MX2014005984A - Peptidos citotoxicos y conjugados de anticuerpo-farmaco de los mismos. - Google Patents

Peptidos citotoxicos y conjugados de anticuerpo-farmaco de los mismos.

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Abstract

La presente invención está dirigida a pentapéptidos citotóxicos, a conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos, y a métodos para utilizar los mismos para tratar el cáncer.

Description

PÉPTIDOS CITOTÓXICOS Y CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama los beneficios de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/561,255 presentada el 17 de Noviembre de 2011 , y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/676,423 presentada el 27 de Julio de 2012, las cuales están incorporadas a la presente mediante referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a compuestos en base a polipéptidos novedosos útiles como cargas útiles en conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC's, por sus siglas en inglés), y compuestos de ligador-carga útil útiles en relación con los ADC's. La presente invención se refiere además a composiciones que incluyen las cargas útiles antes mencionadas, ligadores-carga útil y ADC's, y métodos para utilizar estas cargas útiles, ligadores-carga útil y ADC's, para tratar condiciones patológicas que incluyen cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La conjugación de fármacos a anticuerpos, ya sea de manera directa o a través de ligadores, involucra una consideración de una variedad de factores, que incluyen la identidad y ubicación del grupo químico para la conjugación del fármaco, el mecanismo de liberación del fármaco, los elementos estructurales que proporcionan la liberación del fármaco y la modificación estructural para el fármaco libre liberado. Además si el fármaco va a ser liberado después de la internalización del anticuerpo, el mecanismo de liberación del fármaco debe ser concordante con el tráfico intracelular del conjugado.
En tanto que se ha probado un número de diferentes clases de fármacos para el suministro a través de anticuerpos, solo unas cuantas clases de fármacos han demostrado ser eficaces como conjugados anticuerpo-fármaco, en tanto que tienen un perfil de toxicidad adecuado. Una de dichas clases son las auristatinas, derivados del producto natural dolastatina 10. Las auristatinas representativas incluyen MMAE (N-metilvalin-valin-dolaisoleuin-dolaproin-norefedrina) y MMAF (N-metilvalin-valin-dolaisoleuin-dolaproin-fenilalanina. Sin embargo, existe la necesidad de auristatinas adicionales con propiedades mejoradas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a pentapéptidos citotóxicos y conjugados fármaco-anticuerpo de los mismos representados por la fórmula I: o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R1 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, o R es un ligado o un ligador-carga útil tal Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -ar¡leno-C|- C|0alquileno-, -Ci-C|0alqu¡leno-(C3-C8carboc¡clo)-, -(C3-C8carboc¡clo)-Cr Ci0alquileno-, -Ci-Cioalquileno-(C3-C8heterociclo-)- o -(C3-Cs heterociclo-)-Cr Cioalquileno-; G es halógeno, -OH, -SH o -S-CrC6 alquilo; L es un anticuerpo; R2 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o C^Ce haloalquilo; R3A y R3B están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Cr C8 heteroalquileno; R4A y R48 están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d-C8 heteroalquileno; carbociclilo y C6-Ci4 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -d- C8 alquilo, -Ci-C8 alqu¡l-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR' -0-(C C8 alquil), -C(0)R\ -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R\ -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR", en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Cr C8 alquilo, -Ci-C8 alquil-N(R')2, -CrC8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR', -0-(CrC8 alquil), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R\ -S(0)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo, d-Ceheterociclilo, Ci-Cioalquileno-Ca-Ceheterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un Ci-C 0 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -Ci-Ce alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-Ce haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci arilo; R13 es C Ci0 heterociclilo; y R7 es F, Cl, I, Br, NO2, CN y CF3; h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S. La presente invención se refiere a pentapéptidos citotóxicos y conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos representados por la fórmula: o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R y R están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, d-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo, halógeno o hidrógeno; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d- C8 heteroalquileno; R A y R B están de inidos como cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d- Ce heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-C8 alquilo, -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R\ -C(0)OR\ -C(O)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido; R1 es hidrógeno, C C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, o R11 es un ligador o anticuerpo ligador tal como Y es C2-C20 alquileno o C2-C20 heteroalquileno; C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C|-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C|-C|0 alquileno-, -CrCi0 alquileno-(C3-Ca carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Ci- Ci0alquileno-, -Ci-Cio alquileno-(C3-C8 heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Cr Cío alquileno-; -NH2 0 -NHL; G es halógeno, -OH, -SH o -S-CrC6 alquilo; L es un anticuerpo; R7 es F, Cl, I, Br, N02> CN y CF3; h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S.
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad efectiva de cualquiera de los compuestos antes mencionados y/o cualquiera de los conjugados de anticuerpo-fármaco citados con anterioridad y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para utilizar una cantidad efectiva de cualquiera de los compuestos antes citados y/o cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco antes mencionados para tratar el cáncer mediante la administración a un paciente que necesita de la misma, de una cantidad efectiva de dicho compuesto y/o conjugado.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar el cáncer en donde el cáncer incluye un tumor, metástasis, u otra enfermedad o padecimiento caracterizado por el crecimiento celular descontrolado en donde el cáncer es seleccionado a partir del grupo que consta de carcinomas de la vejiga, mama, cérvix, colon, gliomas, endometrio, riñon, pulmón, esófago, ovario, próstata, páncreas, melanoma, estómago y testículos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una gráfica de actividad anti-tumoral de cuatro conjugados (cada uno administrado a 1 mk/kg, Q4dx4) graficada como volumen de tumor en función del tiempo.
La Figura 2 muestra una gráfica de actividad anti-tumoral de seis conjugados (cada uno administrado a 1 mk/kg, Q4dx4) graficada como volumen de tumor tratado con fármaco/ volumen de tumor tratado con vehículo en función del tiempo.
La Figura 3 muestra los resultados de la prueba de H(C)-#54 y H(C)-vcMMAE a 1 mg/kg s.
La Figura 4A muestra resultados de la prueba de H(C)-#54 y H(K)-MCC-DM1 en un modelo de tamizado in vivo de xenoinjerto de ratón M DA-M B-36 -D YT2 ; la Figura 4B muestra resultados de la prueba de H(C)-vcMMAE y H(C)-mcMMAF en un modelo de tamizado in vivo de xenoinjerto de ratón M DA-M B-361-DYT2; y la Figura 4C muestra una comparación de T/C calculado parta los cuatro conjugados. Los ratones fueron tratados q4dx4, iniciando en el día 1.
Las Figuras 5A-5F muestran los resultados de respuesta de dosis de la prueba (Figura 5A) H(C)-#D54, (Figura 5B) H(C)-vcMMAE, (Figura 5C) H(C)-mcMMAF y (Figura 5D) H(K)-MCC-DM1 , respectivamente, en un modelo in vivo de xenoinjerto de ratón; la Figura 5E muestra una comparación de H(C)-#D54 y H(C)-vcMMAE; y la Figura 5F muestra una comparación de T/C para los cuarto conjugados. Los ratones fueron tratados q4dx4, iniciando el día 1.
La Figura 6 muestra los resultados de respuesta de dosis de la prueba H(C)-#A115 a 1 mpk, 3 mpk y 10 mpk, en un modelo in vivo de xenoinjerto de ratón N87. Los ratones fueron tratados q4dx4, iniciando en el día 1.
La Figura 7 muestra datos que comparan anticuerpo hu08 humanizado conjugado para vc-0101 o mc-3377, probado en un modelo de xenoinjerto in vivo con células PC3MM2, una linea celular de próstata humana que expresa el receptor IL-13Ra2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a pentapéptidos citotóxicos, a conjugados anticuerpo-fármaco que comprenden dichos pentapéptidos citotóxicos, y a métodos para utilizar los mismos a fin de tratar el cáncer y otras condiciones patológicas. La invención se refiere también a métodos para utilizar dichos compuestos y/o conjugados in vitro, in situ e in vivo para la detección, diagnóstico o tratamiento de células de mamífero, o condiciones patológicas asociadas.
Definiciones y Abreviaturas A menos de que se establezca de otro modo, los siguientes términos y frases como se utilizan en la presente están destinados a tener los siguientes significados. Cuando se usen nombres de marcas en la presente, las marcas incluyen la formulación del producto, el fármaco genérico y el o los ingredientes farmacéuticos activos del producto de la marca, a menos de que el contexto indique lo contrario.
El término "anticuerpo" (o "Ab") se utiliza en la presente en el sentido más amplio y cubre de manera específica anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo que exhiben la actividad biológica deseada. Un anticuerpo intacto tiene principalmente dos regiones: una región variable y una región constante. La región variable se enlaza a e interactúa con un antígeno de objetivo. La región variable incluye una región de determinación complementaria (CDR) que reconoce y se enlaza a un sitio de enlace específico en un antígeno particular. La región constante puede ser reconocida por e ¡nteractuar con el sistema inmune (véase por ejemplo, Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo o clase (por ejemplo IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2). El anticuerpo puede ser derivado a partir de cualesquiera especies adecuadas. En ciertas modalidades, el anticuerpo es de origen humano o de murino. Un anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano, humanizado o quimérico.
Los términos "se enlaza específicamente" y "que enlaza de manera específica" se refieren a un anticuerpo que se enlaza a un antígeno predeterminado. De manera común, el anticuerpo se enlaza con una afinidad de por lo menos 1x107 M"1, y se enlaza al antígeno predeterminado con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor que su afinidad para enlace a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto al antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones de presencia natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, son dirigidos contra un sitio antigénico individual. El modificador "monoclonal" indica el carácter di anticuerpo como es obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpretará que requiere de la producción del anticuerpo a través de ningún método particular.
El término "anticuerpos monoclonales" incluye de manera específica anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga con la secuencia correspondiente de anticuerpos derivados a partir de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) a u homóloga(s) con las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados a partir de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada.
Como se usa en la presente, "H(C)-" se refiere a trastzumab (marca HERCEPTIN®) que es un anticuerpo monoclonal que interfiere con el receptor HER2/neu, enlazado a través de una de sus cistinas al compuesto de la invención. Como se utiliza en la presente "H(K)-" se refiere a trastzumab que es un anticuerpo monoclonal que interfiere con el receptor HER2/neu, enlazado a través de una de sus ' lisinas al compuesto de la invención.
Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de enlace de antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL), y dominios constantes de cadena pesada, CHi , CH2, CH3 Y CH4, según resulte adecuado para la clase de anticuerpo. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácido de los mismos.
Un anticuerpo intacto puede tener una o más "funciones efectoras", las cuales se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (por ejemplo, una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácido) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen citotoxicidad dependiente complementaria, citotoxicidad célula-mediada dependiente de anticuerpo (ADCC) y fagocitosis célula-mediada dependiente de anticuerpo.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, que comprende de preferencia en enlace-antígeno o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, scFv, scFv- Fc, fragmentos de anticuerpo multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticuerpo, un fragmento(s) producido por medio de una biblioteca de expresión Fab, o fragmentos de enlace de epítope de cualquiera de los anteriores cuyo inmuno se enlaza de manera específica a un antígeno de objetivo (por ejemplo, un antígeno de célula cancerígena, un antígeno viral o un antígeno microbial).
El término "variable" en el contexto de un anticuerpo se refiere a ciertas porciones de los dominios variables del anticuerpo que difieren extensivamente en secuencia y son usados en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Esta variabilidad está concentrada en tres segmentos llamados "regiones hipervariables" en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables reciben el nombre de regiones de estructura (FRs). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FRs conectadas por tres regiones hipervariables.
El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables del enlace de antígeno. La región hipervariable comprende por lo general residuos aminoácido a partir de una "región de determinación complementaria" o "CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89- 97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95- 102 (L3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat el al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos a partir de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (I42) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada. Chothia y Lesk, 1987, J. Mol Biol. 196:901-917). Los residuos FR son aquellos residuos de dominio variable distintos a los residuos de región hipervariable como se definirá más adelante.
Un fragmento de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFV" comprende los dominios V.sub.H y V.sub.L de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. De manera común, el polipéptido Fv comprende además un ligador polipéptido entre los dominios V.sub.H y V.sub.L lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en -the Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y More eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
El término "diacuerpo" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena de polipéptido. Mediante el uso de un ligador que es demasiado corto a fin de permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen de modo más completo, por ejemplo, en EP 0 404 097; WO 93/11161 ; y Hollinger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada a partir de inmunoglobulina no humana. Casi en su totalidad, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en cuyos residuos a partir de una región hipervariable del receptor son remplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En ciertos casos, los residuos de región e estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son remplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar de modo adicional el rendimiento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá de manera sustancial por lo menos uno, y comúnmente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también de manera opcional al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), de forma común aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al, 1986, Nature 321 :522-525; Riechmann et al, 1988, Nature 332-323-329; y Presta, 1992, Curr, Op. Struct. Biol. 2:593-596.
Como se usa en la presente "aislado" significa separado de los otros componentes de (a) una fuente natural, como una célula vegetal o animal o cultivo celular, o (b) una mezcla de reacción química orgánica sintética. Como se utiliza en la presente, "purificado" representa que, cuando se aisla, el aislado contiene por lo menos 95% y en otro aspecto al menos 98% de un compuesto (por ejemplo, un conjugado) en peso del aislado.
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recubierto a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con el diagnóstico o los usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) hasta más de 95% en peso de anticuerpo según se determinó a través del método de Lowry y, de mayor preferencia hasta 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener para obtener al menos 15 residuos de secuencia N-terminal o aminoácido interna a través del uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajó condiciones de reducción o sin reducción utilizando azul de Coomasie o, de preferencia, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, de modo ordinario, el anticuerpo aislado será preparado a través de por lo menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada como se determinó mediante el enlace de anexina V, fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apotóticos). La célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, páncreas o vejiga. Están disponibles varios métodos para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede ser medida a través del enlace de anexina; la fragmentación de ADN puede ser evaluada a través de encadenamiento de ADN; y la condensación nuclear/de cromatina junto con la fragmentación de ADN se pueden evaluar por medio de cualquier incremento en las células hipodiploides.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectiva para tratar una enfermedad o padecimiento en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, desacelerar hasta cierto grado y de preferencia detener) la infiltración celular cancerígena en los órganos periféricos; inhibir (es decir, desacelerar hasta cierto grado y de preferencia detener) la metástasis del tumor; inhibir, hasta cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Hasta el grado que el fármaco puede inhibir el crecimiento de y/o eliminar las células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia puede, por ejemplo, se puede medir a través de la evaluación de la progresión de la enfermedad en relación con el tiempo (TTP) y/o determinación de la tasa de respuesta (RR).
El término "cantidad sustancial" se refiere a una mayoría, es decir más del 50% de una población, de una mezcla o una muestra.
El término "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto que resulta a partir de un proceso metabólico dentro de una célula en un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). El proceso metabólico o reacción puede ser un proceso enzimático tal como escisión proteolítica de un ligador péptido del ADC. Los metabolitos intracelulares incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos y fármaco libre que han experimentado escisión intracelular después de la entrada, difusión, captación o transporte dentro de la célula.
Los términos "escindido intracelularmente" y escisión intracelular" se refieren a un proceso metabólico o reacción dentro de una célula en un ADC o similar, por lo que la unión covalente, por ejemplo, el ligador, entre la porción de fármaco y el anticuerpo se rompe, resultando en el fármaco libre, u otro metabolito del conjugado disasociado desde el anticuerpo dentro de la célula. Las porciones escindidas del ADC son por tanto metabolitos intracelulares.
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad determinada de un fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición tanto del tiempo (velocidad) como de la cantidad total (extensión) del fármaco que alcanza la circulación general a partir de una forma de dosis administrada.
El término "actividad citotóxica" se refiere a un efecto de eliminación celular, citostático o anti-proliferativo de un ADC o un metabolito intracelular de dicho ADC. La actividad citotóxica puede ser expresada como el valor IC50, el cual es la concentración (molar o masa) por unidad de volumen en cuya mitad sobreviven las células.
Un "padecimiento" es cualquier condición que se mejoraría a partir del tratamiento con un fármaco o conjugado anticuerpo-fármaco. Este incluye padecimientos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen a un mamífero al padecimiento en cuestión. Ejemplos no limitantes de padecimientos que serán tratados en la presente incluyen cánceres benignos y malignos; leucemia y malignidades linfoides, padecimientos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otro glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y de blastocele; y padecimientos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.
El término "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica o padecimiento en mamíferos que comúnmente está caracterizado por crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o más células cancerígenas.
Ejemplos de un "paciente" incluye, aunque no se limitan a, un ser humano, rata, ratón, cobayo, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, ave y aves de corral. En una modalidad ilustrativa, el paciente es un ser humano.
Los términos "tratar" o "tratamiento", a menos de que se indique lo contrario mediante el contexto, se refieren a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas para evitar recaída, en donde el objeto es inhibir o desacelerar (reducir) un cambio fisiológico o padecimiento indeseable, tal como el desarrollo o diseminación del cáncer. Para los fines de esta invención, los resultados benéficos o deseados incluyen, aunque no se limitan a, alivio de síntomas, reducción de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado de la enfermedad (es decir, que no empeore), retraso o desaceleración del avance de la enfermedad, mejoramiento o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" puede significar también prolongar la sobrevivencia en comparación con la sobrevivencia esperada en caso de no recibir el tratamiento. Aquellos que necesitan de tratamiento incluyen a quienes ya tienen las condiciones o padecimiento así como quienes son propensos a tener la condición o padecimiento.
En el contexto del cáncer, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de la inhibición de crecimiento de las células tumorales, células cancerígenas, o de un tumor; inhibir la replicación de células cancerosas o células cancerígenas, reducir la carga tumoral general o reducir el número de células cancerosas, y mejorar uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad.
En el contexto de la enfermedad autoinmune, el término "tratar" incluye cualquiera o todos de inhibir la replicación de las células asociadas con el estado de enfermedad autoinmune que incluye, aunque no se limita a, células que producen un anticuerpo autoinmune, reducir la carga de anticuerpo-autoinmune y mejorar uno o más de los síntomas de una enfermedad autoinmune.
En el contexto de una enfermedad infecciosa, el término "tratar" incluye cualesquiera o todos de: inhibir el crecimiento, multiplicación o replicación del patógeno que ocasiona la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más de los síntomas de una enfermedad infecciosa.
El término "inserto de paquete" se utiliza para referirse a instrucciones comúnmente incluidas en los empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de la(s) indicación(es), uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de dichos productos terapéuticos.
Como se utilizan en la presente, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean de manera intercambiable y tales designaciones incluyen progenie. Las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria y los cultivos o progenie derivados de las mismas sin consideración del número de transferencias. Se comprende también que no toda la progenie puede ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como fue tamizada en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan designaciones distintas, será evidente a partir del contexto.
A menos de que se indique de otro modo, el término "alquilo" en si mismo o como parte de otro término se refiere a un hidrocarburo saturado de cadena recta o ramificada, que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, "C-i-Ce" alquilo se refiere a cualquier grupo alquilo que tiene de 1 hasta 8 átomos de carbono). Cuando el número de átomos de carbono no está indicado, el grupo alquilo tiene desde 1 hasta 8 átomos de carbono. Los d-C8 alquilos de cadena recta representativos incluyen, aunque no se limitan a metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo; entretanto los Ci-Cs alquilos ramificados incluyen, aunque no se limitan a, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -tent-butilo, -isopentilo, y -2-metilbutilo; los C Ce alquilos insaturados incluyen, aunque no se limitan a vinilo, alilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil— 2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo y 3-metil-1-butinilo.
A menos de que se indique de otro modo, "alquileno", en si mismo o como parte de otro término, se refiere a un radical hidrocarburo cíclico de cadena recta o ramificada, saturado del número establecido de átomos de carbono, de manera común 1-18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados mediante la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir de los mismos o dos diferentes átomos de carbono de un alcano padre. Los radicales alquileno comunes incluyen, aunque no se limitan a: metileno (-CH2-), 1 ,2-etileno (-CH2CH2-), 1 ,3-propileno (-CH2CH2CH2), 1 ,4-butileno (-CH2CH2CH2CH2), y similares. Un alquileno de cadena recta "C1-C10" es un grupo hidrocarburo saturado, de cadena recta de la fórmula -(CH2)i-io-. Ejemplos de un C1-C10 alquileno incluye metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
A menos de que se indique de otro modo, el término "heteroalquilo", por si mismo o en combinación con otro término significa, a menos de que se establezca lo contrario, un hidrocarburo de cadena recta o ramificada estable, o combinaciones del mismo, completamente saturado o que contiene desde 1 hasta 3 grados de insaturación, que consta del número establecido de átomos de carbono y desde uno hasta tres heteroátomos seleccionados a partir del grupo que comprende O, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden ser oxidados de manera opcional y el heteroátomo de nitrógeno puede ser cuaternizado opcionalmente. El(los) heteroátomo(s) O, N y S pueden ser colocados en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo. El heteroátomo Si puede ser colocado en cualquier posición del grupo heteroalquilo, que incluye la posición en la cual el grupo alquilo es unido al resto de la molécula. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos.
A menos de que se indique lo contrario, el término "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente representa a un grupo divalente derivado a partir de heteroalquilo (como se describió con anterioridad). Para grupos heteroalquileno, los heteroátomos pueden ocupar también cualquiera o ambos extremos de la cadena.
A menos de que se indique de otra manera, "arilo" por si mismo o como una parte de otro término, representa un radical hidrocarburo aromático carbocíclico monovalente sustituido o no sustituido de 6-20, de preferencia 6-14, átomos de carbono derivado mediante la remoción de un átomo de hidrógeno desde un átomo de carbono individual de un sistema de anillo aromático padre. Los grupos arilo comunes incluyen, aunque no se limitan a, radicales derivados a partir de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares. Un grupo aromático carbocíclico (por ejemplo, un grupo arilo) puede ser sustituido con uno o más, de preferencia 1 a 5, de los siguientes grupos: CrC8 alquilo, -0-(d-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(0)NH2, -C(0)NHR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R\ -S(O)R\ -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir de -H, C Ce alquilo y arilo no sustituido. En ciertas modalidades, un grupo aromático carbocíclico sustituido puede incluir además uno o más de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR'.R'. "Arileno" es la porción divalente correspondiente.
"Alquilo sustituido" representa un alquilo en el cual uno o más de los átomos de hidrógeno son remplazados cada uno de manera independiente con un sustituyente. Los sustituyentes comunes incluyen, aunque no se limitan a,-X, -R, -O-, -OR, -SR, -S", -NR2, -NR3, =NR, -CX3> -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NCS, -NO, -N02, =N2, -N3, -NRC(=0)R, -C(=0)NR2, -S03", -S03H, -S(=O)2R, -OS(=0)2OR, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -OP(=0)(OR)2, -P(=0)(OR)2, -P032", PO3H2, -AsO2H2, -C(=0)R, -C(=0)X, -C(=S)R, -C02R, -C02\ -C(=S)OR, -C(=0)SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2, -C(=S)NR2, o -C(=NR)NR2, en donde cada X es de manera independiente un halógeno, -F, -Cl, -Br, o -I; y cada R es de modo independiente -H, CrC20 alquilo, CrC20 heteroalquilo, C5-C20 arilo, C1-C10 heterociclilo, un grupo protector o una porción profármaco, grupos arilo, alquileno y heteroalquileno como se describió con anterioridad puede ser sustituido también de manera similar.
A menos de que se indique lo contrario, "aralquilo" por si mismo o como parte de otro término, representa un grupo alquilo, como se definió con anterioridad, sustituido con un grupo arilo, como se definió antes.
A menos de que se indique de otro modo, "C1-C10 heterociclilo" en si mismo o como parte de otro término, se refiere a un sistema de anillo monocíclico o bicíclico, aromático o no aromático, sustituido o no sustituido monovalente que tiene desde 3 hasta 8 átomos de carbono (referido también como miembros de anillo) y uno a cuatro miembros de anillo de heteroátomo seleccionados de manera independiente a partir de N, O, P o S, y derivados mediante la remoción de un átomo de hidrógeno desde un átomo de anillo de un sistema de anillo padre. Uno o más átomos de N, C o S en el heterociclilo pueden ser oxidados. El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos de que se indique lo contrario, el heterociclilo es unido a su grupo dependiente en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que heterociclilo incluyen, aunque no se limitan a, tetrahidrofuranilo, ocetanilo, piranilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, benzofuranilo, benzotiofenona, benzotiazolilo, indolilo, benzopirazolilo, pirrolilo, tiofenilo (tiofeno), furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, que incluyen porciones tales como 1 ,2,3,4-tetrahihro-quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, tetrazolilo, epóxido, oxetano y BODIPY (sustituido o no sustituido). Un C1-C10 puede ser sustituido hasta con siete grupos que incluyen, aunque no se limitan a, C Ce alquilo, C C8 heteroalquilo, -OR', arilo, -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(=0)2R', -S(0)R\ halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir de -H, C C8 alquilo, Ci-C8 heteroalquilo y arilo. En ciertas modalidades, un heterociclilo sustituido puede incluir también uno o más de -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR". "Heterociclo" "C1-C10 heterociclo" es la porción divalente correspondiente.
A menos que se indique de otra manera, "heteroaralquilo" por si mismo o como parte de otro término, representa un grupo alquilo, como se definió con anterioridad, sustituido con un grupo heterociclilo aromático, como se definió antes. Heteroaralquilo es la porción divalente correspondiente.
A menos de que se indique de otro modo, "C3-C8 carbociclilo" en si mismo o como parte de otro término, es un anillo carbocíclico monocíclico o bicíclico no aromático, saturado o no saturado, sustituido o no sustituido, monovalente de 3-, 4-, 5- 6- 7- u 8- miembros derivado mediante la remoción de un átomo de hidrógeno desde un átomo de anillo de un sistema anillo padre. El C3-C8 carbociclilo representativo incluye, aunque no se limita a, ciclopropilo, ci8clobutilo, ciclopentilo, ciclopentadienilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 1 ,3-ciclohexadienilo, 1 ,4-ciclohexadienilo, cicloheptilo, 1 ,3-cicloheptadienilo, 1 ,3,5-cicloheptatrienilo, ciclooctilo, ciclooctadienilo, biciclo(111)pentano, y biciclo(222)octano. Un grupo C1-C8 carbociclilo puede ser no sustituido o sustituido con hasta siete grupos que incluyen, aunque no se limitan a,, C C8 alquilo, Ci-C8 heteroalquilo, -OR', arilo, -C(0)R', -OC(0)OR\ -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(=0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir de -H, Ci-C8 alquilo, CrC8 heteroalquilo y arilo. "C3-C8 carbociclo" es la porción divalente correspondiente.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superimposición del asociado de imagen de espejo, en tanto que el término "antiquiral" se refiere a moléculas que se pueden superimponer en su asociado de imagen de espejo.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen idéntica constitución química, aunque difieren con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómeros" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes de espejo una de la otra. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse bajo procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroporesis y cromatografía.
A continuación siguen de manera general las definiciones y convenciones estereoquímicas utilizadas en la presente según S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, McGraw-Hill Book Company, New York (1984); y Eliel y Wilen, Stereochemistry of Organic Compuestos, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la habilidad de girar el plano de luz plana-polarizada. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, son utilizados para denotar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su(s) centro(s) quiral(es). Los prefijos d y • (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de la luz plana-polarizada mediante el compuesto, con (-) o I que significa que el compuesto es levorotatorio. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrorotatorio. Para una estructura química determinada, estos estereoisómeros son idénticos excepto que son imágenes de espejo unos de los otros. Un estereoisómero específico también puede ser referido como un enantiómero, y una mezcla de dichos isómeros con frecuencia recibe el nombre de mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros es referida como una mezcla racémica o un racemato, el cual puede estar presente cuando no ha habido una estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, carente de actividad óptica.
Un "derivado" aminoácido incluye un aminoácido que tiene sustituciones o modificaciones a través de fijación covalente de un aminoácido padre, tal como, por ejemplo, mediante alquilación, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Incluido además dentro de la definición de "derivado" está, por ejemplo, uno o más análogos de un aminoácido con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica.
Un "aminoácido natural" se refiere a arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptofano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutámico, ácido aspártico, treonina, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina y valina, a menos de que se indique de otra manera mediante el contexto.
"Grupo protector" se refiere a una porción que cuando es fijada a un grupo reactivo en una molécula enmascara, reduce o previene esa reactividad. Los ejemplos de grupos protectores se pueden encontrar en T.W. Greene y P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999, y Harrison y Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (John Wiley y Sons, 1971-1996), los cuales están incorporados a la presente mediante referencia en su totalidad. Los grupos protectores hidroxi representativos incluyen grupos acilo, éteres de bencilo y tritilo, éteres de tetrahidropiranilo, éteres de trialquilsililo y éteres de alilo. Los grupos protectores amino representativos incluyen formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo (CBZ), ter-butoxicarbonilo (Boc), trimetil sililo (TMS), 2-trimetilsilil-etansulfonilo (SES), tritilo y grupos tritilo sustituidos, aliloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), nitri-veratriloxicarbonilo (NVOC) y similares.
Ejemplos de un "grupo protector hidroxilo" incluyen, aunque no se limitan a, éter de metpoximetilo, éter de 2-metoxietoximetilo, éter de tetrahidropiranilo, éter de bencilo, éter de p-metoxibencilo, éter de trimetilsililo, éter de trietilsililo, éter de triisopropil sililo, éter de t-butildimetil sililo, éter de trifenilmetil sililo, éster de acetato, ésteres de acetato sustituidos, pivaloato, benzoato, metansulfonato y p-toluensulfonato..
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede ser sustituido por otro grupo. Dichos grupos salientes son bien conocidos en la técnica, y los ejemplos incluyen, aunque no se limitan a, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metansulfonilo (mesilo), p-toluensulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto. El compuesto contiene de manera común por lo menos un grupo amino, y en consecuencia se pueden formar las sales de adición de ácido con este grupo amino. Las sales ilustrativas incluyen, aunque no se limitan a, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metansulfonato, etansulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato y pamoato (es decir, 1 ,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naptoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede involucrar la inclusión de otra molécula tal como un ión acetato, un ión succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica que estabiliza la carga en el presente compuesto. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Hay casos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o una o más contraiones.
"Solvato farmacéuticamente aceptable" o "solvato" hace referencia a una asociación de una o más moléculas de solvente y un compuesto o conjugado de la invención. Ejemplos de solventes que forman sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no se limitan a, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina.
Los términos "carga" o "carga de fármaco" o "carga de carga útil" representa o se refiere al número promedio de cargas útiles ("carga útil" y "cargas útiles" se usan de manera intercambiable en la presente con "fármaco" y "antifármacos") por anticuerpo en una molécula ADC. La carga de fármaco puede variar desde 1 hasta 20 fármacos por anticuerpo. En ocasiones es referido como el DAR, o relación fármaco a anticuerpo. Las composiciones de los ADCs descritos en la presente de modo común tienen DAR's desde 1-20, y en ciertas modalidades desde 1-8, desde 2-8, desde 2-6, desde 2-5 y desde 2-4. Los valores DAR comunes son 2, 4, 6 y 8. El número promedio de fármacos anticuerpo, o valor DAR, puede estar caracterizado a través de medios convencionales tales como espectroscopia UV/visible, espectroscopia de masa, ensayo ELISA, y HPLC. El valor DAR cuantitativo se pueden determinar también. En ciertos casos, la separación, purificación, y caracterización de ADCs homogéneos tienen un valor DAR particular se puede lograr a través de medios tales como HPLC de fase inversa o electroporesis. DAR puede estar limitado por el número de sitios de fijación en el anticuerpo. Por ejemplo, en donde la fijación es una cisteína tiol, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos cisteína tiol, o puede tener sólo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través del cual se puede fijar una unidad Ligador. En ciertas modalidades, la cisteína tiol es un grupo tiol de un residuo cisteína que forma un enlace disulfuro intercadena. En ciertas modalidades, la cisteína tiol es un grupo tiol de un residuo cisteína que no forma un enlace disulfuro intercadena. De manera común, el menor al nivel máximo teórico de porciones fármaco son conjugadas a un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, por ejemplo, muchos residuos de lisina que no reaccionan con un ligador o intermediario ligador. Sólo los grupos lisina más reactivos pueden reaccionar con un agente de reacción ligador reactivo.
Generalmente, los anticuerpos no contienen, muchos, si es que los tienen, grupos cisteína tiol libres y reactivos los cuales pueden ser enlazados a un fármaco a través de un ligador. La mayoría de los residuos cisteína tiol en los anticuerpos existen como enlaces disulfuro y deben ser reducidos con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT). El anticuerpo puede ser sometido a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleofílicos reactivos tales como lisina o cisteína. La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar de varias maneras distintas, que incluyen (i) limitar el exceso molar de fármaco-ligador con relación al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o temperatura de la reacción de conjugación, y (iii) condiciones reductivas parciales o limitantes para la modificación de cisteína tiol. Cuando más de un grupo nucleofílica reacciona con un fármaco-ligador entonces el producto resultante es una mezcla de ADC's con una distribución de una o más porciones fármaco por anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla, por ejemplo, a través de ensayo de anticuerpo ELISA dual, específico para anticuerpo y específico para el fármaco. Los ADC's individuales pueden ser identificados en la mezcla por medio de espectroscopia de masa y separados mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrofóbica.
A continuación hay una lista de abreviaturas y definiciones que pueden no estar definidas o descritas en esta solicitud: DMSO (se refiere a dimetil sulfóxido), HRMS (se refiere a espectroscopia de masa de alta resolución), DAD (se refiere a detección de disposición de diodo), TFA (se refiere a ácido 2,2,2-trifluoroacético o ácido trifluoroacético), TFF (se refiere a filtración de flujo tangencial), EtOH (se refiere a etanol), MW (se refiere a peso molecular), HPLC (se refiere a cromatografía en líquido de alto rendimiento), HPLC preparatoria (se refiere a cromatografía en líquido de alto rendimiento preparatoria), etc. (se refiere a y así sucesivamente), trifilo (se refiere a 1 ,1',G-etan-1 ,1,1-triiltribenceno), THF (se refiere a tetrahidrofurano), NHS (se refiere a 1-Hidroxi-2,5-pirrolidindiona), Cbz (se refiere a carboxibencilo), eq. (se refiere a equivalente), n-BuLi (se refiere a n-butilitio), OAc (se refiere a acetato), MeOH (se refiere a metanol), i-Pr (se refiere a isopropil o propan-2-il), NMM (se refiere a 4-metilmorfolina), y "-" (en un cuadro se refiere a que no hay datos disponibles en este momento).
