to G e n e ra l Q. El Fmoc-AmPegXC2-COOH adecuado se acopla al pentapépt¡do c¡totóx¡co pert¡nente (o el pentapépt¡do c¡totóx¡co que cont¡ene un grupo protector en un resto react¡vo d¡st¡nto del térm¡no N) y la desprotecc¡ón de Fmoc se real¡za como se descr¡be en el proced¡m¡ento general N. La reacc¡ón se concentra al vacío y después se pur¡f¡ca por cromatografía de síl¡ce o HPLC prep. (o el mater¡al en bruto puede usarse según está). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de este res¡duo en DMF a 0 °C (o una temperatura l¡geramente mayor en algunos casos) se añad¡ó ác¡do bromoacét¡co (1,0-2,0 equ¡v.), segu¡do de base de Hun¡g (1,0-5,0 equ¡v.) y HATU (1,0-2,0 equ¡v.) La reacc¡ón se dejó calentar a temperatura amb¡ente y en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente m¡entras se controlaba por CL-EM (o TLC o HPLC). La reacc¡ón se concentró al vacío y se pur¡f¡có por HPLC prep.
P ro ce d im ie n to G e n e ra l R. Se s¡gu¡ó el proced¡m¡ento general E reemplazando mcValC¡tPABC-PNP, con N-(6-{[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]am¡no}hexano¡l)-L-val¡l-N~5~-carbamo¡l-N-[4-({[(4-n¡trofenox¡)carbon¡l]ox¡}met¡l)fen¡l]-L-orn¡t¡nam¡da (preparada de una manera s¡m¡lar a mcValC¡tPABC-PNP). Después, se real¡zó la desprotecc¡ón de Fmoc (proced¡m¡ento general B), segu¡do de pur¡f¡cac¡ón de HPLC prep.
P ro ce d im ie n to G e n e ra l S. A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de 6-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)hexanal (1,0-3,0 equ¡v.) en metanol se añad¡ó el pentapépt¡do c¡totóx¡co pert¡nente (1,0 equ¡v.), segu¡do de ác¡do fórm¡co. La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 1-40 m¡nutos, segu¡do de la ad¡c¡ón de (c¡anokappaC)(tr¡h¡dr¡do)borato sód¡co (1-) (3,0-6,0 equ¡v., tamb¡én denom¡nado c¡anboroh¡druro sód¡co). La reacc¡ón se controló por CL-EM (o TLC o HPLC). En algunos casos se añad¡ó más cant¡dad de 6-(2,5- d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)hexanal (1,0-3,0 equ¡v.). La reacc¡ón se concentró al vacío segu¡do de pur¡f¡cac¡ón usando HPLC prep.
P ro ce d im ie n to g e n e ra l T. Se prepara 4-[3-oxo-3-(2-oxoazet¡d¡n-1-¡l)prop¡l]an¡l¡n¡o según se descr¡be en las referenc¡as (B¡oorgan¡c and Med¡c¡nal Chem¡stry Letters. 2012, vol. 22, n.° 13, 4249 - 4253) que después se acopla a 3,3'-[etano-1,2-d¡¡lb¡s(ox¡)]d¡propanoato de b¡s(pentafluorofen¡lo) usando HATU en d¡clorometano, seguido de acoplamiento al pentapéptido citotóxico deseado. Después, el material se purifica por HPLC prep. Procedimiento general U. Se acopla Fmoc-ValCitPABC-PNP al pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E y después se retira el Fmoc siguiendo el procedimiento general A. Después, este residuo se acopla a ácido [2-oxo-2-({4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1-il)propil]fenil}amino) etoxi]acético (que se prepara por acoplando 4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1-il)propil]anilinio con 1,4-dioxano-2,6-diona, siguiendo el procedimiento general D). Después, el material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general V. Se acopla 3,3'-[etano-1,2-diilbis(oxi)]dipropanoato de bis(pentafluorofenilo) o 4,7,10,13,16-pentaoxanonadecano-1,19-dioato de bis(pentafluorofenilo) al pentapéptido citotóxico deseado (o en algunos casos se acopla al pentapéptido citotóxico deseado que contiene un grupo protector en un resto reactivo distinto del término N), siguiendo el procedimiento general D. Si hay presente un grupo protector, se retira entonces el grupo protector (usando los procedimientos pertinentes descritos en las referencias). Después, el material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general W Se acopla 1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oato de 4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenilo al pentapéptido citotóxico deseado, siguiendo el procedimiento general E. Se retira Fmoc siguiendo el procedimiento general A. Se acopla 3,3'-[etano-1,2-diilbis(oxi)]dipropanoato de bis(pentafluorofenilo) a este residuo, siguiendo el procedimiento general D. Después, el material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general X 1. Se acopla N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-alanil-L-alanil-N~1~-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-N-4-tritil-L-aspartamida al pentapéptido citotóxico, siguiendo el procedimiento general E. Se retira Fmoc siguiendo el procedimiento general A y se retira el grupo protector de tritilo siguiendo el procedimiento general B. Se acopla 3,3'-[etano-1,2-diilbis(oxi)]dipropanoato de Bis(pentafluorofenilo) a este residuo siguiendo el procedimiento general D. El material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general X2. Se acopla N-{3-[2-(3-etoxi-3-oxopropoxi)etoxi]propanoil}-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida al pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E. Se retira éster etílico usando hidróxido de litio en THF y agua. Después se forma éster de NHS acoplando el residuo con 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona usando N,N’-diciclohexilcarbodiimida en THF. El material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general X3. Se acopla N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-D-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-carboxipropan-2-il)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida se acopla al n.° 50 siguiendo el procedimiento general D en DMSO y acetonitrilo. Se retira Fmoc siguiendo el procedimiento general A, seguido de acoplamiento con 3,3'-[etano-1,2-diilbis(oxi)]dipropanoato de bis(pentafluorofenilo) usando base de Hunig en acetonitrilo. El material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general X4. Se acopla N-[1-(9H-fluoren-9-il)-3,5,12-trioxo-2,7,10-trioxa-4-azadodecan-12-il]-2-metilalanina al n.° 250 siguiendo el procedimiento general D en acetonitrilo. Se retira Fmoc siguiendo el procedimiento general A, seguido de acoplamiento con 3,3'-[etano-1,2-diilbis(oxi)]dipropanoato de bis(pentafluorofenilo) usando base de Hunig en acetonitrilo. El material se purifica por HPLC prep.
Procedimiento general X5. Se acopla L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida a N~2~-acetil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisina siguiendo el procedimiento general D. Este residuo resultante se acopla con bis(4-nitrofenil)carbonato con base de Hunig en DMF, seguido de acoplamiento con el pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E. Después, se realiza la desprotección de Boc siguiendo el procedimiento general B en acetonitrilo. El residuo se purifica por HPLC prep.
En algunos casos, se hicieron alteraciones menores a las condiciones de reacción, tales como, pero sin limitación, el orden de la adición del reactivo y el disolvente y/o la cantidad de reactivo o reactante, que se indica mediante el símbolo *. Por otro lado, estos procedimientos generales se proporcionan únicamente como ejemplares y son no limitantes.
Además de los Procedimientos Generales proporcionados anteriormente, las referencias de auristatina y dolastatina pertinentes incluyen las siguientes: Petit y col. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,5463; Petit y col. AntiCancer Drug Design 1998, 13, 243 y referencias citadas en ese documento; Petit y col. J. Nat. Prod. 2011, 74, 962; documento WO 96/33212; documento WO 95/09864; documento EP 0695758; documento WO 07/8848; documento WO 01/18032; documento WO 09/48967; documento WO 09/48967; documento WO 09/117531; documento WO 08/8603; documento US 7.750.116; documento US 5.985.837; y documento US 2005/9751; todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
Análisis de EM y preparación de la muestra
Las muestras se prepararon para análisis de CL-EM combinando aproximadamente 20 pl de muestra (aproximadamente 1 mg/ml de ADC en PBS) con 20 pl de ditiotreitol 20 mM (DTT). Después de dejar reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos, las muestras se analizaron de acuerdo con el protocolo O.
Se realizó el siguiente cálculo para establecer la carga total (DAR) del conjugado:
Carga = 2 x [LC1/(LC1+LC0)]+2 x [HC1/(HC0+HC1+HC2+HC3)]+ 4 x [HC2/(HC0+HC1+HC2+HC3)]+6 x [HC3/(HC0+HC1+HC2+HC3)]
Donde las variables indicadas son la abundancia relativa de: LC0 = cadena ligera descargada, LC1 = cadena ligera con carga única, HC0 = cadena pesada descargada, HC1 = cadena pesada con carga única, HC2 = cadena pesada de doble carga y HC3 = cadena pesada de triple carga.
Las condiciones de CL-EM usadas son el Protocolo F para un tiempo de retención por debajo de un minuto y el Protocolo H para el resto de los experimentos, a menos que se indique otra cosa.
Preparación de W-[(9H-Fluoren-9-Mmetox¡)carboml]-W-metN-L-val¡l-W-[(2R,3S,4S)-1-carbox¡-2-metox¡-4-metMhexan-3-il]-W-met¡l-L-valmam¡da (n.° 8)
Figure imgf000074_0001
Etapa 1. Síntesis de [(2S,3S)-1-hidroxi-3-metilpentan-2-il]metilcarbamato de bencilo (n.° 1). A una solución de N-[(benciloxi)carbonil]-N-metil-L-isoleucina (52,37 g, 187,5 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (524 ml, 0,35 M) se añadió complejo de borano-tetrahidrofurano (1 M en tetrahidrofurano, 375 ml, 375 mmol, 2 equiv.) lentamente durante 1 hora y la reacción se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. La reacción se enfrió a 0 °C y se añadió agua (30 ml) durante 30 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con una solución acuosa 1 M de carbonato sódico (100 ml) y terc-butil metil éter (250 ml). La fase acuosa se extrajo de nuevo con terc-butil metil éter (100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa 1 M de carbonato sódico (100 ml), se lavaron con salmuera (200 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar n.° 1 (48,44 g, rendimiento del 97 % ) en forma de un aceite de color amarillo pálido, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), se presume que es una mezcla de rotámeros: 87,26-7,41 (m, 5H), [5,06 (AB cuadruplete, Jab = 12,9 Hz, Avab = 22,8 Hz) y 5,06 (AB cuadruplete, Jab = 9,0 Hz, Avab = 9,0 Hz), total 2H], [4,65 (t, J = 5,3 Hz) y 4,59 (t, J = 5,4 Hz), total 1H], 3,67-3,80 (m, 1H), 3,51-3,60 (m, 1H), 3,41-3,51 (m, 1H), 2,75 y 2,71 (2 s, total 3H), 1,49-1,64 (m a, 1H), 1,24 -1,37 (m a, 1H), 0,90-1,02 (m a, 1H), 0,74-0,87 (m, 6H).
Etapa 2. Síntesis de metil[(2S,3S)-3-metil-1-oxopentan-2-il]carbamato de bencilo (n.° 2). A una solución de n.° 1 (8,27 g, 31,2 mmol, 1 equiv.) en dimetilsulfóxido (41,35 ml, 0,75 M), se añadió trietilamina (8,70 ml, 64,0 mmol, 2,05 equiv.) y la mezcla se enfrió a 0 °C. Después, se añadió en porciones complejo de trióxido de azufre y piridina (10,18 g, 63,96 mmol, 2,05 equiv.), mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 8 °C. Se dejó que la reacción alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. La reacción se vertió en agua (100 ml) y terc-butil metil éter (100 ml). La fase acuosa se extrajo de nuevo con terc-butil metil éter (50 ml) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío, y se purificaron por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 10 % a 60 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 2 (7,14 g, 87 % ) en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 89,61 (s, 1H), 7,26­ 7,42 (m, 5H), 5,01-5,13 (m, 2H), 4,04-4,12 (m, 1H), 2,86 y 2,82 (2 s, total 3H), 1,94 -2,11 (m a, 1H), 1,26 -1,42 (m a, 1H).
Etapa 3. Síntesis de (3R,4S,5S)-4-{[(benciloxi)carbonil](metil)amino}-3-hidroxi-5-metilheptanoato de terc-butilo (n.° 3). Se preparó diisopropilamina de litio se preparó añadiendo n-butillitio (solución 2,5 M en tetrahidrofurano, 35,9 ml, 89,8 mmol, 1,4 equiv.) a una solución de diisopropilamina (13,8 ml, 96,3 mmol, 1,5 equiv.) en tetrahidrofurano (50 ml, 1,3 M) a -78 °C. Después de 1 hora, se añadió gota a gota acetato de terc-butilo (15,7 ml, 116 mmol, 1,8 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante 1,5 horas más mientras se dejaba que se calentara lentamente a -20 °C. La mezcla de reacción se enfrió de nuevo a -78 °C y se añadió una solución del aldehido n.° 2 (16,9 g, 64,2 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 horas y después se inactivó mediante la adición de agua (100 ml). Después de la extracción con éter dietílico (2 x 100 ml), las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío y se purificaron por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 20 % de acetona en heptano) para proporcionar n.° 3 (8,4 g, 34 % ) en forma de un aceite incoloro. CL-EM: m/z 402,4 [M+Na+], tiempo de retención = 3,91 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), se presume que es una mezcla de rotámeros: 87,27­ 7,39 (m, 5H), 5 ,01-5,12 (m, 2H), [4,93 (d, J = 7,2 Hz) y 4,98 (d a, J = 7,2 Hz), total 1H], 4,03-4,15 (m a, 1H), 3,68­ 3,85 (m a, 1H), 2,65 y 2,72 (2 s a, total 3H), 2,28-2,37 (m, 1H), 2,09-2,17 (m, 1H), 1,74-1,90 (m a, 1H), 1 ,41-1,51 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 0,92-1,01 (m, 1H), 0,77-0,92 (m, 6H).
Etapa 4. Síntesis de (3R,4S,5S)-4-{[(benciloxi)carbonil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoato de ferc-butilo (n .°@ 2). A una solución de n.° 3 (8,4 g, 22 mmol, 1 equiv.) en 1,2-dicloroetano (25 ml, 0,88 M) se añadieron tamices moleculares (4 A, 0,7 g) y Proton Sponge (1,8-bis(dimetilamino)naftaleno) (13,4 g, 59,2 mmol, 2,7 equiv.), seguido de tetrafluoroborato de trimetiloxonio (9,10 g, 61,6 mmol, 2,8 equiv.). Después de agitar durante una noche, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 40 % de 1:1 de acetona:acetato de etilo en heptano) para dar n.° @2 (8,7 g, 68 % ) en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfóJ, se presume que es una mezcla de rotámeros: 87,28-7,40 (m, 5H), 5 ,01-5,13 (m, 2H), 3,89-4,08 (m a, 1H), 3,70-3,82 (m, 1H), 3,18 y 3,26 (2 s, total 3H), 2,66 y 2,71 (2 s a, total 3H), 2,44-2,53 (m, 1H, asumido; parcialmente oscurecido por pico de disolvente), 2,17-2,24 (m, 1H), 1,71-1,86 (m a, 1H), 1,39 y 1,39 (2 s, total 9H), 1,31-1,40 (m, 1H), 0,94-1,08 (m, 1H), 0,76-0,91 (m, 6H).
Etapa 5. Síntesis de (3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamino)heptanoato de terc-butilo, sal clorhidrato (n.° 4). A una solución de n.°@2 (13,37 g, 33,98 mmol, 1 equiv.) en metanol (134 ml, 0,1 M) y ácido clorhídrico concentrado (3,1 ml, 37,4 mmol, 1,1 equiv.) se añadió paladio al 10 % sobre carbono (50 % húmedo) (0,1 % en peso; 1,34 g, 3,40 mmol). La mezcla se hidrogenó a 0,34 MPa (45 psi) durante 3 horas, después se purgó con nitrógeno, se filtró a través de Celite y se concentró al vacío para proporcionar n.° 4 (9,20 g, 92 % ) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 89,65 (s a, 1H), 8,97 (s a, 1H), 3,98-4,04 (m, 1H), 3,40 (s, 3H), 3,06-3,13 (m a, 1H), 2,82 (dd a, J = 6, 5 Hz, 3H), 2,74-2,80 (m, 1H), 2,68 (dd, mitad del patrón ABX, J = 16,3, 4,2 Hz, 1H), 2,00-2,10 (m a, 1H), 1,73-1,84 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,38-1,45 (m, 1H), 1 ,13 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,99 (t, J = 7,4 Hz, 3 H).
Etapa 6. Síntesis de (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoato de terc-butilo (n.° 5). A una mezcla de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetox¡)carbonil]-L-val¡na (18,53 g, 54,60 mmol, 1,3 equiv.) y 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) (9,58 g, 54,6 mmol, 1,3 equiv.) en 2-metiltetrahidrofurano (118,00 ml, 0,34 M) se añadió W-metilmorfolina (6,52 ml, 59,1 mmol, 1,5 equiv.) seguido de n.° 4 (11,80 g, 39,9 mmol, 1 equiv.). Después de 3 horas, la reacción se interrumpió con agua (50 ml) y se agitó durante 15 minutos. La fase acuosa se separó y se extrajo de nuevo con 2-metiltetrahidrofurano (50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (50 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron para dar un aceite incoloro, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 5 % a 40 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 5 (26,2 g, 91 % ) en forma de una espuma incolora. CL-EM (Protocolo I) m/z 581,3 [M+H+] 604,3 [M+Na+], tiempo de retención = 4,993 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), posiblemente una mezcla de rotámeros, señales características principales: 87,88 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,71 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,41 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,27-7,34 (m, 2H), 4,13-4,32 (m, 4H), 3,70-3,82 (m a, 1H), 3,24 (s, 3H), 2,92 (s a, 3H), 2,54 (dd, J = 15,7, 2,4 Hz, 1H), 2 ,17 (dd, J = 15,4, 9,4 Hz, 1H), 1,95-2,07 (m, 1H), 1,70-1,83 (m a, 1H), 1,40 (s, 9H), 0,83-0,94 (m, 9H), 0,69 (t, J = 7,2 Hz, 3 H).
Etapa 7A. Síntesis de (3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoato de terc-butilo (n.° 6). A una solución de n.° 5 (26 g, 42 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (260 ml, 0,16 M) se añadió dietilamina (22 ml) durante 30 minutos. La reacción se agitó durante aproximadamente 6 horas y después, la suspensión se filtró a través de Celite y se lavó con más cantidad de tetrahidrofurano (25 ml). El filtrado se concentró al vacío para proporcionar un aceite de color amarillo pálido, que se disolvió de nuevo en 2-metiltetrahidrofurano (50 ml) y se concentró de nuevo para asegurar la retirada completa de la dietilamina. El aceite en bruto de n.° 6 (>15,25 g) se recogió en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 7B. Síntesis de ácido (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil} (metil) amino]-3-metoxi-5-metilheptanoico (n.°@5). De acuerdo con procedimiento general B, a partir de n.° 5 (1,62 g, 2,79 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,3 M) y ácido trifluoroacético (3 ml) se sintetizó n.°@5 (1,42 g, 97 % ) en forma de un sólido que se usó sin purificación adicional. CL-EM m/z 525,3 [M+H+] 547,3 [M+Na+]; tiempo de retención = 0,95 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), señales características: 87,89 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,71 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,59 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,41 (dd, J = 7,6, 7,4 Hz, 2H), 7,28-7,34 (m, 2H), 4,14-4,32 (m, 4H), 3,24 (s, 3H), 2,92 (s a, 3H), 2,51-2,57 (m, 1H, supuesto; parcialmente oscurecido por pico de disolvente), 2,20 (dd, J = 15,9,
9,5 Hz, 1H), 1,95-2,06 (m, 1H), 1,70-1,83 (m a, 1H), 1,22 -1,36 (m a, 1H), 0,84-0,93 (m, 9H), 0,70 (t, J = 7,3 Hz, 3
H).
Etapa 8. Síntesis de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-W-[(3R,4S,5S)-1-terc-butoxi-3-metoxi-5-meí¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 7). A una mezcla de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-W-metil-L-valina (19,54 g, 55,29 mmol, 1,3 equiv.) y n.° 6 (15,25 g, 42,54 mmol, 1 equiv.) en 2-metiltetrahidrofurano (152 ml, 0,28 M) se añadió 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) (9,71 g, 55,3 mmol, 1,3 equiv.). Después de 10 minutos, se añadió lentamente W-metilmorfolina (6,6 ml, 60 mmol, 1,4 equiv.), mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de 25 °C. La reacción se agitó durante 4 horas y después se interrumpió mediante la adición de agua (50 ml). Después de agitar durante 15 minutos, la fase acuosa se separó y se extrajo de nuevo con 2-metiltetrahidrofurano (50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (100 ml), después se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío. La espuma de color amarillo resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 5 % a 35 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 7 (32 g, 97 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H),
7.62 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,41 (dd a, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,29-7,34 (m, 4,52-4,69 (m a, 1H), 3,70-3,82 (m a, 1H), 3,22 y 3,25 (2 s a, total 3H), 2,94 y 2,96 (2 s a, total 3H), 2,78 y
Figure imgf000076_0001
(2 s a, total 3H), 2 ,11 -2 ,23 (m, 1H), 1,90-2,10 (m, 2H), 1,68-1,83 (m a, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,21 -1,33 (m a, 1H).
Etapa 9. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-W-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 8). A n.° 7 (32 g, 46 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (160 ml, 0,29 M) se añadió gota a gota durante 10 minutos ácido trifluoroacético (17,4 ml, 231 mmol, 5 equiv.). Después de 6 horas, se añadió la misma cantidad de ácido trifluoroacético y la reacción se continuó durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con tolueno (320 ml) y se concentró al vacío para proporcionar n.° 8 (35,8 g, 97 % ) en forma de un aceite de color rosáceo, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN 1H (400
MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,90 (d, J = 7,0 Hz, 2H),
7.62 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,41 (dd a, J = 7,4, 7,0 Hz, 2H), 7,29-7,35 (m, 2H), 4,54-4,68 (m a, 1H), [4,09 (d, J = 11 Hz) y 4,22 (d, J = 10,9 Hz), total 1H], 3,74-3,84 (m a, 1H), 3,22 y 3,24 (2 s a, total 3H), 2,94 y 2,96 (2 s a, total
3H), 2,78 y 2,80 (2 s a, total 3H), 2,13-2,24 (m, 1H), 1,89-2,10 (m a, 2H), 1,70-1,81 (m a, 1H).
Preparación de ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(íerc-butoxicarboml)pirroMdm-2-M]-3-metoxi-2-metNpropanoico (n.° 11;
"Boc-Dap-ácido")
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Etapa 1. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2S)-1-hidroxi-2-metilbut-3-en-1-il]pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 9). A una solución de (2S)-2-formilpirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo (10 g, 50 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (120 ml, 0,42 M) se añadió (2Z)-2-buten-1-iltrifluoroborato potásico (9,76 g, 60,2 mmol, 1,2 equiv.), seguido de bromuro de tetra-n-butilamonio (3,24 g, 5,02 mmol, 0,1 equiv.) y agua (60 ml). Después de 13 horas, la reacción se diluyó con diclorometano (150 ml) y agua (150 ml). La fase acuosa se separó y se extrajo de nuevo con diclorometano (100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa de cloruro sódico
(5 % en peso, 200 ml), se lavaron con agua (200 ml) y se concentraron al vacío para proporcionar n.° 9 (~13 g) en forma de un aceite de color naranja, que se usó sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 85,61­
5,86 (m a, 1H), 4,97-5,09 (m, 2H), 3,80-3,98 (m a, 2H), 3,45-3,67 (m a, 1H), 3,21-3,29 (m, 1H), 2,14-2,26 (m, 1H),
1,80-2,04 (m, 3H), 1,65-1,76 (m, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,12 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
Etapa 2. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2S)-1-metoxi-2-metilbut-3-en-1-il]pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 10).
Se combinó hidruro sódico (al 60 % en aceite mineral, 3,38 g, 84,4 mmol, 1,1 equiv.) con hexano (40 ml) y la mezcla se sometió agitación mecánica rápida durante 5 minutos. Se dejó que los sólidos se asentaran y el hexano se retiró. Este procedimiento se repitió dos veces para retirar aceite mineral. Se añadió N,N-dimetilformamida (59 ml, 1,3 M) y la mezcla se enfrió a 0 °C; después se añadió gota a gota yoduro de metilo (5 ml; 81 mmol, 1,05 equiv.), seguido de la adición gota a gota de una solución de n.° 9 (19,6 g, 76,8 mmol, 1 equiv.) en W,W-dimetilformamida (59 ml) durante 5 minutos, mientras se mantenía la temperatura entre 0 °C y
5 °C. La reacción se agitó a 0 °C durante 2 horas. La reacción se interrumpió con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (150 ml), se vertió en una solución acuosa de cloruro sódico (5 % en peso, 300 ml) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa al 10 % de cloruro sódico (2 x 300 ml), se lavaron con agua (200 ml) y se concentraron al vacío. El aceite humedecido con agua resultante se concentró de nuevo en acetato de etilo (150 ml) y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 2 % a 10 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.°
10 (15,0 g, 73 % ) en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, CDCh), presuntamente una mezcla de
rotámeros: 85,60-5,83 (m, 1H), 4,91-5,06 (m, 2H), 3,81-3,95 (m a, 1H), 3,43 (s, 3H), 3,36-3,61 (m, 2H), 3,19-3,31 (m, 1H), 2,09-2,21 (m, 1H), 1,86-2,02 (m a, 2H), 1,62-1,85 (m a, 2H), 1,47 y 1,49 (2 s, total 9H), 1,09 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(terc-butox¡carbon¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡co (n.° 11). A n.° 10 (25,0 g, 92,8 mmol, 1 equ¡v.) en terc-butanol (100 ml, 0,93 M) se añad¡ó ¡nmed¡atamente agua (30,00 ml) segu¡do de N-óxido de N-met¡lmorfol¡na (25,97 g, 192,1 mmol, 2,07 equ¡v.) y tetraóx¡do de osm¡o (235,93 mg, 928,04 pmol, 0,01 equ¡v.) Después de 12 horas, la mezcla se concentró al vacío usando agua (20 ml) para retirar azeotróp¡camente el terc-butanol res¡dual. El res¡duo se repart¡ó entre acetato de et¡lo (500 ml) y agua (500 ml) más salmuera (150 ml). La fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de et¡lo (250 ml). Las fases orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con una soluc¡ón acuosa de cloruro sód¡co (10 % en peso, 200 ml), se lavaron con agua (150 ml) y se concentraron al vacío para proporc¡onar un ace¡te de color pardo pál¡do humedec¡do con agua que se concentró de nuevo en acetato de et¡lo (100 ml) para retirar cualqu¡er agua restante. El d¡ol en bruto (34,76 g) se usó s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal.
Al d¡ol en bruto (34,76 g, <92,8 mmol, 1 equ¡v.) en aceton¡tr¡lo (347 ml, 0,1 M) y agua (174 ml) se añad¡ó permanganato sód¡co (2,03 g, 5,73 mmol, 0,05 equ¡v.). La mezcla se enfr¡ó a 0 °C y se añad¡ó en porc¡ones peryodato sód¡co (51,46 g, 240,6 mmol, 2,1 equ¡v.) durante 30 m¡nutos, m¡entras se mantenía la temperatura ¡nterna por debajo de 5 °C. La reacc¡ón se agitó a 0 °C durante 4 horas y después se vert¡ó en una soluc¡ón de pentah¡drato de t¡osulfato sód¡co (65,40 g, 263,5 mmol, 2,3 equ¡v.) en agua (100 ml). La mezcla se f¡ltró a través de Cel¡te y el f¡ltrado se concentró al vacío. El res¡duo se repart¡ó entre acetato de et¡lo (200 ml) y agua (200 ml). La fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de et¡lo (250 ml), y las fases orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con una soluc¡ón acuosa al 10 % de ác¡do cítr¡co. Como el producto deseado era muy soluble en agua, todas las fases acuosas se comb¡naron, se trataron con Cel¡te (100 g) y se concentraron al vacío para produc¡r una pasta de color blanquec¡no. Se añad¡ó acetato de etilo (150 ml) y la mezcla se concentró de nuevo para ret¡rar cualqu¡er agua res¡dual; esta operac¡ón se repitió una vez más. La pasta se trató con acetato de etilo (150 ml) y se puso al vacío a 50 °C durante 10 minutos y se filtró (repetido dos veces). Los filtrados se combinaron con la fase orgánica previa (del lavado de ácido cítrico), se concentraron, se diluyeron con acetato de etilo (200 ml) y se filtraron a través de Celite para retirar los sólidos. Finalmente, este filtrado se concentró para producir n.° 11 (22,9 g, 69 % en dos etapas) en forma de una espuma de color amarillento/pardo. CLEM (Protocolo I): m/z 310,1 [M+Na+], 232,1 [(M -2-metilprop-1-eno)-H"], 188,1 [(M - Boc)+H+], tiempo de retención = 3,268 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), señales características: 83,61-3,85 (m a, 2H), 3,20-3,45 (m a, 4H), 3,03-3,17 (m a, 1H), 1,59-1,93 (m a, 4H), 1,40 (s a, 9H), 1,02-1,18 (m a, 3H).
Preparación de (2R,3R)-3-metoxi-2-metN-W-[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-2-N)etM]-3-[(2S)-pirroMdm-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 19) y (2R,3R)-3-metoxi-2-metN-W-[(1S)-2-feniM-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanotioamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 18)
Figure imgf000077_0001
Etapa 1. Síntesis de Na-(terc-butoxicarbonil)-L-fen¡lalan¡nam¡da (n.° 12). A una solución de Boc-Phe-OH (30,1 g, 113 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (378 ml, 0,3 M) enfriada a -10 °C se añadieron N-metilmorfolina (13,6 ml, 124 mmol, 1,09 equiv.) y cloroformiato de etilo (11,8 ml, 124 mmol, 1,09 equiv.). Después de 20 minutos, se añadió una solución acuosa al 30 % de hidróxido de amonio (45 ml, 350 mmol, 3,1 equiv.). La mezcla se agitó a temperatura amb¡ente durante 18 horas antes de concentrarse al vacío. El res¡duo se d¡luyó con acetato de et¡lo y se lavó secuenc¡almente con una soluc¡ón acuosa 1 N de b¡sulfato potás¡co, agua y salmuera. Después, la fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El sólido de color blanco se disolvió (esto requirió calentamiento con agitación) en acetato de etilo (aproximadamente 400 ml); después, la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de añadir hexano (~1000 ml). Después de unos pocos minutos, comenzó a precipitar un material de color blanco de la mezcla de reacción. El sólido se recogió por filtración, se lavó con heptano (2 x -150 ml) y se secó al vacío durante 18 horas para dar n.° 12 (24,50 g, 82 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m /z 263,2 [M-H+], 309,2 [M+HCO2 "], tiempo de retención = 1,85 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), presuntamente una mezcla de rotámeros, rotámero principal: 87,35 (s a, 1H), 7,22-7,30 (m, 5H), 7,00 (s a, 1H), 6,78 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,09 (ddd, J =10, 9, 4,5 Hz, 1H), 2,95 (dd, J = 13,8, 4,4 Hz, 1H), 2,72 (dd, J = 13,7, 10,1 Hz, 1H), 1,30 (s, 9H).
E ta p a 2. Síntesis de [(2S)-1-amino-3-fenil-1-tioxopropan-2-il]carbamato de tere-butilo (n.° 13). A una solución de n.° 12 (14,060 g, 53,192 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (180 ml, 0,296 M), se añadió 2,4-bis(4-metoxifenil)-1.3.2.4- ditiadifosfetano-2,4-ditiona (reactivo de Lawesson) (12,70 g, 31,40 mmol, 0,59 equiv.) y la reacción se calentó a reflujo durante 90 minutos. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se interrumpió mediante la adición de una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. La mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se concentró al vacío sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 100 % de acetato de etilo en heptano), proporcionando n.° 13 (11,50 g, 77 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m /z 279,4 [M-H+], 225,2 [(M -2-metilprop-1-eno)+H+], 181,2 [(M -Boc)+H+]; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, rotámero principal: 89,60 (s a, 1H), 9,19 (s a, 1H), 7,23-7,32 (m, 5H), 6,82 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,44 (ddd, J =9,4, 9,1, 4,4 Hz, 1H), 3,00 (dd, J = 13,7, 4,5 Hz, 1H), 2,79 (dd, J = 13,6, 9,9 Hz, 1H), 1,29 (s, 9H).
E ta p a 3. Síntesis de [(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamato de tere-butilo (n.° 14). A una mezcla de n.° 13 (5,65 g, 20,2 mmol, 1 equiv.) en acetona (101 ml, 0,2 M) se añadió bromoacetaldehído dietil acetal (8,76 ml, 58,2 mmol, 2,89 equiv.) y 2 gotas de ácido clorhídrico 4 M en dioxano. La mezcla se desgasificó tres veces con nitrógeno antes de calentarse a reflujo. Después de 2 horas, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico y se lavó con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El aceite en bruto de color naranja resultante se diluyó con acetato de etilo antes de concentrarse al vacío sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 35 % de acetato de etilo en heptano) y después por cromatografía de fase inversa (Procedimiento A) para dar n.° 14 (625 mg, 10 % ) ; HPLC (Protocolo E): m /z 304,5 [M+H+], 248,9 [(M -2-metilprop-1-eno)+H+], tiempo de retención = 7,416 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, rotámero principal: 87,75 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,75 (d a, J = 8,6 Hz, 1H), 7,61 (d a, J = 3,1 Hz, 1H), 7,25-7,30 (m, 5H), 4,99 (ddd, J =10,5, 8,9, 4,5 Hz, 1H), 3,29-3,36 (m, 1H, supuesto; parcialmente oscurecido por señal de agua), 2,98 (dd, J = 13,8, 10,6 Hz, 1H), 1,31 (s, 9H).
E ta p a 4. Síntesis de (1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etanamina, sal clorhidrato (n.° 15). De acuerdo con procedimiento general C, a partir de n.° 14 (1,010 g, 3,318 mmol, 1 equiv.), dioxano (10 ml, 0,33 M) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (20 ml, 80 mmol, 20 equiv.) se sintetizó n.° 15 (775 mg, 97 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 88,95-9,07 (m a, 3H), 7,86 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,18-7,28 (m, 3H), 7 ,10 -7,15 (m, 2H), 4,98-5,07 (m, 1H), 3,49 (dd, J = 13,3, 4,9 Hz, 1H), 3,18 (dd, J = 13,4, 10,2 Hz, 1H).
E ta p a 5. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -carboxilato de tere-butilo (n.° 16). A una solución de n.° 11 (280 mg, 0,974 mmol, 1 equiv.) y n.° 15 (460 mg, 1,44 mmol, 1,48 equiv.) en W,A/-dimetilformamida (3 ml, 0,32 M) a 0 °C se añadió cianuro de dietilfosforilo (DEPC) (pureza del 93 % , 212 jl, 1,30 mmol, 1,34 equiv.), seguido de trietilamina (367 |jl, 2,63 mmol, 2,7 equiv.). Después de 2 horas a 0 °C, la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente durante 18 horas. Después, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo:tolueno (2:1, 30 ml) y se lavó sucesivamente con una solución acuosa 1 M de bisulfato sódico (35 ml) y una solución acuosa al 50 % saturada de bicarbonato sódico (4 x 25 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró al vacío y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (de 12 % a 100 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 16 en forma de un aceite de color ámbar claro (374 mg, 81 % ). CL-EM: m/z 474,4 [M+H+], 374,4 [(M -2-metilprop-1-eno)+H+]; tiempo de retención = 3,63 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), señales características: 88,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,21-7,31 (m, 4H), 7,14-7,20 (m, 1H), 5,40 (ddd, J =11,4, 8,5, 4,0 Hz, 1H), 3,23 (s a, 3H), 2,18 (dc, J = 9,7, 6,7 Hz, 1H), 1,06 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
E ta p a 6A. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1 -carboxilato de tere-butilo (n.° 17). Una mezcla de n.° 16 (350 mg, 0,739 mmol, 1 equiv.) y 2.4 - bis(4-metoxifenil)-1,3,2,4-ditiadifosfetano-2,4-ditiona (reactivo de Lawesson) (324 mg, 0,776 mmol, 1,05 equiv.) en tolueno (6 ml, 0,1 M) se calentó a 100 °C. Después de 10 minutos, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. El material insoluble se retiró por filtración y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 12 % a 80 % de acetato de etilo en heptano) y después por cromatografía de fase inversa (Procedimiento E2) para dar n.° 17 (120 mg, 33 % ); HPLC (Protocolo J): m /z 490,2 [M+H+], tiempo de retención = 10,069 minutos; [a]20D - 110 (c 0,24, MeOH); RMN 1H (400 MHz, CD 3OD), señales características: 87,78 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,32-7,37 (m, 2H), 7,24-7,30 (m, 2H), 7 ,17 ­ 7,23 (m, 1H), 6,52-6,61 (m a, 1H), 3,62 (dd a, J = 15, 4 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 2,98-3,09 (m a, 1H), 2,53-2,64 (m a, 1H), 1,60-1,78 (m, 2H), 1,49 (s, 9H), 1,27 (d, J = 6,5 Hz, 3H).
E ta p a 6B. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-A/-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2il]propanotioamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 18). De acuerdo con procedimiento general B, a partir de n.° 17 (198 mg, 0,404 mmol, 1 equiv.), diclorometano (6 ml, 0,07 M) y ácido trifluoroacético (2 ml) se sintetizó n.° 18 (185 mg, 91 % ), que se usó sin purificación adicional. CL-EM: m/z 390,1 [M+H+], tiempo de retención = 0,57 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 10,91 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 9,07-9,20 (m a, 1H), 7,86-8,00 (m a, 1H), 7,83 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,27-7,36 (m, 4H), 7,21-7,26 (m, 1H), 6,33 (ddd, J = 11,3 , 8,3, 4,4 Hz, 1H), 3,76-3,82 (m, 1H), 3,56 (dd, J = 14,6, 4,3 Hz, 1H), 3,45 (s, 3H), 3,28 (dd, J = 14,6, 11,3 Hz, 1H), 3,02-3,12 (m a, 1H), 2,89-3,00 (m a, 1H), 2,72-2,89 (m, 2H), 1,69-1,83 (m a, 1H), 1,43-1,58 (m, 2H), 1,20-1,33 (m, 1H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
Etapa 7. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 19). De acuerdo con procedimiento general B, a partir de n.° 16 (607 mg, 1,28 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,13 M) y ácido trifluoroacético (2 ml) se sintetizó n.° 19 (640 mg, cuantitativo), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 8,96-9,07 (m a, 1H), 8,89 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,87-8,00 (m a, 1H), 7,80 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,28-7,34 (m, 4H), 7,20-7,27 (m, 1H), 5,43 (ddd, J = 11,3 , 8,6, 4,2 Hz, 1H), 3,42-3,50 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,04-3,14 (m a, 1H), 2,99 (dd, J = 14,2, 11,5 Hz, 1H), 2,92-3,02 (m, 1H), 2,78-2,88 (m a, 1H), 2,34-2,42 (m, 1H), 1,73-1,84 (m a, 1H), 1,55-1,68 (m, 1H), 1,38-1,53 (m, 2H), 1,15 (d, J = 6,9 Hz, 3H).
Preparación de (2R,3R)-3-Metox¡-2-met¡l-W-(2-femletM)-3-[(2S)-p¡rroMdm-2-¡l]propanot¡oam¡da, sal clorhidrato (n.° 23) y (2R,3R)-3-metox¡-2-met¡l-W-(2-femlet¡l)-3-[(2S)-p¡rrol¡dm-2-¡l]propanam¡da, sal clorh¡drato (n.° 24)
Figure imgf000079_0001
Etapa 1A. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil) amino]propil}pirrolidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 20). Al n.° 11 (22 g, 77 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (383 ml, 0,2 M) y N,N-dimetilformamida (30 ml) se añadieron diisopropiletilamina (26,9 ml, 153 mmol, 2 equiv.), 2-feniletilamina (11,6 ml, 91,9 mmol, 1,2 equiv.) y HATU (39,0 g, 99,5 mmol, 1,3 equiv.). La reacción se agitó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (700 ml) y se lavó secuencialmente con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 200 ml) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó al vacío. El material en bruto se recogió en diclorometano y se filtró. El filtrado se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 100 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 2o (24 g, 80 % ) en forma de un sólido de color blanquecino. CL-EM: m/z 392,2 [M+2H+], 291,1 [(M -Boc)+H+], tiempo de retención = 0,88 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros: 87,80-7,89 (m a, 1H), 7,23-7,29 (m, 2H), 7,15-7,23 (m, 3H), 3,72-3,82 y 3,55-3,62 (2 m a, total 1H), 3,45-3,55 (m a, 1H), 3,31-3,44 (m a, 2H), 3,29 (s, 3H), 3,12-3,25 (m a, 1H), 2,98-3,12 (m a, 1H), 2,71 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,09-2,19 (m, 1H), 1,71-1,83 (m a, 2H), 1,60-1,70 (m a, 1H), 1,49-1,60 (m a, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,03 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
Etapa 1B. Síntesis de pentatiodifosfonato de dipiridinio-1-ilo (n.° 21). Se añadió pentasulfuro fosforoso (4,45 g, 2,19 ml, 20 mmol, 1 equiv.) a piridina (56 ml, 0,36 M) a 80 °C y la mezcla se calentó a reflujo (115 °C) durante 1 hora. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y el producto se recogió por filtración para dar n.° 21 en forma de un sólido de color amarillo (4,57 g, 60 % ); pf: 165-167 °C (descomposición); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 8,78-8,84 (m, 4H), 8,22-8,30 (m, 2H), 7,76-7,83 (m, 4H).
