ES2817751T3 - Purificación de conjugados de anticuerpo-fármaco mediante el uso de un gradiente de fosfato de sodio - Google Patents

Purificación de conjugados de anticuerpo-fármaco mediante el uso de un gradiente de fosfato de sodio Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de purificación de monómeros de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) a partir de agregados en una preparación de ADC, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) cargar una preparación de ADC sobre una columna de resina de hidroxiapatita, (ii) lavar dicha columna de resina de hidroxiapatita con una concentración baja de tampón de fosfato de sodio; y (iii) eluir dicha preparación de ADC a través de dicha columna con una concentración de crecimiento gradual de dicho tampón de fosfato de sodio, en el que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio de la etapa (iii) aumenta gradualmente desde una concentración de aproximadamente 5 a 35 mM hasta aproximadamente 130 a 150mM, por lo cual los monómeros de ADC purificados son separados a partir de dichos agregados.

Description

DESCRIPCIÓN
Purificación de conjugados de anticuerpo-fármaco mediante el uso de un gradiente de fosfato de sodio
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la purificación cromatográfica de monómeros de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) a partir de agregados, y de otras impurezas normalmente formadas en el procedimiento de fabricación de ADC, por elución de una preparación de ADC a través de una columna de resina de hidroxiapatita por el uso de un tampón de fosfato de sodio, de concentración variable, para obtener ADC purificado.
Antecedentes
Es deseable identificar procedimientos útiles para la purificación de biomoléculas (incluyendo proteínas, anticuerpos peptídicos, fragmentos de proteínas y anticuerpos y conjugados de anticuerpo-fármaco) que no destruyan o reduzcan significativamente la actividad biológica de estas moléculas.
La producción de ADC normalmente incluye la conjugación de una o más "cargas útiles" de moléculas pequeñas (frecuentemente un agente citotóxico) a un anticuerpo a través de un conector. El procedimiento de conjugación está diseñado para producir monómeros de ADC, dichos monómeros comprenden un anticuerpo individual conectado a una o más cargas útiles. Sin embargo, normalmente son halladas impurezas en el producto ("preparación de ADC") del procedimiento de conjugación de ADC. Estas impurezas son conocidas porque incluyen especies de bajo peso molecular (relativo a las especies de monómero ADC deseada) que comprenden principalmente anticuerpo no conjugado, carga útil no conjugada o "libre" y también especies tal como disolventes. Estas impurezas también son conocidas porque incluyen especies de alto peso molecular (en ocasiones denominadas HMWS, o especies de alta masa molecular - HMMS) tal como agregados.
La presencia de niveles altos de agregados afecta de manera adversa la seguridad al causar activación complementaria o anafilaxis tras la administración. La formación de agregados puede perjudicar los procedimientos de fabricación al causar reducción del rendimiento del producto y pérdida de la actividad. De este modo, los agregados deben ser retirados sustancialmente de las preparaciones de ADC antes de que esas preparaciones de ADC puedan ser usadas en aplicaciones terapéuticas o en estudios relacionados.
Los procedimientos de purificación más comunes para las preparaciones de conjugados de proteínas, tal como preparaciones de conjugados de fármacos de anticuerpos, son predicados sobre las diferencias en el tamaño, la carga útil y/o la solubilidad entre las moléculas de proteínas o a base de proteínas que serán purificadas comparado con las impurezas potenciales. Los protocolos basados en estos parámetros incluyen pero sin limitación cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía por exclusión de tamaño y cromatografía por interacción hidrófoba. Estos procedimientos cromatográficos, sin embargo, pueden presentar dificultades técnicas en la separación de especies agregadas o multiméricas de anticuerpos o conjugados de fármacos de anticuerpos. Las técnicas tales como cromatografía de intercambio de iones e interacción hidrófoba, por ejemplo, pueden realmente inducir la formación de agregados durante la purificación debido a un aumento de la concentración de proteínas o los cambios requeridos en la concentración de buffer y/o el pH durante la elución. Además, en varias instancias, los anticuerpos monoméricos y los correspondientes anticuerpos agregados muestran diferencias en los puntos isoeléctricos que son demasiado pequeños para permitir su separación por cromatografía de intercambio de iones. Tarditi, J. Immunol. Methods 599:13-20 (1992). Más aún, la cromatografía por exclusión de tamaño es problemática y resulta en la dilución significativa del producto monomérico de conjugado de anticuerpo-fármaco, el cual es un obstáculo en procedimientos de fabricación a gran escala, basados en la eficiencia. Puede ocurrir también filtración de ligandos de las columnas de cromatografía por afinidad, lo cual resulta en impurezas indeseables en el producto eluido. Steindl, J. Immunol. Methods 235:61-69 (2000).
De manera más general, a través de diversos procedimientos cromatográficos, las condiciones rigurosas de elución, cuando son usadas en un intento de romper la estrecha unión de una proteína o ADC a una matriz, son conocidas por destruir la actividad biológica de la proteína o el ADC.
En el caso de ADC anti-Notch 3 del tipo desvelado en el documento WO2014/072987, por ejemplo, el ADC Notch3:
Figure imgf000002_0001
(en el que X es un anticuerpo anti-Notch 3) intenta retirar impurezas que comprenden agregados de preparaciones de ADC anti-Notch 3 por el uso de cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de intercambio de cationes, así como cromatografía por interacción hidrófoba han sido encontrados problemáticos o ineficientes, dado que ninguno de estos procedimientos de la forma en que fueron practicados fueron capaces de remover de manera sustancial y eficiente los agregados de las preparaciones de ADC anti-Notch 3 manteniendo al mismo tiempo la relación deseada de fármaco a anticuerpo (DAR) del ADC anti-Notch 3 entre 3 y 5, preferentemente aproximadamente 4. Ha sido demostrado que la mezcla de ADC con la DAR promedio de aproximadamente 4 produce el mejor índice terapéutico en modelos in-vivo e in-vitro para algunos ADC. Hamblett et al., Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate, Clin Cancer Res 10:7063-7070 (2004).
La resina de hidroxiapatita está compuesta por un fosfato de calcio insoluble que forma tanto la matriz como el ligando. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10 (4) pp. 440-6; 2009. Kevin Beam, Gagnon, Pete. Validated Biosystems, San Clemente, CA 92672, USA.
Los grupos funcionales consisten en pares de iones de calcio cargados positivamente (sitios C) y racimos de grupos de fosfato cargados negativamente (sitios P). Las interacciones entre la hidroxiapatita y las proteínas son complejas y multimodo. En un procedimiento de interacción, sin embargo, los grupos amino cargados positivamente sobre las proteínas se asocian con los sitios P cargados negativamente y los grupos carboxilo interactúan por complejación por coordinación a los sitios C. Shepard, S. J. of Chromatography 891:93-98(2000). La hidroxiapatita cristalina fue el primer tipo de hidroxiapatita usado en cromatografía, pero estaba limitado por sus dificultades estructurales. La cromatografía con hidroxiapatita cerámica (cHA) fue desarrollada para solucionar algunas de las dificultades asociadas con la hidroxiapatita cristalina, tal como los flujos limitados. La hidroxiapatita cerámica tiene alta durabilidad, buena capacidad de unión a las proteínas, y puede ser usada a caudales y presiones más altas que la hidroxiapatita cristalina. Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993).