Compuestos v Conjugados Anticuerpo-Fármaco de los Mismos Un aspecto de la invención se refiere a un compuesto de la R1 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o C C8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, CrC8 alquilo o C C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; y R3B es Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C1-C8 heteroalquileno; R4A y R B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R B es hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C1 C8 heteroalquileno; heterociclilo, C3-C8 carbociclilo y C6-Ci4 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -d-C8 alquilo, -d-C8 alquil-N(R')2, -d-C8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR' -O-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(O)OR", -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C^-C& alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de C C8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R\ -C C8 alquil-C(0)OR\ -0-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -0(0)?(?·)2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo, Ci-C8heterociclilo, CrC^alquileno-Cs-Ceheterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un CrC10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -C Ce alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo, -C2-Ce alquinilo o -CrC8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-C14 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula lia: lia o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-; -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C|-C|0alquileno-, -C|-C|0 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-CrCio alquileno-, -Ci-Cio alquileno-(C3-Ce heterociclo-)- o -(C3-Ce heterociclo-)-CrCio alquileno-; R y R son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, d-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o halógeno; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; heterociclilo, C3-C8 carbociclilo y C6-Ci4 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -d-C8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR' -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(O)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-C8 alquilo, -Ci-C8 alquil-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR', -O-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R", -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(O)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 heterociclilo, Ci-Ci0alquileno-C3-C8 heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C Cio heterociclilo; R6 es hidrógeno, -d-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-C14 arilo; R13 es C\-Cw heterociclilo; y R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, NO2l CN y CF3; R10 es hidrógeno, -CrC|0alquilo, -C3-C8carbociclilo, -aril, -Ci-Cioheteroalquilo, -C3- C8heterociclo, -C|-C|0alquileno-aril, -arileno-Ci-C|0alquilo, -CrCioalquileno-(C3-C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-C|-C|0alquilo, -d-C|0alquileno-(C3-C8heterociclo), y -(C3-C8 heterociclo-)-C|-C|0alquilo, en donde el arilo en R10 que comprende arilo es opcionalmente sustituido con [R7]h¡ h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula Illa: Illa o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R1 es hidrógeno, C C8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, CrC8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R3A y R3B SQn cua|qUjera de |0S siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, C Ce alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R48 tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de d-Ce alquilo, -0-(CrC8 aquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR\ -C(0)NH2, -C(O)NHR\ -C(0)N(R")2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(O)R\ -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R*)2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo y arilo no sustituido; Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C3heterociclo-, -Ci-Cioalquileno-arileno-, -arileno-Cr C|0alquileno-, -CrCi0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Ci-C10alquileno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-d-Cioalquileno-; R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, N02, CN y CF3; R10 es hidrógeno, -d-Cio alquilo, -C3-C8 carbociclo, arilo, -Ci-Cioheteroalquilo, -C3-C8heterociclo, -Ci-C|0alquileno-arilo, -arileno-C|-C|0alquilo, -Ci-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-C|-C|0alqu¡lo, -C|-C|0alquileno-(C3-C8heterociclo), y -(C3-C8 heteroc¡clo-)-CrC|0alquilo, en donde ahlo en R10 comprende arilo es opcionalmente sustituido con [R7]h; h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S.
R6 es hidrógeno, C Ce alquilo o C-i-Ce haloalquilo; y h es 1 , 2, 3, 4 o 5.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula llb: llb o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Ci-Ci0alquileno-arileno-, -arileno-Cr Ci0alqu¡leno-, -Ci-Ci0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-C|- Ci0alquileno-, -CrCioalquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Cr Cioalquileno-; o -NHL; L es un anticuerpo; R2 es hidrógeno, CrC8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, Ci-Ca alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, d-Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R38 tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, ?·,-?10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, d-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Cr C8 heteroalquileno; heterociclilo, C3-Ce carbociclilo y C6-C14 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -CrC8 alquilo, -CrC8 alquil-N(R')2, -Ci-Ce alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR' -O-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN , -NHC(=NH)NH2, -NHCONHz, -S(=O)2R* y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; o opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Cr C8 alquilo, -d-Ce alquil-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR', -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R', -C(0)OR*, -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo, C^Caheterociclilo, Ci-Ci0alquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -C C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C C4 alquilo, C C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R es hidrógeno X es S.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula lllb: R1 es hidrógeno, C C8 alquilo o C^Ce haloalquilo; R2 es hidrógeno, CrC8 alquilo o CrC8 haloalquilo; 3A y R3B son cua|qUíera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R y R son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, CrC8 alquilo, C^-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C1-C-8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, CrC10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d-C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de C C8 alquilo, -0-(C^Ca alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR\ -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2l -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2l -S(=0)2R' y -SR*. en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrCe alquilo y arilo no sustituido; Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-Ce carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Ci-Cioalquileno-arileno-, -arileno-Cr C|0alquileno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cr Ci0alquileno-, -CrCioalquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-d-Cioalquileno-; L es un anticuerpo; X es O o S.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula lie: lie o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -C|-Ci0alquileno-arileno-, -arileno-C|-C)0alqu¡leno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cr Cioalquileno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8heteroc¡clo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Cr Ci0alquileno-; L es un anticuerpo; D es -C(R4A')(R B')- o está ausente; R2 es hidrógeno, Ci-Ca alquilo, Ci-C8 haloalquilo, o está 'ausente si ' %-está presente; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B' es CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo, o R3B es C2-C4 alquileno y forma un anillo de 5-7 miembros como se indica mediante -'" ; o (ii) R3Ay R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C1- C8 heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (¡i) R4A y R4B' tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d- C8 heteroalquileno; heterociclilo, C3-C8 carbociclilo y C6-C14 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -Ci-C8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR' -0-(Ci-C8 alquilo), -C(O)R\ -OC(O)R\ -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C Ce alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C Cio heterociclilo; seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-C8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R', -d-C8 alquil-C(0)OR', -0-(C Ca alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8heterociclilo, Ci-C 0alquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un CrC 0 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -CrC8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R 2 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula lile: haloalquilo; R2 es hidrógeno, C C8 alquilo o d-C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R es Ci-C8 alquilo, d-Ce haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C1 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d-C8 heteroalquileno; R4A y p4B son cua|qUjera \os siguientes: (i) R4A es hidrógeno, CrC8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C 0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C1-C3 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de C^-Ce alquilo, -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR\ -C(0)NH2, -C(0)NHR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR\ en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido; Y es -C2-C2o alquileno-, -C2-C2o heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Ci-Ci0alquileno-arileno-, -arileno-Cr C|0alquileno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carboc¡clo)-d-C10alquileno-, -CrCioalquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-Cioalquileno-; Z" es L es un anticuerpo; X es O o S.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula lid: lid o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, L es un anticuerpo; [ligador] es un ligador divalente; D es -C(R4A')(R4B')- o está ausente; R2 es hidrógeno, d-Ce alquilo, Ci-C8 haloalquilo, o está ausente si ' ' está presente; R3A y R3B' son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrC8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo, o R3B es C2-C4 alquileno y forma un anillo de 5-7 miembros como se indica mediante ' v ; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R A es hidrógeno, C-i-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B' es hidrógeno, C C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; heterociclilo, C3-C8 carbociclilo y C6-Ci4 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -Ci-C8 alquilo, -Ci-C8 alquil-N(R')2, -Ci-C8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR" -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONHz, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de C C8 alquilo, -CrCe alquil-N(R')2, -CrC8 alquil-C(0)R', -C^Ce alquil-C(0)OR', -0-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C^Cs alquilo, C C8heterociclilo, Ci-Cioalquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -C^Ce alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, Ct-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula llld: llld o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R es hidrógeno, C G8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, Ci-Ce alquilo o d-Ce haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C carbociclilo, d-Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, d-Ci heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d C8 heteroalquileno; R4A y R B son cualquiera de los siguientes: (i) R A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, d-Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R B es hidrógeno, CrC8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (i¡) R y R tomados en conjunto son C2-C8 alquileno heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-C8 alquilo, -O-ÍCrCe alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR\ -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R\ -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-Cs alquilo y arilo no sustituido; [ligador] es un ligador divalente; L es un anticuerpo; X es O o S.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde el compuesto está representado por En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde W es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde W es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde W es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde En ciertas modalidades de la invención W es: En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es hidrógeno, Ci-Ce alquilo o C C8 haloalquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es Ci-Ce alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R2 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R2 es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R2 es CrC8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R2 es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R es hidrógeno; y R2 es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es metilo; y R2 es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C Ca haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R3B es C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R3B es CrC8 alquilo, C^Ca haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es halógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es C C8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3B es C C8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3B es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R38 es isopropilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3B es C3-C8 carbociclilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3B es ciclohexilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es C-\-Cs alquilo; y R3B es Ci-Ce alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es metilo; y R3B es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es hidrógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A es hidrógeno; y R3B es isopropilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C Ce heteroalquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son -CH2CH2-.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son - CH2CH2CH2- .
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son -CH2CH2CH2CH2-.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son Ci-C8 heteroalquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R3A y R3B tomados en conjunto son -CH2OCH2-.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es C Ce alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R A es Ci-C8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4B es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4B es C Ca alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4B es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es C C8 alquilo; y R4B es Ci-C8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es metilo; y R B es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es hidrógeno; y R4B es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A es hidrógeno; y R4B es C^-Ca alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d-Ca heteroalquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R4B tomados en conjunto son -CH2CH2-.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R B tomados en conjunto son -CH2CH2CH2— .
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R B tomados en conjunto son -CH2CH2CH2CH2— .
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R B tomados en conjunto son C C8 heteroalquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R4A y R4B tomados en conjunto son -CH2OCH2-.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones frespondientes, en donde R En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R5 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R6 es hidrógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R6 es Ci-C8 alquilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R6 es metilo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde X es O.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde X es S.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, y definiciones correspondientes, en donde el compuesto es seleccionado a partir del grupo que consta de: N-Metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N2-[(1 -Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)- 2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-met¡l-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[( 1 S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N-Metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -[(2S)-2-{(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-[(2-fenilet¡l)am¡no]-3-tioxopro^ oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida; N-Metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N-Metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan^-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metiU 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2- etilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1- metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)- 2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-m N2-[(1-Aminociclopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam 1- Amino-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]ciclohexancarboxamida; 2- Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2- etilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi- 5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{((2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-il]amino}-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolid¡n-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N2-[(3-Aminooxetan-3-il)carbon¡l]-N-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-[(2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-met¡l-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]prop¡l}pirrolidin-1-¡l]-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-met¡l-L-val¡namida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-il]am¡no}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan^-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-D¡metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-fenilet¡l]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxoprop¡l]p¡rrolidin-1-¡l}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val¡namida¡ N,2-D¡metilalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-t¡oxopropil]pirrol¡din-1-il}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val¡nam¡da; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil-1 -( 1 ,3-tiazol-2-il)etil]am¡no}propil]pirrolidin-1-¡l}-5-meti^-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-v^ N2-(3-Amino-2,2-d¡metilpropano¡l)-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1- {(2S)-2-[( 1R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam N2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1 -il]-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida; 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-^ 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4.2 ]octa-1 ,3,5-trien-7-il)-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[biciclo[4 .0]octa-1 ,3,5-trien-7-il(carboxi)metil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-cailDOxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi^ 1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida; 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1- metox¡-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil- 3oxopropil]pirrolid¡n-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val¡namida; 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 RI2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolidin-1-¡l}-3-met^ 5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -ter-butoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrol¡din-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-N]-N-met¡l-L-valinamida; Metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1 -[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-am¡no-2,2-dimet¡lpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrol¡din-2 3-metox¡-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato; N^-Dimetilalanil-N- R^S.SSí-I ^S^-KI R^RJ-a^S^I-ter-butox¡-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metox¡-2-metil-3-oxopropil]pirrol¡din-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida; 2-met¡l-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metox¡-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-met¡l-L-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1 -h¡droxi-1-fen¡lpropan-2-il}amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxoprop¡l]pirrolidin-1-¡l}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val¡namida; N,2-Dimet¡lalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-benc¡l-2-(metilamino)-2-oxoet¡l]amino}-1 -metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]p¡rrol¡din-1-il}-2-metox¡-1 -[(1 S)-1 -metilprop¡l]-4-oxobutil}-N-metil-L-val¡nam¡da; N,2-D¡metilalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-2-am¡no- 1 -bencil-2-oxoetil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-metoxi- 1 -[(1 S)-1 -met¡lpropil]-4-oxobutil}-N-met¡l-L-valinam¡da; N,2-Dimetilalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -bencil-2-oxo-2-(propilamino)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metox¡-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida; N,2-D¡met¡lalan¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-(d¡ethylamino)-2-oxoetil]amino}-1-metox^^ metox¡-1-[(1S)-1-met¡lpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida; N,2-D¡metilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-(ter-butilam¡no)-2-oxoetil]am¡no}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrol¡d¡n-1-il}-2-metoxi- 1 -[( 1 S)- 1 -metilpropil]-4-oxobut¡l}-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-m metox¡-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 3-metil-D-isovalil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metox¡-2-oxoetil]amino}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l]pirrolid¡n-1-¡l}-2-metoxi- 1 -[(1 S)-1 -metilpropil]-4-oxobut¡l}-N-metil-L-valinamida; 3-met¡l-L-isoval¡l-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1 -metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolid¡n-1 -il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-met¡lpropil]-4-oxobut¡l}-N-met¡l-L-valinamida; L-isovalil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrol¡din-1 -il}-2-metoxi-1 - [(1S)-1-metilpropil]- -oxobutil}-N-met¡l-L-valinamida¡ D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benc¡l-2-metox¡-2-oxoetil]am¡no}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-met¡l-L-valinamida¡ 1 ,2-d¡metil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]p¡rrolid¡n-1-il}-2-metoxi- 1- [(1 S)-1-met¡lprop¡l]-4-oxobutil}-N-metil-L-val¡namida; 1 ,2-dimetil-D-prol¡l-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-fenilet¡l]amino}-1-metox¡-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolid¡n-1-il}-2-metox¡-1 -[(1 S)-1 -metilpropil]-4-oxobutil}-N-met¡l-L-valinam¡da; N~2~-[2,2-dimet¡l-3-(metilamino)propano¡l]-N-{(1 S,2R)-2-metoxi-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrol¡din-1-il}-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida; iletil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1 -{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-dimetil-3- (metilamino)propano¡l]-L-valil}(met¡l)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirroli^ 2- il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fen¡lalan¡nato¡ Metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperid¡n-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}p¡rrolidin-2-¡l]-2-met¡lpropanoil}-L-feniialan¡nato¡ Metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1 -{(3R,4S,5S)-3-metox¡-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-met¡lpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalan¡nato; N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-i^ il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina; N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]cate il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina; Metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato; Metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato; (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-m^ 2-carboxamida; (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-meto^ 5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida; 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida; N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-meto^ metil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida; (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-m 1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida; (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-meti 1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida; N-2-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam N-2-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3- (4-aminofenil)-1 -metox¡-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-(1 ,2,3l4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina; N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]^ metoxi-2-metilpropanoil}-L-fen¡lalan¡na¡ 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2R,4S)-4-carboxi-1-fenilpentan-2-il]am¡no}-1-metox¡-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3- (biciclo[1.1.1]pent-1 -ilamino)-1-metox¡-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-H metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida; 2- etilalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(1 R)-2-metox¡-2-oxo-1-(1-fenilciclopropil)et¡l]am¡no}-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam¡da; 2-Met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(1 S)-2-metoxi-2-oxo-1 -(1 -fenilciclopropil)et¡l]am¡no}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxo eptan-4-il]-N-metil-L-valinam¡da; 2-Metilalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-({(1 R)-1 -[(7R)-bic¡clo[4.2.0]octa-1.S.S-trien-y-ill^-metoxi^-oxoetilJamino)-! -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-({(1 S)-1 -[(7S)-biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il]-2-metoxi-2-oxoetil}amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolid¡n-1-¡l}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida; N,2-D¡met¡lalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)- 1 -metoxi- 1 -oxo-3-fen¡lpropan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-({(1 S)-1-[(7R)-biciclo[4.2 ]octa-1 ,3,5-trien-7-il]-2-metoxi-2-oxoetil}amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,N,2-trimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,N,2-trimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(R)-carboxi(1 -fenilciclopropil)metil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; difluoro{2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(3R,4 ,7S)-7-bencil-15-{2-[(3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il-kappaN)metiliden]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-4-metil-5,8, 13-trioxo-2-oxa-6,9, 12-triazapentadecan-3-il]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamidato}boro; 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1-oxoheptan-4-N]-N-metil-L-valinamida; metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(3-aminooxetan-3-il)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-m metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato; 2-Metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S, 12S)-7-bencil- 14-[3-cloro-4-(propan-2-iloxi)fenil]-4-metil-12-[4-(8-metilimidazo[1 ,2-a]piridin il)bencil]-5,8,14-trioxo-2,9-dioxa-6,13-diazatetradecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida; 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-{[4-(5-fluoro-1 ,3-benzotiazol-2-il)-2-metilfenil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1 ,2-dimetil-D-protil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1 -oxo-3-fenil-1 -(prop-2-en-1 -iloxi)propan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-ter-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1- metoxi-2-metil-3-oxo-3-({(2S)-1-oxo-3-fenil-1-[(1H-1 ,2,3-triazol-4- ¡lmetil)am¡no]propan-2-il}amino)propil]pirrolidin-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]- N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fenil-1-(prop-2-yn-1-ilamino)propan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-( 1 H-imidazol-4-il)- 1 -metoxi- 1 -oxopropan-2-ilJamino}- 1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)-1-metoxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-lH'l}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1R)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metox 5-metil- 1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fenil-1-(piperazin-1-il)propan-2-il)amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metn-3-oxopropil]pirrolidi metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam¡da; y 2-metil-D-prol¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-m il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es En ciertas modalidades, ta presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R1 es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Y es C2-C20 alquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Y es -(CH2)P-; y p es 1-10.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 1. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 2. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 3. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 4. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 5. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 6. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 7. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 8. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 9. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde p es 10.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Y es C2-C20 heteroalquileno.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Y es -(CH2CH20)qCH2CH2-; y q es 1-10.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 1. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 2. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 3. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 4. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 5. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 6. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 7. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 8. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 9. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde q es 10.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es .
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R7 es F o Cl; y h es 4 o 5.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R7 es F; y h es 3, 4 o 5.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde R7 es F; y h es 5.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es -NH2.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde G es Cl. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde G es Br. En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde G es I.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde el compuesto es seleccionado a partir del grupo que consta de los compuestos del Cuadro 18B.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde el compuesto es seleccionado a partir del grupo que consta de: En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es -NHL.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde Z es En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde .
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde L es H(C)-.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los compuestos antes mencionados y definiciones correspondientes, en donde L es un anticuerpo seleccionado a partir de un anticuerpo de murino para el tratamiento de cáncer de ovarios tal como oregovomab (OVAREX®*; un anticuerpo lgG2a de murino para el tratamiento de cáncer de colorectal tal como edrecolomab (PANOREX®) ; un anticuerpo quimérico IgG anti-EGFR para el tratamiento de cánceres positivos para el factor de crecimiento epidérmico, tal como cáncer de cuello y cabeza, por ejemplo cetuximab (ERBITUX®); un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sarcoma, tal como un Anticuerpo Monoclonal Humanizado para el Receptor de Vitronectina (a?ß3) como Vitaxin®; un anticuerpo IgGi humanizado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL) tal como alemtuzumab (CAMPATH l/H®); SMART ID10 que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; 1311 Lym-1 (ONCOLYM®) que es un anticuerpo anti-HLA-Dr10 de murino radiomarcado para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; un mAb anti-CD2 humanizado para el tratamiento de Enfermedad de Hodgkin o linfoma no-Hodgkin tal como ALLOMUNE® ; labetuzumab (CEACIDE®) que es un anticuerpo anti-CEA humanizado para el tratamiento de cáncer colorectal; bevacizumab (AVASTIN®) que es un anti-VEGF-A mAb humanizado para el tratamiento de cáncer cerebral, de colon, de riñon o pulmonar; Ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN®) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; ofatumumab (ARZERRA®* que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica; panitumumab (VECTIBIX®) que es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR humano para el tratamiento de cáncer de colon; rituximab (RITUXAN®) que es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20 para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica y linfoma no-Hodgkin; tositumomab (BEXXAR®) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no- Hodgkin; trastuzumab (HERCEPTIN®) que es un anticuerpo monoclonal antireceptor HER2 para el tratamiento de cáncer de mama y de estómago; ipilimumab (YERVO Y®) que es un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA4 para el tratamiento de melanoma; gemtuzumab y inotuzumab ozogamicina.
En otra modalidad específica, L incluye anticuerpos seleccionados a partir de anticuerpos anti-l-13, que incluyen anticuerpos anti-l-13 usados en el tratamiento de cáncer, por ejemplo anticuerpos anti-IL-13Ra2.
En otra modalidad específica más, L incluye anticuerpos seleccionados a partir de anticuerpos anti-Notch, que incluyen anticuerpos anti-Notch usados en el tratamiento de cáncer.
En ciertas modalidades, el anticuerpo L es enlazado al ligador a través de un enlace azufre o a por medio de un enlace azufre-azufre.
Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende cualquiera de los compuestos antes mencionados.
Otro aspecto de la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo y cualquiera de los compuestos antes mencionados.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco antes mencionados y las definiciones correspondientes, en donde el compuesto es enlazado de manera covalente al anticuerpo.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco y las definiciones correspondientes, en donde el compuesto en dicho conjugado anticuerpo- fármaco es seleccionado a partir del grupo que consta de los compuestos del En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco mencionados con anterioridad y definiciones correspondientes, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 compuestos de la invención.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco mencionados con anterioridad y definiciones correspondientes, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende 3 o 4 compuestos de la invención.
La Unidad Anticuerpo (Ab) Como se mencionó con anterioridad, el término "anticuerpo" (o "Ab") se usa en la presente en el sentido más amplio y cubre de manera específica anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo que exhiben la actividad biológica deseada. Además, en tanto que ciertos aspectos de la invención descritos en la presente se refieren a conjugados de anticuerpo-fármaco, se considera además que la porción anticuerpo del conjugado puede ser remplazada con cualquiera que se enlace de manera especifica o se asocie de manera reactiva o forme complejos con un receptor, antígeno u otra porción receptora asociada con una población celular de objetivo. Por ejemplo, en lugar de contener un anticuerpo, un conjugado de la invención podría contener una molécula de objetivo que se enlaza a, forma complejos con, o reacciona con un receptor, antígeno u otra porción receptora de una población celular que se busca sea terapéutica o de otro modo modificada biológicamente. Ejemplos de dichas moléculas incluyen proteínas de menor peso molecular, polipéptido o péptidos, lectinas, glicoproteínas, no-péptídos, vitaminas, moléculas de transporte de nutriente (tales como, aunque sin limitarse a, transferrina), o cualesquiera otra molécula o sustancias de enlace celular. En ciertos aspectos, el anticuerpo u otra molécula de objetivo actúan para suministrar un fármaco a la población celular de objetivo particular con la cual interactúa el anticuerpo u otra molécula de objetivo.
Los heteroátomos que pueden estar presentes en una unidad de anticuerpo incluyen azufre (en una modalidad, a partir de un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo), oxígeno (en una modalidad, a partir de un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un anticuerpo) y nitrógeno (en una modalidad, a partir de un grupo amino primario o secundario de un anticuerpo). Estos hetero átomos pueden estar presentes en el anticuerpo en el estado natural del anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo de presencia natural, o puede ser introducido dentro del anticuerpo a través de modificación química.
En una modalidad, una unidad de anticuerpo tiene un grupo sulfhidrilo y la unidad de anticuerpo se enlaza a través del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otra modalidad, el anticuerpo tiene residuos de lisina que pueden reaccionar con los ésteres activados (dichos ésteres incluyen, aunque no se limitan a, ésteres de N-hidroxisuccinimida, pentafluorofenilo, y p-nitrofenilo) y por tanto forman un enlace amida que consta del átomo de nitrógeno de la unidad de anticuerpo y un carbonilo.
En otro aspecto más, la unidad de anticuerpo tiene uno o más residuos de lisina que pueden ser químicamente modificados para introducir uno o más grupos sulfhidrilo. Los reactivos que se pueden utilizar para modificar las lisinas incluyen, aunque no se limitan a, N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) y clorhidrato de 2-lminotiolano (Reactivo de Traut).
En otra modalidad, la unidad de anticuerpo puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden ser químicamente modificados para tener uno o más grupos sulfhidrilo.
En otra modalidad más, la unidad de anticuerpo puede tener uno o más grupos carbohidrato que pueden ser oxidados a fin de proporcionar un grupo aldehido (véase, por ejemplo, Laguzza, et al., 1989, J. Med. Chem. 32(3):548-55). El aldehido correspondiente puede formar un enlace con un sitio reactivo como, por ejemplo, hidrazina e hidroxilamina. Otros protocolos para la modificación de proteínas para la fijación o asociación de fármacos se describen en Coligan et al., Current Protocolos in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002) (incorporado a la presente mediante referencia).
Cuando los conjugados comprenden proteína no-inmunoreactiva, polipéptido, o unidades péptido en lugar de un anticuerpo, la proteína no-inmunoreactiva, polipéptido, o unidades péptido útiles incluyen, aunque no se limitan a, transferrina, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de plaqueta, IL-2, IL-6, factores de crecimiento de transformación ("TOP"), tales como TGF-a y TGF-ß, factor de crecimiento de virus vacuna ("VGF"), insulina y factores de crecimiento similares a insulina I y II, somatostatina, lectinas y apoproteína a partir de una lipoproteína de baja densidad.
Los anticuerpos policlonales útiles son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas a partir del suero de animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales útiles son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un determinante antigénico particular (por ejemplo, un antígeno de célula cancerígena, un antígeno viral, un antígeno microbial, una proteína, un péptido, un carbohidrato, un agente químico, un ácido nucléico, o fragmentos de los mismos). Un anticuerpo monoclonal (mAb) para un antígeno de interés se puede preparar mediante el uso de cualquier técnica conocida que proporciones la producción de moléculas de anticuerpo a través líneas celulares continuas en cultivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpo, o anticuerpos monoclonales quiméricos. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden elaborar a través de numerosas técnicas conocidas (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology ToDÍA 4:72-79; y Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico. Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica y se describen más adelante.
El anticuerpo puede ser un fragmento funcionalmente activo, derivado o análogo de un anticuerpo que se enlaza de manera inmunoespecífica a células de objetivo (por ejemplo, antígenos de célula cancerígena, antígenos virales, o antígenos microbiales) u otros anticuerpos que se enlazan a células tumorales o matriz. A este respecto, "funcionalmente activo" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de obtener anticuerpos anti-anti-idiotipo que reconocen el mismo antígeno que el anticuerpo a partir del cual el fragmento, derivado o análogo es derivado o reconocido. De manera específica, en una modalidad ilustrativa la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede ser mejorada a través de la eliminación de la estructura y las secuencias CDR que son C-terminal para la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar que secuencias CDR enlazan el antígeno, los péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR pueden ser utilizados en pruebas de enlace con el antígeno a través de cualquier método de prueba de enlace conocidos en la técnica (por ejemplo, la prueba de núcleo BIA) (para ubicación de las secuencias CDR, véase, por ejemplo, Kabat et al., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125(3):961-969).
Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, aunque sin limitarse a, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, Fvs, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, scFv, scFv-FV, o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo.
De manera adicional, los anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanos como no humanas, que se pueden elaborar utilizando técnicas ADN recombinantes estándar, son anticuerpos útiles. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones son derivadas a partir de diferentes especies animales, como por ejemplo, aquellas que tienen una región variable derivada a partir de regiones constantes de inmunoglobulina humana y monoclonal de murino. (Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y la Patente de los Estados Unidos No. 4,816,397, las cuales están incorporadas a la presente mediante referencia en su totalidad). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo a partir de especies no-humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) a partir de las especies no-humanas y una región de estructura a partir de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,585,089, la cual está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad). Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir a través de técnicas ADN recombinantes conocidas en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos en la Publicación Internacional No. WO 87/02671 ; Publicación de Patente Europea No. 0 184 187; Publicación de Patente Europea No. 0 171 496; Publicación de Patente Europea No. 0 173 494; Publicación Internacional No. WO 86/01533; Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Publicación de Patente Europea No. 012 023; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cáncer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559; Morn'son, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente de los Estados Unidos No. 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321 :552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060; cada una de las cuales está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables y pueden ser producidos utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina endógena, aunque pueden expresar genes de cadena ligera y pesada humanas. Los ratones transgénicos son inmunizados de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergadas por los ratones transgénicos se reacomodan durante la diferenciación de célula B, y subsecuentemente experimentan cambio de clase y mutación somática. Por tanto, empleando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM y IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661 ,016; 5,545,806; cada una de las cuales está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad. Otros anticuerpos humanos se pueden obtener a nivel comercial, por ejemplo, a partir de Abgenix, Inc. (ahora Amgen, Freemont, Calif.) y Medarex (Princeton, N.J.).
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado pueden ser generados utilizando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque un anticuerpo monoclonal no-humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, es usado para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítope. (Véase, por ejemplo, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas, que incluyen bibliotecas de exhibición de fago (véase, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991 , J. Mol. Biol. 227:381 ; Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol. 222:581 ; Quan y Cárter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, In Anti-lgE y AIlergic Disease, Jardieu y Fick, eds., Marcel Dekker, New York, N.Y., Chapter 20, pp. 427-469).
En otras modalidades, el anticuerpo es una proteína de fusión de un anticuerpo, o un fragmento funcionalmente activo de la misma, por ejemplo en la cual el anticuerpo es fusionado a través de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace péptido), ya sea en el extremo N o el extremo C a una secuencia de aminoácido de otra proteína (o porción de la misma, de preferencia por lo menos la porción de aminoácido 10, 20 o 50 de la proteína) que no es a partir de un anticuerpo. De preferencia, el anticuerpo o fragmento del mismo es covalentemente enlazado a la otra proteína en el extremo N del dominio constante.
Los anticuerpos incluyen análogos y derivados que son modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula en tanto que dicha unión covalente permita que el anticuerpo retenga su inmunoespecificidad de enlace de antígeno. Por ejemplo, aunque no a manera de limitación, los derivados y análogos de los anticuerpos incluyen aquellos que han sido adicionalmente modificados, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidacion, derivación a través de grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a una unidad de anticuerpo celular u otra proteína, etcétera. Se puede llevar a cabo cualquiera de las numerosas modificaciones químicas a través de técnicas conocidas que incluyen, aunque no se limitan a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etcétera. De modo adicional, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales.
Los anticuerpos pueden tener modificaciones (por ejemplo, substituciones, eliminaciones o adiciones) en residuos de amino ácido que interactúan con receptores Fe. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en residuos de aminoácido identificados como involucrados en la interacción entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 97/34631 , la cual está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad).
Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerígena se pueden obtener comercialmente o ser elaborados a través de cualquier método conocido por alguien con experiencia en la técnica como, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. Los anticuerpos de codificación de secuencia de nucleótido inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerígena se pueden obtener, por ejemplo, a partir de la base de datos GenBank o una base de datos similar a esa, publicaciones de la literatura, o por medio de clonación y secuenciamiento de rutina.
En una modalidad específica, se pueden usar los anticuerpos conocidos para el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerígena se pueden obtener a nivel comercial o ser producidos a través de cualquier método conocido en la técnica, como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. Los anticuerpos de codificación de secuencia de nucleótido inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerígena se pueden obtener, por ejemplo, a partir de la base de datos GenBank o una base de datos similar, las publicaciones de la literatura, o por medio de clonación y secuenciamiento de rutina. Los ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cáncer incluyen, aunque no se limitan a, OVAREX® que es un anticuerpo de murino para el tratamiento de cáncer de ovario; PANOREX® (Glaxo Wellcome, NC) que es un anticuerpo lgG2a de murino para el tratamiento de cáncer colorectal; Cetuximab ERBITUX® (Imclone Systems Inc., NY) que es un anticuerpo quimérico anti-EGFR IgG para el tratamiento de cánceres positivos al factor de crecimiento epidérmico, tales como cáncer de cabeza y cuello; Vitaxin® (Medlmmune, Inc., MD) que es un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sarcoma; CAMPATH l/H® (Leukosite, MA) que es un anticuerpo IgG-i humanizado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL); SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; ONCOLYM® (Techniclone, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-Dr10 de murino radioetiquetado para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; ALLOMUNE® (BioTransplant, CA) que es un mAb anti-CD2 humanizado para el tratamiento de Enfermedad de Hodgkin o linfoma no-Hodgkin; CEACIDE® (Immunomedics, NJ) que es un anticuerpo anti-CEA humanizado para el tratamiento de colorectal cáncer, AVASTIN® (Genentech/Roche, CA) que es un mAb anti-VEGF-A humanizado para el tratamiento de cáncer cerebral, de colon, de riñón o pulmonar; ZEVALIN® (Spectrum Pharmaceuticals, NV) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; ARZERRA® (GSK, UK) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica; VECTIBIX® (Amgen, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR humano para el tratamiento de cáncer de colon; RITUXAN® (Genetech/BioGen, CA) que es un anticuerpo monoclonal quimérico anti- CD20para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica y linfoma no-Hodgkin; BEXXAR® (GSK, UK) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; HERCEPTIN® (Genentech, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-receptor HER2 para el tratamiento de cáncer de mama y de estómago; YERVOY® (BMS, NJ) que es un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA4 para el tratamiento de melanoma; MYLOTARG® (Wyeth/Pfizer, NY) que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD33 conjugado para calicheamicina para el tratamiento de leucemia mieloide aguda; e, inotuzumab ozogamicina (Wyeth/Pfizer, NY) que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD22 conjugado para calicheamicina para el tratamiento de leucemia linfocítica aguda y linfoma no-Hodgkin.
En otra modalidad específica, se pueden utilizar los anticuerpos anti-IL13, que incluyen anticuerpos anti-IL13 usados en el tratamiento de cáncer.
En otra modalidad específica, se pueden utilizar los anticuerpos anti-Notch, que incluyen anticuerpos anti-Notch usados en el tratamiento de cáncer.
En los intentos para descubrir objetivos celulares efectivos para el diagnóstico y terapia del cáncer, los investigadores han buscado la identificación de la transmembrana o de otro modo los polipéptidos tumor-asociados que están específicamente expresados en la superficie de uno o más tipos de célula cancerígena en comparación con una o más células no cancerosas normales. Con frecuencia, dichos polipéptidos tumor-asociados son expresados de manera más abundante en la superficie de las células cancerosas en comparación con la superficie de las células no cancerosas. La identificación de dichos polipéptidos tumor-asociados de antígeno de superficie celular ha dado origen a la capacidad de dirigir de manera específica a las células cancerosas para destrucción a través de terapias en base a anticuerpos.
Síntesis de Compuestos y Conjugados de Anticuerpo-Fármaco de los Mismos Los compuestos y conjugados de la invención se pueden elaborar usando los procedimientos sintéticos detallados a continuación en la Ejemplificación. Como se describe en mayor detalle a continuación, los compuestos y conjugados de la invención pueden ser preparados utilizando una sección de una unidad ligadora que tiene un sitio reactivo para enlace a un compuesto.
Ligador Un ligador (referido en ocasiones como "[ligador]" en la presente) es un compuesto bifuncional que puede ser utilizado para unir un fármaco y un anticuerpo para formar un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). Tales conjugados son útiles, por ejemplo, en la formación de inmunoconjugados dirigidos contra antígenos asociados a tumor. Dichos conjugados permiten el suministro selectivo de fármacos citotóxicos a las células tumorales.
En una modalidad el ligador tiene la fórmula: es en donde Y es C2-C20 alquileno o C2-C2o heteroalquileno; C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-Ci-Ci0 alquileno-, -Ci-Cio alquileno-(C3-Ce carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-CrCio alquileno-, -Ci-Cio alquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-C|0alquileno-; R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, N02, CN y CF3; R10 es hidrógeno, -C|-C|0alquilo, -C3-C8carbociclo, arilo, -Ci Cioheteroalquilo, -C3- Ceheterociclo, -Ci-C|0alquileno-arilo, -arileno-Ci- C|0alquilo, -Ci-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Ci-C|0alquilo, - C|-C|0alquileno-(C3-C8heterociclo), y -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-C|0alquilo, en donde el arilo en R10 que comprende arilo es opcionalmente sustituido con [R7]h; y h es 1 , 2, 3, 4 o 5.
En un ADC el ligador sirve para unir la carga útil al anticuerpo. En un aspecto, se introduce una segunda sección de la unidad ligadora la cual tiene un segundo sitio reactivo por ejemplo, un grupo electrofílico que es reactivo para un grupo nucleofílico presente en una unidad de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo). Los grupos nucleofílicos útiles en un anticuerpo incluyen aunque no se limitan a, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleofílico de un anticuerpo es reactivo para un grupo electrofílico en una unidad ligadora y forma un enlace covalente para una unidad ligadora. Los grupos electrofílicos útiles incluyen, aunque sin limitarse a, grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrofílico proporciona un sitio conveniente para la unión del anticuerpo.