Etapa 2A. Síntesis de (2S)-2-{(1R,2R)~1-metoxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 22). Una mezcla de n.° 20 (1,200 g, 3,073 mmol, 1 equiv.) y n.° 21 (1,40 g, 3,69 mmol, 1,2 equiv.) en acetonitrilo (15 ml, 0,20 M) se sometió a radiación de microondas a 100 °C durante 30 minutos. Después, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y se lavó secuencialmente con una solución acuosa 0,5 M de ácido clorhídrico (100 ml) y salmuera (2 x 50 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 20 % a 80 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 22 (670 mg, 54 % ) en forma de un sólido de color blanco similar a una cera; pf: 107-109 °C; CL-EM: m/z 407,4 [M+H+], 351,3 [(M -2-metilprop-1-eno)+H+], 307,3 [(M - Boc)+H+], tiempo de retención = 0,99 minutos; RMN 1H (400 MHz, CD 3 CN), presuntamente una mezcla de rotámeros: 8 8,28 (s a, 1H), 7,19-7,33 (m, 5H), 3,81-4,05 (m a, 2H), 3,60­ 3,81 (m a, 2H), 3,38-3,51 (m a, 1H), 3,36 (s, 3H), 3,02-3,17 (m a, 1H), 2,89-3,02 (m, 2H), 2,50-2,62 (m a, 1H), 1,71-1,85 (m a, 2H), 1,53-1,66 (m a, 2H), 1,45 (s a, 9H), 1,23 (d, J = 6,7 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-W-(2-feniletil)-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanotioamida, sal clorhidrato (n.° 23). De acuerdo con el procedimiento C, a partir de n.° 22 (325 mg, 0,799 mmol, 1 equiv.), dioxano (5 ml, 0,2 M) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (4 ml, 16 mmol, 20 equiv.) se sintetizó n.° 23 (274 mg, cuantitativo) en forma de una espuma de color blanco; CL-EM: 308,2 [M+H+], tiempo de retención = 0,55 minutos.
Etapa 2B. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-A/-(2-feniletil)-3-[(2S)-pirrolidin-2-il] propanamida, sal clorhidrato (n.° 24). Al n.° 20 (7,00 g, 17,9 mmol, 1 equiv.) en dioxano (50 ml, 0,36 M) y metanol (2 ml) se añadió una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (20 ml, 80 mmol, 4,4 equiv.). Después de agitar durante 18 horas, la mezcla se concentró para proporcionar n.° 24 (5,86 g, cuantitativo) en forma de una goma, que se usó sin purificación adicional; CL-EM: 292,2 [M+H+], tiempo de retención = 0,47 minutos.
Preparación de N-MetN-L-valN-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxM-£(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metN-3-£[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-2-il)etil]ammo}-3-tioxopropM]pirrolidm-1-M}-5-metiM-oxoheptan-4-M]-N-metil-L-valmamida (n.° 26)
Figure imgf000080_0001
Etapa 1. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-W-metil-L-valil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n .°25)
De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 8 (480 mg, 0,753 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,07 M), W,W-dimetilformamida (2 ml), la amina n.° 18 (401 mg, 0,941 mmol, 1,25 equiv.), HATU (372 mg, 0,979 mmol, 1,3 equiv.) y trietilamina (367 pl, 2,64 mmol, 3,5 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano) para proporcionar n.° 25 (711 mg, 75 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 1009,7 [M+H+], tiempo de retención = 1,15 minutos; HPLC (Protocolo B): m/z 505,3 [M+2H+]/2, tiempo de retención = 10,138 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6 ), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,81 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,89 (d a, J = 7 Hz, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) y 7,83 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], [7,64 (d, J = 3,2 Hz) y 7,69 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,62 (d a, J = 7 Hz, 2H), 7,37-7,44 (m, 2H), 7,28-7,35 (m, 4H), 7,20-7,27 (m, 2H), 7 ,12 -7 ,18 (m, 1H), 6,27-6,35 y 6,40-6,48 (2 m, total 1H), [1,14 (d, J = 6,4 Hz) y 1,17 (d, J = 6,3 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de A/-metil-L-valil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n.° 26). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 25 (701 mg, 0,694 mmol) en diclorometano (10 ml, 0,07 M) y dietilamina ( 1 0 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar un sólido similar al vidrio. Se añadieron éter dietílico y heptano y la mezcla se concentró al vacío, produciendo n.° 26 (501 mg, 92 % ) en forma de un sólido de color blanco. HpLC (Protocolo A): m/z 787,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,229 minutos, (pureza > 97 %); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,81 (d a, J = 8 Hz), total 1H], [7,99 (d a, J = 9 Hz) y 8,00 (d a, J = 9 Hz), total 1H], [7,80 (d, J = 3,3 Hz) y 7,83 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], [7,65 (d, J = 3,2 Hz) y 7,69 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,29-7,34 (m, 2H), 7,19-7,28 (m, 2H), 7 ,13 -7 ,19 (m, 1H), [6,31 (ddd, J = 11, 8 , 4,5 Hz) y 6,45 (ddd, J = 11,5 , 8 , 4,5 Hz), total 1H], [4,57 (dd, J = 8,9, 8,7 Hz) y 4,63 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz), total 1H], 3,16, 3,21, 3,24 y 3,25 (4 s, total 6 H), 2,96 y 3,03 (2 s a, total 3H), [1,14 (d, J = 6 , 6 Hz) y 1,17 (d, J = 6,4 Hz), total 3H].
Preparación de N2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil3-{[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-2-N)etN]ammo}-3-tioxopropN]pirroMdm-1-M}-5-metiM-oxoheptan-4-M]-W-metN-L-valinamida (n.° 30)
Figure imgf000081_0001
Etapa 1. Síntesis de (3R,4S,5S)-4-[{N-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil] amino} ciclopentil)carbonil]-L-valil}(metil)amino] -3-metoxi-5-metilheptanoato de tere-butilo (n.° 27). A n.° 6 (287 mg, 0,801 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (4 ml, 0,2 M) se añadieron ácido 1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}ciclopentanocarboxílico (309 mg, 0,879 mmol, 1,1 equiv.), diisopropiletilamina (281 pl, 1,60 mmol, 2 equiv.) y HATU (376 mg, 0,960 mmol, 1,2 equiv.). La mezcla se agitó durante 18 horas y se diluyó con acetato de etilo (15 ml). La mezcla de reacción se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 5 ml) y con salmuera (5 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El material en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 60 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 27 (502 mg, 91 % ) en forma de una espuma de color blanco. CL-EM: m/z 692,3 [M+H+], 714,3 [M+Na+], 636,3 [(M -2-metilprop-1-eno)+H+], tiempo de retención = 1,13 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), señales características: 87,89 (d a, J = 7,4 Hz, 2H), 7,67-7,75 (m, 2H), 7,60 (s a, 1H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,30-7,36 (m, 2H), 7,21 (d a, J = 8,8 Hz, 1H), 4,44-4,59 (m, 2H), 4,17-4,27 (m, 3H), 3,68-3,78 (m a, 1H), 3,21 (s, 3H), 2,88 (s a, 3H), 2,09-2,20 (m, 2H), 1,39 (s, 9H).
Etapa 2. Síntesis de ácido (3R,4S,5S)-4-[{N-[(1-{[(977-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino} ciclopentil)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoico (n.° 28). A una solución de n.° 27 (500 mg, 0,723 mmol) en diclorometano (7 ml, 0,1 M) se añadió ácido trifluoroacético (3 ml). La mezcla de reacción se volvió inicialmente de color naranja, después se oscureció a lo largo del tiempo. Después de agitar durante 18 horas, el disolvente se retiró al vacío para dar n.° 28 (460 mg, cuantitativo) en forma de un vidrio de color pardo oscuro, que se usó sin purificación adicional. CL-EM: m/z 636,3 [M+H+].
Etapa 3. Síntesis de W2-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonN]amino}ciclopentN)carbonN]-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-valinam¡da (n.° 29). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 28 (50 mg, 0,079 mmol, 1 equiv.) diclorometano (3 ml, 0,03 M), W,W-dimetilformamida (0,5 ml), amina n.° 18 (44 mg, 0,087 mmol, 1,1 equiv.), trietilamina (33,0 pl, 0,237 mmol, 3 equiv.) y HATU (36 mg, 0,95 mmol, 1,2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano) para dar n.° 29 (59 mg, 67 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 1007,5 [M+H+], tiempo de retención = 1,11 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,80 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,89 (d a, J = 7 Hz, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) y 7,82 (d, J = 3,1 Hz), total 1H], 7,68-7,75 (m, 2H), [7,64 (d, J = 3,2 Hz) y 7,68 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,38­ 7,44 (m, 2H), 7,27-7,36 (m, 4H), 7 ,12 -7,25 (m, 4H), [6,30 (ddd, J = 11,8, 4,5 Hz) y 6,39-6,48 (m), total 1H], [4,50 (dd a, J = 8, 8 Hz) y 4,54-4,59 (m), total 1H], 4,17-4,29 (m, 3H), 2,89 y 2,96 (2 s a, total 3H), [1,13 (d, J = 6,5 Hz) y 1,16 (d, J = 6,4 Hz), total 3H].
Etapa 4. Síntesis de W2-[(1-aminociclopentil)carbonil]-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n.° 30). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 29 (54 mg, 0,054 mmol) en diclorometano (6 ml, 0,9 mM) y dietilamina (4 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar el ejemplo n.° 30 (26 mg, 61 % ) en forma de un sólido. HPLC (Protocolo A): tiempo de retención = 7,233 minutos, m/z 785,4 [M+H+], (pureza > 72 % ) . RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,82 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 8,19-8,27 (m, 1H), [7,80 (d, J = 3,2 Hz) y 7,83 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], [7,65 (d, J = 3,3 Hz) y 7,69 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,28-7,33 (m, 2H), 7,20-7,27 (m, 2H), 7,14 -7,19 (m, 1H), [6,31 (ddd, J = 11,8, 4,5 Hz) y 6,44 (ddd, J = 11,8, 4 Hz), total 1H], [4,53 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,60 (dd, J = 9, 7,5 Hz), total 1H], 3,24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3 ,17 y 3,21 (2 s, total 3H), 2,93 y 3,00 (2 s a, total 3H), [1,14 (d, J = 6,5 Hz) y 1,17 (d, J = 6,5 Hz), total 3H].
Preparación de 2-Metilalaml-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxM-£(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metN-3-£[(1S)-2-femM-(1,3t¡azol-2-M)et¡l]ammo}-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡dm-1-M}-5-metM-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-valmam¡da (n.° 34)
Figure imgf000082_0001
Etapa 1. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-2-metilalan¡l-W-[(3R,4S,5S)-1-terc-butox¡-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-W-met¡l-L-val¡namida (n.° 31). A una soluc¡ón de n.° 6 (70 % puro, 3,13 g, 6,1 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (40 ml, 0,15 M) se añad¡eron W-[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbon¡l]-2-met¡lalan¡na (1,99 g, 6,12 mmol, 1 equ¡v.), d¡¡soprop¡let¡lam¡na (2,67 ml, 15,3 mmol, 2,5 equ¡v.) y HATU (2,79 g, 7,35 mmol, 1,2 equ¡v.). La mezcla de reacc¡ón se ag¡tó durante 18 horas, se diluyó con acetato de et¡lo, se lavó con una soluc¡ón acuosa 1 M de ác¡do clorhídrico y se lavó con salmuera. La fase orgán¡ca se secó sobre sulfato sód¡co, se f¡ltró y se concentró al vacío sobre síl¡ce. Después, el mater¡al se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de sílice (Grad¡ente: de 0 % a 45 % de acetato de et¡lo en heptano) para proporc¡onar n.° 31 (3,65 g, 90 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 665,5 [M+H+], 688,5 [M+Na+], 610,5 [(M -2-metilprop-1-eno)+H+]; HPLC (Protocolo C): t¡empo de retenc¡ón = 9,455 (pureza > 94 % ); RMN 1H (400 Mh z , DMSO-d6), señales característ¡cas: 87,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,67-7,74 (m, 2H), 7,39-7,48 (m, 3H), 7,31-7,36 (m, 2H), 7,29 (d a, J = 8,8 Hz, 1H), 4,47-4,60 (m a, 1H), 4,47 (dd, J = 8,6, 8,0 Hz, 1H), 4,18-4,28 (m, 3H), 3,69-3,79 (m a, 1H), 3,21 (s, 3H), 2,88 (s a, 3H), 2 ,15 (dd, J = 15,5, 9,3 Hz, 1H), 1,91-2,01 (m, 1H), 1,67-1,81 (m a, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,36 (s a, 3H), 1,30 (s, 3H), 0,75 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,66-0,73 (m a, 3H).
Etapa 2. Síntes¡s de W-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbonil]-2-met¡lalan¡l-W-[(2R,3S,4S)-1-carbox¡-2-metox¡-4-met¡lhexan-3-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 32). De acuerdo con proced¡m¡ento general B, a part¡r de n.° 31 (500 mg, 0,751 mmol) en d¡clorometano (7 ml, 0,1 M) y ác¡do tr¡fluoroacét¡co (3 ml) se s¡ntet¡zó n.° 32 en forma de un cristal (458 mg, cuant¡tat¡vo), que se usó en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal. CL-EM: m/z 611,4 [M+2H+], 632,2 [M+Na+], t¡empo de retenc¡ón = 0,94 m¡nutos.
Etapa 3. Síntes¡s de W-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbonil]-2-met¡lalan¡l-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-Á/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 33). De acuerdo con proced¡m¡ento general D, a partir de n.° 32 (53,0 mg, < 0,083 mmol, 1 equiv.), diclorometano (4 ml, 0,02 M), W,W-dimet¡lformamida (1 ml), la amina n.° 18 (43,8 mg, 0,0870 mmol, 1 equiv.), trietilamina (36 pl, 0,26 mmol, 3 equiv.) y HATU (39,5 mg, 0,104 mmol, 1,2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano) para dar n.° 33 (60 mg, 69 % en dos etapas). CL-EM: m/z 981,4 [M+H+], tiempo de retención = 1,090 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,80 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,86-7,91 (m, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) y 7,82 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,68-7,74 (m, 2H), [7,64 (d, J = 3,2 Hz) y 7,68 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,38-7,44 (m, 2H), 7,20­ 7,36 (m, 6H), 7 ,12 -7 ,17 (m, 1H), 6,27-6,34 y 6,40-6,47 (2 m, total 1H), 3,22 y 3,24 (2 s, total 3H), 3,14 y 3,18 (2 s, total 3H), 2,90 y 2,97 (2 s a, total 3H), 1,37 (s a, 3H), 1,31 (2 s a, total 3H), [1,13 (d, J = 6,6 Hz) y 1,16 (d, J = 6,5 Hz), total 3H].
Etapa 4. Síntesis de 2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 34). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 33 (55 mg, 0,055 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (6 ml, 0,009 M) y dietilamina (4 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 5 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 34 (25 mg, 60 % ) en forma de un sólido. HPLC (Protocolo A): m/z 759,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,088 minutos, (pureza > 75 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,81 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 8,01-8,08 (m, 1H), [7,80 (d, J = 3,1 Hz) y 7,83 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], [7,65 (d, J = 3,2 Hz) y 7,69 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,29-7,33 (m, 2H), 7,20-7,27 (m, 2H), 7 ,13 -7,19 (m, 1H), 6,27-6,35 y 6,40-6,48 (2 m, total 1H), [4,49 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,56 (dd, J = 9, 8 Hz), total 1H], 3,24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,17 y 3,21 (2 s, total 3H), 2,92 y 2,99 (2 s a, total 3H), 1,20 y 1,21 (2 s, total 3H), 1 ,12 y 1 ,13 (2 s, total 3H), 0,75-0,81 (m, 3H).
Preparac¡ón de N-metM-L-vaMl-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxM-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-[(2femletil)ammo]-3-tioxopropil}pirrolidm-1-il]-5-metiM-oxoheptan-4-il}-W-metil-L-valmamida (n.° 36)
Figure imgf000083_0001
Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (n.° 35). A una mezcla de n.° 23 (337 mg, 0,983 mmol, 1 equiv.) en diclorometano ( 8 ml, 0,1 M) y N,N-dimetilformamida (1 ml) se añadieron n.° 8 (564 mg, 0,885 mmol, 0,9 equiv.), diisopropiletilamina (383 mg, 2,95 mmol, 3 equiv.) y HATU (472 mg, 1,18 mmol, 1,2 equiv.). Después de 2 horas, la mezcla se diluyó con diclorometano, se lavó secuencialmente con ácido clorhídrico acuoso 0,1 M y con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento G) para dar n.° 35 (600 mg, 6 6 % ) ; CL-EM : m/z 926,6 [M+H+], tiempo de retención = 1,16 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 [9,94 (t a, J = 5 Hz) y 10,16-10 ,23 (m a), total 1H], 7,90 (d, J = 7,2 Hz, 2H), [7,71 (d a, J = 7 Hz) y 8,06 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,60-7,65 (m, 2H), 7,41 (dd a, J = 7, 7 Hz, 2H), 7,15-7,36 (m, 7H), 3,29 (s, 3H), 1 ,16 -1,22 (m, 3H).
Etapa 2. Síntesis de N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (n.° 36). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 35 (465 mg, 0,502 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (5 ml, 0,1 M) y dietilamina (5 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 36 (310 mg, 8 8 % ) en forma de un sólido. C l -EM: m/z 704,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,74 minutos; HRMS: m/z calculado para C 38H66N5O5 S: 704,4779, encontrado: 704,477 [M+H+]; RMN 1H (400 MHz, CD 3 OD), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 7,23-7,30 (m, 4H), 7 ,15 -7,22 (m, 1H), [4,68 (d, J = 8 , 6 Hz) y 4,74 (d, J = 8,0 Hz), total 1H], 3,39 y 3,40 (2 s, total 3H), 3 ,12 y 3,22 (2 s a, total 3H), [2,82 (d, J = 6,0 Hz) y 2,84 (d, J = 6,0 Hz), total 1H], 2,29 y 2,30 (2 s, total 3H), [1,27 (d, J = 6 , 8 Hz) y 1,29 (d, J = 6 , 6 Hz), total 3H], [0,84 (t, J = 7,4 Hz) y 0,87 (t, J = 7,4 Hz), total 3H].
Preparación de Af-metil-L-valil-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-femletil]ammo}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidm-1-il}-3-metoxi-5-metiM-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 4 l) y N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2s)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-femlpropan-2-il]ammo}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidm-1-il}-5-metiM-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n.° 42)
Figure imgf000083_0002
Etapa 1. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(terc-butox¡carbon¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l}-L-fenilalaninato de met¡lo (n.° 37). A una mezcla de n.° 11 (2,7 g, 9,4 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (3o ml, 0,3 M) y N,N-d¡met¡lformam¡da (3 ml) se añad¡eron d¡¡soprop¡let¡lam¡na (3,30 ml, 18,8 mmol, 2 equ¡v.), clorhidrato de éster metíl¡co de L-fen¡lalan¡na (2,03 g, 9,40 mmol, 1,2 equ¡v.) y HATU (4,79 g, 12,2 mmol, 1,3 equ¡v.). La reacc¡ón se ag¡tó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El res¡duo se recog¡ó en acetato de et¡lo (100 ml) y se lavó secuenc¡almente con ác¡do clorhídr¡co 1 M (2 x 50 ml) y salmuera. La fase orgán¡ca se secó sobre sulfato sód¡co, se f¡ltró y se evaporó al vacío. El mater¡al en bruto se recog¡ó en d¡clorometano y se f¡ltró. El f¡ltrado se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 0 % a 100 % de acetato de et¡lo en heptano) para dar n.° 37 (2,76 g, 65 % ) en forma de un sól¡do de color blanquec¡no. CL-EM: m/z 449,3 [M+H+], 349.2 [(M - Boc)+H+]; t¡empo de retenc¡ón = 0,88 m¡nutos; RMN 1H (400 m Hz , DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 88,28 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,14-7,29 (m, 5H), 4,50 (ddd, J =10,9, 8,1, 4,4 Hz, 1H), 3,64 (s, 3H), 3,23 (s, 3H), 2 ,15 -2,24 (m, 1H), 1,56-1,76 (m, 2H), 1,31 -1,55 (m, 11H), 1,02 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
Etapa 2. Síntes¡s de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(terc-butox¡carbon¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l]-3-metox¡-2-met¡lpropanot¡o¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo (n.° 38). Una mezcla de n.° 37 (1,52 g, 3,39 mmol, 1 equ¡v.) y n.° 21 (1,68 g, 4,41 mmol, 1,3 equ¡v.) en aceton¡tr¡lo (12 ml, 0,28 M) se somet¡ó a rad¡ac¡ón de m¡croondas a 100 °C durante 1 hora. La mezcla se repart¡ó entre agua y acetato de et¡lo. La fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de et¡lo. Las fases orgán¡cas comb¡nadas se lavaron con una soluc¡ón acuosa al 10 % de ác¡do cítr¡co y con salmuera, se secaron sobre sulfato sód¡co, se f¡ltraron y se concentraron al vacío. El mater¡al se d¡solv¡ó en una pequeña cant¡dad de acetato de et¡lo y se concentró sobre síl¡ce al vacío. La pur¡f¡cac¡ón por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 0 % a 30 % de acetato de et¡lo en heptano) proporc¡onó n.° 38 (680 mg, 43 % ); CL-EM: m/z 465.2 [M+H+], 487,3 [M+Na+], 365,2 [(M - Boc)+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,97 m¡nutos; HPLC (Protocolo B): 465.2 [M+H+], 487,2 [M+Na+], 365,2 [(M - Boc)+H+], t¡empo de retenc¡ón = 7,444 m¡nutos (pureza > 98 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 810,23 (d a, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17-7,28 (m, 5H), 5,24 (ddd, J = 11,7 , 5, 4,5 Hz, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,28 (s, 3H), 3,21 (dd, J = 14,3, 4,4 Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 14,2, 11,2 Hz, 1H), 2,65-2,74 (m, 1H), 1,54 -1,71 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,17 (d, J = 6,4 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntes¡s de N-{(2R,3R)-3-metox¡-2-met¡l-3-[(2S)-p¡rrol¡d¡n-2-¡l]propanot¡o¡l}-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo, sal clorhidrato (n.° 39). De acuerdo con proced¡m¡ento general C, a 0 °C a part¡r de n.° 38 (660 mg, 1,42 mmol, 1 equ¡v.), d¡oxano (10 ml, 0,14 M) y una soluc¡ón 4 M de ác¡do clorhídr¡co en d¡oxano (20 ml, 80 mmol, 60 equ¡v.) se s¡ntet¡zó n.° 39 (590 mg) en forma de un sól¡do de color blanquec¡no, que se usó en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal. C L -e M: m/z 365,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,58 m¡nutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 810,67 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 9,42-9,54 (m a, 1H), 8,21-8,33 (m a, 1H), 7,20-7,35 (m, 5H), 5,25 (ddd, J = 11,1, 7,6, 4,4 Hz, 1H), 3,76 (dd, J = 8,9, 3,0 Hz, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,39 (s, 3H), 3,24 (dd, J = 14,2, 4,5 Hz, 1H), 3,13 (dd, J = 14,3, 11,0 Hz, 1H), 2,93-3,09 (m, 3H), 2,85-2,93 (m, 1H), 1,72-1,84 (m, 1H), 1,36-1,60 (m, 3H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
Etapa 4. Síntes¡s de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N-met¡l-L-val¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S )-1-metox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxohieptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 40). De acuerdo con proced¡m¡ento general D, a part¡r de n.° 8 (247 mg, 0,387 mmol, 1 equ¡v.), n.° 39 (186 mg, <0,450 mmol, 1,2 equ¡v.), d¡clorometano (10 ml, 0,04 M), N,N-d¡met¡lformam¡da (2 ml), HATU (176 mg, 0,464 mmol, 1,2 equ¡v.) y tr¡et¡lam¡na (189 pl, 1,35 mmol, 3,5 equ¡v.) se s¡ntet¡zó el mater¡al en bruto deseado, que se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 0 % a 2 5 % de acetona en heptano) para dar n.° 4o (410 mg, 90 % en 2 etapas) en forma de un sól¡do de color blanquec¡no. CL-EM: m/z 984,7 [M+H+], 1006,7 [M+Na+], t¡empo de retenc¡ón = 1,15 m¡nutos; HPLC (Protocolo C): t¡empo de retenc¡ón = 9,683 m¡nutos (pureza > 99 % ); r Mn 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 8 [10,19 (d a, J = 7 Hz) y 10,49 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60-7,65 (m, 2H), 7,38-7,45 (m, 2H), 7,29-7,35 (m, 2H), 7,14-7,28 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11,7 , 4 Hz) y 5,35-5,43 (m), total 1H], 3,65 y 3,69 (2 s, total 3H), [1,15 (d, J = 6,5 Hz) y 1,18 (d, J = 6,4 Hz), total 3H].
Etapa 5A. Síntes¡s de N-met¡l-L-val¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 41). A una soluc¡ón de n.° 40 (401 mg, 0,407 mmol, 1 equ¡v.) en tetrah¡drofurano (10 ml, 0,03 M) se añad¡ó una soluc¡ón de h¡dróx¡do de l¡t¡o (24,4 mg, 1,02 mmol, 2,5 equ¡v.) en agua (5 ml). Después de 4 horas, la reacc¡ón se concentró al vacío y después se dest¡ló azeotróp¡camente tres veces con heptano. El mater¡al en bruto se d¡solv¡ó en d¡met¡lsulfóx¡do (7 ml) y se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento C, 7 ¡nyecc¡ones de 1 ml). Las fracc¡ones aprop¡adas se concentraron (Genevac) antes de d¡lu¡rse con una pequeña cant¡dad de metanol en d¡clorometano. La mezcla se concentró al vacío para dar un sól¡do parec¡do al cr¡stal. Después, se añad¡ó éter d¡etíl¡co, segu¡do de heptano, y la mezcla se concentró al vacío para proporc¡onar n.° 41 (180 mg, 59 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM: m/z 748,6 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,68 m¡nutos; HPLC (Protocolo A): 748,4 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 6,922 m¡nutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 8 12,9 y 13,1 (2 x s a, total 1H), [10,12 (d a, J = 8 Hz) y 10,45 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 8,75-8,90 (m, 2H), 8,62-8,73 (m a, 1H), 7,13-7,29 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11,7,5, 4 Hz) y 5,40 (ddd, J = 11,5 , 8, 4 Hz), total 1H], 4,55-4,73 (m, 2H), 3,23 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,16 y 3,18 (2 s, total 3H), 2,97 y 3,01 (2 s a, total 3H), 1,13 -1,20 (m, 3H), 0,73-0,81 (m, 3H).
Etapa 5B. Síntesis de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 42). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 40 (561 mg, 0,570 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,057 M) y dietilamina (10 ml) se sintetizó n.° 42 (348 mg, 80 % ) en forma de un sólido de color blanco después de cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano). CL-EM : m/z 762,7 [M+H+], tiempo de retención = 0,74 minutos; HPLC (Protocolo A): 762,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,315 minutos (pureza > 95 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 [10,20 (d a, J = 7,5 Hz) y 10,50 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,95­ 8,03 (m, 1H), 7,15-7,29 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11,7,5, 5 Hz) y 5,39 (ddd, J = 11,7 , 5, 4 Hz, total 1H], [4,57 (dd, J = 8,8, 8,7 Hz) y 4,61 (dd, J = 8,7, 8,6 Hz), total 1H], 3,65 y 3,69 (2 s, total 3H), 3,24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,16 y 3,17 (2 s, total 3H), 2,96 y 2,99 (2 s a, total 3H), 2,69-2,79 (m, 1H), 2,62-2,68 (m, 1H), 2,14 y 2 ,15 (2 s a, total 3H), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) y 1,18 (d, J = 6,5 Hz), total 3H], [0,75 (t, J = 7,4 Hz) y 0,76 (t, J = 7,3 Hz), total 3H].
Preparación de 2-Metilalaml-W-[(3R,4S,5S)-1-{2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-femletil]ammo}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidm-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valmamida, sal clorhidrato (n.° 44) y 2-metilalaml-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-femlpropan-2-il]am ino}-2-metil-3-tioxopropil] pirrolidm-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-Ñ-metil-L-valmamida, sal clorhidrato (n.° 45)
Figure imgf000085_0001
Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il] amino }-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 43). A una solución de n.° 32 (321 mg, 0,881 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (5 ml, 0,1 M) y N,A/-dimetilformamida (1 ml) se añadieron n.° 39 (484 mg, <0,769 mmol, 0,9 equiv.), HATU (353 mg, 0,881 mmol, 1 equiv.) y diisopropiletilamina (463 ^l, 2,64 mmol, 3 equiv.). Después de agitar durante 18 horas, la mezcla se diluyó con diclorometano, se lavó con agua y con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró sobre sílice al vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano) para dar n.° 43 (574 mg, 68 % en dos etapas) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 956,6 [M+H+], tiempo de retención = 4,49 minutos; RMN 1H (400 MHz, CD 3OD), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 7,80 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,64-7,72 (m, 2H), 7,16-7,35 (m, 7H), [5,43 (dd, J = 11,4 ,5 Hz) y 5,58 (dd, J = 11,5 , 4 Hz), total 1H], 3,72 y 3,75 (2 s, total 3H), 3,34 y 3,35 (2 s, total 3H), 3,26 y 3,29 (2 s, total 3H), 3,05 y 3,11 (2 s a, total 3H), 1,39 y 1,40 (2 s, total 3H), [1,24 (d, J = 6,7 Hz) y 1,29 (d, J = 6,4 Hz), total 3H].
Etapa 2A. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida, sal clorhidrato (n.° 44). A una solución de n.° 43 (100 mg, 0,105 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (5 ml, 0,02 M) se añadió una solución de hidróxido de litio (10 mg, 0,417 mmol, 3 equiv.) en agua (3 ml). Después de 3 horas, la reacción se concentró al vacío y se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar una sal de ácido trifluoroacético, que se disolvió en metanol, se trató con una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano y se concentró al vacío para dar n.° 44 (56 mg, 71 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 720,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,67 minutos; HPLC (Protocolo D): tiempo de retención = 8,851 minutos; RMN 1H (400 MHz, CD 3OD), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 7,17-7,31 (m, 5H), 3,34 y 3,35 (2 s, total 3H), 3,10 y 3,16 (2 s a, total 3H), 1,62 y 1,64 (2 s, total 3H), 1,53 y 1,55 (2 s, total 3H), [1,26 (d, J = 6,5 Hz) y 1,30 (d, J = 6,5 Hz), total 3H], 0,84-0,91 (m, 3H).
Etapa 2B. Síntesis de 2-met¡lalan¡l-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da, sal clorhidrato (n.° 45). De acuerdo con proced¡m¡ento general A, a partir de n.° 43 (176 mg, 0,184 mmol, 1 equ¡v.), d¡clorometano (4 ml, 0,05 M) y d¡et¡lam¡na (4 ml) se s¡ntet¡zó el mater¡al en bruto deseado, que se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento C). La sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co resultante se d¡solv¡ó en metanol, se trató con una soluc¡ón 4 M de ác¡do clorhídr¡co en d¡oxano y se concentró al vacío para dar n.° 45 (100 mg, 70 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM: m/z 734,6 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,72 m¡nutos; RMN 1H (400 MHz, CD 3OD), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 87,18 ­ 7,31 (m, 5H), 5,41-5,47 y 5,55-5,62 (2 m, total 1H), 3,73 y 3,76 (2 s, total 3H), 3,35 y 3,36 (2 s, total 3H), 3,10 y 3,15 (2 s a, total 3H), 1,62 y 1,64 (2 s, total 3H), 1,53 y 1,55 (2 s, total 3H), [1,25 (d, J = 6,6 Hz) y 1,29 (d, J = 6,5 Hz), total 3H], 0,84-0,91 (m, 3H).
Preparación de W2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenM-1-(1,3-tiazol-2-N)etM]ammo}propN]pirroMdm-1-M}-5-metiM-oxoheptan-4-N]-W-metN-L-valinamida (n.° 47)
Figure imgf000086_0001
Etapa 1. Síntes¡s de W2-[(1-{[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]am¡no}c¡clopent¡l)-carbon¡l]-A/-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 46). A una soluc¡ón de n.° 19 (353 mg, 0,944 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (10 ml, 0,094 M) se añad¡eron n.° 28 (600 mg, 0,944 mmol, 0,9 equ¡v.), d¡¡soprop¡let¡lam¡na (498 |jl, 2,83 mmol, 3 equ¡v.) y HATU (444 mg, 1,13 mmol, 1,2 equ¡v.). Después de ag¡tar durante dos días, la mezcla se concentró al vacío y el res¡duo se d¡luyó con acetato de et¡lo (60 ml), se lavó con una soluc¡ón acuosa 1 M de ác¡do clorhídr¡co y con salmuera, se secó sobre sulfato sód¡co, se f¡ltró y se concentró al vacío. El res¡duo se diluyó con d¡clorometano y se f¡ltró. El f¡ltrado se concentró a pres¡ón reduc¡da sobre síl¡ce y se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 40 % a 100 % de acetato de et¡lo en heptano) para dar n.° 46 (644 mg, 69 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM: m/z 991,8 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 1,07 m¡nutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 87,89 (d a, J = 7,4 Hz, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,79 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,66-7,76 (m, 2H), [7,62 (d, J = 3,3 Hz) y 7,65 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,37-7,44 (m, 2H), 7 ,11-7 ,36 (m, 7H), [5,38 (ddd, J = 11,8, 4 Hz) y 5,48-5,57 (m), total 1H], 3,13, 3,17, 3,18 y 3,24 (4 s, total 6H), 2,90 y 3,00 (2 s a, total 3H), [1,05 (d, J = 6,6 Hz) y 1,09 (d, J = 6,8 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntes¡s de W2-[(1-am¡noc¡clopent¡l)carbon¡l]-A/-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 47). A una mezcla de n.° 46 (500 mg, 0,504 mmol, 1 equ¡v.) en tetrah¡drofurano (8 ml, 0,06 M) se añad¡ó d¡et¡lam¡na (4 ml). Después de ag¡tar durante 18 horas, la mezcla de reacc¡ón se concentró al vacío y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 0 % a 10 % de metanol en d¡clorometano) para dar n.° 47 (374 mg, 96 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM: m/z 769,6 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,70 m¡nutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales característ¡cas: 8 [8,64 (d a, J = 8,4 Hz) y 8,87 (d a, J = 8,6 Hz), total 1H], [8,22 (d a, J = 9,4 Hz) y 8,26 (d a, J = 9,4 Hz), total 1H], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,80 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,1 Hz) y 7,66 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,13-7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,1, 8,5, 4,2 Hz) y 5,54 (ddd, J = 11,7, 8,8, 4,1 Hz), total 1H], [4,53 (dd, J = 9,2, 7,6 Hz) y 4,64 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz), total 1H], 3,16, 3,20, 3,21 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,93 y 3,03 (2 s a, total 3H), [1,05 (d, J = 6,8 Hz) y 1,10 (d, J = 6,6 Hz), total 3H], 0,73-0,80 (m, 3H).
Preparación de W2-[(1-Aminociclopropil)carbonil]-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-feml-1-(1,3-tiazol-2-N)eÍM]ammo}propN]pirroMdm-1-M}-5-metiM-oxoheptan-4-N]-W-metN-L-valinamida (n.° 51) y 1-amino-W-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxM-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metN-3-oxo-3 {[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-2-N)etM]ammo}propN]pirroNdm-1-M}-5-metiM-oxoheptan-4-N](metM)ammo}-3-metiM-oxobutan-2-il]ciclohexanocarboxamida (n.° 52)
Figure imgf000087_0001
Etapa 1. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético y ácido (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoico (n.° 48). A una solución de n.° 16 (1,0 g, 2 ,11 mmol, 1 equiv.) y n.° 5 (1,22 g, 2 ,11 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (20 ml, 0,1 M) a 0 °C se añadió ácido trifluoroacético (6 ml). Después de 3 horas, la mezcla se concentró al vacío para dar la mezcla n.° 48 (1,8 g), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional; CL-EM (Protocolo K): m/z 374,2 [M+H+], tiempo de retención = 2,093 minutos, 525,2 [M+H+], tiempo de retención = 4,875 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-^-metil-L-valinamida (n.° 49). A una solución de n.° 48 (1,8 g, <2,1 mmol, 1 equiv.) y cianofosfonato de dietilo (DEPC) (0,51 g, 3,2 mmol, 1,5 equiv.) en 1,2-dimetoxietano (30 ml, 0,07 M) a 0 °C se añadió trietilamina (1,47 ml, 10,6 mmol, 5 equiv.). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (de 10 % a 50 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar n.° 49 (0,8 g, 45 % ). Fr 0,6 (metanol al 10 % en diclorometano); CL-EM (Protocolo K): m/z 881,3 [M+H+], 903,3 [M+Na+], tiempo de retención = 4,837 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 50). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 49 (0,70 g, 0,79 mmol, 1 equiv.), diclorometano (15 ml, 0,05 M) y dietilamina (10 ml) se sintetizó n.° 50 (160 mg, 30 % ) después de la purificación por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 5 % de metanol en diclorometano). Fr 0,4 (metanol al 10 % en diclorometano); CL-EM (Protocolo K): m/z 658,3 [M+H+], 680,3 [M+Na+], tiempo de retención = 2,760 minutos.
Etapa 4A. Síntesis de N2-[(1-aminociclopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 51). A una solución de n.° 50 (100 mg, 0,15 mmol, 1 equiv.), hexafluorofosfato de bromotris(dimetilamino)fosfonio (Brop, 70 mg, 0,18 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (0,08 ml, 0,45 mmol, 3 equiv.) en diclorometano (15 ml, 0,01 M) a 0 °C se añadió ácido 1-aminociclopropanocarboxílico (18 mg, 0,18 mmol, 1,2 equiv.). Después de 2 horas, la mezcla se inactivó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 5 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 51 (45 mg, 34 % ) . Fr 0,5 (metanol al 10 % en diclorometano). CL-EM (Protocolo l): m/z 741,44 [m +H+]; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8 Hz) y 8,88 (da, J = 8 Hz), total 1H], [8,16 (d a, J = 9 Hz) y 8,22 (d a, J = 10 Hz), total 1H], [7,77 (d, J = 3,5 Hz) y 7,79 (d, J = 3,5 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,5 Hz) y 7,65 (d, J = 3 Hz), total 1H], 7,10-7,32 (m, 5H), 5,33-5,60 (m, 1H), 3,16, 3,20, 3,21 y 3,26 (4 s, total 6H), 2,93 y 3,02 (2 s a, total 3H), [1,05 (d, J = 6,3 Hz) y 1,10 (d, J = 6,3 Hz), total 3H].
Etapa 4B. Síntesis de 1-amino-A/-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]ciclohexanocarboxamida (n.° 52). A una solución de n.° 50 (120 mg, 0,18 mmol, 1 equiv.), Brop (84 mg, 0,21 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (0,1 ml, 0,54 mmol, 3 equiv.) en diclorometano (15 ml, 0,009 M) a 0 °C se añadió ácido 1-aminociclohexanocarboxílico (31 mg, 0,21 mmol, 1,2 equiv.). Después de 2 horas, la mezcla se inactivó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 5 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 52 (50 mg, 35 % ). Fr 0,6 (metanol al 10 % en diclorometano). CL-EM (Protocolo K): m/z 783,79 [M+H+]; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8 Hz) y 8,87 (d a, J = 9 Hz), total 1H], 8,18-8,28 (m, 1H), [7,77 (d, J = 3,5 Hz) y 7,80 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) y 7,66 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,12 -7,31 (m, 5H), 5,35-5,43 y 5,49-5,57 (2 m, total 1H), [4,51 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,61 (dd, J = 9, 7 Hz), total 1H], 3,16, 3,19, 3,21 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,93 y 3,02 (2 s a, total 3H), [1,05 (d, J = 6,8 Hz) y 1,10 (d, J = 6,8 Hz), total 3H].
Preparación de 2-Met¡lalaml-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-feml-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]ammo}prop¡l]p¡rrol¡dm-1-M}-5-met¡l-Í-oxoheptan-4-M]-W-met¡l-L-valmam¡da (n.° 54)
Figure imgf000088_0001
Etapa 1. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 53). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 32 (2,05 g, 2,83 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (20 ml, 0,1 M) y W,A/-dimetilformamida (3 ml), la amina n.° 19 (2,5 g, 3,4 mmol, 1,2 equiv.), HATU (1,29 g, 3,38 mmol, 1,2 equiv.) y trietilamina (1,57 ml, 11,3 mmol, 4 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 55 % de acetona en heptano), produciendo n.° 53 (2,42 g, 74 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 965,7 [M+H+], 987,6 [M+Na+], tiempo de retención = 1,04 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 965,4 [M+H+], tiempo de retención = 11,344 minutos (pureza > 97 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,86-7,91 (m, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,79 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,67-7,74 (m, 2H), [7,63 (d, J = 3,2 Hz) y 7,65 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,38-7,44 (m, 2H), 7,30-7,36 (m, 2H), 7,11-7,30 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,4, 8,4, 4,1 Hz) y 5,52 (ddd, J = 11,7 , 8,8, 4,2 Hz), total 1H], [4,49 (dd, J = 8,6, 7,6 Hz) y 4,59 (dd, J = 8,6, 6,8 Hz), total 1H], 3,13, 3,17, 3,18 y 3,24 (4 s, total 6H), 2,90 y 3,00 (2 s a, total 3H), 1,31 y 1,36 (2 s a, total 6H), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) y 1,09 (d, J = 6,7 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de 2-metilalanil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 54). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 53 (701 mg, 0,726 mmol) en diclorometano (10 ml, 0,07 M) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano). El residuo se diluyó con éter dietílico y heptano y se concentró al vacío para proporcionar n.° 54 (406 mg, 75 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 743,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,70 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 743,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,903 minutos, (pureza > 9 7 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8,5 Hz) y 8,86 (d a, J = 8,7 Hz), total 1H], [8,04 (d a, J = 9,3 Hz) y 8,08 (d a, J = 9,3 Hz), total 1H], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,80 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) y 7,66 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,13-7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11, 8,5, 4 Hz) y 5,53 (ddd, J = 12, 9, 4 Hz), total 1H], [4,49 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,60 (dd, J = 9, 7 Hz), total 1H], 3,16, 3,20, 3,21 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,93 y 3,02 (2 s a, total 3H), 1,21 (s, 3H), 1,13 y 1,13 (2 s, total 3H), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) y 1,10 (d, J = 6,7 Hz), total 3H], 0,73-0,80 (m, 3H).