La cromatografía con hidroxiapatita ha sido intentada en la separación de proteínas (tal como anticuerpos) y ácidos nucleicos. En dichos intentos la columna puede ser equilibrada, y la muestra aplicada, en una concentración baja de tampón de fosfato y las proteínas adsorbidas luego son eluidas en un gradiente de concentración indistintamente de un cloruro de sodio o un tampón de fosfato (tampón de fosfato de potasio o de sodio). Véase, por ej., Giovanni, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000), particularmente en las páginas 524-525 ("antibody peak contained several impurities"); y Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985). Sin embargo, dichos intentos de uso de los gradientes para separar anticuerpos monoclonales (mAb) particularmente para los IgG han sido menos efectivos, resultante en la resolución escasa y una falla en el retiro de impurezas. Ha sido demostrado que los tampones de cloruro de sodio y gradientes, además de los tampones de fosfato son en cierta forma más efectivos en la purificación de mAb (documento WO2005/044856).
A pesar del uso de resina de hidroxiapatita para separar anticuerpos, este material no ha sido usado exitosamente para purificar ADC incluyendo los ADC Notch 3 del tipo desvelado en el documento WO2014/072987. Los intentos en la purificación de ADC por el empleo de gradientes diferentes de tampón de cloruro de sodio durante la elución han sido inefectivos en la remoción de impurezas agregadas de las preparaciones de ADC, y no fue esperado que los tampones de fosfato y gradientes, que han demostrado ser inefectivos en la purificación de mAb (particularmente IgG), removieron efectivamente las impurezas agregadas. De este modo, existe la necesidad de lograr procedimientos eficientes de remoción de impurezas agregadas de las preparaciones de ADC cuyos procedimientos no destruyen la actividad biológica de los monómeros de ADC deseados.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra la separación de agregados por el uso de un gradiente de fosfato sobre una columna de resina de hidroxiapatita.
La FIG. 2 muestra la separación de agregados por el uso de un gradiente de fosfato sobre una columna de resina de hidroxiapatita a un pH 7,5.
La FIG. 3 muestra la purificación del ADN Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita por el uso de un gradiente en etapa.
La FIG. 4 muestra la purificación del ADN Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita por el uso de un gradiente en etapa.
La FIG. 5 muestra la purificación del ADN Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita por el uso de una fase móvil que contiene una concentración baja de cloruro de sodio.
La FIG. 6 muestra la purificación del ADN Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita por el uso de una fase móvil que tiene una concentración alta de cloruro de sodio.
Sumario de la invención
El alcance de la invención está definido en las reivindicaciones. Cualquier tópico por fuera del alcance de las reivindicaciones es proporcionado solo para fines informativos. Inesperadamente, ha sido descubierto que un gradiente de fosfato novedoso de acuerdo con lo descrito en las reivindicaciones puede ser usado en un procedimiento de cromatografía con hidroxiapatita para la purificación de monómeros de a Dc de las impurezas agregadas por remoción selectiva de agregados, así como impurezas de peso molecular bajo como disolventes orgánicos y carga no conjugada ("libre"). De este modo, la presente invención se refiere a procedimientos de remoción de agregados a partir de monómeros de ADC en preparaciones de ADC, por contacto de dichas preparaciones de ADC con una resina de hidroxiapatita y eluyendo selectiva y separadamente los agregados y los monómeros de ADC de la resina por el uso de un gradiente de fosfato de sodio.
En realizaciones de la invención un volumen predeterminado de un tampón de elución de fosfato de sodio es aplicado a una columna de hidroxiapatita. En ciertas realizaciones el volumen predeterminado de tampón de elución de fosfato de sodio es de 15 - 25 volúmenes de columna. En una realización preferente el volumen predeterminado de tampón de elución de fosfato de sodio es de 20 volúmenes de columna.
En otra realización, la preparación de ADC es purificada para contener menos que 3% de agregados. En una realización adicional, la preparación de ADC purificada contiene menos que 1% de agregados.
En una realización adicional, la preparación de ADC contiene al menos un anticuerpo de IgG. Más específicamente, la preparación de ADC contiene al menos un anticuerpo Notch 3 conjugado a un fármaco de molécula hidrófoba pequeña.
Pueden ser usados el procedimiento o procedimientos de purificación adicionales en combinación con la cromatografía con hidroxiapatita de la invención, incluyendo, pero sin limitación, cromatografía por afinidad, cromatografía pro interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad de metales inmovilizados, cromatografía por exclusión de tamaño, diafiltración, ultrafiltración, cromatografía de intercambio de aniones, y/o cromatografía de intercambio de cationes.
En una realización de la invención es proporcionado un procedimiento para purificación de los monómeros de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de los agregados en una preparación de ADC, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (i) cargar una preparación de ADC sobre una columna de resina de hidroxiapatita, (ii) lavar la columna de resina de hidroxiapatita con una concentración baja de tampón de fosfato de sodio; y (iii) eluir la preparación de ADC a través de la columna con una concentración que aumenta gradualmente de tampón de fosfato de sodio según lo definido en las reivindicaciones; por las cuales los monómeros de ADC purificados son separados de dichos agregados. La concentración de fosfato de sodio representado en un gradiente de dicha realización aumentaría linealmente (gradiente lineal) o no linealmente (gradiente no lineal).
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente lineal) también incluyen aquellas en las que el volumen de tampón de fosfato de sodio en la etapa (ii) es de aproximadamente 1-5 volúmenes de columna; y preferentemente aproximadamente 3 volúmenes de columna.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente lineal) también incluyen aquellas en las que el volumen de tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es de aproximadamente 5-25 volúmenes de columna; y preferentemente aproximadamente 20 volúmenes de columna.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente lineal) también incluyen aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (ii) es de aproximadamente 5 a 35 mM.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente lineal) son aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) aumenta gradualmente de aproximadamente 5 a 35 mM a aproximadamente 130 a 150 mM.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal) también incluyen aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es inicialmente de aproximadamente 20-25 mM y es aumentada gradualmente hasta aproximadamente 140 mM.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal) también incluyen aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es aumentada gradualmente hasta aproximadamente 130-150 mM durante un período de tiempo definido; preferentemente en el que el período de tiempo definido es de 112-188 minutos; más preferentemente aproximadamente 150 minutos.
En otra realización de la invención es proporcionado un procedimiento de "gradiente en etapas" para purificación de los monómeros de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de los agregados en una preparación de ADC, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (i) cargar una preparación de ADC sobre una columna de resina de hidroxiapatita, (ii) lavar la columna de resina de hidroxiapatita con una concentración baja de tampón de fosfato de sodio; y (iii) eluir dicha preparación de ADC a través de la columna con una concentración alta de tampón de fosfato de sodio según lo definido en las reivindicaciones; por las cuales los monómeros de ADC purificados son separados de dichos agregados.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente en etapas) también incluyen aquellas en las que el volumen de tampón de fosfato de sodio en la etapa (ii) es de aproximadamente 1-5 volúmenes de columna; y preferentemente aproximadamente 3 volúmenes de columna.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente en etapas) también incluyen aquellas en las que el volumen de tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es de aproximadamente 5-25 volúmenes de columna; y preferentemente aproximadamente 20 volúmenes de columna.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente en etapas) también incluyen aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (ii) es de aproximadamente 5 a 35 mM.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente en etapas) también incluyen aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es de aproximadamente 80 -130 mM.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente en etapas) también incluyen aquellas en las que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es de aproximadamente 100 mM.
También son proporcionadas realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) en las que la aplicación del gradiente en etapas resulta en ADC purificado que contiene menos de 5% de agregados; menos de 3% de agregados; y/o menos de 1% de agregados. Adicionalmente, las realizaciones de la invención incluyen aquellas en las que el ADC purificado es al menos 95% monómero de ADC; el ADC purificado es al menos 97% monómero de ADC; y/o el ADC purificado es al menos 99% monómero de ADC.