En otra modalidad, una unidad ligadora tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofílico que es reactivo para el grupo electrofílico presente en un anticuerpo. Los grupos electrofílicos útiles en un anticuerpo incluyen, aunque no se limitan a, grupos carbonil aldehido y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleofílico de una unidad ligadora puede reaccionar con el grupo electrofílico en un anticuerpo y formar un enlace covalente para el anticuerpo. Los grupos nucleofílicos en una unidad ligadora incluyen, aunque no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrofílico en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para fijación a una unidad ligadora.
Los grupos funcionales amino también son sitios reactivos útiles para una unidad ligadora debido a que pueden reaccionar con ácido carboxílico, o ésteres activados de un compuesto para formar un enlace amida. De manera común, los compuestos de la invención en base a péptido pueden ser preparados mediante la formación de un enlace péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Dichos enlaces de péptido se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (véase, por ejemplo, Schroder y Lubke, "The Peptides", volumen 1 , pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptido.
Como se describe en mayor detalle a continuación, los conjugados se pueden preparar utilizando una sección de un ligador que tiene un sitio reactivo para enlace a un compuesto de la invención e introduciendo otra sección de la unidad ligadora que tiene un sitio reactivo para un anticuerpo. En un aspecto, una unidad ligadora tiene un sitio reactivo que tiene el grupo electrofílico que es reactivo con un grupo nucleofílico presente en una unidad de anticuerpo, tal como un anticuerpo. El grupo electrofílico proporciona un sitio conveniente para fijación de anticuerpo. Los grupos nucleofílicos útiles en un anticuerpo incluyen aunque no se limitan a, grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleofílico de un anticuerpo es reactivo para el grupo electrofílico en una unidad ligadora y forma un enlace covalente para una unidad ligadora. Los grupos electrofílicos útiles incluyen, aunque no se limitan a, grupos maleimida y haloacetamida.
En otra modalidad, una unidad ligadora tiene un sitio reactivo el cual tiene un grupo nucleofílico que es reactivo con el grupo electrofílico presente en una unidad de anticuerpo. El grupo electrofílico en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la fijación a una unidad ligadora. Los grupos electrofílicos útiles en un anticuerpo incluyen, aunque no se limitan a, grupos carbonil aldehido y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleofílico de una unidad ligadora puede reaccionar con el grupo electrofílico en un anticuerpo y formar un enlace covalente para el anticuerpo. Los grupos nucleofílicos útiles en una unidad ligadora incluyen, aunque no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y arilhidrazida.
Como se usa en la presente, "me-" previamente conocido como MalC-" se refiere a Como se utiliza en la presente, "mcValCitPABC-" previamente conocido como "MalCValCitPABC-" se refiere a Como se usa en la presente, "MalPegXC2-" se refiere a se usa en la presente, "AmPegXC2-" se refiere a Como se usa en la presente, "mcValCitPABCAmPegXC2-"se refiere a Como se usa en la presente, "MalPegXC2ValCitPABC-" se refiere Como se usa en la presente, "2BrAcPegXC2" se refiere a Como se usa en la presente, "me-" se refiere a se usa en la presente, "MalC6-" se refiere a Como se usa en la presente, "PFPCOPegXC2ValCitPABC-" se Como se usa en la presente, "PFPCOPegXC2AmPegYC2-" se Como se usa en la presente, "PFPCOPegXC2AlaAlaAsnPABC-" Como se usa en la presente, "PFPCOPegXC2-" se refiere a Como se usa en la presente, "PFPCOPegXC2AmPegYC2PABC-" se refiere a Como se usa en la presente, "mcGly-" se refiere a Como se usa en la presente, "AzCOC2Ph4AmCOPeg2C2-" se refiere a Como se usa en la presente, "AzCOC2Ph4AmPeg1 C1-" Como se usa en la presente, "AcLysValCitPABC " se refiere a Conjugación con Transglutaminasa En ciertas modalidades, un compuesto de la invención puede ser entrelazado de manera covalente a un polipéptidos que contiene Fe o que contiene Fab modificado genéticamente con una marca que contiene glutamina donadora de acilo (por ejemplo, marcas de péptido que contienen Gln o Q-marcas) o una glutamina endógena hecha reactiva (es decir, la habilidad para formar un enlace covalente con un donador acilo en presencia de una amina y una transglutaminasa) mediante modificación genética de polipéptido (por ejemplo, a través de eliminación, inserción, sustitución o mutación de aminoácido o cualquier combinación de las mismas en el polipéptido), en presencia de transglutaminasa, a condición de que el compuesto de la invención comprenda un agente donador de amina (por ejemplo, molécula pequeña que comprende o es fijada a una amina reactiva), formando de esta manera una población estable y homogénea de un conjugado de polipéptido que contiene Fe genéticamente modificado con el agente donador de amina que está específicamente conjugado en el sitio para el polipéptido que contiene Fe o que contiene Fab a través de la marca que contiene glutamina donadora de acilo o la glutamina endógena expuesta/accesible/reactiva. Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden ser conjugados como se describió en la Solicitud de Patente Internacional No. de Serie PCT/IB2011/054899, cuyo contenido completo está incorporado a la presente mediante referencia. En ciertas modalidades, para facilitar la conjugación del compuesto de la invención a un polipéptido que contiene Fe o que contiene Fab modificado genéticamente con una marca que contiene glutamina donadora de acilo o una glutamina endógena hecha reactiva por medio de una modificación genética de polipéptido en presencia de transglutaminasa, Z es NH2.
Conjugación para la Región Constante de Dominio Kappa de Cadena Ligera Humana En ciertas modalidades, un compuesto de la invención puede ser fijado de manera covalente a la cadena lateral de K188 de la región constante de dominio kappa de cadena ligera humana (CLK) (numeración de cadena ligera completa de acuerdo con Kabat). K188 puede ser nombrado también CLK K80, cuando contiene sólo la región constante kappa humana, por ejemplo, de NOs ID NO ID SEQ: 1 , 2, 3 y 4). Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden ser conjugados como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número de Serie 13/180,204, o WO2012/007896 cuyos contenidos completos están incorporados en la presente mediante referencia. En ciertas modalidades, para facilitar la conjugación para K188 CLK (CLK-K80), Z es ; R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, N02, CN y CF3; y h es 1 , 2, 3, 4 o 5.
En ciertas modalidades, para facilitar la conjugación para K CLK (CLK-K80), Z es La presente invención proporciona además conjugados anticuerpo-fármaco que comprenden un anticuerpo, o porciones de enlace de antígeno del mismo, que comprenden un dominio kappa constante conjugado de manera covalente para una toxina de la invención, caracterizado porque al menos una toxina de la invención es conjugada de manera covalente para K80 de NO ID SEQ:1 , NO ID SEQ:2, NO ID SEQ:3 o NO ID SEQ: 4 (Cuadro 1 ). En ciertos aspectos, el número de toxinas de la invención conjugadas de forma covalente para K80 puede estar en un rango cuyo límite inferior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.6, aproximadamente 1.7, aproximadamente 1.8, aproximadamente 1.9, y aproximadamente 2.0, y cuyo límite superior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 2.0, aproximadamente 2.1 , aproximadamente 2.2, aproximadamente 2.3, aproximadamente 2.4, aproximadamente 2.5. En ciertos aspectos, p es aproximadamente 2.
La conjugación de la toxina con el dominio de cadena ligera constante de un anticuerpo es particularmente deseable para reducir al mínimo, o prevenir, cualquier interferencia con el enlace de la porción Fe del anticuerpo a receptores Fe (tales como FcyR y FcRn) o el enlace del anticuerpo a su objetivo respectivo. De modo inverso, la conjugación de la toxina respectiva a la porción Fe de un anticuerpo puede reducir la vida media del anticuerpo in vivo y/o su capacidad para interactuar con el sistema inmune (función efectora). La conjugación de la toxina en la región de cadena pesada variable (VH) o cadena ligera variable (VL) del anticuerpo conlleva el riesgo de disminuir el enlace del anticuerpo a su cognado.
Además, en tanto que la conjugación para CLK-K80 es confiable y robusta, la conjugación para otras lisinas de superficie de anticuerpo, cada una de reactividad ligeramente distinta y pl puede resultar en una muestra heterogénea de anticuerpos conjugados que pueden liberar moléculas conjugadas en momentos inoportunos o irregulares, por ejemplo durante la circulación y antes del suministro de la Porción Efectora al objetivo mediante reconocimiento de anticuerpo.
Además, la presente invención proporciona polimorfismos conocidos de la cadena kappa V/A en la posición 45 y A/L en la posición 83 (proporcionando los 3 polimorfismos kappa constantes humanos identificados Km(1):V45/L83 (NO ID SEQ:2), Km(1 ,2): A45/L83 (NO ID SEQ:3), y Km(3) A45/V83 (NO ID SEQ:4)). La variabilidad de los residuos en las posiciones 45 y 83 en NO ID SEQ: 1 se puede seleccionar a fin de proporcionar sólo uno, dos o los tres de Km(1 ), Km(1 ,2), y Km(3) polimorfismos.
CUADRO 1 En donde x en la posición 45 es A o V, y x en la posición 83 es L o V.
En ciertas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de la invención conjugado de manera covalente para un anticuerpo (o porción de enlace de antígeno del mismo), en donde por lo menos aproximadamente 50%, o por lo menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 90% del compuesto de la invención en la composición es conjugado para el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo en K CLK.
En ciertas modalidades, los compuestos de la invención pueden ser conjugados para el sitio de combinación de un anticuerpo catalítico, tales como los anticuerpos de aldolasa, o porción de enlace de antígeno de los mismos. Los anticuerpos de aldolasa contienen porciones de sitio de combinación que, cuando son armoniosas (por ejemplo mediante conjugación), catalizan una reacción de adición de aldol entre un donador de cetona alifática y un aceptor de aldehido. Los contenidos de la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2006/205670 están incorporados en la presente mediante referencia, en particular en las páginas 78-118 que describen enlazadores, y los párrafos
[0153]-
[0233] que describen anticuerpos, fragmentos útiles, variantes y modificaciones de los mismos, h38C2, sitios de combinación y regiones de determinación complementarias (CDRs), y tecnología de anticuerpo relacionada (Cuadro 2, y los compuestos ilustrativos siguientes): El término "sitio de combinación" incluye las CDRs y los residuos de estructura adyacentes que están involucrados en el enlace de antígeno.
CUADRO 2 Conjugación con ligadores que comprenden succinimidas, que incluyen versiones de anillo-abierto En ciertas modalidades, la presente invención incluye un compuesto de la invención conjugado a través de un ligador en base a succinimida o un ligador en base a succinimida de anillo abierto. La estabilidad del enlace succinimida-cisteina se convertido en un área de creciente interés. Las succinimidas pueden ser transferidas tanto in vitro como in vivo a tiol nucleófilos exógenos, presumiblemente a través de una reacción retro-Michael que resulta en una maleimida que es subsecuentemente atacada por un tiol. Se considera que la hidrólisis del anillo resulta en una especie que es resistente a la reacción retro-Michael. Esto hace al conjugado resultante más estable y potencialmente más eficaz. Las condiciones pueden ser optimizadas para abrir de manera forzada el anillo succinimida en el conjugado. Las condiciones básicas dieron como resultado una hidrólisis sencilla del anillo. Por ejemplo, los ligadores que contienen una cadena polietilen glicol (PEG) pueden ser hidrolizados a pH 9.2 a 37°C en aproximadamente 12h, y los ligadores que contienen una cadena alquilo, tal como "me" pueden requerir de una mayor temperatura y mayor tiempo de reacción a fin de activar la apertura del anillo para complementación. 50 mM re ulador de borato h 9.2 l r to h 9.2 Ejemplo de hidrólisis forzada de conjugados en base a maleimida A fin de evaluar la estabilidad de estos conjugados y asignar prioridades a las muestras para evaluación ¡n vivo, se desarrolló un ensayo que involucra el tratamiento de los conjugados maleimida-enlazados con glutatión acuosos en exceso (GSH) o plasma. Las alícuotas de la mezcla de reacción fueron analizadas en varios intervalos de tiempo prestablecidos para determinar la carga del conjugado, utilizando la metodología antes descrita. Los resultados (Cuadro 24) indican que el enlace fármaco-anticuerpo es escindido lentamente de una manera GSH-dependiente. Como se esperaba, la velocidad de escisión es altamente dependiente de la hidrólisis del anillo de succinimida. De manera importante, estos resultados parecen traducirse para mejorar la exposición PK, como se midió a través de un incremento en el área-bajo-la-curva (AUC, por sus siglas en inglés) del conjugado y a través de un incremento en la relación de exposición conjugado/Ab.
Método para determinar la estabilidad de ADCs La muestra de ADC (30 pg) en PBS es mezclada con solución de glutatión (GSH) para producir la concentración final de GSH de 0.5 mM y 3 mg/mL de concentración de proteína. De igual manera se prepare una muestra de control (sin GSH) a partir de 30 pg ADC diluidos para 3 mg/mL en PBS. La muestra ADC GSH-tratada y la muestra ADC de control fueron incubadas a 37°C y fueron muestreadas a 0, 3, y 6 días. Las alícuotas fueron reducidas con TCEP en exceso, acidificadas mediante la adición de solución de ácido fórmico al 0.1 % con 10% acetonitrilo y analizadas para carga por medio de LC/MS como se describe más adelante.
Análisis de muestra: El análisis se realizó utilizando una HPLC capilar Aglient 1100 acoplada con espectrómetro de masa Waters Xevo G2 Q-TOF. Los analitos fueron cargados en una columna Zorbax Poroshell 300SB C8 (0.5 mm X 75 mm, mantenida a 80°C) con ácido fórmico al 0.1%, y eluida utilizando un gradianete de 20-40% solución reguladora B (80% acetonitrilo, 18% 1 -propanol, 2% agua con ácido fórmico al 0.1 %) a una velocidad de flujo de 20 µ?/min durante 5.5 minutos. La detección espectrométrica de masa se llevo a cabo en modo de sensibilidad positive con voltaje capilar fijado a 3.3 kV. El análisis de datos se realizó con la función MaxEnt 1 en MassLynx y se utilizaron intensidades para cálculo de carga en base a la fórmula descrita previamente.
Composiciones v Métodos de Administración En otras modalidades, otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad efectiva de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, las composiciones son adecuadas para administración veterinaria o humana.
Las actuales composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma que permite que la composición sea administrada a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un sólido o un líquido. Las rutas de administración comunes incluyen, sin limitación, parenteral, ocular e intra-tumor. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares o técnicas de inyección o infusión intraesternal. En un aspecto, las composiciones son administradas parenteralmente. En una modalidad específica, las composiciones son administradas por vía intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas a fin de permitir que un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo estén biodisponibles al momento de la administración de la composición al paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosis, en donde por ejemplo, una tableta puede ser una unidad de dosis individual, y un recipiente de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo en forma líquida puede contener una pluralidad de unidades de dosis.
Los materiales usados en la preparación de las composiciones farmacéuticas pueden ser no tóxicos en las cantidades utilizadas. Será evidente para aquellos con experiencia en la técnica que la dosificación óptima de él o los ingredientes activos en la composición farmacéutica dependerá de una variedad de factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo, humano), la forma particular del compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo, la forma de administración y la composición empleada.
El excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser sólido o en partículas, de modo que las composiciones están, por ejemplo, en forma de tableta o de polvo. EI(Los) excipiente(s) puede(n) ser líquido(s).
Además, el (los) excipiente(s) pueden estar en partículas.
La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, una solución, emulsión o suspensión. En una composición para administración mediante inyección, pueden incluirse también uno o más agentes tensioactivos, conservadores, agentes de humectación, agente dispersantes, agentes de suspensión, reguladores de pH, estabilizadores y agentes isotónicos.
Las composiciones líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir también uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución de salina, de preferencia solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijados tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietlien glicoles, glicerina, ciclodextrina, propilen glicol u otros solventes; agentes antibacteriales tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes como el ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como el ácido etilendiamintetraacético; soluciones amortiguadoras tales como acetatos, citratos, fosfatos o amino ácidos y agentes para el ajuste de la tonicidad como el cloruro o dextrosa de sodio. Una composición parenteral puede ser encerrada en una ampolleta, una jeringa desechabie o un envase de dosis múltiple de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un auxiliar ilustrativo. Una composición inyectable es preferiblemente estéril.
La cantidad de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo que es efectiva para el tratamiento de un padecimiento o condición particular dependerá de la naturaleza del padecimiento o condición, y se puede determinar a través de técnicas clínicas estándar. Además, las pruebas in vitro o in vivo se pueden emplear de manera opcional para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se utilizará en las composiciones dependerá también de la ruta de administración y la seriedad de la enfermedad o padecimiento, y se decidirá de acuerdo con el criterio del practicante y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo de modo que se obtendrá una dosificación adecuada. De modo común, esta cantidad es de por lo menos aproximadamente 0.01 % de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo en peso de la composición. En una modalidad ilustrativa, las composiciones farmacéuticas son preparadas de manera que una unidad de dosificación parenteral contiene desde aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 2% en peso de la cantidad de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo.
Para administración intravenosa, la composición puede comprender desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 100 mg de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo por kg del peso corporal del paciente. En un aspecto, la composición can incluye desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo por kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto, la cantidad administrada estará en el rango desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo.
En general, la dosificación de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo administrado a un paciente es, de manera común, de aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente. En un aspecto, la dosificación administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto, la dosificación administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto más, la dosificación administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal del paciente. En otro aspecto más la dosificación administrada es de entre aproximadamente 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente. En un aspecto más, la dosificación administrada es de entre aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente.
Un compuesto de la invención y/o conjugado de anticuerpo-fármaco del mismo puede ser administrado a través de cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo. La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de suministro, por ejemplo, encapsulado en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etcétera, y se pueden utilizar para administrar un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo. En ciertas modalidades, más de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo es administrado a un paciente.
En modalidades específicas, puede ser deseable administrar uno o más compuestos de la invención y/o conjugados de anticuerpo-fármaco de los mismos de manera local al área que necesita del tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, mediante infusión local durante la cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con un aposito para herida después de la cirugía; mediante inyección a través de un catéter; o por medio de un implante, el implante que es e un material poroso, no-poroso, o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas silásticas o fibras. En una modalidad, la administración puede ser mediante inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un cáncer, tumor o tejido neoplásico o pre-neoplásico. En otra modalidad, la administración puede ser mediante inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de una manifestación de una enfermedad autoinmune.
En otra modalidad más, el compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo puede ser suministrado en un sistema de liberación controlada, tal como, aunque sin limitarse a, una bomba o se pueden utilizar varios materiales poliméricos. En otra modalidad más, un sistema de liberación controlada puede ser colocado en proximidad al objetivo del compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo, por ejemplo, el hígado, requiriendo por tanto sólo de una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada descritos en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, auxiliar o excipiente, con el cual se administra un compuesto o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, que incluyen aquellos del petróleo, animales, vegetales o de origen sintético. Los vehículos pueden ser solución salina, y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizadores y otros. En una modalidad, cuando se administra a un paciente, el compuesto o conjugado y los vehículos farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un vehículo ilustrativo cuando el compuesto o conjugado son administrados por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden ser utilizadas como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Las composiciones de la presente, si se desea, pueden contener también cantidades menores de agentes de humectación y emulsificación, o agentes reguladores de pH.
Las composiciones de la presente pueden tomar la forma de soluciones, granulos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, o cualquier otra forma adecuada para el uso. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin.
En una modalidad, el compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo son formulados de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a animales, en particular seres humanos. De manera común, los portadores o vehículos para administración intravenosa son soluciones amortiguadoras acuosas isotónicas estériles. Cuando es necesario, las composiciones pueden incluir también un agente de solubilización. Las composiciones para administración intravenosa pueden comprender de manera opcional un anestésico local como la lignocaina en caso de dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes son suministrados ya sea por separado o mezclados juntos en forma de unidad de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado deshidratado o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolleta o sobredio que indica la cantidad de agente activo. Cuando un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo va a ser administrado mediante infusión, puede ser suministrado, por ejemplo, con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando el compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo es administrado mediante inyección, se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los ingredientes pueden ser mezclados antes de la administración.
La composición puede incluir varios materiales que modifican la forma física de una unidad de dosis sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una capa de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la capa de recubrimiento comúnmente son inertes, y pueden ser seleccionados a partir de, por ejemplo, azúcar, goma-laca y otros agentes de recubrimiento entérico. De manera alternativa, los ingredientes activos pueden ser encerrados en una cápsula de gelatina.
Ya sea en forma sólida o líquida, las composiciones de la presente pueden incluir un agente farmacológico usado en el tratamiento del cáncer.
Usos Terapéuticos de los Compuestos v Conjugados de Anticuerpo-Fármaco de los Mismos Otro aspecto de la invención se refiere a un método para usar los compuestos de la invención y los conjugados de anticuerpo-fármaco de los mismos para tratar el cáncer.
Los compuestos de la invención y/o conjugados de anticuerpo-fármaco de los mismos son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o célula cancerosa, ocasionando apoptosis en una célula tumoral o cancerosa, o para tratar el cáncer en un paciente. Los compuestos de la invención y/o conjugados de anticuerpo-fármaco de los mismos pueden ser utilizados consecuentemente en una variedad de entornos para el tratamiento de cánceres de animales. Dichos conjugados pueden ser usados para suministrar un compuesto de la invención a una célula tumoral o célula cancerosa. Sin enlazarse a teoría, en una modalidad, el anticuerpo del conjugado se enlaza a o se asocia con un antígeno de célula cancerosa o de célula tumoral, y el conjugado puede ser absorbido (internalizado) dentro de una célula tumoral o célula cancerosa a través de la endocitosis receptor-mediada u otro mecanismo de internalización. El antígeno puede ser fijado a una célula tumoral o célula cancerosa o puede ser una proteína de matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa. En ciertas modalidades, una vez dentro de la célula, una o más de las secuencias de péptido específico son eliminadas enzimática o hidrolíticamente a través de una o más proteasas asociadas a célula tumoral o célula cancerosa, resultando en la liberación de un compuesto de la invención desde el conjugado. El compuesto liberado de la invención está en libertad entonces de migrar dentro de la célula e inducir actividades citotóxicas o citostáticas. El conjugado puede ser separado también por medio de una proteasa intracelular para liberar un compuesto de la invención. En una modalidad alternativa, el compuesto de la invención es separado desde el conjugado fuera de la célula tumoral o célula cancerosa, y el compuesto de la invención penetra de manera subsecuente la célula.
En ciertas modalidades, los conjugados proporcionan marcación de fármaco de tumor o cáncer de conjugación específica, reduciendo por tanto la toxicidad general de los compuestos de la invención.
En otra modalidad, la unidad de anticuerpo se enlaza a la célula tumoral o célula cancerosa.
En otra modalidad, la unidad de anticuerpo se enlaza a un antígeno de célula tumoral o de célula cancerígena que está en la superficie de la célula tumoral o célula cancerosa.
En otra modalidad, la unidad de anticuerpo se enlaza a un antígeno de célula tumoral o de célula cancerígena que es una proteína de matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de anticuerpo para una célula tumoral o célula cancerosa particular puede ser importante para determinar aquellos tumores o cánceres que son tratados de manera más efectiva.
Los tipos particulares de cánceres que pueden ser tratados con un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo, incluyen aunque no se limitan a, carcinomas de la vejiga, mama, cérvix, colon, endometrio, riñon, pulmón, esófago, ovarios, próstata, páncreas, piel, estómago, y testículos; y cánceres hematógenos que incluyen, aunque no se limitan a leucemias y linfomas.
Terapia Multi-Modal para el Cáncer. Los cánceres, que incluyen, aunque no se limitan a, un tumor, metástasis, u otra enfermedad o padecimiento caracterizado por crecimiento celular descontrolado, pueden ser tratados o inhibidos mediante la administración de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo.
En otras modalidades, se proporcionan métodos para tratar el cáncer, que incluyen administrar a un paciente que necesita del tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo y un agente quimioterapéutico. En una modalidad el agente quimioterapéutico es aquel con el cual no se ha encontrado que el tratamiento del cáncer sea refractario. En otra modalidad, el agente quimioterapéutico es aquel con el cual se ha encontrado que el tratamiento del cáncer es refractario. Un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo puede ser administrado a un paciente ha experimentado también cirugía como tratamiento para el cáncer.
En ciertas modalidades, el paciente recibe también un tratamiento adicional, tal como terapia de radiación. En una modalidad específica, el compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo es administrado de manera concurrente con el agente quimioterapéutico o con terapia de radiación. En otra modalidad específica, el agente quimioterapéutico o terapia de radiación es administrado antes de o subsecuente a la administración de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo.
Un agente quimioterapéutico puede ser administrado en una serie de sesiones. Se puede administrar cualquiera o una combinación de agentes quimioterapéuticos, tales como uno estándar de agente(s) quimioterapéutico(s) de cuidado.
De manera adicional, los métodos de tratamiento de cáncer con un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo se proporcionan como una alternativa a la quimioterapia o terapia de radiación cuando la quimioterapia o la terapia de radiación han demostrado ser demasiado tóxicas, por ejemplo, resultan en efectos colaterales inaceptables o insoportables, para el paciente que está siendo tratado. El paciente que es tratado puede, de manera opcional, ser tratado con otro tratamiento del cáncer tal como cirugía, terapia de radiación o quimioterapia, dependiendo de que tratamiento se encuentre aceptable o soportable.
Los compuestos de la invención y/o conjugados de anticuerpo-fármaco de los mismos también pueden ser utilizados de una manera in vitro o ex vivo, tal como para el tratamiento de ciertos cánceres, que incluyen aunque no se limitan a leucemias y linfomas, el tratamiento que involucra trasplantes de célula madre autóloga. Esto puede involucrar un proceso multi-etapa en el cual las células madre hematopoyéticas autólogas del animal son cultivadas y purgadas de todas las células cancerosas, la población celular de la médula ósea restante del animal que es erradicada después a través de una elevada dosis de un compuesto de la invención y/o conjugado anticuerpo-fármaco del mismo con o sin terapia de radiación de dosis elevada acompañante, y el injerto de célula madre se infunde de regreso al animal. Se proporciona entonces cuidado paliativo mientras se restaura la función de la médula ósea y se recupera el paciente.
Especies Liberadas Modalidades adicionales de la invención incluyen las especies químicas liberadas, dentro o en la cercanía de la célula cancerosa o célula tumoral por lo que se considera que hay separación enzimática y/o hidrolítica de una o más proteasas asociadas a célula cancerosa o célula tumoral. Dichos compuestos incluyen las especies descritas en la presente, e incluyen también compuestos tales como aquellos descritos en la estructura: IV o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, Y es C2-C20 alquileno o C2-C2o heteroalquileno; C3-C8 carbociclo- -arileno-, -C3-C8heteroc¡clo-, -C|-Cioalquileno-arileno-, -arileno-Ci-Cioalquileno-, -Ci-C|0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Ci-C10alquileno-, -d- Cioalquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-Ci0alquileno-; G es halógeno, -OH, -SH o -S-Ci-C6 alquilo; R2 es hidrógeno, CrC8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; 3A y R3B están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, d-Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclílo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d- C8 heteroalquileno; R A y R4B están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, CrCs haloalquilo, C3-C carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo, o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C1 Ca heteroalquileno; heterociclilo, C3-C8 carbociclilo y C6-Ci arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -d-C8 alquilo, -C^Cs alquil-N(R')2, -Ci-C8 alquil-C(0)R', -Ci-Ca alquil-C(0)OR' -0-(d-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; independiente a partir del grupo que consta de Ci-C8 alquilo, -C-i-C8 alquil- N(R')2, -C Ce alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR', -O-(d-C8 alquilo), - C(0)R\ -OC(O)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8heterociclilo, Ci- Ci0alquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, N02, CN y CF3; R10 es hidrógeno, -C|-C|0alquilo, -C3-C8carbociclo, arilo, -C Cioheteroalquilo, -C3- Csheterociclo, -Ci-C|0alquileno-arilo, -ar¡leno-C|-Ci0alquilo, -Ci-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Ci-C|0alquilo, -d-Cioalquileno-ÍCs-Ceheterociclo), y -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-C|0alquilo, en donde el arilo en R10 que comprende arilo es opcionalmente sustituido con [R7]h; h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S.
Son de particular interés los compuestos de la fórmula IV que tienen las estructuras: La invención está descrita además en los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplificación Los experimentos se llevaron a cabo de manera general bajo atmósfera inerte (nitrógeno o argón), en particular en casos en donde se emplearon reactivos o intermediarios sensibles al oxígeno o la humedad. Los solventes y reactivos comerciales fueron utilizados en general sin purificación adicional, incluyendo solventes anhidro cuando es apropiado (generalmente productos Sure-Sea1™ de Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin). En general los productos fueron deshidratados al vacío secados antes de ser llevados a reacciones adicionales o sometidos a prueba biológica. Los datos de espectrometría de masa se reportaron a partir de cromatografía de líquido-espectrometría de masas (LCMS), ionización química a presión atmosférica (APCI) o instrumentación de cromatografía de gas-espectrometría de masa (GCMS). Los desplazamientos químicos para los datos de resonancia magnética nuclear (RMN) son expresados en partes por millón (ppm, d) referenciados para picos residuales a partir de los solventes deuterizados utilizados.
Para los procedimientos de referencia de síntesis en otros Ejemplos o Métodos, puede variar el Protocolo de reacción (duración de la reacción y temperatura). En general, se siguieron las reacciones mediante cromatografía de capa fina o espectrometría de masa, y sometidas a análisis cuando es apropiado. Las purificaciones pueden variar entre los experimentos: en general, los solventes y las relaciones de solvente usadas para eluyentes/gradientes se seleccionaron para proporcionar Rfs o tiempos de retención apropiados.
Las rotaciones ópticas se efectuaron en un polarímetro Perkin- Elmer 343 (Número de serie 9506).
Se realizó HRMS en un aparato Agilent 6220 TOF LC/MS.
Los nombres de compuesto se generaron con software ACD Labs.
Condiciones HPLC y LC-IWS Usadas para Análisis Protocolo A: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácidoJórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 1.5 minutos, 5% hasta 100% B durante 8.5 minutos, después 100% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo B: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 50% B durante 1.5 minutos, 50% hasta 100% B durante 6.5 minutos, después 100% B durante 3 minutos; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 µ?_; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo C: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 µ?t?; Fase móvil A: 0.02% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: 0.02% ácido trifluoroacético en metanol (v/v); Gradiente: 50% hasta 100% B durante 10 minutos; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; Volumen de inyección: 10 µ?_; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo D: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.02% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: 0.02% ácido trifluoroacético en metanol (v/v); Gradiente: 5% hasta 100% B durante 8 minutos; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo E: Columna: Phenomenex Lux Amylose-2, 250 x 4.6 mm, 5 pm; Fase móvil A: heptano; Fase móvil B: etanol (desnaturalizado); Gradiente: 5% hasta 100% B durante 10 minutos; 10 Velocidad de flujo: 1.5 mL/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-1500 daltons; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
Protocolo F: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, 2.1 mm x 50 mm, C18, 1.7 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 0.1 minuto, 5% hasta 95% B durante 0.7 minuto, 95% B durante 0.1 minuto; Velocidad de flujo: 1.25 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detección: 200- 450nm; MS (+) rango 100-1200 daltons; Volumen de inyección: 5 µ?_; Instrumento: Waters Acquity.
Protocolo G: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 µ??; Fase móvil A: 0.02% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: 0.02% ácido trifluoroacético en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0% hasta 100% B durante 8.5 minutos; Velocidad de flujo: 1.5 mUminuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm; Volumen de inyección: 10 µ?_; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo H: Columna: Phenomenex Gemini-NX, 4.6mm x 50mm, C18, 3pm, 110 A; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0% hasta 100% B durante 4.10 minutos, lineal después 100% B durante 0.4 minuto; Velocidad de flujo: 1.5 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detección: DAD 200- 450 nm; MS (+) rango 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 pL; Instrumento: Agilent.
Protocolo I: Columna: Atlantis T3, 75 x 3.0 mm, 3 pm; Fase móvil A: 0.05% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: acetonitrilo; Gradiente: 5% hasta 95% B durante 5.75 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 mL/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 230 nm, 254 nm; MS (+) rango: 150-1200 daltons; Volumen de inyección: 5 pL; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
Protocolo I: Columna: Atlantis T3, 75 x 3.0 mm, 3 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.05% en agua (v/v); Fase móvil B: acetonitrilo; Gradiente: 5% hasta 95% B durante 5.75 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 mL/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 230 nm, 254 nm; MS (+) rango: 150-1200 daltons; Volumen de inyección: 5 pl_; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
Protocolo J: Columna: Phenomenex Luna Fenil-Hexyl, 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 1.5 minutos, 5% hasta 100% B durante 8.5 minutos, después 100% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo K: Columna: Symmetry-C18, 50 x 2.1 mm, 3.5 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en metanol (v/v); Gradiente: 10% hasta 90% B durante 6.5 minutos; Velocidad de flujo: 0.7 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detección: DAD 215 nm; MS (+) rango 100-1500 daltons; Volumen de inyección: 3 pL; Instrumento: Waters 996 PDA.
Protocolo L: Columna: XBridge C-18, 150 x 4.6 mm, 3.5 pm; Fase móvil A: 5 mM solución de acetato de amonio acuosa; Fase móvil B: acetonitrilo; Gradiente: 10% B durante 3 minutos después 10% hasta 80% B durante 14 minutos; Velocidad de flujo. 0.7 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detección: DAD 215 nm; MS (+) rango 100-1500 daltons; Volumen de inyección: 3 µ?_; Instrumento: Waters 996 PDA.
Protocolo M: Columna: Phenomenex Luna, 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en metanol (v/v); Gradiente: 50% B durante 1.5 minutos, 50% hasta 80% B durante 8.5 minutos, después 80% B durante 10 minutos; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 90-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 µ?_; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo N: Columna: Phenomenex Luna C18 (2) 150 x 3.0 mm 5 pm; Fase móvil A: 0.02% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: 0.02% ácido trifluoroacético en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0% hasta 100% B durante 23.5 minutos; Velocidad de flujo: 1.5 mL/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm; Volumen de Inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC Protocolo O: Columna: Agilent Poroshell 300SB-C8, 75 x 2.1 mm, 2.6 pm; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 20% B hasta 45% B durante 4 minutos; Velocidad de flujo: 1.0 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detección: 220 nm; MS (+) rango 400-2000Da; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1100 LC, Waters MicromassZQ MS. Se realizó la deconvolución utilizando MaxEntl .
Protocolo P: Columna. TSK-gel G3000SWx1, 300 x 7.8 mm 10 µ?t?; Fase móvil: Solución salina amortiguadora de fosfato (PBS, 1X), pH 7.4 con 2% acetonitrilo; Isocrático; Velocidad de flujo: 1 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Volumen de Inyección: 5 pL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
Protocolo Q: Columna: Waters Acquity UPLC HSS T3, 2.1 mm x 50 mm, C18, 1.7 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 0.1 minuto, 5% hasta 95% B durante 2.5 minutos, 95% B durante 0.35 minuto; Velocidad de flujo: 1.25 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detección: 200-450nm; MS (+) rango 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 pl_; Instrumento: Waters Acquity.
Protocolo Q1 : Columna: Waters Acquity UPLC HSS T3, C18, 2.1 x 50 mm, 1.7pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 0.1 minuto, 5% hasta 95% B durante 1.5 minuto, 95% B durante 0.35 minuto; Velocidad de flujo: 1.25 mL/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: 200-450nm; MS (+) rango 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 pL; Instrumento: Waters Acquity.
Protocolo Q2: Columna: Xtimate C18, 2.1 x 30 mm, 3 µ??; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1 % en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 10% hasta 80% B durante 0.9 minutos, 80% B durante 0.6 minutos; 100 % B durante 0.5 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 mL/minuto. Detección: DAD 220 nM; Temperatura: 25°C; Volumen de inyección: 1 µ?_; Instrumento: Agilent.