Preparación de 2-Met¡lalaml-W-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-[(2-femlet¡l)ammo]prop¡l}p¡rrol¡dm-1-¡l]-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l}-W-met¡l-L-valmam¡da, sal de ácido acético (n.° 56)
Figure imgf000089_0001
Etapa 1. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-2-met¡lalan¡l-W-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-[(2-fen¡let¡l)am¡no]prop¡l}p¡rrol¡d¡n-1-¡l]-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l}-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 55). A una soluc¡ón de n.° 24 (104 mg, 0,256 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (10 ml, 0,094 M) se añad¡eron n.° 32 (156 mg, 0,256 mmol, 0,9 equ¡v.), d¡¡soprop¡let¡lam¡na (135 pl, 0,768 mmol, 3 equ¡v.) y HATU (120 mg, 0,307 mmol, 1,2 equ¡v.). Después de ag¡tar durante 18 horas, la mezcla se concentró al vacío y el res¡duo se d¡luyó con acetato de et¡lo (10 ml), se lavó con una soluc¡ón acuosa 1 M de ác¡do clorhídrico (2 x 5 ml) y con salmuera, se secó sobre sulfato sód¡co, se f¡ltró y se concentró al vacío. El res¡duo se d¡luyó con d¡clorometano y se f¡ltró. El f¡ltrado se concentró a pres¡ón reduc¡da sobre síl¡ce y se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de sílice (Grad¡ente: de 0 % a 100 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 55 (44 mg, 19 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM: m/z 884,5 [M+2H+], t¡empo de retenc¡ón = 1,04 m¡nutos.
Etapa 2. Síntes¡s de 2-met¡lalan¡l-W-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-[(2-fen¡let¡l)am¡no]prop¡l}p¡rrol¡d¡n-1-¡l]-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l}-A/-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do acét¡co (n.° 56). A una mezcla de n.° 55 (44 mg, 0,050 mmol, 1 equ¡v.) en tetrah¡drofurano (1 ml, 0,05 M) se añad¡ó d¡et¡lam¡na (0,5 ml). Después de ag¡tar durante 18 horas, la mezcla de reacc¡ón se concentró al vacío y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento B) para dar n.° 56 (16,2 mg, 49 % ) en forma de un sól¡do. CL-EM: m/z 660,8 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 2,23 m¡nutos; HPLC (Protocolo A): m/z 660,5 [M+H+], 682,4 [M+Na+], t¡empo de retenc¡ón = 6,865 m¡nutos.
Preparac¡ón de 2-Met¡lalaml-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1-femlc¡cloprop¡l)met¡l]ammo}prop¡l]p¡rrol¡dm-1-¡l}-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-valmam¡da (n.° 60)
Figure imgf000089_0002
Etapa 1. Síntes¡s de 1-(1-fen¡lc¡cloprop¡l)metanam¡na n.°@1. A una soluc¡ón de 1-fen¡lc¡clopropanocarbon¡tr¡lo (50 g, 0,34 mol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (500 ml, 0,7 M) a 0 °C se añadió hidruro de litio y aluminio (23 g, 0,35 mol, 1,03 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante una hora y después a reflujo durante una hora. Después, la mezcla de reacción se enfrió y se inactivó con agua (23 ml) y una solución acuosa al 15 % hidróxido sódico acuoso (69 ml). La mezcla se filtró y se concentró al vacío para proporcionar n.°@1 (36 g, 72 % ). CL-EM: m/z 148,1 [M+H+], tiempo de retención = 0,86 minutos; RMN 1H (400 MHz, CDCh) 87,2-7,4 (m, 5H), 2,78 (s, 2H), 1,19 (s a, 2H), 0,72-0,84 (m, 4H).
Etapa 2. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclo propil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 57). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 11 (2,15 g, 7,48 mmol, 1,1 equiv.) en diclorometano (20 ml, 0,3 M) y A/,W-dimetilformamida (4 ml), 1-(1-fenilciclopropil)metanamina n.°@1 (1,001 g, 6,799 mmol, 1 equiv.), HATU (3,10 g, 8,16 mmol, 1,2 equiv.) y trietilamina (2,84 ml, 20,4 mmol, 3 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 100 % de acetato de etilo en heptano), produciendo n.° 57 (1,93 g, 68 % ) en forma de un sólido. HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 417,3 [M+H+], tiempo de retención = 10,575 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), se presume que es una mezcla de rotámeros: 87,75-7,81 (m, 1H), 7,20-7,27 (m, 4H), 7,12 -7 ,19 (m, 1H), 3,33-3,62 y 3,71-3,80 (multipletes a, total 4H), 3,28 (s, 3H), 2,97-3,17 (m a, 2H), 2,14-2,24 (m, 1H), 1,67-1,80 (m a, 2H), 1,45­ 1,65 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,00 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,67-0,93 (m, 4H).
Etapa 3. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-W-[(1-fenilciclopropil)metil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal clorhidrato (n.° 58). De acuerdo con procedimiento general C, a partir de n.° 57 (566 mg, 1,36 mmol, 1 equiv.) en dioxano (4 ml, 0,3 M) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (4 ml, 16 mmol, 11,7 equiv.) se sintetizó n.° 58 (466 mg, 97 % ); CL-EM: m/z 318,2 [M+H+], 339,2 [M+Na+], tiempo de retención = 0,56 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,53 (s a, 1H), 8,48 (s a, 1H), 8,11 (dd a, J = 5,7, 5,6 Hz, 1H), 7,23-7,30 (m, 4H), 7,14­ 7,21 (m, 1H), 3,58 (dd, J = 7,5, 3,9 Hz, 1H), 3,50 (dd, J = 13,7, 6,3 Hz, 1H), 3,34 (s, 3H), 3,21-3,29 (m a, 1H), 3,18 (dd, J = 13,8, 5,0 Hz, 1H), 3,04-3,13 (m a, 2H), 2,42-2,50 (m, 1H), 1,56-1,89 (m, 4H), 1,04 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,71-0,91 (m, 4H).
Etapa 4. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxo-heptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 59). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 32 (550 mg, 0,902 mmol, 1 equiv.), n.° 58 (350 mg, 0,992 mmol, 1,1 equiv.) diclorometano (10 ml, 0,08 M) y W,W-dimetilformamida (2 ml), HATU (446 mg, 1,17 mmol, 1,3 equiv.) y trietilamina (0,503 ml, 3,61 mmol, 4 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano), produciendo n.° 59 (618 mg, 69 % ) en forma de un sólido de color blanquecino. CL-EM: m/z 908,7 [M+H+], 930,7 [M+Na+], tiempo de retención = 1,07 minutos; HPLC (Protocolo B a 45 °C): m/z 908,5 [M+H+], tiempo de retención = 8,721 minutos (pureza > 97 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,89 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,30-7,36 (m, 2H), [4,49 (dd, J = 8,5, 7,8 Hz) y 4,59 (dd, J = 8,7, 6,9 Hz), total 1H], 4,18-4,26 (m, 3H), 3,93-4,01 (m a, 1H), 3,23 y 3,26 (2 s, total 3H), 3,16 y 3,16 (2 s, total 3H), 2,91 y 3,05 (2 s a, total 3H), 1,36 y 1,37 (2 s a, total 3H), 1,30 y 1,32 (2 s a, total 3H), [1,00 (d, J = 6,7 Hz) y 1,02 (d, J = 6,6 Hz), total 3H], 0,67-0,78 (m, 7H).
Etapa 5. Síntesis de 2-metilalanil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n.° 60). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 59 (605 mg, 0,666 mmol, 1 equiv.) diclorometano (10 ml, 0,067 M) y dietilamina (10 ml) se sintetizó n.° 60 (379 mg, 83 % ); HPLC (Protocolo A 45 °C) m/z 685,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,072 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,03 (d a, J = 9,6 Hz) y 8,07 (d a, J = 9,4 Hz), total 1H], [7,74 (dd a, J = 7, 4 Hz) y 7,99 (dd a, J = 5,9, 5,7 Hz), total 1H], 7,20-7,27 (m, 4H), 7 ,11 -7 ,17 (m, 1H), [4,49 (dd, J = 9, 7 Hz) y 4,58 (dd, J = 9, 7,5 Hz), total 1H], 3,96-4,04 (m a, 1H), 3,24 y 3,27 (2 s, total 3H), 3,18 y 3,19 (2 s, total 3H), 2,93 y 3,07 (2 s a, total 3H), 1,20 y 1,21 (2 s, total 3H), 1,12 y 1,14 (2 s, total 3H), [1,00 (d, J = 6,7 Hz) y 1,03 (d, J = 6,7 Hz), total 3H].
Preparación de 2-MetNalaml-W-[(3R,4S,5S)-1-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[2-(dclohepta-2,4,6-trien-1-N)etM]ammo}-1-metoxi-2-metN-3-oxopropM]pirroNdm-1-M}-3-metoxi-5-metiM-oxoheptan-4-M]-W-metM-L-valmamida (n.° 66)
Figure imgf000091_0001
Etapa 1. Síntesis de cidohepta-2,4,6-trien-1-ilacetonitrilo (n.° 61). A una solución de acetonitrilo anhidro (3,12 ml, 56,2 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (281 ml, 0,2 M) se añadió diisopropilamina de litio (1,8 M en heptano/ etilbenceno/ tetrahidrofurano, 31,2 ml, 56,2 mmol, 1 equiv.) a -78 °C. Después de 20 minutos a -78 °C, se añadió tetrafluoroborato de tropilio (10 g, 56 mmol, 1 equiv.). Después de 10 minutos, la reacción se concentró al vacío y el residuo se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar un aceite de color pardo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 61 (1,88 g, 25 % ) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 86,69-6,71 (m, 2H), 6,27-6,32 (m, 2H), 5,28­ 5,33 (m, 2H), 2,61 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 2,26-2,34 (m, 1H).
Etapa 2. Síntesis de 2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etanamina (n.° 62). A una suspensión de hidruro de litio y aluminio (911 mg, 24,0 mmol, 1,4 equiv.) en éter dietílico anhidro (75 ml, 0,23 M) a 0 °C se añadió lentamente, gota a gota durante 15 minutos, una solución de n.° 61 (2,25 g, 17,2 mmol, 1 equiv.) en éter dietílico (15 ml). La reacción se calentó a temperatura ambiente. Después de 5 horas, la reacción se enfrió a 0 °C y se interrumpió mediante la adición de agua (1 ml), después se filtró a través de un lecho pequeño de Celite y se lavó con metanol. El filtrado se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar n.° 62 (1,683 g, 73 % ) en forma de un aceite de color dorado. CL-EM: m/z 136,1 [M+H+], tiempo de retención = 0,23 minutos; RMN 1H (400 MHz, CDCla) 86,64-6,67 (m, 2H), 6,16-6,21 (m, 2H), 5,16-5,21 (m, 2H), 2,84-2,89 (m, 2H), 1,86­ 1,92 (m, 2H), 1,62-1,70 (m, 1H).
Etapa 3. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 63). A una solución de n.° 11 (3,57 g, 12,4 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (100 ml, 0,1 M) y N,N-dimetilformamida (4 ml) se añadió HATU (5,36 g, 13,7 mmol, 1,1 equiv.). Después de 20 minutos, se añadió trietilamina (5,20 ml, 37,3 mmol, 3 equiv.), seguido de n.° 62 (1,68 g, 12,4 mmol, 1 equiv.) y la mezcla se agitó durante 18 horas. La reacción se concentró al vacío y el residuo se recogió en acetato de etilo y se lavó con agua (50 ml). La fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de etilo (3 times) y las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar un aceite de color pardo, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 100 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 63 (2,95 g, rendimiento del 59 % ) en forma de un aceite viscoso. CL-EM: m/z 405,4 [M+H+], 427,4 [M+Na+], tiempo de retención = 0,75 minutos; RMN 1H (400 MHz, CDCh), presuntamente una mezcla de rotámeros: 86,63-6,68 (m, 2H), 6,16-6,23 (m, 2H), 5,19 (dd a, J = 9,0, 5,8 Hz, 2H), 3,51-3,63 y 3,71-3,90 (2 multipletes a, total 3H), 3,42 (s, 3H), 3,18-3,29 y 3,34-3,47 (2 multipletes a, total 3H), 2,27-2,45 (m a, 1H), 1,6-2,00 (m, 7H), 1,47 y 1,50 (2 s a, total 9H), 1,16 -1,29 (m a, 3H).
Etapa 4. Síntesis de (2R,3R)-N-[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal clorhidrato (n.° 64)
El Intermedio n.° 63 (400 mg, 0,989 mmol, 1 equiv.) se trató con una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (10 ml, 40 mmol, 40 equiv.). Después de 1 hora, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se recogió en diclorometano y se lavó con una solución 1 M de hidróxido sódico. La fase acuosa se extrajo de nuevo con diclorometano y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar n.° 64 (301 mg, cuantitativo) en forma de un aceite de color pardo, que comenzó a solidificarse lentamente tras un periodo de reposo. CL-EM: m/z 305,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,54 minutos; HPLC (Protocolo G): tiempo de retención = 4,848 minutos; RMN 1H (400 MHz, CDCh), señales características: 86,64-6,67 (m, 2H), 6,16-6,22 (m, 2H), 6,08-6,14 (m a, 1H), 5,16-5,22 (m, 2H), 3,44 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 6,3, 4,5 Hz, 1H), 2,98-3,04 (m, 1H), 2,94 (ddd, J =10,5, 7,2, 5,6 Hz, 1H), 2,81 (ddd, J =10,5, 7,7, 6,7 Hz, 1H), 2,57 (cd, J = 7,1,4,5 Hz, 1H), 1,90-1,97 (m, 2H), 1,49-1,55 (m, 1H), 1,18 (d, J = 7,1 Hz, 3H).
Etapa 5. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 65). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 32 (678 mg, 0,937 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (9,37 ml, 0,1 M), la amina n.° 64 (300 mg, 0 , 9 8 5 mmol, 1,1 equiv.), HATU (427 mg, 1,12 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (494 pl, 2,81 mmol, 3 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano), produciendo n.° 65 (546 mg, 65 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 896,7 [M+H+], 918,7 [M+Na+], tiempo de retención = 1,06 minutos.
Etapa 6. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 66). A una solución de n.° 65 (540 mg, 0,603 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (10 ml, 0,06 M) se añadió trietilamina (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 2 horas. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 66 (347 mg, 85 % ) en forma de un sólido incoloro. HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 674,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,015 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 [8,03 (d a, J = 9 Hz) y 8,05 (d a, J = 9 Hz), total 1H], [7,77 (dd a, J = 5,5, 5,5 Hz) y 7,98 (dd a, J = 5,5, 5,5 Hz), total 1H], 6,54-6,65 (m, 2H), 6,10-6,19 (m, 2H), 5 ,11-5 ,19 (m, 2H), [4,48 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,54 (dd, J = 9, 7,5 Hz), total 1H], 3,94-4,04 (m a, 1H), 3,26 y 3,29 (2 s, total 3H), 3 ,17 y 3,19 (2 s, total 3H), 2,93 y 3,06 (2 s a, total 3H), 1,20 y 1,21 (2 s, total 3H), 1,12 y 1,13 (2 s, total 3H), [1,04 (d, J = 6,8 Hz) y 1,07 (d, J = 6,7 Hz), total 3H].
Preparación de 2-M etilalam l-A#-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-femletN]amm o}-1-m etoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidm-1-M}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valmamida (n.° 69) y 2-metilalam l-W -[(3R,4S,5S)-3-m etoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1 -m etoxi-3-{[(2S)-1-m etoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]ammo}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidm-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metM-L-valmamida (n.° 70)
Figure imgf000092_0001
Etapa 1. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal clorhidrato (n.° 67). De acuerdo con procedimiento general C, a partir de n.° 37 (2,39 g, 5,33 mmol, 1 equiv.), dioxano (10 ml, 0,53 M) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (10 ml, 40 mmol, 7,5 equiv.) se sintetizó n.° 67 (2,21 g) en forma de un sólido de color blanco, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. C L -e M: m/z 349,2 [M+H+], tiempo de retención = 0,53 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 9,45­ 9,58 (m a, 1H), 8,63 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,51-8,62 (m a, 1H), 7,25-7,33 (m, 4H), 7,18-7,25 (m, 1H), 4,50 (ddd, J =10,8, 8,1, 4,5 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,54 (dd, J = 6,8, 4,5 Hz, 1H), 3,20 (s, 3H), 3 ,11 (dd, J = 13,8, 4,5 Hz, 1H), 2,99-3,14 (m a, 3H), 2,89 (dd, J = 13,8, 10,9 Hz, 1H), 2,44-2,50 (m, 1H, supuesto; parcialmente oscurecido por pico de disolvente), 1,77-1,89 (m, 1H), 1,60-1,73 (m, 2H), 1,46-1,57 (m, 1H), 1,05 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
Etapa 2. Síntesis de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4s,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 68). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 32 (353 mg, 0,488 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (10 ml, 0,04 M), la amina n.° 67 (271 mg, <0,588 mmol, 1,3 equiv.), HATU (223 mg, 0,586 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (238 pl, 1,71 mmol, 3,5 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 40 % de acetona en heptano), proporcionando n.° 68 (404 mg, 88 % en dos etapas) en forma de un sólido. CL-EM : m/z 940,7 [M+H+], 962,7 [M+Na+], tiempo de retención = 1,04 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9,022 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 [8,25 (d a, J = 8 Hz) y 8,48 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,67-7,75 (m, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,31-7,36 (m, 2H), 7,14-7,24 (m, 5H), 4,43-4,69 (m, 3H), 4,17-4,26 (m, 3H), 3,91-3,99 (m a, 1H), 3,63 y 3,65 (2 s, total 3H), 3,19 y 3,24 (2 s, total 3H), 3,14 y 3,15 (2 s, total 3H), 2,90 y 2,99 (2 s a, total 3H), 1,36 y 1,37 (2 s a, total 3H), 1,30 y 1,32 (2 s, total 3H), [1,02 (d, J = 6,8 Hz) y 1,06 (d, J = 6,6 Hz), total 3H].
Etapa 3A. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 69). A una solución de n.° 68 (143 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (5 ml, 0,02 M) se añadió una solución de hidróxido de litio (9,10 mg, 0,378 mmol, 2,5 equiv.) en agua (3 ml). Después de 5 horas, la reacción se concentró al vacío, se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano, se disolvió en dimetilsulfóxido (2,2 ml) y se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar n.° 69 (56 mg, 52 % ) . HPLC (Protocolo A 45 °C): 704,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,623 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 58,08-8,22 y 8,37-8,49 (2 m, total 5H), 7,12-7,28 (m, 5H), 3,18, 3,20 y 3,24 (3 s, total 6H), 2,95 y 3,04 (2 s a, total 3H), 1,52 y 1,53 (2 s, total 3H), 1,39 y 1,41 (2 s, total 3H), [1,02 (d, J = 6,8 Hz) y 1,05 (d, J = 6,6 Hz), total 3H], 0,74-0,81 (m, 3H).
Etapa 3B. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2s)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 70). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 68 (240 mg, 0,255 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,026 M) y dietilamina (10 ml) se sintetizó n.° 70 (120 mg, 65 % ) en forma de una mezcla de sólido/cristal de color blanco después de cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano). HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 762,7 [M+H+], 740,4 [M+Na+], tiempo de retención = 6,903 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 5 [8,26 (d, J = 8,1 Hz) y 8,49 (d, J = 8,3 Hz), total 1H], [8,03 (d, J = 9,5 Hz) y 8,07 (d, J = 9,5 Hz), total 1H], 7,14­ 7,27 (m, 5H), 3,63 y 3,67 (2 s, total 3H), 3,16, 3,18, 3,20 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,92 y 3,01 (2 s a, total 3H), 1,20 y 1,22 (2 s, total 3H), 1,12 y 1,13 (2 s, total 3H), [1,02 (d, J = 6,8 Hz) y 1,06 (d, J = 6,7 Hz), total 3H], 0,74-0,80 (m, 3H).
Preparación de W2-[(3-Aminooxetan-3-il)carbonil]-W-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-femletN)ammo]propM}pirroMdm-1-M]-5-metiM-oxoheptan-4-M}-W-metN-L-valmamida, sal de ácido acético (n.° 75)
Figure imgf000093_0001
Etapa 1. Síntesis de ácido 3-[(terc-butoxicarbonil)amino]oxetano-3-carboxílico (n.° 71). A ácido 1-aminooxetano-3-carboxílico (1,00 g, 8,54 mmol, 1 equiv.) en dioxano (15 ml, 0,5 M) se añadió una solución de hidróxido sódico (1,55 g, 38,7 mmol, 4,5 equiv.) en agua (15 ml) seguido de dicarbonato de di-terc-butilo (2,09 g, 9,29 mmol, 1,1 equiv.) Se formó un sólido de color blanco. La reacción se agitó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para dar n.° 71 (633 mg, 38 % ) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), se presume que es una mezcla de rotámeros: 5 12,93 (s a, 1H), 7,59 y 7,93 (2 s a, total 1H), 4,71-4,78 (m, 2H), 4,47 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 1,30 y 1,38 (2 s, total 9H).
Etapa 2. Síntesis de A/2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (n.° 72). A n.°@5 (9,47 g, 18,0 mmol, 1 equiv.) y n.° 24 (5,90 g, 18,0 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (250 ml, 0,072 M) se añadieron diisopropiletilamina (9,52 ml, 54,2 mmol, 3 equiv.) y HATU (8,49 g, 21,7 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se agitó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (300 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 100 ml) y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recogió en diclorometano (250 ml) y se filtró.
El filtrado se concentró al vacío sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano) para proporcionar n.° 72 (11,61 g, 81 % ) en forma de un sólido de color amarillo claro. CL-EM: m/z 797,6 [M+H+], 819,6 [M+Na+], tiempo de retención = 1,06 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 83,26 y 3,28 (2 s, total 3H), 3,18 y 3,20 (2 s, total 3H), 2,95 y 3,10 (2 s a, total 3H), 1,01-1,09 (m, 3H), 0,67-0,78 (m, 3H).
Etapa 3. Síntesis de N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2s)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (n.° 73). A n.° 72 (5,16 g, 6,47 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (10 ml, 0,65 M) se añadió dietilamina (10 ml). Después de 2 horas, la reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 73 (2414 mg, 65 % ). CL-EM: m/z 576,5 [M+H+], tiempo de retención = 0,64 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,80-7,88 y 7,99-8,10 (2 m, total 1H), 7,14-7,31 (m, 5H), 3 ,17 y 3,18 (2 s, total 3H), 2,87 y 3,03 (2 s a, total 3H), 1,02-1,08 (m, 3H).
Etapa 4. Síntesis de N2-({3-[(terc-butoxicarbonil)amino]oxetan-3-il}carbonil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil} pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (n.° 74). A n.° 73 (100 mg, 0,174 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (4 ml, 0,04) y N,N-dimetilformamida (0,5 ml) se añadió n.° 71 (45,2 mg, 0,208 mmol, 1,2 equiv.), seguido de diisopropiletilamina (92 |jl, 0,521 mmol, 3 equiv.) y HATU (102 mg, 0,260 mmol, 1,5 equiv.). Después de 16 horas, la reacción se concentró al vacío y el residuo se recogió en acetato de etilo (6 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 2 ml) y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El material en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar n.° 74 (140 mg), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL-EM: m/z 774,7 [M+H+], 796,6 [M+Na+], tiempo de retención = 0,91 minutos.
Etapa 5. Síntesis de N2-[(3-aminooxetan-3-il)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético A n.° 74 (140 mg, <0,181 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (3 ml, 0,06 M) se añadió ácido trifluoroacético (1 ml). Después de 1 hora, la reacción se concentró al vacío y el residuo se recogió en acetato de etilo (6 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (2 ml) y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. La mitad del material en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento B) para dar n.° 75 (16 mg, 26 % , en dos etapas). CL-EM: m/z 674,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,68 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 674,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,128 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,80-7,87 y 8,02-8,07 (2 m, total 2H), 7,23-7,30 (m, 2H), 7,14-7,22 (m, 3H), 4,28-4,33 (m, 2H), 3,96-4,04 (m a, 1H), 3 ,17 y 3,19 (2 s, total 3H), 2,96 y 3,10 (2 s a, total 3H), [1,04 (d, J = 7,0 Hz) y 1,07 (d, J = 6,6 Hz), total 3H].
Preparación de N,2-D¡met¡lalaml-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-femlpropan-2-¡l]ammo}-2-met¡l-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡dm-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-valmam¡da (n.° 79) y N,2-d¡met¡lalaml-N-[(3R,4S,5S)-1-{2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-femlet¡l]ammo}-1-metox¡-2-met¡l-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 80)
Figure imgf000094_0001
Etapa 1. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi) carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanotioil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 76). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° @5 (260 mg, 0,648 mmol, 1 equiv.), n.° 39 (340 mg, <0,629 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,065 M), HATU (296 mg, 0,778 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (339 pl, 1,94 mmol, 3 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 40 % de acetona en heptano) para dar n.° 76 (466 mg, 8 3 % en dos etapas) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 871,5 [M+H+], 893,5 [M+Na+], tiempo de retención = 1.10 minutos; h P l C (Protocolo C): tiempo de retención = 9,249 minutos (pureza > 99 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,19 (d a, J = 7,4 Hz) y 10,49 (d a, J = 7,8 Hz), total 1H], 7,89 (d a, J = 7,4 Hz, 2H), 7,68-7,75 (m, 2H), 7,54-7,60 (m, 1H), 7,41 (dd a, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,15-7,28 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 10,9, 7,3, 4,4 Hz) y 5,34-5,43 (m), total 1H], 3,65 y 3,69 (2 s, total 3H), 3,24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3 ,17 (s a, 3H), 2,93 y 2,98 (2 s a, total 3H), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) y 1,18 (d, J = 6,6 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanotioil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 77). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 76 (460 mg, 0,528 mmol, 1 equiv.) tetrahidrofurano (8 ml, 0,07 M) y dietilamina (8 ml) se sintetizó n.° 77 (399 mg), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional; CL-EM m/z 649,5 [m +H+], tiempo de retención = 0,73 minutos; RMN 1H (400 m Hz , DMsO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales de producto características: 8 [10,20 (d, J = 7,4 Hz) y 10,49 (d, J = 7,4 Hz), total 1H], 7,15-7,28 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 10,9, 7,2, 4,5 Hz) y 5,34-5,42 (m), total 1H], 3,65 y 3,68 (2 s, total 3H), 3.24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,15 y 3,15 (2 s, total 3H), 2,83 y 2,88 (2 s a, total 3H), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) y 1,18 (d, J = 6,6 Hz), total 3H].
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 78). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 77 (399 mg, <0,52 mmol, 1 equiv.), N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanina (213 mg, 0,628 mmol, 1,2 equiv.), diclorometano (5 ml, 0,1 M), HATU (239 mg, 0,628 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (282 pl, 1,62 mmol, 3,1 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano), proporcionando n.° 78 (231 mg, 46 % en dos etapas). CL-EM: m/z 970,7 [M+H+], 992,6 [M+Na+], tiempo de retención = 1,11 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9,260 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,19 (d, J = 7,4 Hz) y 10,47 (d, J = 7,8 Hz), total 1H], 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,61-7,67 (m, 2H), 7,41 (dd a, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,14-7,36 (m, 8H), [5,20 (ddd, J = 11,7 , 5 Hz) y 5,38 (ddd, J = 11,8, 4 Hz), total 1H], [4,41 (dd, J = 8,6, 8,4 Hz) y 4,46 (dd, J = 8,2, 8,2 Hz), total 1H], 3,65 y 3,68 (2 s, total 3H), 3,23 y 3,24 (2 s, total 3H), 3,13 (s a, 3H), 2,88 y 2,93 (2 s a, total 3H), 2,84 y 2,85 (2 s, total 3H), 1,31 y 1,32 (2 s, total 3H), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) y 1,18 (d, J = 6,4 Hz), total 3H].
Etapa 4A. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 79). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 78 (223 mg, 0,230 mmol, 1 equiv.), diclorometano (6 ml, 0,04 M) y dietilamina (6 ml) se sintetizó n.° 79 (146 mg, 85 % ) en forma de un sólido de color blanco después de cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 5 % de metanol en heptano después de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano). HPLC (Protocolo A 45 °C): 749,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,315 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,20 (d, J = 7,6 Hz) y 10,50 (d, J = 8,0 Hz), total 1H], 7,79-7,88 (m, 1H), 7,15-7,29 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11, 7, 4 Hz) y 5,38 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz), total 1H], [4,50 (dd, J = 8,8, 8,6 Hz) y 4,56 (dd, J = 9, 8 Hz), total 1H], 3,65 y 3,69 (2 s, total 3H), 3,24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,16 (s a, 3H), 2,93 y 2,97 (2 s a, total 3H), 2.10 y 2 ,11 (2 s, total 3H).
Etapa 4B. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 80). A una solución de n.° 78 (170 mg, 0,175 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (3 ml, 0,04 M) se añadió una solución de hidróxido de litio (12,6 mg, 0,525 mmol, 3 equiv.) en agua (1,5 ml). Después de agitar durante una noche, el disolvente se retiró al vacío. El residuo se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano. Después, el residuo se diluyó con dimetilsulfóxido (2,2 ml) y se purificó cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para proporcionar n.° 80 (74 mg, 58 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 734,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,69 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): 734,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,903 minutos (pureza > 96 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 812,9 y 13,1 (2 x s a, total 1H), [10,12 (d, J = 7,4 Hz) y 10,46 (d, J = 7,8 Hz), total 1H], 8,77-8,89 (m a, 2H), [8,47 (d, J = 8,6 Hz) y 8,51 (d, J = 8,6 Hz), total 1H], 7,21-7,29 (m, 4H), 7,14-7,21 (m, 1H), [5,16-5,23 (m) y 5,38 (ddd, J = 11,3 , 8,2, 3,9 Hz), total 1H], [4,51 (dd, J = 9,0, 9,0 Hz) y 4,57 (dd, J = 9,4, 8,6 Hz), total 1H], 3.24 y 3,24 (2 s, total 3H), 3,18 y 3,19 (2 s, total 3H), 2,96 y 3,00 (2 s a, total 3H), 1,51 y 1,53 (2 s, total 3H), 1,40 y 1,42 (2 s, total 3H), 1,14 -1,19 (m, 3H), 0,74-0,81 (m, 3H).
Preparación de N,2-D¡metMalaml-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-£(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-£[(1S)-2-femM-(1,3-t¡azol-2-M)etM]ammo}-3-t¡oxopropM]p¡rrol¡dm-1-M}-5-met¡M-oxoheptan-4-M]-W-met¡l-L-valmam¡da (n.° 84)
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Etapa 1. Síntesis de W2-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carboml]-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metM-1 -oxoheptan-4-il]-^-metil-L-valinamida (n.° 81). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° @5 (620 mg, 1,18 mmol, 1 equiv.) diclorometano (10 ml, 0,1 M), amina n.° 18 (604 mg, 1,42 mmol, 1,2 equiv.), diisopropiletilamina (618 pl, 3,54 mmol, 3 equiv.) y HATU (539 mg, 1,42 mmol, 1,2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano) para dar n.° 81 (737 mg, 58 % ). HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9,235 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMsO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,81 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,89 (d, J = 7,6 Hz, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) y 7,83 (d, J = 3,1 Hz), total 1H], 7,70-7,75 (m, 2H), [7,64 (d, J = 3,1 Hz) y 7,68 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,55-7,60 (m, 1H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,13-7,35 (m, 7H), [6,31 (ddd, J = 11,8, 4,5 Hz) y 6,40-6,48 (m), total 1H], 3,23 y 3,24 (2 s, total 3H), 3 ,17 y 3,22 (2 s, total 3H), 2,94 y 3,01 (2 s a, total 3H), [1,14 (d, J = 6,4 Hz) y 1,17 (d, J = 6,2 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 82). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 81 (733 mg, 0,818 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (7 ml, 0,1 M) y dietilamina (7 ml) se sintetizó n.° 82 (670 mg), que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL-EM: m/z 674,5 [m +H+], tiempo de retención = 1,29 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales de producto características: 8 [10,55 (d a, J = 8 Hz) y 10,84 (d a, J = 8 Hz), total 1H], [7,64 (d, J = 3,1 Hz) y 7,69 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,13-7,33 (m, 5H), 6,27-6,35 y 6,38-6,47 (2 m, total 1H), 3,23 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,15 y 3,19 (2 s, total 3H), 2,84 y 2,91 (2 s a, total 3H).
Etapa 3. Síntesis de N -^H -fluoren^-ilm etoxO carbom ^-N ^-dim etN alanN -N -^R ^S^S^-m etoxM -^S)^-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-{[(1s)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azoí-2-¡l)et¡l] am¡no}-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-i^-N-metil-L-valinamida (n.° 83). De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 82 (670 mg, < 0,818 mmol, 1 equiv.), diclorometano (5 ml, 0,16 M), N-^H-fluoren^-NmetoxOcarbonil^N^-dimetNalanina (304 mg, 0,896 mmol, 1,1 equiv.), HATU (372 mg, 0,978 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (440 pl, 2,53 mmol, 3,1 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 30 % de acetona en heptano) para dar n.° 83 (556 mg, 69 % en dos etapas). CL-EM: m/z 994,7 [M+H+], tiempo de retención = 0,69 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9,333 minutos (pureza > 98 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,53 (d a, J = 8 Hz) y 10,80 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,86-7,91 (m, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) y 7,82 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], [7,64 (d, J = 3,2 Hz) y 7,68 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,62-7,66 (m, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 5H), 7,19-7,26 (m, 2H), 7 ,12 -7 ,17 (m, 1H), [6,31 (ddd, J = 11,8, 4,5 Hz) y 6,44 (ddd, J = 11,8,5, 4,5 Hz), total 1H], [4,42 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,48 (dd, J = 8, 8 Hz), total 1H], 3,22 y 3,24 (2 s, total 3H), 3,13 y 3,17 (2 s, total 3H), 2,89 y 2,97 (2 s a, total 3H), 2,84 y 2,85 (2 s, total 3H), [1,13 (d, J = 6,4 Hz) y 1,16 (d, J = 6,4 Hz), total 3H].
Etapa 4. Síntesis de N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}-3-t¡oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 84). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 83 (552 mg, 0,555 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (10 ml, 0,05 M) y dietilamina (10 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se diluyó con metanol, se concentró al vacío sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 84 (406 mg, 95 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 772,8 [M+H+], tiempo de retención = 1,35 minutos; HPLC (Protocolo A): 774,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,390 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [10,54 (d a, J = 8 Hz) y 10,81 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 7,78-7,84 (m, 2H), [7,65 (d, J = 3,1 Hz) y 7,69 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,29-7,34 (m, 2H), 7,20-7,28 (m, 2H), 7,14 -7,19 (m, 1H), 6,27-6,35 y 6,40-6,48 (2 m, total 1H), [4,51 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,57 (dd, J = 9, 8 Hz), total 1H], 3,24 y 3,25 (2 s, total 3H), 3,16 y 3,21 (2 s, total 3H), 2,94 y 3,00 (2 s a, total 3H), 2,09 y 2,10 (2 s, total 3H), 1,08 y 1,09 (2 s, total 3H), 0,73-0,80 (m, 3H).
N,2-Dimetilalaml-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxM-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metN-3-oxo-3-{[(1S)-2-femM-(1,3-tiazol-il)etil]am ino}propil]pirrolidin-1-il}-5-m etil-1-oxoheptan-4-il] -W-metil-L-valinamida (n.° 88)
Figure imgf000097_0001
Etapa 1. Síntesis de N2-[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbon¡l]-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino} propil] pirrolidin-1 -¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-^-metil-L-valinamida (n.° 85). A una mezcla de n.° @5 (5,48 g, l0,4 mmol, 1 equ¡v.) y n.° 19 (3,90 g, 10,4 mmol, 1 equ¡v.) en diclorometano (50 ml, 0,2 M) se añadió diisopropiletilamina (5,51 ml, 31,3 mmol, 3 equiv.) seguido de HATU (4,91 g, 12,5 mmol, 1,2 equiv.). Después de agitar durante una noche, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (100 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 30 ml) y con salmuera (30 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recogió en diclorometano y se filtró; el filtrado se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente; de 0 % a 50 % de acetona en heptano) para proporcionar n.° 85 (7,20 g, 78 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 880,6 [M+H+], tiempo de retención = 1,07 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]pirrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 86). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 85 (5,00 g, 5,68 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (10 ml, 0,56 M) y dietilamina (3 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 86 (2,952 g, 79 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 658,5 [M+H+], 680,5 [M+Na+]; tiempo de retención = 0,66 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8,4 Hz) y 8,90 (d a, J = 8,8 Hz), total 1H], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,80 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) y 7,66 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7 ,12 -7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,2 , 8,4, 4,2 Hz) y 5,54 (ddd, J = 11,9, 8,9, 4,0 Hz), total 1H], 3,15, 3,19, 3,20 y 3,26 (4 s, total 6H), 2,86 y 2,98 (2 s a, total 3H), [1,06 (d, J = 6,6 Hz) y 1,11 (d, J = 6,6 Hz), total 3H]. Etapa 3. Síntesis de N-(terc-butox¡carbon¡l)-N,2-d¡metilalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)etil]am¡no} propil]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida una mezcla de n.° 86 (80,3 mg, 0,122 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (4 ml, 0,03 M) se añadió N-(terc-butoxicarbon¡l)-N,2-d¡met¡lalan¡na (29,1 mg, 0,134 mmol, 1,1 equiv.) seguido de diisopropiletilamina (64 pl, 0,365 mmol, 3 equiv.) y HATU (71,7 mg, 0,183 mmol, 1,5 equiv.). Después de agitar durante una noche, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (6 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 2 ml) y con salmuera. El disolvente orgánico se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recogió en diclorometano y se filtró; el filtrado se concentró al vacío sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano) para proporcionar n.° 87 (58 mg, 50 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 857,7 [M+H+], 879,7 [M+Na+], tiempo de retención = 0,99 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8 Hz) y 8,87 (d a, J = 9 Hz), total 1H], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,80 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,2 Hz) y 7,66 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,13-7,31 (m, 5H), [6,95 (d a, J = 8 Hz) y 7,06 (d a, J = 8 Hz), total 1H], 5,35-5,42 y 5,51-5,58 (2 m, total 1H), 3,15, 3,19, 3,20 y 3,26 (4 s, total 6H), 2,94 y 3,03 (2 s a, total 3H), 2,83 y 2,84 (2 s, total 3H), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) y 1,11 (d, J = 6,7 Hz), total 3H].
Etapa 4. Síntesis de N,2-dimet¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)et¡l]am¡no}prop¡l]pirrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 88). A una mezcla de n.° 87 (58 mg, 0,068 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (8 ml) se añadió ácido trifluoroacético (2 ml). Después de agitar durante una noche, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (10 ml), se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para dar n.° 88 (52 mg, cuantitativo). CL-EM 757,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,69 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8,6 Hz) y 8,87 (d a, J = 8,6 Hz), total 1H], 7,80-7,85 (m, 1H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,80 (d, J = 3,1 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,1 Hz) y 7,66 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,20-7,31 (m, 4H), 7,13-7,19 (m, 1H), [5,39 (ddd, J = 11,8,5, 4 Hz) y 5,49-5,56 (m), total 1H], [4,51 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,61 (dd, J = 9, 8 Hz), total 1H], 3,16, 3,20, 3,21 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,94 y 3,03 (2 s a, total 3H), 2,10 y 2,10 (2 s, total 3H), 1,16 (s a, 3H), 1,04 -1,12 (m, 6H), 0,72-0,80 (m, 3H).
Preparación de W2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-feml-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]ammo}propil]pirrolidm-1-il}-5-metiM-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 95)
Figure imgf000098_0001
Etapa 1. Síntesis de ácido 3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoico (n.° 93). A ácido 3-amino-2,2-dimetilpropanoico, sal clorhidrato (250 mg, 1,63 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (4 ml, 0,4 M) se añadió diisopropiletilamina (859 pl, 4,88 mmol, 3 equiv.), seguido de cloruro de (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo (473 mg, 1,79 mmol, 1,1 equiv.) La reacción se agitó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (3 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 1 ml) y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 100 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 93 (250 mg, 45 % ) en forma de un aceite. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 812,22 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,72 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,38­ 7,44 (m, 2H), 7,27-7,35 (m, 3H), 4,18-4,30 (m, 3H), 3,16 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 1,05 (s, 6H).