Las realizaciones de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que el buffer usado en la etapa (iii) tiene un pH de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,5, y preferentemente un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,3.
Incluso en realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que el componente del anticuerpo del ADC es un anticuerpo IgG, IgA, IgD, IgE, o IgM; y en las que el componente del anticuerpo del ADC es monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado o un fragmento de éstos.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que la resina es hidroxiapatita cerámica tipo I o tipo II.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que la preparación del ADC es primero someter a cromatografía de intercambio de iones o aniones.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) incluyen aquellas en las que el ADC comprende un anticuerpo anti-Notch 3 y una carga útil de auristatina; por ejemplo el ADC anti-Notch 3 de la fórmula:
Figure imgf000005_0001
en la que X es un anticuerpo anti-Notch 3.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que la preparación del ADC contiene un disolvente orgánico, por el cual el ADC purificado es sustancialmente separado de dicho disolvente. El disolvente orgánico puede ser sulfóxido de dimetilo (DMSO).
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que la preparación del ADC contiene moléculas de carga útil no conjugadas, por lo cual el monómero de ADC purificado es sustancialmente separado de dichas moléculas de carga útil no conjugadas.
Las realizaciones adicionales de la invención (procedimiento con gradiente lineal o en etapas) también incluyen aquellas en las que el ADC purificado contiene una DAR promedio de entre 3 y 5; y preferentemente entre 3,5 y 4,5.
Los objetos y las ventajas adicionales de la invención serán establecidos en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvios a partir de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Los objetos y las ventajas de la invención serán realizados y logrados por medio de los elementos y las combinaciones indicados particularmente en las reivindicaciones anexas.
Los dibujos adjuntos, que son incorporados en esta memoria descriptiva y constituyen parte de esta, y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.
Descripción detallada
Definiciones
Con el fin de que la presente invención pueda ser comprendida más fácilmente, en primer lugar son definidos ciertos términos. Las definiciones adicionales son establecidas toda lo largo de la descripción detallada.
El término "anticuerpo" (o "Ab") en la presente memoria es usado en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ej., anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo que exhiben la actividad biológica deseada. Un anticuerpo intacto tiene principalmente dos regiones: una región variable y una región constante. La región variable se une al antígeno diana e interactúa con este. La región variable incluye una región determinante de complementariedad (CDR) que reconoce un sitio de unión específico sobre un antígeno particular y se une a este. La región constante puede ser reconocida por el sistema inmune e interactuar con éste (véase, por ej., Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo o clase (por ej., IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) o subclase (por ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) de inmunoglobulina. El anticuerpo puede derivar de cualquier especie adecuada. En algunas realizaciones, el anticuerpo es de origen humano o murino. Un anticuerpo puede, por ejemplo, ser humano, humanizado o quimérico. De este modo, el término incluye cualquier inmunoglobulina o fragmento de ésta, y abarca cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión al antígeno. El término incluye, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, humanos, de cadena simple, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados y generados in vitro. El término "anticuerpo" también incluye fragmentos de anticuerpo tal como Fab, F(ab')~, Fv, scFv, Fd, dAb, y otros fragmentos de anticuerpo que retienen la función que se une al antígeno. Normalmente, tales fragmentos comprenden un dominio que se une al antígeno. Se encuentran definiciones adicionales de anticuerpos en el documento WO2013/072813 que es incorporado a la presente memoria.
"Conjugado anticuerpo-fármaco" o "ADC" se refiere a anticuerpos, o sus fragmentos que se unen al antígeno y son conjugados a un fármaco tal como un agente citotóxico, citostático, y/o terapéutico, según lo descrito en la presente memoria a continuación. Por ejemplo, un agente citotóxico puede estar conectado o conjugado a un anticuerpo anti-Notch3 de acuerdo con lo descrito en la presente memoria para administración local dirigida del agente citotóxico a tumores (por ej., tumor que expresa Notch 3).
Los anticuerpos anti-Notch3 ejemplares incluyen hu28 y hu75, y los ADC anti-Notch3 ejemplares incluyen hu28-vc0101, hu75-vc0101, hu28-vc678o y hu75-vc6780.
El término "volumen de columna" se refiere al volumen total del lecho de resina que está empacado en la columna de cromatografía (normalmente n r2h en el que r es el radio de la columna y h es la altura del lecho de resina en la columna).
El término "fármaco" es usado en la presente memoria como sinónimo de "carga útil" y se refiere al compuesto químico de molécula pequeña o a la proteína o fragmento de proteína que está conjugado, o que será conjugado, al anticuerpo. De este modo, en algunas realizaciones, el fármaco es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente citotóxico o un agente de imágenes. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste en una antraciclina, una auristatina, una dolastatina, una duocarmicina, una endiína, una geldanamicina, una maytansina, una puromicia, un taxano, un alcaloide vinca, SN-38, una tubulisina, una hemiasterlina y sus estereoisómeros, isósteros, análogos o derivados. En algunas realizaciones, el fármaco es un polímero o un polipéptido biocompatible. "Fármaco" como es usado en la presente memoria no debe ser considerado como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada.
El término "relación fármaco a anticuerpo" (abreviada "DAR") se refiere al número de moléculas de fármaco conjugadas por anticuerpo. Las composiciones, partidas y/o formulaciones de una pluralidad de conjugados de anticuerpo-fármaco pueden ser caracterizadas por una DAR promedio. La DAR y DAR promedio pueden ser determinadas por varios medios convencionales tal como espectroscopía UV, espectroscopía de masa, ensayo ELISA, procedimientos radiométricos, cromatografía por interacción hidrófoba (HIC), electroforesis y HPLC.