Protocolo Q3: Columna: Xtimate C18, 2.1 x 30 mm, 3 µ??; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente 0% hasta 60% B durante 0.9 minutos, 60% B durante 0.6 minutos; 100% B durante 0.5 minutos; Velocidad de flujo: 1.2mL/minuto. Detección: DAD 220 nM; Temperatura: 25°C; Volumen de inyección: 1 µ?_; Instrumento: Agilent.
Protocolo R: Columna: Phenomenex Luna, 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en metanol (v/v); Gradiente: 5% B durante 1.5 minutos, 5% hasta 100% B durante 8.5 minutos, después 100% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: 45 C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección. 10 pL; Instrumento: 305 RP Agilent 1200 LCMS.
Protocolo S: Columna: Phenomenex Luna, 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 1.5 minutos, 5% hasta 95% B durante 8.5 minutos, después 100% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 1.0 mL/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: 305 RP Agilent 1100 HPLC.
Protocolo T: Columna: Atlantis dC18, 50 x 4.6 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.05% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.05% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% hasta 95% B durante 4.0 minutos; sostenida después a 95% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 2 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detección: DAD 215 nm; MS (+) rango 160 -1000 daltons; Volumen de inyección: 3 pL; Instrumento: Waters 996 PDA.
Protocolo U: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 1.5 minutos, 5% hasta 100% B durante 8.5 minutos, después 100% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 0.75 mUminuto. Temperatura: 45 °C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 pL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
Protocolo V: Columna: HPLC-V Ultímate XB- C18, 50 x 3.0 mm, 3 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.225% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.225% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 30% hasta 90% B durante 6 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 mUminuto. Temperatura: 40°C; Detección. DAD 220 nm; Volumen de inyección: 1 pL; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo W: Columna. HPLC-V Ultímate XB- C18, 50 x 3.0 mm, 3 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 10% hasta 80% B durante 6 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 mL/minuto. Temperatura: 40°C; Detección: DAD 220 nm; Volumen de inyección: 3 pL; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo X: Columna: YMC-pack ODS-A, 150 x 4.6 mm, 5 µ??; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 10% hasta 80% B durante 6 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 mIJminuto. Detección: DAD 220 nm. Temperatura: 40 °C; Volumen de inyección: 3 µ?_; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo Y: Columna: YMC-pack ODS-A, 150 x 4.6 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0% hasta 95% B durante 10 minutos, después 95% B durante 5 minutos; Velocidad de flujo: 1.5 mUminute; Detección: DAD 220 nm; Instrumento: Agilent 1100.
Protocolo Z: Columna: Xtimate C18, 2.1 x 30 m, 3 µ??; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0% hasta 60% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 1.2 ml/min. Temperatura: 50°C; Detección: 220 nm, MS (+) rango 100 -1000 daltons; Volumen de inyección: 1 µ?_; Instrumento: SHIMADZU.
Protocolo AB: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 2.0 mm, 5 µ?t?; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% hasta 100% B durante 10 minutos, después 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 0.5 mUminuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 µ?_; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
Protocolo BB: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 2.0 mm, 5 µ??; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 2.0 minutos, 5% hasta 100% B durante 12 minutos, y 100% B durante 2 minuto, después 100% hasta 5% B durante 1.5 min; Velocidad de flujo: 0.75 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 µ?_; Instrumento: Agilent.
Protocolo CB: Columna: Waters XBridge C18, 4.6 x 50 mm, 5pm; Fase móvil A: hidróxido de amonio al 0.03% en agua (v/v); Fase móvil B: hidróxido de amonio al 0.03% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% hasta 95% B durante 4.0 minutos, después 95% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 2 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detección: DAD 215 nm, MS (+) rango 160-1000 daltons; Volumen de inyección: 4 pL; Instrumento: Waters ZQ/Alliance 2795 HPLC.
Protocolo DB: Columna: Waters Atlantis dC18, 4.6 x 50 mm, 5pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.05% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.05% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5.0% hasta 95% B durante 4.0 minutos, después 95% B durante 1 minuto. Velocidad de flujo: 2 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detección: DAD 215 nm, MS (+) rango 160-1000 daltons; Volumen de inyección: 4 pL; Instrumento: Waters ZQ/Alliance 2795 HPLC.
Protocolo EB: Columna: XBridge RP18, 2.1 x 50 mm, 5 µ??; Fase móvil A: hidróxido de amonio al 0.02% en agua (v/v); Fase móvil B: hidróxido de amonio al 0.02% en acetonitrilo (v/v); Gradiente 10% hasta 80% B% durante 6 minutos, después 80% durante 2 minutos; Velocidad de flujo. 1.2 mL/minuto. Detección: DAD 220 nm.; Temperatura: 50°C.
Protocolo FB: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 2.0 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.1%» en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 2.0 minutos, 5% hasta 100% B durante 10 minutos, y 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 0.50 mUminuto. Temperatura: 25°C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 pl_; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
En ciertos casos, se hicieron ciertas alteraciones menores a las condiciones LC-MS y HPLC de análisis tal como aunque sin limitarse a un cambio en gradiente o velocidad de flujo lo cual está indicado por el símbolo *.
Condiciones HPLC Usadas para Purificación Método A: Columna: Phenomenex Lux Amylose-2, 250 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A; Heptano; Fase móvil B: Etanol (desnaturalizado); Gradiente: 5% hasta 100% B durante 6 minutos; Velocidad de Flujo: 27 mUminuto; Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Método B. Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.02% ácido acético en agua; Fase móvil B: 0.02% ácido acético en acetonitrilo; Gradiente: 5% B durante 1.5 minutos, 5% hasta 45% B durante 8.5 minutos; Velocidad de flujo: 27 mLJminuto; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Método C: Columna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 10 µ?t?; Fase móvil A: 0.02% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: 0.02% ácido trifluoroacético en metanol (v/v); Gradiente: 10% hasta 90% B durante 20 minutos; Velocidad de flujo: 20 mL/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; Volumen de Inyección: variable; Instrumento: Gilson.
Método D: Columna: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21.2 mm, 4 µ??; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua; Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo; Gradiente: 30% B durante 1.5 minutos, 30% hasta 60% B durante 8.5 minutos, 60 hasta 100% B durante 0.5 minutos después 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 27 mlJ minuto; Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Método E1 : Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 µ??; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua; Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en acetonitrilo; Gradiente: 40% B durante 1.5 minutos, 40% hasta 80% B durante 8.5 minutos, 80 hasta 100% B durante 0.5 minuto después 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 27 ml_/ minuto; Detección: Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Método E2: Columna: Phenomenex Luna Fenil-hexyl, 150 x 21.2 mm, 5 um. El resto de los Protocolos son idénticos a aquellos descritos para el Método E1.
Método F: Columna: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21.2 mm, 4 pm; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua; Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en metanol; Gradiente: 44% B durante 1.5 minutos, 44% hasta 77% B durante 8.5 minutos, después 77% B durante 10 minutos; Velocidad de flujo: 27 mL/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Método G: Columna: PrincetonSFC 2-etilpiridina, 250 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A: heptano; Fase móvil B: etanol (desnaturalizado); Gradiente: 1% B durante 1.5 minutos, 1% hasta 50% B durante 8.5 minutos; Velocidad de flujo: 27 mL/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 15025 2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Método H: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.02% ácido acético en agua; Fase móvil B: 0.02% ácido acético en acetonitrilo; Gradiente: 20% B durante 1.5 minutos, 20% hasta 60% B durante 10.5 minutos; Velocidad de flujo: 27 mL/ minuto; Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Método I: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1% ácido fórmico en agua; Fase móvil B: 0.1 % ácido fórmico en metanol; Gradiente: 40% B durante 1.5 minutos, 40% hasta 70% B durante 8.5 minutos después 70% B durante 10 minutos; Velocidad de flujo: 27 mL/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
Método J: Columna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 5 µ??; Fase móvil A: 0.02% ácido trifluoroacético en agua (v/v); Fase móvil B: 0.02% ácido trifluoroacético en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 10% hasta 90% B durante 20 minutos; Velocidad de flujo: 20 mlJminuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; Volumen de Inyección: variable; Instrumento: Gilson.
Método K: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 µ??; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua; Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo; Gradiente: 20% B durante 1.5 minutos, 20% hasta 50% B durante 8.5 minutos, 50 hasta 100% B durante 0.5 minuto después 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 27 U minuto; Detección: Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters Fraction Lynx LCMS.
Método L: Columna: Phenomenex Luna C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A: 0.1 % ácido fórmico en agua; Fase móvil B: 0.1% ácido fórmico en acetonitrilo; Gradiente: 30% B durante 1.5 minutos, 30% hasta 50% B durante 8.5 minutos, 50 hasta 100% B durante 0.5 minuto después 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 27 mU minuto; Detección: Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters Fraction Lynx LCMS.
Método M: Columna: Waters Sunfire, C18, 19x100 mm, 5 µ/?; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.05% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0.05% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0 hasta 100% durante 8.5 minutos. Velocidad de flujo 25 mL/minuto. Detección: DAD 215 nm MS (+) rango 160-1000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Método N: Columna: Waters Sunfire, C18, 19x100 mm, 5 µ??; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.05% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.05% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0 hasta 100% durante 8.5 minutos. Velocidad de flujo 25 mL/minuto. Detección: DAD 215 nm MS (+) rango 160-1000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Método O: Columna: Phenomenex Luna C18, 21.2 x150 mm, 5 pm; Fase móvil A: ácido fórmico al 0.1% en agua (v/v) ácido en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente (v/v); Gradiente 20% B durante 1.5 minutos, 20% hasta 40% B durante 8.5 minutos, 40 hasta 100% B durante 0.5 minutos, sostenido después 100% B durante 1.5 minutos. Velocidad de flujo: 27 mlJmínuto. Detección: DAD 210-360 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
Método P: Columna: Phenomenex Gemini C18, 21.2x250mm, 5 µ??; Fase móvil A: hidróxido de amonio 0.225% en agua (pH 10) (v/v); Fase móvil B: hidróxido de amonio al 0.225% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 45% hasta 85% B durante 10 minutos. Velocidad de flujo 35 mL/minuto. Detección: DAD 220 nm MS (+) rango 100-1200 daltons; Instrumento: Shimadzu MS Trigger.
Método Q: Columna: Columna: Phenomenex Synergi C18, 50x250 mm, 10 pm; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0.1 % en agua (v/v) Fase móvil B: acetonitrilo; Gradiente 10% hasta 40% B durante 25 minutos. Velocidad de flujo 100 mL/ minuto. Detección: UV/Vis 220 nm; Instrumento: Shimadzu LC-8A.
Método R: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 250 x 21.2 mm, 5 pm; Fase móvil A: TFA al 0.1 % en agua (v/v); Fase móvil B: 0.1 % TFA en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 10% hasta 100% durante 30 minutos; Velocidad de flujo variable. Temperatura: 25°C; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) rango 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 1.8 mL: Instrumento: Agilent 1100 Prep HPLC.
En ciertos casos se realizaron ciertas alteraciones menores a las condiciones de purificación tales como aunque sin limitarse a un cambio en gradiente o velocidad de flujo lo que está indicado por el símbolo *.
Procedimientos Generales Procedimiento General A: Remoción de Fmoc utilizando dietilamina. A una solución del compuesto que contiene Fmoc en diclorometano ?,?-dimetilformamida (referida también como DMF), se agregó un volumen igual de dietilamina o piperidina. Se monitoreó el avance de la reacción por medio de LC-MS (o HPLC o TLC). Los solventes fueron removidos in vacuo, y el residuo fue formado como azeotropo una a cuatro veces con heptano. El residuo fue diluido usualmente con diclorometano y una pequeña cantidad de metanol antes de ser reducido sobre sílice y purificado por medio de cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con metanol en diclorometano (u otra mezcla de solventes apropiada) para obtener el material deseado (o se utilizó el material crudo como está).
Procedimiento General B: Remoción de Boc o separación de éster t-Bu usando ácido trifiuoroacético. A una solución del compuesto que contiene Boc o compuesto que contiene éster de ter-butilo en diclorometano a 0°C (o a temperatura ambiente) se agregó ácido trifiuoroacético, para obtener una relación de 1 :4 ácido trifluoroacético:diclorometano. Se monitoreó el avance de la reacción mediante LC-MS (o HPLC o TLC); Los solventes fueron removidos in vacuo. El residuo fue formado como azeotropo tres veces con heptano para obtener el material deseado.
Procedimiento General C: Remoción de Boc o separación de éster de ter-butilo (también referido como un éster t-Bu) usando ácido clorhídrico en dioxano. A cualquiera de una solución de compuesto que contiene Boc o compuesto que contiene éster de ter-butilo en dioxano (o en ciertos casos sin solución, u otro solvente relevante) se agregó una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano. Se monitoreó el avance de la reacción por medio de LC-MS (o HPLC o TLC) La reacción fue concentrada in vacuo y en ciertos casos formada como azeotropo una a cuatro veces con heptanos.
Procedimiento General D: Acoplamiento con hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU). A una solución sometida a agitación de la amina (1 eq.) y ácido (1.0-2.0 eq.) en diclorometano, ?,?-dimetilformamida (también referida como DMF), o una mezcla de ambos, se agregó HATU (1.0-2.0 eq.) seguido por trietilamina (2.0- 4.0 eq.) o diisopropiletilamina (2.0-4.0 eq., también referida como base de Hunig). Se monitoreó el avance de la reacción por medio de LC-MS (o HPLC o TLC); usualmente la reacción se completó en un lapso de tres horas. Los solventes fueron removidos in vacuo. El residuo fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice o de fase inversa o, en ciertos casos, formado como azeotropo tres veces con heptanos, diluido con una pequeña cantidad de acetato de etilo antes de ser reducido sobre sílice o sílice enlazado C18 y purificado mediante cromatografía en gel de sílice o de fase inversa.
Procedimiento General E: Acoplamiento con N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP). A una mezcla de la amina de carga útil (1 eq.) y N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP, Eur. Pat. Appl. (1994), EP624377, 1.0-2.0 eq.) en ?,?-dimetilformamida o se agregó dimetilacetamida (referida también como DMA), piridina (0.0-4.0 eq.), diisopropiletilamina (0.0-4.0 eq.), 2,6-dimetilpiridina (0.0-4.0 eq., referida también como 2,6-Luditina) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (0.01-1.1 eq. referido también como HOBT) o 3H-[1 ,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-ol (0.01-1.1 eq., referido también como HOAT). Después de someter a agitación a 40°C- 50°C durante 1-48 horas, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo y formada como azeotropo tres veces con heptano. El material crudo fue purificado mediante cromatografía de fase inversa de acuerdo con el método especificado para obtener el material deseado.
Procedimiento General F: Conjugación del anticuerpo HERCEPTIN comercial con enlazador-carga útil a través de disulfuros internos. El anticuerpo HERCEPTIN® comercialmente disponible (Genentech Inc) fue dializado en Solución Salina Regulada con Fosfato de Dulbecco (DPBS, Lonza). El anticuerpo dializado fue reducido con la adición de x equivalentes de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 5mM en agua destilada) y diluido hasta una concentración de anticuerpo final de 15 mg/mL usando DPBS, 5mM ácido 2,2,,2",2,,,-(Etan-1 ,2-diildinitril)tetraacético (EDTA), pH 7.0-7.4 (Solución Amortiguadora A). La reacción fue incubada a 37°C durante 1-2 h y después enfriada a temperatura ambiente. La conjugación se realizó mediante la adición de equivalentes y de enlazador-carga útil (5-1 OmM en dimetilacetamida (DMA)). Se agregó DMA para lograr 10-20% (v/v) componente de solvente orgánico en la mezcla de reacción final, y se agregó Solución Amortiguadora A para lograr una concentración de anticuerpo final de 10 mg/mL. La reacción fue incubada durante 1-2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se intercambió después con regulador de pH en DPBS (pH7.4) usando columnas de intercambio de regulador de pH de GE Healthcare Sephadex G-25 M según las instrucciones del fabricante. El material crudo fue purificado mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC) utilizando el sistema GE AKTA Explorer con columna GE Superdex y eluyente PBS (pH7.4).
Procedimiento general G: Las reacciones de conjugación se ejecutaron en la Proción superior de un dispositivo de ultrafiltración centrífuga tal como filtros Amicon Ultra 50k Ultracel (parte #UFC805096, GE). Se preparó una solución concentrada 132 mM de L-cisteina en PBS que contiene 50 mM EDTA. Esta solución (50 pL) fue agregada a una mezcla del anticuerpo mutante respectivo (5 mg) en 950 pL de PBS que contiene 50 mM EDTA. La concentración final de cisteina en la mezcla de reacción fue de 6.6 mM. Después de permitir que la reacción repose a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) durante 1.5 horas el tubo de reacción fue centrifugado para concentrar el material hasta aproximadamente 100 pL. La mezcla fue diluida hasta 1 mL con PBS que contiene 50 mM EDTA. Este proceso se repitió 4 veces a fin de remover el reductor de cisteina. El material resultante fue diluido hasta 1 mL en PBS que contiene 50 mM EDTA y tratado con 16 pL de una solución 5 mM del ligador maleimida-carga útil (a partir del Cuadro 18Aen dimetil acetamida (DMA) (aproximadamente 5 equivalentes). Después de dejar reposar la reacción a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) durante 1.5 horas el tubo de reacción fue centrifugado para concentrar el material hasta aproximadamente 100 pL. La mezcla fue diluida hasta 1 mL con PBS. Este proceso se repitió 2 veces a fin de remover el reactivo de maleimida en exceso. Los conjugados de anticuerpo generalmente fueron purificados por medio de cromatografía de exclusión molecular (SEC) utilizando el sistema GE AKTA Explorer con una columna GE Superdex200 y eluyente PBS (pH7.4). La carga del fármaco sobre el sitio pretendido de conjugación se determinó utilizando una variedad de métodos que incluyen espectrometría de masa (MS), HPLC de fase inversa, y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), como se ha descrito en otra parte. El valor reportado (en Cuadros 19A y 19B) se obtiene de modo general mediante LC-MS bajo condiciones de reducción.
Procedimiento general H: Una solución 20 mM TCEP (generalmente 50 hasta 100 equivalentes molares) fue agregada al anticuerpo (de modo común 5 mg) de manera que la concentración de anticuerpo final fue de 5 mg/mL en PBS que contiene 50 mM EDTA. Después de permitir que la reacción repose a 37°C durante 1.5 horas, el anticuerpo fue intercambiado con solución reguladora en PBS que contiene 50 mM EDTA usando un dispositivo de concentración por giro de recorte 50 kD MW (3 x 3 mL lavado, 10x concentración por ciclo). Los métodos alternativos tales como TFF o diálisis también son útiles en circunstancias particulares. El anticuerpo resultante fue suspendido de nuevo en 1 mL de PBS que contiene 50 mM EDTA y tratado con una solución recién preparada 50 mM de DHA (deshidroascorbato) en 1 :1 PBS/EtOH (concentración DHA final comúnmente es de 1 mM) y se permite reposar a 4°C durante la noche. La mezcla anticuerpo/DHA fue intercambiada con solución reguladora en PBS que contiene 50 mM EDTA usando un dispositivo de concentración por giro de recorte 50 kD MW (3 x 3 mL lavado, 10x concentración por ciclo). El anticuerpo resultante fue suspendido de nuevo en 1 mL de PBS que contiene 50 mM EDTA y tratado con 10 mM ligador maleimida-carga útil en DMA (de modo común 5-10 equivalentes). Después de reposo durante 1.5 horas, el material fue intercambiado con solución reguladora (como se hizo antes) en 1 mL de PBS (3 x 3 mL lavados, 10x concentración por ciclo). La purificación por medio de SEC (como se describió de manera previa) se realizó según fue necesario para remover cualquier material agregado.
Procedimiento general I: La conjugación inicial del ligador-carga útil se realizó utilizando el método antes descrito (Procedimiento General F). El conjugado anticuerpo-fármaco resultante fue intercambiado con solución reguladora en un regulador de borato 50 mM (pH 9.2) usando un dispositivo de ultrafiltración (50 kd MW recorte). La solución resultante fue calentada hasta 37°C durante 24 horas (para ligadores maleimida-Peg) o hasta 45°C durante 48 horas (para ligadores maleimida-caproilo). La solución resultante fue enfriada, intercambiada con solución reguladora en PBS, y purificada mediante SEC (como se describió de manera previa) a fin de remover cualquier material agregado. El análisis LCMS del material indicó que el anillo succinimida había abierto por completo (90% o más). Obsérvese que en los ejemplos donde está presente un éster de metilo en la carga útil, el éster es hidrolizado para el ácido carboxílico bajo las condiciones descritas.
Procedimiento general J: Los ésteres de pentafluorofenilo fueron conjugados para el anticuerpo mostrado siguiendo el procedimiento detallado de modo previo en WO2012007896 A1.
Procedimiento general K: La conjugación de los ligadores amino- alquilo se logró a través de ligadura mediada por enzima como se describe en WO2012059882 A2.
Procedimiento general L. N-[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbonil]-2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidm-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (preparada de la misma manera que en #136) fue acoplada a la porción aminoácido o amina relevante usando HATU (1.0-2.0 eq.) en presencia de base de Hunig (1.-5.0 eq.) en una solución de DMF, diclorometano, o en ciertos casos una solución de ambos (o una solución de uno o más solventes). La reacción fue monitoreada a través de LC-MS (o TLC o HPLC). La reacción fue concentrada in vacuo y purificada usualmente mediante cromatografía en gel de sílice o mediante HPLC preparatoria. La protección Fmoc fue removida después como se describió en el procedimiento general A seguida por la concentración in vacuo y purificada mediante cromatografía en gel de sílice o mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general M. #151 fue acoplado a la amina relevante usando HATU (1.0-2.0 eq., u otro reactive de acoplamiento apropiado) en presencia de base de Hunig (1.0-5.0 eq.) en una solución de DMF, diclorometano, o en ciertos casos una solución de ambos (o una solución de uno o más solventes). La reacción fue monitoreada a través de LC-MS (o TLC o HPLC). La reacción fue concentrada in vacuo. Se realizó después la desprotección Boc como se describió en el procedimiento general B, concentrada in vacuo y purificada mediante cromatografía en gel de sílice o mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general N. ácido 1 -(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16,19,22-heptaoxa-4-azapentacosan-25-oico (u otro Fmoc-AmPegXC2-COOH apropiado) fue acoplado al pentapéptido citotóxico relevante (o el pentapéptido citotóxico que contiene un grupo protector en una porción reactiva diferente al extremo-N) usando HATU (1.0-2.0 eq., u otro reactivo de acoplamiento apropiado) en presencia de base de Hunig (1 .0-5.0 eq. U otra base apropiada) en una solución de DMF, diclorometano, o en ciertos casos una solución de ambos (o una solución de uno o más solventes). La reacción fue monitoreada a través de LC-MS (o TLC o HPLC). La reacción fue concentrada in vacuo. La desprotección Fmoc se realizó de acuerdo con el procedimiento general A. En ciertos casos se efectuó una segunda desprotección a fin de remover un grupo protector en una porción reactiva en el pentapéptido citotóxico usando el procedimiento general B (u otro procedimiento relevante conocido en la literatura en base al grupo protector). La reacción fue concentrada in vacuo y purificada mediante cromatografía en gel de sílice o mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general O. El Fmoc-AmPegXC2-COOH apropiado es acoplado al pentapéptido citotóxico relevante (o el pentapéptido citotóxico que contiene un grupo protector en una porción reactiva distinta al extremo-N) y la desprotección Fmoc se realizó de acuerdo con el procedimiento general N. La reacción es concentrada in vacuo y después purificada mediante cromatografía en gel de sílice o HPLC preparatoria (o el material crudo puede ser usado como está). La secuencia PABC apropiada (tal como mcValCitPABC, o derivativo de) es instalada después según el procedimiento general E. En ciertos casos si un grupo protector está presente en la porción de pentapéptido citotóxico de la molécula se efectúa entonces la desprotección utilizando el procedimiento general A o el procedimiento general B (u otro procedimiento relevante conocido en la literatura en base al grupo protector). La reacción es concentrada in vacuo y purificada mediante cromatografía en gel de sílice o mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general P. Siguiendo el procedimiento E remplazando mcValCitPABC-PNP, con MalPeg3C2ValCitPABC-PNP (preparado de una manera similar a mcValCitPABC-PNP).
Procedimiento general Q. El Fmoc-AmPegXC2-COOH apropiado es acoplado al pentapéptido citotóxico relevante (o el pentapéptido citotóxico que contiene un grupo protector en una porción reactiva distinta al extremo-N) y se efectuó la desprotección Fmoc como se describió en el procedimiento general N. La reacción es concentrada in vacuo y después purificada mediante cromatografía en gel de sílice o mediante HPLC preparatoria (o el material crudo puede utilizarse como está). A una solución sometida a agitación de este residuo en DMF a 0°C (o una temperatura ligeramente mayor en ciertos casos) se agregó ácido bromoacético (1.0-2.0 eq.) seguido por base de Hunig (1.0-5.0 eq.) y HATU (1.0-2.0 eq.). Se permitió el calentamiento de la reacción hasta temperatura ambiente y se sometió a agitación a temperatura ambiente en tanto que se monitoreó a través de LC-MS (o TLC o HPLC). La reacción fue concentrada in vacuo y purificada mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general R. Siguiendo el procedimiento E remplazando mcValCitPABC-PNP, con N-(6-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}hexanoil)-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornithinamida (preparada de una manera similar a mcValCitPABC-PNP). Se realizó después la desprotección Fmoc (procedimiento general B) seguida por purificación con HPLC preparatoria.
Procedimiento general S. A una solución sometida a agitación 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanal (1.0-3.0 eq.) en metanol se agregó el pentapéptido citotóxico relevante (1.0 eq) seguido por ácido fórmico. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 -40 minutos seguida por la adición de (ciano-kappa C)(trihidro)borato sódico (1 -)(3.0-6.0 eq., referido también como cianoborohidruro sódico). La reacción fue monitoreada a través de LC-MS (o TLC o HPLC). En ciertos casos se agregó 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanal adicional (1.0-3.0 eq.). La reacción fue concentrada in vacuo seguida por purificación utilizando HPLC preparatoria.
Procedimiento general T. Se preparó 4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1 -il)propil]anilinio como se describe en la literatura (Bioorganic y Medicinal by the addition of Chemistry Letters. 2012, vol. 22, #13, 4249- 4253) el cual es acoplado después a bis(pentafluorofenil)3,3'-[etan-1 ,2-diilbis(oxi)]dipropanoato usando HATU en diclorometano seguido por acoplamiento al pentapéptido citotóxico deseado. El material es purificado después mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general U. Fmoc-ValCitPABC-PNP es acoplado al pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E y después se remueve Fmoc siguiendo el procedimiento general A. Este residuo es acoplado después a ácido [2-oxo-2-({4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1- il)propil]fenil}amino)etoxi]acético (el cual es preparado mediante acoplamiento de 4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1-il)propil]anilinio con 1 ,4-dioxan-2,6-diona siguiendo el procedimiento general D). El material es purificado después mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general V. Se acopla Bis(pentafluorofenil)3,3'-[etan-1 ,2-diilbis(oxi)]dipropanoato o bis(pentafluorofenil) 4,7,10,13,16-pentaoxanonadecan-1 ,19-dioato es acoplado al pentapéptido citotóxico deseado (o en ciertos casos acoplado al pentapéptido citotóxico deseado que contiene un grupo protector en una porción reactiva distinta al extremo-N) siguiendo el procedimiento general D. Si un grupo protector está presente, el grupo protector es removido después (usando los procedimientos relevantes descritos en la literatura). El material es purificado después mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general W. 4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil 1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oato es acoplado al pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E. Fmoc es removido siguiendo el procedimiento general A. Bis(pentafluorofenil)3,3'-[etan-1 ,2-diilbis(oxi)]dipropanoato es acoplado a este residuo siguiendo el procedimiento general D. El material es purificado después mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general X1. N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-alanil-L-alanil-N~1~-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-N r¡til-L-aspartamida es acoplada al pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E. Fmoc es removido siguiendo el procedimiento general A y el grupo protector tritilo es removido siguiendo el procedimiento general B. Bis(pentafluorofenil) 3,3'-[etan-1 ,2-diilbis(oxi)]dipropanoato es acoplado a este residuo siguiendo el procedimiento general D. El material es purificado mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general X2. N-{3-[2-(3-etoxi-3-oxopropoxi)etoxi]propanoil}-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornithinamida es acoplada al pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E. El éster etílico es removido usando hidróxido de litio en THF y agua. Se forma entonces éster NHS mediante acoplamiento del residuo con 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona usando ?,?'-diciclohexilcarbodiimida en THF. El material es purificado mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general X3. N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-D-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-carboxipropan-2-il)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornithinamida es acoplada a #50 siguiendo el procedimiento general D en DMSO y acetonitrilo. Fmoc es removido siguiendo el procedimiento general A seguido por el acoplamiento con bis(pentafluorofenil)3,3'-[etan-1 ,2-diilbis(oxi)]dipropanoato usando base de Hunig en acetonitrilo. El material es purificado mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general X4. N-[1-(9H-fluoren-9-il)-3,5, 12-trioxo-2,7, 10-trioxa-4-azadodecan-12-il]-2-metilalanina es acoplado a #250 siguiendo el procedimiento general D en acetonitrilo. Fmoc es removido siguiendo el procedimiento general A seguido por el acoplamiento con bis(pentafluorofenil)3,3'-[etan-1 ,2-diilbis(oxi)]dipropanoato usando base de Hunig en acetonitrilo. El material es purificado mediante HPLC preparatoria.
Procedimiento general X5. L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida es acoplada a N~2~-acetil-N~6~-(ter-butoxicarbonil)-L-lisina siguiendo el procedimiento general D. Este residuo resultante es acoplado con bis(4-nitrofenil)carbonato con base de Hunig en DMF, seguido por el acoplamiento con el pentapéptido citotóxico deseado siguiendo el procedimiento general E. Se ejecuta después la desprotección Boc siguiendo el procedimiento general B en acetonitrilo. El residuo es purificado mediante HPLC preparatoria.
En ciertos casos se efectuaron alteraciones menores a las condiciones de reacción tales como aunque sin limitarse al orden de adición del reactivo y reactante y/o la cantidad de reactivo o reactante lo que está indicado por el símbolo *. Además, estos procedimientos generales se proporcionan solamente como ilustrativos y no son limitantes.
Además de los Procedimientos Generales proporcionados con anterioridad, las referencias a dolastatina y auristatina relevantes incluyen las siguientes: Petit et al. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111 , 5463; Petit et al. Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243 y las referencias citadas en ellas; Petit et al. J. Nat. Prod. 2011 , 74, 962; WO 96/33212; WO 95/09864; EP 0695758; WO 07/8848; WO 01/18032; WO 09/48967; WO 09/48967; WO 09/117531; WO 08/8603; US 7,750,116; US 5,985,837; y US 2005/9751; todas las cuales están incorporadas a la presente mediante referencia en su totalidad.
Análisis MS y Preparación de Muestra Las muestras fueron preparadas para análisis LC-MS mediante la combinación de aproximadamente 20 pL de muestra (aproximadamente 1 mg/mL de ADC en PBS) con 20 pL de 20 mM ditiotreitol (DTT). Después de permitir que la mezcla se mantenga a temperatura ambiente durante 5 minutos, las muestras fueron analizadas de acuerdo con el protocolo O.
Se efectuó el siguiente cálculo a fin de establecer la carga total (DAR) del conjugado: Carga = 2*[LC1/(LC1+LC0)]+2*[HC1/(HC0+HC1+HC2+HC3)]+ 4*[HC2/(HC0+HC1+HC2+HC3)]+6*[HC3/(HC0+HC1+HC2+HC3)] Cuando las variables indicadas son la abundancia relativa de: LC0 = cadena ligera descargada, LC1 = cadena ligera cargada individual, HC0 = cadena pesada descargada, HC1 = cadena pesada cargada individual, HC2 = cadena pesada cargada doble, y HC3 = cadena pesada cargada triple.
Las condiciones LC-MS utilizadas son las Condiciones F para el tiempo de retención por debajo de un minuto y las Condiciones H para los experimentos restantes a menos de que se indique lo contrario.
Preparación de N-f(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonill-N-Metil-L-valil-N-f(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-iH-N-metil-L-valinamida í#8) ácido dimero Etapa 1. Síntesis de bencil [(2S,3S)-1-hidroxi-3-metilpentan-2-iljmetilcarbamato (#1 ). A una solución de N-[(benciloxi)carbonil]-N-metil-L-isoleucina (52.37 g, 187.5 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (524 mL, 0.35 M) se agregó complejo de borano-tetrahidrofurano (1 M en tetrahidrofurano, 375 mL, 375 mmol, 2 eq.) lentamente durante 1 hora y se permitió la agitación de la reacción durante 18 horas a temperatura ambiente. La reacción fue enfriada hasta 0°C y se agregó agua (30 mL) durante 30 minutos. La mezcla de reacción fue diluida con solución de carbonato de sodio acuosa 1 M (100 mL) y ter-butil metil éter (250 mL). La capa acuosa fue re-extraída con ter-butil metil éter (100 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con solución de carbonato de sodio acuosa 1 M(100 mL), lavadas con salmuera (200 mL), secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas, y concentradas in vacuo a fin de proporcionar #1 (48.44 g, 97% rendimiento) como un aceite de color amarillo pálido, el cual fue usado en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 7.26-7.41 (m, 5H), [5.06 (AB cuarteto, JAB= 2.9 Hz, ????=22.8 Hz) y 5.06 (AB cuarteto, JAB=9.0 Hz, ????=9.0 Hz), total 2H], [4.65 (t, J=5.3 Hz) y 4.59 (t, J=5.4 Hz), total 1 H], 3.67-3.80 (m, 1 H), 3.51 -3.60 (m, 1 H), 3.41-3.51 (m, 1 H), 2.75 y 2.71 (2 s, total 3H), 1.49-1.64 (br m, 1 H), 1.24-1.37 (br m, 1 H), 0.90-1.02 (br m, 1 H), 0.74-0.87 (m, 6H).
Etapa 2. Síntesis de bencil metil[(2S,3S)-3-metil-1 -oxopentan-2-iljcarbamato (#2). A una solución de #1 (8.27 g, 31.2 mmol, 1 eq.) en dimetil sulfóxido (41.35 mL, 0.75 M), se agregó trietilamina (8.70 mL, 64.0 mmol, 2.05 eq.) y la mezcla fue enfriada hasta 0°C. El complejo de trióxido de azufre piridina (10.18 g, 63.96 mmol, 2.05 eq.) fue agregado después en porciones, en tanto que se mantiene la temperatura interna por debajo de los 8°C. Se permitió que la reacción alcanzara la temperatura ambiente y fue sometida a agitación durante 18 horas. La reacción fue vertida en agua (100 mL) y ter-butil metil éter (100 mL). La capa acuosa fue re-extraída con ter-butil metil éter (50 mL) y las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con salmuera (100 mL), secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas, concentradas in vacuo y purificadas mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 10% hasta 60% acetato de etilo en heptano) a fin de proporcionar #2 (7.14 g, 87%) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 9.61 (s, 1 H), 7.26-7.42 (m, 5H), 5.01-5.13 (m, 2H), 4.04-4.12 (m, 1 H), 2.86 y 2.82 (2 s, total 3H), 1.94-2.11 (br m, 1 H), 1.26-1.42 (br m, 1 H).