Etapa 2. Síntesis de W2-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-met¡l-L-valinam¡da (n.° 94). A n.° 86 (100 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (4 ml, 0,038 M) y W,Ñ-dimetilformamida (0,5 ml) se añadió n.° 93 (51,6 mg, 0,152 mmol, 1 equiv.) seguido de diisopropiletilamina (80,0 pl, 0,457 mmol, 3 equiv.) y HATU (89,8 mg, 0,229 mmol, 1,5 equiv.). La reacción se agitó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (6 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 2 ml) y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recogió en diclorometano (250 ml) y se filtró; el filtrado se concentró al vacío sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano) para proporcionar n.° 94 (90 mg, 60 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 979,8 [M+H+], 1002,7 [M+Na+], tiempo de retención = 1,15 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales de producto características: 8 [8,64 (d a, J = 8,6 Hz) y 8,86 (d a, J = 8,6 Hz), total 1H], 7,86-7,91 (m, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,79 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7,67-7,73 (m, 2H), [7,63 (d, J = 3,3 Hz) y 7,65 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 6,87-6,95 (m, 1H), [5,39 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz) y 5,52 (ddd, J = 11,5 , 9, 4 Hz), total 1H], [4,44 (dd, J = 8,4, 8,4 Hz) y 4,55 (dd, J = 8,4, 8,4 Hz), total 1H], 3,16, 3,20, 3,21 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,96 y 3,06 (2 s a, total 3H), 0,69-0,77 (m, 3H).
Etapa 3. Síntesis de W2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 95). A n.° 94 (86 mg, 0,088 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (2 ml, 0,04 M) se añadió dietilamina (10 ml). Después de agitar durante una noche, la reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar n.° 5 (55 mg, 72 % ). CL-EM: m/z 757,5 [M+H+], tiempo de retención = 0,74 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,66 (d a, J = 8 Hz) y 8,92 (d a, J = 9 Hz), total 1H], [7,91 (d a, J = 8 Hz) y 7,97 (d a, J = 9 Hz), total 1H], [7,78 (d, J = 3,3 Hz) y 7,81 (d, J = 3,1 Hz), total 1H], 7,65-7,74 (m a, 3H), [7,63 (d, J = 3,3 Hz) y 7,67 (d, J = 3,3 Hz), total 1H], 7 ,12 -7 ,31 (m, 5H), [5,35-5,42 (m) y 5,45-5,52 (m), total 1H], [4,44 (dd, J = 9, 9 Hz) y 4,55 (dd, J = 9, 9 Hz), total 1H], 3,17, 3,20, 3,22 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,96 y 3,05 (2 s a, total 3H), 1,25 y 1,25 (2 s, total 3H), 1,14 y 1,15 (2 s, total 3H), [1,06 (d, J = 6,6 Hz) y 1,10 (d, J = 6,4 Hz), total 3H], 0,72-0,80 (m, 3H).
Preparación de W2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-W-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-femletil)ammo]propil}pirrolidm-1-il]-5-metiM-oxoheptan-4-il}-W-metil-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 97)
Figure imgf000099_0001
Etapa 1. Síntesis de W2-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-W-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-[(2-fen¡let¡l)am¡no]propil}p¡rrol¡d¡n-1-¡l]-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l}-N-metil-L-valinamida (n.° 96). A n.° 73 (100 mg, 0,174 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (4 ml, 0,04 M) y N,N-d¡met¡lformam¡da (0,5 ml) se añadió n.° 93 (59,1 mg, 0,174 mmol, 1 equiv.), seguido de diisopropiletilamina (92 pl, 0,52 mmol, 3 equiv.) y HATU (102 mg, 0,260 mmol, 1,5 equiv.). La reacción se agitó durante 18 horas y después se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo (6 ml) y se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico (2 x 2 ml) y con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano) proporcionó n.° 96 (102 mg, 65 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 896,7 [M+H+], 918,8 [M+Na+], tiempo de retención = 1,14 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d^), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales de producto características: 67,88 (d, J = 7,4 Hz, 2H), [7,83 (dd a, J = 6, 5 Hz) y 8,03 (dd a, J = 6, 5 Hz), total 1H], 7,67-7,73 (m, 2H), 7,36-7,48 (m, 3H), 7,22-7,35 (m, 4H), 7,13-7,21 (m, 3H), 6,86-6,96 (m, 1H), [4,44 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz) y 4,50 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz), total 1H], 3,18, 3,19, 3,26 y 3,29 (4 s, total 6H), 2,96 y 3 ,11 (2 s a, total 3H), 0,70-0,77 (m, 3H).
Etapa 2. Síntesis de N2-(3-amino-2,2-d¡met¡lpropano¡l)-N-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-[(2-fen¡let¡l)am¡no]prop¡l}p¡rrol¡d¡n-1-¡l]-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ácido trifluoroacético A n.° 96 (98 mg, 0,11 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (2 ml, 0,04 M) se añadió dietilamina (0,5 ml). Después de agitar durante una noche, la reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar n.° 97 (58 mg, 68 % ). CL-EM: m/z 674,4 [m +H+], 696,4 [M+Na+], tiempo de retención = 0,74 minutos; HPLC (Protocolo A): 674,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,072 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 6 [7,92 (d a, J = 8 Hz) y 7,97 (d a, J = 8 Hz), total 1H], [7,86 (dd a, J = 6, 5 Hz) y 8,07 (dd a, J = 6, 5 Hz), total 1H], 7,64-7,74 (m a, 3H), 7,15-7,29 (m, 5H), [4,44 (dd, J = 9, 9 Hz) y 4,50 (dd, J = 9, 9 Hz), total 1H], 3,26 y 3,29 (2 s, total 3H), 3,18 y 3,20 (2 s, total 3H), 2,96 y 3,10 (2 s a, total 3H), 1,24 y 1,25 (2 s, total 3H), 1,14 y 1,16 (2 s, total 3H), 1,02-1,07 (m, 3H), 0,73-0,80 (m, 3H).
Preparación de 2-m et¡l-L-proM l-W -[(3R,4S,5S)-3-m etoxM -{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etox¡-2-m et¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-femM-(1,3-t¡azol-2-M)etM]ammo}propM]p¡rrol¡dm-1-¡l}-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-valmam¡da, sal de ácido tr¡fluoroacét¡co (n.° 98)
Figure imgf000099_0002
A una mezcla de 1-(terc-butoxicarbon¡l)-2-met¡l-L-prolina (65,1 mg, 0,284 mmol, 1,1 equiv.) y n.° 86 (170 mg, 0,258 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (5 ml, 0,03 M) se añadió HATU (0,108 mg, 0,284 mmol, 1,1 equiv.), seguido de diisopropiletilamina (139 pl, 0,800 mmol, 3,1 equiv.). Después de agitar durante una noche, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C, se añadió diclorometano (3 ml), seguido de la adición lenta de ácido trifluoroacético (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 5 minutos, se dejó calentar a temperatura ambiente y después se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de concentrarse al vacío. El residuo se destiló azeotrópicamente dos veces con heptano, se diluyó con una pequeña cantidad de diclorometano y metanol antes de concentrarse al vacío sobre sílice. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) y después por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para proporcionar n.° 98 (128 mg, 56 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 769,4 [M+H+], tiempo de retención = 1,28 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C) m/z 769,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,146 minutos (pureza > 98 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 69,03-9,15 (m a, 1H), 8,77-8,86 (m a, 1H), 8,69-8,76 (m, 1H), [8,66 (d, J = 8,2 Hz) y 8,92 (d, J = 8,6 Hz), total 1H], [7,78 (d, J = 3,1 Hz) y 7,80 (d, J = 3,5 Hz), total 1H], [7,63 (d, J = 3,1 Hz) y 7,67 (d, J = 3,1 Hz), total 1H], 7 ,12-7,31 (m, 5H), [5,38 (ddd, J = 11,8, 4 Hz) y 5,47 (ddd, J = 11,9, 4 Hz), total 1H], [4,46 (dd, J = 9,4, 9,0 Hz) y 4,55 (dd, J = 9,0, 8,6 Hz), total 1H], 3,17, 3,20, 3,22 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,98 y 3,04 (2 s a, total 3H), [1,06 (d, J = 7,0 Hz) y 1,09 (d, J = 6,6 Hz), total 3H], 0,73-0,80 (m, 3H).
Preparación de amino(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)acetato de metilo, sal clorhidrato (n.° 102)
Figure imgf000100_0001
Etapa 1. Síntesis de (acetilamino)(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)cianoacetato de etilo (n.° 99). Se dejó que sodio (464 mg, 20,2 mmol, 1,2 equiv.) reaccionara con etanol absoluto (40 ml, 0,42 M); a la mezcla resultante se le añadió 2-(acetilamino)-2-cianoacetato de etilo (3,44 g, 20,2 mmol, 1,2 equiv.). Después de 20 minutos a 60 °C, se añadió 7-bromobiciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trieno (3,092 g, 16,89 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una noche, después se filtró y se concentró al vacío. El residuo se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para dar un aceite oscuro, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 99 (4,38 g) en forma de una goma de color amarillo. C L-EM: m/z 273,2 [M+H+], tiempo de retención = 2,36 minutos.
Etapa 2. Síntesis de ácido (acetilamino)(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)acético (n.° 100). A una mezcla de n.° 99 (4,38 mg, <16,1 mmol, 1 equiv.) en metanol (30 ml, 0,53 M) se añadió una solución acuosa 1 N de hidróxido sódico (38 ml, 38 mmol, 2,4 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una noche, después se concentró al vacío, se diluyó con agua (40 ml) y se acidificó con una solución acuosa 1 N de ácido clorhídrico (40 ml). La fase acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 30 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío. El aceite resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Disolvente A: diclorometano; Disolvente B: metanol al 20 % en diclorometano que contenía ácido trifluoroacético al 0,02 % ; Gradiente: de 0 % a 40 % de B) después por cromatografía de fluidos supercríticos (Columna: Chiralpak AD-H, 250 x 21 mm; Eluyente: 85:15 de dióxido de carbono/metanol; Caudal: 65 g/min; Detección: 210 nm; Instrumento: sistema de S F C preparativa Berger minigram). El segundo pico de elusión se aisló para dar n.° 100 (600 mg, 17 % en dos etapas) en forma de un enantiómero individual (tiempo de retención = 3,37 minutos, pureza > 99 % ). CL-EM: m/z 220,3 [M+H+], tiempo de retención = 2,10 minutos; RMN 1H (400 MHz, CD 3OD) 67,14-7,24 (m, 2H), 7,03-7,09 (m, 2H), 4,59 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,87 (ddd, J =8,5, 5,3, 2,4 Hz, 1H), 3,35 (dd, J = 14,5, 5,4 Hz, 1H, supuesto; parcialmente oscurecido por pico de disolvente), 3,10 (dd, J = 14,4, 2,4 Hz, 1H), 2,00 (s, 3H). Rotación óptica: [a,]o25 70,9°(c 0,67, metanol)
Etapa 3. Síntesis de ácido amino(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)acético, sal clorhidrato (n.° 101). Una mezcla de n.° 100 (200 mg, 0,912 mmol, 1 equiv.) y ácido clorhídrico acuoso 6 N (12,3 ml, 73,8 mmol, 81 equiv.) se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío para dar el enantiómero individual n.° 101 (195 mg) en forma de un sólido de color blanquecino, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 4. Síntesis de amino(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)acetato de metilo, sal clorhidrato (n.° 102). A una mezcla de n.° 101 (195 mg, <0,913 mmol, 1 equiv.) en metanol (20 ml, 0,04 M) se añadió cloruro de tionilo (0,666 ml, 9,13 mmol, 10 equiv.). Después de dos horas a reflujo, la mezcla de reacción se concentró al vacío para dar el enantiómero individual n.° 102 (175 mg, 84 % en dos etapas) en forma de un sólido de color claro. CL-EM: m/z 192,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,80 minutos; CG-EM : m/z 192 [M+H+], tiempo de retención = 3,206 minutos; RMN 1H (400 MHz, CD 3OD) 67,24-7,33 (m, 2H), 7 ,11 -7 ,18 (m, 2H), 4,40 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 3,99-4,05 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,46 (dd, J = 14,8, 5,4 Hz, 1H), 3,23 (dd, J = 14,8, 2,5 Hz, 1H).
Preparación de ácido (2R,3R)-3-metoxi-2-metN-3-[(2S)-pirroNdm-2-N]propanoico, sal clorhidrato (n.° 103)
Figure imgf000101_0001
A una mezcla de n.° 11 (4,09 g, 14,2 mmol, 1 equiv.) en ciclopentil metil éter (10 ml, 0,14 M) se añadió una solución 4 N de cloruro de hidrógeno en dioxano (37 ml, 100 mmol, 7 equiv.). Después de tres horas, la mezcla de reacción se concentró al vacío y se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano para dar n.° 103 (1000 mg, 31 % ) en forma de una goma, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,92-10,06 (s a, 1H), 8,66-8,80 (s a, 1H), 3,89 (dd, J = 5,2, 4,9 Hz, 1H), 3,43-3,53 (m, 1H), 3,39 (s, 3H), 3,06-3,17 (m, 2H), 2,66 (cd, J = 7,1,4,6 Hz, 1H), 1,71-2,03 (m, 4H), 1,11 (d, J = 7,1 Hz, 3H).
Preparación de 2-M etilalam l-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-tN en-7-il)-2-m etoxi-2-oxoetil] am mo}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-W -m etil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 107) y 2-m etilalam l-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[biciclo [4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il(carboxi)m etil]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 108)
Figure imgf000101_0002
Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-1-oxo-1-(pentafluorofenoxi)heptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡namida (n.° 104). A n.° 32 (4,00 g, 6,56 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (20 ml, 0,33 M) y piridina (1,06 ml, 13,1 mmol, 2 equiv.) se añadió gota a gota trifluoro-acetato de pentafluorofenilo (2,25 ml, 13,1 mmol, 2 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante una hora.
En un segundo matraz que contenía n.° 32 (360 mg, 0,59 mmol) en diclorometano (0,6 ml, 1 M) y piridina (0,095 ml, 1,2 mmol, 2 equiv.) se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (0,203 ml, 1,18 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos.
Las dos mezclas de reacción se combinaron, se lavaron dos veces con ácido clorhídrico acuoso 1 N, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron al vacío. El aceite de color amarillo resultante se disolvió en acetato de etilo, se preadsorbió sobre gel de sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 40 % de acetato de etilo en heptano) para dar n.° 104 (4,6 g, 83 % ) en forma de una espuma de color blanco que contenía algunas impurezas. CL-EM: m/z 798,3 [M+Na+], tiempo de retención = 1,23 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 105). A una mezcla de n.° 104 (2,00 g, <2,58 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (6 ml, 0,4 M) se añadió una solución de n.° 103 (483 mg, 2,16 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (2 ml), seguido de diisopropiletilamina (1,35 ml, 7,73 mmol, 3 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas, después se adsorbió sobre sílice y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 20 % de metanol en diclorometano) para dar n.° 105 (1,67 g, 83 % ) en forma de una espuma de color blanco. Las fracciones que contenían el producto deseado con impurezas (0,571 g) se recogieron por separado.
La reacción y la purificación anteriores se repitieron de una manera similar usando n.° 104 (2,60 g, <3,35 mmol, 1 equiv.), n.° 103 (750 mg, 3,35 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml, 0,3 M) y diisopropiletilamina (1,35 ml, 7,73 mmol, 2,3 equiv.) para dar n.° 105 (2,4 g, 92 % ) en forma de una espuma de color castaño. Las fracciones que contenían producto impuro (1,7 g) con las fracciones impuras previas y se purificaron como se ha descrito anteriormente para proporcionar más cantidad de n.° 105 (1,30 g, rendimiento cuantitativo para ambas reacciones en dos etapas). CL-EM: m/z 779,3 [M+H+], 802,3 [M+Na+], tiempo de retención = 1,05 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 106). A una mezcla de n.° 105 (225 mg, 0,289 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (15 ml, 0,02 M) y N,N-dimetilformamida (1 ml) se añadió HATU (136 mg, 0,347 mmol, 1,2 equiv.). Después de cinco minutos, se añadió una solución de la amina n.° 102 (72,4 mg, 0,318 mmol, 1 equiv.) y diisopropilamina (203 pl, 1,16 mmol, 3 equiv.) en diclorometano (5 ml). Después de 24 horas, la mezcla de reacción se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío sobre gel de sílice, y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 50 % de acetona en heptano) para dar el enantiómero individual n.° 106 (210 mg, 76 % ) en forma de un aceite transparente. CL-EM: m/z 953,1 [M+H+], tiempo de retención = 3,99 minutos; RMN 1H (400 MHz, CDCh), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,57-7,64 (m, 2H), 7,40 (dd, J = 7,5, 7,4 Hz, 2H), 7,28-7,34 (m, 2H), 4,82-4,88 (m, 1H), 3,95-4,01 (m, 1H), 3,76 y 3,82 (2 s, total 3H), 3,30, 3,31, 3,34 y 3,35 (4 s, total 6H), [1,20 (d, J = 7,0 Hz) y 1,20 (d, J = 7,0 Hz), total 3H].
Etapa 4A. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il)-2-meíox¡-2-oxoet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metoxi-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 107). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 106 (25 mg, 0,026 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (10 ml, 0,003 M) y dietilamina (4 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar el enantiómero individual n.° 107 (16 mg, 73 % ) en forma de un sólido. CL-EM: m/z 730,8 [M+H+], tiempo de retención = 2,13 minutos; HPLC (Protocolo N): tiempo de retención = 9,889 minutos.
Etapa 4B. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[biciclo[4,2,0]octa-1,3,5-trien-7-il(carboxi)metil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 108). El enantiómero individual n.° 108 (94,5 mg, 57 % ) se sintetizó a partir de n.° 106 (190 mg, 0,200 mmol) de acuerdo con un procedimiento similar al descrito para la síntesis de n.° 41 a partir de n.° 40. CL-EM: m/z 716,8 [M+H+], tiempo de retención = 2,06 minutos; HPLC (Protocolo N): tiempo de retención = 9,137 minutos.
Preparación de 2-m etilalam l-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxM -fem lpropan-2-N]am m o}-1-metoxi-2-metN-3-oxopropM]pirroNdm-1-M}-3-metoxi-5-metiM-oxoheptan-4-M]-W-metM-L-valmamida (n.° 112 )
Figure imgf000102_0001
Etapa 1. Síntesis de (2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 109). A una solución de n.° 11 (2,00 g, 6,96 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (21 ml, 0,3 M) y W,W-dimetilformamida (3 ml) se añadió HATU (3270 mg, 8,35 mmol, 1,2 equiv.). Después de dos minutos, se añadieron la amina (1R,2S)-(+)-norefedrina (1,07 mg, 6,96 mmol, 1 equiv.) y trietilamina (1,94 ml, 13,9 mmol, 2 equiv.). Después de dos horas, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (100 ml), se lavó con una solución acuosa 1 M de ácido clorhídrico y con salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró al vacío, y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 60 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 109 (2,18 g, 74 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 321,3 [(M - Boc)+H+], tiempo de retención = 3,14 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,64 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,24-7,33 (m, 4H), 7,15 -7,21 (m, 1H), 5,35 (d a, J = 5 Hz, 1H), 4,45 (dd a, J = 5, 5 Hz, 1H), 3,91-4,00 (m, 1H), 3,30-3,39 (m, 1H), 3,26 (s, 3H), 2,94-3,07 (m, 1H), 2,04-2,14 (m, 1H), 1,46-1,78 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 0,97-1,04 (m, 6H).
Etapa 2. Síntesis de (2R,3R)-A/-[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 110). De acuerdo con procedimiento general C, a 0 °C a partir de n.° 109 (414 mg, 0,984 mmol, 1 equiv.), dioxano (5 ml, 0,2 M) y una solución 4 M de cloruro de hidrógeno en dioxano (15 ml, 60 mmol, 60 equiv.) se sintetizó el compuesto en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento C) para dar n.° 110 (120 mg, 34 % ) en forma de un líquido viscoso. CL-EM: m/z 321,1 [M+H+], tiempo de retención = 0,55 minutos; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), señales características: 87,90 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,28-7,36 (m, 4H), 7,20-7,27 (m, 1H), 4,46 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 3,48 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,92-3,16 (m, 3H), 2,24-2,35 (m, 1H), 1,49-1,88 (m, 4H), 1,09 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,01 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 111) . De acuerdo con procedimiento general D, a partir de n.° 32 (140 mg, 0,230 mmol, 1 equiv.), n.° 110 (110 mg, 0,253 mmol, 1,1 equiv.), diclorometano (3 ml, 0,08 M), N,N-dimetilformamida (0,5 ml), Ha TU (96,2 mg, 0,253 mmol, 1,1 equiv.) y trietilamina (96 pl, 0,69 mmol, 3 equiv.) se sintetizó el producto en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 40 % de acetona en heptano) para dar n.° 111 (220 mg, 95 % ). CL-EM: m/z 912,4 [M+H+], 935,4 [M+Na+], tiempo de retención = 2,15 minutos; HPLC (Protocolo B): m/z 912,5 [M+H+], 934,5 [M+Na+], tiempo de retención = 10,138 minutos (pureza > 94 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,89 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,66-7,75 (m, 2H), 7,41 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,12-7,20 (m, 1H), [5,33 (d, J = 4,7 Hz) y 5,38 (d, J = 4,7 Hz), total 1H], 3,15, 3,18, 3,22 y 3,23 (4 s, total 6H), 1,30, 1,33, 1,36 y 1,39 (4 s, total 6H), 0,95-1,06 (m, 6H).
Etapa 4. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 112). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 111 (210 mg, 0,230 mmol) en diclorometano (5 ml, 0,05 M) y dietilamina (5 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 10 % de metanol en diclorometano) para dar una mezcla de un aceite y un sólido. Se añadieron éter dietílico y heptano y la mezcla se concentró al vacío, produciendo n.° 112 (81 mg, 51 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM: m/z 690,4 [M+H+], tiempo de retención = 1,10 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 690,5 [M+H+], 712,4 [M+Na+], tiempo de retención = 7,229 minutos (pureza > 90 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), presuntamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [7,62 (d a, J = 8 Hz), 7,88 (d a, J = 8 Hz), 8,07 (d a, J = 9 Hz) y 8,11 (d a, J = 9 Hz), total 2H], 7,15-7,34 (m, 5H), [5,34 (d, J = 4 Hz) y 5,41 (d, J = 5 Hz), total 1H], 3,18, 3,21, 3,23 y 3,25 (4 s, total 6H), 2,93 y 3,08 (2 s a, total 3H), 1,15 , 1,18, 1,21 y 1,25 (4 s, total 6H).
Preparación de N,2-dim etilalaml-W -{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-femletM ]ammo}-1-m etox¡-2-metM-3-oxopropM]p¡rrol¡dm-1-M}-2-metox¡-1-[(1S)-1-meí¡lpropM]-4-oxobutM}-W-met¡l-L-valmam¡da, sal de ácido trifluoroacético (115).
Figure imgf000103_0001
Etapa 1. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 113). A una mezcla en agitación del dímero del ácido n.° 5 (12,1 g, 23,0 mM) y n.° 67 (11,5 g, 23,0 mM) en 75 ml de diclorometano en una atmósfera de nitrógeno, se añadió HATU (10,8 g, 27,6 mM) seguido de base de Hunig (12,1 ml, 69,0 mM). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 15 horas. La reacción se concentró a un volumen menor, se recogió con acetato de etilo y se lavó dos veces con HCl 1 N. Después, la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. Después, el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 70 % de acetona en heptanos), produciendo n.° 113 (12,3 g, 62 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 855,3 [m +H+], 877,2 [M+Na+], tiempo de retención = 2,32 minutos; HPLC (Protocolo R): m/z 855,5 [M+H+], tiempo de retención = 9,596 minutos (pureza > 97 %).
Etapa 2. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 114). De acuerdo con procedimiento general A, a partir de n.° 113 (12 g, 14 mmol, 1 equiv.), diclorometano (60 ml, 0,24 M) y dietilamina (40 ml, 390 mM) se sintetizó n.° 114 (5,9 g, 67 % ) , sólido de color blanco/amarillo claro, después de la purificación por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 % a 25 % de metanol en diclorometano). C L-EM (Protocolo Q): m/z 633,0 [M+H+], tiempo de retención = 1,19 minutos. HPLC (Protocolo A): m/z 633,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,142 minutos (pureza > 98 %).
Etapa 3. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil] amino }-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida-sal de ácido trifluoroacético (n.° 115). A una mezcla en agitación de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanina (167 mg, 0,493 mM), n.° 114 (260 mg, 0,411 mM) y HATU (188 mg, 0,493 mM) en 10 ml de diclorometano, se añadió base de Hunig (0,14 ml, 0,82 mM). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora y 20 minutos. La reacción se redujo. Se añadió THF (9 ml) a un material en bruto y a esta mezcla en agitación se añadió hidróxido de litio (49,2 mg, 2,06 mM) disuelto en 3 ml de agua. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se concentró, seguido de purificación por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 5 % a 45 % de agua en acetonitrilo con TFA al 0,02 % en cada fase) para dar n.° 115 (218 mg, 64 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 718,7 [M+H+], 740,6 [M+Na+], tiempo de retención = 1,21 minutos. HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 718,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,903 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,81-8,95 (m), 8,44-8,50 (m), 8,42 (d), 8,15 (d), 7,14-7,28 (m), 4,71-4,78 (m), 4,57-4,66 (m), 4,49-4,56 (m), 4,41-4,48 (m), 3,94-4,05 (m), 3,72-3,79 (m), 3,39-3,60 (m), 2,95-3,33 (m), 2,78-2,89 (m), 2,69 (s), 2,43-2,50 (m), 2,08-2,42 (m), 1,60-1,92 (m), 1,20-1,57 (m), 0,84-1,11 (m), 0,74-0,83 (m).
Preparación de 2-m et¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-m etox¡-1-{2S)-2-[(1R,2R)-1-m etox¡-3-{[(2S)-1-m etox¡-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]am ino}-2-m etil-3 oxoprop¡l]p¡rrol¡dm -1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-m et¡l-L-valmam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 117 ) y 2-m et¡l-L-prol¡l-N -[(3R,4S,5S)-1-{2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l] am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l] p¡rrol¡dm -1-¡l}-3-m etox¡-5-m et¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-m et¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 118).
Figure imgf000104_0001
Etapa 1. Síntesis de 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (n.° 116). A una solución en agitación de n.° 114 (1,02 g, 1,61 mmol, 1,0 equiv.) y 1-(tercbutoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (443 mg, 1,93 mmol, 1,2 equiv.) en 12 ml de diclorometano, se añadió HATU (735 mg, 1,93 mmol, 1,2 equiv.), seguido de base de Hunig (1,12 ml, 6,45 mmol, 4,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se redujo, se diluyó con acetato de etilo antes de lavarse con HCl 0,5 N y salmuera. Después, los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato sódico, se redujeron a un volumen menor y después se redujeron sobre sílice. Después, se realizó cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -45 % de acetona en heptanos) produciendo n.° 116 (1,02 g, 74 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 844,3 [M+H+], 867,2 [M+Na+], tiempo de retención = 2 ,15 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil] amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 117). A una solución en agitación de n.° 116 (450 mg, 0,533 mmol, 1,0 equiv.) en 7 ml de diclorometano a 0 °C, se añadió TFA (3 ml, 40 mmol, 70 equiv.). La reacción se dejó en agitación a 0 °C durante 5 minutos y después se dejó calentar a temperatura ambiente mientras se agitaba durante 20 minutos. La reacción se redujo, se diluyó con diclorometano y una pequeña cantidad de metanol antes de reducirse sobre sílice. Después, se realizó cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -20 % de metanol en acetato de etilo) produciendo n.° 117 (396 mg, 89 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 744,5 [m H+], 767,2 [M+Na+], tiempo de retención = 1,40 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 744,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,149 minutos (pureza > 91 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,73-9,14 (m), 8,66 (d a), 8,50 (d), 8,22 (d), 7,12-7,25 (m), 4,67-4,74 (m), 4,41-4,63 (m), 3,93-4,00 (m), 3,73 (dd), 3,63 (d), 3,46-3,57 (m), 3,38­ 3,45 (m), 3,26-3,23 (m), 3,22-3,25 (m), 3,06-3,22 (m), 2,99-3,05 (m), 2,93-2,97 (m), 2,80-2,89 (m), 2,75-2,78 (m), 2,64-2,67 (m), 2,46-2,50 (m), 2,27-2,43 (m), 2,00-2,26 (m), 1,85-1,99 (m), 1,70-1,83 (m), 1,52-1,69 (m), 1,33-1,51 (m), 1,18 -1,31 (m), 0,98-1,07 (m), 0,93-0,97 (m), 0,82-0,92 (m), 0,71-0,78 (m).
Etapa 2B. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ácido trifluoroacético (n.° 118). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 116 (435 mg, 0,515 mmol), en 4 ml de THF en una atmósfera de n¡trógeno, se añad¡ó L¡OH (24,7 mg, 1,03 mmol, 2,0 equ¡v.) d¡suelto en 2 ml de agua. La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente hasta que la CL-EM ¡ndícó la sapon¡f¡cac¡ón del éster metíl¡co. La reacc¡ón se concentró al vacío y después se puso al vacío. La reacc¡ón se diluyó con d¡clorometano y se puso en una atmósfera de n¡trógeno. A esta mezcla en ag¡tac¡ón se añad¡ó TFA (3 ml, 40,5 mmol, 80 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 30 m¡nutos. Después, la reacc¡ón se redujo. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía C l8 de fase ¡nversa y pres¡ón med¡a (Grad¡ente: de 5 % a 60 % de aceton¡tr¡lo en agua con TFA al 0,02 % en cada fase) para dar n.° 118 (396 mg, 89 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 730,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 1,18 m¡nutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 730,5 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 7,088 m¡nutos (pureza > 98 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), 89,04-9,13 (m), 8,75-8,87 (m), 8,70 (d), 8,38 (d), 8,11 (d), 7,10-7,24 (m), 4,66-4,74 (m), 4,48-4,64 (m), 4,37-4,47 (m), 3,91-3,99 (m), 3,77 (m), 3,47-3,56 (m), 3,33-3,47 (m), 3,08-3,30 (m), 2,93-3,07 (m), 2,75-2,86 (m), 2,63-2,69 (m), 2,45-2,50 (m), 2,28-2,44 (m), 2,03-2,27 (m), 1,88-2,02 (m), 1,68-1,86 (m), 1,55-1,67 (m), 1,30-1,47 (m), 1,17 -1 ,29 (m), 0,98­ 1,05 (m), 0,93-0,97 (m), 0,83-0,92 (m), 0,71-0,79 (m).
Preparación de 2-m etilalam l-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc-butoxi-1-oxo-3-fem lpropan-2-il]ammo}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropM]pirrolidm-1-M}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-M]-W-metil-L-valmamida (n.° 123).
Figure imgf000105_0001
Etapa 1. Síntes¡s de ác¡do (2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]p¡rrol¡d¡n-2-¡l}-3-metox¡-2-met¡lpropano¡co (n.° 119). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 11 (2,4 g, 8,4 mmol, 1,0 equ¡v.) en 10 ml de d¡oxano en una atmósfera de n¡trógeno, se añad¡ó HCl 4 M en d¡oxano(20 ml, 80 mM, 10 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 3 horas antes de concentrarse al vacío y de ponerse a alto vacío. Después, el mater¡al en bruto se d¡solv¡ó con 30 ml de Na2 CO 3 al 10 % . Después, esta soluc¡ón se añad¡ó a una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de 1-{[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]ox¡}p¡rrol¡d¡n-2,5-d¡ona (2,96 g, 8,77 mmol, 1,05 equ¡v.) en 30 ml de DME. La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente hasta que la TLC (20 % de metanol/40 % de acetato de et¡lo/40 % de heptanos) ¡ndícó el consumo del mater¡al de part¡da desproteg¡do de Boc. La reacc¡ón se concentró al vacío a un volumen menor, se lavó dos veces con éter, se ac¡d¡f¡có a pH 2 usando HCl concentrado y después se extrajo tres veces con una soluc¡ón de d¡clorometano al 90 % y metanol al 10 % . Los mater¡ales orgán¡cos se lavaron con b¡carbonato sód¡co saturado y salmuera antes de secarse sobre sulfato sód¡co, se f¡ltraron y se concentraron al vacío hasta un sól¡do de color pardo n.° 119 (3,4 g, cuant.). CL-EM (Protocolo Q): m/z 410,0 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 1,81 m¡nutos.
Etapa 2. Síntes¡s de N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]p¡rrol¡d¡n-2-¡l}-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l]-L-fen¡lalan¡nato de terc-but¡lo (n.° 120). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de L-fen¡lalan¡nato de terc-but¡lo, sal clorh¡drato (1,67 g, 6,5 mmol, 1,0 equ¡v.) y n.° 119 (5,9 g, 6,5 mmol, 1,0 equ¡v.) en 50 ml de d¡clorometano y 5 ml de DMF, se añad¡ó HATU (2,9 g, 7,9 mmol, 1,2 equ¡v.), segu¡do de base de Hun¡g (5,6 ml, 32 mmol, 5,0 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 45 m¡nutos. La reacc¡ón se redujo, se d¡luyó con acetato de et¡lo, se lavó con HCl 0,5 N y salmuera antes de concentrarse sobre síl¡ce. Después, se real¡zó cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -25 % de acetona en heptano) produc¡endo n.° 120 (3,14 g, 79 % ) en forma de un sól¡do de color blanco amar¡llo. CL-EM (Protocolo Q): m/z 613,1 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 2,37 m¡nutos.
Etapa 3. Síntes¡s de N-{(2R,3R)-3-metox¡-2-met¡l-3-[(2S)-p¡rrol¡d¡n-2-¡l]propano¡l}-L-fen¡lalan¡nato de terc-but¡lo (n.° 121). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 120 (2,87 g, 4,68 mmol, 1,00 equ¡v.) en 20 ml de d¡clorometano, se añad¡ó d¡et¡lam¡na (10 ml, 95 mM, 20,5 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 2 horas. Se añad¡ó más d¡et¡lam¡na (10 ml, 95 mmol, 20,5 equ¡v.) y la reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 3 horas más. La reacc¡ón se concentró al vacío y se puso a alto vacío, produc¡endo n.° 121 (1,8 g, cuant.) en forma de una mezcla de sól¡do y ace¡te de color amar¡llo blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 391,1 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 1,05 m¡nutos.
Etapa 4. Síntes¡s de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-2-met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1terc-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -W-metil-L-valinamida (n.° 122). A una solución en agitación de n.° 121 (0,55 g, 1,0 mmol, 1,0 equiv.) en 10 ml de diclorometano y 1 ml de DMF, se añadió n.° 32 (0,62 g, 1,0 mmol, 1,0 equiv.), seguido de h At U (0,42 g, 1,1 mmol, 1,1 equiv.) y base de Hunig (0,72 ml, 4,1 mmol, 4,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 21 horas. La reacción se redujo, se diluyó con acetato de etilo y después se lavó con HCl 0,5 N y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró a un volumen menor antes de concentrarse sobre sílice. Después, se realizó cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -40 % de acetona en heptano) produciendo n.° 122 (0,62 g, 62 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 982,3 [M+H+], tiempo de retención = 2,44 minutos.
Etapa 5. Síntesis de 2-metilalanil-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 123). A una mezcla en agitación de n.° 122 (600 mg, 0,611 mmol, 1,00 equiv.) en 15 ml de diclorometano, se añadió dietilamina (5 ml, 50 mmol, 80 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se concentró al vacío y la mezcla se purificó por cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -40 % de metanol en diclorometano) produciendo n.° 123 (0,46 g, 99 % ) en forma de un sólido. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 760,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,83 minutos. RMN 1H (400 MHz, CD 3 OD), 87,14-7,30 (m), 4,70-4,78 (m), 4,56-4,64 (m), 4,05-4,19 (m), 3,87 (dd), 3,79-3,84 (m), 3,72-3,77 (m), 3,62-3,70 (m), 3,46-3,56 (m), 3,37-3,45 (m), 3,33-3,36 (m), 3,16-3,24 (m), 3,09-3,11 (m), 2,98-3,05 (m), 2,95 (d), 2,91 (d), 2,87 (d), 2,83 (d), 2,73-2,79 (m), 2,40-2,51 (m), 2,29-2,39 (m), 2,16-2,28 (m), 2,04-2,15 (m), 2,01 (s), 1,73-1,96 (m), 1,50-1,68 (m), 1,47-1,49 (m), 1,46 (s), 1,43 (s), 1,38 (s), 1,35 (d), 1,23 -1,32 (m), 1,17 -1,22 (m), 1,15 (d), 1,04 -1,11 (m), 0,94-1,03 (m), 0,82-0,91 (m).
Preparación de W-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-ammo-2,2-dimetNpropanoN)-L-valN] (metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato de metilo (n.° 126).
Figure imgf000106_0001
Etapa 1. Síntesis de ácido 3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoico (n.° 124). Una solución de clorhidrato del ácido 3-amino-2,2-dimetilpropanoico (1,0 g, 6,5 mmol, 1,0 equiv.) en 10 ml de Na2 CO 3 al 10 % se añadió a una solución de 1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]oxi}pirrolidin-2,5-diona (2,3 g, 6,5 mmol, 1,0 equiv.) en 10 ml de DME. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante una noche. La reacción se concentró a un volumen menor y después se lavó dos veces con éter. La fase acuosa se acidificó a pH <2 con HCl concentrado y después se extrajo tres veces con una solución de metanol al 10 % y diclorometano al 90 % . Los materiales orgánicos se combinaron antes de lavarse con HCl 1 M y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío, produciendo n.° 124 (2,2 g, 98 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 362,0 [M+Na+]; tiempo de retención = 0,89 minutos. Etapa 2. Síntesis de N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato de metilo (n.° 125). A una solución en agitación de n.° 114 (200 mg, 0,316 mmol, 1,00 equiv.) en 2 ml de diclorometano, se añadió n.° 124 (107 mg, 0,316 mmol, 1,00 equiv.), seguido de base de Hunig (0,167 ml, 0,948 mmol, 3,00 equiv.) y HATU (149 mg, 0,379 mmol, 1,20 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~ 12 horas. La reacción se concentró a un volumen menor, se recogió en 10 ml de acetato de etilo y se lavó dos veces con 5 ml de HCl 1 M y una vez con 5 ml de salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se decantó. Los materiales orgánicos se concentraron al vacío y el material en bruto se recogió en diclorometano. El precipitado se filtró. La fase orgánica se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -50 % de acetona en heptano) produciendo n.° 125 (235 mg, 78 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 954,2 [M+H+], tiempo de retención = 2,28 minutos.
Etapa 3. Síntesis de W-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato de metilo (n.° 126). A una solución en agitación de n.° 125 (235 mg, 0,246 mmol, 1,00 equiv.) en 2 ml de THF, se añadió dietilamina (1 ml, 10 mM, 40,6 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -30 % de metanol en acetato de etilo) produciendo n.° 126 (101 mg, 56 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 732,2 [M+H+], tiempo de retención = 1,32 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,51 (dd), 8,28 (d), 7,15-7,29 (m), 5,77 (s), 4,55-4,77 (m), 4,44-4,54 (m), 3,94-4,10 (m), 3,73-3,79 (m), 3,66 (d), 3,49-3,60 (m), 3,40­ 3,48 (m), 3,10-3,36 (m), 3,00-3,09 (m), 2,83-2,98 (m), 2,57-2,77 (m), 2,19-2,46 (m), 1,87-2,14 (m), 1,61-1,86 (m), 1,36-1,55 (m), 1,23-1,36 (m), 1,12 -1,22 (m), 0 ,97-1,11 (m), 0,82-0,96 (m), 0,73-0,81 (m).
Preparación de N,2-dim etilalam l-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc-butoxi-1-oxo-3-fem lpropan-2-il]ammo}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidm-1-M}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-M]-W-metM-L-valmamida (n.° 130).
Figure imgf000107_0001
Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-terc-butox¡-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 127). En un matraz de fondo redondo que contenía n.° 6 (4,7 g, 7,9 mmol, 1,0 equ¡v.) y N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡na (3,2 g, 9,4 mmol, 1,2 equ¡v.) y una barra de ag¡tac¡ón en una atmósfera de n¡trógeno, se añad¡eron 50 ml de d¡clorometano, segu¡do de HATU (3,6 g, 9,4 mmol, 1,2 equ¡v.) y base de Hun¡g (5,5 ml, 32 mmol, 4,0 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante ~12 horas. La reacc¡ón se redujo a un volumen menor, se recog¡ó en acetato de et¡lo, antes de lavarse con HCl 1 N y salmuera. Después, los mater¡ales orgán¡cos se secaron sobre sulfato sód¡co, se f¡ltraron y después se redujeron sobre síl¡ce. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -30 % de acetona en heptano) produc¡endo n.° 127 (4,2 g, 78 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 680,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 2,52 m¡nutos.
Etapa 2. Síntes¡s de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(2R,3S,4S)-1-carbox¡-2-metox¡-4-met¡lhexan-3-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da, (n.° 128). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 127 (4,2 g, 6,1 mmol, 1,0 equ¡v.) en 21 ml de d¡clorometano en una atmósfera de n¡trógeno, se añad¡ó TFA (7 ml, 90 mmol, 10 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante ~4 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío, se dest¡ló azeotróp¡camente una vez con heptano y después se puso a alto vacío, produc¡endo n.° 128 en forma de un sól¡do de color blanco amar¡llo claro (3,8 g, cuant.). c L-EM (Protocolo Q): m/z 624,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 2,01 m¡nutos.
Etapa 3. Síntes¡s de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 129). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 128 (1,67 g, 3,1 mmol, 1,0 equ¡v.) en 20 de d¡clorometano y 2 ml de DMF, se añad¡ó n.° 121 (2,4 g, 3,1 mmol, 1,0 equ¡v.), segu¡do de HATU (1,29 g, 3,39 mmol, 1,1 equ¡v.) y después base de Hun¡g (2,2 ml, 12,3 mmol, 4,0 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante ~2 horas. La reacc¡ón se redujo, se d¡luyó con acetato de et¡lo antes de lavarse con HCl 0,5 N y salmuera. Los mater¡ales orgán¡cos se secaron sobre sulfato sód¡co y después se redujeron sobre síl¡ce. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -50 % de acetona en heptanos) produc¡endo n.° 129 (1,9 g, 62 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 996,3 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =2,53 m¡nutos.