Un "agente contra el cáncer" incluye, pero sin limitación, un fármaco enumerado a continuación: metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, etoposidas, camptotecinas, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel, y docetaxel, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, taxanos tal como docetaxel y paclitaxel, leucovorina, levamisol, irinotecano, estramustina, etoposida, nitrosoureas tal como carmustina y lomustina, Lasparaginasa, topotecan, mostazas de nitrógeno, citoxano, etoposida, BCNU, alcaloides vinca, compuestos de platino, mitomicina, gemcitabina, hexametilmelamina, temsirolimo (CCI-779); lapatinib (GW 572016); RAD-001 (everolimo); XRP-9881; ixabepilona (BMS-247550); pertuzumab (OMNITARG, 2C4); topotecan, inhibidores de quinasa de la tirosina, tirfostinas, mesilato de imatinib (GLEEVEC), herbimicina A, genisteina, erbstatina, y lavendustina A. En otras realizaciones, los quimioterapéuticas adecuados incluyen, pero sin limitación, agentes de alquilación: mostazas de nitrógeno (por ej., ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida, clorambucilo); nitrosoureas (por ej., carmustina (BC-NU), lomustina (CCNU)); alquilsulfonatos (por ej., busulfan, treosulfan); triazenos (por ej., dacarbazina); Compuestos que contienen platino (por ej., cisplatino, carboplatino, aroplatino, oxaliplatino); Alacaloides vegetales: Alcaloides vinca (por ej., vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina); Taxoides (por ej., paclitaxel, docetaxel; inhibidores de topoisomerasa del ADN: epipodofilinas (por ej., etoposida, teniposida, topotecano, 9-aminocamptotecina, camptotecina, crisnatol); mitomicinas (por ej., mitomicina C, anti-metabolitos); anti-folatos: inhibidores de DHFR (por ej., metotrexato, trimetrexato), inhibidores de deshidrogenasa de IMP (por ej., ácido micofenólico, tiazofurina, ribavirina, EICAR); inhibidores de ribonucleótido reductasa (por ej., hidroxiurea, deferoxamina); análogos de pirimidina: análogos de uracilo (por ej., 5-fluorouracilo, floxuridina, doxifluridina, ratitrexed); análogos de citosina (por ej., citarabina (ara C), arabinósido de citosina, fludarabina); análogos de purina (por ej., mercaptopurina, tioguanina); antimetabolitos de ADN (por ej., 3-HP, 2'-desoxi-5-fluorouridina, 5-HP, alfa-TGDR, glicinato de afidicolina, ara-C, 5-aza-2'-deoxicitidina, beta- TGDR, ciclocitidina, guanazol, glicodialdehído de inosina, macebecina II, pirazoloimidazol); Terapias hormonales: Antagonistas del receptor: Anti-estrógeno (por ej., tamoxifeno, raloxifeno, megestrol); inhibidores de aromatasa (por ej., exemestano, anastrozol, letrozol); antagonistas de GnRH (por ej., abarelix, histrelina); moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM) (por ej., lasofoxifeno); agonistas de LH-RH (por ej., goserelina, triptorelina, buserelina, acetato de leuprolida); Anti-andrógenos (por ej., flutamida, bicalutamida, nilutamida, megestrol, ciproterona); Retinoides/Deltoides, ácido cis-retinoico; derivado de vitamina A (por ej., ácido alltrans retinoico (ATRA-IV)); análogos de vitamina D3 (por ej., EB 1089, CB 1093, KH 1060); terapias fotodinámicas (por ej., vertoporfina (BPD-MA), ftalocianina, fotosensibilizador Pc4, demetoxi-hipocrelina A (2BA-2-DMHA); Inhibidores de angiotensina: angiostatina (fragmento plasminógeno), antitrombina antiangiogénica III, 2-metoxiestradiol; Agentes Antimitóticos (por ej., alocolcicina, halicondrina B, colquicina, derivado de colquicina, dolstatina 10, maitansina, rizoxina, tiocolquicina, tritil cisteína); Otros agentes: inhibidores de isoprenilación; neurotoxinas dopaminérgicas (por ej., ión de 1 -metil-4-fenilpiridinio); inhibidores del ciclo celular (por ej., estaurosporina): actinomicinas (por ej., actinomicina D, dactinomicina); bleomicinas (por ej., bleomicina A2, bleomicina B2, peplomicina); antraciclinas (por ej., daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina, epirubicina, pirarubicina, zorubicina, mitoxantrona); inhibidores de mTOR (por ej., temsirolimo, everolimo); inhibidores de MDR (por ej., verapamil); inhibidores de Ca2+ ATPasa (por ej., tapsigargina); agonistas del receptor símil toll (por ej., CpG-7909, también conocido como PF03512676 o PROMUNE; Coley Pharm); moléculas coestimuladoras (por ej., entre muchos otros agentes conocidos en la técnica. Los agentes adicionales contra el cáncer que pueden ser usados en los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; amifostina trihidrato; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; azacitidina; azetepa; azotomicina; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; bortezomib; brequinar sódico; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; capecitabina; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; clorambucilo; cladribina; clodronato; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; darbepoyetina; clorhidrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatino; dexrazoxano; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; dietilstilbestrol; docetaxel; doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; farmorubicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; erlotinib; eritropoyetina; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etoposida; fosfato de etoposida; etoprina; everolimo; exemestano; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgastrim (G-CSF); floxuridina; fosfato de fludarabina; fludrocortisona; fluorouracilo; fluoximesterona; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; fulvestrant; gefitinib; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; gemtuzumab; goserelina; imatinib; clorhidrato de irinotecan; ixabepilona; cetoconazol; acetato de lanreotida; lapatinib; letrozol; leucovorin; acetato de leuprolida; levamisol; clorhidrato de liarozola; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maytansina; clorhidrato de mecloretamina; medroxiprogesterona; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogarilo; mercaptopurina; mesna; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; octreotida; ormaplatino; oxaliplatino; oxisuran; paclitaxel; pamidronato; peliomicina; pentamustina; pentostatina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobroman; piposulfan; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfímero; porfiromicina; prednimustina; pemetrexed; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; raltitrexed; riboprina; rituximab; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; sunitinib; estreptozocina; talisomicina; tecogalan sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; temozolomida; temsirolimo; teniposida; teroxirona; testolactona; talidomida; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; topotecan; citrato de toremifeno; trastuzumab; tretinoina; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; topotecan; clorhidrato de tubulozol; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; zolendronato; clorhidrato de zorubicina. Otros fármacos contra el cáncer que pueden ser usados incluyen, pero sin limitación: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína 1 morfogenética anti-dosalización; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplastona; oligonucleótidos antiesntido; glicinato de afidicolina; moduladores del gen de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina deaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilstaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionine sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptoteecina; canarypox IL-2; capecitabina; carboxamida- amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor de derivados del cartílago; carzelesina; inhibidores de quinasa de la caseína (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalin sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina B; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; octofosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; dehidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-dioxamicina; espiromustina de difenilo; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifena; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de estrógenos; etanidazol; fosfato de etoposida; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texapirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor del factor 1 de crecimiento similar a insulina; agonistas de interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; iododoxorubicina; ipomeanol, 4-iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; jasplaquinolida; cahalalida F; triacetato de lamelarin-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de leucenia; interferón alfa de leucocitos; leuprolida+estrógeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipofílico; compuestos de platino lipofílicos; lisoclinamida 7; lobaplatio; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecan; texafirina de lutetio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarone; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN de hebra doble no coincidentes; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; saporina del factor de crecimiento de fibroblastos de mitotoxina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; sk de la pared celular de miobacterias lípido monofosforilo A; mopidamol; inhibidor genético de resistencia a múltiples fármacos; terapia a base del supresor 1 de tumores múltiples; agente anti-cancerígeno de mostaza; micaperóxido B; extracto de la pared celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavin; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; o6-bencilguanina; octreótido; oquicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; inductor de citoquina oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato sódico de pentosan; pentostatina pentrozol; perflubron; perfosfamida; alcohol perelílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanilo; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador de plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfímero sódico; porfiromicina; prednisona; bis-acridona de propilo; prostaglandina J2; inhibidores de proteasom; modulador inmune a base de proteína A; inhibidor de quinasa C de la proteína; inhibidores de quinasa C de la proteína, microalgal; inhibidores de fosfatasa de tirosina de la proteína; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxitileno de hemoglobina piroxilada; antagonistas raf; raltitrexed; ramosetron; inhibidores de transferasa de proteínas ras famesilo; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohituquina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcoftol A; sargramostim; imitadores de Sdi 1; semustina; inhibidor derivado de senesencia 1; oligonucleótidos sentido; inhibidores de transducción de señal; moduladores de transducción de señal; proteína que se une al antígeno de cadena simple; sizofuran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína que se une a somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; esqualamina; inhibidor de mastocitos; inhibidores de la división celular; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista peptídico intestinal superactivo vasoactivo; suradista; suramina; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; metioduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilio; inhbidores de telomerasa; temoporfina; temozolomida; teniposida; tetraclorodecaoxida; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; imitador de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinan; hormona estimulante de tiroides; etiopurpurina de etilo y estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifena; factor de mastocitos titopotentes; inhibidores de traducción; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosterida; inhibidores de quinasa de la tirosina; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor de crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de uroqinasa; vapreotida; variolina B; sistema vector, terapia genética de eritrocitos; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalámero de zinostatina.