Etapa 3. Síntesis de ter-butil (3R,4S,5S)-4-{[(benciloxi)carbonil(metil)amino}-3-hidroxi-5-metilheptanoato (#3). Se preparó diisopropilamina de litio mediante la adición de n-butil-litio (2.5 M solución en tetrahidrofurano, 35.9 mL, 89.8 mmol, 1.4 eq.) a una solución de diisopropilamina (13.8 mL, 96.3 mmol, 1.5 eq.) en tetrahidrofurano (50 mL, 1.3 M) a -78°C. Después de 1 hora, se agregó ter-butil acetato (15.7 mL, 116 mmol, 1.8 eq.) mediante goteo y la mezcla de reacción fue sometida a agitación durante 1.5 horas adicionales en tanto que se permite calentar lentamente hasta -20°C. La mezcla de reacción fue enfriada de nuevo hasta -78°C y se agregó una solución de aldehido #2 (16.9 g, 64.2 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (10 mL). La mezcla de reacción fue sometida a agitación durante 1.5 horas y después apagada mediante la adición de agua (100 mL). Después de la extracción con éter dietílico (2 x 100 mL), las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de sodio, filtradas, concentradas in vacuo y purificadas mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 20% acetona en heptano) a fin de proporcionar #3 (8.4 g, 34%) como un aceite incoloro. LC-MS: m/z 402.4 [M+Na+], tiempo de retención = 3.91 minutos; ?? RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 7.27-7.39 (m, 5H), 5.01-5.12 (m, 2H), [4.93 (d, J=7.2 Hz) y 4.98 (br d, J=7.2 Hz), total 1 H], 4.03-4.15 (br m, 1 H), 3.68-3.85 (br m, 1 H), 2.65 y 2.72 (2 br s, total 3H), 2.28-2.37 (m, 1 H), 2.09-2.17 (m, 1 H), 1.74-1.90 (br m, 1 H), 1.41-1.51 (m, 1 H), 1.39 (s, 9H), 0.92-1.01 (m, 1 H), 0.77-0.92 (m, 6H).
Etapa 4. Síntesis de ter-butil (3R,4S,5S)-4-{[(benciloxi)carbonil(metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoato (#@2). A una solución de #3 (8.4 g, 22 mmol, 1 eq.) en 1 ,2-dicloroetano (25 mL, 0.88 M) se agregaron tamices moleculares (4Á, 0.7 g) y esponja de protón (1 ,8-bis(dimetilamino)naffaleno) (13.4 g, 59.2 mmol, 2.7 eq.), seguidos por trimetiloxonio tetrafluoroborato (9.10 g, 61.6 mmol, 2.8 eq.). Después de someter a agitación durante la noche, la mezcla de reacción fue filtrada a través de Celite. El filtrado fue concentrado in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 40% 1 :1 acetona.acetato de etilo en heptano) para dar #@2 (8.7 g, 68%) como un aceite incoloro. H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 7.28-7.40 (m, 5H), 5.01-5.13 (m, 2H), 3.89-4.08 (br m, 1 H), 3.70-3.82 (m, 1H), 3.18 y 3.26 (2 s, total 3H), 2.66 y 2.71 (2 br s, total 3H), 2.44-2.53 (m, 1 H, asumido; parcialmente oscurecido por pico de solvente), 2.17-2.24 (m, 1 H), 1.71-1.86 (br m, 1 H), 1.39 y 1.39 (2 s, total 9H), 1.31-1.40 (m, 1 H), 0.94-1.08 (m, 1 H), 0.76-0.91 (m, 6H).
Etapa 5. Síntesis de ter-butil (3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4- (metilamino)heptanoato, sal de clorhidrato (#4). A una solución de #@2 (13.37 g, 33.98 mmol, 1 eq.) en metanol (134 mL, 0.1 M) y ácido clorhídrico concentrado (3.1 mL, 37.4 mmol, 1.1 eq.) se agregó 10% paladio sobre carbono (50% humedad) (0.1 % en peso; 1.34 g, 3.40 mmol). La mezcla fue hidrogenada a 45 psi durante 3 horas, purgada después con nitrógeno, filtrada a través de Celite y concentrada in vacuo a fin de proporcionar #4 (9.20 g, 92%) como un sólido de color blanco. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 9.65 (br s, 1 H), 8.97 (br s, 1 H), 3.98-4.04 (m, 1 H), 3.40 (s, 3H), 3.06-3.13 (br m, 1 H), 2.82 (br dd, J=6, 5 Hz, 3H), 2.74-2.80 (m, 1 H), 2.68 (dd, mitad del patrón ABX, J=16.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.00- 2.10 (br m, 1 H), 1.73-1.84 (m, 1 H), 1.46 (s, 9H), 1.38-1.45 (m, 1 H), 1.13 (d, J=7.0 Hz, 3H), 0.99 (t, J=7.4 Hz, 3H).
Etapa 6. Síntesis de ter-butil (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoato (#5). A una mezcla de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valina (18.53 g, 54.60 mmol, 1.3 eq.) y 2-cloro-4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazina (CDMT) (9.58 g, 54.6 mmol, 1.3 eq.) en 2-metiltetrahidrofurano (118.00 mL, 0.34 M) se agregó N-metilmorfolina (6.52 mL, 59.1 mmol, 1.5 eq.) seguida por #4 (11.80 g, 39.9 mmol, 1 eq.). Después de 3 horas, la reacción fue apagada con agua (50 mL) y sometida a agitación durante 15 minutos. La capa acuosa fue separada y re-extraída con 2-metiltetrahidrofurano (50 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada (50 mL), secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas, y concentradas in vacuo para dar un aceite incoloro, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 5% hasta 40% acetato de etilo en heptano) para dar #5 (26.2 g, 91 %) como una espuma incolora. LC-MS (Protocolo I) m/z 581.3 [M+H+]1 604.3 [M+Na+], tiempo de retención = 4.993 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), posiblemente una mezcla de rotámeros, señales principales características: d 7.88 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.71 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.62 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 7.41 (dd, J=7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.27-7.34 (m, 2H), 4.134.32 (m, 4H), 3.70-3.82 (br m, 1 H), 3.24 (s, 3H), 2.92 (br s, 3H), 2.54 (dd, J=15.7, 2.4 Hz, 1 H), 2.17 (dd, J=15.4, 9.4 Hz, 1 H), 1.95-2.07 (m, 1 H), 1.70-1.83 (br m, 1 H), 1.40 (s, 9H), 0.83-0.94 (m, 9H), 0.69 (t, J=7.2 Hz, 3H).
Etapa 7A. Síntesis de ter-butil (3R,45,5S)-3-metoxi-5-metil-4- [metil(L-valil)amino]heptanoato (#6). A una solución de #5 (26 g, 42 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (260 mL, 0.16 M) se agregó dietilamina (22 mL) durante 30 minutos. La reacción fue sometida a agitación durante aproximadamente 6 horas y la suspensión fue filtrada después a través de Celite y lavada con tetrahidrofurano adicional (25 mL). El filtrado fue concentrado in vacuo a fin de proporcionar un aceite de color amarillo pálido, 4el cual fue re disuelto en 2-metiltetrahidrofurano (50 mL) y concentrado de nuevo para asegurar la remoción completa de dietilamina. El aceite crudo de #6 (> 15.25 g) fue llevado a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 7B. Síntesis de ácido (3R,4S,5S)-4-[{N-R9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-L-valyl}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanóico (#@5). De acuerdo con el procedimiento general B, a partir de #5 (1.62 g, 2.79 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0.3 M) y ácido trifluoroacético (3 mL) se sintetizó #@5 (1.42 g, 97%) como un sólido que fue utilizado sin purificación adicional sin purificación adicional. LC-MS m/z 525.3 [M+H+] 547.3 [M+Na+] tiempo de retención = 0.95 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), señales características: d 7.89 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.71 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.59 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.41 (dd, J=7.6, 7.4 Hz, 2H), 7.28-7.34 (m, 2H), 4.14-4.32 (m, 4H), 3.24 (s, 3H), 2.92 (br s, 3H), 2.51-2.57 (m, 1 H, asumido; parcialmente oscurecido por solvente pico), 2.20 (dd, J =15.9, 9.5 Hz, 1 H), 1.95-2.06 (m, 1 H), 1.70-1.83 (br m, 1 H), 1.221.36 (br m, 1 H), 0.84-0.93 (m, 9H), 0.70 (t, J=7.3 Hz, 3H).
Etapa 8. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -ter-butoxi-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#7). A una mezcla de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-metil-L-valina (19.54 g, 55.29 mmol, 1.3 eq.) y #6 (15.25 g, 42.54 mmol, 1 eq.) en 2-metiltetrahidrofurano (152 mL, 0.28 M) se agregó 2-cloro-4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazina (CDMT) (9.71 g, 55.3 mmol, 1.3 eq.). Después de 10 minutos, se agregó lentamente N-metilmorfolina (6.6 mL, 60 mmol, 1.4 eq.), en tanto que se mantuvo la temperatura interna por debajo de 25 °C. La reacción fue sometida a agitación durante 4 horas y fue extinguida después mediante la adición de agua (50 mL). Después de someter a agitación durante 15 minutos, la capa acuosa fue separada y re-extraída con 2-metiltetrahidrofurano (50 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada (100 mL), después fueron secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas, y concentradas in vacuo. La espuma de color amarillo resultante fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 5% hasta 35% acetato de etilo en heptano) para dar #7 (32 g, 97%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.41 (br dd, J=7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.29-7.34 (m, 2H), 4.52-4.69 (br m, 1 H), 3.70-3.82 (br m, 1 H), 3.22 y 3.25 (2 br s, total 3H), 2.94 y 2.96 (2 br s, total 3H), 2.78 y 2.81 (2 br s, total 3H), 2.11-2.23 (m, 1 H), 1 .90-2.10 (m, 2H), 1.68-1.83 (br m, 1 H), 1.40 (s, 9H), 1.21-1.33 (br m, 1 H).
Etapa 9. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-N-metil-L-valil-N-[(2R,3S,4S)-1 -carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#8). A #7 (32 g, 46 mmol, 1 eq.) en diclorometano (160 ml_, 0.29 M) se agregó mediante goteo durante 10 minutos ácido trifluoroacético (17.4 ml_, 231 mmol, 5 eq.). Después de 6 horas, se agregó la misma cantidad de ácido trifluoroacético y se continuó la reacción durante 18 horas. La mezcla de reacción fue diluida con tolueno (320 mL) y concentrada in vacuo a fin de proporcionar #8 (35.8 g, 97%) como un aceite de color rosáceo, el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.90 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.41 (br dd, J=7.4, 7.0 Hz, 2H), 7.29-7.35 (m, 2H), 4.54-4.68 (br m, 1 H), [4.09 (d, J=11 Hz) y 4.22 (d, J=10.9 Hz), total 1 H], 3.74-3.84 (br m, 1 H), 3.22 y 3.24 (2 br s, total 3H), 2.94 y 2.96 br s, total 3H), 2.78 y 2.80 (2 br s, total 3H), 2.13-2.24 (m, 1 H), 1.89-2.10 (br m, 2H), 1.70-1.81 (br m, 1 H).
Preparación de ácido (2R,3R)-3-í(2S)-1-(ter- Butoxicarbonil)pirrolidin-2-ill-3-metoxi-2-metilpropanóico (#11 ; "ácido Boc-Dap- Etapa 1. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R,2S)-1-hidroxi-2-metilbut-3-en-1-il]pirrolidin-1-carboxilato (#9). A una solución de ter-butil (2S)-2-formilpirrolidin-1-carboxilato (10 g, 50 mmol, 1 eq.) en diclorometano (120 mL, 0.42 M) se agregó potasio (2Z)-2-buten-1-iltrifluoroborato (9.76 g, 60.2 mmol, 1.2 eq.) seguido por bromuro de tetra-n-butilamonio (3.24 g, 5.02 mmol, 0.1 eq.) y agua (60 mL). Después de 13 horas, la reacción fue diluida con diclorometano (150 mL) y agua (150 mL). La capa acuosa fue separada y re-extraída con diclorometano (100 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con solución de cloruro de sodio acuosa (5 % en peso, 200 mL), lavadas con agua (200 mL), y concentradas in vacuo para obtener #9 (-13 g) como un aceite de color anaranjado, el cual fue utilizado sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 5.61-5.86 (br m, 1 H), 4.97-5.09 (m, 2H), 3.80-3.98 (br m, 2H), 3.45-3.67 (br m, 1 H), 3.21-3.29 (m, 1 H), 2.14-2.26 (m, 1 H), 1.80-2.04 (m, 3H), 1 .65-1.76 (m, 1 H), 1.47 (s, 9H), 1.12 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 2. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R, 2S)-1-metoxi-2-metilbut-3-en-1-il]pirrolidin-1-carboxilato (#10). Se combinó hidruro de sodio (60% en aceite mineral, 3.38 g, 84.4 mmol, 1.1 eq.) con hexano (40 mL), y la mezcla fue sometida a agitación mecánica rápida durante 5 minutos. Se permitió la sedimentación de los sólidos y se removió el hexano. Este procedimiento se repitió dos veces para remover el aceite mineral. Se agregó N,N-Dimetilformamida (59 mL, 1.3 M) y la mezcla fue enfriada hasta 0°C; se agregó después yoduro de metilo (5 mL; 81 mmol, 1.05 eq.) mediante goteo, seguido por la adición a través de goteo de una solución de #9 (19.6 g, 76.8 mmol, 1 eq.) en N,N-dimetilformamida (59 mL) durante 5 minutos, en tanto que se mantiene la temperatura entre 0°C y 5°C. La reacción fue sometida a agitación a 0°C durante 2 horas. La reacción fue apagada con solución de cloruro de amonio acuosa saturada (150 mL), vertida en solución de cloruro de sodio acuosa (5% en peso, 300 mL), y la mezcla fue extraída con acetato de etilo (3 x 50 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con 10% solución de cloruro de sodio acuosa (2 x 300 mL), ladas con agua (200 mL), y concentradas in vacuo. El agua-aceite húmedo resultante fue reconcentrado a partir de acetato de etilo (150 mL) y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 2% hasta 10% acetato de etilo en heptano) para obtener #10 (15.0 g, 73%) como un aceite incoloro. ? RMN (400 MHz, CDC13), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 5.60-5.83 (m, 1 H), 4.91-5.06 (m, 2H), 3.81-3.95 (br m, 1 H), 3.43 (s, 3H), 3.36-3.61 (m, 2H), 3.19-3.31 (m, 1 H), 2.09-2.21 (m, 1 H), 1.86-2.02 (br m, 2H), 1.62-1.85 (br m, 2H), 1.47 y 1.49 (2 s, total 9H), 1.09 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(ter- butoxicarbonil)p¡rrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanó¡co (#11). A #10 (25.0 g, 92.8 mmol, 1 eq.) en ter-butanol (100 mL, 0.93 M) se agregó inmediatamente agua (30.00 mL) seguida por N-metilmorfolin-N-óxido (25.97 g, 192.1 mmol, 2.07 eq.) y tetróxido de osmio (235.93 mg, 928.04 µ?t???, 0.01 eq.). Después de 12 horas, la mezcla fue concentrada in vacuo utilizando agua (20 mL) para remover azeotrópicamente el ter-butanol residual. El residuo fue particionado entre acetato de etilo (500 mL) y agua (500 mL) más salmuera (150 mL). La capa acuosa fue re-extraída con acetato de etilo (250 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con solución de cloruro de sodio acuosa (10 % en peso, 200 mL), lavadas con agua (150 mL), y concentradas in vacuo para obtener un aceite de color café claro acuoso-húmedo que fue re-concentrado a partir de acetato de etilo (100 mL) para remover cualquier agua remanente. Este diol crudo (34.76 g) fue utilizado sin purificación adicional.
Al diol crudo (34.76 g, <92.8 mmol, 1 eq.) en acetonitrilo (347 mL, 0.1 M) y agua (174 mL) se agregó permanganato de sodio (2.03 g, 5.73 mmol, 0.05 eq.). La mezcla fue enfriada hasta 0°C y se agregó periodato de sodio (51.46 g, 240.6 mmol, 2.1 eq.) en porciones durante 30 minutos, mientras que se mantuvo la temperatura interna por debajo de 5°C. La reacción fue sometida a agitación a 0°C durante 4 horas y después fue vertida en una solución de pentahidrato de tiosulfato sódico (65.40 g, 263.5 mmol, 2.3 eq.) en agua (100 mL). La mezcla fue filtrada a través de Celite y el filtrado fue concentrado in vacuo. El residuo fue particionado entre acetato de etilo (200 mL) y agua (200 mL). La capa acuosa fue re-extraída con acetato de etilo (250 mL), y las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con una solución de ácido cítrico acuoso al 10%. Ya que el producto deseado es muy soluble en agua, todas las capas acuosas fueron combinadas, tratadas con Celite (100 g) y concentradas in vacuo para producir una pasta blanquecina. Se agregó acetato de etilo (150 mL) y la mezcla fue re-concentrada para remover cualquier agua residual; esta operación se repitió una vez más. La pasta fue tratada con acetato de etilo (150 mL) y colocada in vacuo a 50°C durante 10 minutos y filtrada (repetido en dos ocasiones). Estos filtrados fueron combinados con la capa orgánica previa (a partir del lavado con ácido cítrico), concentrados, diluidos con acetato de etilo (200 mL) y filtrados a través de Celite para remover los sólidos. Finalmente este filtrado fue concentrado para producir #11 (22.9 g, 69% durante dos etapas) como una espuma de color amarillento/café. LCMS (Protocolo I): m/z 310.1 [M+Na+], 232.1 [(M-2-metilprop-1-en)+H+], 188.1 [(M- Boc)+H+], tiempo de retención = 3.268 minutos; H RMN (400 MHz, DMSO-d6), señales características: d 3.61 -3.85 (br m, 2H), 3.20-3.45 (br m, 4H), 3.03-3.17 (br m, 1 H), 1.59-1.93 (br m, 4H), 1.40 (br s, 9H), 1.02-1.18 (br m, 3H).
Preparación de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-r(1 S)-2-fenil-1-(1.3- tiazol-2-il)et¡n-3-f(2S)-pirrolidin-2-¡npropanamida, sal de ácido trifluoroacético (#19) y (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-r(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etin-3-f(2S)- pirrolid¡n-2-inpropantioamida, sal de ácido trifluoroacético (#18) Etapa 1. Síntesis de Na-(ten-butoxicarbonil)-L-fenilalaninamida (#12). A una solución de Boc-Phe-OH (30.1 g, 113 mmol, 1 eq ) en tetrahidrofurano (378 m¡_, 0.3 M) enfriada hasta -10°C se agregó N-metilmorfolina (13.6 mL, 124 mmol, 1.09 eq.), y cloroformato de etilo (11.8 ml_, 124 mmol, 1.09 eq.). Después de 20 minutos, se agregó una solución de hidróxido de amonio acuosa al 30% (45 mL, 350 mmol, 3.1 eq.). La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas antes de ser concentrada in vacuo. El residuo fue diluido con acetato de etilo y lavado de manera secuencial con 1 N solución de bisulfato de potasio acuosa, agua y salmuera. La capa orgánica fue secad después sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El sólido de color blanco fue disuelto (esto requirió de calentamiento con agitación) en acetato de etilo (aproximadamente 400 mL); se permitió entonces el enfriamiento de la solución hasta temperatura ambiente antes de agregar hexano (-1000 ml_). Después de unos minutos, inició la precipitación de un material de color blanco desde la mezcla de reacción. El sólido fue recolectado mediante filtración, lavado con heptano (2 x -150 ml_), y secado bajo vacío durante 18 horas para dar #12 (24.50 g, 82%) como un sólido. LC-MS: m/z 263.2 [M-H+], 309.2 [M+HC02 ], tiempo de retención = 1.85 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, rotámero principal: d 7.35 (br s, 1 H), 7.22-7.30 (m, 5H), 7.00 (br s, 1 H), 6.78 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 4.09 (ddd, J=10, 9, 4.5 Hz, 1 H), 2.95 (dd, J=13.8, 4.4 Hz, 1 H), 2.72 (dd, J=13.7, 10.1 Hz, 1 H), 1.30 (s, 9H).
Etapa 2. Síntesis de ter-butil [(2S)-1-amino-3-fenil-1-tioxopropan-2-il]carbamato (#13). A una solución de #12 (14.060 g, 53.192 mmol, 1 eq.) en tetrahídrofurano (180 ml_, 0.296M), se agregó 2,4-bis(4-metoxifenil)-1 ,3,2,4-ditiadifosfetan-2,4-ditiona (reactivo de Lawesson) (12.70 g, 31.40 mmol, 0.59 eq.) y la reacción fue calentada a reflujo durante 90 minutos. La reacción fue enfriada hasta temperatura ambiente y apagada mediante la adición de solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada. La mezcla fue extraída dos veces con acetato de etilo y las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de sodio, filtradas, y concentradas in vacuo. El residuo fue disuelto en acetato de etilo, concentrado in vacuo sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 100% acetato de etilo en heptano), obteniendo #13 (11.50 g, 77%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 279.4 [M-H+], 225.2 [(M-2-metilprop-1-en)+H+], 181.2 [(M- Boc)+H+]; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, rotámero principal: d 9.60 (br s, 1 H), 9.19 (br s, 1H), 7.23-7.32 (m, 5H), 6.82 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 4.44 (ddd, J=9.4, 9.1 , 4.4 Hz, 1 H), 3.00 (dd, J=13.7, 4.5 Hz, 1H), 2.79 (dd, J=13.6, 9.9 Hz, 1 H), 1.29 (s, 9H).
Etapa 3. Síntesis de ter-butil [(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]carbamato (#14). A una mezcla de #13 (5.65 g, 20.2 mmol, 1 eq.) en acetona (101 ml_, 0.2 M) se agregó bromoacetaldehído dietil acetal (8.76 ml_, 58.2 mmol, 2.89 eq.) y 2 gotas de 4 M ácido clorhídrico en dioxano. La mezcla fue desgasificada con nitrógeno tres veces antes de ser calentada a reflujo. Después de 2 horas, la reacción fue enfriada hasta temperatura ambiente y concentrada ¡n vacuo. El residuo fue disuelto en acetato de etilo, lavado con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada y lavado con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El aceite de color anaranjado crudo resultante fue diluido con acetato de etilo antes de ser concentrado in vacuo sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 35% acetato de etilo en heptano) y después mediante cromatografía de fase inversa (Método A) para dar #14 (625 mg, 10%); HPLC (Protocolo E): m/z 304.5 [M+H+], 248.9 [(M-2-metílprop-1-eno)+H+], tiempo de retención = 7.416 minutos; H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, rotámero principal: d 7.75 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.75 (br d, J=8.6 Hz, 1 H), 7.61 (br d, J=3.1 Hz, 1 H), 7.25-7.30 (m, 5H), 4.99 (ddd, J=10.5, 8.9, 4.5 Hz, 1 H), 3.29- 3.36 (m, 1 H, asumido; oscurecido parcialmente por señal de agua), 2.98 (dd, J=13.8, 10.6 Hz, 1 H), 1.31 (s, 9H).
Etapa 4. Síntesis de (1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etanamina, sal de clorhidrato (#15). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #14 (1.010 g, 3.318 mmol, 1 eq.), dioxano (10 mL, 0.33 M) y una 4 M solución de ácido clorhídrico en dioxano (20 mL, 80 mmol, 20 eq.) se sintetizó #15 (775 mg, 97%). H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 8.95-9.07 (br m, 3H), 7.86 (d, J=3.2 Hz, 1 H), 7.73 (d, J=3.2 Hz, 1 H), 7.18-7.28 (m, 3H), 7.10-7.15 (m, 2H), 4.98-5.07 (m, 1 H), 3.49 (dd, J=13.3, 4.9 Hz, 1 H), 3.18 (dd, J=13.4, 10.2 Hz, 1 H).
Etapa 5. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -carboxilato (#16). A una solución de #11 (280 mg, 0.974 mmol, 1 eq.) y #15 (460 mg, 1.44 mmol, 1.48 eq.) en N,N-dimetilformamida (3 mL, 0.32 M) a 0°C se agregó dietilfosforil cianida (DEPC) (93% de pureza, 212 pL, 1.30 mmol, 1.34 eq.), seguida por trietilamina (367 µ?, 2.63 mmol, 2.7 eq.). Después de 2 horas a 0°C, la mezcla de reacción fue calentada hasta temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción fue diluida después con acetato de etilo:tolueno (2:1 , 30 mL) y fue lavada de manera sucesiva con 1 M solución de bisulfato de sodio acuosa (35 mL) y 50% solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada (4 x 25 mL). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, concentrada in vacuo, y purificada mediante cromatografía en gel de sílice (12% hasta 100% acetato de etilo en heptano) para dar #16 como un aceite de color ámbar claro (374 mg, 81 %). LC-MS: m/z 474.4 [M+H+], 374.4 [(M-2-metilprop-1-eno)+H+] tiempo de retención = 3.63 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), señales características: d 8.66 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 7.78 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.64 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.21-7.31 (m, 4H), 7.14-7.20 (m, 1 H), 5.40 (ddd, J=11.4, 8.5, 4.0 Hz, 1 H), 3.23 (br s, 3H), 2.18 (dq, J=9.7, 6.7 Hz, 1 H), 1.06 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 6A. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]p¡rrolidin-1-carboxilato (#17). Una mezcla de #16 (350 mg, 0.739 mmol, 1 eq.) y 2,4-bis(4-metoxifenil)-1 ,3,2,4-ditiadifosfetan-2,4-ditiona (reactivo de Lawesson) (324 mg, 0.776 mmol, 1.05 eq.) en tolueno (6 mL, 0.1 M) fue calentada hasta 100°C. Después de 10 minutos, la mezcla fue enfriada hasta temperatura ambiente. El material insoluble fue removido mediante filtración y el filtrado fue concentrado in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 12% hasta 80% acetato de etilo en heptano) y después mediante cromatografía de fase inversa (Método E2) para dar #17 (120 mg, 33%); HPLC (Protocolo J): m/z 490.2 [M+H+], tiempo de retención = 10.069 minutos; [ct]20D— 110 (c 0.24, MeOH); 1H RMN (400 MHz, CD3OD), señales características: d 7.78 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.51 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.327.37 (m, 2H), 7.24-7.30 (m, 2H), 7.17-7.23 (m, 1 H), 6.52-6.61 (br m, 1 H), 3.62 (br dd, J=15, 4 Hz, 1 H), 3.37 (s, 3H), 2.98-3.09 (br m, 1 H), 2.53-2.64 (br m, 1 H), 1.60-1.78 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.27 (d, J=6.5 Hz, 3H).
Etapa 6B. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propantioamida, sal de ácido trifluoroacético (#18). De acuerdo con el procedimiento general B, a partir de #17 (198 mg, 0.404 mmol, 1 eq.), diclorometano (6 mL, 0.07 M) y ácido trifluoroacético (2 mL) se sintetizó #18 (185 mg, 91%), el cual fue utilizado sin purificación adicional. LC-MS: m/z 390.1 [M+H+], tiempo de retención = 0.57 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 10.91 (d, J=8.2 Hz, 1 H), 9.07-9.20 (br m, 1 H), 7.86-8.00 (br m, 1 H), 7.83 (d, J=3.2 Hz, 1 H), 7.69 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.27-7.36 (m, 4H), 7.21-7.26 (m, 1 H), 6.33 (ddd, J=11.3, 8.3, 4.4 Hz, 1 H), 3.76-3.82 (m, 1H), 3.56 (dd, J=14.6, 4.3 Hz, 1H), 3.45 (s, 3H), 3.28 (dd, J=14.6, 11.3 Hz, 1 H), 3.02-3.12 (br m, 1H), 2.89-3.00 (br m, 1 H), 2.72-2.89 (m, 2H), 1.69-1.83 (br m, 1H), 1.43-1.58 (m, 2H), 1.20-1.33 (m, 1 H), 1.22 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 7. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (#19). De acuerdo con el procedimiento general B, a partir de #16 (607 mg, 1.28 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0.13 M) y ácido trifluoroacético (2 mL) se sintetizó #19 (640 mg, cuantitativo), el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de) d 8.96-9.07 (br m, 1 H), 8.89 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.87-8.00 (br m, 1 H), 7.80 (d, J=3.2 Hz, 1 H), 7.66 (d, J=3.3 Hz, 1 H), 7.28-7.34 (m, 4H), 7.20-7.27 (m, 1 H), 5.43 (ddd, J=11.3, 8.6, 4.2 Hz, 1H), 3.42-3.50 (m, 2H), 3.36 (s, 3H), 3.04-3.14 (br m, 1 H), 2.99 (dd, J=14.2, 11.5 Hz, 1H), 2.92-3.02 (m, 1H), 2.78-2.88 (br m, 1 H), 2.34-2.42 (m, 1H), 1.73-1.84 (br m, 1 H), 1.55-1.68 (m, 1H), 1.38-1.53 (m, 2H), 1.15 (d, J=6.9 Hz, 3H).
Preparación de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-(2-feniletil)-3-r(2S)- pirrolidin-2-illpropantioamida, sal de clorhidrato (#23) v (2R.3R)-3-metoxi-2- metil-N-(2-feniletil)-3-r(2S)-pirrolidin-2-inpropanmida, sal de clorhidrato (#24) Etapa 1A. Síntesis de ter-butil (2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil- 3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-carboxilato (#20). A #11 (22 g, 77 mmol, 1 eq.) en diclorometano (383 mL, 0.2 M) y N,N-dimetilformamida (30 mL) se agregó diisopropiletilamina (26.9 mL, 153 mmol, 2 eq.), 2-feniletilamina (11.6 mL, 91.9 mmol, 1.2 eq.) y HATU (39.0 g, 99.5 mmol, 1.3 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y después fue concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (700 mL) y lavado de manera secuencial con 1 M solución de ácido clorhídrico acuosa (2 x 200 mL) y salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada y evaporada in vacuo. El material crudo fue absorbido en diclorometano y filtrado. El filtrado fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 100% acetato de etilo en heptano) para dar #20 (24 g, 80%) como un sólido blanquecino. LC- S: m/z 392.2 [M+2H+], 291.1 [(M-Boc)+H+], tiempo de retención = 0.88 minutos;1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 7.80-7.89 (br m, 1 H), 7.23-7.29 (m, 2H), 7.15-7.23 (m, 3H), 3.72-3.82 y 3.55-3.62 (2 br m, total 1 H), 3.45-3.55 (br m, 1 H), 3.31-3.44 (br m, 2H), 3.29 (s, 3H), 3.12-3.25 (br m, H), 2.98-3.12 (br m, 1H), 2.71 (t, J=7.1 Hz, 2H), 2.09-2.19 (m, 1H), 1.71-1.83 (br m, 2H), 1.60-1.70 (br m, 1 H), 1.49-1.60 (br m, 1H), 1.41 (s, 9H), 1.03 (d, J=6.8 Hz, 3H).
Etapa 1B. Síntesis de dipiridinio-1-ilpentatiodifosfonato (#21). Se agregó pentasulfuro de fósforo (4.45 g, 2.19 mL, 20 mmol, 1 eq.) a piridina (56 mL, 0.36 M) at 80 °C y la mezcla fue calentada a reflujo (115°C) durante 1 hora. La mezcla fue enfriada hasta temperatura ambiente y el producto fue recolectado mediante filtración para dar #21 como un sólido de color amarillo (4.57 g, 60%); mp: 165-167°C (descomposición); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 8.78-8.84 (m, 4H), 8.22-8.30 (m, 2H), 7.76-7.83 (m, 4H).
Etapa 2A. Síntesis de ter-butil (2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil- 3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-carboxilato (#22). Una mezcla de #20 (1.200 g, 3.073 mmol, 1 eq.) y #21 (1.40 g, 3.69 mmol, 1.2 eq.) en acetonitrilo ( 5 mL, 0.20 M) fue sometida a radiación de microondas a 100°C durante 30 minutos. La mezcla de reacción fue enfriada después hasta temperatura ambiente, diluida con acetato de etilo (150 mL), y lavada de manera secuencial con 0.5 M solución de ácido clorhídrico acuosa (100 mL) y salmuera (2 x 50 mL). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de magnesio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 20% hasta 80% acetato de etilo en heptano) para dar #22 (670 mg, 54%) como un sólido similar a cera de color blanco; mp: 107-109°C; LC-MS: m/z 407.4 [ +H+], 351.3 [(M-2-metilprop-1-eno)+H+], 307.3 [( -Boc)+H1 , tiempo de retención = 0.99 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3CN), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 8.28 (br s, 1H), 7.19-7.33 (m, 5H), 3.81-4.05 (br m, 2H), 3.60-3.81 (br m, 2H), 3.38-3.51 (br m, 1 H), 3.36 (s, 3H), 3.02-3.17 (br m, 1 H), 2.89-3.02 (m, 2H), 2.50-2.62 (br m, 1 H), 1.71-1.85 (br m, 2H), 1.53-1.66 (br m, 2H), 1.45 (br s, 9H), 1.23 (d, J=6.7 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-(2-feniletil)-3- [(2S)-pirrolidin-2-il]propantioamida, sal de clorhidrato (#23). De acuerdo con el procedimiento C, a partir de #22 (325 mg, 0.799 mmol, 1 eq.), dioxano (5 ml_, 0.2 M) y una 4 M solución de ácido clorhídrico en dioxano (4 ml_, 16 mmol, 20 eq.) se sintetizó #23 (274 mg, cuantitativo) como una espuma de color blanco; LC-MS: 308.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.55 minutos.
Etapa 2B. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-(2-feniletil)-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de clorhidrato (#24). A #20 (7.00 g, 17.9 mmol, 1 eq.) en dioxano (50 ml_, 0.36 M) y metanol (2 ml_) se agregó una 4 M solución de ácido clorhídrico en dioxano (20 ml_, 80 mmol, 4.4 eq.). Después de ser sometida a agitación durante 18 horas, la mezcla fue concentrada para obtener #24 (5.86 g, cuantitativo) como una goma, la cual fue utilizada sin purificación adicional; LC-MS: 292.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.47 minutos.
Preparación de N-Metil-L-valil-N-f(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((2S)-2- G? R.2R¾-1-metoxi-2-metil-3-(rn S)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-¡l¾etinam¿nol-3- tioxopropillpirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-in-N-metil-L-valinamida (#26) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrol¡din-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#25) De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #8 (480 mg, 0.753 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 ml_, 0.07 M), N,N-dimetilformamida (2 ml_), la amina #18 (401 mg, 0.941 mmol, 1.25 eq.), HATU (372 mg, 0.979 mmol, 1.3 eq.) y trietilamina (367 µ?_, 2.64 mmol, 3.5 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano) para obtener #25 (711 mg, 75%) como un sólido. LC-MS: m/z 1009.7 [M+H+], tiempo de retención = 1.15 minutos; HPLC (Protocolo B): m/z 505.3 [M+2+]/2, tiempo de retención = 10.138 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.81 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.89 (br d, J=7 Hz, 2H), [7.80 (d, J=3.3 Hz) y 7.83 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], [7.64 (d, J=3.2 Hz) y 7.69 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.62 (br d, J=7 Hz, 2H), 7.37-7.44 (m, 2H), 7.28-7.35 (m, 4H), 7.20-7.27 (m, 2H), 7.12-7.18 (m, 1 H), 6.27-6.35 y 6.40-6.48 (2 m, total 1 H), [1.14 (d, J=6.4 Hz) y 1.17 (d, J=6.3 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)eti 3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#26). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #25 (701 mg, 0.694 mmol) en diclorometano (10 ml_, 0.07 M) y dietilamina (10 ml_) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar un sólido similar a vidrio. Se agregaron éter dietílico y heptano y la mezcla fue concentrada in vacuo, produciendo #26 (501 mg, 92%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo A): m/z 787.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.229 minutos, (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.81 (br d, J=8. Hz), total 1 H], [7.99 (br d, J=9 Hz) y 8.00 (br d, J=9 Hz), total 1 H], [7.80 (d, J=3.3 Hz) y 7.83 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], [7.65 (d, J=3.2 Hz) y 7.69 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.29-7.34 (m, 2H), 7.19-7.28 (m, 2H), 7.13-7.19 (m, 1 H), [6.31 (ddd, J=11 , 8, 4.5 Hz) y 6.45 (ddd, J=11.5, 8, 4.5 Hz), total 1 H], [4.57 (dd, J=8.9, 8.7 Hz) y 4.63 (dd, J=8.7, 8.7 Hz), total 1 H], 3.16, 3.21 , 3.24 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.96 y 3.03 (2 br s, total 3H), [1.14 (d, J=6.6 Hz) y 1.17 (d, J=6.4 Hz), total 3H].