Etapa 4. Síntes¡s de N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l] am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 130). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 129 (823 mg, 0,826 mmol, 1,00 equ¡v.) en 15 ml de d¡clorometano, se añad¡ó d¡et¡lam¡na (4 ml, 40 mmol, 50 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante ~14 A horas. La reacc¡ón se concentró al vacío y se dest¡ló azeotróp¡camente una vez con heptanos. El res¡duo se d¡luyó con d¡clorometano y una pequeña cant¡dad de metanol antes de reduc¡rse sobre síl¡ce. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -20 % de metanol en acetato de et¡lo) produc¡endo n.° 130 (518 mg, 81 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 774,3 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =1,48 m¡nutos. HPLC (Protocolo A 25 °C): m/z 774,5 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 7,733 m¡nutos (pureza > 98 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,36 (d). 8,14 (d), 7,81 (t), 7,14-7,25 (m), 7,01-7,07 (m), 4,87­ 4,94 (m), 4,78-4,85 (m), 4,67-4,76 (m), 4,46-4,65 (m), 4,29-4,40 (m), 3,93-4,03 (m), 3,70-3,81 (m), 3,49-3,60 (m), 3,38-3,47 (m), 3,29-3,36 (m), 3,15-3,28 (m), 2,98-3,13 (m), 2,94 (s a), 2,74-2,89 (m), 2,64-2,69 (m), 2,18-2,45 (m), 2,02-2,14 (m), 1,90-2,01 (m), 1,62-1,87 (m), 1,40-1,55 (m), 1,37 (d), 1,20 -1,33 (m), 1,16 (d), 1,01-1,10 (m), 0,90-0,98 (m), 0,82 -0,89 (m), 0,69-0,79 (m).
Preparación de 2-m etil-D-prolil-W -[(3R,4S,5S)-3-m etoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etoxi-3-{[(2S)-1-m etoxi-1-oxo-3-femlpropan-2-il]ammo}-2-metM-3-oxopropil]pirrolidm-1-M}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 131).
Figure imgf000108_0001
Etapa 1. Síntesis de sal de ácido trifluoroacético de 2-metil-D-prolil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n.° 131). A una solución en agitación de n.° 114 (164 mg, 0,259 mmol, 1,0 equiv.) y 1-(tercbutoxicarbonil)-2-metil-D-prolina (71,3 mg, 0,311 mmol, 1,2 equiv.) en 4 ml de diclorometano, se añadió h At U (118 mg, 0,311 mmol, 1,2 equiv.), seguido de base de Hunig (0,180 ml, 1,04 mmol, 4 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~30 minutos. La reacción se redujo. La reacción se recogió en 3,5 ml de diclorometano y se puso en una atmósfera de nitrógeno. A esta solución en agitación, se añadió TFA (1,5 ml, 20 mmol, 76 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~1 hora. La reacción se redujo y se puso a alto vacío. La purificación por (Procedimiento J*) proporcionó n.° 131 (119 mg, 54 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 744,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,342 minutos (pureza > 98 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), 89,08-9,18 (m), 8,79-8,89 (m), 8,76 (t), 8,54 (d), 8,29 (d), 7,14-7,31 (m), 4,70­ 4,79 (m), 4,57-4,66 (m), 4,45-4,55 (m), 3,96-4,04 (m), 3,74-3,80, 3,66 (d), 3,48-3,61 (m), 3,40-3,48 (m), 3,09-3,34 (m), 3,00-3,09 (m), 2,95-3,00 (m), 2,83-2,93 (m), 2,36-2,53 (m), 2 ,21-2,35 (m), 2,10 -2,19 (m), 1,99-2,10 (m), 1,61­ 1,09 (m), 1,36-1,53 (m), 1,21 -1,35 (m), 1,02-1,10 (m), 0,94-1,0 (m), 0,86-0,93 (m), 0,73-0,82 (m).
Preparación de 2-m etil-L-prolil-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxM -fem lpropan-2-il]ammo}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropM]pirrolidm-1-M}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-M]-W-metil-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 134).
Figure imgf000108_0002
Etapa 1. Síntesis de N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxo-heptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 132). En un matraz que contenía n.° @5 (1,14 g, 2 ,17 mmol, 1,0 equiv.), se añadieron 10 ml de diclorometano, seguido de base de Hunig (1,15 ml, 6,52 mmol, 3,0 equiv.), HATU (1,02 g, 2,61 mmol, 1,2 equiv.) y n.° 110 (0,776 g, 2 ,17 mmol, 1,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se concentró al vacío. El material en bruto se recogió en 50 ml de acetato de etilo, se lavó dos veces con 25 ml de HCl 1 M y una vez con 25 ml de salmuera. Los materiales orgánicos se secaron sobre sulfato sódico y se decantaron. Los materiales orgánicos se concentraron al vacío, se recogieron en 30 ml de diclorometano y el precipitado resultante se retiró por filtración. Los materiales orgánicos se concentraron al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -50 % de acetona en heptanos) produciendo n.° 132 (1,33 g, 81 % ) en forma de un sólido. CL-EM (Protocolo Q): m/z 849,2 [M+Na+]; tiempo de retención = 2,19 minutos.
Etapa 2. Síntesis de W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (n.° 133). A una solución en agitación de n.° 132 (1,33 g, 1,60 mmol, 1,0 equiv.) en 10 ml de THF se añadió dietilamina (5 ml, 50 mM, 31,3 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -30 % de metanol en acetato de etilo) produciendo n.° 133 (418 mg, 43 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 605,2 [M+H+]; tiempo de retención = 1,48 minutos.
Etapa 3. Síntesis de 2-metil-L-prolil-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il] amino }-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 134). Se combinaron HATU (151 mg, 0,398 mmol, 1,2 equiv.), n.° 133 (201 mg, 0,332 mmol, 1,0 equiv.) y 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (91,3 mg, 0,398 mM, 1,2 equiv.) en un matraz de fondo redondo que contenía una barra de agitación en una atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 5 ml de diclorometano, seguido de base de Hunig (0,231 ml, 1,33 mmol, 4,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~15 horas. Después, la reacción se concentró al vacío y se puso a alto vacío. Después, se añadieron 4 ml de dioxano al residuo, seguido de HCl 4 M en dioxano (4 ml, 20 mmol, 50 equiv.). Después, la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, la reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 5 % a 90 % de acetonitrilo en agua con TFA al 0,02 % en cada fase) para dar n.° 134 (237 mg, 86 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 716,3 [M+H+], tiempo de retención = 1,16 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 716,5 [M+H+], tiempo de retención = 6,930 minutos (pureza > 98 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), 9,12-9,21 (m), 8,79-8,90 (m), 8,70-8,78 (m), 7,95 (d), 7,64 (d), 7,25-7,36 (m), 7,16-7,23 (m), 4,74-4,80 (m), 4,61-4,69 (m), 4,41-4,59 (m), 3,91-4,06 (m), 3,78 (dd), 3,54-3,64 (m), 3,45-3,51 (m), 3,17-3,36 (m), 3,02-3,15 (m), 3,00 (s a), 2,40-2,48 (m), 2,24-2,35 (m), 1,91-2,21 (m), 1,68-1,90 (m), 1,61-1,68 (m), 1,48-1,59 (m), 1,22 ­ 1,35 (m), 0,97-1,09 (m), 0,84-0,97 (m), 0,74-0,83 (m).
Preparación de N,2-dim etilalam l-N-{(1S,2R)-4-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(1S)-1-bencil-2-(m etilam m o)-2-oxoetil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valinam ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 140), N,2-dim etilalam l-N-{(1S,2R)-4-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(1S)-2-am m o-1-bencil-2-oxoetil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valm am ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 141), N,2-dim etilalam l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-oxo-2-(propilam m o)etil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-propil]pirrolidm -1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valm am ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 142), N,2-dim etilalam l-N-{(1S,2RM -{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(dietilam m o)-2-oxoetil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valinam ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 143, y N,2-dim etilalam l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(terc-butilam m o)-2-oxoetil]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valinam ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 144).
Figure imgf000110_0001
Etapa 1. Síntesis de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-1-oxo-1-(pentafluorofenoxi)heptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (n.° 135). Se añadió 3,3,3-trifluoropropanoato de pentafluorofenilo (2,44 ml, 13,4 mmol, 2,0 equiv.) a una solución de n.° 128 (4,18 g, 6,70 mmol, 1,0 equiv.) en 50 ml de diclorometano, seguido de piridina (1,61 ml, 20,1 mmol, 3,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~ 12 horas. La reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -70 % de acetona en heptanos) produciendo n.° 135 (5,2 g, 98 % ) en forma de una espuma de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 812,1 [M+Na+]; tiempo de retención = 1,24 minutos.
Etapa 2. Síntesis de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2 carbox¡-1-metox¡prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 136). A una solución en ag¡tac¡ón de HCl 4 M en d¡oxano (10 ml, 25 mmol, 3,7 equ¡v.) en 10 ml de d¡oxano se añad¡ó n.° 11 (2,31 g, 8,05 mmol, 1,2 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 6 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío produc¡endo una goma de color amar¡llo. Una soluc¡ón de n.° 135 (5,3 g, 6,7 mmol, 1,0 equ¡v.) en 30 ml de d¡clorometano se añad¡ó al res¡duo prev¡o, segu¡do de base de Hun¡g (3,5 ml, 20 mmol, 3 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 4 horas. La reacc¡ón se d¡luyó con d¡clorometano antes de lavarse con una soluc¡ón acuosa al 1 % de HCl y después salmuera. La fase orgán¡ca se secó sobre sulfato sód¡co, se concentró al vacío y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 20 % -50 % de acetato de et¡lo en heptanos, segu¡do de 93 % de acetato de et¡lo y 6,6 % de metanol y 0,4 % de ác¡do acét¡co) produc¡endo n.° 136 (4,87 g, 92 % ) en forma de un sól¡do de color blanquec¡no. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 793,3 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =1,07 m¡nutos.
Etapa 3. Síntes¡s de A/-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(pentafluorofenox¡)prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 137). Se añad¡ó 3,3,3-tr¡fluoropropanoato de pentafluorofen¡lo (1,3 ml, 7,1 mmol, 2,0 equ¡v.) a una soluc¡ón de n.° 136 (2,8 g, 3,5 mmol, 1,0 equ¡v.) en 30 ml de d¡clorometano, segu¡do de la ad¡c¡ón de p¡r¡d¡na (0,85 ml, 10,6 mM). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 2 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío, y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -70 % de acetona en heptano) produc¡endo n.° 137 (3,1 g, 92 % ) en forma de un polvo de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 959,2 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =1,28 m¡nutos.
Etapa 4. Síntes¡s de A/-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 138). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 137 (493 mg, 0,514 mmol, 1,0 equ¡v.) en 4 ml de DMF, se añad¡ó L-fen¡lalan¡na (84,9 mg, 0,514 mmol, 1,0 equ¡v.), segu¡do de base de Hun¡g (0,27 ml, 1,54 mmol, 3,0 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante ~ 12 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -100 % de acetato de et¡lo en heptano) produc¡endo n.° 138 (200 mg, 41 % ) en forma de una espuma de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 940,3 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =1,08 m¡nutos.
Etapa 5. Síntes¡s de A/-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-1-(pentafluorofenox¡)-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 139). A una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de n.° 138 (200 mg, 0,213 mmol, 1,0 equ¡v.) en 5 ml de d¡clorometano, se añad¡ó 3,3,3-tr¡fluoropropanoato de pentafluorofen¡lo (126 mg, 0,426 mM, 2,0 equ¡v.), segu¡do de p¡r¡d¡na (0,051 ml, 0,64 mmol, 3,0 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante ~ 12 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % - 100 % de acetato de et¡lo en heptanos) produc¡endo n.° 139 (174 mg, 74 % ) en forma de un ace¡te de color amar¡llo. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 1128 [M+Na+]; t¡empo de retenc¡ón = 1,23 m¡nutos.
Etapa 6A. Síntes¡s de N,2-d¡met¡lalan¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-(met¡lam¡no)-2-oxoet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-W-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 140). A una soluc¡ón ag¡tada de n.° 139 (20 mg, 0,018 mmol, 1,0 equ¡v.) en 1 ml de THF se añad¡ó met¡lam¡na (1 M en THF, 0,18 ml, 0,18 mmol, 10 equ¡v.) y la mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 3 horas. La reacc¡ón se redujo y se d¡luyó con DMSO y se somet¡ó a pur¡f¡cac¡ón (Proced¡m¡ento J*). Las fracc¡ones se recog¡eron y se concentraron al vacío para dar n.° 140 (4,0 mg, 30 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 731,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,70 m¡nutos. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4), 7,30-7,41 (m), 4,71-4,78 (m), 4,58-4,69 (m), 4,04-4,15 (m), 3,86-3,98 (m), 3,73-3,78 (m), 3,61-3,70 (m), 3,50-3,58 (m), 3,32-3,47 (m), 3,23-3,26 (m), 3,17-3,22 (m), 3,07-3,15 (m), 2,95­ 2,98 (m), 2,76-2,91 (m), 2,68-2,75 (m), 2,63-2,66 (m), 2,43-2,51 (m), 2,22-2,28 (m), 1,99-2,11 (m), 1,74-1,96 (m), 1,21 -1,31 (m), 1,17 -1,20 (m), 0,92-1,10 (m), 0,79-0,89 (m).
Etapa 6B. Síntes¡s de N,2-d¡met¡lalan¡l-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2-am¡no-1-benc¡l-2-oxoet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-W-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 141). S¡gu¡endo el m¡smo proced¡m¡ento que para el n.° 140 usando n.° 139 (20 mg, 0,018 mmol, 1,0 equ¡v.), una soluc¡ón de amon¡aco (7 M en metanol, 0,026 ml, 0,18 mmol, 10 equ¡v.) y pur¡f¡cac¡ón (Proced¡m¡ento J*), se obtuvo n.° 141 (3,0 mg, 20 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 717,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,79 m¡nutos. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4), 7,22-7,30 (m), 7,14-7,21 (m), 4,57-4,480 (m), 4,02-4,17 (m), 3,92-3,98 (m), 3,84-3,91 (m), 3,32-3,74 (m), 3,17-3,27 (m), 3,06-3,14 (m), 2,77-3,05 (m), 2,65 (s), 2,43-2,51 (m), 2,21-2,26 (m), 1,98-2,13 (m), 1,70-1,94 (m), 1,32-1,69 (m), 1,16 -1,31 (m), 0,89-1,13 (m), 0,80-0,88 (m).
Etapa 6C. Síntes¡s de N,2-d¡met¡lalan¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-oxo-2-(prop¡lam¡no)et¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-A/-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 142). S¡gu¡endo el mismo proced¡m¡ento que para el n.° 140 usando n.° 139 (20 mg, 0,018 mmol, 1,0 equ¡v.), n-prop¡lam¡na (1 M en THF, 0,18 ml, 0,18 mmol, 10. equ¡v.) y pur¡f¡cac¡ón (Proced¡m¡ento J*), se obtuvo n.° 142 (3,0 mg, 20 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 759,2 [M+H+], tiempo de retención = 0,74 minutos. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4), 7,15-7,29 (m), 4,71-4,79 (m), 4,52-4,68 (m), 4,04-4,17 (m), 3,87-3,99 (m), 3,73-3,99 (m), 3,73-3,79 (m), 3,50-3,70 (m), 3,34­ 3,49 (m), 3,06-3,23 (m), 2,79-2,99 (m), 2,44-2,50 (m), 2,28-2,43 (m), 2,22-2,27 (m), 1,75 -2,10 (m), 1,34-1,61 (m), 1,16 -1,29 (m), 0,92-1,10 (m), 0,77-0,89 (m).
Etapa 6D. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(dietilamino)-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 143). Siguiendo el mismo procedimiento que para el n.° 140 usando n.° 139 (20 mg, 0,018 mmol, 1,0 equiv.) dietilamina (1 M en THF, 0,18 ml, 0,18 mmol, 10 equiv.) y purificación (Procedimiento J*), se obtuvo n.° 143 (4,0 mg, 30 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 773,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,77 minutos. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4), 7,16-7,33 (m), 5,10­ 5,17 (m), 4,96-5,07 (m), 4,68-4,75 (m), 4,60-4,65 (m), 3,61-4,23 (m), 3,35-3,67 (m), 3,16-3,26 (m), 2,99-3,15 (m), 2,78-2,94 (m), 2,30-2,52 (m), 2,19-2,28 (m), 1,73 -2 ,13 (m), 1,83-1,45 (m), 1,19 -1,31 (m), 0,92-1,18 (m), 0,80-0,89 (m).
Etapa 6E. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(terc-butilamino)-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético n.° 144. Siguiendo el mismo procedimiento que para el n.° 140 usando n.° 139 (20 mg, 0,018 mmol, 1,0 equiv.), terc-butilamina (1 M en THF, 0,18 ml, 0,18 mmol, 10 equiv.) y purificación (Procedimiento J*), se obtuvo n.° 144 (3,4 mg, 24 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 773,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,74 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,21 (d), 8,03-7,98 (m), 7,92 (d), 7,81-7,62 (m), 7,46-7,16 (m), 4,83-4,69 (m), 4,68-4,56 (m), 4,21-4,07 (m), 3,92-3,86 (m), 3,83-3,80 (m), 3,74-3,65 (m), 3,60-3,48 (m), 3,47-3,36 (m), 3,28-3,13 (m), 3,11-3 ,01 (m), 2,96-2,82 (m), 2,69-2,62 (m), 2,54-2,43 (m), 2,38-2,12 (m), 2,00-1,76 (m), 1,69-1,161 (m), 1,60-1,53 (m), 1,52-0,98 (m), 0,94-0,86 (m). Preparación de N ,2-dim etilalam l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxM -fem lpropan-2-il]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N-m etil-L-valm am ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 145).
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Etapa 1. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1R,2S)-2-hidroxi-1-metil-2-feniletil]amino }-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 145). A una solución en agitación de n.° 137 (300 mg, 0,313 mmol, 1,0 equiv.) en 3 ml de DMF, se añadió (1S,2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol (54,8 mg, 0,344 mmol, 1,1 equiv.), seguido de base de Hunig (0,164 ml, 0,939 mmol, 3,0 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~ 12 horas. Después, se añadió una solución al 20 % de piperidina en DMF (1 ml, 2,2 mmol, 7,0 equiv.) y la reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La purificación (Procedimiento J, seguido de concentración de los tubos de ensayo adecuados produjo n.° 145 (190 mg, 74 % ) en forma de un polvo de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 704,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,67 minutos. RMN 1H (400 MHz, CD 3OD), 87,97 (d), 7,73 (d), 7,37-7,41 (m), 7,27-7,36 (m), 7,19-7,25 (m), 4,70-4,75 (m), 4,58-4,63 (m), 4,49-4,54 (m), 4,14-4,30 (m), 4,04-4,11 (m), 3,87 (dd), 3,63-3,77 (m), 3,51-3,58 (m), 3,46-3,49 (m), 3,38-3,43 (m), 3,25-3,37 (m), 3,15-3,23 (m), 3 ,11-3 ,14 (m), 3,01-3,02 (m), 2,59-2,64 (m), 2,52-2,55 (m), 2,44-2,52 (m), 2,41-2,43 (m), 2,07-2,26 (m), 1,73-2,0 (m), 1,65-1,73 (m), 1,59-1,65 (m), 1,51-1,59 (m), 1,32-1,46 (m), 1,23-1,26 (m), 1,08-1,21 (m), 0,94-1,07 (m), 0,83-0,92 (m).
Preparación de 3-m etil-D -isovalil-N -{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-m etoxi-2-oxoetil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valm am ida (n.° 146), 3-m etil-L-isovalil-N -{(1S,2R)-4-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(1S)-1-bencil-2-m etoxi-2-oxoetil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valinam ida (n.° 147), L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(1S)-1-bencil-2-m etoxi-2-oxoetil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valinam ida (n.° 148) y D -isovalil-N -{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-m etoxi-2-oxoetil]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-N-m etil-L-valinam ida (n.° 149).
Figure imgf000113_0001
Etapa 1A. Síntesis de 3-met¡l-D-¡soval¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metox¡-2-oxoet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 146). Una soluc¡ón de n.° 1 l4 (225 mg, 0,356 mmol, 1,0 equ¡v.) en 2 ml de d¡clorometano se añad¡ó a una soluc¡ón de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-3-met¡l-D-¡soval¡na (126 mg, 0,356 mmol, 1,0 equ¡v.) en 4 ml de d¡clorometano. Se añad¡ó base de Hun¡g (0,188 ml, 1,07 mmol, 3,0 equ¡v.), segu¡do de HATU (167 mg, 0,427 mmol, 1,2 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 12 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío y después se recog¡ó en acetato de et¡lo antes de lavarse dos veces con HCl 1 M y una vez con salmuera. La fase orgán¡ca se secó sobre sulfato sód¡co y se decantó. El d¡solvente orgán¡co se retiró en un Genevac. Se añad¡ó THF (4 ml), segu¡do de d¡et¡lam¡na (2 ml, 19 mmol, 53,4 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón durante ~12 horas. La reacc¡ón se concentró usando un Genevac, segu¡do de cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -30 % de metanol en acetato de et¡lo), produc¡endo n.° 146 (183 mg, 69 % ) en forma de un sól¡do. CL-EM (Protocolo Q): m/z 746,4 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =1,37 m¡nutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,55 (d), 8,26-8,36 (m), 7,88-8,03 (m), 7,81 (d), 7,41-7,53 (m), 7,13-7,30 (m), 7,01 (s), 4,71-4,79 (m), 4,44­ 4,70 (m), 3,96-4,04 (m), 3,70-3,80 (m), 3,62-3,69 (m), 3,40-3,61 (m), 2,76-3,35 (m), 2,67-2,71 (m), 2,56-2,58 (m), 2,06-2,46 (m), 1,61-1,90 (m), 1,14 -1,54 (m), 0 ,72-1,12 (m).
Etapa 1B. Síntes¡s de 3-met¡l-L-¡soval¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metox¡-2-oxoet¡l] am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 147). Una soluc¡ón de n.° 114 (224 mg, 0,354 mmol, 1,0 equ¡v.) en 2 ml de d¡clorometano se añad¡ó a una soluc¡ón de N-[(9H-fluoren-9-¡lmetox¡)carbon¡l]-3-met¡l-L-¡soval¡na (125 mg, 0,354 mmol, 1,0 equ¡v.) en 4 ml de d¡clorometano. Se añad¡ó base de Hun¡g (0,187 ml, 1,06 mmol, 3,0 equ¡v.), segu¡do de HATU (167 mg, 0,425 mmol, 1,2 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente durante 12 horas. La reacc¡ón se concentró al vacío y después se recog¡ó en acetato de et¡lo antes de lavarse dos veces con HCl 1 M y una vez con salmuera. La fase orgán¡ca se secó sobre sulfato sód¡co y se decantó. El d¡solvente orgán¡co se ret¡ró en un Genevac. Se añad¡ó THF (4 ml), segu¡do de d¡et¡lam¡na (2 ml, 19 mmol, 53,7 equ¡v.). La reacc¡ón se dejó en ag¡tac¡ón durante ~12 horas. La reacc¡ón se concentró usando un Genevac, segu¡do de cromatografía de síl¡ce (Grad¡ente: 0 % -30 % de metanol en acetato de et¡lo), produc¡endo n.° 147 (216 mg, 82 % ) en forma de un sól¡do. CL-EM (Protocolo Q): m/z 746,6 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón =1,29 m¡nutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,56 (m), 8,31-8,39 (m), 8,50 (d), 8,30 (d a), 7,87-8,01 (m), 7,80 (d), 7,40-7,53 (m), 7,14-7,30 (m), 4,45-4,78 (m), 3,94-4,04 (m), 3,70-3,79 (m), 3,61-3,69 (m), 3,42-3,59 (m), 2,97-3,37 (m), 2,80-2,92 (m), 2,32-2,49 (m), 2,05­ 2,30 (m), 1,61-1,89 (m), 1,37-1,56 (m), 1,14 -1,135 (m), 0 ,70-1,11 (m).
Etapa 1C . Síntes¡s de L-¡soval¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metox¡-2-oxoet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 148). Una soluc¡ón de n.° 114 (447 mg, 0,707 mmol, 1,0 equ¡v.) en 2 ml de d¡clorometano se añad¡ó a una soluc¡ón de W-[(9H-fluoren-9-ilmetox¡)carboml]-L-¡soval¡na (240 mg, 0,707 mmol, 1,0 equiv.) en 4 ml de diclorometano. Se añadió base de Hunig (0,373 ml, 2 ,12 mmol, 3,0 equiv.), seguido de HATU (332 mg, 0,425 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción se concentró al vacío y después se recogió en acetato de etilo antes de lavarse dos veces con HCl 1 M y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se decantó. El disolvente orgánico se retiró en un Genevac. Se añadió THF (4 ml), seguido de dietilamina (2 ml, 19 mmol, 26,9 equiv.). La reacción se dejó en agitación durante ~12 horas. La reacción se concentró usando un Genevac, seguido de cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -30 % de metanol en acetato de etilo), produciendo n.° 148 (182 mg, 35 % ) en forma de un sólido. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 732,3 [M+H+]; tiempo de retención =0,71 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), 88,56 (d), 8,46-8,52 (m), 8,30 (d), 8,02-8,15 (m), 7,98 (d), 7,80 (d), 7,40-7,53 (m), 7,15-7,30 (m), 4,70-4,80 (m), 4,44-4,69 (m), 3,96­ 4,05 (m), 3,70-3,79 (m), 3,62-3,69 (m), 3,41-3,59 (m), 2,99-3,35 (m), 2,31-2,95 (m), 2,67-2,71 (m), 2,55-2,59 (m), 2,32-2,48 (m), 2,20-2,31 (m), 1,97-2,19 (m), 1,61-1,88 (m), 1,37-1,56 (m), 1,20-1,34 (m), 1,14 -1,19 (m), 1,02 -1,11 (m), 0,97-1,01 (m), 0,86-0,96 (m), 0,71-0,83 (m).
Etapa 1D. Síntesis de D-¡soval¡l-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metox¡-2-oxoet¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 149). Una solución de n.° 114 (447 mg, 0,707 mmol, 1,0 equiv.) en 2 ml de diclorometano se añadió a una solución de W-^H-fluoren^-ilmetoxOcarbonilJ-D-isovalina (240 mg, 0,707 mmol, 1,0 equiv.) en 4 ml de diclorometano. Se añadió base de Hunig (0,373 ml, 2 ,12 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (332 mg, 0,425 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción se concentró al vacío y después se recogió en acetato de etilo antes de lavarse dos veces con HCl 1 M y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se decantó. El disolvente orgánico se retiró en un Genevac. Se añadió THF (4 ml), seguido de dietilamina (2 ml, 19 mmol, 26,9 equiv.). La reacción se dejó en agitación durante ~12 horas. La reacción se concentró usando un Genevac, seguido de cromatografía de sílice (Gradiente: 0 % -30 % de metanol en acetato de etilo), produciendo n.° 149 (154 mg, 30 % ) en forma de un sólido. CL-EM (Protocolo Q): m/z 732,0 [M+H+]; tiempo de retención =1,24 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,55 (d), 8,38-8,46 (m), 8,29 (d), 8,03-8,14 (m), 7,97 (d), 7,81 (d), 7,40-7,53 (m), 7,14-7,28 (m), 7,02 (s), 4,71-4,79 (m), 4,43-4,69 (m), 3,96-4,05 (m), 3,71-3,80 (m), 3,62-3,70 (m), 3,49-3,60 (m), 3,40-3,48 (m), 3,15-3,34 (m), 3,10-3,14 (m), 3,01­ 3,09 (m), 2,94-3,00 (m), 2,83-2,93 (m), 2,65-2,71 (m), 2,55-2,59 (m), 2,32-2,48 (m), 2,04-2,31 (m), 1,61-1,89 (m), 1,37 -1,52 (m), 1,21-1,35 (m), 1,15 -1,20 (m), 1,02-1,10 (m), 0,75-1,01 (m).
Preparación de 1,2-dimetN-L-proMl-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-fenMetM]ammo}-1-metoxi-2-metN-3-oxopropN]pirroMdm-1-M}-2-metoxM-[(1S)-1-meÍNpropM]-4-oxobutM}-W-metN-L-valmamida (n.° 151).
Figure imgf000114_0001
Etapa 1. Síntesis de 1,2-dimetil-L-prolina (n.° 150). Un matraz Parr que contenía 2-metil-L-prolina (1,0 g, 7,7 mmol, 1,0 equiv.), 40 ml de metanol, formaldehído al 37 % en peso en agua (2,1 ml, 77 mmol, 10 equiv.) y paladio al 10 % en peso sobre carbono (313 mg, 2,94 mmol, 0,38 equiv.) se puso en un agitador Parr y se dejó en agitación en una atmósfera de 0,28 MPa (40 psi) de hidrógeno durante ~12 horas. Se retiró hidrógeno y la reacción se filtró a través de una capa de celite, que se aclaró con una solución de metanol al 50 % y diclorometano al 50 % . El residuo se concentró al vacío, produciendo n.° 150 (1,1 g, 100 % ) en forma de un sólido de color blanco ligeramente ennegrecido. CL-EM (Protocolo Q): m/z 144,0 [M+H+]; tiempo de retención =0,17 minutos.
Etapa 2. Síntesis de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-meíox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 151). A una mezcla en agitación de n.° 114 (125 mg, 0,198 mmol, 1,0 equiv.), n.° 150 (37 mg, 0,26 mmol, 1,3 equiv.) y HATU (98 mg, 0,26 mmol, 1,3 equiv.) en 5 ml de diclorometano, se añadió base de Hunig (0,14 ml, 0,80 mmol, 4,1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentró al vacío. Se añadió THF (6 ml) al material en bruto. A esta mezcla en agitación se añadió LiOH (14 mg, 0,59 mmol, 3,0 equiv.) en 2 ml de agua. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 90 minutos. La reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 5 % a 40 % de acetonitrilo en agua con TFA al 0,02 % en cada fase) para dar n.° 151 (147 mg, 69 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 744,3 [M+H+], tiempo de retención = 1,19 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 744,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,631 minutos (pureza > 98 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 89,57-9,71 (m), 8,75 (d), 8,42 (d), 8,15 (d), 7,14-7,29 (m), 4,70-4,79 (m), 4,40­ 4,68 (m), 3,95-4,03 (m), 3,73-3,80 (m), 3,37-3,61 (m), 2,97-3,31 (m), 2,79-2,88 (m), 2,66-2,76 (m), 2,54-2,58 (m), 2,31-2,43 (m), 1,94-2,29 (m), 1,57-1,91 (m), 1,21 -1,52 (m), 0,85-1,10 (m), 0,74-0,82 (m).
Preparación de 1,2-dim etil-D-prolil-W -{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-fem letil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1-m etilpropil]-4-oxobutil}-W -m etil-L-valm am ida (n.° 153).
Figure imgf000115_0001
Etapa 1. Síntesis de 1,2-dimetil-D-prolina (n.° 152). En un matraz Parr que contenía 2-metil-D-prolina (432 mg, 3,34 mmol, 1,0 equiv.), formaldehído al 37 % en peso en agua (1,0 ml, 37 mM, 11 equiv.), 3,5 ml de metanol y 1 ml de agua, se añadió paladio 10 % en peso sobre carbono (108 mg, 0,304 mmol, 0,304 equiv.). El matraz se puso en un agitador Parr y se dejó en agitación en una atmósfera de 0,21 MPa (30 psi) de hidrógeno durante ~48 horas. Se retiró hidrógeno y la reacción se lavó a través de una capa de celite, que a continuación se lavó con metanol. Los materiales orgánicos se concentraron al vacío y después se destilaron azeotrópicamente con tolueno, proporcionando n.° 152 (517 mg, 100 % ) en forma de un sólido. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4): 8 [3,61­ 3,56 (m, 1H), 3,07-2,96 (m, 1H), 2,68 (s a, 3H), 2,34-2,22 (m, 1H), 2,01-1,88 (m, 1H), 1,87-1,73 (m, 1H), 1,40 (s a, 3H)].
Etapa 2. Síntesis de 1,2-dimetil-D-proNl-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-fenNetN]amino}-1-metoxi-2-metN-3-oxopropil]pirroNdin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropN]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida (n.° 153). A una mezcla en agitación de n.° 114 (240 mg, 0,379 mmol, 1,0 equiv.), n.° 152 (71 mg, 0,49 mmol, 1,3 equiv.) y HATU (188 mg, 0,49 mmol, 1,3 equiv.) en 10 ml de diclorometano, se añadió base de Hunig (0,27 ml, 4,1 mM, 4,1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentró al vacío. Se añadió THF (6 ml) al material en bruto. A esta mezcla en agitación se añadió LiOH (36 mg, 1,5 mmol, 4 equiv.) disuelto en 2 ml de agua. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 5 % a 40 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase) para dar n.° 153 (220 mg, 78 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q): m/z 744,8 [M+H+], tiempo de retención = 1,16 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m/z 744,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,713 minutos (pureza > 98 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 89,72-9,85 (m), 8,65 (t), 8,41 (d), 8,14 (d), 7,14-7,28 (m), 4,69-4,79 (m), 4,38­ 4,53 (m), 3,95-4,04 (m), 3,73-3,79 (m), 3,37-3,62 (m), 3,13-3,33 (m), 2,95-3,10 (m), 2,79-2,89 (m), 2,67-2,75 (m), 2,00-2,46 (m), 1,61-1,90 (m), 1,22-1,54 (m), 1,02-1,09 (m), 0,95-1,01 (m), 0,85-0,94 (m), 0,75-0,83 (m).
Preparación de N~2~[2,2-dim etil-3-(m etilam mo)propanoil]-W -{(1S,2R)-2-m etoxi-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-m etil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]am ino}propil]pirrolidin-1-il}-1-[(1S)-1 -metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 154).
Figure imgf000115_0002
Etapa 1. Síntesis de N~2~-[2,2-dimetil-3-(metilamino)propanoil]-W-{(1S,2R)-2-metoxi-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 154). En un vial que contenía n.° 50 (100 mg, 0,152 mmol, 1,0 equiv.) y 1 ml de diclorometano, se añadió ácido 2,2-dimetil-3-(metilamino)propanoico (36 mg, 0,152 mmol, 1,0 equiv.), seguido de base de Hunig (0,080 ml, 0,456 mmol, 3,0 equiv.) y HATU (66 mg, 0,17 mmol, 1,1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentró al vacío y después se recogió en acetato de etilo antes de lavarse dos veces con HCl 1 M y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se decantó. La reacción se concentró al vacío. Se añadió dioxano (1 ml), seguido de HCl 4 M en dioxano (1,0 ml, 4,0 mmol, 26 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~12 horas. La reacción se concentró al vacío. El material en bruto se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 10 % a 100 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase), produciendo n.° 154 (55,8 mg, 41 % ) en forma de un sólido. CL-EM (Protocolo Q): m/z 771,8 [M+H+]. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 8 8,70 (d), 8,45 (d), 7,90-8,15 (m), 7,82 (d), 7,75 (d), 7,55 (dd), 7,40 (dd), 6,90-7,10 (m), 5,10-5,30 (m), 4,45-4,55 (a), 4,30-4,45 (m), 4,20-4,30 (m), 3,75-3,90 (m), 3,50-3,60 (m), 3,15-3,40 (m), 3,05-3,15 (m), 2,85-3,05 (m), 2,60-2,85 (m), 2,25-2,40 (m), 1,80-2,25 (m), 1,70-1,80 (m), 1,20-1,60 (m), 0,80-1,10 (m), 0,05-0,80 (m).
Preparación de W-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-dim etil-3-(metilamm o)propanoil]-L-valil}(metil)am ino]-3-metoxi-5-m etilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-m etilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 155).
Figure imgf000116_0001
Etapa 1. Síntesis de A/-{(2R,3R)-3-[(2S)-H(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-d¡met¡l-3-(met¡lam¡no)propanoil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 155). En un vial que contenía n.° 114 (96,2 mg, 0,152 mmol, 1,0 equiv.) y 1 ml de diclorometano, se añadió ácido 2,2-d¡met¡l-3-(met¡lam¡no)propano¡co (36,1 mg, 0,152 mmol, 1,0 equiv.), seguido de base de Hunig (0,080 ml, 0,456 mmol, 3,0 equiv.) y HATU (66 mg, 0,17 mmol, 1,1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentró al vacío y después se recogió en acetato de etilo antes de lavarse dos veces con HCl 1 M y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se decantó. La reacción se concentró al vacío. Se añadió dioxano (1 ml), seguido de HCl 4 M en dioxano (1,0 ml, 4,0 mmol, 26 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante ~12 horas. La reacción se concentró al vacío. El material en bruto se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 10 % a 100 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase), produciendo n.° 155 (22,2 mg, 17 % ) . RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 8 8,55 (d), 8,22 (d), 8,15-8,35 (m), 7,90-8,05 (m), 7,10-7,25 (m), 4,70-4,80 (m), 4,55-4,65 (m), 4,45-4,52 (m), 3,93-4,00 (m), 3,72-3,78 (m), 3,60-3,70 (m), 3,50-3,60 (m), 3,40-3,50 (m), 2,80-3,30 (m), 2,45-2,60 (m), 2,00-2,45 (m), 1,60-1,80 (m), 1,35-1,50 (m), 1,10 -1,35 (m).
Preparación de N-{(2R,3R)-3-m etoxi-3-[(2S)-1-{3R,4S,5S)-3-m etoxi-5-m etil-4-[m etil(N-{[(2S)-2-m etilpiperidm -2-il]carbonil}-L-valil)am ino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-m etilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 158) y N-{(2R,3R)-3-m etoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-m etoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)am ino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-m etilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 159)
Figure imgf000116_0002
Etapa 1. Síntesis de ácido pS^-^erc-butoxicarboml^-metNpipendin^-carboxíNco (n.° 156) y ácido (2R)-1-(tercbutoxicarbonil^-metilpiperidin^-carboxílico (n.° 157). Se separó ácido 1-(terc-butox¡carbon¡l)-2-met¡lp¡pe^d¡n-2-carboxílico (500 mg, 2,06 mmol, 1 equiv.) por cromatografía de fluidos supercríticos (Columna: Chiralcel OJ-H, 250 x 21 mm; Eluyente: 90:10 de dióxido de carbono/etanol; Caudal: 65 g/min; para dar los enantiómeros correspondientes. El primer pico de elusión (tiempo de retención = 1,57 minutos) se aisló para dar n.° 156 en forma de una goma (140 mg, 28 % ) (estereoquímica asignada arbitrariamente como el enantiómero S). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 3,83-3,90 (m, 1H), 2,93-3,01 (m, 1H), 1,87-1,97 (m, 1H), 1,67-1,77 (m, 3H), 1,48-1,66 (m, 2 h ), 1,46 (s, 3H), 1,44 (s, 9H). Rotación óptica: [a]D25 -21,7 ° (c 0,40, cloroformo). El segundo pico de elusión (tiempo de retención = 2,22 minutos) se aisló para dar n.° 157 en forma de un aceite (255 mg, 51 % ) (estereoquímica asignada arbitrariamente como el enantiómero R). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 3,83-3,90 (m, 1H), 2,93-3,01 (m, 1H), 1,87-1,97 (m, 1H), 1,67-1,77 (m, 3H), 1,48-1,66 (m, 2H), 1,46 (s, 3H), 1,44 (s, 9H).
Rotación óptica: [a]D25 30,2°(cloroformo).
Etapa 2A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 158). A una solución de n.° 156 (8,3 mg, 0,034 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (0,3 ml) y N,N-dimetilformamida (0,05 ml), se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,018 ml, 0,102 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (16,1 mg, 0,041 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se agitó durante 15 minutos y se añadió n.° 114 (23,4 mg, 0,037 mmol, 1,1 equiv.) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La reacción se diluyó con diclorometano (2,5 ml) y se añadió ácido cítrico al 10 % (1,5 ml). Las fases se separaron usando un cartucho de separación de fases y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 2,5 ml), y las fases orgánicas combinadas se concentraron al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (4 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (0,5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se concentró al vacío. La purificación por cromatografía de fase inversa (procedimiento M*) proporcionó n.° 158 (10,6 mg, 49 % ). HPLC (Protocolo T): m/z 758,4 [M+H+], tiempo de retención = 2,53 minutos (pureza >99 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da), 88,74­ 8,90 (m), 8,49-8,55 (m), 8,24 (d), 8,08-8,12 (m), 7,94-8,01 (m), 7,14-7,26 (m), 4,71-4,77 (m), 4,57-4,68 (m), 4,44­ 4,55 (m), 3,94-4,0 (m), 3,73-3,78 (m), 3,40-3,72 (m), 3,16-3,32 (m), 2,98-3,16 (m), 2,82-2,92 (m), 2,47-2,56 (m), 2,38-2,44 (m), 2,20-2,37 (m), 2,08-2,19 (m), 1,74-1,88 (m), 1,61-1,73 (m), 1,52-1,59 (m), 1,22 -1,52 (m), 1,05 (dd), 0,94-1,00 (m), 0,85-0,93 (m), 0,74-0,79 (m).