El término "preparación de conjugado de anticuerpo-fármaco" se refiere a cualquier composición que contiene ADC e impurezas potencialmente indeseadas, por ejemplo, especies de alto peso molecular tal como agregados, disolventes, fármacos residuales libres y especies relacionadas, y otras especies resultantes de o que permanecen del procedimiento de conjugación.
"Hidroxiapatita cerámica" o "cHA" se refiere a un fosfato de calcio hidroxilado insoluble de la fórmula [Capp(PO4)p(OH)~], que ha sido sinterizado a altas temperaturas en una forma cerámica esférica, macroporosa. El término "cHA" abarca, pero sin limitación, hidroxiapatita cerámica de Tipo I y Tipo II. A menos que sea especificado, "cHA" se refiere a cualquier tamaño de partículas que incluye, pero sin limitación, 20, 40 y 80 mm.
El término "especies de alto peso molecular" o "HMWS" se refiere a cualquier impureza de alto peso molecular, pero normalmente a un agregado. (Las especies de alto peso molecular son referidas en ocasiones como especies de alta masa molecular, o HMMS, en la bibliografía científica.)
Un "agregado" es una asociación de al menos dos o más componentes seleccionados de anticuerpos no conjugados y monómeros de ADC (por ej., dímeros que comprenden dos monómeros de ADC, dímeros que comprenden un anticuerpo no conjugado y un monómero de ADC, trímeros que comprenden diversas combinaciones de monómeros de ADC y anticuerpos no conjugados, y similares). Un agregado puede surgir por cualquier procedimiento que incluya, pero sin limitación, reticulación covalente, no covalente, de disulfuro o no reducible. La porción de anticuerpo de los componentes agregados puede estar en la forma de un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo, u otras formas descritas en la definición de "anticuerpo" anterior.
El término "vc" o "conector vc" se refiere a maleimidocaprónico-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo, también denominado "mcValCitPABC-" o "MalCValCitPABC-", que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000009_0001
El término "0101" o "carga útil de 0101" se refiere a (2-metilalanil-W -[(3R4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-m etoxi-2-m etil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]am ino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-M-metil-L-valinamida), que tiene la siguiente estructura:
El término "6780" o "carga útil de 6780" se refiere a (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]am ino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxo heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida), que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000010_0001
Descripción del procedimiento
La presente invención proporciona procedimientos de extracción de especies de alto peso molecular, específicamente agregados, de las preparaciones de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) por el uso de cromatografía con hidroxiapatita y una elución con gradiente de fosfato. La presente invención es útil para purificación a gran escala de las preparaciones de conjugado de anticuerpo-fármaco. El procedimiento usa un soporte de hidroxiapatita cargado con fosfato a pH neutro y baja potencia iónica para unir tanto los monómeros de conjugado de anticuerpo-fármaco como los agregados correspondientes. Después, la columna es lavada con un tampón de fosfato para retirar las impurezas unidas libremente tal como disolvente y compuestos residuales de molécula pequeña. Luego, el ADC es eluido selectivamente por el uso de un tampón de fosfato de potencia creciente bajo condiciones de gradiente que contiene de aproximadamente 5-35 mM a aproximadamente 130-150 mM (preferentemente 140 mM) fosfato de sodio a pH levemente ácido a levemente alcalino. Los agregados son separados de los monómeros de ADC en estas condiciones de gradiente. La resina es regenerada opcionalmente por el uso de solución tampón de fosfato de sodio o potasio de potencia iónica superior. La resina es lavada opcionalmente con solución acuosa de hidróxido de sodio.
En una realización de la invención, la preparación de ADC purificado contiene menos de 3% de agregados, y en otra realización menos de 1% de agregados.
La presente invención proporciona además monómeros de ADC que tienen una DAR promedio optimizada y distribución estrecha de DAR. La DAR promedio y la distribución de DAR pueden tener un efecto sobre la eficacia clínica de un ADC, un efecto tanto sobre la potencia como la toxicidad potencial del ADC, y pueden tener un efecto significativo sobre las propiedades, tales como estabilidad y agregación del ADC.
La distribución de DAR proporciona el porcentaje o la fracción de varias especies de monómero de ADC, por ej., DAR 0 a 8, que puede estar presente en una composición, partida y/o formulación de ADC. La distribución de DAR de una composición, partida y/o formulación de ADC puede ser determinada por procedimientos conocidos en la técnica, tal como UV, cromatografía por interacción hidrófoba (YHIC), enfoque isoeléctrico con capilares (cIEF) o cromatografía de fase inversa reducida (RP-HPLC). La distribución de DAR de una composición, partida y/o formulación de ADC puede ser caracterizada como una mezcla altamente heterogénea con una distribución de DAR amplia, que generalmente contiene un rango amplio de especies de monómero ADC con DAR 0 a 8. La distribución de DAR de una composición, partida y/o formulación de ADC puede ser caracterizada como una mezcla altamente homogénea con una distribución de dA r estrecha, que generalmente contiene un rango estrecho de especies de monómero ADC que tienen un DAR particular, tal como DAR 3 a 5.
En aspectos particulares de la presente invención, la conjugación mejorada y las condiciones de purificación desveladas en la presente memoria proporcionan ADC anti-Notch 3 con una DAR promedio optimizada en el intervalo de aproximadamente 3 a 5, preferentemente aproximadamente 4, y una distribución de DAR estrecha, por ejemplo, menos heterogeneidad, en especies de monómeros con una DAR de 3 a 5 (que son las más deseadas).
En aspectos particulares de la invención, es beneficioso eliminar los ADC con una DAR alta (DAR > 6) que son más hidrófobos y demuestran depuración más rápida, lo que puede contribuir a toxicidad más alta y reducir el índice terapéutico (TI). En otros aspectos de la invención, es beneficioso eliminar los ADC con una DAR baja (DAR <2) lo que contribuye poco a la eficacia, sin embargo, proporcionan un aumento en las cantidades de anticuerpo no conjugado que pueden competir con los ADC para el antígeno diana, tal como Notch 3, y conducir a TI inferior. En otro aspecto de la invención, es beneficioso eliminar los ADC con una DAR alta (DAR >6) y los ADC con una DAR baja (DAR <2).
En una realización de la invención el ADC purificado contiene una carga útil del fármaco (relación fármaco a anticuerpo, DAR) entre 3,5 y 4,5 y en otra realización entre 3 y 5.
Resina de hidroxiapatita
Diversas resinas cromatográficas de hidroxiapatita se encuentran comercialmente disponibles, y cualquier forma disponible del material puede ser usada en la práctica de esta invención. En una realización de la invención, la hidroxiapatita está en una forma cristalina. Las hidroxiapatitas para usar en esta invención pueden ser aquellas que son aglomeradas para formar partículas y sinterizadas a altas temperaturas en una masa cerámica porosa estable. El tamaño de partículas de la hidroxiapatita puede variar ampliamente, pero un tamaño de partículas normal oscila de 1 |jm a 1.000 |jm de diámetro, y puede ser de 10 jim a 100 jim. En otra realización de la invención, el tamaño de partícula es 20 jm . En otra realización de la invención, el tamaño de partícula es 40 jm . Incluso en otra realización de la invención, el tamaño de partícula es 80 jm . Puede ser empleado un número de soportes cromatográficos en la preparación de las columnas de cHA; las usadas más extensivamente son la hidroxiapatita Tipo I y Tipo II. El tipo I tiene una capacidad alta de unión a la proteína y mejor capacidad por las proteínas ácidas. La selección de un tipo particular de hidroxiapatita puede ser determinada por el experto en la técnica.