Preparación de N2-f(1-Aminociclopentil)carboniH-N-f3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -1 (2S)-2-í(1 R.2F0-1 -metoxi-2-metil-3-1 f(1 S)-2-fenil-1 -(1.3-tiazol-2-il)etillamino)-3-tioxopropinpirrolidin-1-il>-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N-metil-L-valinamida (#30) IfFmoc-amino) ácido Etapa 1. Síntesis de ter-butil (3R,4S,5S)-4-[{N-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}ciclopentil)carbonil-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoato (#27). A #6 (287 mg, 0.801 mmol, 1 eq.) en diclorometano (4 mL, 0.2 M) se agregó ácido 1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}ciclopentancarboxílico (309 mg, 0.879 mmol, 1.1 eq.), diisopropiletilamina (281 pL, 1.60 mmol, 2 eq.) y HATU (376 mg, 0.960 mmol, 1.2 eq.). La mezcla fue sometida a agitación durante 18 horas y diluida con acetato de etilo (15 mL). La mezcla de reacción fue lavada con 1 M solución de ácido clorhídrico acuosa (2 x 5 mL) y con salmuera (5 mL). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El material crudo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 60% acetato de etilo en heptano) a fin de proporcionar #27 (502 mg, 91 %) como una espuma de color blanco. LC-MS: m/z 692.3 [M+H+], 714.3 [M+Na+], 636.3 [(M-2-metilprop-1-eno)+H+], tiempo de retención = 1.13 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), señales características: d 7.89 (br d, J=7.4 Hz, 2H), 7.67-7.75 (m, 2H), 7.60 (br s, 1 H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.21 (br d, J=8.8 Hz, 1 H), 4.44-4.59 (m, 2H), 4.17-4.27 (m, 3H), 3.68-3.78 (br m, 1 H), 3.21 (s, 3H), 2.88 (br s, 3H), 2.09-2.20 (m, 2H), 1.39 (s, 9H) Etapa 2. Síntesis de ácido (3R,4S,5S)-4-[{N-[1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}ciclopentil)carbonil-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanóico (#28). A una solución de #27 (500 mg, 0.723 mmol) En diclorometano (7 ml_, 0.1 M) se agregó ácido trifluoroacético (3 ml_).
Inicialmente la mezcla de reacción se tornó de color anaranjado, oscureciéndose después al paso del tiempo. Después de ser sometida a agitación durante 8 horas, se removió el solvente in vacuo para dar #28 (460 mg, cuantitativo) como un cristal de color café oscuro, el cual fue utilizado sin purificación adicional. LC-MS: m/z 636.3 [M+H+].
Etapa 3. Síntesis de N2-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}ciclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#29).
De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #28 (50 mg, 0.079 mmol, 1 eq.) diclorometano (3 mL, 0.03 M), N,N-dimet¡lformamida (0.5 mL), amina #18 (44 mg, 0.087 mmol, 1.1 eq.), trietilamina (33.0 µ?_, 0.237 mmol, 3 eq.) y HATU (36 mg, 0.95 mmol, 1.2 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano) para dar #29 (59 mg, 67%) como un sólido. LC-MS: m/z 1007.5 [M+H+], tiempo de retención = 1.11 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.80 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.89 (br d, J=7 Hz, 2H), [7.80 (d, J=3.3 Hz) y 7.82 (d, J=3.1 Hz), total 1H], 7.687.75 (m, 2H), [7.64 (d, J=3.2 Hz) y 7.68 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.277.36 (m, 4H), 7.12-7.25 (m, 4H), [6.30 (ddd, J=11 , 8, 4.5 Hz) y 6.39-6.48 (m), total 1 H], [4.50 (br dd, J=8, 8 Hz) y 4.54-4.59 (m), total 1 H], 4.17-4.29 (m, 3H), 2.89 y 2.96 (2 br s, total 3H), [1.13 (d, J=6.5 Hz) y 1.16 (d, J=6.4 Hz), total 3H].
Etapa 4. Síntesis de N2-[(1-aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-meto (1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan N-metil-L-valinamida (#30). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #29 (54 mg, 0.054 mmol) en diclorometano (6 mL, 5 0.9 mM) y dietilamina (4 mL) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar el ejemplo #30 (26 mg, 61%) como un sólido. HPLC (Protocolo A): tiempo de retención = 7.233 minutos, m/z 785.4 [M+H+], (pureza > 72%). H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.82 (br d, J=8 Hz), total 1H], 8.19-8.27 (m, 1 H), [7.80 (d, J=3.2 Hz) y 7.83 (d, J=3.2 Hz), total 1H], [7.65 (d, J=3.3 Hz) y 7.69 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.28-7.33 (m, 2H), 7.20-7.27 (m, 2H), 7.14-7.19 (m, 1 H), [6.31 (ddd, J=11 , 8, 4.5 Hz) y 6.44 (ddd, J=11 , 8, 4 Hz), total 1 H], [4.53 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.60 (dd, J=9, 7.5 Hz), total 1 H], 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.17 y 3.21 (2 s, total 3H), 2.93 y 3.00 (2 br s, total 3H), [1.14 (d, J=6.5 Hz) y 1.17 (d, J=6.5 Hz), total 3H].
Preparación de 2-Metilalanil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-i(2S)-2-í(1R.2R)-1-metoxi-2-metií-3-ffnS)-2^ tioxoprop¡npirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida (#34) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-ter-butoxi-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#31). A una solución de #6 (70% pura, 3.13 g, 6.1 mmol, 1 eq.) en diclorometano (40 mL, 0.15 M) se agregó N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanina (1.99 g, 6.12 mmol, 1 eq.), diisopropiletilamina (2.67 mL, 15.3 mmol, 2.5 eq.) y HATU (2.79 g, 7.35 mmol, 1.2 eq.). La mezcla de reacción fue sometida a agitación durante 18 horas, diluida con acetato de etilo, lavada con solución de ácido clorhídrico acuosa 1 M y lavada dos veces con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada ¡n vacuo sobre sílice. El material fue purificado después mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 45% acetato de etilo en heptano) a fin de proporcionar #31 (3.65 g, 90%) como un sólido. LC-MS: m/z 665.5 [M+H+], 688.5 [M+Na+], 610.5 [(M-2-metílprop-1-eno)+H+]; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.455 (pureza > 94%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), señales características: d 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.67-7.74 (m, 2H), 7.39-7.48 (m, 3H), 7.31-7.36 (m, 2H), 7.29 (br d, J=8.8 Hz, 1 H), 4.47-4.60 (br m, 1 H), 4.47 (dd, J=8.6, 8.0 Hz, 1 H), 4.18-4.28 (m, 3H), 3.69-3.79 (br m, 1 H), 3.21 (s, 3H), 2.88 (br s, 3H), 2.15 (dd, J=15.5, 10 9.3 Hz, 1 H), 1.91-2.01 (m, 1 H), 1.67-1.81 (br m, 1 H), 1.39 (s, 9H), 1.36 (br s, 3H), 1.30 (s, 3H), 0.75 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.66-0.73 (br m, 3H).
Etapa 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#32). De acuerdo con el procedimiento general B, a partir de #31 (500 mg, 0.751 mmol) en diclorometano (7 mL, 0.1 M) y ácido trifluoroacético (3 mL) se sintetizó #32 como un cristal (458 mg, cuantitativo), el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS: m/z 611.4 [M+2H+], 632.2 [M+Na+], tiempo de retención = 0.94 minuto.
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3- {[(1S)-2-fenii-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1 - oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-val¡nam¡da (#33). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #32 (53.0 mg, <0.083 mmol, 1 eq.), diclorometano (4 mL, 0.02 M), N,N-dimetilformamida (1 mL), amina #18 (43.8 mg, 0.0870 mmol, 1 eq.), trietilamina (36 pL, 0.26 mmol, 3 eq.) y HATU (39.5 mg, 0.104 mmol, 1.2 eq.) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano) para dar #33 (60 mg, 69% durante dos etapas). LC-MS: m/z 981.4 [M+H+], tiempo de retención = 1.090 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.80 (br d, J=8 Hz), total 1H], 7.86-7.91 (m, 2H), [7.80 (d, J=3.3 Hz) y 7.82 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.68-7.74 (m, 2H), [7.64 (d, J=3.2 Hz) y 7.68 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.20-7.36 (m, 6H), 7.12-7.17 (m, 1H), 6.27-6.34 y 6.40-6.47 (2 m, total 1 H), 3.22 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.14 y 3.18 (2 s, total 3H), 2.90 y 2.97 (2 br s, total 3H), 1.37 (br s, 3H), 1.31 (2 br s, total 3H), [1.13 (d, J=6.6 Hz) y 1.16 (d, J=6.5 Hz), total 3H].
Etapa 4. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#34). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #33 (55 mg, 0.055 mmol, 1 eq.) en diclorometano (6 mL, 0.009 M) y dietilamina (4 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 5% metanol en diclorometano) para dar #34 (25 mg, 60%) como un sólido. HPLC (Protocolo A): m/z 759.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.088 minutos, (pureza > 75%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.81 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 8.01-8.08 (m, 1 H), [7.80 (d, J=3.1 Hz) y 7.83 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], [7.65 (d, J=3.2 Hz) y 7.69 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.29-7.33 (m, 2H), 7.20-7.27 (m, 2H), 7.13-7.19 (m, 1H), 6.27-6.35 y 6.40-6.48 (2 m, total 1 H), [4.49 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.56 (dd, J=9, 8 Hz), total 1H], 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.17 y 3.21 (2 s, total 3H), 2.92 y 2.99 (2 br s, total 3H), 1.20 y 1.21 (2 s, total 3H), 1.12 y 1.13 (2 s, total 3H), 0.75-0.81 (m, 3H).
Preparación de N-metil-L-valil-N-{(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-(HR,2R)-1-metoxi-2-metil-3-f(2-feniletil)am metil-1-oxoheptan-4-il)-N-metil-L-valinamida (#36) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -[(2S)-2-{(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-[(2-fen¡letil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#35). A una mezcla de #23 (337 mg, 0.983 mmol, 1 eq.) en diclorometano (8 mL, 0.1 M) y N,N-d¡metilformamida (1 mL) se agregó #8 (564 mg, 0.885 mmol, 0.9 eq.), diisopropiletilamina (383 mg, 2.95 mmol, 3 eq.) y HATU (472 mg, 1.18 mmol, 1.2 eq.). Después de 2 horas, la mezcla fue diluida con diclorometano, lavada de manera secuencial con 0.1 ácido clorhídrico acuoso y con salmuera, secada sobre sulfato de magnesio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método G) para dar #35 (600 mg, 66%); LC-MS: m/z 926.6 [M+H+], tiempo de retención = 1.16 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [9.94 (br t, J=5 Hz) y 10.16-10.23 (br m), total 1 H], 7.90 (d, J=7.2 Hz, 2H), [7.71 (br d, J=7 Hz) y 8.06 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.60-7.65 (m, 2H), 7.41 (br dd, J=7, 7 Hz, 2H), 7.15-7.36 (m, 7H), 3.29 (s, 3H), 1.16-1.22 (m, 3H).
Etapa 2. Síntesis de N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 [(2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3[(2-feniletil)aminol-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#36). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #35 (465 mg, 0.502 mmol, 1 eq.) en diclorometano (5 mL, 0.1 M) y dietilamina (5 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #36 (310 mg, 88%) como un sólido. LC-MS: m/z 704.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.74 minutos; HRMS: m/z calculado para C38H66 5O5S: 704.4779, encontrado: 704.477 [M+H+]; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.23-7.30 (m, 4H), 7.15-7.22 (m, 1 H), [4.68 (d, J=8.6 Hz) y 4.74 (d, J=8.0 Hz), total 1 H], 3.39 y 3.40 (2 s, total 3H), 3.12 y 3.22 (2 br s, total 3H), [2.82 (d, J=6.0 Hz) y 2.84 (d, J=6.0 Hz), total 1 H], 2.29 y 2.30 (2 s, total 3H), [1.27 (d, J=6.8 Hz) y 1.29 (d, J=6.6 Hz), total 3H], [0.84 (t, J=7.4 Hz) y 0.87 (t, J=7.4 Hz), total 3HJ.
Preparación de N-metil-L-valil-N-r(3R.4S.5S)-1-{(2S)-2-f(1 R.2R)- 3-íf( 1 S)-1 -carboxi-2-feniletinamino)- 1 -metoxi-2-metil-3-tioxopropillpirrolidin- 1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinarnide, sal de ácido trifluoroacético (#41) v N-Metil-L-valil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-í(2S)-2-f(1R.2R)-1-metoxi-3-(f(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-illaminoV2-meti thioxopropillpirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-met¡l-L-valinamida (#42) Etapa 1. Síntesis de metil N- (2R,3R)-3-[(2S)-1-(ter-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#37). A una mezcla de #11 (2.7 g, 9.4 mmol, 1 eq.) en diclorometano (30 mL, 0.3 ) y ?,?-dimetilformamida (3 mL) se agregó diisopropiletilamina (3.30 mL, 18.8 mmol, 2 eq.), clorhidrato de L-fenilalanina metil éster (2.03 g, 9.40 mmol, 1.2 eq.) y HATU (4.79 g, 12.2 mmol, 1.3 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y después concentrada ¡n vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (100 mL) y lavado de manera secuencial con 1 M ácido clorhídrico (2 x 50 mL) y salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada y evaporada in vacuo. El material crudo fue absorbido en diclorometano y filtrado. El filtrado fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 100% acetato de etilo en heptano) para dar #37 (2.76 g, 65%) como un sólido blanquecino. LC-MS: m/z 449.3 [M+H+], 349.2 [(M-Boc)+H+] tiempo de retención = 0.88 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 8.28 (d, J=8.2 Hz, 1 H), 7.14-7.29 (m, 5H), 4.50 (ddd, J=10.9, 8.1 , 4.4 Hz, 1 H), 3.64 (s, 3H), 3.23 (s, 3H), 2.15-2.24 (m, 1 H), 1.56-1.76 (m, 2H), 1.31 -1.55 (m, 11 H), 1.02 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 2. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(ter-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanetioil}-L-fenilalaninato (#38). Una mezcla de #37 (1.52 g, 3.39 mmol, 1 eq.) y #21 (1.68 g, 4.41 mmol, 1.3 eq.) en acetonitrilo (12 mL, 0.28 M) fue sometida a radiación de microondas a 100°C durante 1 hora. La mezcla fue particionada agua y acetato de etilo. La capa acuosa fue re-extraída con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con solución de ácido cítrico acuoso al 10% y con salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El material fue disuelto en una pequeña cantidad de acetato de etilo y concentrado sobre sílice in vacuo. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetato de etilo en heptano) produjo #38 (680 mg, 43%); LC-MS: m/z 465.2 [ +H+], 487.3 [M+Na+], 365.2 [(M-Boc)+H+], tiempo de retención = 0.97 minutos; HPLC (Protocolo B): 465.2 [M+H+], 487.2 [M+Na+], 365.2 [(M-Boc)+H+], tiempo de retención = 7.444 minutos (pureza > 98%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 10.23 (br d, J=7.5 Hz, 1 H), 7.17-7.28 (m, 5H), 5.24 (ddd, J=11 , 7.5, 4.5 Hz, 1 H), 3.66 (s, 3H), 3.28 (s, 3H), 3.21 (dd, J=14.3, 4.4 Hz, 1 H), 3.07 (dd, J=14.2, 11.2 Hz, 1 H), 2.65-2.74 (m, 1 H), 1.54-1.71 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.17 (d, J=6.4 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanetiol}-L-fenilalaninato, sal de clorhidrato (#39). De acuerdo con el procedimiento general C, a 0°C a partir de #38 (660 mg, 1.42 mmol, 1 eq.), dioxano (10 mL, 0.14 M) y solución de 4 M ácido clorhídrico en dioxano (20 mL, 80 mmol, 60 eq.) se sintetizó #39 (590 mg) como un sólido blanquecino, el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS: m/z 365.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.58 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 10.67 (d, J=7.7 Hz, 1H), 9.429.54 (br m, 1 H), 8.21-8.33 (br m, 1 H), 7.20-7.35 (m, 5H), 5.25 (ddd, J=11.1 , 7.6, 4.4 Hz, 1 H), 3.76 (dd, J=8.9, 3.0 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.39 (s, 3H), 3.24 (dd, J=14.2, 4.5 Hz, 1 H), 3.13 (dd, J=14.3, 11.0 Hz, 1 H), 2.93-3.09 (m, 3H), 2.85-2.93 (m, 1 H), 1.72-1.84 (m, 1 H), 1.36-1.60 (m, 3H), 1.22 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 4. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#40). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #8 (247 mg, 0.387 mmol, 1 eq.), #39 (186 mg, <0.450 mmol, 1.2 eq.), diclorometano (10 mL, 0.04 M), N,N-dimetilformamida (2 mL), HATU (176 mg, 0.464 mmol, 1.2 eq.) y trietilamina (189 uL, 1.35 mmol, 3.5 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 25% acetona en heptano) para dar #40 (410 mg, 90% durante 2 etapas) como un sólido blanquecino. LC-MS: m/z 984.7 [M+H+], 1006.7 [M+Na+], tiempo de retención = 1.15 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.683 minutos (pureza > 99%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.19 (br d, J=7 Hz) y 10.49 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.90 <d, J=7.5 Hz, 2H), 7.60-7.65 (m, 2H), 7.38-7.45 (m, 2H), 7.29-7.35 (m, 2H), 7.14-7.28 (m, 5H), [5.20 (ddd, J=11, 7, 4 Hz) y 5.35-5.43 (m), total 1 H], 3.65 y 3.69 (2 s, total 3H), [1.15 (d, J=6.5 Hz) y 1.18 (d, J=6.4 Hz), total 3H], Etapa 5A. Síntesis de N-metil-L-valil-N-[(3R,45,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#41). A una solución de #40 (401 mg, 0.407 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (10 mL, 0.03 ) se agregó una solución de hidróxido de litio (24.4 mg, 1.02 mmol, 2.5 eq.) en agua (5 mL). Después de 4 horas, la reacción fue concentrada in vacuo y después formada en azeotropo tres veces con heptano. El material crudo fue disuelto en sulfóxido de dimetilo (7 mL) y purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C, 7 inyecciones de 1 mL). Las fracciones apropiadas fueron concentradas (Genevac) antes de ser diluidas con una pequeña cantidad de metanol en diclorometano. La mezcla fue concentrada in vacuo hasta un sólido similar a vidrio. Se agregó después éter de dietilo, seguido por heptano, y la mezcla fue concentrada in vacuo para obtener #41 (180 mg, 59%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 748.6 [M+HI, tiempo de retención = 0.68 minutos; HPLC (Protocolo A): 748.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.922 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 12.9 y 13.1 (2 v br s, total 1 H), [10.12 (br d, J=8 Hz) y 10.45 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 8.75-8.90 (m, 2H), 8.62-8.73 (br m, 1 H), 7.13-7.29 (m, 5H), [5.20 (ddd, J=11 , 7.5, 4 Hz) y 5.40 (ddd, J=11.5, 8, 4 Hz), total 1 H], 4.55-4.73 (m, 2H), 3.23 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.16 y 3.18 (2 s, total 3H), 2.97 y 3.01 (2 br s, total 3H), 1.13-1.20 (m, 3H), 0.73-0.81 (m, 3H).
Etapa 5B. Síntesis de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#42). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #40 (561 mg, 0.570 mmol, 1 eq.), diclorometano (30 mL, 0.057 M) y dietilamina (10 mL) se sintetizó #42 (348 mg, 80%) como un sólido de color blanco después de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano). LC-MS: m/z 762.7 [M+H+], tiempo de retención = 0.74 minutos; HPLC (Protocolo A): 762.4 [M+hT], tiempo de retención = 7.315 minutos (pureza > 95%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.20 (br d, J=7.5 Hz) y 10.50 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.95-8.03 (m, 1 H), 7.15-7.29 (m, 5H), [5.20 (ddd, J=11 ,7.5, 5 Hz) y 5.39 (ddd, J=11 , 7.5, 4 Hz, total 1 H], [4.57 (dd, J=8.8, 8.7 Hz) y 4.61 (dd, J=8.7, 8.6 Hz), total 1 H], 3.65 y 3.69 (2 s, total 3H), 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.16 y 3.17 (2 s, total 3H), 2.96 y 2.99 (2 br s, total 3H), 2.69-2.79 (m, 1 H), 2.62-2.68 (m, 1 H), 2.14 y 2.15 (2 br s, total 3H), [1.15 (d, J=6.6 Hz) y 1.18 (d, J=6.5 Hz), total 3H], [0.75 (t, J=7.4 Hz) y 0.76 (t, J=7.3 Hz), total 3H].
Preparación de 2-Metilalanil-N-f(3R,4S,5S)-1-1 (2S)-2-[(1 R.2F -3- ([(1S)-1-carboxi-2-feniletillaminol-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropillpirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamida, sal de clorhidrato (#44) y 2-metilalanil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-í(1R,2R)-1-metoxi-3-í[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il1amino}-2-metil-3-thioxopropil1 pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-¡n-N-metil-L-valinamida, sal de clorhidrato (#45) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,45,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5 metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#43). A una solución de #32 (321 mg, 0.881 mmol, 1 eq.) en diclorometano (5 mL, 0.1 M) y N,N-dimetilformamida (1 mL) se agregó #39 (484 mg, <0.769 mmol, 0.9 eq.), HATU (353 mg, 0.881 mmol, 1 eq.) y diisopropiletilamina (463 µ?, 2.64 mmol, 3 eq.).
Después de ser sometida a agitación durante 18 horas, la mezcla fue diluida con diclorometano, lavada con agua y con salmuera, secada sobre sulfato de magnesio, filtrada, y concentrada sobre sílice in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano) para dar #43 (574 mg, 68% durante dos etapas) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 956.6 [M+H+], tiempo de retención = 4.49 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.80 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.64-7.72 (m, 2H), 7.16-7.35 (m, 7H), [5.43 (dd, J=11 , 4.5 Hz) y 5.58 (dd, J=11.5, 4 Hz), total 1 H], 3.72 y 3.75 (2 s, total 3H), 3.34 y 3.35 (2 s, total 3H), 3.26 y 3.29 (2 s, total 3H), 3.05 y 3.11 (2 br s, total 3H), 1.39 y 1.40 (2 s, total 3H), [1.24 (d, J=6.7 Hz) y 1.29 (d, J=6.4 Hz), total 3H].
Etapa 2A. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de clorhidrato (#44). A una solución de #43 (100 mg, 0.105 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (5 ml_, 0.02 M) se agregó una solución de hidróxido de litio (10 mg, 0.417 mmol, 3 eq.) en agua (3 ml_). Después de 3 horas, la reacción fue concentrada in vacuo y purificada mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar una sal de ácido trifluoroacético, la cual fue disuelta en metanol, tratada con una solución de 4 M ácido clorhídrico en dioxano, y concentrada in vacuo para dar #44 (56 mg, 71 %) como un sólido de color blanco. LC-MS: m z 720.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.67 minutos; HPLC (Protocolo D): tiempo de retención = 8.851 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.17-7.31 (m, 5H), 3.34 y 3.35 (2 s, total 3H), 3.10 y 3.16 (2 br s, total 3H), 1.62 y 1.64 (2 s, total 3H), 1.53 y 1.55 (2 s, total 3H), [1.26 (d, J=6.5 Hz) y 1.30 (d, J=6.5 Hz), total 3H], 0.84-0.91 (m, 3H).
Etapa 2B. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3- [(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-¡l]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de clorhidrato (#45). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #43 (176 mg, 0.184 mmol, 1 eq.), diclorometano (4 mL, 0.05 M) y dietilamina (4 mL) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C). La sal de ácido trifluoroacético resultante fue disuelta en metanol, tratada con una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano, y concentrada in vacuo para dar #45 (100 mg, 70%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 734.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.72 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.18-7.31 (m, 5H), 5.41-5.47 y 5.55-5.62 (2 m, total 1H), 3.73 y 3.76 (2 s, total 3H), 3.35 y 3.36 (2 s, total 3H), 3.10 y 3.15 (2 br s, total 3H), 1.62 y 1.64 (2 s, total 3H), 1.53 y 1.55 (2 s, total 3H), [1.25 (d, J=6.6 Hz) y 1.29 (d, J=6.5 Hz), total 3H], 0.84-0.91 (m, 3H).
Preparación de N2-f(1-Aminociclopentil)carbonin-N-f(3R.4S.5S)- 3-metoxi-1-((2SV2-f(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-ir(1 S)-2-fen¡l-1-(1.3- tiazol-2-il)etillamino)propil1pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L- valinamida (#47) Etapa 1. Síntesis de N2-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxiícarbonilJarninoJcyclopenti -carbonill-N-^SR^S.SS^S-metoxi-l -^S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-¡l)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valina (#46). A una solución de #19 (353 mg, 0.944 mmol, 1 eq.) en diclorometano (10 mL, 0.094 M) se agregó #28 (600 mg, 0.944 mmol, 0.9 eq.), diisopropiletilamina (498 uL, 2.83 mmol, 3 eq.) y HATU (444 mg, 1.13 mmol, 1.2 eq.). Después de ser sometida a agitación durante dos días, la mezcla fue concentrada in vacuo y el residuo fue diluido con acetato de etilo (60 mL), lavada con 1 M solución de ácido clorhídrico acuosa y con salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue diluido con diclorometano y filtrado. El filtrado fue concentrado bajo presión reducida sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 40% hasta 100% acetato de etilo en heptano) para dar #46 (644 mg, 69%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 991.8 [M+HI, tiempo de retención = 1.07 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.89 (br d, J=7.4 Hz, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.79 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.667.76 (m, 2H), [7.62 (d, J=3.3 Hz) y 7.65 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.37-7.44 (m, 2H), 7.117.36 (m, 7H), [5.38 (ddd, J=11 , 8, 4 Hz) y 5.48-5.57 (m), total 1H], 3.13, 3.17, 3.18 y 3.24 (4 s, total 6H), 2.90 y 3.00 (2 br s, total 3H), [1.05 (d, J=6.6 Hz) y 1.09 (d, J=6.8 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de N2-[(1-aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,45,55)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]p¡ N-metil-L-valinamida (#47). A una mezcla de #46 (500 mg, 0.504 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (8 ml_, 0.06 M) se agregó dietilamina (4 ml_). Después de ser sometida a agitación durante 18 horas, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #47 (374 mg, 96%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 769.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.70 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8.4 Hz) y 8.87 (br d, J=8.6 Hz), total 1 H], [8.22 (br d, J=9.4 Hz) y 8.26 (br d, J=9.4 Hz), total 1 H], [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.80 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.1 Hz) y 7.66 (d, J=3.3 Hz), total 1H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.1 , 8.5, 4.2 Hz) y 5.54 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.1 Hz), total 1 H], [4.53 (dd, J=9.2, 7.6 Hz) y 4.64 (dd, J=9.2, 6.6 Hz), total 1 H], 3.16, 3.20, 3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.03 (2 br s, total 3H), [1.05 (d, J=6.8 Hz) y 1.10 (d, J=6.6 Hz), total 3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
Preparación de N2-f(1-Aminociclopropil)carbonin-N-f(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-r(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(f(1 S)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-il)etinamino}propil]pirrolidin-1-i^ valinamida (#51) v 1-amino-N-[(2S)-1-([(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-r(1R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(f(1S)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-il)etil1amino)propil1pirrolidin-1-il)-5-me 1 -oxobutan-2-illciclohexancarboxamida (#52) Etapa 1. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético y ácido (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanóico (#48). A una solución de #16 (1.0 g, 2.11 mmol, 1 eq.) y #5 (1.22 g, 2.11 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 ml_, 0.1 M) a 0°C se agregó ácido trifluoroacético (6 ml_). Después de 3 horas, la mezcla fue concentrada in vacuo para dar la mezcla #48 (1.8 g), la cual fue utilizada en la siguiente etapa sin purificación adicional; LC-MS (Protocolo K): m/z 374.2 [M+H+], tiempo de retención = 2.093 minutos, 525.2 [M+H+], tiempo de retención = 4.875 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-5-metil- 1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#49). A una solución de #48 (1.8 g, <2.1 mmol, 1 eq.) y dietil cianofosfonato (DEPC) (0.51 g, 3.2 mmol, 1.5 eq.) en 1 ,2-dimetoxietano (30 mL. 0.07 M) a 0°C se agregó trietilamina (1.47 ml_, 10.6 mmol, 5 eq.). Después de ser sometida a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (10% hasta 50% acetato de etilo en éter de petróleo) para dar #49 (0.8 g, 45%). Rf 0.6 (10% metanol en diclorometano); LC-MS (Protocolo K): m/z 881.3 [M+H+], 903.3 [M+Na+], tiempo de retención = 4.837 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R, 2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2- ¡l)et¡l]amino}propil]pirrolidin-1-H (#50). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #49 (0.70 g, 0.79 mmol, 1 eq.), diclorometano (15 mL, 0.05 M) y dietilamina (10 ml_) se sintetizó #50 (160 mg, 30%) después de la purificación mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 5% metanol en diclorometano). Rf 0.4 (10% metanol en diclorometano); LC-MS (Protocolo K): m/z 658.3 [M+hT], 680.3 [M+Na+], tiempo de retención = 2.760 minutos.
Etapa 4A. Síntesis de N2-[(1-aminociclopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]^ N-metil-L-valinamida (#51). A una solución de #50 (100 mg, 0.15 mmol, 1 eq.), hexafluorofosfato de bromotris(dimetilamino)fosfonio (Brop, 70 mg, 0.18 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (0.08 mL, 0.45 mmol, 3 eq.) en diclorometano (15 mL, 0.01 M) a 0°C se agregó ácido 1-aminociclopropancarboxílico (18 mg, 0.18 mmol, 1.2 eq.). Después de 2 horas, la mezcla fue apagada con agua y extraída dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de sodio, filtradas, y concentradas in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 5% metanol en diclorometano) para dar #51 (45 mg, 34%). Rf 0.5 (10% metanol en diclorometano). LC-MS (Protocolo L): m/z 741.44 [M+H+]; 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8 Hz) y 8.88 (br d, J=8 Hz), total 1 HJ, [8.16 (br d, J=9 Hz) y 8.22 (br d, J=10 Hz), total 1 H], [7.77 (d, J=3.5 Hz) y 7.79 (d, J=3.5 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.5 Hz) y 7.65 (d, J=3 Hz), total 1 H], 7.10-7.32 (m, 5H), 5.33-5.60 (m, 1 H), 3.16, 3.20, 3.21 y 3.26 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.02 (2 br s, total 3H), [1.05 (d, J=6.3 Hz) y 1.10 (d, J=6.3 Hz), total 3H].
Etapa 4B. Síntesis de 1-amino-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](met¡ 1-oxobutan-2-il]ciclohexancarboxamida (#52). A una solución de #50 (120 mg, 0.18 mmol, 1 eq.), Brop (84 mg, 0.21 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (0.1 mL, 0.54 mmol, 3 eq.) en diclorometano (15 mL, 0.009 M) a 0°C se agregó ácido 1-aminociclohexancarboxílico (31 mg, 0.21 mmol, 1.2 eq.). Después de 2 horas, la mezcla fue apagada con agua y extraída dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de sodio, filtradas, y concentradas in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 5% metanol en diclorometano) para dar #52 (50 mg, 35%). Rf 0.6 (10% metanol en diclorometano). LC-MS (Protocolo K): m/z 783.79 [M+H+]; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8 Hz) y 8.87 (br d, J=9 Hz), total 1 H], 8.18-8.28 (m, 1 H), [7.77 (d, J=3.5 Hz) y 7.80 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.3 Hz) y 7.66 (d, J=3.3 Hz), total 1H], 7.12-7.31 (m, 5H), 5.35-5.43 y 5.49- 5.57 (2 m, total 1 H), [4.51 (dd, J=9, 8 Hz), y 4.61 (dd, J=9, 7 Hz), total 1 H], 3.16, 3.19, 3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.02 (2 br s, total 3H), [1.05 (d, J=6.8 Hz) y 1.10 (d, J=6.8 Hz), total 3H].
Preparación de 2- etilalanil-N-ff3R.4S.5S)-3-metoxi-1-f(2S)-2- f(1 R.2FQ-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-( í(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2- il)etil1amino}propinpirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-vanilam (#54) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2- metilalanil-N-[(3R,45,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo- 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#53). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #32 (2.05 g, 2.83 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 mL, 0.1 M) y N,N-dimetilformamida (3 mL), la amina #19 (2.5 g, 3.4 mmol, 1.2 eq.), HATU (1.29 g, 3.38 mmol, 1.2 eq.) y trietilamina (1.57 mL, 11.3 mmol, 4 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 55% acetona en heptano), produciendo #53 (2.42 g, 74%) como un sólido. LC- S: m/z 965.7 [M+H+], 987.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.04 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 965.4 [M+H+], tiempo de retención = 11.344 minutos (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.79 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, J=3.2 Hz) y 7.65 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz) y 5.52 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.2 Hz), total 1 H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz) y 4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), total 1 H], 3.13, 3.17, 3.18 y 3.24 (4 s, total 6H), 2.90 y 3.00 (2 br s, total 3H), 1.31 y 1.36 (2 br s, total 6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz) y 1.09 (d, J=6.7 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#54) De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #53 (701 mg, 0.726 mmol) en diclorometano (10 mL, 0.07 M) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano). El residuo fue diluido con éter dietílico y heptano y fue concentrado in vacuo para obtener #54 (406 mg, 75%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 743.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.70 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 25 743.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.903 minutos, (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8.5 Hz) y 8.86 (br d, J=8.7 Hz), total 1 H], [8.04 (br d, J=9.3 Hz) y 8.08 (br d, J=9.3 Hz), total 1 H], [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.80 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.3 Hz) y 7.66 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11 , 8.5, 4 Hz) y 5.53 (ddd, J=12, 9, 4 Hz), total 1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.60 (dd, J=9, 7 Hz), total 1 H], 3.16, 3.20, 3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.02 (2 br s, total 3H), 1.21 (s, 3H), 1.13 y 1.13 (2 s, total 3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz) y 1.10 (d, J=6.7 Hz), total 3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
Preparación de 2-Metilalanil-N-1(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-r(2S)-2- 1(1R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-f(2-feniletil)aminolpropil)p¡rrolidin-1-ill-5- metil-1-oxoheptan-4-il)-N-metil-L-valinamida. sal de ácido acético (#56) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2- metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo- 3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L- valinamida (#55). A una solución de #24 (104 mg, 0.256 mmol, 1 eq.) en diclorometano (10 ml_, 0.094 M) se agregó #32 (156 mg, 0.256 mmol, 0.9 eq.), diisopropiletilamina (135 µ?_, 0.768 mmol, 3 eq.) y HATU (120 mg, 0.307 mmol, 1.2 eq.). Después de ser sometida a agitación durante 18 horas, la mezcla fue concentrada in vacuo y el residuo fue diluido con acetato de etilo (10 ml_), lavado con solución 1 M de ácido clorhídrico acuosa (2 x 5 ml_) y con salmuera, secado sobre sulfato de sodio, filtrado, y concentrado in vacuo. El residuo fue diluido con diclorometano y filtrado. El filtrado fue concentrado bajo presión reducida sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 100% acetato de etilo en heptano) para dar #55 (44 mg, 19%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 884.5 [M+2H+], tiempo de retención = 1.04 minutos.