Etapa 2B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 159). A una solución de n.° 157 (7,8 mg, 0,032 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (0,3 ml) y NN-dimetilformamida (0,05 ml), se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,017 ml, 0,096 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (14,9 mg, 0,038 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se agitó durante 15 minutos y se añadió n.° 114 (22,1 mg, 0,035 mmol, 1,1 equiv.) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y después se concentró al vacío. La purificación del residuo por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 80 % de acetona en heptano) proporcionó un sólido de color blanco, que se disolvió en dioxano (0,2 ml) y se añadió HCl 4 N en dioxano (0,2 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se añadió más cantidad de HCl 4 N en dioxano (0,1 ml). La reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y se concentró al vacío. La purificación por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) proporcionó n.° 159 (6,6 mg, 33 % ) . HPLC (Protocolo T): m/z 758,4 [M+H+], tiempo de retención = 2,46 minutos (pureza = 89 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,86-8,95 (m), 8,75-8,84 (m), 8,48-8,54 (m), 8,33-8,45 (m), 8,22-8,27 (m), 8,17-8,19 (m), 7,99-8,12 (m), 7,83-7,91 (m), 7,13-7,29 (m), 7,04-7,08 (m), 4,69-4,76 (m), 4,55-4,66 (m), 4,45-4,53 (m), 3,96-4,01 (m), 3,41­ 3,78 (m), 3,28-3,33 (m), 3,24-3,27 (m), 3,16-3,23 (m), 3 ,11 -3 ,15 (m), 3,02-3,10 (m), 2,93-3,02 (m), 2,91-2,93 (m), 2,84-2,91 (m), 2,76-2,82 (m), 2,69-2,71 (m), 2,60-2,63 (m), 2,53-2,55 (m), 2,47-2,53 (m), 2,40-2,46 (m), 2,30-2,38 (m), 2,20-2,30 (m), 2,06-2,17 (m), 1,75-1,87 (m), 1,52-1,74 (m), 1,35-1,51 (m), 1,14 -1,34 (m), 1,01-1,08 (m), 0,92­ 1,0 (m), 0,85-0,94 (m), 0,74-0,82 (m).
Preparación de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metN-4-[metN(N-{[(2S)-2-metM-piperidm-2-il]carbonil}-L-valil)am ino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-m etilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (n.° 162), y N-£(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metM(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)am ino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-m etilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (n.° 163).
Figure imgf000117_0001
Etapa 1A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2S)-1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-piperidin-2-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 160). A una solución de n.° 156 (106 mg, 0,436 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (3 ml) y N,N-dimetilformamida (0,5 ml) se añadió diisopropiletilamina (0,228 ml, 1,31 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (205 mg, 0,523 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se agitó durante 15 minutos y se añadió n.° 114 (276 mg, 0,436 mmol, 1 equiv.) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se diluyó con diclorometano (10 ml) y se lavó con ácido cítrico al 10 % (3 x 5 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y el filtrado se concentró al vacío. La purificación del residuo por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 80 % de acetona en heptano) proporcionó n.° 160 (145 mg, 39 % ). CL-EM (protocolo Q1): m/z 858,8 [M+H+], tiempo de retención = 1,12 minutos.
Etapa 1B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2R)-1-(terc-butox¡carbon^¡l)-2-met^¡l-p^¡per^¡d^¡n-2-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirro¡idin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 161). A una solución de n.° 157 (109 mg, 0,448 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (3 ml) y N,N-dimetilformamida (0,5 ml), se añadió diisopropiletilamina (0,234 ml, 1,34 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (205 mg, 0,538 mmol, 1,2 equiv.). La reacción se agitó durante 15 minutos y se añadió n.° 114 (284 mg, 0,448 mmol, 1 equiv.). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla se diluyó con diclorometano (10 ml), se lavó con ácido cítrico al 10 % (3 x 5 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. La purificación del residuo por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 100 % de acetona en heptano) proporcionó n.° 161 (185 mg, 48 % ). CL-EM (Protocolo Q): m/z 858,3 [M+H+], tiempo de retención = 2,25 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metox¡-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-4-[met¡l(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (n.° 162). A una solución de n.° 1 6 0 (145 mg, 0,169 mmol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (1,25 ml) se añadió hidróxido de litio (8 mg, 0,338 mmol, 2 equiv.) disuelto en agua (0,75 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se evaporó a sequedad al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (2,5 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (1 ml). La reacción se agitó durante 30 minutos, se concentró al vacío y se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 0 % a 100 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase) para proporcionar el compuesto del título n.° 162 (145 mg, cuantitativo) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo U): m/z 744,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,121 minutos (pureza = 98 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da). 88,76-8,96 (m), 8,52-8,58 (m), 8,38-8,43 (m), 8 ,11-8,16 (m), 7,27-7,30 (m), 7,12 -7,27 (m), 7,01-7,05 (m), 4,71-4,79 (m), 4,48-4,67 (m), 4,39-4,47 (m), 3,79-4,22 (m), 3 ,71­ 3,78 (m), 3,38-3,57 (m), 3,22-3,30 (m), 3,14-3,23 (m), 3,07-3,13 (m), 2,96-3,06 (m), 2,76-2,87 (m), 2,66-2,68 (m), 2,47-2,57 (m), 2,42-2,44 (m), 2,06-2,40 (m), 1,73-1,89 (m), 1,51 -1,72 (m), 1,36-1,49 (m), 1,20-1,35 (m), 1,00-1,09 (m), 0,95-0,99 (m), 0,83-0,94 (m), 0,73-0,80 (m).
Etapa 2B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metox¡-3-{(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-me\^l-4-[met¡l(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (n.° 163). El compuesto n.° 161 (185 mg, 0,216 mmol, 1 equiv.) se convirtió en el compuesto del título en bruto n.° 163, usando el procedimiento descrito para la preparación de n.° 162. El material en bruto se purificó por cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 0 % a 85 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase) para producir n.° 163 (127 mg, 68 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo U): m/z 744,5 [M+H+], tiempo de retención = 7,077 minutos (pureza = 98 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6). 88,79-8,99 (m), 8,36-8,49 (m), 8 ,12-8 ,17 (m), 7,31-7,34 (m), 7 ,11-7 ,27 (m), 7,05-7,09 (m), 4 ,71­ 4,77 (m), 4,54-4,68 (m), 4,40-4,53 (m), 3,88-4,39 (m), 3,71-3,77 (m), 3,39-3,58 (m), 3,22-3,32 (m), 3,10-3,22 (m), 3,04-3,09 (m), 2,92-3,03 (m), 2,77-2,88 (m), 2,68-2,71 (m), 2,47-2,57 (m), 2,43-2,45 (m), 2,30-2,42 (m), 2,03-2,29 (m), 1,74-1,88 (m), 1,52-1,73 (m), 1,37-1,51 (m), 1,17 -1,37 (m), 1,00-1,07 (m), 0,95-0,99 (m), 0,84-0,93 (m), 0,73­ 0,81 (m).
Preparación de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-£(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidm -3-il]carbom l}-L-valil)(metil)am ino]-3-metoxi-5-m etilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-m etilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 172), y N-£(2R,3R)-3-[(2S)-1-£(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidm -3-il]carbonil}-L-valil)(m etil)am ino]-3-m etoxi-5-m etilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-m etoxi-2-m etilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 173).
Figure imgf000119_0001
Etapa 1. Síntesis de (3R)-1-bencil-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato de metilo (n.° 164) y (3S)-1-bencil-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato de metilo (n.° 165). Se preparó el 1-bencil-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato de metilo conocido (3900 mg, 16,4 mmol, 1 equiv.) por cromatografía de fluidos supercríticos (Columna: Chiralpak IC, 250 x 21 mm; Eluyente: 95:5 de dióxido de carbono/propanol; Caudal: 65 g/min; para dar los enantiómeros correspondientes. El primer pico de elusión (tiempo de retención = 3,37 minutos) se aisló para proporcionar n.° 164 (1720 mg, 36 % ) como un enantiómero individual (estereoquímica asignada arbitrariamente como enantiómero R). RMN 1H (400 MHz, TM S-CDCh; 6 7,17-7,30 (m, 5H), 3,74 (s, 3H), 3,65 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 3,63 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 2,86-3,03 (m, 3H), 2,61 (c, J = 8,0 Hz, 1H), 2,34-2,46 (m, 1H), 2,13-2,26 (m, 1H). Rotación óptica: [o]d25 24,7° (cloroformo). El segundo pico de elusión (tiempo de retención = 3,91 minutos) se aisló para proporcionar n.° 165 (1600 mg, 33 % ) como un enantiómero individual (estereoquímica asignada arbitrariamente como enantiómero S). RMN 1H (400 MHz, CDCh. (CH3 )4 Si), 6 7,17-7,30 (m, 5H), 3,74 (s, 3H), 3,65 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 3,63 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 2,86-3,03 (m, 3H), 2,61 (c, J = 8,0 Hz, 1H), 2,34-2,46 (m, 1H), 2,13-2,26 (m, 1H). Rotación óptica: [o]d25 -23 ,3 ° (cloroformo).
Etapa 2A. Síntesis de (3R)-3-fluoropirrolidin-1,3-dicarboxilato de 3-metil 1-terc-butilo (n.° 166). A una solución que contenía n.° 164 (355 mg, 1,50 mmol, 1 equiv.) y carbonato de di-terc-butilo (400 mg, 1,8 mmol, 1,2 equiv.) en metanol (15,5 ml) se añadió Pd al 10 % /C (70 mg). La reacción se hidrogenó a 0,34 MPa (45 psi) en un agitador Parr durante 22 horas, se filtró sobre celite y el filtrado se concentró al vacío y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 30 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 166 en forma de un aceite transparente. (272 mg, 74 % ). RMN 1H (400 MHz, CDCh), 6 3,87 (s, 3H), 3,85-3,66 (m, 3H), 3,56 (m, 1H), 2,53-2,28 (m, 2H), 1,51 (s, 9H).
Etapa 2B. Síntesis de (3S)-3-fluoropirrolidin-1,3-dicarboxilato de 3-metil 1-terc-butilo (n.° 167). El compuesto n.° 165 (362 mg, 1,53 mmol, 1 equiv.) se convirtió en n.° 167 con un rendimiento del 63 % , usando el procedimiento descrito anteriormente para n.° 164. RMN 1H (400 MHz, CDCls), 63,87 (s, 3H), 3,85-3,66 (m, 3H), 3,56 (m, 1H), 2,53-2,28 (m, 2H), 1,51 (s, 9H).
Etapa 3A. Síntesis de ácido (3R)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxílico (n.° 168). A una solución de n.° 166 (272 mg, 1,10 mmol, 1 equiv.) disuelto en metanol (2,96 ml) se añadió una solución acuosa de hidróxido sódico (2,5 M, 0,88 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas. La reacción se interrumpió con ácido cítrico acuoso al 10 % (5 ml), se añadió acetato de etilo (100 ml) y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con ácido cítrico al 10 % , agua y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar n.° 168 en forma de un sólido de color blanco. (253 mg, 99 % ). RMN 1H (400 MHz, CDCls), 63,96-3,69 (m, 3H), 3,59 (m, 1H), 2,59-2,33 (m, 2H), 1,51 (s, 9H). CL-EM (Protocolo Q1): m/z 232,1 [M-H+], tiempo de retención = 0,67 minutos. tiempo de retención de HPLC quiral: 3,39 min (pureza = 99 %). (Columna: Chiralpak AD-H, 4,6 mm x 25 cm, fase móvil CO 2 al 5-60 %/Metanol, caudal 3,0 ml/min); Rotación óptica: [o]d25 4,8 (c = 0,52, MeOH)
Etapa 3B. Síntesis de ácido (3S)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxílico (n.° 169). A una solución de n.° 167 (238 mg, 0,963 mmol, 1 equiv.) disuelto en metanol (2,6 ml) se añadió una solución acuosa de hidróxido sódico (2,5 M, 0,88 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después, la reacción se interrumpió con ácido cítrico acuoso al 10 % (5 ml) y se añadió acetato de etilo (100 ml), y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con ácido cítrico al 10 % , agua y salmuera, después se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar n.° 169 en forma de un sólido de color blanco (221 mg, 9 9 % ). RMN 1H (400 MHz, CDCh), 6 3,96-3,69 (m, 3H), 3,59 (m, 1H), 2,59-2,33 (m, 2H), 1,51 (s, 9H). CL-EM (Protocolo Q1): m/z 232,1 [M-H+], tiempo de retención = 0,67 minutos. tiempo de retención de HPLC quiral: 3,95 min (pureza = 98 % ) (Columna: Chiralpak AD-H, 4,6 mm x 25 cm, fase móvil CO 2 al 5-60 %/Metanol, caudal 3,0 ml/min); Rotación óptica: [o]d25 -3,6 (c = 0,55, MeOH)
Etapa 4A. Síntesis de (3R)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato de litio (n.° 170). A una solución de n.° 168 (50 mg, 0,21 mmol, 1 equiv.) en metanol (0,2 ml) se añadió una solución de hidróxido de litio (9,2 mg, 0,38 mmol, 1,8 equiv.) disuelto en agua (0,1 ml). A continuación, se añadió tetrahidrofurano (0,3 ml) y la reacción se agitó a 45 °C durante 18 horas. La reacción se concentró al vacío y el material se destiló azeotrópicamente (3 x) con tolueno (2 ml) para obtener n.° 170 (51 mg, 100 % ) en forma de un sólido de color blanco, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 4B. Síntesis de (3S)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato de litio (n.° 171). A una solución de n.° 169 (75 mg, 0,32 mmol, 1 equiv.) en metanol (0,3 ml) se añadió una solución de hidróxido de litio (13,8 mg, 0,572 mmol, 1,8 equiv.) en agua (0,4 ml). A continuación, se añadió tetrahidrofurano (0,45 ml ) y la reacción se agitó a 45 °C durante 18 horas. La reacción se concentró al vacío y el material se destiló azeotrópicamente (3 x) con tolueno (4 ml) para obtener n.° 171 (77 mg, 100 % ) en forma de un sólido de color blanco, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 5A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 172). A una suspensión de n.° 168 (36,9 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) y n.° 114 (100 mg, 0,158 mmol, 1,0 equiv.) en N,N-dimetilformamida (0,8 ml) y diclorometano (3,6 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,083 ml, 0,474 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (60,7 mg, 0,158 mmol, 1,0 equiv.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con agua, ácido cítrico acuoso al 10 % (P/V) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío para dar 220 mg (164 % del teórico) de un intermedio en bruto. Una porción de este intermedio en bruto (50 mg, 23 % ) se disolvió en diclorometano (1,5 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (0,4 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se evaporó a sequedad al vacío. La purificación por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) proporcionó n.° 172 (15,8 mg, 51 % ) CL-EM (Protocolo Q): m/z 748,9 [M+H+], tiempo de retención = 1,29 minutos. RMN 1H (DMSO-d6), 89,16-9,43 (m), 8,48­ 8,53 (m), 8,40-8,44 (m), 8,34-8,39 (m), 8,22-8,30 (m), 8,09-8,16 (m), 7,87-7,91 (m), 7,77-7,83 (m), 7,12-7,24 (m), 4,56-4,72 (m), 4,41-4,54 (m), 3,92-4,00 (m), 3,70-3,75 (m), 3,39-3,66 (m), 3,20-3,25 (m), 3,12-3,20 (m), 2,97-3,11 (m), 2,94 (s a), 2,75-2,89 (m), 2,63-2,69 (m), 2,47-2,54 (m), 2,29-2,45 (m), 2 ,15 -2,27 (m), 2,02-2,15 (m), 1,57­ 1,87 (m), 1,33-1,51 (m), 1,19 -1,30 (m), 1,02 (dd), 0,82-0,97 (m), 0,70-0,79 (m).
Etapa 5B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de ácido trifluoroacético (n.° 173). A una suspensión de n.° 169 (36,9 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) y n.° 114 (100,0 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) en N,N-dimetilformamida (0,8 ml) y diclorometano (3,6 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,083 ml, 0,474 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (60,7 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas, se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con agua, ácido cítrico acuoso al 10 % (P/V) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío para dar 180 mg (134 % del teórico) de un intermedio en bruto. Una porción de éster intermedio en bruto (50 mg, 27 % ) se disolvió en diclorometano (1,5 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (0,4 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se evaporó a sequedad al vacío. La purificación por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) proporcionó n.° 173 (17,6 mg, 45 % ) . CL-EM (Protocolo Q): m/z 748,9 [M+H+]; tiempo de retención =1,29 minutos. RMN 1H (DMSO-d6) 89,35-9,50 (m), 9,22­ 9,34 (m), 8,47-8,52 (m), 8,39-8,45 (m), 8,30-8,37 (m), 8,22-8,24 (m), 8,09-8,13 (m), 7,80-7,85 (m), 7,67-7,72 (m), 7,09-7,24 (m), 6,97-6,98 (m), 4,65-4,72 (m), 4,55-4,64 (m), 4,41-4,50 (m), 3,92-3,99 (m), 3,42-3,75 (m), 3,32-3,39 (m), 3,25-3,31 (m), 3,21-3,24 (m), 3,11-3 ,20 (m), 3,06-3,11 (m), 2,97-3,05 (m), 2,95 (s a), 2,83-2,88 (m), 2,76­ 2,82 (m), 2,65-2,70 (m), 2,44-2,54 (m), 2,15 -2,42 (m), 2,02-2,14 (m), 1,57-1,84 (m), 1,33-1,48 (m), 1,19 -1,30 (m), 1,02 (dd), 0,92-0,97 (m), 0,82-0,91 (m), 0,70-0,77 (m).
Preparación de (2S)-N -[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[2-(dclohepta-2A6-trien-1-il)etil]am m o}-1-metoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il](m etil)am ino}-3-m etil-1-oxobutan-2 - il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal clorhidrato (n.° 178), y (2R)-N -[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3 - {[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1 -m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il](m etil)amino}-3-m etil-1-oxobutan-2-il]-2-metil-piperidin-2-carboxam ida, sal clorhidrato (n.° 180).
Figure imgf000121_0001
Etapa 1. Síntesis de (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoato de pentafluorofenilo (n.° 174). A una solución de n.°@5 (19,43 g, 37,03 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (100 ml) y piridina (5,86 g, 74,1 mmol, 2 equiv.) se añadió trifluoroacetato de pentafluorofenilo (20,7 g, 74,1 mmol, 2 equiv.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentró al vacío y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 52 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 174 (23,58 g, 92 % ) en forma de un aceite de color amarillo. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 691,2 [M+H+], tiempo de retención = 1,23 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetox¡)carbon¡l]-A/-met¡l-L-valinamida (n.° 175). A una solución de n.° 174 (706 mg, 1,02 mmol, 1 equiv.) y n.° 64 (311 mg, 1,02 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (3 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (400 mg, 3,07 mmol, 3 equiv.). Después de 18 horas de agitación a temperatura ambiente, la reacción se concentró al vacío y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 100 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 175 (560 mg, 68 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 611,8 [M+H+], tiempo de retención = 1,15 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 176). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de n.° 175 (560 mg, 0,690 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (9 ml) y N,N-dietilamina (6,0 ml), se sintetizó el compuesto deseado en bruto, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 50 % de metanol en diclorometano) para proporcionar n.° 176 (351 mg, 87 % ) en forma de un aceite de color amarillo. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 589,5 [M+H+], tiempo de retención = 0,72 minutos.
Etapa 4A. Síntesis de (2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 177). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 176 (100 mg, 0,170 mmol, 1 equiv.), n.° 156 (53,8 mg, 0,221 mmol, 1,3 equiv.), diclorometano (4,5 ml), HATU (84,9 mg, 0,221 mmol, 1,3 equiv.) y N,N-diisopropiletilamina (0,123 ml, 0,697 mmol, 4,1 equiv.), se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 100 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 177 (145 mg, asumido rendimiento cuantitativo) en forma de un sólido de color blanco. C l - e M (Protocolo Q1): m/z 814,7 [M+H+], tiempo de retención = 1,14 minutos.
Etapa 4B. Síntesis de (2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 179). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 176 (100 mg, 0,170 mmol, 1 equiv.), n.° 157 (53,8 mg, 0,221 mmol, 1,3 equiv.), diclorometano (4,5 ml), HATU (84,9 mg, 0,221 mmol, 1,3 equiv.) y N,N-diisopropiletilamina (0,123 ml, 0,697 mmol, 4,1 equiv.), se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 100 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 179 (155 mg, asumido rendimiento cuantitativo) en forma de un sólido de color blanco. C l - e M (Protocolo Q1): m/z 814,7 [M+H+], tiempo de retención = 1,14 minutos.
Etapa 5A. Síntesis de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal clorhidrato (n.° 178). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 177 (143 mg, 0,176 mmol, 1 equiv.) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (2,0 ml) se sintetizó el material deseado en forma de una goma (145 mg). Una porción de este residuo en bruto (25 mg) se destiló azeotrópicamente con una mezcla de metanol/acetonitrilo para proporcionar n.° 178 (20 mg, rendimiento del 89 % ) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 58,96-9,07 (m), 8,79-8,96 (m), 8,58 (d), 8,02-8,08 (m), 7,77-7,83 (m), 7,25-7,31 (m), 7,19-7,24 (m), 6,56-6,67 (m), 6,12-6,21 (m), 5,13-5,22 (m), 4,72­ 4,81 (m), 4,63-4,70 (m), 4,50-4,59 (m), 4,07-4,16 (m), 3,98-4,05 (m), 3,80-3,86 (m), 3,55-3,76 (m), 3,46-3,54 (m), 3,38 -3,44 (m), 3,26-3,35 (m), 3,18-3,24 (m), 3,05-3,18 (m), 2,98-3,04 (m), 2,40-2,55 (m), 2,27-2,35 (m), 2,08­ 2,27 (m), 1,74-1,98 (m), 1,50-1,74 (m), 1,20-1,46 (m), 0 ,73-1,16 (m). CL-EM (Protocolo Q1): m/z 714,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,76 minutos. H PLC (Protocolo U): m/z 714,5 [M+H+]; tiempo de retención = 7,124 minutos (pureza = 91 % ).
Etapa 5B. Síntesis de (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1 -oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal clorhidrato (n.° 180). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 179 (162 mg, 0,199 mmol, 1 equiv.) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (2,0 ml) se sintetizó el material deseado en forma de una goma (155 mg). Una porción de esta goma (25 mg) se destiló azeotrópicamente con una mezcla 1/1 de metanol/acetonitrilo para proporcionar n.° 180 (20 mg, 83 % ) en forma de un sólido. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d5), 5 9,02-9,13 (m), 8,83-8,93 (m), 8,39-8,46 (m), 8,00-8,06 (m), 7,78 (t), 7,24-7,30 (m), 7,16 -7,21 (m), 6,54-6,65 (m), 6,09-6,19 (m), 5 ,11-5 ,18 (m), 4,69-4,78 (m), 4,59-4,68 (m), 4,46­ 4,56 (m), 4,08-4,13 (m), 3,95-4,03 (m), 3,77-3,85 (m), 3,54-3,73 (m), 3,43-3,53 (m), 3,37-3,42 (m), 3,24-3,33 (m), 3,16-3,22 (m), 3,03-3,15 (m), 2,99-3,02 (m), 2,89-2,98 (m), 2,65-2,76 (m), 2,41-2,54 (m), 2,15-2,39 (m), 2,07-2,15 (m), 1,51-1,94 (m), 1,49 (d), 1,38 (t), 1,20 -1,32 (m), 1,02-1,09 (m), 0,84-0,97 (m), 0,73-0,81 (m). CL-EM (Protocolo Q1): m/z 714,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,76 HPLC (Protocolo U): m/z 714,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,409 minutos (pureza = 90 % ).
Preparación de 2-m etil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2A6-trien-1-il)etil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N-m etil-L-valm am ida, sal de ácido fórmico (n.° 182), y N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carboml}-N-m etil-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 184) y N-[(3R,4s ,5s )-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3S )-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N -m etil-L-valinam ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 186).
Figure imgf000122_0001
Etapa 1A. Síntesis de 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 1 8 1 ). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 176 (100 mg, 0,170 mmol, 1 equiv.), (S)-1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (50,7 mg, 0,221 mmol, 1,3 equiv.), diclorometano (4,3 ml), HATU (84,9 mg, 0,221 mmol, 1,3 equiv.) y N,N-diisopropiletilamina (0,123 ml, 0,697 mmol, 4,1 equiv.), se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0 a 100 % de acetato de etilo en heptano) para proporcionar n.° 181 (142 mg, asumido rendimiento cuantitativo). C L-EM (Protocolo Q1): m/z 800,6 [M+H+], tiempo de retención = 1,11 minutos.
Etapa 1B. Síntesis de (3R)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1 -oxobutan-2-il]carbamoil}-3-fluoropirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 183). A una solución de n.° 170 (18,2 mg, 0,076 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (1,8 ml) y N,N-dimetilformamida (0,3 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,040 ml, 0,228 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (29,2 mg, 0,076 mmol, 1 equiv.). Después de agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió n.° 176 (45 mg, 0,076 mmol, 1 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se añadió más cantidad de HATU (29 mg, 0,076 mmol, 1 equiv.).
Después de 8 horas, la reacción se concentró al vacío para proporcionar n.° 183 (61,0 mg, cuantitativo), que se recogió en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 826,6 [M+Na+], tiempo de retención = 1,05 minutos.
Etapa 1C . Síntesis de (3S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-3-fluorociclopentanocarboxilato de terc-butilo (n.° 185). A una solución de n.° 171 (24 mg, 0,1 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (2,35 ml) y W,W-dimetilformamida (0,33 ml) se añadió A/,W-diisopropiletilamina (0,053 ml, 0,300 mmol, 3 equiv.), seguido de HATU (38,4 mg, 0,100 mmol, 1 equiv.). Después de agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadió n.° 176 (58,9 mg, 0,1 mmol, 1 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se añadió más cantidad de HATU (38,4 mg, 0,100 mmol, 1 equiv.) y W,W-dimetilformamida (0,2 ml) y se agitó durante 9 horas más. La reacción se concentró al vacío para dar n.° 185 (80 mg, cuantitativo), que se recogió en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 804,6 [M+H+], tiempo de retención = 1,05 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida, sal de ácido fórmico (n.° 182). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 181 (136 mg, 0,170 mmol, 1 equiv.) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (2 ml) se sintetizó el material deseado en forma de una goma (142 mg). Una porción de este residuo en bruto (20 mg, 14 % ) se destiló azeotrópicamente con una mezcla 1/1 de metanol/acetonitrilo y después se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento O) para obtener n.° 182 (10 mg, 57 % en dos etapas) en forma de un sólido. HPLC (Protocolo U): m/z 700,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,106 minutos (pureza > 90 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de), 88,25­ 8,39 (m), 8,20-8,25 (m), 7,96-7,99 (m), 7,74-7,77 (m), 6,55-6,63 (m), 6,10-6,18 (m), 5 ,11-5 ,18 (m), 4,66-4,72 (m), 4,51-4,61 (m), 4,46-4,50 (m), 3,96-4,01 (m), 3,37-3,86 (m), 3,20-3,36 (m), 3 ,11-3 ,19 (m), 3,03-3,11 (m), 2,98-3,03 (m), 2,90-2,96 (m), 2,77-2,79 (m), 2,65-2,73 (m), 2,57-2,63 (m), 2,47-2,56 (m), 2,36-2,46 (m), 2,26-2,32 (m), 2 ,14 ­ 2,25 (m), 2,03-2,10 (m), 1,92-2,03 (m), 1,72 -1,92 (m), 1,64-1,72 (m), 1,60-1,64 (m), 1,50-1,59 (m), 1,39-1,48 (m), 1,23 -1,32 (m), 1,18 -1,22 (m), 1,12 -1,14 (m), 1,01-1,09 (m), 0,83-1,00 (m), 0,74-0,83 (m), 0,70-0,74 (m).
Etapa 2B. Síntesis de sal de ácido trifluoroacético de W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-A/-metil-L-valinamida (n.° 184). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 183 (61,1 mg, 0,076 mmol, 1 equiv.), diclorometano (0,3 ml) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (0,9 ml) se sintetizó el material en bruto deseado (140 mg). Una porción del material en bruto (98 mg, 69 % ) se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para dar n.° 184 (7,6 mg, 20 % en dos etapas). HPLC (Protocolo T): m/z 704,5 [M+H+], tiempo de retención = 2,50 minutos (pureza = 84 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de), 88,67-8,71 (m), 8,44-8,48 (m), 8,27-8,33 (m), 8,22-8,27 (m), 7,97-8,03 (m), 7,84-7,89 (m), 7,74-7,81 (m), 7,43-7,48 (m), 7,23-7,29 (m), 7,17-7,21 (m), 6,55-6,66 (m), 6,10-6,19 (m), 5,10-5,19 (m), 4,66-4,75 (m), 4,51-4,63 (m), 3,96-4,04 (m), 3,78-3,85 (m), 3,65-3,73 (m), 3,46-3,62 (m), 3,37-3,45 (m), 3,24-3,37 (m), 3 ,21­ 3,24 (m), 3,13-3,21 (m), 3,02-3,13 (m), 2,95-3,00 (m), 2,80-2,82 (m), 2,66-2,71 (m), 2,47-2,57 (m), 2,24-2,46 (m), 2,09-2,24 (m), 1,95-2,05 (m), 1,49-1,93 (m), 1,22-1,34 (m), 1,02-1,09 (m), 0,83-1,01 (m), 0,74-0,82 (m).
Etapa 2C. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-W-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 186). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 185 (80,3 mg, 0,1 mmol, 1 equiv.), diclorometano (0,4 ml) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (1,2 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, en el que se purificó una porción (94 mg, 53 % ) por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para dar n.° 186 (11,8 mg, 32 % en dos etapas). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de), 88,85-9,07 (m), 8,29-8,41 (m), 7,99-8,04 (m), 7,76-7,84 (m), 6,56-6,68 (m), 6,12-6,21 (m), 5 ,12 ­ 5,21 (m), 4,87-4,99 (m), 4,69-4,79 (m), 4,49-4,67 (m), 3,98-4,06 (m), 3,80-3,87 (m), 3,64-3,76 (m), 3,55-3,64 (m), 3,47-3,54 (m), 3,39-3,46 (m), 3,26-3,39 (m), 3,22-3,25 (m), 3,18-3,22 (m), 3,06-3,14 (m), 2,98-3,01 (m), 2,55-2,57 (m), 2,42-2,49 (m), 2,11-2 ,38 (m), 2,09 (s), 1,78-1,97 (m), 1,72 -1,77 (m), 1,51 -1,71 (m), 1,24-1,36 (m), 1,07 (dd), 0,83-1,03 (m), 0,75-0,82 (m). Hp LC (Protocolo T): m/z 704,5 [M+H+], tiempo de retención = 2,48 minutos (pureza = 100 %).
Preparación de (2S)-N -[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-m etoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fem l-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]am ino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-m etil-1-oxoheptan-4-il](m etil)am m o}-3-m etil-1-oxobutan-2-il]-2-m etilpiperidin-2-carboxam ida, sal formiato (n.° 188), y (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-m etoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]am ino}propil]pirrolidin-1-il}-5-m etil-1-oxoheptan-4-il](m etil)amino}-3-m etil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal formiato (n.° 190) y N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-m etoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fem l-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]am m o}propil]pirrolidm -1-il}-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N-m etil-L-valm am ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 192) y N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidm -3-il]carbom l}-N-[(3R,4S,5S)-3-m etoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]am ino}propil]pirrolidin-1-il}-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N-m etil-L-valinam ida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 194).
Figure imgf000124_0001
Etapa 1A. Síntesis de (2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1,3-tiazol-2-M)etM]amino}propM]pirroMdin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato de tere-butilo (n.° 187). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 86 (280 mg, 0,4 mmol, 1 equiv.), n.° 156 (100 mg, 0,4 mmol, 1 equiv.), diclorometano (5 ml), HATU (182 mg, 0,48 mmol, 1,2 equiv.) y NN-diisopropiletilamina (100 mg, 0,8 mmol, 2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0,01 a 0,05 % de metanol en diclorometano) para proporcionar n.° 187 (220 mg, 62 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo V ) : m/z 883,57 [m H+], tiempo de retención = 3,23 minutos (pureza = 95 % ).
Etapa 1B. Síntesis de (2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 189). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 86 (400 mg, 0,6 mmol, 1 equiv.), n.° 157 (146 mg, 0,6 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml), HATU (259 mg, 0,72 mmol, 1,2 equiv.) y NN-diisopropiletilamina (158 mg, 1,2 mmol, 2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Gradiente: de 0,01 a 0,05 % de metanol en diclorometano) para proporcionar n.° 189 (220 mg, 37 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo W ) : m/z 883,7 [M+H+], tiempo de retención = 4,12 minutos (pureza = 95 % ).
Etapa 1C . Síntesis de (3R)-3-fluoro-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 191). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 86 (300 mg, 0,45 mmol, 1 equiv.), n.° 168 (106 mg, 0,45 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml), HATU (194 mg, 0,54 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (117 mg, 0,9 mmol, 2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Proeedimiento P) para proporcionar n.° 191 (159 mg, 40 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo X): m/z 873,4 [M+H+], tiempo de retención = 3,32 minutos (pureza = 99 % ).
Etapa 1D. Síntesis de (3S)-3-fluoro-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo (n.° 193). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de n.° 86 (300 mg, 0,45 mmol, 1 equiv.), n.° 169 (106 mg, 0,45 mmol, 1 equiv.), diclorometano (10 ml), HATU (194 mg, 0,54 mmol, 1,2 equiv.) y diisopropiletilamina (117 mg, 0,9 mmol, 2 equiv.) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Proeedimiento P) para proporcionar n.° 193 (149 mg, 37 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo X): m/z 873,4 [M+H+], tiempo de retención = 3,34 minutos (pureza = 98 % ).
Etapa 2A. Síntesis de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal de ácido fórmico (n.° 188). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 187 (20 mg, 0,023 mmol, 1 equiv.), diclorometano (0,1 ml), acetonitrilo (0,1 ml) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (0,26 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Proeedimiento N*) para obtener n.° 188 (11,6 mg, 61 % ,); Hp LC (Protocolo T): m/z 783,8 [M+H+], tiempo de retención = 2,53 minutos (pureza = 96 % ). R m N 1H (400 MHz, D M S O d ), 5 8,82-8,87 (m), 8,60-8,63 (m), 8,26-8,29 (m), 7,84-7,90 (m), 7,75-7,81 (m), 7,60-7,67 (m), 7,21-7,31 (m), 7,14 -7,19 (m), 5,49-5,55 (m), 5,37-5,42 (m), 4,69-4,75 (m), 4,59-4,65 (m), 4,50-4,56 (m), 3,95-4,01 (m), 3,77-3,82 (m), 3,54-3,61 (m), 3,47­ 3,53 (m), 3,24-3,45 (m), 3,14-3,23 (m), 3,03-3,08 (m), 2,96-3,03 (m), 2,78-2,80 (m), 2,64-2,73 (m), 2,60-2,62 (m), 2,47-2,56 (m), 2,31-2,45 (m), 2,13-2,28 (m), 2,00-2,07 (m), 1,92-1,99 (m), 1,71-1,86 (m), 1,58-1,70 (m), 1,50-1,56 (m), 1,38-1,49 (m), 1,15 -1,36 (m), 1,08-1,14 (m), 1,03-1,07 (m), 0,90-1,02 (m), 0,83-0,90 (m), 0,73-0,80 (m), 0,70­ 0,73 (m).
Etapa 2B. Síntesis de (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-¡l]-2-metilp¡per¡d¡n-2-carboxam¡da, sal de ácido fórmico (n.° 190). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 189 (20 mg, 0,022 mmol, 1 equiv.), diclorometano (0,1 ml), acetonitrilo (0,1 ml) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (0,26 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento N*) para obtener n.° 190 (13,2 mg, 73 % ), HPLC (Protocolo T): m/z 783,7 [M+H+], tiempo de retención = 2,5 minutos (pureza = 100 % ). r Mn 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,83-8,86 (m), 8,60-8,62 (m), 8,24-8,27 (m), 7,83-7,89 (m), 7,78-7,80 (m), 7,75-7,77 (m), 7,64-7,66 (m), 7,60-7,63 (m), 7,20-7,31 (m), 7 ,13 ­ 7,19 (m), 5,49-5,55 (m), 5,36-5,42 (m), 4,65-4,74 (m), 4,60-4,65 (m), 4,50-4,56 (m), 3,95-4,01 (m), 3,76-3,81 (m), 3,53-3,62 (m), 3,47-3,52 (m), 3,22-3,45 (m), 3,14-3,21 (m), 2,97-3,05 (m), 2,93-2,96 (m), 2,79-2,86 (m), 2,76-2,78 (m), 2,65-2,68 (m), 2,48-2,56 (m), 2,37-2,43 (m), 2,29-2,35 (m), 2,17 -2 ,27 (m), 2,04-2,11 (m), 1,93-2,00 (m), 1,70­ 1,85 (m), 1,53-1,69 (m), 1,36-1,48 (m), 1,28-1,36 (m), 1,13 -1,26 (m), 1,08 -1,12 (m), 0,98-1,07 (m), 0,91-0,97 (m), 0,84-0,91 (m), 0,73-0,78 (m).
Etapa 2C. Síntesis de N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrol¡d¡n-3-¡l]carbon¡l}-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)etil]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 192). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 191 (10 mg, 0,011 mmol, 1 equiv.), diclorometano (0,1 ml), acetonitrilo (0,1 ml) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (0,13 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para obtener n.° 192 (5,1 mg, 60 % ), HPLC (Protocolo T): m/z 773,5 [M+H+], tiempo de retención = 2,43 minutos (pureza = 100 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,32-9,44 (m), 9,17-9,21 (m), 8,91 (d), 8,63-8,69 (m), 8,38-8,43 (m), 8,22-8,27 (m), 7,80 (dd), 7,66 (dd), 7,14-7,33 (m), 5,49-5,57 (m), 5,37­ 5,45 (m), 4,10-4,78 (m), 3,97-4,06 (m), 3,77-3,83 (m), 3,33-3,65 (m), 3,15-3,29 (m), 2,95-3,09 (m), 2,82-2,83 (m), 2,67-2,71 (m), 2,55-2,57 (m), 2,32-2,54 (m), 2,10-2,31 (m), 2,09 (s), 1,72-1,90 (m), 1,57-1,72 (m). 1,38-1,50 (m), 1,15 -1,38 (m), 1,09 (dd), 0,85-1,0 (m), 0,75-0,83 (m).
Etapa 2D. Síntesis de N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrol¡d¡n-3-¡l]carbon¡l}-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-{[(1S)-2-fen¡l-1-(1,3-t¡azol-2-¡l)etil]am¡no}prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 194). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de n.° 193 (10 mg, 0,011 mmol, 1 equiv.), diclorometano (0,1 ml), acetonitrilo (0,1 ml) y una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (0,13 ml) se sintetizó el material en bruto deseado, que se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para obtener n.° 194 (9 mg, 93 % ), HPLC (Protocolo T): m/z 773,8 [M+H+], tiempo de retención = 2,42 minutos (pureza = 100 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,39-9,52 (m), 9,21-9,35 (m), 8,90 (d), 8,63-8,69 (m), 8,42-8,48 (m), 8,29 -8,34 (m), 7,80 (dd), 7,66 (dd), 7,22-7,33 (m), 7,13-7,21 (m), 5,47-5,57 (m), 5,36-5,44 (m), 4,43-4,93 (m), 3,97-4,05 (m), 3,64-3,83 (m), 3,32-3,61 (m), 3,15-3,29 (m), 3,06-3,09 (m), 2,95-3,05 (m), 2,89-2,95 (m), 2,82-2,84 (m), 2,67-2,72 (m), 2,54-2,56 (m), 2,48-2,53 (m), 2,28-2,48 (m), 2 ,11 ­ 2,28 (m), 2,09 (s), 1,57 -1,72 (m), 1,38-1,47 (m), 1,15 -1,37 (m), 1,09 (dd), 0,85-0,99 (m), 0,78 (t).
Preparación de 1,2-dim etil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(2S)-3-(4-am m ofem l)-1-m etoxi-1-oxopropan-2-il]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1-il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N-m etil-L-valinam ida, sal formiato (n.° 200), y 1,2-dim etil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(2S)-3-(4-am inofenil)-1-m etoxi-1-oxopropan-2-il]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam ida, sal formiato (n.° 201).
Figure imgf000126_0001
Etapa 1. Síntesis de 1,2-d¡met¡l-D-prol¡l-W-[(3R,4S,5S)-1-terc-butox¡-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-valinamida (n.° 195). De acuerdo con el proced¡m¡ento general D, a part¡r de n.° 6 (7,75 g, 21,6 mmol, 1 equ¡v.), n.° 152 (3,88 g, 21,6 mmol, 1 equ¡v.), d¡clorometano (100 ml), HATU (9,8 g, 25,9 mmol, 1,2 equ¡v.) y d¡¡soprop¡let¡lam¡na (11,1 g, 86,4 mmol, 4 equ¡v.) se s¡ntet¡zó el mater¡al en bruto deseado, que se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de sílice (Grad¡ente: de 20 a 55 % de acetato de et¡lo en éter de petróleo) para proporc¡onar n.° 195 (11,1 g, rend¡m¡ento cuant¡tat¡vo) en forma de un ace¡te de color amar¡llo.
Etapa 2. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-D-prol¡l-W-[(2R,3S,4S)-1-carbox¡-2-metox¡-4-met¡lhexan-3-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 196). De acuerdo con el proced¡m¡ento general B, a part¡r de n.° 195 (11,1 g, 21,6 mmol, 1 equ¡v.), d¡clorometano (100 ml) y ác¡do tr¡fluoroacét¡co (40 ml), se s¡ntet¡zó el mater¡al en bruto deseado, para obtener n.° 196 (10,1 g, rend¡m¡ento cuant¡tat¡vo) que se usó en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal. CL-EM (Protocolo Z): m/z 428,5 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,9 m¡nutos.
Etapa 3. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-D-prol¡l-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxo-1-(pentafluorofenox¡)heptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 197). A una soluc¡ón enfr¡ada (0 °C) de n.° 196 (4,0 g, 9,4 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (40 ml) se añad¡ó gota a gota p¡r¡d¡na (2,95 g, 37,6 mmol, 4 equ¡v.), segu¡do de una soluc¡ón de tr¡fluoroacetato de pentafluorofen¡lo (3,9 g, 13,6 mmol, 1,4 equ¡v.) en d¡clorometano (5 ml). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante una hora y el d¡solvente se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 1 a 10 % de metanol en d¡clorometano) para proporc¡onar el compuesto n.° 197 (4,5 g, 81,2 % (en tres etapas) en forma de un sól¡do de color blanco.