La presente invención puede ser usada con resina de hidroxiapatita que esté libre, empaquetada en una columna, o en un cromatógrafo anual continuo. En una realización de la invención, la hidroxiapatita cerámica está empaquetada en una columna. La elección de las dimensiones de la columna puede ser determinada por el experto en la técnica. En una realización de la invención, un diámetro de columna de al menos 1 cm con una altura de lecho de aproximadamente 22 cm puede ser usado para purificación a pequeña escala. En una realización adicional de la invención, puede ser usado un diámetro de columna de aproximadamente 7 cm a aproximadamente 30 cm. En ciertas realizaciones de la invención, una suspensión de resina de hidroxiapatita cerámica en solución de fosfato de sodio hasta 200 mM a pH 7,0 puede ser usada para empaquetar la columna a un caudal constante de aproximadamente 4 cm/min o con gravedad.
Las resinas de hidroxiapatita del tipo útil en esta invención pueden ser obtenidas a partir de Bio-Rad.
Composiciones tampón y condiciones de carga
Antes de poner en contactar la resina de hidroxiapatita con la preparación de ADC, puede ser necesario ajustar los parámetros tal como pH, potencia iónica y temperatura y en algunas instancias la adición de sustancias de diferentes clases. De este modo, es una etapa opcional realizar un equilibrio de la matriz de hidroxiapatita por su lavado con una solución (por ej., un tampón para ajuste del pH, potencia iónica, etc., o para la introducción de un detergente) logrando las características necesarias para la purificación de la preparación de anticuerpos. En la cromatografía con hidroxiapatita de modo combinado unión/elución, la matriz de hidroxiapatita es equilibrada y lavada con una solución. En una realización de la invención, la matriz puede ser equilibrada usando una solución que contiene fosfato de sodio de 5 mM a 500 mM a pH levemente alcalino o levemente ácido. Por ejemplo, el tampón de equilibrio puede contener fosfato de sodio 10 a 500 mM, en otra realización puede contener fosfato de sodio 5 a 10 mM, en otra realización puede contener fosfato de sodio 2 a 5 mM, en otra realización puede contener fosfato de sodio 2 mM, y en otra realización puede contener fosfato de sodio 5 mM. El pH del tampón de carga puede oscilar de 6,8 a 8,0. En una realización, el pH puede ser de 7,0 a 7,3, y en otra realización el pH puede ser de 7,5. La preparación de ADC puede ser también intercambiada con tampón en un tampón apropiado o tampón de carga en la preparación por cromatografía con hidroxiapatita. Por ejemplo, el tampón de carga puede contener fosfato de sodio 2 mM a 10 mM, en otra realización puede contener fosfato de sodio 2 a 8 mM, en otra realización puede contener fosfato de sodio 3 a 7 mM, y en otra realización puede contener fosfato de sodio mM. En una realización, el pH puede ser de 6,8 a 8,0, y en otra realización el pH puede ser de 7,0.
El contacto de una preparación de ADC a la resina de hidroxiapatita puede ser realizado en una columna de lecho empaquetado, una columna de lecho fluidificado/expandido que contiene la matriz de fase sólida, y/o en una operación de partida individual en la cual la matriz de fase sólida es mezclada con la solución durante un cierto tiempo.
Después de la puesta en contacto de la resina de hidroxiapatita con la preparación de conjugado de anticuerpo-fármaco opcionalmente es realizado un procedimiento de lavado. Los tampones de lavado empleados dependen de la naturaleza de la resina de hidroxiapatita, el modo de cromatografía de hidroxiapatita empleado, y por lo tanto puede ser determinado por un experto en la técnica. Durante la operación de lavado cualquier disolvente y otras impurezas de molécula pequeña tal como fármaco libre no conjugado pueden ser, y normalmente son, retirados de la mezcla de ADC. El lavado normalmente comprende el uso de 1-5 volúmenes de columna, preferentemente aproximadamente 3 volúmenes de columna, de un tampón de lavado según lo descrito en la presente memoria. En un modo de unión y elución, el ADC puede ser eluido de la columna después del procedimiento de lavado. Para la elución del ADC de la columna, la presente invención usa un tampón de fosfato de potencia iónica superior que puede contener aproximadamente fosfato de sodio aproximadamente 15 a 150 mM; en otra realización puede contener fosfato de sodio aproximadamente 20 mM a 150 mM.
En una realización, el pH puede ser de 6,8 a 7,3, en otra realización el pH puede ser de 7,0, en otra realización el pH puede ser de 7,5, y en otra realización el pH puede ser de 8,0. El tampón de elución puede ser alterado para elución del ADC de la columna en un gradiente continuo o en etapas.
La resina de hidroxiapatita puede opcionalmente ser limpiada, es decir desprendida y regenerada, después de la elución del ADC. Este procedimiento es realizado normalmente en forma regular para minimizar la formación de impurezas sobre la superficie de la fase sólida y/o para esterilizar la matriz para evitar la contaminación del producto con microorganismos.
Los componentes del tampón pueden ser ajustados de acuerdo con el conocimiento del experto en la técnica. Los intervalos de la composición del tampón de muestra y los ejemplos para la elución en modo de unión son proporcionados en las Tablas 1 y 2. No todos los tampones ni todas las etapas son necesarios, sino que son proporcionados solo para ilustración. Por ejemplo, puede no ser necesario contar con dos etapas de equilibrio distintas, y puede no ser necesario desprender, regenerar o almacenar la resina de hidroxiapatita.
Aunque ha sido descubierto que la cromatografía con hidroxiapatita puede ser usada sola para separar especies de ADC monomérico de los agregados, según lo mencionado con anterioridad, el procedimiento de purificación de la invención puede ser usado en combinación con otras técnicas de purificación de las proteínas. En una realización de la invención, una o más etapas precedentes a la etapa de hidroxiapatita pueden ser deseables para reducir el desafío de carga útil de los contaminantes o las impurezas. En otra realización de la invención, una o más etapas de purificación posteriores a la etapa de hidroxiapatita pueden ser deseables para retirar los contaminantes o las impurezas adicionales.
El procedimiento de purificación cromatográfica con hidroxiapatita (cHA) descrito puede ser combinado opcionalmente con otras etapas de purificación, incluyendo, pero sin limitación, cromatografía de proteínas A, cromatografía por afinidad, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad de metales inmovilizados, cromatografía por exclusión de tamaño, diafiltración, ultrafiltración, cromatografía de intercambio de iones.
Extracción de impurezas adicionales
Además de la extracción de agregados, la cromatografía cHA ha demostrado utilidad en la extracción de otras impurezas de las preparaciones de ADC. Otras impurezas que pueden ser extraídas por los procedimientos de cromatografía cHA de la invención incluyen, pero sin limitación, disolventes orgánicos, fármacos libres de molécula pequeña (cargas útiles no conjugadas o cualquier especie originada a partir de las cargas), reactivos usados para templar la mezcla de reacción, reactivos usados para la reducción de un anticuerpo y cualquier subproducto de molécula pequeña originado a partir del agente reductor, contaminantes de proteínas de las etapas de purificación previas, y disolventes que son usados para la preparación de la mezcla de a Dc .
En una realización de la invención, la invención es capaz de extraer dimetil sulfóxido del disolvente orgánico (DMSO) de la preparación de ADC del 11 % a una cantidad menor que el límite de detección por técnicas analíticas.
En otra realización de la presente invención, la invención es capaz de retirar la carga tóxica de molécula pequeña de la preparación de ADC de aproximadamente 0,2 mg/ml a una cantidad menor que el límite de detección por técnicas analíticas.