Etapa 2. Síntesis de 2-metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -[(2S)-2-{(1 R,2R)-1-methoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#56). A una mezcla de #55 (44 mg, 0.050 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (1 ml_, 0.05 M) se agregó dietilamina (0.5 ml_). Después de ser sometida a agitación durante 18 horas, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método B) para dar #56 (16.2 mg, 49%) como un sólido. LC-MS: m/z 660.8 [M+H+], tiempo de retención = 2.23 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 660.5 [M+H+], 682.4 [M+Na+], tiempo de retención = 6.865 minutos.
Preparación de 2-Metilalanil-N-f(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-í(2S)-2-f(1 R.2FQ-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-í í(1 -fenilcicloprop¡l)metil1amino)propillpirrolidin-1-il -5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-vanilamida (#60) Etapa 1. Síntesis de 1-(1-fenilciclopropil)metanamina A una solución de 1 -fenilciclopropancarbonitrilo (50 g, 0.34 mol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (500 mL, 0.7 M) a 0°C se agregó hidruro de litio-aluminio (23 g, 0.35 mol, 1.03 eq.). La mezcla de reacción fue sometida a agitación a 0°C durante una hora y después a reflujo durante una hora. La mezcla de reacción fue enfriada después y apagada con agua (23 mL) y una solución de hidróxido de sodio acuosa al 15% (69 mL).
La mezcla fue filtrada y concentrada in vacuo para obtener #@1 (36 g, 72%). LC-MS: m/z 148.1 [M+H+], tiempo de retención = 0.86 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.2-7.4 (m, 5H), 2.78 (s, 2H), 1.19 (br s, 2H), 0.72-0.84 (m, 4H).
Etapa 2. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3- oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-carboxilato (#57). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #11 (2.15 g, 7.48 mmol, 1.1 eq.) en diclorometano (20 mL, 0.3 M) y N,N-dimet¡lformamida (4 ml_), 1-(1-fenilciclopropil)metanamina #@1 (1.001 g, 6.799 mmol, 1 eq.), HATU (3.10 g, 8.16 mmol, 1.2 eq.) y trietilamina (2.84 mL, 20.4 mmol, 3 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 00% acetato de etilo en heptano), produciendo #57 (1.93 g, 68%) como un sólido. HPLC (Protocolo A a 45 C): m/z 417.3 [M+H+], tiempo de retención = 10.575 minutos; 1H R N (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 7.75-7.81 (m, 1H), 7.20-7.27 (m, 4H), 7.12- 7.19 (m, 1H), 3.33-3.62 y 3.71-3.80 (br multipletos, total 4H), 3.28 (s, 3H), 2.97-3.17 (br m, 2H), 2.14-2.24 (m, 1H)r 1.67-1.80 (br m, 2H), 1.45-1.65 (m, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.00 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.67-0.93 (m, 4H).
Etapa 3. Síntesis de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-N-[(1-fenilciclopropil)metil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de clorhidrato (#58). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #57 (566 mg, 1.36 mmol, 1 eq.) en dioxano (4 mL, 0.3 M) y solución de 4 M ácido clorhídrico en dioxano (4 mL, 16 mmol, 11.7 eq.) se sintetizó #58 (466 mg, 97%); LC-MS: m/z 318.2 [M+H+], 339.2 [M+Na+], tiempo de retención = 0.56 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de) d 9.53 (br s, 1H), 8.48 (br s, 1 H), 8.11 (br dd, J=5.7, 5.6 Hz, 1 H), 7.23-7.30 (m, 4H), 7.14-7.21 (m, 1 H), 3.58 (dd, J=7.5, 3.9 Hz, 1 H), 3.50 (dd, J=13.7, 6.3 Hz, 1H), 3.34 (s, 3H), 3.21-3.29 (br m, 1 H), 3.18 (dd, J=13.8, 5.0 Hz, 1 H), 3.04-3.13 (br m, 2H), 2.42-2.50 (m, 1 H), 1.56-1.89 (m, 4H), 1.04 (d, J=6.9 Hz, 3H), 0.71-0.91 (m, 4H).
Etapa 4. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbon¡l]-2- metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo- 3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-¡l}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#59). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #32 (550 mg, 0.902 mmol, 1 eq.), #58 (350 mg, 0.992 mmol, 1.1 eq.) diclorometano (10 mL, 0.08 M) y N,N-dimetilformamida (2 ml_), HATU (446 mg, 1.17 mmol, 1.3 eq.) y trietilamina (0.503 mL, 3.61 mmol, 4 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano), produciendo #59 (618 mg, 69%) como un sólido blanquecino. LC-MS: m/z 908.7 [M+H+], 930.7 [M+Na+], tiempo de retención = 1.07 minutos; HPLC (Protocolo B a 45°C): m/z 908.5 [M+H+], tiempo de retención = 8.721 minutos (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.89 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), [4.49 (dd, J=8.5, 7.8 Hz) y 4.59 (dd, J=8.7, 6.9 Hz), total 1H], 4.18-4.26 (m, 3H), 3.93-4.01 (br m, 1H), 3.23 y 3.26 (2 s, total 3H), 3.16 y 3.16 (2 s, total 3H), 2.91 y 3.05 (2 br s, total 3H), 1.36 y 1.37 (2 br s, total 3H), 1.30 y 1.32 (2 br s, total 3H), [1.00 (d, J=6.7 Hz) y 1.02 (d, J=6.6 Hz), total 3H], 0.67-0.78 (m, 7H).
Etapa 5. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[( 1R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 -fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida (#60). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #59 (605 mg, 0.666 mmol, 1 eq.) diclorometano (10 mL, 0.067 M) y dietilamina (10 mL) se sintetizó #60 (379 mg, 83%); HPLC (Protocolo A a 45 C) m/z 685.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.072 minutos; 1H R N (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.03 (br d, J=9.6 Hz) y 8.07 (br d, J=9.4 Hz), total 1H], [7.74 (br dd, J=7, 4 Hz) y 7.99 (br dd, J=5.9, 5.7 Hz), total 1 H], 7.20-7.27 (m, 4H), 7.11-7.17 (m, 1 H), [4.49 (dd, J=9, 7 Hz) y 4.58 (dd, J=9, 7.5 Hz), total 1 H], 3.96-4.04 (br m, 1 H), 3.24 y 3.27 (2 s, total 3H), 3.18 y 3.19 (2 s, total 3H), 2.93 y 3.07 (2 br s, total 3H), 1.20 y 1.21 (2 s, total 3H), 1.12 y 1.14 (2 s, total 3H), [1.00 (d, J=6.7 Hz) y 1.03 (d, J=6.7 Hz), total 3HJ.
Preparación de 2-Metilalanil-N-f(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-rn R,2R)-3-(r2-(cicloheDta-2.4.6-trien-1-il)et¡namino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡n-N-metil-L-vanilam¡da (#66) Etapa 1. Síntesis de ciclohepta-2,4,6-trien-1-ilacetonitrilo (#61). A una solución de acetonitrilo anhidro (3.12 ml_, 56.2 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (281 ml_, 0.2 M) se agregó litio diisopropilamina (1.8 M en heptano/etilbenceno/tetrahidrofurano, 31.2 mL, 56.2 mmol, 1 eq.) a -78°C. Después de 20 minutos a -78°C, se agregó tetrafluoroborato de tropillo (10 g, 56 mmol, 1 eq.). Después de 10 minutos, la reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue diluido con acetato de etilo y lavado con agua. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo a fin de proporcionar un aceite de color café, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% acetato de etilo en heptano) a fin de proporcionar #61 (1.88 g, 25%) como un aceite de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 6.69-6.71 (m, 2H), 6.27-6.32 (m, 2H), 5.285.33 (m, 2H), 2.61 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.26-2.34 (m, 1 H).
Etapa 2. Síntesis de 2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etanamina (#62). A una suspensión de hidruro de litio-aluminio (911 mg, 24.0 mmol, 1.4 eq.) en éter dietílico anhidro (75 mL, 0.23 M) a 0'C se agregó lentamente a través de goteo durante 15 minutos, una solución de #61 (2.25 g, 17.2 mmol, 1 eq.) en éter dietílico (15 mL). La reacción fue calentada hasta temperatura ambiente. Después de 5 horas, la reacción fue enfriada hasta 0°C y apagada mediante la adición de agua (1 mL), después filtrada a través de una pequeña almohadilla de Celite y lavada con metanol. El filtrado fue secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado in vacuo a fin de proporcionar #62 (1.683 g, 73%) como un aceite de color dorado. LC-MS: m/z 136.1 [M+H+], tiempo de retención = 0.23 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 6.64-6.67 (m, 2H), 6.16-6.21 (m, 2H), 5.16-5.21 (m, 2H), 2.84-2.89 (m, 2H), 1.86-1.92 (m, 2H), 1.62-1.70 (m, 1 H).
Etapa 3. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-carboxilato (#63). A una solución de #11 (3.57 g, 12.4 mmol, 1 eq.) en diclorometano (100 ml_, 0.1 M) y ?,?-dimetilformamida (4 ml_) se agregó HATU (5.36 g, 13.7 mmol, 1 .1 eq.). Después de 20 minutos, se agregó trietilamina (5.20 ml_, 37.3 mmol, 3 eq.), seguida por #62 (1.68 g, 12.4 mmol, 1 eq.), y la mezcla fue sometida a agitación durante 18 horas. La reacción fue concentrada ¡n vacuo y el residuo fue absorbido en acetato de etilo y lavado con agua (50 ml_). La capa acuosa fue re-extraída con acetato de etilo (3 veces) y las capas orgánicas combinadas fueron secadas, filtradas, y concentradas in vacuo a fin de proporcionar un aceite de color café, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 100% acetato de etilo en heptano) a fin de proporcionar #63 (2.95 g, 59% de rendimiento) como un aceite viscoso. LC-MS: m/z 405.4 [M+H+], 427.4 [M+Na+], tiempo de retención = 0.75 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 6.63-6.68 (m, 2H), 6.16-6.23 (m, 2H), 5.19 (br dd, J=9.0, 5.8 Hz, 2H), 3.51-3.63 y 3.71-3.90 (2 br multipletos, total 3H), 3.42 (s, 3H), 3.18-3.29 y 3.34-3.47 (2 br multipletos, total 3H), 2.27-2.45 (br m, 1H), 1.6-2.00 (m, 7H), 1.47 y 1.50 (2 br s, total 9H), 1.16-1.29 (br m, 3H).
Etapa 4. Síntesis de (2R,3R)-N-[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de clorhidrato (#64) El intermediario #63 (400 mg, 0.989 mmol, 1 eq.) fue tratado con una 4 M solución de ácido clorhídrico en dioxano (10 mL, 40 mmol, 40 eq.). Después de 1 hora, la mezcla de reacción fue concentrada ¡n vacuo y el residuo fue absorbido en diclorometano y lavado con 1 M solución de hidróxido de sodio. La capa acuosa fue re-extraída con diclorometano y las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de sodio, filtradas, y concentradas in vacuo a fin de proporcionar #64 (301 mg, cuantitativo) como un aceite de color café, el cual empezó a solidificarse lentamente en reposo. LC-MS: m/z 305.3 [M+hf], tiempo de retención = 0.54 minutos; HPLC (Protocolo G): tiempo de retención = 4.848 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3), señales características: d 6.64-6.67 (m, 2H), 6.16-6.22 (m, 2H), 6.08-6.14 (br m, 1 H), 5.16-5.22 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.31 (dd, J=6.3, 4.5 Hz, 1 H), 2.98-3.04 (m, 1 H), 2.94 (ddd, J=10.5, 7.2, 5.6 Hz, 1 H), 2.81 (ddd, J=10.5, 7.7, 6.7 Hz, 1 H), 2.57 (qd, J=7.1 , 4.5 Hz, 1 H), 1.90-1.97 (m, 2H), 1.49-1.55 (m, 1 H), 1.18 (d, J=7.1 Hz, 3H).
Etapa 5. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#65). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #32 (678 mg, 0.937 mmol, 1 eq.) en diclorometano (9.37 mL, 0.1 M), la amina #64 (300 mg, 0.985 mmol, 1.1 eq.), HATU (427 mg, 1.12 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (494 uL, 2.81 mmol, 3 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano), produciendo #65 (546 mg, 65%) como un sólido. LC-MS: m/z 896.7 [M+H 1 , 918.7 [M+Na+], tiempo de retención = 1.06 minutos.
Etapa 6. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#66). A una solución de #65 (540 mg, 0.603 mmol, 1 eq.) en diclorometano (10 ml_, 0.06 M) se agregó trietilamina (10 ml_) y la mezcla de reacción fue sometida a agitación durante 2 horas. La mezcla fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #66 (347 mg, 85%) como un sólido incoloro. HPLC (Protocolo A a 45 C): m/z 674.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.015 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.03 (br d, J=9 Hz) y 8.05 (br d, J=9 Hz), total 1H], [7.77 (br dd, J=5.5, 5.5 Hz) y 7.98 (br dd, J=5.5, 5.5 Hz), total 1 H], 6.54-6.65 (m, 2H), 6.10-6.19 (m, 2H), 5.11-5.19 (m, 2H), [4.48 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.54 (dd, J=9, 7.5 Hz), total 1 H], 3.944.04 (br m, 1 H), 3.26 y 3.29 (2 s, total 3H), 3.17 y 3.19 (2 s, total 3H), 2.93 y 3.06 (2 br s, total 3H), 1.20 y 1.21 (2 s, total 3H), 1.12 y 1.13 (2 s, total 3H), [1.04 (d, J=6.8 Hz) y 1.07 (d, J=6.7 Hz), total 3H].
Preparación de 2-Metilalanil-N-r(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-f(1 R.2R)-3- íí(1S)-1-carboxi-2-feniletillamino)-1-metoxi-2-^ metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N-metil-L-valinamida (#69) y 2-metilalanil-N- f(3R.4S.5S)-3-metox¡-1-((2S)-2-f(1 R.2R)-1-metoxi-3-(f(2S)-1-metoxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il|amino}-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1 -il)-5-metil-1 -oxoheptan- 4-ill-N-metil-L-valinamida (#70) Etapa 1. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)- pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato, sal de clorhidrato (#67). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #37 (2.39 g, 5.33 mmol, 1 eq.), dioxano (10 mL, 0.53 M) y una solución de 4 M ácido clorhídrico en dioxano (10 mL, 40 mmol, 7.5 eq.) se sintetizó #67 (2.21 g) como un sólido de color blanco, el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC- MS: m/z 349.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.53 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 9.45-9.58 (br m, 1H), 8.63 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 8.51-8.62 (br m, 1 H), 7.25-7.33 (m, 4H), 7.18-7.25 (m, 1 H), 4.50 (ddd, J=10.8, 8.1 , 4.5 Hz, 1 H), 3.65 (s, 3H), 3.54 (dd, J=6.8, 4.5 Hz, 1 H), 3.20 (s, 3H), 3.11 (dd, J=13.8, 4.5 Hz, 1 H), 2.99-3.14 (br m, 3H), 2.89 (dd, J=13.8, 10.9 Hz. 1 H), 2.44-2.50 (m, 1 H, asumido; parcialmente oscurecido por solvente pico), 1.77-1.89 (m, 1 H), 1.60-1.73 (m, 2H), 1.46-1.57 (m, 1 H), 1.05 (d, J=6.8 Hz, 3H).
Etapa 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#68). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #32 (353 mg, 0.488 mmol, 1 eq.) en diclorometano (10 ml_, 0.04 M), amina #67 (271 mg, <0.588 mmol, 1.3 eq.), HATU (223 mg, 0.586 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (238 pL, 1.71 mmol, 3.5 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 40% acetona en heptano), obteniendo #68 (404 mg, 88% en dos etapas) como un sólido. LC-MS: m/z 940.7 [M+H+], 962.7 [ +Na+], tiempo de retención = 1.04 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.022 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.25 (br d, J=8 Hz) y 8.48 (br d, J=8 Hz), total 1H], 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.67-7.75 (m, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.31-7.36 (m, 2H), 7.14-7.24 (m, 5H), 4.43-4.69 (m, 3H), 4.17-4.26 (m, 3H), 3.91-3.99 (br m, 1 H), 3.63 y 3.65 (2 s, total 3H), 3.19 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.14 y 3.15 (2 s, total 3H), 2.90 y 2.99 (2 br s, total 3H), 1.36 y 1.37 (2 br s, total 3H), 1.30 y 1.32 (2 s, total 3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz) y 1.06 (d, J=6.6 Hz), total 3H].
Etapa 3A. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#69). A una solución de #68 (143 mg, 0.152 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (5 mL, 0.02 M) se agregó una solución de hidróxido de litio (9.10 mg, 0.378 mmol, 2.5 eq.) en agua (3 mL). Después de 5 horas, la reacción fue concentrada in vacuo, formada como azeotropo tres veces con heptano, disuelta en dimetil sulfóxido (2.2 mL) y purificada mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar #69 (56 mg, 52%). HPLC (Protocolo A a 45 C): 704.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.623 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 8.08-8.22 y 8.37-8.49 (2 m, total 5H), 7.12-7.28 (m, 5H), 3.18, 3.20 y 3.24 (3 s, total 6H), 2.95 y 3.04 (2 br s, total 3H), 1.52 y 1.53 (2 s, total 3H), 1.39 y 1.41 (2 s, total 3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz) y 1.05 (d, J=6.6 Hz), total 3H], 0.74-0.81 (m, 3H).
Etapa 3B. Síntesis de 2-metilalan¡l-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#70). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #68 (240 mg, 0.255 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0.026 M) y dietilamina (10 mL) se sintetizó #70 (120 mg, 65%) como una mezcla de sólido/cristal de color blanco después de la cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano). HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 762.7 [M+H+], 740.4 [M+Na+], tiempo de retención = 6.903 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.26 (d, J=8.1 Hz) y 8.49 (d, J=8.3 Hz), total 1 H], [8.03 (d, J=9.5 Hz) y 8.07 (d, J=9.5 Hz), total 1H], 7.14-7.27 (m, 5H), 3.63 y 3.67 (2 s, total 3H), 3.16, 3.18, 3.20 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.92 y 3.01 (2 br s, total 3H), 1.20 y 1.22 (2 s, total 3H), 1.12 y 1.13 (2 s, total 3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz) y 1.06 (d, J=6.7 Hz), total 3H], 0.74-0.80 (m, 3H).
Preparación de N2-f(3-Aminooxetan-3-il)carbon¡n-N-((3R.4S.5S)- 3-metoxi-1-r(2S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-f(2-feniletil)amino1propil)pirrol¡din-1-ill-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#75) Etapa 1. Síntesis de ácido 3-[(ter-butoxicarbonil)amino]oxetan-3- carboxílico (#71). Al ácido 1-amino]oxetan-3-carboxílico (1.00 g, 8.54 mmol, 1 eq.) en dioxano (15 mL, 0.5 M) se agregó una solución de hidróxido de sodio (1.55 g, 38.7 mmol, 4.5 eq.) en agua (15 mL) seguida por di-ter-butil dicarbonato (2.09 g, 9.29 mmol, 1.1 eq.). Se formó una espuma de color blanco. La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y después concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo y lavado con solución 1 M de ácido clorhídrico acuosa y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo para dar #71 (633 mg, 38%) como un sólido de color blanco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros: d 12.93 (br s, 1 H), 7.59 y 7.93 (2 br s, total 1 H), 4.71-4.78 (m, 2H), 4.47 (d, J=6.4 Hz, 2H), 1.30 y 1.38 (2 s, total 9H).
Etapa 2. Síntesis de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1 -il]-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#72). A #@5 (9.47 g, 18.0 mmol, 1 eq.) y #24 (5.90 g, 18.0 mmol, 1 eq.) en diclorometano (250 mL, 0.072 M) se agregó diisopropiletilamina (9.52 mL, 54.2 mmol, 3 eq.) y HATU (8.49 g, 21.7 mmol, 1.2 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y después concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (300 mL) y fue lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuosa (2 x 100 mL) y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en diclorometano (250 mL) y filtrado. El filtrado fue concentrado in vacuo sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano) a fin de proporcionar #72 (11.61 g, 81 %) como un sólido de color amarillo claro. LC-MS: m/z 797.6 [M+H+], 819.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.06 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 3.26 y 3.28 (2 s, total 3H), 3.18 y 3.20 (2 s, total 3H), 2.95 y 3.10 (2 br s, total 3H), 1.01-1.09 (m, 3H), 0.67-0.78 (m, 3H).
Etapa 3. Síntesis de N-{(3R,45,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1 R,2R)- 1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1 -il]-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#73). A #72 (5.16 g, 6.47 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (10 ml_, 0.65 M) se agregó dietilamina (10 mL). Después de 2 horas, la reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #73 (2414 mg, 65%). LC-MS: m/z 576.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.64 minutos; H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.80-7.88 y 7.99-8.10 (2 m, total 1 H), 7.14-7.31 (m, 5H), 3.17 y 3.18 (2 s, total 3H), 2.87 y 3.03 (2 br s, total 3H), 1.02-1.08 (m, 3H).
Etapa 4. Síntesis de N2-({3-[(ter-butox¡carbonil)amino]oxetan-3-yl}carbonil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1 -il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#74). A #73 (100 mg, 0.174 mmol, 1 eq.) en diclorometano (4 mL, 0.04) y N,N-dimetilformamida (0.5 mL) se agregó #71 (45.2 mg, 0.208 mmol, 1.2 eq.), seguido por diisopropiletilamina (92 µ?, 0.521 mmol, 3 eq.) y HATU (102 mg, 0.260 mmol, 1.5 eq.). Después de 16 horas, la reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue absorbido en acetato de etilo (6 mL) y lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuosa (2 x 2 mL) y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El material crudo fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar #74 (140 mg), el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS: m/z 774.7 [M+H+], 796.6 [M+Na+], tiempo de retención = 0.91 minuto.
Etapa 5. Síntesis de N2-[(3-aminooxetan-3-il)carbonil]-N- {(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -[(2S)-2-{(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#75). A #74 (140 mg, <0.181 mmol, 1 eq.) en diclorometano (3 mL, 0.06 M) se agregó ácido trifluoroacético (1 mL). Después de 1 hora, la reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue absorbido en acetato de etilo (6 mL) y lavado con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada (2 mL) y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. La mitad del material crudo fue purificada mediante cromatografía de fase inversa (Método B) para dar #75 (16 mg, 26%, en dos etapas). LC-MS: m/z 674.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.68 minutos; HPLC (Protocolo A a 45 C): m/z 674.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.128 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.80-7.87 y 8.02-8.07 (2 m, total 2H), 7.23-7.30 (m, 2H), 7.14-7.22 (m, 3H), 4.28-4.33 (m, 2H), 3.96-4.04 (br m, 1 H), 3.17 y 3.19 (2 s, total 3H), 2.96 y 3.10 (2 br s, total 3H), [1.04 (d, J=7.0 Hz) y 1.07 (d, J=6.6 Hz), total 3H].
Preparación de N.2-Dimetilalanil-N-[(3R.4S,5S)-3-metoxi-1-((2S)- 2- f(1 R,2R)-1-metoxi-3-{í(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-illamino)-2-metil- 3- tioxopropillpirrolid¡n-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamid (#79) y N,2-dimet¡lalanil-N-f(3R.4S.5S)-1-{(2S)-2-f(1 R.2R)-3-í r(1S)-1-carboxi-2-feniletil1amino)-1-metoxi-2-metil-3-tioxopropillpirrolid¡n-1-il)-3-metoxi-5-m oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#80) Etapa 1. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-R9H-fluoren-9-ilrnetoxi)carbonil-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropantioil}-L-fenilalaninato (#76).
De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #@5 (260 mg, 0.648 mmol, 1 eq.), #39 (340 mg, <0.629 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0.065 M), HATU (296 mg, 0.778 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (339 µ?_, 1.94 mmol, 3 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 40% acetona en heptano) para dar #76 (466 mg, 83% en dos etapas) como un sólido. LC-MS: m/z 871.5 [M+H+], 893.5 [M+Na+], tiempo de retención = 1.10 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.249 minutos (pureza > 99%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.19 (br d, J=7.4 Hz) y 10.49 (br d, J=7.8 Hz), total 1 H], 7.89 (br d, J=7.4 Hz, 2H), 7.68-7.75 (m, 2H), 7.54- 7.60 (m, 1 H), 7.41 (br dd, J=7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.28-7.36 (m, 2H), 7.15-7.28 (m, 5H), [5.20 (ddd, J=10.9, 7.3, 4.4 Hz) y 5.34-5.43 (m), total 1 H], 3.65 y 3.69 (2 s, total 3H), 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.17 (br s, 3H), 2.93 y 2.98 (2 br s, total 3H), [1.15 (d, J=6.6 Hz) y 1.18 (d, J=6.6 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropantioil}-L-fenilalaninato (#77). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #76 (460 mg, 0.528 mmol, 1 eq.) tetrahidrofurano (8 mL, 0.07 M) y dietilamina (8 mL) se sintetizó #77 (399 mg), el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional; LC-MS m/z 649.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.73 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales de producto características: d [10.20 (d, J=7.4 Hz) y 10.49 (d, J=7.4 Hz), total 1H], 7.15-7.28 (m, 5H), [5.20 (ddd, J=10.9, 7.2, 4.5 Hz) y 5.34-5.42 (m), total 1 H], 3.65 y 3.68 (2 s, total 3H), 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.15 y 3.15 (2 s, total 3H), 2.83 y 2.88 (2 br s, total 3H), [1.15 (d, J=6.6 Hz) y 1.18 (d, J=6.6 Hz), total 3H].
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-1-oxo-3-fenílpropan-2-il]amino}-2-metil-3-t¡oxopropil]pirrol¡din-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#78). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #77 (399 mg, <0.52 mmol, 1 eq.), N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-N,2-dimetilalanina (213 mg, 0.628 mmol, 1.2 eq.), diclorometano (5 mL, 0.1 M), HATU (239 mg, 0.628 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (282 µ?_, 1.62 mmol, 3.1 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano), proporcionando #78 (231 mg, 46% en dos etapas). LC-MS: m/z 970.7 [M+H+], 992.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.11 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.260 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.19 (d, J=7.4 Hz) y 10.47 (d, J=7.8 Hz), total 1 H], 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.61-7.67 (m, 2H), 7.41 (br dd, J=7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.14-7.36 (m, 8H), [5.20 (ddd, J=11 ,7, 5 Hz) y 5.38 (ddd, J=11 , 8, 4 Hz), total 1H], [4.41 (dd, J=8.6, 8.4 Hz) y 4.46 (dd, J=8.2, 8.2 Hz), total 1 H], 3.65 y 3.68 (2 s, total 3H), 3.23 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.13 (br s, 3H), 2.88 y 2.93 (2 br s, total 3H), 2.84 y 2.85 (2 s, total 3H), 1.31 y 1.32 (2 s, total 3H), [1.15 (d, J=6.6 Hz) y 1.18 (d, J=6.4 Hz), total 3H].
Etapa 4A. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1- {(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-l-oxo-3-fenilpropan-2-il]am¡no}-2-metil-3-tioxoprop¡l]pirrolidin-1-¡l}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-val¡namtí (#79). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #78 (223 mg, 0.230 mmol, 1 eq.), diclorometano (6 mL, 0.04 M) y dietilamina (6 mL) se sintetizó #79 (146 mg, 85%) como un sólido de color blanco después de la cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 5% metanol en heptano después 0% hasta 10% metanol en diclorometano). HPLC (Protocolo A a 45 C): 749.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.315 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.20 (d, J=7.6 Hz) y 10.50 (d, J=8.0 Hz), total 1 H], 7.79-7.88 (m, 1 H), 7.15-7.29 (m, 5H), [5.20 (ddd, J=11 , 7, 4 Hz) y 5.38 (ddd, J=11 , 8, 4 Hz), total 1H], [4.50 (dd, J=8.8, 8.6 Hz) y 4.56 (dd, J=9, 8 Hz), total 1 H], 3.65 y 3.69 (2 s, total 3H), 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.16 (br s, 3H), 2.93 y 2.97 (2 br s, total 3H), 2.10 y 2.11 (2 s, total 3H).
Etapa 4B. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#80). A una solución de #78 (170 mg, 0.175 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (3 mL, 0.04 M) se agregó una solución de hidróxido de litio (12.6 mg, 0.525 mmol, 3 eq.) en agua (1.5 mL). Después de someter la mezcla a agitación durante la noche, se removió el solvente in vacuo. El residuo fue formado como azeotropo tres veces con heptano. El residuo fue diluido después con sulfóxido de dimetilo (2.2 mL) y purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para obtener #80 (74 mg, 58%) como un sólido. LC-MS: m/z 734.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.69 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C): 734.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.903 minutos (pureza > 96%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 12.9 y 13.1 (2 v br s, total 1 H), [10.12 (d, J=7.4 Hz) y 10.46 (d, J=7.8 Hz), total 1 H], 8.77-8.89 (br m, 2H), [8.47 (d, J=8.6 Hz) y 8.51 (d, J=8.6 Hz), total 1 H], 7.21-7.29 (m, 4H), 7.14-7.21 (m, 1 H), [5.16-5.23 (m) y 5.38 (ddd, J=11.3, 8.2, 3.9 Hz), total 1 H], [4.51 (dd, J=9.0, 9.0 Hz) y 4.57 (dd, J=9.4, 8.6 Hz), total 1 H], 3.24 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.18 y 3.19 (2 s, total 3H), 2.96 y 3.00 (2 br s, total 3H), 1.51 y 1.53 (2 s, total 3H), 1.40 y 1.42 (2 s, total 3H), 1.14-1.19 (m, 3H), 0.74-0.81 (m, 3H).
Preparación de N.2-Dimetilalanil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1 -{ (2S)-2-r(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-ÍÍMS)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-il)etil1amino}-3-tioxopropinpirrolidin-1 -il>-5-metil-1 -oxoheptan-4-in-N-metil-L-vanilamida (#84) Etapa 1. Síntesis de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N- [(3R,4S,5S)-3-metox¡-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-met¡l-3-{[(1 S)-2-fen¡ (1 ,3-tiazol-2-il)et¡l]amino}-3-tioxoprop N-metil-L-valinamida (#81). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #@5 (620 mg, 1.18 mmol, 1 eq.) diclorometano (10 ml_, 0.1 M), amina #18 (604 mg, 1.42 mmol, 1.2 eq.), diisopropiletilamina (618 uL, 3.54 mmol, 3 eq.) y HATU (539 mg, 1.42 mmol, 1.2 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano) para dar #81 (737 mg, 58%). HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.235 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.81 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.89 (d, J=7.6 Hz, 2H), [7.80 (d, J=3.3 Hz) y 7.83 (d, J=3.1 Hz), total 1HJ, 7.70-7.75 (m, 2H), [7.64 (d, J=3.1 Hz) y 7.68 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.55-7.60 (m, 1H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.13-7.35 (m, 7H), [6.31 (ddd, J=11 , 8, 4.5 Hz) y 6.40-6.48 (m), total 1 H], 3.23 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.17 y 3.22 (2 s, total 3H), 2.94 y 3.01 (2 br s, total 3H), [1.14 (d, J=6.4 Hz) y 1.17 (d, J=6.2 Hz), total 3H].
Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il]etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#82). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #81 (733 mg, 0.818 mmol, 1 eq.) en diclorometano (7 mL, 0.1 M) y dietilamina (7 ml_) se sintetizó #82 (670 mg), el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS: m/z 674.5 [M+H+], tiempo de retención = 1.29 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales de producto características: d [10.55 (br d, J=8 Hz) y 10.84 (br d, J=8 Hz), total 1 H], [7.64 (d, J=3.1 Hz) y 7.69 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.13-7.33 (m, 5H), 6.27-6.35 y 6.38-6.47 (2 m, total 1H), 3.23 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.15 y 3.19 (2 s, total 3H), 2.84 y 2.91 (2 br s, total 3H).
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetox¡)carbonil]-N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#83). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #82 (670 mg, <0.818 mmol, 1 eq.), diclorometano (5 ml_, 0.16 M), N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-dimetilalanina (304 mg, 0.896 mmol, 1.1 eq.), HATU (372 mg, 0.978 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (440 uL, 2.53 mmol, 3.1 eq.) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 30% acetona en heptano) para dar #83 (556 mg, 69% en dos etapas). LC-MS: m/z 994.7 [M+H+], tiempo de retención = 0.69 minutos; HPLC (Protocolo C): tiempo de retención = 9.333 minutos (pureza > 98%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.53 (br d, J=8 Hz) y 10.80 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.86-7.91 (m, 2H), [7.80 (d, J=3.3 Hz) y 7.82 (d, J=3.2 Hz), total 1H], [7.64 (d, J=3.2 Hz) y 7.68 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.62-7.66 (m, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.28-7.36 (m, 5H), 7.19-7.26 (m, 2H), 7.12-7.17 (m, 1 H), [6.31 (ddd, J=11 , 8, 4.5 Hz) y 6.44 (ddd, J=11 , 8.5, 4.5 Hz), total H], [4.42 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.48 (dd, J=8, 8 Hz), total 1 H], 3.22 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.13 y 3.17 (2 s, total 3H), 2.89 y 2.97 (2 br s, total 3H), 2.84 y 2.85 (2 s, total 3H), [1 .13 (d, J=6.4 Hz) y 1.16 (d, J=6.4 Hz), total 3HJ.
Etapa 4. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etin^ 3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#84). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #83 (552 mg, 0.555 mmol, 1 eq.) en diclorometano (10 ml_, 0.05 M) y dietilamina (10 ml_) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue diluido con metanol, concentrado in vacuo sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #84 (406 mg, 95%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 772.8 [M+H+], tiempo de retención = 1.35 minutos; HPLC (Protocolo A): 774.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.390 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [10.54 (br d, J=8 Hz) y 10.81 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 7.78-7.84 (m, 2H), [7.65 (d, J=3.1 Hz) y 7.69 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.29-7.34 (m, 2H), 7.20-7.28 (m, 2H), 7.14-7.19 (m, 1 H), 6.27-6.35 y 6.40-6.48 (2 m, total 1 H), [4.51 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.57 (dd, J=9, 8 Hz), total 1 H], 3.24 y 3.25 (2 s, total 3H), 3.16 y 3.21 (2 s, total 3H), 2.94 y 3.00 (2 br s, total 3H), 2.09 y 2.10 (2 s, total 3H), 1.08 y 1.09 (2 s, total 3H), 0.73-0.80 (m, 3H).
N.2-Dimetilalanil-N-r(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-f(1 R.2R)-1- metoxi-2-metil-3-oxo-3- í í ( 1 S)-2-f en i I- 1 -( 1 , 3-tiazol-2- il)etil1amino)propil1pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-vali (#88) Etapa 1. Síntesis de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida (#85). A una mezcla de #@5 (5.48 g, 10.4 mmol, 1 eq.) y #19 (3.90 g, 10.4 mmol, 1 eq.) en diclorometano (50 mL, 0.2M) se agregó diisopropiletilamina (5.51 mL, 31.3 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (4.91 g, 12.5 mmol, 1.2 eq.). Después de ser sometida a agitación durante la noche, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (100 mL) y lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuosa (2 x 30 mL) y con salmuera (30 mL). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en diclorometano y filtrado; el filtrado fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente; 0% hasta 50% acetona en heptano) para obtener #85 (7.20 g, 78%) como un sólido. LC-MS: m/z 880.6 [M+H+], tiempo de retención = 1.07 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)- 1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#86). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #85 (5.00 g, 5.68 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (10 ml_, 0.56 M) y dietilamina (3 mL) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #86 (2.952 g, 79%) como un sólido. LC-MS: m/z 658.5 [M+H+], 680.5 [M+Na+] tiempo de retención = 0.66 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8.4 Hz) y 8.90 (br d, J=8.8 Hz), total 1 H], [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.80 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.3 Hz) y 7.66 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.12-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.2, 8.4, 4.2 Hz) y 5.54 (ddd, J=11.9, 8.9, 4.0 Hz), total 1 H], 3.15, 3.19, 3.20 y 3.26 (4 s, total 6H), 2.86 y 2.98 (2 br s, total 3H), [1.06 (d, J=6.6 Hz) y 1.11 (d, J=6.6 Hz), total 3H].