Etapa 4. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-D-prol¡l-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carbox¡-1-metox¡prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 198). A una soluc¡ón enfr¡ada (0 °C) de n.° 197 (4,0 g, 7,4 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (25 ml) se añad¡ó gota a gota d¡¡soprop¡let¡lam¡na (3,4 g, 26,3 mmol, 3,5 equ¡v.), segu¡do de una soluc¡ón de n.° 103 (2,3 g, 7,6 mmol, 1,02 equ¡v.) en d¡clorometano (15 ml). Después de la ad¡c¡ón, la mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 16 horas y el d¡solvente se ret¡ró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 1 a 10 % de metanol en d¡clorometano), segu¡do de una segunda pur¡f¡cac¡ón por cromatografía de fase ¡nversa (Procedimiento Q) para dar n.° 198 (1,57 g, 57,5 % ) en forma de un sól¡do de color blanco HPLC (Protocolo X): m/z 597,49 [M+H+]; t¡empo de retenc¡ón = 8,879 m¡nutos (pureza = 98 % ). t¡empo de retenc¡ón de HPLC qu¡ral: 3,328 m¡n (pureza = 98 % ); Columna: Columna: Ch¡ralcel OJ-H, 250 x 4,6 mm, 5 pm; Fase móv¡l: metanol (0,05 % de d¡et¡lam¡na) en C O 2 del 5 % al 40 % durante 15 m¡nutos; Caudal: 2,35 ml/m¡nuto.
Etapa 5. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-D-prol¡l-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(pentafluorofenox¡)prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 199). A una soluc¡ón de n.° 198 (280 mg, 0,394 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (2 ml) se añad¡ó p¡r¡d¡na (75 mg, 0,94 mmol, 2,4 equ¡v.), segu¡do de una soluc¡ón de tr¡fluoroacetato de pentafluorofen¡lo (268 mg, 0,94 mmol, 2,4 equ¡v.) en d¡clorometano (1,5 ml). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 2,5 horas y el d¡solvente se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 1 a 10 % de metanol en d¡clorometano) para proporc¡onar el compuesto n.° 199 (279 mg, 39 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 763,5 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,93 m¡nutos.
Etapa 6A. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-(1,2,3,4-tetrah¡droqu¡nol¡n-6-¡l)propan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-W-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 200). A una mezcla de n.° 199 (25 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) y n.° 215 ((7,7 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (1,5 ml), se añad¡ó A/,W-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (30,2 mg, 2,31 mmol, 7 equ¡v.). La reacc¡ón se ag¡tó durante 5 m¡nutos y se añad¡ó W,A/-d¡met¡lformam¡da (0,5 ml). Después de ag¡tar durante 2 A horas, se añad¡ó más cant¡dad de Ñ,A/-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (30,2 mg, 2,31 mmol, 7 equ¡v.). Después de 3 A horas, se añad¡ó más W,W-d¡met¡lformam¡da (0,75 ml) y la mezcla se ag¡tó durante 18 horas. Se añad¡eron más cant¡dades de A/,W-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (15,1 mg, 1,15 mmol, 3,6 equ¡v.) y W,W-d¡met¡lformam¡da (0,25 ml) y la reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 48 horas. La mezcla de reacc¡ón se concentró al vacío y el producto en bruto se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento M*) para dar n.° 2 0 O (12,9 mg, 48 % ). HPLC (Protocolo T): m/z HPLC (Protocolo T): m/z 407,7, doble carga [2+], tiempo de retención = 1,69 minutos (pureza = 100 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,72­ 9,82 (m), 8,61-8,67 (m), 8,42-8,48 (m), 8,19-8,24 (m), 7,25-7,27 (m), 7 ,12 -7 ,14 (m), 6,94-7,01 (m), 6,88-6,94 (m), 6,78-6,84 (m), 6,67-6,74 (m), 6,57-6,64 (m), 4,69-4,77 (m), 4,60-4,68 (m), 4,53-4,60 (m), 4,46-4,53 (m), 4,37-4,45 (m), 3,97-4,05 (m), 3,76-3,81 (m), 3,62-3,67 (m), 3,53-3,62 (m), 3,44-3,52 (m), 3,32-3,38 (m), 3,27-3,32 (m), 3,22­ 3,27 (m), 3 ,15-3,22 (m), 3,06-3,14 (m), 2,97-3,01 (m), 2,92-2,96 (m), 2,74-2,83 (m), 2,61-2,74 (m), 2,57-2,61 (m), 2,48-2,56 (m), 2,37-2,46 (m), 2,25-2,36 (m), 2,00-2,20 (m), 1,67-1,91 (m), 1,47-1,60 (m), 1,37-1,47 (m), 1,24-1,35 (m), 1,03-1,10 (m), 0,95-1,00 (m), 0,88-0,94 (m), 0,76-0,83 (m).
Etapa 6B. Síntesis de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1-metoxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 201). A una mezcla de n.° 199 (25 mg, 0,033 mmol, 1 equiv.) y el 4-amino-L-fenilalaninato de metilo disponible en el mercado (8,8 mg, 0,033 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (1,5 ml), se añadió N,N-diisopropiletilamina (30,2 mg, 2,31 mmol, 7 equiv.). La reacción se agitó durante 5 minutos y se añadió N,N-dimetilformamida (0,5 ml). Después de 4 horas, se añadió más cantidad de N,N-diisopropiletilamina (37,75 mg, 2,88 mmol, 8,25 equiv.) y la mezcla se agitó durante 50 minutos. Se añadió más cantidad de N,N-dimetilformamida (0,75 ml) y la reacción se agitó durante 66 horas, se concentró al vacío y el producto en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para dar n.° 201 (14,3 mg, 56 % ); HPLC (Protocolo T): m/z 387,2, doble carga [2+], tiempo de retención = 1,50 minutos (pureza= 100 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,68-9,84 (m), 8,57-8,66 (m), 8,46-8,51 (m), 8,23-8,29 (m), 7,18-7,28 (m), 7 ,11 ­ 7,16 (m), 7,03-7,08 (m), 6,97-7,02 (m), 4,67-4,75 (m), 4,58-4,66 (m), 4,34-4,57 (m), 3,95-4,03 (m), 3,85-3,90 (m), 3,73-3,81 (m), 3,66-3,72 (m), 3,57-3,66 (m), 3,50-3,57 (m), 3,42-3,49 (m), 3,32-3,38 (m), 3,14-3,30 (m), 2,95-3,11 (m), 2,84-2,94 (m), 2,78-2,81 (m), 2,63-2,74 (m), 2,46-2,57 (m), 2,34-2,45 (m), 2,19-2,34 (m), 1,97-2,19 (m), 1,67­ 1,90 (m), 1,45-1,62 (m), 1,34-1,41 (m), 1,21-1,34 (m), 1,01-1,10 (m), 0,82-0,99 (m), 0,72-0,81 (m).
Preparación de 1,2-dimetM -L-proM l-W -[(3R,4S,5S)-3-metoxM -{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxM -oxo-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2-il]am ino}-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-m etil-1-oxoheptan-4-M]-N-metM-L-valmamida, sal formiato (n.° 207), y 1,2-dim etil-L-prolil-W -[(3R,4S,5S)-1-£(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-am inofenil)-1-m etoxi-1-oxopropan-2-il]am ino}-1 -metoxi-2-metM-3-oxopropN]pirrolidm-1-M}-3-metoxi-5-metN-1-oxoheptan-4-il]-N-m etil-L-valm am ida, sal formiato (n.° 208), y 1,2-dimetil-L-proM l-N-[(3R,4S,5S)-3-m etoxM -{(2S)-2-[(lR ,2R )-1 -metoxi-3-{[(2S)-1-metoxM-oxo-3-feml-propan-2-N]ammo}-2-metM-3-oxopropN]pirrolidm-1-M}-5-metM-1-oxoheptan-4-M]-N-metN-L-valmamida, sal de ácido trifluoroacético (n.° 209)
Etapa 1. Síntesis de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-terc-butox¡-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-valinamida (n.° 202). De acuerdo con el proced¡m¡ento general D, a part¡r de n.° 6 (4,3 g, 12 mmol, 1 equ¡v.), n.° 150 (2,15 g, 12 mmol, 1 equ¡v.), d¡clorometano (50 ml), HATU (5,46 g, 14 mmol, 1,2 equ¡v.) y d¡¡soprop¡let¡lam¡na (8,17 ml) se s¡ntet¡zó el mater¡al en bruto deseado, que se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 20 a 55 % de acetato de et¡lo en éter de petróleo) para proporc¡onar n.° 202 (5,2 g, 89 % ) en forma de un ace¡te de color amar¡llo.
Etapa 2. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(2R,3S,4S)-1-carbox¡-2-metox¡-4-met¡lhexan-3-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 203). De acuerdo con el proced¡m¡ento general B, a part¡r de n.° 202 (5,2 g, 10,77 mmol, 1 equ¡v.), d¡clorometano (45 ml) y ác¡do tr¡fluoroacét¡co (20 ml), se s¡ntet¡zó el mater¡al en bruto deseado, para obtener n.° 203 (7 g, rend¡m¡ento cuant¡tat¡vo) que se usó en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal.
Etapa 3. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxo-1-(pentafluorofenox¡)heptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 204). A una soluc¡ón enfr¡ada (0 °C) de n.° 203 (7,0 g, 10,77 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (15 ml), se añad¡ó gota a gota p¡r¡d¡na (3,41 g 43,08 mmol, 4 equ¡v.), segu¡do de una soluc¡ón de tr¡fluoroacetato de pentafluorofen¡lo (6,03 g, 21,54 mmol, 2 equ¡v.) en d¡clorometano (7 ml). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante una hora y el d¡solvente se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 1 a 10 % de metanol en d¡clorometano) para proporc¡onar el compuesto n.° 204 (8 g, 82 % en dos etapas) en forma de un sól¡do de color amar¡llo.
Etapa 4. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carbox¡-1-metox¡prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 205). A una soluc¡ón enfr¡ada (0 °C) de n.° 204 (8,0 g, 10,77 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (25 ml) se añad¡ó gota a gota d¡¡soprop¡let¡lam¡na (5,6 g, 43,08 mmol, 4 equ¡v.), segu¡do de una soluc¡ón de n.° 103 (3,22 g, 10,77 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (15 ml). Después de la ad¡c¡ón, la mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 16 horas y el d¡solvente se ret¡ró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 1 a 10 % de metanol en d¡clorometano) para dar n.° 205 (2,2 g, 33 % ) en forma de un sól¡do de color amar¡llo HPLC (Protocolo X): m/z 597,42 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 8,729 m¡nutos (pureza > 97 % ), t¡empo de retenc¡ón de HPLC qu¡ral: 2,87 m¡n (pureza = 89 % ); Columna: Ch¡ralcel OD-3, 150 x 4,6 mm, 3 pm; Fase móv¡l: etanol (0,05 % de d¡et¡lam¡na) en C O 2 del 5 % al 40 % durante 12 m¡nutos; Caudal: 2,5 ml/m¡nuto.
Etapa 5. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(pentafluorofenox¡)prop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 206). A una soluc¡ón de n.° 198 (0,28 g, 0,47 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (2 ml) se añad¡ó p¡r¡d¡na (75 mg, 0,94 mmol, 2 equ¡v.), segu¡do de una soluc¡ón de tr¡fluoroacetato de pentafluorofen¡lo (268 mg, 0,94 mmol, 2 equ¡v.) en d¡clorometano (1,5 ml). La mezcla se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 2,5 horas y el d¡solvente se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía sobre gel de síl¡ce (Grad¡ente: de 1 a 10 % de metanol en d¡clorometano) para proporc¡onar el compuesto n.° 206 (348 mg, 97 % ) en forma de un sól¡do de color blanco. CL-EM (protocolo Q1): m/z 763,5 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,9 m¡nutos.
Etapa 6A. Síntes¡s de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-(1,2,3,4-tetrah¡droqu¡nol¡n-6-¡l)propan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 207). El compuesto del título se preparó a part¡r de n.° 206 (25 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) y n.° 215 (7,7 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) usando el proced¡m¡ento descr¡to anter¡ormente para la preparac¡ón de n.° 200. El producto en bruto se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento M*) para dar n.° 207 (11,7 mg, 44 % ). HPLC (Protocolo T): m/z 407,6, doble carga [2+], t¡empo de retenc¡ón = 1,59 m¡nutos (pureza = 100 % ). RMN 1H (DMSO-ds) 89,57-9,69 (m), 8,68-8,76 (m), 8,42-8,47 (m), 8,23-8,29 (m), 8,18-8,23 (m), 7,24-7,27 (m), 6,95-7,01 (m), 6,89-6,94 (m), 6,80-6,86 (m), 6,70-6,78 (m), 6,60-6,67 (m), 4,69-4,77 (m), 4,60-4,68 (m), 4,46-4,60 (m), 4,34-4,46 (m), 3,95-4,03 (m), 3,87-3,91 (m), 3,79-3,85 (m), 3,74­ 3,79 (m), 3,60-3,66 (m), 3,49-3,60 (m), 3,41-3,49 (m), 3,12-3,35 (m), 3,04-3,12 (m), 2,89-3,04 (m), 2,68-2,83 (m), 2,61-2,67 (m), 2,45-2,55 (m), 2,34-2,44 (m), 2,08-2,33 (m), 2,05-2,08 (m), 1,92-2,05 (m), 1,75-1,91 (m), 1,65-1,75 (m), 1,59-1,64 (m), 1,34-1,58 (m), 1,20-1,31 (m), 1,01-1,09 (m), 0,94-0,99 (m), 0,84-0,93 (m), 0,80-0,83 (m), 0,72­ 0,80 (m).
Etapa 6B. Síntes¡s de sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-am¡nofen¡l)-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (n.° 208). A una mezcla de n.° 206 (25,0 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.), y el 4-am¡no-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo d¡spon¡ble en el mercado (8,8 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) en d¡clorometano (1,5 ml), se añad¡ó N,N-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (30,2 mg, 2,31 mmol, 7 equ¡v.). La reacc¡ón se ag¡tó durante 5 m¡nutos y se añad¡ó N,N-d¡met¡lformam¡da (0,5 ml). Después de 2 A horas, se añad¡ó más cant¡dad de N,N-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (30,2 mg, 2,31 mmol, 7 equ¡v.). Después de ag¡tar durante 3 1/2 horas, se añad¡ó más cant¡dad de N,N-d¡met¡lformam¡da (0,75 ml) y la reacc¡ón se ag¡tó durante 66 horas, se concentró al vacío y el producto en bruto se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento M*) para dar n.° 208 (13 mg, 51 % ); HPLC (Protocolo T): m/z 387,2, doble carga [2+], t¡empo de retenc¡ón = 1,58 m¡nutos (pureza= 100 % ); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 89,54-9,69 (m), 8,68-8,75 (m), 8,46-8,50 (m), 8,33-8,37 (m), 8,22-8,31 (m), 8,09­ 8,14 (m), 7,17 -7 ,27 (m), 7,07-7,16 (m), 6,99-7,05 (m), 6,92-6,99 (m), 4,69-4,75 (m), 4,60-4,68 (m), 4,42-4,59 (m), 4,34-4,42 (m), 3,95-4,03 (m), 3,85-3,90 (m), 3,74-3,80 (m), 3,65-3,72 (m), 3,62-3,65 (m), 3,42-3,62 (m), 3,31-3,36 (m), 3,24-3,30 (m), 3 ,11-3 ,24 (m), 3,03-3,11 (m), 2,96-3,03 (m), 2,81-2,92 (m), 2,65-2,76 (m), 2,43-2,55 (m), 2,34­ 2,43 (m), 2,06-2,33 (m), 1,93-2,05 (m), 1,75-1,89 (m), 1,66-1,74 (m), 1,58-1,65 (m), 1,47-1,57 (m), 1,34-1,43 (m), 1,20 -1,32 (m), 1,10 -1,14 (m), 1,00-1,09 (m), 0,83-0,99 (m), 0,72-0,81 (m).
Etapa 6C. Síntesis de 1,2-d¡met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da, sal de ác¡do tr¡fluoroacét¡co (n.° 209). El compuesto del título se preparó a partir de n.° 206 (25,0 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) y clorhidrato de L-fen¡lalan¡nato de met¡lo (7,1 mg, 0,033 mmol, 1 equ¡v.) usando el proced¡m¡ento descr¡to anter¡ormente para la preparac¡ón de n.° 200. El producto en bruto se pur¡f¡có por cromatografía de fase ¡nversa (Proced¡m¡ento M*) para dar n.° 209 (10,3 mg, 41 %). HPLC (Protocolo T): m /z 758,7 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 1,787 m¡nutos (pureza = 100 % ). RMN 1H (DMSO-d6) 89,57-9,70 (m), 8,70-8,75 (m), 8,50-8,56 (m), 8,32-8,42 (m), 8,24-8,26 (m), 8,10-8,15 (m), 7,14-7,27 (m), 7 ,12 -7 ,13 (m), 6,98-7,00 (m), 4,69-4,77 (m), 4,55-4,67 (m), 4,43­ 4,53 (m), 3,94-4,02 (m), 3,73-3,78 (m), 3,62-3,68 (m), 3,48-3,60 (m), 3,39-3,48 (m), 3,23-3,33 (m), 3,13-3,22 (m), 3,08-3,13 (m), 3,02-3,08 (m), 2,96-3,01 (m), 2,81-2,94 (m), 2,76-2,80 (m), 2,66-2,75 (m), 2,62-2,66 (m), 2,46-2,55 (m), 2,31-2,45 (m), 2,09-2,29 (m), 2,05-2,09 (m), 1,93-2,04 (m), 1,74-1,88 (m), 1,65-1,74 (m), 1,59-1,65 (m), 1,36­ 1,52 (m), 1,21 -1,35 (m), 1,01-1,08 (m), 0,94-1,00 (m), 0,83-0,94 (m), 0,73-0,81 (m).
Preparación de (2S)-2-am ino-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propanoato de metilo
Figure imgf000129_0001
Etapa 1. Síntes¡s de 6-(bromomet¡l)qu¡nol¡na (n.° 210). Una soluc¡ón de 6-met¡lqu¡nol¡na (5 g, 35 mmol, 1 equ¡v.), W-bromosucc¡n¡m¡da (8,1 g, 45,5 mmol, 1,3 equ¡v.) y peróx¡do de benzoílo (840 mg, 3,5 mmol, 0,1 equ¡v.) en tetracloruro de carbono (100 ml) se ag¡tó a la temperatura de reflujo durante 3 horas y después se enfr¡ó a temperatura amb¡ente. La mezcla de reacc¡ón se f¡ltró y el f¡ltrado se concentró al vacío. El res¡duo se d¡solv¡ó en tetrah¡drofurano (100 ml) y se f¡ltró. El f¡ltrado se usó d¡rectamente en la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal. Etapa 2. Síntes¡s de 6-{[(2S,5R)-3,6-d¡metox¡-5-(propan-2-¡l)-2,5-d¡hidrop¡raz¡n-2-¡l]met¡l}qu¡nol¡na (n.° 211). A una soluc¡ón enfr¡ada (-70 °C) de (2R)-3,6-d¡metox¡-2-(propan-2-¡l)-2,5-d¡h¡drop¡raz¡na (25,8 g, 140 mmol, 2 equ¡v.) en tetrah¡drofurano (200 ml) se añad¡ó gota a gota n-but¡ll¡t¡o (2,5 M, 64,4 ml, 161 mmol, 2,3 equ¡v.) y después se ag¡tó durante 30 m¡nutos. Una soluc¡ón de n.° 210 (15,4 g, 70 mmol, 1 equ¡v.) en tetrah¡drofurano (150 ml) se añad¡ó gota a gota a - 65 °C y después la soluc¡ón se ag¡tó durante 2 horas a esta temperatura. La reacc¡ón se ¡nterrump¡ó con cloruro de amon¡o acuoso saturado (100 ml) y se extrajo con acetato de et¡lo (100 ml). La fase orgán¡ca se secó sobre sulfato sód¡co y se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía en columna de síl¡ce (Grad¡ente: de 10 a 16 % de acetato de et¡lo en éter de petróleo) para proporc¡onar n.° 211 (7,3 g, 32 % , en dos etapas) en forma de un sólido de color amar¡llo. CL-EM (Protocolo Z): m /z 326,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,88 m¡nutos.
Etapa 3. Síntes¡s de (2S)-2-am¡no-3-(qu¡nol¡n-6-¡l)propanoato de met¡lo (n.° 212). A una soluc¡ón de n.° 211 (7,3 g, 22,5 mmol, 1 equ¡v.) en agua (25 ml) y aceton¡tr¡lo (80 ml) se añad¡ó ác¡do tr¡fluoroacét¡co (9 ml) a 0 °C y la soluc¡ón se ag¡tó a 10 °C durante una noche. La fase orgán¡ca se retiró al vacío y la fase acuosa restante se bas¡f¡có a pH 9 con carbonato sód¡co, que se usó d¡rectamente para la s¡gu¡ente etapa.
Etapa 4. Síntes¡s de (2S)-2-[(terc-butox¡carbon¡l)am¡no]-3-(qu¡nol¡n-6-¡l)propanoato de met¡lo (n.° 213). A una soluc¡ón de n.° 212 (5,2 g, 22,5 mmol, 1 equ¡v.) y tr¡et¡lam¡na (9,1 g, 90 mmol, 4 equ¡v.) en un d¡solvente m¡xto de metanol (30 ml) y agua (50 ml) se añad¡ó d¡carbonato de d¡-terc-but¡lo (17,5 g, 78,75 mmol, 3,5 equ¡v.) a 0 °C y después la soluc¡ón se ag¡tó a 10 °C durante una noche. La mezcla de reacc¡ón se f¡ltró y la torta de f¡ltro se lavó con metanol (20 ml x 2). El f¡ltrado se extrajo con acetato de etilo (50 ml x 2) y la fase orgán¡ca se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía en columna de síl¡ce (Grad¡ente: de 25 a 50 % de acetato de et¡lo en éter de petróleo) para proporc¡onar n.° 213 (5,5 g, 74 % en dos etapas) en forma de un ace¡te de color amar¡llo. CL-EM (Protocolo Z): m /z 331,2 [M+H+], t¡empo de retenc¡ón = 0,76 m¡nutos.
Etapa 5. Síntes¡s de (2S)-2-[(terc-butox¡carbon¡l)am¡no]-3-(1,2,3,4-tetrah¡droqu¡nol¡n-6-¡l)propanoato de met¡lo (n.° 214). Una suspens¡ón de n.° 213 (1,5 g, 4,55 mmol, 1 equ¡v.) y palad¡o sobre carbono (150 mg) en etanol (20 ml) se ag¡tó a 50 °C en una atmósfera de 0,21 MPa (30 ps¡) de hidrógeno durante una noche. La mezcla de reacc¡ón se f¡ltró a través de una capa de cel¡te y el f¡ltrado se concentró al vacío. El res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía en columna de sílice (Gradiente: 40 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para proporcionar n.° 214 (1,2 g, 80 % ) en forma de un aceite. RMN 1H (400 MHz, CDCh): 86,70 (d, 2H), 6,40 (m, 1H), 4,95 (m, 1H), 4,49 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,28 (m, 2H), 2,97 (m, 2H), 2,71 (m, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,26 (s, 9H), HPLC (Protocolo Y): m /z 357,0 [M+Na+]; tiempo de retención = 5,304 minutos (pureza >98 % ). tiempo de retención de HPLC quiral: 4,64 min (pureza = 98 % ) (Columna: Chiralcel OJ-H, 150 x 4,6 mm, 5 pm; Fase móvil: etanol (0,05 % de dietilamina) en CO 2 del 5 % al 40 % durante 15 minutos; Caudal: 2,5 ml/minuto.
Etapa 6. Síntesis de (2S)-2-amino-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propanoato de metilo (n.° 215). A una solución de n.° 214 (750 mg, 2,25 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (20 ml) se añadió gota a gota ácido trifluoracético (2 ml) a 0 °C y después la solución se agitó a 20 °C durante una noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se disolvió en agua (20 ml). La solución se basificó con carbonato sódico y se extrajo con acetato de etilo/tetrahidrofurano (30 ml x 3). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío para proporcionar n.° 215 (450 mg, 85 % ) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (400 MHz, CDCla): 86,70 (d, 2H), 6,40 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,67 (m, 1H), 3,30 (m, 2H), 2,96 (m, 1H), 2,75 (m, 3H), 1,96 (m, 2H), 1,50 (a, 2H), 1,26 (a, 1H). HPLC (Protocolo Y): m/z 235,14 [M+H+]; tiempo de retención = 4,35 minutos (pureza > 96 % ). tiempo de retención de HPLC quiral: 5,71 min (pureza = 98 % ). (Columna: Chiralcel OJ-H, 150 x 4,6 mm, 5 pm; Fase móvil: etanol (0,05 % de dietilamina) en CO 2 del 5 % al 40 % durante 15 minutos; Caudal: 2,5 ml/minuto.
Preparación de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-£(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidm -3-il]carbom l}-L-valil)(metil)am ino]-3-metoxi-5-m etilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-m etilpropanoil}-L-fenilalanina, sa l de ácido trifluoroacético (n.° 217), y N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-fluoropirrolidm -3-il]carbom l}-L-valil)(metil)ammo]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidm-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-femlalamna, sal de ácido trifluoroacético (n.° 219).
Figure imgf000130_0001
Etapa 1A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoro-pirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 216). A una solución de n.° 168 (36,9 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) y n.° 114 (100 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (3,6 ml) y NN-dimetilformamida (0,8 ml), se añadió diisopropiletilamina (0,083 ml, 0,474 mmol, 3 equiv.), seguido de h At U (60,7 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas, se diluyó con acetato de etilo (25 ml), se lavó con agua (1x), ácido cítrico al 10 % (1x) y salmuera (1x). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y el filtrado se concentró al vacío para dar n.° 216 en bruto (220 mg, 164 % del teórico) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. HPLC (protocolo Q): m /z 848,6 [M+H+], tiempo de retención = 2,10 minutos.
Etapa 1B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoro-pirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metilo (n.° 2 1 8 ). A una solución de n.° 169 (36,9 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) y n.° 114 (100 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (3,6 ml) y NN-dimetilformamida (0,8 ml), se añadió diisopropiletilamina (0,083 ml, 0,474 mmol, 3 equiv.), seguido de h At U (60,7 mg, 0,158 mmol, 1 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas, se diluyó con acetato de etilo (25 ml), se lavó con agua (1x), ácido cítrico al 10 % (1x) y salmuera (1x). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y el filtrado se concentró al vacío para proporcionar n.° 218 en bruto (180 mg, 134 % del teórico) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. HPLC (protocolo Q): m /z 848,6 [M+H+], tiempo de retención = 2,10 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (n.° 217). A una solución de n.° 216 en bruto (134 mg) en tetrahidrofurano (4 ml) se añadió hidróxido de litio (1 M, 0,5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano (2 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (2 ml). La reacción se agitó durante 4 horas y se concentró al vacío. El material en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para obtener n.° 217 (60 mg, 86 % en dos etapas) en forma de una goma. CL-EM (protocolo Q): m /z 734,93 [M+H+], tiempo de retención = 1,19 minutos. RMN 1H (DMSO-d6) 12,62-12,83 (m), 9,30-9,43 (m), 9,17-9,28 (m), 8,34-8,41 (m), 8,22-8,31 (m), 8,08-8,15 (m), 7,87-7,93 (m), 7,76-7,81 (m), 7 ,11-7 ,23 (m), 4,93-4,99 (m), 4,81-4,88 (m), 4,55-4,71 (m), 4,48-4,54 (m), 4,37-4,45 (m), 3,92-3,99 (m), 3,69-3,75 (m), 3,31-3,65 (m), 3,25­ 3,30 (m), 3,20-3,24 (m), 3 ,12 -3 ,19 (m), 3,08-3,10 (m), 2,97-3,07 (m), 2,92-2,97 (m), 2,75-2,84 (m), 2,64-2,70 (m), 2,43-2,57 (m), 2,28-2,43 (m), 2,15-2,26 (m), 2,02-2,15 (m), 1,56-1,87 (m), 1,31-1,48 (m), 1,05-1,30 (m), 0,97-1,06 (m), 0,82-0,97 (m), 0,71-0,79 (m).
Etapa 2B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (n.° 219). A una solución de n.° 218 en bruto (100 mg) en tetrahidrofurano (4 ml) se añadió hidróxido de litio 1,0 M en agua (0,5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y después se concentró al vacío. El material en bruto se disolvió en diclorometano (2 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (2 ml). La reacción se agitó durante 4 horas y después se concentró al vacío. El material en bruto se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento M*) para obtener n.° 219 en forma de una goma (60 mg, 91 % en dos etapas). CL-EM (protocolo Q): m /z 734,97 [M+H+], tiempo de retención = 1,14 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 8 12,62-12,85 (m), 9,32-9,43 (m), 9,13-9,26 (m), 8,39-8,46 (m), 8,30-8,39 (m), 8,25-8,29 (m), 8,08-8,13 (m), 7,79-7,85 (m), 7,67-7,72 (m), 7,10-7,23 (m), 4,94-5,01 (m), 4,83-4,89 (m), 4,64-4,73 (m), 4,56­ 4,63 (m), 4,44-4,50 (m), 4,37-4,44 (m), 3,92-3,99 (m), 3,60-3,74 (m), 3,24-3,55 (m), 3 ,11-3 ,24 (m), 3,07-3,10 (m), 3,02-3,06 (m), 2,98-3,02 (m), 2,93-2,97 (m), 2,75-2,85 (m), 2,68-2,69 (m), 2,63-2,67 (m), 2,45-2,55 (m), 2,26 -2,44 (m), 2 ,15 -2,25 (m), 2,03-2,14 (m), 1,55-1,87 (m), 1,31-1,47 (m), 1,15 -1,31 (m), 0,98-1,05 (m), 0,91-0,98 (m), 0,82-0,91 (m), 0,71-0,78 (m).
Preparación de 2-m etilalam l-N-{(3R,4S,5S)-H(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-bendl-4-m etiM 8-[(4S,5R)-5-m etN-2-oxoim idazolidin-4-il]-5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12-triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1 -il]-3-m etoxi-5-m etil-1-oxoheptan-4-il}-N-m etil-L-valinam ida (n.° 257).
Figure imgf000131_0001
-
Etapa 1. Síntesis de [(2S)-1-({2-[(tere butoxicarbonil)amino]etil}amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetilo (n.° 253). Siguiendo el procedimiento general D, usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-fenilalanina (500 mg, 1,29 mmol, 1,0 equiv.), (2-aminoetil)carbamato de tere-butilo (207 mg, 1,29 mmol, 1,0 equiv.), HATU (620 mg, 1,55 mmol, 1,2 equiv.) y base de Hunig (0,452 ml, 2,58 mmol, 2,0 equiv.) en 6 ml de DMF, se produjo n.° 253 en forma de un sólido de color blanco (620 mg, 91 % ), después de concentración del disolvente y recristalización usando acetato de etilo. CL-EM (Protocolo Q1): m/z 552,3 [M+Na+], tiempo de retención = 1,01 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-alfa-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-[2-({6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanoil}amino)etil]-L-fenilalaninamida (n.° 254). La protección de Boc se retiró usando el procedimiento general C, usando n.° 251 (88 mg, 0,17 mmol, 1,0 equiv.) y HCl 4 M (2,0 ml, 8,0 mmol, 48 equiv.), seguido de concentración al vacío. Después, la reacción de acoplamiento se realizó siguiendo el procedimiento general D, usando un residuo en bruto, ácido 6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanoico (35,6 mg, 0,166 mmol, 1,0 equiv.), HATU (73,2 mg, 0,18 mmol, 1,1 equiv.) y base de Hunig (0,087 ml, 0,50 mmol, 3,0 equiv.) en 2 ml de d Mf , seguido de purificación (Procedimiento J), para producir n.° 254 (35 mg, 34 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m /z 626,3 [M+H+], tiempo de retención = 0,86 minutos.
Etapa 3. Síntesis de A/-[2-({6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanoil}amino)etil]-L-fenilalaninamida (n.° 255). Siguiendo el procedimiento general A, usando n.° 254 (35 mg, 0,056 mmol, 1,0 equiv.), piperidina (0,10 ml, 1,0 mmol, 20 equiv.) en 0,5 ml de DMF, seguido de purificación usando cromatografía de sílice (0 -30 % de metanol en diclorometano) se obtuvo n.° 253 (19 mg, 84 % ). CL-EM (Protocolo Q1): m /z 404,2 [M+H+], tiempo de retención = 0,48 minutos.
Etapa 4. Síntesis de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-bencil-4-metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]-5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12-triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-W-metil-L-valinamida (n.° 256). Siguiendo el procedimiento general D, usando n.° 105 (36,6 mg, 0,047 mmol, 1,0 equiv.), n.° 255 (19 mg, 0,047 mmol, 1,0 equiv.), HATU (22,4 mg, 0,056 mmol, 1,2 equiv.) y base de Hunig (0,025 ml, 0,141 mmol) en 1,5 ml de DMF, seguido de purificación (Procedimiento J), se produjo n.° 256 (15 mg, 27 % ) en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Protocolo Q1): m /z 1164,8 [M+H+], tiempo de retención = 0,99 minutos.
Etapa 5. Síntesis de 2-metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-bencil-4-metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]-5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12-triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-W-metil-L-valinamida (n.° 257). Siguiendo el procedimiento general A, usando n.° 256 (5 mg, 0,004 mmol, 1,0 equiv.) y piperidina (0,02 ml, 0,2 mmol, 50 equiv.) en 0,7 ml de DMF, seguido de purificación (Procedimiento J), se obtuvo n.° 257 (2 mg, 50 % ) en forma de un cristal incoloro. CL-EM (Protocolo Q1): m /z 1164,8 [M+H+], tiempo de retención = 0,99 minutos. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 88,44-8,52 (m), 8,06-8,20 (m), 7,96-8,01 (m), 7,69­ 7,83 (m), 7,20-7,28 (m), 7 ,11-7 ,19 (m), 3,38-3,83 (m), 3,19-3,26 (m), 3,03-3,12 (m), 2,98 (s), 2,91 (s), 2,75 (s), 2,65-2,70 (m), 2,01-2,36 (m), 1,65-1,87 (m), 1,39-1,57 (m), 1,13 -1,37 (m), 1,04-1,08 (m), 0,74-1,01 (m).
Preparación de W -[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentanoil]-N,2-dim etilalam l-W -{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-fem letil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1 -il}-2 -m e to x i-1-[(lS )-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valmamida (mv n.° 115).
Figure imgf000132_0001
Etapa 1. Preparación de A/-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentanoil]-N,2-dimetilalanil-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida (mvn.° 115). A una solución en agitación de ácido 5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentanoico (12 mg, 0,061 mM) en 0,4 ml de diclorometano y 0,1 ml de DMF, se añadió HATU (23,2 mg, 0,061 mM), seguido de base de Hunig (0,033 ml, 0,188 mM). La reacción se dejó en agitación durante 5 minutos antes de añadirse n.° 115 (39 mg, 0,047 mM) como una solución en 0,4 ml de diclorometano y 0,1 ml de DMF. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas y 15 minutos, antes de interrumpirse a través de la adición de agua que contenía una pequeña cantidad de TFA. Después, la reacción se redujo. El material en bruto se disolvió con DMSO y se purificó por cromatografía de fase inversa (Procedimiento J). Después, las fracciones apropiadas se concentraron (Genevac). Después, el material purificó adicionalmente por cromatografía de fase inversa (Procedimiento K) concentrándose las fracciones apropiadas (Genevac). Después, el material se transfirió a un vial pequeño usando diclorometano y metanol antes de reducirse (Genevac) para proporcionar mvn.° 115 (1,4 mg, 3 ,3 % ) como una mezcla de aceite/sólido. HPLC (Protocolo A 45 °C): m /z 897,5 [M+H+], tiempo de retención = 9,149 minutos (pureza > 97 %).
Preparación de W -[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N,2-dim etilalam l-W -[(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-fem letil]am m o}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidm -1 -il}-2 -m etoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valmamida (mcn.° 115)
Figure imgf000133_0001
Etapa 1. Síntesis de cloruro de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoílo (n.° 248). A una solución en agitación de ácido 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoico (3,15 g, 14,9 mM) en 15 ml de diclorometano, se añadió cloruro de oxalilo (1,61 ml, 17,9 mM), seguido de una gota de DMF. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante tres horas. La reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió en una solución uno a uno de heptano y diclorometano y después se concentró al vacío. Este procedimiento se repitió dos veces más, produciendo un n.° 248 sólido (3,43 g, 100 % ). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da): 8 [7,02 (s, 2H), 3,43 (m, 2H), 2,53 (m, 1H), CH2, 18 (m, 1H), 1,54 (m, 4H), 1,26 (m, 2H)].
Etapa 2. Síntesis de W-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N,2-dimetilalanina (n.° 249). A una solución en agitación de n.° 248 (600 mg, 2,61 mM) en 10 ml de diclorometano, se añadió N,2-dimetilalanina (306 mg, 2,61 mM), seguido de trietilamina (1,09 ml, 7,84 mM). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante tres horas. Se añadió diclorometano a la reacción y la fase orgánica se lavó tres veces con agua y dos veces con salmuera. La fase orgánica se separó y después se secó sobre sulfato sódico antes de concentrarse al vacío. El residuo en bruto se purificó por cromatografía de sílice (0-30 % de metanol en diclorometano) sobre sílice que se había neutralizado previamente con trietilamina, produciendo un sólido de color blanco, n.° 249 (127 mg, 16 % ) . CL-EM (Protocolo Q): m /z 309,0 [M-H-], tiempo de retención = 0,96 minutos.
Etapa 3. Síntesis de W-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina (n.° 250). A una solución en agitación de n.° 113 (2,10 g, 2,46 mM) en 10 ml de THF, se añadió hidróxido de litio (228 mg, 5,16 mM), seguido de 3 ml de agua. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se acidificó a través de la adición de HCl 1 M y después se concentró al vacío. El sólido de color blanco resultante se recogió en 20 ml de acetonitrilo y 5 ml de agua. La fase acuosa se retiró y la fase orgánica se lavó una vez con agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. Después, se añadió acetato de etilo (20 ml) y el aceite en bruto se dejó en agitación durante 30 minutos, antes de filtrarse para producir un sólido de color blanco, n.° 250 (1,42 g, 94 % ). CL-EM (Protocolo Q): m /z 619,5 [M+H+], tiempo de retención = 1,10 minutos. HPLC (Protocolo A 45 °C) m /z 619,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,732 minutos.
Etapa 4. Síntesis de W-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N,2-dimetilalanil-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida (mcn.° 115). A una solución en agitación de n.° 249 (382 mg, 1,23 mM) en 5 ml de diclorometano, se añadió h At U (482 mg, 1,23 mM), seguido de trietilamina (0,52 ml, 1,23 mM). La reacción se dejó en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de la adición de n.° 250 (762 mg, 1,23 mM). La reacción se dejó en agitación durante 3 horas. La reacción se concentró al vacío. La purificación de fase inversa (Procedimiento L), seguido de liofilización, produjo un sólido de color blanco mcn.° 120 (124 mg, 11 % ). HPLC (Protocolo A 45 °C); m /z 911,5 [M+H+], tiempo de retención = 9,676 minutos.
Preparación de W -[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-N)butanoM]-N,2-dimetilalaml-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-femletM]ammo}-1-metoxi-2-metM-3-oxopropM]pirroNdm-1 -il}-2 -m etoxi-1-[(1S)-1-met¡lpropM]-4-oxobut¡l}-W-met¡l-L-valmam¡da (mbn.° 115).
Figure imgf000134_0001
Etapa 1. Síntesis de /V-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]-N,2-dimetilalanil-^-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡letN]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxopropN]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-W-metN-L-val¡nam¡da (mbn.° 115). Una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de ác¡do 4-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)butano¡co (1,2 equivalentes), HATU (1,2 equ¡valentes) y base de Hun¡g (3 equ¡valentes) en DMF y d¡clorometano se deja en ag¡tac¡ón durante 30 m¡nutos. Después, se añad¡ó el compuesto n.° 115 (1 equ¡valente) en forma de una soluc¡ón en d¡clorometano y DMF. La reacc¡ón se concentró por CL-EM. La reacc¡ón se concentró y la pur¡f¡cac¡ón se completó med¡ante cromatografía de fase ¡nversa de med¡a pres¡ón Isco (Grad¡ente: 5 % -100 % de agua en aceton¡tr¡lo).
Preparación de W -[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)heptanoil]-N,2-dimetilalanil-W-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2 -m etoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-W-metil-L-valinamida (men.° 115).
Figure imgf000134_0002
Etapa 1. Síntes¡s de A/-[7-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)heptano¡l]-N,2-d¡met¡lalan¡l-W-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡letN]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxopropN]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobut¡l}-W-met¡l-L-val¡nam¡da (men.° 115). Una soluc¡ón en ag¡tac¡ón de ác¡do 7-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)heptano¡co (1,2 equi valentes), HATU (1,2 equ¡valentes) y base de Hun¡g (3 equi valentes) en DMF y d¡clorometano se deja en ag¡tac¡ón durante 30 m¡nutos. Después, se añad¡ó el compuesto n.° 115 (1 equi valente) en forma de una soluc¡ón en d¡clorometano y DMF. La reacc¡ón se concentró por CL-EM. La reacc¡ón se concentró y la pur¡f¡cac¡ón se completó med¡ante cromatografía de fase ¡nversa de med¡a pres¡ón Isco (Grad¡ente: 5 % -100 % de agua en aceton¡tr¡lo).