Los disolventes orgánicos y las impurezas de moléculas pequeñas tal como la carga útil no se unen a la resina de hidroxiapatita bajo condiciones de elución de la presente invención. Estas impurezas eluyen antes en la porción de lavado (Tabla 1) de la purificación después de la carga útil de la columna (véase la Figura 1). Esto permite una fácil separación de estas impurezas de las moléculas de ADC.
Ejemplos
Tablas que muestran parámetros de purificación representativos
Tabla 1: Composiciones de tampón que usan un gradiente lineal en la fase móvil
Figure imgf000013_0001
Tabla 2: Composiciones de tampón que usan un gradiente en etapas de la fase móvil
Figure imgf000013_0002
Las condiciones descritas en las Tablas 1 y 2 son empleadas en algunos de los siguientes Ejemplos representativos.
Ejemplo 1: Conjugación y purificación del anticuerpo Notch 3 a conector-carga útil vc0101
Conjugación de ADC: El pH de una solución estándar del anticuerpo anti-Notch 3 fue ajustado a 6,5 - 7. La solución de anticuerpo fue calentada a 37°C. Una solución acuosa de TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina, 2,2 equiv.) fue añadida a la solución de anticuerpos. La solución resultante fue agitada durante 90 minutos a 37 °C. Luego la solución fue enfriada hasta la temperatura ambiente. A esta solución de anticuerpos fue añadida una solución de exceso de vc0101 en DMSO. La mezcla de reacción fue agitada durante 1 hora. La mezcla fue desactivada mediante la adición de L-cisteína. La mezcla de reacción fue filtrada a través de un filtro de 0,22 mm. Los 50 gramos aproximadamente resultantes del producto no purificado consistían en un ADC con relación promedio fármaco a anticuerpo (DAR) ~ 4,2 según lo evaluado por cromatografía con interacción hidrófoba (HIC) y niveles de agregado ~ 5 %, según lo evaluado por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC).
Análisis de la preparación de ADC bruto: El procedimiento analítico de HIC fue usado para determinar la carga útil de fármaco y la distribución de la carga útil de fármaco de ADC. El material de referencia y las muestras para análisis fueron diluidos e inyectados en una columna de HIC. Las especies de diferente relación fármaco a anticuerpo (DAR) fueron separadas por el uso de un gradiente de sal y detectadas por absorbancia UV a 280 nm. La DAR promedio y el perfil de distribución fueron determinados por porcentaje del área del pico de cada especie. El procedimiento SEC fue usado para determinar la pureza del producto y el contenido de agregados. Las muestras para análisis fueron diluidas e inyectadas en una columna por exclusión de tamaño. El agregado y la especie de monómero en la preparación de ADC bruto fueron informados como porcentaje del área total para todos los picos relacionados con la proteína.
Preparación de columna de hidroxiapatita: Una columna de 7,5 m de resina de hidroxiapatita (tipo I, 40 pm) fue lavada con 1 volumen de columna (CV) de agua, luego equilibrada con 2 CV de fosfato de sodio 500 nM a pH 7,0 y luego 5 CV de tampón B al 10%. La columna fue ajustada con Tampón C para llevar el contenido de fosfato a 10 mM). 15 g de preparación de ADC bruto fue añadida a la columna y lavada con 3 CV de Tampón B al 10%. (Las composiciones de tampón y las condiciones de columna son según lo definido en la Tabla 1, anterior.)
Purificación de la mezcla de conjugación por el uso de cromatografía en columna: Consistente con los parámetros de la Tabla 1, fueron usadas las siguientes condiciones de purificación de columna: Fase móvil A: Fosfato de sodio 5 mM, pH 7; Fase móvil B: Fosfato de sodio 200 mM, pH 7; gradiente de tampón = 10-70 % de Fase móvil B sobre 20 CV, Carga de proteína = 15 mg/ml, flujo = 1 ml/min, altura del lecho de columna = 22 cm, CV = 7,5 ml. El perfil de purificación es mostrado en la Figura 1.
La mayor parte del producto de monómero deseado eluyó entre el comienzo del pico (absorbancia ~ 50 mAU) hasta los siguientes 6,9 volúmenes de columna en la fracción 1 (Fr.1). Fueron recogidas cuatro fracciones principales. La primera fracción fue recogida desde el comienzo del pico del producto hasta los siguientes 6,9 CV, seguido de fraccionamiento cada 1/3 CV para las siguientes tres fracciones. Las fracciones fueron analizadas en el ensayo UV en proceso para los valores de relación fármaco-anticuerpo (DAR) y por el procedimiento analítico por SEC para los agregados. La mayor parte del monómero eluido en la fracción 1 del conjunto recolectado de fracciones que produjeron el producto ADC en 85 - 88 % de rendimiento (basado en el rendimiento de la proteína), DAR = 3,6 que contiene nivel de agregados ~ 1 %. Los agregados estaban en el último pico según lo mostrado en el cromatograma.
Ultrafiltración - Diafiltración (UF-DF): El material de ADC obtenido después de la purificación en columna fue purificado de manera adicional por el procedimiento de ultrafiltración/diafiltración (UF-DF) por el uso de cartuchos de membrana Ultracel (30 kD) y tampón de histidina 20 mM como tampón de diafiltración (pH 5,8). La solución de retentado fue recogida y filtrada a través de un filtro de 0,22 pm.
Ejemplo 2: Purificación de ADC Notch 3 sobre resina de hidroxiapatita con tampón de fase móvil pH de 7,5
Después de los procedimientos de conjugación de ADC y los procedimientos de preparación de la columna sustancialmente de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 1 y en la Tabla 1 anteriores (excepto con respecto al pH del tampón), el producto de la conjugación que contiene los agregados ~ 4,5 % y DAR ~ 4 de acuerdo con lo determinado por el procedimiento de SEC analítico fue purificado sobre resina de hidroxiapatita por el uso de tampón de fosfato que tiene un pH 7,5. Las condiciones de purificación fueron las siguientes, Fase móvil A: Fosfato de sodio 5 mM, pH 7,5. Fase móvil B: Fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5, gradiente de la fase móvil = 10-70 % de B sobre 20 volúmenes de columna, Carga de proteína = 15 mg/ml, flujo = 1 ml/min, altura del lecho = 22 cm, volumen de columna = 7,5 ml.
La fracción 1 fue recogida al comienzo del pico hasta 5 volúmenes de columna. Esta fracción contenía la mayor parte del monómero de acuerdo con lo determinado por el procedimiento analítico SEC. Las fracciones posteriores contenían principalmente agregados. El producto de ADC resultante en la fracción 1 fue obtenido con el contenido de agregado de 1,5 % y una DAR de 4 de acuerdo con lo determinado por SEC. El rendimiento de ADC de la etapa de la columna fue de 88 %. El cromatograma de purificación es mostrado en la Figura 2.