Preparación de W -[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N~5—carbam oil-N-(4-{(8S,11 S ,12R )-12-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil] am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-8-isopropil-4,5,5,10-tetram etil-11-[(1S)-1-m etilpropil]-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il}fenil)-L-ornitinam ida (m cValCitPABCn.° 115).
Figure imgf000134_0003
Etapa 1. Síntes¡s de W-[6-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-N)hexanoN]-L-val¡l-N~5~-carbamo¡l-A/-(4-{(8S,11S,12R)-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1 S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-oxoet¡l)-8-¡soprop¡l-4,5,5,10-tetramet¡l-11-[(1S)-1-met¡lprop¡l]-3,6,9-tr¡oxo-2,13-d¡oxa-4,7,10-tr¡azatetradec-1-¡l}fen¡l)-L-om¡t¡nam¡da (m cValCitPABCn.° 115). Se preparó una soluc¡ón de mcCValC¡tPABC (Engarce n.° D, 1 equ i valente) y n.° 115 (1 equ¡valente) en DMF. Se añad¡ó base de Hun¡g (4 equ¡valentes), 2,6-Lud¡t¡na (4 equ¡valentes) y HOAT (0,2 equi valentes). La reacc¡ón se concentró por CL-EM. La reacc¡ón se concentró y la pur¡f¡cac¡ón se completó med¡ante cromatografía de fase ¡nversa de med¡a pres¡ón Isco (Grad¡ente: 5 % -100 % de agua en aceton¡tr¡lo).
Preparación de W -(21-am ino-4,7,10,13,16,19-hexaoxahenicosan-1-oil)-N,2-dim etilalanil-W -{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-m etoxi-1-[(1S)-1 met¡lprop¡l]-4-oxobutil}-N-met¡l-L-valmam¡da (Am Peg6C2n.° 115).
Figure imgf000135_0001
Etapa 1. Síntesis de N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxahen¡cosan-1-o¡l)-N,2-d¡met¡lalan¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbox¡-2-fen¡let¡l]am¡no}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxopropil]p¡rrol¡d¡n-1-¡l}-2-metox¡-1-[(1S)-1-metilprop¡l]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-val¡nam¡da (Am Peg6C2n.° 115). Una solución de ácido 1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16,19,22-heptaoxa-4-azapentacosan-25-oico (1 equivalente), HATU (1 equivalente) y base de Hunig (3 equivalentes) se dejó en agitación durante 30 minutos. Se añadió el compuesto n.° 115 en forma de una solución en d Mf . La reacción se concentró por CL-EM. Cuando la reacción de acoplamiento estaba casi completa, se añadió piperidina (5 equivalentes). La desprotección de Fmoc se controló por CL-EM. La reacción se concentró y la purificación se completó mediante cromatografía de fase inversa de media presión Isco (Gradiente: 5 % - 100 % de agua en acetonitrilo).
Preparación de 1,2-d¡m et¡l-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{2S)-2-[(1R,2R)-3-({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)hexano¡l]gl¡c¡l}am m o)fem l]-1-m etox¡-1-oxopropan-2-il}am m o)-1-m etox¡-2-m et¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡dm -1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-m et¡l-L-valmamida m cGlyn.° 201.
Figure imgf000135_0002
Etapa 1: Síntesis de N-(terc-butoxicarbon¡l)-4-({N-[6-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡hidro-1H pirrol-1 -M)hexanoM]gMc¡i}amino)-L-fenilalaninato de metilo (n.° 251): A una solución de 4-am¡no-N-(terc-butoxicarbon¡l)-L-fen¡lalan¡nato de metilo (4,1 g, 15,3 mmol, 1 equiv.) en N,N-dimet¡lformamida seca (70 ml) se añadió N,N'-dic¡clohex¡lcarbod¡¡m¡da (2,9 g, 15,3 mmol, 1 equiv.) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 minutos. Se añadió una solución de ácido 2-(6-(2,5-dioxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)hexanam¡do)acético (3 g, 10,2 mmol, 0,66 equiv.) en N,N-dimet¡lformamida seca (20 ml) se añadió a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla se filtró. El filtrado se vertió en agua enfriada con hielo (200 ml) y se extrajo con EtOAc (200 ml x 3). El extracto se lavó con salmuera (200 ml), se secó sobre Na2 SO 4 y se concentró al vacío para proporcionar n.° 251 (1,8 g, rendimiento del 32 ,3 % ) en forma de un sólido de color amarillo claro. HPLC (Protocolo Q2) [M+Na+] 567,3, tiempo de retención = 1,02 min.
Etapa 2: Síntesis de 4-({N-[6-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-il)hexano¡l]gl¡c¡l}am¡no)-L-fen¡lalan¡nato de metilo (n.° 252): A una solución de n.° 251 (800 mg, 1,47 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (16 ml) se añadió TFA (4,8 ml) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se concentró al vacío. El residuo se disolvió en agua y se filtró. El filtrado se liofilizó para proporcionar n.° 252 (800 mg, 97,5 % ) en forma de un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo Q3) [M+H+] 445,4, tiempo de retención = 0,90 min.
Etapa 3: Síntesis de 1,2-dimetil-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-d¡oxo-2,5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)hexano¡l]gl¡cil}am¡no)fen¡l]-1-metox¡-1-oxopropan-2-¡l}am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡din-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (m cGlyn.° 201). A una solución de n.° 198 (94 mg, 0,13 mmol, 1 equiv.) y n.° 252 (60,3 mg, 0,18 mmol, 1,4 equiv.) en N,N-dimetilformamida (2 ml) se añadió HATU (64,2 mg, 0,13 mmol, 1 equiv.) seguido de N,N-di¡soprop¡letilam¡na (66 mg, 0,52 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se neutralizó con ácido cítrico ac. y se concentró para dar el producto en bruto, que se purificó por cromatografía de gel de sílice (eluyendo con MeOH/DCM de 1 % a 7 % ), después se purificó de nuevo por TLC preparativa (Metanol:diclorometano = 1:10) para dar m cGlyn.0201 (25 mg, 16,2 % ) en forma de un sólido de color blanco: IEN-EM: m/z 1023,59 [M+H+], HPLC (Protocolo EB); tiempo de retención = 4,0 minutos (Pureza = 96 % ). RMN 1H (DMSO-da) 9,88 (d, 1H), 8,48 (d, 0,5H), 8,24 (d, 0,5H), 8,11 (m, 1H), 7,82 (m, 1H), 7,47 (d, 2H), 7 ,15 (m, 2H), 7,01 (s, 2H), 4,67 (m, 3H), 3,96 (m, 4H), 3,65 (m, 4H), 3,40 (m, 4H), 3,27 (m, 7H), 3,16 (m, 5H), 2,24 (m, 8H), 1,50 (m, 11H), 1,19 (m, 21H).
Preparación de 1,2-dim etM -L-propN-W -[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-£[(2S)-1-£[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]am ino}-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]am ino}-1-m etoxi-2-m etil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m etoxi-5-metiM-oxoheptan-4-M]-W-metN-L-vaNnamida (MalC6Amn.° 151).
Figure imgf000136_0001
Etapa 1. Síntesis de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (MalC6Amn.° 151). Siguiendo el procedimiento general D, usando n.° 151 (20 mg, 0,023 mmol, 1,0 equiv.), 1-(6-aminohexil)-1H-pirrol-2,5-diona (7,0 mg, 0,030 mmol, 1,3 equiv.), HATU (11,4 mg, 0,030 mmol, 1,3 equiv.) y base de Hunig (0,016 ml, 0,092 mmol, 1,3 equiv.) en 2 ml de diclorometano y 0,2 ml de DMF, seguido de purificación usando cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 5 % a 80 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase) se produjo M alc6Amn.° 151 (18,4 mg, 86 % ) en forma de una mezcla transparente de aceite/sólido. CL-EM (Protocolo Q): m /z 922,3 [M+H+], tiempo de retención = 1,43 minutos; HPLC (Protocolo A 45 °C): m /z 922,4 [M+H+], tiempo de retención = 7,203 minutos.
Preparación de W-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-M)hexanoM]-L-valN-W-(4-£(6S,9R,10R)-6-bencN-10-[(2S)--{(3R,4S,5S)-4-[(1,2-dimetM-L-proMl-L-valM)(metN)ammo]-3-metoxi-5-metMheptanoN}pirroMdm-2-N]-9-metN-3,8-dioxo-2,11-dioxa-4,7-diazadodec-1-M}fenN)-N~5~-carbamoN-L-omitmamida (m cVal-CitPA BCn.° 246)
Figure imgf000136_0002
Etapa 1. Síntesis de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{(6S,9R,10R)-6-bencil-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(1,2-dimetil-L-prolil-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-9-metil-3,8-dioxo-2,11-dioxa-4,7-diazadodec-1-il}fenil)-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (m cValCitPABCn.° 246). Siguiendo el procedimiento general E, usando n.° 246 (29,2 mg, 0,035 mmol, 1,0 equiv.), mcValCitPABC-PNP (28,8 mg, 0,039 mmol, 1,1 equiv.), 2,6-Luditina (0,016 ml, 0,14 mmol, 4,0 equiv.), base de Hunig (0,025 ml, 0,14 mmol, 4,0 equiv.) y HOAT (4,8 mg, 0,035 mmol, 1,0 equiv.) en 2,0 ml de DMA, seguido de purificación usando cromatografía C 18 de fase inversa y presión media (Gradiente: de 5 % a 50 % de acetonitrilo en agua con 0,02 % de TFA en cada fase) se produjo mcValCitPABCn.° 246 (21 mg, 45 % ) en forma de una mezcla transparente de aceite/sólido. CL-EM (Protocolo Q): m /z 1327,9 [M+H+], tiempo de retención = 1,36 minutos.
Estudios de H ERCEPTIN ® in vitro e in vivo
Nótese que para los siguientes estudios H ERCEPTIN ® en ausencia de agentes citotóxicos conjugados no muestra potencia significativa in vitro o efectividad in vivo a concentraciones equivalentes de anticuerpo.
Procedimiento de ensayo celular in vitro
Se sembraron células que expresan la diana (BT474 (cáncer de mama, N87 (cáncer de gástrico), H CC1954 (cáncer de mama), MDA-MB-361-DYT2 (cáncer de mama)) o células que no la expresan (MDA-MB-468) en placas de cultivo celular de 96 pocillos durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados fármaco anticuerpo diluidos en serie 3 veces o compuestos libres (es decir, sin anticuerpo conjugado al fármaco) por duplicado a 10 concentraciones. La viabilidad celular se determinó por el Ensayo CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation MTS (Promega, Madison WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como porcentaje de control sin tratar. Los valores C I50 se calcularon usando un modelo n.° 203 logístico de cuatro parámetros con XLfit v4.2 (IDBS, Guildford, Surry, RU). Los resultados se muestran en las Tablas 20, 21A y 21B.
Modelo de xenoinjerto de tumor MDAMB-361 DYT2 in vivo
Se realizaron estudios de efectividad in vivo de los conjugados fármaco anticuerpo con la línea celular Her2+ MDAMB-361 DYT2. Para los estudios de efectividad, se implantaron subcutáneamente 10 millones de células tumorales en matrigel al 50 % en ratones desnudos irradiados de 6-8 semanas de edad. Cuando los tamaños del tumor alcanzaron entre 250-350 mm3 se administraron fármacos o vehículo a través de inyección de bolo en la vena de la cola. Los ratones se inyectaron con 1 mg/kg de conjugados fármaco anticuerpo tratados cuatro veces cada cuatro días (Q4dx4). El volumen del tumor se mide dos veces a la semana durante los primeros 50 días y una vez a la semana en lo sucesivo por un dispositivo calibrador y se calculó con la siguiente fórmula: Volumen del tumor = (longitud x anchura2) / 2. Los resultados se compararon a lo largo de los estudios normalizando la regresión tumoral del ratón tratado con fármaco dividiendo el volumen tumoral por el volumen tumoral tratado con vehículo (T/C). Se ensayaron seis compuestos en los tres diferentes estudios de xenoinjerto MDA-MB-361-DYT2 para determinar su actividad antitumoral. Los resultados de un estudio representativo con cuatro de los compuestos demuestran la regresión significativa del tumor de los ratones tratados con vehículos durante el periodo de observación de 50 días (Figura 1). Para comparar los resultados de los compuestos en los tres estudios, la actividad anti-tumoral se normalizó dividiendo el volumen del tumor tratado con fármaco por el volumen tumoral tratado con vehículo (T/C). Un gráfico de los seis valores T/C (Figura 2) demuestra que cada uno de los seis compuestos provoca la regresión tumoral completa (o casi completa) durante el periodo de observación que fue hasta 107 días para uno de los estudios.
Los resultados de la prueba de H(C)-n.°D54, H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF y H(K)-MCC-DM1 en los estudios de xenoinjerto de MDA-MB-361-DYT2 se muestran en la Figura 4. El gráfico del volumen tumoral en el grupo de tratamiento frente al grupo control (T/C) permite la comparación entre conjugados (véase la Figura 5C). Estos resultados demuestran que H(C)n.°D54 muestra eficiencia equivalente a los conjugados de H ER CEPTIN ® con H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF y es superior a H(K)-MCC-DM1 en este modelo.
Modelo de xenoinjerto de tumor N87 in vivo (HERCEPTIN®)
Se realizaron estudios de efectividad in vivo de los conjugados fármaco anticuerpo con modelos de xenoinjerto que expresan la diana usando las líneas celulares N87. Para los estudios de efectividad, se implantan subcutáneamente 7,5 millones de células tumorales en matrigel al 50 % en ratones desnudos de 6-8 semanas de edad hasta que los tamaños de los tumores alcanzan entre 250 y 350 mm3. La dosificación se realiza a través de inyección de bolo de la vena de la cola. Dependiendo de la respuesta del tumor al tratamiento, los animales se inyectaron con 1-10 mg/kg de conjugados fármaco anticuerpo tratados cuatro veces cada cuatro días. Todos los animales experimentales se monitorizan para los cambios en el peso corporal semanalmente. El volumen del tumor se mide dos veces a la semana durante los primeros 50 días y una vez a la semana en lo sucesivo por un dispositivo calibrador y se calculó con la siguiente fórmula: Volumen del tumor = (longitud x anchura2) / 2. Los animales se sacrifican humanamente antes de que sus volúmenes tumorales alcancen 2500 mm3. El tamaño del tumor se observa disminuir después de la primera semana de tratamiento. Los animales pueden monitorizarse continuamente para el re-crecimiento del tumor después de que el tratamiento sea discontinuo.
Los resultados de la prueba de H(C)-n.°D54, H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF y H(K)-MCC-DM1 en los estudios en el modelo de detección in vivo de xenoinjerto de ratón N87 se muestran en las Figuras 3 y 5. Estos resultados demuestran que H(C)-n.°D54 es superior/similar al conjugado H(C)-vcMMAE y es más potente que los conjugados H(C)-mcMMAF y H(K)-MCC-DM1 en este modelo.
Farm acocinética y toxicocinética
La farmacocinética de ratón y la toxicocinética de rata se determinaron a partir de estudios de farmacocinética de ratón de dosis única y de toxicología de rata (véanse las Tablas 22 y 23). La farmacocinética de ratón y la toxicocinética de rata se determinaron a partir de estudios de farmacocinética de ratón de dosis única y de toxicología de rata. La farmacocinética de ratón se determinó a partir de muestras recogidas de ratones desnudos que se administraron una dosis única de 3 mg/kg. Las muestras se recogieron durante hasta 336 h. La toxicocinética de ratas se determinó en ratas (Sprague-Dawley (Crl:CD (SD))) que se administraron una única administración de H(C)-vc-MMAE o H(C)-n.° D54 a dosis de 3, 10 y 30 mg/kg o se administraron H(C)-mc-MMAD o H(C)-mc-MMAF a 10, 30 y 100 mg/kg. Las muestras se recogieron durante hasta 336 horas. Las concentraciones circulantes de anticuerpo total y ADC se midieron usando ensayos ELISA. El área bajo la curva (AUC) se calculó para el anticuerpo total y ADC y para cada ADC. También se calcularon las relaciones a Uc ADC frente a anticuerpo.
La exposición del anticuerpo total H(C)-n.° D54 y el ADC fue mayor que la observada para H(C)-vc-MMAE en ratones a 3 mg/kg y a todas las dosis evaluadas en ratas. La relación ADC a AUC Ac para H(C)-n.° D54 también fue mayor que la observada para H(C)-vc-MMAE. Estos resultados sugieren que H(C)-n.° D54 tiene mayor exposición y que el ADC y/o la carga útil de engarce son potencialmente más estables que H(C)-vc-MMAE.
Toxicidad
La toxicidad independiente de diana de n.° D54 y el comparador engarce-cargas útiles (mcValCitPABC-MMAD y mcVal-CitPABC-MMAE) conjugado a un anticuerpo monoclonal sin reactividad cruzada (IgG 1) se evaluó en un estudio de toxicidad de rata de dosis única en un periodo de observación de dos semanas. Las dosis de los conjugados fármaco anticuerpo (ADC) fueron 0, 3,10 y 30 mg/kg con una n es 5 machos/grupo y la carga de engarce-carga útil fue similar a lo largo de los conjugados (3,8, 3,2, y 4 respectivamente). Estos estudios incluían observaciones clínicas al menos diarias, pesos corporales semanales, patología clínica (final de la vida) y necropsia (Día 15 -17) con examinación al microscopio de 9 o más tejidos y cualquier lesión bruta.
La mortalidad con los cambios de peso corporal relacionados y los signos de morbilidad se observaron en la dosis de 30 mg/kg para todos los conjugados y a la dosis de 10 mg/kg para el conjugado MMAD. No hubo observaciones clínicas o cambios en el peso corporal en los grupos supervivientes.
Los órganos diana de los conjugados identificados por examinación al microscopio en los grupos supervivientes de dosis fueron como sigue. El conjugado a 10 mg/kg tenía deshechos en la luz del epidídimo (5/5, de mínimo a suave), inflamación en la base del corazón (1/5 ratas, mínimo) y mitosis aumentada en la córnea (1/5 ratones, mínimo). No hubo descubrimientos histológicos para el conjugado a 3 mg/kg. Para el conjugado MMAD en el grupo de dosis superviviente a 3 mg/kg, hubo cambios en y relacionados con la médula ósea y en los testículos y el epidídimo. Para el conjugado MMAE a 10 mg/kg, hubo cambios en la médula ósea, el riñón, el hígado y el epidídimo. En la dosis de 3 mg/kg para este conjugado, hubo cambios en el riñón y mitosis aumentada en el hígado. Por lo tanto, en estudios de diseño similar en los grupos supervivientes, el conjugado no tuvo descubrimientos de médula ósea vistos con los conjugados comparadores y tampoco tuvieron descubrimientos vistos del hígado o el riñón con uno de los comparadores.
En resumen, la dosis máxima tolerada (MTD) del conjugado y el conjugado MMAE fue 10 mg/kg y la MTD del conjugado MMAD fue 3 mg/kg. El nivel de efecto adverso no observado (NOAEL) del conjugado fue 3 mg/kg mientras que el NOAEL de los conjugados comparadores engarce-carga útil fue menos de 3 mg/kg. Este estudio demuestra cómo el perfil toxicológico de n.° D54 se compara con ciertos compuestos descritos en la técnica.
Estudios in vitro e in vivo AD C A nti-IL-13R a2
Anticuerpos y AD C A nti-IL -13R a2
El anticuerpo hu08 humanizado se une específicamente al receptor IL-13Ra2. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para hu08 se muestran en la Tabla 3. Las CDR de Kabat están subrayadas.
Tabla 3. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos del anticuerpo hu08 humanizado.
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El anticuerpo hu08 anti-IL-13Ra2 humanizado se conjugó a diversas combinaciones engarce-carga útil de la presente invención, como se proporciona en la Tabla 4. Los conjugados fármaco anticuerpo se prepararon de acuerdo con los procedimientos de la presente invención.
Tabla 4 ADC anti-IL-13Ra2.
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Ensayo de citotoxicidad in Vitro con A D C anti-IL-13R a2
Se cultivaron líneas celulares que expresan el antígeno IL-13R a2 y una línea celular de control negativo, con concentraciones en aumento de ADC anti-IL-13Ra2 que comprenden el anticuerpo hu08 conjugado a diversas cargas conectoras de la presente invención. Después de cuatro días, se evaluó la viabilidad de cada cultivo. los valores C I50 se calcularon por regresión no linear logística y se presentan como ng de Ac/ml.
Los datos demuestran que el anticuerpo hu08v1.0/1.0 anti-IL-13Ra2 conjugado a seis cargas útiles de auristatina diferentes es eficaz contra ambas de las líneas celulares positivas IL-13R a2 ensayadas (PC3MM2), que tiene un CI50 que varía de 1,1 a 4,9 ng Ac/ml o 7,3-32,7 pM (Tabla 5). Todos los ADC no eran activos contra la línea celular negativa IL-13Ra2, H460, y los ADC control de no unión a IL-13Ra2, huIgG8.84-vc0101 y huIgG8.84-mc3377, no fueron activos contra cualquiera de las líneas celulares ensayadas.
Tabla 5. Valores CI50 (ng de Ac/ml) de ADC anti-IL-13Ra2 humanizado.
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Modelos de xenoinjerto subcutáneos in v iv o con ADC anti-IL13Ra2
El anticuerpo hu08 humanizado se une específicamente al receptor IL-13Ra2. Se probaron ADC hu08 con once combinaciones diferentes de engarce-carga útil en un modelo de xenoinjerto in vivo. Unos ratones hembra atímicos (desnudos) fueron inyectados subcutáneamente con PC3MM2. Los ratones con tumores faseados, aproximadamente 0,1 a 0,3 g (n = 8 a 10 ratones/grupo de tratamiento), fueron administrados intravenosamente q4d x 4 con solución salina normal (vehículo), ADC hu08v1.0/1.0 con engarces-cargas útiles vc-0101, vc-6780, vc-3906, mc-8261, m c-0131, m c-6121, mc-3377, MalPeg-8261, MalPeg-0131, MalPeg-6121 o MalPeg-3906 y un Ac de no unión (huIgG8.84) conjugado con vc-0101 o mc-3377, a una dosis de 2 o 3 mg Ac/kg. Los ADC fueron dosificados a base de un contenido de Ac. Los tumores se midieron al menos una vez a la semana y su tamaño se calcula como mm3 = 0,5 x (anchura del tumor2) x (longitud del tumor).
Los resultados de efectividad in vivo listados en la Tabla 6 muestran un intervalo de actividad anti-tumoral con los diversos ADC probados. El orden relativo de potencia es hu08-vc-0101 > hu08-vc-6780 > hu08-mc-0131 > hu08-mc-6121 > hu08-mc-3906 > hu08-MalPeg-0131 >hu08-MalPeg-6121 > hu08-MalPeg-3906 > > hu08-mc-8261. En el nivel de dosis de 3 mg/kg, tanto hu08-vc-0101 y hu08-mc-3377 demostraron actividad antitumoral, mientras que el Ac de no unión (huIgG8.84) conjugado con vc-0101 o mc-3377 no tuvo actividad y fueron similares al control vehículo.
Tabla 6. Efectividad de ADC anti-IL-13Ra2 en xenoinjertos PC3MM2.
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Estudios in v i t r o e in v iv o ADC Anti-Notch
Anticuerpos y ADC anti-Notch
Los anticuerpos humanizados, hu28 y hu75 y los anticuerpos quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, se unen específicamente al receptor Notch. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para hu28 y hu75 se proporcionan a la Tabla 7. Las CDR de Kabat están subrayadas.
Tabla 7. Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de anticuerpos anti-Notch humanizados.
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Los anticuerpos anti-Notch humanizados, hu28 y hu75 y los anticuerpos anti-Notch quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, se conjugaron a diversas combinaciones de engarce-carga útil de la presente invención, como se proporciona en la Tabla 8. Los conjugados fármaco anticuerpo se prepararon de acuerdo con los procedimientos de la presente invención.
Tabla 8. ADC anti-Notch.
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Ensayo de citotoxicidad in Vitro con AD C anti-Notch
Los efectos de ADC anti-Notch se evaluaron en 1) líneas celulares que expresan endógenamente la proteína Notch: HCC2429 (cáncer pulmonar), OVCAR3 (cáncer de ovario) y Md A-MB-468 (cáncer de ama), 2) líneas celulares diseñadas por ingeniería para expresar la proteína Notch: MDA-MB-468/hNotch y U2OS/hNotch y 3) una línea celular de control negativo (SW900) usando un indicador de viabilidad celular MTS (Promega, Madison, WI). Estas líneas celulares se cultivaron con concentraciones en aumento de ADC anti-Notch. que comprenden anticuerpos anti-Notch humanizados, hu28 y hu75 y anticuerpos anti-Notch quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, se conjugaron a diversas combinaciones de engarce-carga útil de la presente invención. Como un control de especificidad para los ADC anti-Notch, también se probaron ADC control no marcados como diana (ADC huNeg8.8 o ADC ch2H6) en las mismas líneas celulares. Después de cuatro días, se evaluó la viabilidad de cada cultivo. los valores CI50 se calcularon por regresión no linear logística y se presentan como ng de Ac/ml. También se proporciona la relación fármaco anticuerpo (DAR).
La Tabla 9 muestra valores CI50 (ng Ac/ml) de los tratamientos de ADC anti-Notch humanizados. Las líneas celulares HCC2429 y MDA-MB-468/hNotch tuvieron dos repeticiones individuales. Los datos demostraron que los ADC anti-Notch humanizados con diversos engarces-cargas útiles fueron activos e indujeron muerte celular en las líneas celulares cancerosas que expresan y sobreexpresan Notch HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA-MB-468/hNotch, U2OS/hNotch, pero no en la línea celular de control negativo SW900 que carecen de expresión Notch. Los ADC control no marcados como diana bien carecen de potencia (LP) y por lo tanto los valores CI50 no se generaron como se indicó, o bien estuvieron mínimamente activos a las dosis más altas ensayadas. Los ADC anti-Notch que tienen valores CI50 iguales a o mayores que los valores CI50 para los ADC control se consideraron que carecían de potencia in vitro como se indica por LP.
Tabla 9. Valores CI50 (ng de Ac/ml) de ADC anti-Notch humanizado.
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La Tabla 10 muestra valores CI50 (ng Ac/ml) de los tratamientos de ADC anti-Notch quiméricos rata-humano. Para experimentos con 2-4 repeticiones individuales, se calcularon valores promedio CI50 junto con el error estándar de la media (S.E.M.). Los datos demostraron que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con diversos engarcescargas útiles fueron activos e indujeron muerte celular en las líneas celulares cancerosas que expresan y sobreexpresan Notch HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA-MB-468/hNotch, U2OS/hNotch. Los ADC control no marcados como diana bien carecen de potencia (LP) y por lo tanto los valores CI50 no se generaron como se indicó, o bien estuvieron mínimamente activos a las dosis más altas ensayadas. Los ADC anti-Notch que tienen valores CI50 iguales a o mayores que los valores CI50 para los ADC control se consideraron que carecían de potencia in vitro como se indica por LP.
Tabla 10. Valores CI50 (ng de Ac/ml) de ADC anti-Notch humanizado (nd = no determinado).
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Modelos de xenoinjerto de tumor humano in vivo con AD C anti-Notch
Los anticuerpos anti-Notch humanizados, hu28 y hu75 y anticuerpos anti-Notch quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, se conjugaron a diversas combinaciones de engarce-carga útil y se probaron en cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC) 37622A1, cáncer pulmonar HCC2429, cáncer de mama Md A-MB-468 y modelos de xenoinjerto de cáncer gástrico N87. Para cada modelo descrito a continuación se dio la primera dosis el Día 0. Los tumores se midieron al menos una vez a la semana y su volumen se calculó con la fórmula: volumen (mm3) = 0,5 x (anchura del tumor2)(longitud del tumor). Los volúmenes medios de tumor (± S.E.M.) para cada grupo de tratamiento se calcularon teniendo un máximo de 10 animales y un mínimo de 6 animales a incluirse.
A. Xenoinjertos 37622A1 N SCLC
Los efectos de ADC anti-Notch se examinaron en ratones inmunodeficientes en el crecimiento in vivo de xenoinjertos de tumor humano que se establecieron a partir de fragmentos recientemente reseccionados de tumores 37622A1 N SCLC de acuerdo con procedimientos consentidos apropiados (Asterand). Los xenoinjertos derivados de pacientes 37622A1 N SCLC se pasaron subcutáneamente in vivo como fragmentos de animal a animal en ratones hembra desnudos (Nu/Nu). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 150 a 300 mm3, se fasearon para asegurar la uniformidad del tamaño tumoral entre diversos grupos de tratamiento. El modelo 37622A1 N SCLC se dosificó intravenosamente cuatro veces cada cuatro días (Q4dx4) con vehículo PBS, ACD anti-Notch humanizados, ADC huNeg-8.8 control y cisplatino a las dosis proporcionadas en la Tabla 11.
El cisplatino es un agente anti-cáncer basado en platino usado en el tratamiento de cáncer y considerado un patrón de terapia de cuidado. El cisplatino reticula el ADN induciendo de esta manera la apoptosis e inhibiendo el crecimiento celular. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de xenoinjertos 37622A1 NSCLC. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control. Adicionalmente, los datos muestran que los ADC anti-Notch inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que el cisplatino indicando una potencia mayor que un patrón de cuidado a base de platino de fármaco quimioterapéutico.
Tabla 11. Efectividad de ADC anti-Notch en xenoinjertos 37622A1 NSCLC.
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B. Xenoinjertos de pulmón HCC2429
Se realizaron experimentos similares in vivo con la línea celular pulmonar HCC2429 como se describe anteriormente. Para generar los xenoinjertos, los ratones femeninos (Nu/Nu) desnudos se implantaron subcutáneamente con células 3,5x106 HCC2429 en Mariel al 50 % (BD Vascuences). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 200 a 400 mm3, los tumores se fasearon para asegurar la uniformidad de la masa tumoral entre diversos grupos de tratamiento. El modelo pulmonar HCC2429 se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS, los ACD anti-Notch humanizados y los ADC control huNeg-8.8 a las dosis proporcionadas en las Tablas 12 y 13. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de pulmón HCC2429 de una manera dependiente de dosis. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control y las dosis 1 y 3 mg/kg para ADC anti-Notch con engarces-cargas útiles vc0101 y a las dosis 3 y 10 mg/kg para ADC anti-Notch con engarces-cargas útiles vc6780. Adicionalmente, los datos demuestran que una dosis 3 mg/kg de hu28-vc0101 fue más potente que una dosis 10 mg/kg de hu28-vc6780.
Tabla 12. Efectividad de ADC anti-Notch-vcO 101 en xenoinjertos de pulmón HCC2429.
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Tabla 13. Efectividad de ADC anti-Notch-vc6780 en xenoinjertos de pulmón HCC2429.
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El modelo pulmonar HCC2429 se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS, ADC anti-Notch quiméricos rata-humano y ADC huNeg-8.8 control, a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en la Figura 8A. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch con engarces no escindibles (mc) y escindibles (vc) y diversas combinaciones de cargas útiles inhibieron el crecimiento de xenoinjertos de pulmón HCC2429. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control. Adicionalmente, los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con engarces-cargas útiles vc0101 fueron más potentes que los otros ADC anti-Notch probados.
C. Xenoinjertos de mama MDA-MB-468
Se realizaron experimentos similares in vivo con la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468 como se describe anteriormente. Las células MDA-MB-468 se clasifican como un subtipo tipo basal de cáncer de mama triple negativo (TNBC) ya que carecen de la expresión del receptor de estrógeno, del receptor de progesterona y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico (HER2) (Lehmann, BD, y col., J Clin Invest. 2011;121(7):2750-2767). Para generar los xenoinjertos, se implantaron ortopédicamente ratones hembra SCID Outbred sin pelo (SHO) con células 10x106 MDA-MB-468 que contienen Mariel al 50 % (BD Vascuences) en la almohadilla grasa mamaria. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 250 a 450 mm3, los tumores se fasearon para asegurar la uniformidad de la masa tumoral entre diversos grupos de tratamiento. El modelo en mama MDA-MB-468 se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS, los ACD anti-Notch humanizados y los ADC control huNeg-8.8 a las dosis proporcionadas en las Tablas 14 y 15. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de mama MDA-MB-468 de una manera dependiente de dosis. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control y las dosis 1 y 3 mg/kg para ADC con engarces-cargas útiles vc0101 y a las dosis 1,3 y 10 mg/kg para ADC con engarces-cargas útiles vc6780. Adicionalmente, los datos demuestran que una dosis 1 mg/kg de ADC anti-Notch con engarces-cargas útiles vc0101 fueron más potentes que una dosis 3 mg/kg de ADC anti Notch con engarces-cargas útiles vc6780.
Tabla 14. Efectividad de ADC anti-Notch-vcO 101 en xenoinjertos de mama MDA-MB-468.
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Tabla 15. Efectividad de ADC anti-Notch-vc6780 en xenoinjertos de mama MDA-MB-468.
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El modelo de mama MDA-MB-468 también se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS, ADC anti-Notch quiméricos rata-humano y ADC huNeg-8.8 control, a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en las Figura 8B y 8C. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con engarces no escindibles (mc) y escindibles (vc) y diversas combinaciones de cargas útiles inhibieron el crecimiento de xenoinjertos de mama MDA-MB-468. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control. Adicionalmente, los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con engarces-cargas útiles vc0101 fueron más potentes que los otros ADC anti-Notch quiméricos rata-humano probados.
D. Xenoinjertos gástricos N87
Se realizaron experimentos similares in vivo con la línea celular gástrica N87 como se describe anteriormente. Para generar los xenoinjertos, los ratones femeninos (Nu/Nu) desnudos se implantaron subcutáneamente con células N87 7,5,5x106 en Mariel al 50 % (BD Vascuences). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 250 a 450 mm3, los tumores se fasearon para asegurar la uniformidad de la masa tumoral entre diversos grupos de tratamiento. El modelo gástrico N87 se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS, ACD anti-Notch humanizados, ADC huNeg-8.8 control y cisplatino a las dosis proporcionadas en las Tablas 16 y 17. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos gástricos N87 de una manera dependiente de dosis. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control a las dosis 1,3, 5 mg/kg para ADC con engarces-cargas útiles vc0101 y 3 y 10 mg/kg dosis para ADC con engarces-cargas útiles vc6780. Adicionalmente, los datos demuestran que los ADC con engarces-cargas útiles vc0101 fueron en general más potentes que el cisplatino patrón de terapia de cuidado y ADC con engarces-cargas útiles vc6780.
Tabla 16. Efectividad de ADC anti-Notch-vcO 101 en xenoinjertos gástricos N87.
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Tabla 17. Efectividad de ADC anti-Notch-vc6780 en xenoinjertos gástricos N87.
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El modelo gástrico N87 también se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS, ADC anti-Notch quiméricos rata-humano y ADC huNeg-8.8 control, a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en la Figura 8D. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con engarces no escindibles (mc) y escindibles (vc) y diversas combinaciones de cargas útiles inhibieron el crecimiento de xenoinjertos gásricos N87. Además, los datos muestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano inhibieron el crecimiento tumoral más potentemente que los ADC huNeg8.8 control. Adicionalmente, los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con engarces-cargas útiles vc0101 fueron más potentes que los otros ADC anti-Notch probados.
El modelo gástrico N87 también se dosificó intravenosamente Q4dx4 con vehículo PBS y ADC antiNotch quiméricos rata-humano ch28-m c0131, ch75-m c0131, ch28-m(H2O)c-0131 y ch75-m(H2O)c-0131 a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en la Figura 8E. Los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano que tienen engarces-cargas útiles mc0131 y m(H2O)c-0131 inhibieron el crecimiento de xenoinjertos gástricos N87. Además, los datos demuestran que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano con engarces-cargas útiles m(H2O)c-0131 fueron más potentes que los ADC anti-Notch quiméricos rata-humano que tienen engarces-cargas útiles mc0131.
Tabla 18A - Compuestos seleccionados (péptidos citotóxicos con engarces) de la invención
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Tabla 18B - Compuesto seleccionados (péptidos citotóxicos con engarces) de la invención
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Tabla 19A - Conjugados seleccionados de la invención
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Figure imgf000200_0001
(continuación)
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Tabla 19B - Conjugados seleccionados de la invención
Figure imgf000201_0002
(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
Figure imgf000210_0001
(continuación)
Figure imgf000211_0001
Tabla 20 - Valores CI50 para compuestos seleccionados (péptidos citotóxicos) de la invención
Figure imgf000212_0001
(continuación)
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(continuación)
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Figure imgf000222_0001
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Tabla 21B - Valores CI 50 para conjugados seleccionados de la invención
Figure imgf000225_0001
(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
Figure imgf000230_0001
(continuación)
Figure imgf000231_0001
Tabla 22 - Valores farmacocinéticos seleccionados en ratas para los conjugados de la invención y valores farmacocinéticos seleccionados en ratas para conjugados que comprenden MmAD, MMAE o MMAF. Las AUC se calcularon a 0-última de 0-336 h excepto donde se indique.
Figure imgf000231_0002
continuación
Figure imgf000232_0003
Tabla 23 - Valores farmacocinéticos seleccionados en ratones para conjugados de la invención y para conjugados que comprenden MMAD, MMAE o MMAF. Las AUC se calcularon a 0-última de 0-336 h excepto donde se indique.
Figure imgf000232_0001
Tabla 24 - Datos que muestran la estabilidad de los conjugados preparados usando engarces a base de succinimida de anillo abierto frente a de anillo cerrado.
Figure imgf000232_0002
continuación
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Tabla 25A - Cargas seleccionadas y sus procedimientos de síntesis
Figure imgf000233_0002
continuación
Figure imgf000234_0001
Tabla 25B - Cargas seleccionadas y sus nombres IUPAC y datos de caracterización
Figure imgf000234_0002
(Continuación)
Figure imgf000235_0001
(Continuación)
Figure imgf000236_0001
(Continuación)
7 9 9 0
Figure imgf000237_0001
(Continuación)
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula IV:
Figure imgf000268_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que, independientemente cada vez que aparece, W es
Figure imgf000268_0002
R1 es
Figure imgf000268_0003
Y es alquileno C 2 -C 20- o heteroalquileno C 2-C 20 , carbociclo C 3-C 8-, -arileno-, -heterociclo C 3-C 8-, -alquilen C 1 -C 10 -arileno-, -arilen-alquileno C 1 -C 10 -, -alquilen C 1 -C 10 -(carbociclo C 3-C 8)-, -(carbociclo C 3-C 8)-alquileno C 1 -C 10 -, -alquilen C 1 -C 10 -(heterociclo C 3-C 8 )- o -(heterociclo C 3-C 8)-alquileno C 1 -C 10 -;
Z'' es
Figure imgf000268_0004
Z''' es
Figure imgf000269_0001
R2 es hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 o haloalquilo C 1 -C 8 ;
R3A y R3B se definen como cualquiera de los siguientes:
(i) R3A es alquilo C 1 -C 8, haloalquilo C 1 -C 8, carbociclilo C 3-C 8 o halógeno; y
R3B es alquilo C 1 -C 8 , haloalquilo C 1 -C 8 , carbociclilo C 3-C 8 o halógeno; o
(ii) R3A y R3B tomados juntos son alquileno C 2 -C 8, o heteroalquileno C 1 -C 8;
R5 es
Figure imgf000269_0002
heterociclilo C 1 -C 10 , carbociclilo C 3-C 8 y arilo C 6-C 14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -alquilo C 1 -C 8 , -alquil C 1 -C 8-N(R')2 , -alquil C 1 -C8-C(O)R', -alquil C 1 -C 8-C(O)OR', -O-(alquilo C 1 -C 8 ), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2 , -NHC(O)R', -S(O)2 R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N 3 , -N(R')2 , -CN, -NHC(=NH)NH2 , -NHCONH 2 , -S(=O)2 R' y -SR', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C 1 -C 10
o R5 es
Figure imgf000269_0003
opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C 1 -C 8 , -alquil C t C 8-N(R')2 , -alquil C-i-C 8-C(O)R', -alquil C-i-C 8-C(O)OR', -O-(alquilo C 1 -C 8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH,
halógeno, -N 3 , -N(R')2 , -CN, -NHC(=NH)NH2 , -NHCONH 2 , -S(=O)2 R', -SR' y arileno-R', en los que cada R' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C 1 -C 8 , heterociclilo C 1 -C 8 , alquilen C 1 -C 10 -heterociclilo C 3-C 8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C 1 -C 10 ;
R6 es hidrógeno, -alquilo C 1 -C 8, -alquenilo C 2-C 8, -alquinilo C 2 -C 8 o -haloalquilo C 1 -C 8;
R12 es hidrógeno, alquilo C 1 -C 4 , heterociclilo C 1 -C 10 o arilo C 6-C 14 ;
R13 es heterociclilo C 1 -C 10 ; y
X es O.
2. Un compuesto de fórmula IV de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que W es
Figure imgf000270_0001
3. Un compuesto de fórmula IV de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R2 es hidrógeno o alquilo C 1 -C 8.
4. Un compuesto de fórmula IV de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R3A es alquilo C 1 -C 8, preferentemente metilo.
5. Un compuesto de fórmula C 1 -C 8 , IV de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R3B es alquilo C 1 -C 8, preferentemente metilo.
6. Un compuesto de fórmula IV o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R5 es
Figure imgf000270_0002
7. Un compuesto de fórmula IV de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, seleccionado entre:
Figure imgf000270_0003
y
Figure imgf000271_0001
8. Un conjugado de fármaco anticuerpo o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende un compuesto de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición de la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de cáncer.
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