Ejemplos 3 a 13: Evaluación de purificación de ADC Notch 3 sobre la resina de hidroxiapatita a varios flujos y gradientes de fosfato
Los Ejemplos 4 a 14 demuestran protocolos de purificación similares a los descritos anteriormente en los Ejemplos 1 y 2. Excepto por estos parámetros, todos los otros parámetros usados para estos ejemplos de purificación son de la Tabla 1. Los parámetros experimentales variados para los Ejemplos 3 a 13 son proporcionados en la Tabla 3. Estos productos de conjugación contienen, generalmente, aproximadamente 4,5% de agregados y una DAR de aproximadamente 4 de acuerdo con lo determinado por el procedimiento de HIC analítica. La purificación ocurrió sobre la resina de hidroxiapatita por el uso de los gradientes de tampón de fosfato enumerados. Los datos de control del procedimiento y los resultados de calidad de estas evaluaciones también son enumerados en la Tabla 3. Las siguientes condiciones experimentales fueron usadas para la evaluación de purificación: Fase móvil A: Fosfato de sodio 5 mM, pH 7; Fase móvil B: fosfato de sodio 200 mM, pH 7; Gradiente = de acuerdo con lo mencionado bajo los parámetros en la tabla sobre 20 volúmenes de columna, Carga de proteínas = 15 mg/ml, Flujo = 1 ml/min, Altura del lecho = 22 cm
Tabla 3. Protocolos de purificación adicionales
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 14: Evaluación del gradiente en etapas para purificación de ADC Notch 3 sobre una columna de resina de hidroxiapatita
Un producto de conjugación que contiene agregados ~ 4,5 % y DAR ~ 4 de acuerdo con lo determinado por el procedimiento de HIC analítica fue purificado sobre resina de hidroxiapatita por el uso del gradiente en etapas sobre el tampón de fosfato. Las condiciones de purificación de la Tabla 2 fueron usadas para el procedimiento de purificación: Fase móvil A: Fosfato de sodio 5 mM, pH 7; Fase móvil B: Fosfato de sodio 200 mM, pH 7; Carga de proteína = 15 mg/ml, Flujo = 1 ml/min, altura del lecho = 22 cm, y otras condiciones consistentes con la Tabla 2 anterior. Dos condiciones de purificación por el uso del gradiente en etapas fueron evaluadas de acuerdo con lo mostrado en la Tabla 4. Los resultados sobre el nivel de agregados y la relación de fármaco-anticuerpo son enumerados también en la Tabla 4.
Tabla 4. Evaluación del gradiente en etapas para purificación de ADC Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita
Figure imgf000015_0002
Los perfiles de cromatografía sobre el gradiente en etapas son mostrados en la Figura 3 (Ciclo 1) y en la Figura 4 (Ciclo 2)
Ejemplo 15: Purificación de ADC Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita por el uso de una fase móvil que contiene una concentración baja de cloruro de sodio
El producto de conjugación que contiene agregados ~ 4,5 % y DAR ~ 4 de acuerdo con lo determinado por SEC e HIC analítica fue purificado sobre resina de hidroxiapatita por el uso tampones de fosfato/cloruro de sodio/HEPES. Las siguientes condiciones fueron usadas para el procedimiento de purificación: Fase móvil A: Fosfato de sodio 5 mM, tampón de HEPES 20 mM, pH 7; Fase móvil B: Fosfato de sodio 5 mM, HEPES 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7; Carga de proteína = 13 mg/ml, Flujo = 1 ml/min, altura del lecho = 22 cm, Gradiente = 0-100 % de B en 20 volúmenes de columna. Diversas fracciones fueron recogidas y analizadas por ensayo SEC para determinar la presencia de agregados y por ensayo UV para la DAR. Las fracciones de elución temprana y tardía contenían la mayor parte de los agregados. Las fracciones con niveles más bajos de agregado fueron agrupadas y evaluadas para determinar el contenido de agregados y DAR. El contenido de agregados del grupo de producto fue de 3,3 % y el valor de DAR fue ADC purificado y fue de 3,9. El producto de ADC fue obtenido en 86 % de rendimiento. Sólo fue observada una reducción moderada de ~ 1 % en los niveles de agregados en comparación con el producto no purificado. El cromatograma de purificación es mostrado en la Figura 5.
Ejemplo 16: Purificación de ADC Notch 3 sobre una resina de hidroxiapatita por el uso de una fase móvil que contiene una concentración alta de cloruro de sodio
El producto de conjugación que contiene agregados ~ 4,5 % y DAR ~ 4 de acuerdo con lo determinado por HIC analítica fue purificado sobre resina de hidroxiapatita por el uso tampones de fosfato/cloruro de sodio/HEPES. Las siguientes condiciones fueron usadas para el procedimiento de purificación, Fase móvil A: Fosfato de sodio 5 mM, pH 7; Fase móvil B: Fosfato de sodio 5 mM, cloruro de sodio 2M, pH 7; Carga de proteína = 11 mg/ml, Flujo = 1 ml/min, altura del lecho = 22 cm, Gradiente = 0-100 %B en 20 volúmenes de columna. Varias fracciones fueron recogidas y analizadas por ensayo SEC para determinar la presencia de agregados y por ensayo UV para la DAR. Las fracciones de elución temprana contenían la mayor parte de los agregados. Las fracciones con niveles más bajos de agregado fueron agrupadas y evaluadas para determinar el contenido de agregados y DAR. El contenido de agregados del grupo de producto fue de 3,6 % y el valor de DAR fue ADC purificado y fue de 3,8. El producto de ADC fue obtenido en 92 % de rendimiento. Sólo fue observada una reducción moderada de ~ 1 % en los niveles de agregados comparado con el producto no purificado. El cromatograma de purificación es mostrado en la Figura 6.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de purificación de monómeros de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) a partir de agregados en una preparación de ADC, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) cargar una preparación de ADC sobre una columna de resina de hidroxiapatita, (ii) lavar dicha columna de resina de hidroxiapatita con una concentración baja de tampón de fosfato de sodio; y (iii) eluir dicha preparación de ADC a través de dicha columna con una concentración de crecimiento gradual de dicho tampón de fosfato de sodio, en el que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio de la etapa (iii) aumenta gradualmente desde una concentración de aproximadamente 5 a 35 mM hasta aproximadamente 130 a 150mM, por lo cual los monómeros de ADC purificados son separados a partir de dichos agregados.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de ADC purificado contiene menos que 5% de agregados.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de ADC purificado es de al menos 95% de monómero de ADC.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tampón de fosfato de sodio usado en la etapa (iii) tiene un pH de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,5.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el volumen del tampón de fosfato de sodio usado en la etapa (ii) es de aproximadamente 1 -5 volúmenes de columna.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el volumen del tampón de fosfato de sodio usado en la etapa (iii) es de aproximadamente 5-25 volúmenes de columna.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (ii) es de aproximadamente 5 a 35 mM.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es inicialmente de aproximadamente 20-25 mM y es aumentada gradualmente hasta aproximadamente 140 mM.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración de fosfato de sodio en el tampón de fosfato de sodio en la etapa (iii) es aumentada gradualmente hasta aproximadamente 130-150 mM durante un período de tiempo definido.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho período de tiempo definido es de 112-188 minutos.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el componente de anticuerpo de la preparación de ADC es un anticuerpo IgG, IgA, IgD, IgE, o IgM.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el componente de anticuerpo de la preparación de ADC es monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado, o uno de sus fragmentos.
13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la resina es hidroxiapatita cerámica de tipo I o tipo II.
14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la preparación de ADC es sometida en primer lugar a cromatografía de intercambio de iones o aniones.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el monómero de ADC purificado contiene una DAR promedio de entre 3 y 5.
16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de ADC comprende un anticuerpo anti-Notch 3 y una carga útil de auristatina.
17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de ADC es un ADC anti-Notch 3 de fórmula:
Figure imgf000017_0001
en el cual X es un anticuerpo anti-Notch 3.
18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de ADC contiene un disolvente orgánico, por el cual la preparación de ADC purificado es sustancialmente separada de dicho disolvente.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho disolvente es sulfóxido de dimetilo (DMSO).
20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha preparación de ADC contiene una o más impurezas adicionales seleccionadas de moléculas de carga útil no conjugadas, especies originadas a partir de la carga útil, reactivos de templado, agentes reductores y subproductos de agente reductor, por el cual el monómero de ADC purificado es sustancialmente separado de dichas una o más impurezas adicionales.
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