Etapa 3. Síntesis de N-(ter-butoxicarbonil)-N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil] amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#87). A una mezcla de #86 (80.3 mg, 0.122 mmol, 1 eq.) en diclorometano (4 mL, 0.03 M) se agregó N-(ter-butoxicarbonil)-N,2- dimetilalanina (29.1 mg, 0.134 mmol, 1.1 eq.) seguida por diisopropiletilamina (64 µ!_, 0.365 mmol, 3 eq.) y HATU (71.7 mg, 0.183 mmol, 1.5 eq.). Después de ser sometida a agitación durante la noche, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (6 mL) y lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuosa (2 x 2 mL) y con salmuera. El solvente orgánico fue secado sobre sulfato de sodio, filtrado, y concentrado in vacuo. El residuo fue absorbido en diclorometano y filtrado; el filtrado fue concentrado in vacuo sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano) para obtener #87 (58 mg, 50%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 857.7 [M+H+], 879.7 [M+Na+], tiempo de retención = 0.99 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8 Hz) y 8.87 (br d, J=9 Hz), total 1 H], [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.80 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.2 Hz) y 7.66 (d, J=3.2 Hz), total 1 H], 7.13-7.31 (m, 5H), [6.95 (br d, J=8 Hz) y 7.06 (br d, J=8 Hz), total 1 H], 5.35-5.42 y 5.51 -5.58 (2 m, total 1 H), 3.15, 3.19, 3.20 y 3.26 (4 s, total 6H),2.94 y 3.03 (2 br s, total 3H), 2.83 y 2.84 (2 s, total 3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz) y 1.11 (d, J=6.7 Hz), total 3HJ.
Etapa 4. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#88). A una mezcla de #87 (58 mg, 0.068 mmol, 1 eq.) en diclorometano (8 mL) se agregó ácido trifluoroacético (2 mL). Después de ser sometida a agitación durante ia noche, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (10 mL), lavado con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada, secado sobre sulfato de sodio, filtrado, y concentrado in vacuo para dar #88 (52 mg, cuantitativo). LC-MS 757.6 [M+H+], tiempo de retención = 0. 69 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.64 (br d, J=8.6 Hz) y 8.87 (br d, J=8.6 Hz), total 1H], 7.80-7.85 (m, 1H), [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.80 (d, J=3.1 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.1 Hz) y 7.66 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.20-7.31 (m, 4H), 7.13-7.19 (m, 1 H), [5.39 (ddd, J=11 , 8.5, 4 Hz) y 5.49-5.56 (m), total 1H], [4.51 (dd, J=9, 8 Hz) y 4.61 (dd, J=9, 8 Hz), total 1 H], 3.16, 3.20, 3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.94 y 3.03 (2 br s, total 3H), 2.10 y 2.10(2 s, total 3H), 1.16 (br s, 3H), 1.04-1.12 (m, 6H), 0.72-0.80 (m, 3H).
Preparación de N2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1 -í (2S)-2-f(1 R.2F0-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3- (1 S)-2-fenil-1 -(1.3-tiazol-2-il)etillam¡no>propillPÍrrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#95) Etapa 1. Síntesis de ácido 3-{[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbonil]amíno}-2,2-dimetilpropanóico (#93). A un ácido 3-amino-2,2- dimetilpropanóico, sal de clorhidrato (250 mg, 1.63 mmol, 1 eq.) en diclorometano (4 mL, 0.4 M) se agregó diisopropiletilamina (859 pL, 4.88 mmol, 3 eq.) seguido por cloruro de (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo (473 mg, 1.79 mmol, 1.1 eq.) La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y concentrada después in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (3 mL) y lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuoso (2 x 1 mL) y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 100% acetato de etilo en heptano) para dar #93 (250 mg, 45%) como un aceite. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 12.22 (s, 1 H), 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.72 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.27-7.35 (m, 3H), 4.18-4.30 (m, 3H), 3.16 (d, J=6.2 Hz, 2H), 1.05 (s, 6H).
Etapa 2. Síntesis de N2-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#94). A #86 (100 mg, 0.152 mmol, 1 eq.) en diclorometano (4 mL, 0.038 M) y N.N-dimetilformamida (0.5 mL) se agregó #93 (51.6 mg, 0.152 mmol, 1 eq.) seguido por diisopropiletilamina (80.0 pL, 0.457 mmol, 3 eq.) y HATU (89.8 mg, 0.229 mmol, 1.5 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y después concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (6 mL) y fue lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuosa (2 x 2 mL) y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en diclorometano (250 mL) y filtrado; el filtrado fue concentrado in vacuo sobre sílice y purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano) a fin de proporcionar #94 (90 mg, 60%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 979.8 [M+H+], 1002.7 [M+Na+], tiempo de retención = 1.15 minutos; H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales de producto características: d [8.64 (br d, J=8.6 Hz) y 8.86 (br d, J=8.6 Hz), total 1 H], 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz) y 7.79 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.67-7.73 (m, 2H), [7.63 (d, J=3.3 Hz) y 7.65 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 6.87-6.95 (m, 1 H), [5.39 (ddd, J=11 , 8, 4 Hz) y 5.52 (ddd, J=11.5, 9, 4 Hz), total 1 H], [4.44 (dd, J=8.4, 8.4 Hz) y 4.55 (dd, J=8.4, 8.4 Hz), total 1 H], 3.16, 3.20,3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.96 y 3.06 (2 br s, total 3H), 0.69-0.77 (m, 3H).
Etapa 3. Síntesis de N2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,45,55)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#95). A #94 (86 mg, 0.088 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (2 mL, 0.04 M) se agregó dietilamina (10 mL). Después de ser sometida a agitación durante la noche, la reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar #95 (55 mg, 72%). LC-MS: m/z 757.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.74 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [8.66 (br d, J=8 Hz) y 8.92 (br d, J=9 Hz), total 1 H], [7.91 (br d, J=8 Hz) y 7.97 (br d, J=9 Hz), total 1 H], [7.78 (d, J=3.3 Hz) y 7.81 (d, J=3.1 Hz), total 1 H], 7.65-7.74 (br m, 3H), [7.63 (d, J=3.3 Hz) y 7.67 (d, J=3.3 Hz), total 1 H], 7.12-7.31 (m, 5H), [5.35-5.42 (m) y 5.45-5.52 (m), total 1 H], [4.44 (dd, J=9, 9 Hz) y 4.55 (dd, J=9, 9 Hz), total 1H], 3.17, 3.20, 3.22 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.96 y 3.05 (2 br s, total 3H), 1.25 y 1.25 (2 s, total 3H), 1.14 y 1.15 (2 s, total 3H), [1.06 (d, J=6.6 Hz) y 1.10 (d, J=6.4 Hz), total 3H], 0.72-0.80 (m, 3H).
Preparación de N2-(3-Amino-2.2-dimetilpropanoil)-N-((3R.4S.5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-í(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-fenNet¡l)aminolpropil)pirrolidin-1-in-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#97) Etapa 1. Síntesis de N2-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#96). A #73 (100 mg, 0.174 mmol, 1 eq.) en diclorometano (4mL, 0.04 M) y N,N-dimetilformamida (0.5 mL) se agregó #93 (59.1 mg, 0.174 mmol, 1 eq.), seguido por diisopropiletilamina (92 pL, 0.52 mmol, 3 eq.) y HATU (102 mg, 0.260 mmol, 1.5 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 18 horas y después concentrada in vacuo. El residuo fue absorbido en acetato de etilo (6 mL) y fue lavado con solución de 1 M ácido clorhídrico acuoso (2 x 2 mL) y con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano) proporcionó #96 (102 mg, 65%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 896.7 [M+H+], 918.8 [M+Na+], tiempo de retención = 1.14 minutos; 1H RMN (400 Hz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales de producto características: d 7.88 (d, J=7.4 Hz, 2H), [7.83 (br dd, J=6, 5 Hz) y 8.03 (br dd, J=6, 5 Hz), total 1 H], 7.67-7.73 (m, 2H), 7.36-7.48 (m, 3H), 7.22-7.35 (m, 4H), 7.13-7.21 (m, 3H), 6.86-6.96 (m, 1 H), [4.44 (dd, J=8.6, 8.6 Hz) y 4.50 (dd, J=8.6, 8.6 Hz), total 1 H], 3.18, 3.19, 3.26 y 3.29 (4 s, total 6H), 2.96 y 3.11 (2 br s, total 3H), 0.70-0.77 (m, 3H).
Etapa 2. Síntesis de N2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1 -il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#97). A #96 (98 mg, 0.11 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (2 mL, 0.04 M) se agregó dietilamina (0.5 mL). Después de ser sometida a agitación durante la noche, la reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar #97 (58 mg, 68%). LC-MS: m/z 674.4 [M+H+], 696.4 [M+Na+], tiempo de retención = 0.74 minutos; HPLC (Protocolo A): 674.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.072 minutos; H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [7.92 (br d, J=8 Hz) y 7.97 (br d, J=8 Hz), total 1H], [7.86 (br dd, J=6, 5 Hz) y 8.07 (br dd, J=6, 5 Hz), total 1H], 7.64-7.74 (br m, 3H), 7.15-7.29 (m, 5H), [4.44 (dd, J=9, 9 Hz) y 4.50 (dd, J=9, 9 Hz), total 1 H], 3.26 y 3.29 (2 s, total 3H), 3.18 y 3.20 (2 s, total 3H), 2.96 y 3.10 (2 br s, total 3H), 1.24 y 1.25 (2 s, total 3H), 1.14 y 1.16 (2 s, total 3H), 1.02-1.07 (m, 3H), 0.73-0.80 (m, 3H).
Preparación de 2-metil-L-prolil-N-r(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-í(2S)-2-[(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil)amino)propiHpirrolidin-1-ilV5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamida sal de ácido trifluoroacético (#98) A una mezcla de 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (65.1 mg, 0.284 mmol, 1.1 eq.) y #86 (170 mg, 0.258 mmol, 1 eq.) en diclorometano (5 mL, 0.03 M) se agregó HATU (0.108 mg, 0.284 mmol, 1.1 eq.) seguido por diisopropiletilamina (139 pL, 0.800 mmol, 3.1 eq.). Después de ser sometida a agitación durante toda la noche, la mezcla de reacción fue enfriada hasta 0°C, se agregó diclorometano (3 mL) seguido por la adición lenta de ácido trifluoroacético (2 mL). La mezcla de reacción fue sometida a agitación a 0°C durante 5 minutos, permitiendo que se caliente hasta temperatura ambiente y siendo sometida después a agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de ser concentrada in vacuo. El residuo fue formado en azeotropo dos veces con heptano, diluido con una pequeña cantidad de diclorometano y metanol antes de ser concentrado in vacuo sobre sílice El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) y después mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para obtener #98 (128 mg, 56%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 769.4 [M+H+], tiempo de retención = 1.28 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C) m/z 769.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.146 minutos (pureza > 98%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 9.03-9.15 (br m, 1 H), 8.77-8.86 (br m, 1 H), 8.69-8.76 (m, 1 H), [8.66 (d, J=8.2 Hz) y 8.92 (d, J=8.6 Hz), total 1 H], [7.78 (d, J=3.1 Hz) y 7.80 (d, J=3.5 Hz), total 1 H], [7.63 (d, J=3.1 Hz) y 7.67 (d, J=3.1 Hz), total 1 H], 7.12-7.31 (m, 5H), [5.38 (ddd, J=11 , 8, 4 Hz) y 5.47 (ddd, J=11 , 9, 4 Hz), total 1 H], [4.46 (dd, J=9.4, 9.0 Hz) y 4.55 (dd, J=9.0, 8.6 Hz), total 1 H], 3.17, 3.20, 3.22 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.98 y 3.04 (2 br s, total 3H), [1.06 d, J=7.0 Hz) y 1.09 (d, J=6.6 Hz), total 3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
Preparación de metil amino(biciclof4.2.01octa-1 ,3,5-trien-7- iDacetato, sal de clorhidrato (#102) #100 #101 #102 Etapa 1. Síntesis de etil (acetilamino)(biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il)cianoacetato (#99). Se permitió que sodio (464 mg, 20.2 mmol, 1.2 eq.) reaccione con etanol absoluto (40 ml_, 0.42 M); a la mezcla resultante se agregó etil 2-(acetilamino)-2-cianoacetato (3.44 g, 20.2 mmol, 1.2 eq.). Después de 20 minutos a 60 C, se agregó 7-bromobiciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trieno (3.092 g, 16.89 mmol, 1 eq.) y la mezcla de reacción fue calentada reflujo durante la noche, después filtrada y concentrada in vacuo. El residuo fue diluido con agua y extraído con acetato de etilo. La capa orgánica fue lavada con salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo para dar un aceite oscuro, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetato de etilo en heptano) para dar #99 (4.38 g) como una goma de color amarillo. LC-MS: miz 273.2 [M+H+], tiempo de retención = 2.36 minutos.
Etapa 2. Síntesis de ácido (acetilamino)(biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il)acético (#100). A una mezcla de #99 (4.38 mg, <16.1 mmol, 1 eq.) en metanol (30 mL, 0.53 M) se agregó una solución de 1 N hidróxido de sodio acuosa (38 mL, 38 mmol, 2.4 eq.). La mezcla de reacción fue calentada a reflujo durante la noche, después concentrada in vacuo, diluida con agua (40 mL), y acidificada con una solución de 1 N de ácido clorhídrico acuosa (40 mL). La capa acuosa fue extraída con diclorometano (3 x 30 mL). Las capas orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas in vacuo. El aceite resultante fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Solvente A: diclorometano; Solvente B: 20% metanol en diclorometano que contiene 0.02% ácido trifluoroacético; Gradiente: 0% hasta 40% B) después mediante cromatografía de fluido supercrítico (Columna: Chiralpak AD-H, 250 x 21 mm; Eluyente: 85:15 dióxido de carbono/metanol; Velocidad de Flujo: 65 g/min; Detección: 210 nm; Instrumento: sistema SFC preparatorio minigram Berger). El segundo pico de elución fue aislado para dar #100 (600 mg, 17% en dos etapas) como un enantiómero individual (tiempo de retención = 3.37 minutos, pureza >99%). LC-MS: m/z 220.3 [M+H+], tiempo de retención = 2.10 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.14-7.24 (m, 2H), 7.03-7.09 (m, 2H), 4.59 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 3.87 (ddd, J=8.5, 5.3, 2.4 Hz, 1 H), 3.35 (dd, J=14.5, 5.4 Hz, 1 H, asumido; parcialmente oscurecido por solvente pico), 3.10 (dd, J=14.4, 2.4 Hz, 1H), 2.00 (s, 3H). Rotación óptica: [a]D25 +70.9°(c 0.67, metanol) Etapa 3. Síntesis de ácido amino(biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il)acético, sal de clorhidrato (#101 ). Una mezcla de #100 (200 mg, 0.912 mmol, 1 eq.) y 6 N ácido clorhídrico acuoso (12.3 mL, 73.8 mmol, 81 eq.) fue calentada a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción fue concentrada in vacuo para dar el enantiómero individual #101 (195 mg) como un sólido amarillento, el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 4. Síntesis de metil amino(biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il)acetato, sal de clorhidrato (#102). A una mezcla de #101 (195 mg, <0.913 mmol, 1 eq.) en metanol (20 mL, 0.04 M) se agregó cloruro de tionilo (0.666 mL, 9.13 mmol, 10 eq.). Después de dos horas sometida a calentamiento a reflujo, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo para dar el enantiómero individual #102 (175 mg, 84% en dos etapas) como un sólido de color claro. LC-MS: m/z 192.3 [M+H+], tiempo de retención = 0.80 minutos; GC-MS: m/z 192 [M+H+], tiempo de retención = 3.206 minutos; 1H R N (400 MHz, CD3OD) d 7.24-7.33 (m, 2H), 7.11-7.18 (m, 2H), 4.40 (d, J=6.9 Hz, 1 H), 3.99-4.05 (m, 1 H), 3.78 (s, 3H), 3.46 (dd, J=14.8, 5.4 Hz, 1 H), 3.23 (dd, J=14.8, 2.5 Hz, 1 H).
Preparación de ácido (2R.3R)-3-metoxi-2-metil-3-r(2S)-pirrolidin-2-inpropanóico, sal de clorhidrato (#103) #11 #103 A una mezcla de #11 (4.09 g, 14.2 mmol, 1 eq.) en ciclopentil metil éter (10 mL, 0.14 M) se agregó una solución de 4 N cloruro de hidrógeno (37 mL, 100 mmol, 7 eq.). Después de tres horas, la mezcla de reacción fue concentrada in vacuo y formada como azeotropo tres veces con heptano para dar #103 (1000 mg, 31%) como una goma, la cual fue utilizada en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d 9.92-10.06 (br s, 1H), 8.66-8.80 (br s, 1 H), 3.89 (dd, J=5.2, 4.9 Hz, 1 H), 3.43-3.53 (m, 1 H), 3.39 (s, 3H), 3.06-3.17 (m, 2H), 2.66 (qd, J=7.1 , 4.6 Hz, 1 H), 1.71-2.03 (m, 4H), 1.11 (d, J=7.1 Hz, 3H).
Preparación de 2-Metilalanil-N-f(3R,4S.5S)-1-((2S)-2-f(1R.2R)-3- (f1-(bicvclof4.2.0locta-1.3.5-trien-7-il)-2-metoxi-2-oxoetillamino)-1-metoxi-2- metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il|-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#107) y 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- {(2S)-2-f(1 R.2R)-3-{rbiciclof4.2.01octa-1 ,3,5-trien-7-il(carboxi)metil1aminol-1- metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N- metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (#108) Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2- metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-1-oxo-1-(pentafluorofenoxi)heptan- 4-il]-N-metil-L-valinamida (#104). A #32 (4.00 g, 6.56 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 mL, 0.33 M) y piridina (1.06 mL, 13.1 mmol, 2 eq.) se agregó mediante goteo pentafluorofenil trifluoroacetato (2.25 mL, 13.1 mmol, 2 eq.). La mezcla de reacción fue sometida a agitación durante una hora.
A un segundo matraz que contiene #32 (360 mg, 0.59 mmol) en diclorometano (0.6 mL, 1 M) y piridina (0.095 mL, 1.2 mmol, 2 eq.) se agregó mediante goteo pentafluorofenil trifluoroacetato (0.203 mL, 1.18 mmol). Esta mezcla de reacción fue sometida a agitación durante 15 minutos.
Las dos mezclas de reacción fueron combinadas, lavadas dos veces con 1 N ácido clorhídrico acuoso, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas in vacuo. El aceite de color amarillo resultante se disolvió en acetato de etilo, se pre-adsorbió sobre gel de sílice y fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 40% acetato de etilo en heptano) para dar #104 (4.6 g, 83%) como una espuma de color blanco que contiene algunas impurezas. LC-MS: m/z 798.3 [M+Na+], tiempo de retención = 1.23 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#105). A una mezcla de #104 (2.00 g, <2.58 mmol, 1 eq.) en diclorometano (6 mL, 0.4 M) se agregó una solución de #103 (483 mg, 2.16 mmol, 1 eq.) en diclorometano (2 mL) seguida por diisopropiletilamina (1.35 mL, 7.73 mmol, 3 eq ). La mezcla de reacción fue sometida a agitación durante 16 horas, después adsorbida sobre sílice y purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 20% metanol en diclorometano) para dar #105 (1.67 g, 83%) como una espuma de color blanco. Las fracciones que contienen el producto deseado con impurezas (0.571 g) se recolectaron por separado.
La reacción y purificación anteriores se repitieron de una manera similar utilizando #104 (2.60 g, <3.35 mmol, 1 eq.), #103 (750 mg, 3.35 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0.3 M) y diisopropiletilamina (1.35 mL, 7.73 mmol, 2.3 eq.) para dar #105 (2.4 g, 92%) como una espuma de color marrón. Las fracciones que contienen el producto impuro (1.7 g) se combinaron con las fracciones impuras previas y fueron purificadas como se describió con anterioridad para obtener #105 adicional (1.30 g, rendimiento cuantitativo para ambas reacciones en dos etapas). LC-MS: m/z 779.3 [M+H+], 802.3 [M+Na+], tiempo de retención = 1.05 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[1-(biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il)-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#106). A una mezcla de #105 (225 mg, 0.289 mmol, 1 eq.) en diclorometano (15 mL, 0.02 M) y N,N-dimetilformamida (1 mL) se agregó HATU (136 mg, 0.347 mmol, 1.2 eq.). Después de cinco minutos, se agregó una solución de amina #102 (72.4 mg, 0.318 mmol, 1 eq.) y se añadió diisopropilamina (203 iL, 1.16 mmol, 3 eq.) en diclorometano (5 mL). Después de 24 horas, la mezcla de reacción fue lavada con salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada, concentrada in vacuo sobre gel de sílice, y purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 50% acetona en heptano) para dar el enantiómero individual #106 (210 mg, 76%) como un aceite claro. LC-MS: m/z 953.1 [M+H+], tiempo de retención = 3.99 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCI3), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: 7.76 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.57-7.64 (m, 2H), 7.40 (dd, J=7.5, 7.4 Hz, 2H), 7.28-7.34 (m, 2H), 4.82-4.88 (m, 1 H), 3.95-4.01 (m, 1 H), 3.76 y 3.82 (2 s, total 3H), 3.30, 3.31 , 3.34 y 3.35 (4 s, total 6H), [1.20 (d, 10 J=7.0 Hz) y 1.20 (d, J=7.0 Hz), total 3H].
Etapa 4A. Síntesis de 2-met¡lalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il)-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#107). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #106 (25 mg, 0.026 mmol, 1 eq.) en diclorometano (10 ml_, 0.003 M) y dietilamina (4 ml_) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar el enantiómero individual #107 (16 mg, 73%) como un sólido. LC-MS: m/z 730.8 [M+H1], tiempo de retención = 2.13 minutos; HPLC (Protocolo N): tiempo de retención = 9.889 minutos.
Etapa 4B. Síntesis de 2-met¡lalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1 R,2R)-3-{[biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-yl(carboxi)metil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metíl-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#108). El enantiómero individual #108 (94.5 mg, 57%) se sintetizó a partir de #106 (190 mg, 0.200 mmol) de acuerdo con un procedimiento similar a aquel descrito para la Síntesis de #41 a partir de #40. LC-MS: m/z 716.8 [M+H+], tiempo de retención = 2.06 minutos; HPLC (Protocolo N): tiempo de retención = 9.137 minutos.
Preparación de 2-metilalanil-N-f(3R,4S,5S)-1-((2S)-2-f(1R,2R)-3-(f(1 S,2R)-1 -hidroxi-1 -fenilpropan-2-il1amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-vanilamida (#112) Etapa 1. Síntesis de ter-butil (2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[1S,2R)-1-hidroxi-1 -fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -carboxilato (#109). A una solución de #11 (2.00 g, 6.96 mmol, 1 eq.) en diclorometano (21 ml_, 0.3 M) y N,N-dimetilformamida (3 ml_) se agregó HATU (3270 mg, 8.35 mmol, 1.2 eq.). Después de dos minutos, se agregaron la amina (1 R,2S)-(+)-norefedrina (1.07 mg, 6.96 mmol, 1 eq.) y trietilamina (1.94 mL, 13.9 mmol, 2 eq.). Después de dos horas, la mezcla de reacción fue diluida con acetato de etilo (100 mL), lavada con una solución de 1 ácido clorhídrico acuosa y con salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada, concentrada in vacuo, y purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 60% acetato de etilo en heptano) a fin de proporcionar #109 (2.18 g, 74%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 321.3 [(M-Boc)+H+], tiempo de retención = 3.14 minutos; H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.64 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 7.24-7.33 (m, 4H), 7.15-7.21 (m, 1 H), 5.35 (br d, J=5 Hz, 1 H), 4.45 (br dd, J=5, 5 Hz, 1 H), 3.91-4.00 (m, 1 H), 3.30-3.39 (m, 1 H), 3.26 (s, 3H), 2.94-3.07 (m, 1 H), 2.04-2.14 (m, 1 H), 1.46-1.78 (m, 4H), 1.40 (s, 9H), 0.97-1.04 (m, 6H).
Etapa 2. Síntesis de (2R,3R)-N-[(1S,2R)-1-hidroxi-l-fenilpropan-2-il]-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (#110). De acuerdo con el procedimiento general C, a 0°C a partir de #109 (414 mg, 0.984 mmol, 1 eq.), dioxano (5 mL, 0.2 M) y una solución de 4 M cloruro de hidrógeno en dioxano (15 mL, 60 mmol, 60 eq.) se sintetizó el compuesto crudo deseado, el cual fue purificado mediante cromatografía de fase inversa (Método C) para dar #110 (120 mg, 34%) como un líquido viscoso. LC-MS: m/z 321.1 [M+H+], tiempo de retención = 0.55 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), señales características: d 7.90 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 7.28-7.36 (m, 4H), 7.20-7.27 (m, 1 H), 4.46 (d, J=6.2 Hz, 1 H), 3.48 (dd, J=8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.38 (s,3H), 2.92-3.16 (m, 3H), 2.24-2.35 (m, 1H), 1.49-1.88 (m, 4H), 1.09 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.01 (d, J=6.6 Hz, 3H).
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbon¡l]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val¡nam¡da (#111 ). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #32 (140 mg, 0.230 mmol, 1 eq.), #110 (110 mg, 0.253 mmol, 1.1 eq.), diclorometano (3 mL, 0.08 M), N,N-dimetilformamida (0.5 mL), HATU (96.2 mg, 0.253 mmol, 1.1 eq) y trietilamina (96 pL, 0.69 mmol, 3 eq.) se sintetizó el producto crudo deseado, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 40% acetona en heptano) para dar #111 (220 mg, 95%). LC-MS: m/z 912.4 [M+H+], 935.4 [M+Na+], tiempo de retención = 2.15 minutos; HPLC (Protocolo B): m/z 912.5 [M+H+], 934.5 [M+Na+], tiempo de retención = 10.138 minutos (pureza >94%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d 7.89 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.667.75 (m, 2H), 7.41 (dd, J=7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.12-7.20 (m, 1H), [5.33 (d, J=4.7 Hz) y 5.38 (d, J=4.7 Hz), total 1 H], 3.15, 3.18, 3.22 y 3.23 (4 s, total 6H), 1.30, 1.33, 1.36 y 1.39 (4 s, total 6H), 0.95-1.06 (m, 6H).
Etapa 4. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-l-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#112). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #111 (210 mg, 0.230 mmol) en diclorometano (5 mL, 0.05 M) y dietilamina (5 mL) se sintetizó el material deseado crudo, el cual fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 10% metanol en diclorometano) para dar una mezcla de un aceite y un sólido. Se agregaron éter dietílico y heptano y la mezcla fue concentrada in vacuo, produciendo #112 (81 mg, 51%) como un sólido de color blanco. LC-MS: m/z 690.4 [M+H+], tiempo de retención = 1.10 30 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 690.5 [M+H+], 712.4 [M+Na+], tiempo de retención = 7.229 minutos (pureza > 90%); 1H R N (400 MHz, DMSO-d6), suponiendo que es una mezcla de rotámeros, señales características: d [7.62 (br d, J=8 Hz), 7.88 (br d, J=8 Hz), 8.07 (br d, d=9 Hz) y 8.11 (br d, J=9 Hz), total 2H], 7.15-7.34 (m, 5H), [5.34 (d, J=4 Hz) y 5.41 (d, J=5 Hz), total 1 H], 3.18, 3.21 , 3.23 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.08 (2 br s, total 3H), 1.15, 1.18, 1.21 y 1.25 (4 s, total 6H).
Preparación de N,2-d¡metilalanil-N-í(1 S.2R)-4- 2S)-2-r(1 R.2RV 3-íf(1 S)-1-carboxi-2-feniletillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropill pirrolidin-1-il)-2-metoxi-1 -f(1 S)-1 -metilpropi1l-4-oxobutill-N-metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (1 5).
Etapa 1. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-R9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#113). A una mezcla sometida a agitación de dímero ácido #5 (12. 1g, 23.0 mM) y #67 (11.5 g, 23.0 mM) en 75 mL de diclorometano bajo nitrógeno, se agregó HATU (10.8 g, 27.6 mM) seguido por base de Hunig (12.1 mL, 69.0 mM). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 15 horas. La reacción fue concentrada a un menor volumen, absorbida con acetato de etilo y lavada con 1 N HC1 dos veces. La capa orgánica fue lavada después con salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y concentrada in vacuo. El residuo fue purificado después mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 70% acetona en heptanos), produciendo #113 (12.3 g, 62%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 855.3 [M+H+], 877.2 [M+Na+], tiempo de retención = 2.32 minutos; HPLC (Protocolo R): /z 855.5 [M+H+], tiempo de retención = 9.596 minutos (pureza > 97%).
Etapa 2. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1- {(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#114). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #113 (12 g, 14 mmol, 1 eq.), diclorometano (60 mL, 0.24 M) y dietilamina (40 mL, 390 mM) se sintetizó #114 (5.9 g, 67%) como un sólido de color blanco/amarillo claro después de la purificación mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% hasta 25% metanol en diclorometano). LC-MS (Protocolo Q): m/z 633.0 [M+H+], tiempo de retención = 1.19 minutos. HPLC (Protocolo A): /z 633.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.142 minutos (pureza > 98%).
Etapa 3. Síntesis de N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2 S)-2- [(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}- 1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-yl}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida-sal de ácido trifluoroacético (#115). A una mezcla sometida a agitación de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil-N,2-dimetilalanina (167 mg, 0.493 mM), #114 (260 mg, 0.411 mM), y HATU (188 mg, 0.493 mM) en 10 mL de diclorometano, se agregó base de Hunig (0.14 mL, 0.82 mM). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora y 20 minutos. Se redujo la reacción. Se agregó THF (9 mL) al material crudo y a esta mezcla sometida a agitación se añadió hidróxido de litio (49.2 mg, 2.06 mM) disuelto en 3 ml_ de agua. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción fue concentrada seguida por la purificación a través de cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 45% agua en acetonitrilo con 0.02% TFA en cada fase) #115 (218 mg, 64%) sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 718.7 [M+H+], 740.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.21 minutos. HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 718.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.903 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.81 -8.95 (m), 8.44-8.50 (m), 8.42 (d), 8.15 (d), 7.14-7.28 (m), 4.71-4.78 (m), 4.57-4.66 (m), 4.49-4.56 (m), 4.41-4.48 (m), 3.94-4.05 (m), 3.72-3.79 (m), 3.39-3.60 (m), 2.95-3.33 (m), 2.78-2.89 (m), 2.69 (s), 2.43-2.50 (m), 2.08-2.42 (m), 1.60-1.92 (m), 1.20-1.57 (m), 0.84-1.11 (m), 0.74-0.83 (m).
Preparación de 2-metil-L-prolil-N-í(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2- friR.2R)-1-metoxi-3-(f(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)amino>-2-metil-3 oxopropillpirrolidin-1 -il)-5-metil-1 -oxoheDtan-4-in-N-metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (#117) y 2-metil-L-prolil-N-r(3R.4S.5S)-1-((2S)-2- \( 1 R,2R)-3-(í( 1 S)-1 -carboxi-2-feniletil1amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxoprop¡llpirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#118).
Etapa 1. Síntesis de 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#116). A una solución sometida a agitación #114 (1.02 g, 1.61 mmol, 1.0 eq.) y 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (443 mg, 1.93 mmol, 1.2 eq.) en 12 mL de diclorometano, se agregó HATU (735 mg, 1.93 mmol, 1.2 eq.) seguido por base de Hunig (1.12 mL, 6.45 mmol, 4.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción fue reducida, diluida con acetato de etilo antes de ser lavada con 0.5 N HCI y salmuera. Los elementos orgánicos fueron secados sobre sulfato de sodio, reducidos a un volumen menor, y después reducidos sobre sílice. Se efectuó después la cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-45% acetona en heptanos) produciendo #116 (1.02 g, 74%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 844.3 [M+H+], 867.2 [M+Na+], tiempo de retención = 2.15 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#117). A una solución sometida a agitación #116 (450 mg, 0.533 mmol, 1.0 eq.) en 7 mL de diclorometano a 0°C, se agregó TFA (3 mL, 40 mmol, 70 eq ). Se permitió la agitación de la reacción a 0°C durante 5 minutos y después se permitió el calentamiento hasta temperatura ambiente mientras se sometió a agitación durante 20 minutos. La reacción fue reducida, diluida con diclorometano y una pequeña cantidad de metanol antes de ser reducida sobre sílice. Se efectuó después la cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-20% metanol en acetato de etilo) produciendo #117 (396 mg, 89%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 744.5 [M+hf], 767.2 [M+Na+], tiempo de retención = 1.40 minutos; HPLC (Protocolo A at 45 °C): m/z 744.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.149 minutos (pureza > 91%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.73-9.14 (m), 8.66 (br d), 8.50 (d), 8.22 (d), 7.12-7.25 (m), 4.67-4.74 (m), 4.41-4.63 (m), 3.93-4.00 (m), 3.73 (dd), 3.63 (d), 3.46-3.57 (m), 3.38-3.45 (m), 3.26-3.23 (m), 3.22-3.25 (m), 3.06-3.22 (m), 2.99- 3.05 (m), 2.93-2.97 (m), 2.80-2.89 (m), 2.75-2.78 (m), 2.64- 2.67 (m), 2.46-2.50 (m), 2.27- 2.43 (m), 2.00-2.26 (m), 1.85- 1.99 (m), 1.70-1.83 (m), 1.52-1.69 (m), 1.33- 1.51(m), 1.18-1.31 (m), 0.98-1.07 (m), 0.93-0.97 (m), 0.82-0.92 (m), 0.71-0.78 (m).
Etapa 2B. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carbox¡-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#118). A una solución sometida a agitación #116 (435 mg, 0.515 mmol), en 4 mL de THF bajo nitrógeno, se agregó LiOH (24.7 mg, 1.03 mmol, 2.0 eq.) disuelto en 2 mL de agua. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente hasta que LC-MS indicó saponificación del éster de metilo. La reacción fue concentrada in vacuo y después colocada bajo vacío. La reacción fue diluida con diclorometano y colocada bajo nitrógeno. A esta mezcla sometida a agitación se agregó TFA (3mL, 40.5 mmol, 80 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se redujo la reacción. La reacción fue purificada mediante cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 60% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) #118 (396 mg, 89%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 730.2 [M+H+], tiempo de retención = 1.18 minutos; HPLC (Protocolo A at 45 °C): m/z 730.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.088 minutos (pureza > 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 9.04-9.13 (m), 8.75-8.87 (m), 8.70 (d), 8.38 (d), 8.11 (d), 7.10-7.24 (m), 4.66-4.74 (m), 4.48-4.64 (m), 4.37-4.47 (m), 3.91-3.99 (m), 3.77 (m), 3.47-3.56 (m), 3.33-3.47 (m), 3.08-3.30 (m), 2.93- 3.07 (m), 2.75-2.86 (m), 2.63-2.69 (m), 2.45-2.50 (m), 2.28-2.44 (m), 2.03-2.27 (m), 1.88-2.02 (m), 1.68-1.86 (m), 1.55-1.67 (m), 1.30-1.47 (m), 1.17-1.29 (m), 0.98-1.05 (m), 0.93-0.97 (m), 0.83-0.92 (m), 0.71-0.79 (m).
Preparación de 2- etilalanil-N-í(3R.4S.5S)-1-f(2S)-2-r(1 R.2R)-3-(f(2S)-1 -ter-butoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-illamino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil1pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N-metil-L-valinamida (#123).
Etapa 1. Síntesis de ácido (2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanóico (#119). A una solución sometida a agitación #11 (2.4 g, 8.4 mmol, 1.0 eq.) en 10 mL de dioxano bajo nitrógeno, se agregó 4M HCI en dioxano (20 mL, 80 mM, 10 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas antes de ser concentrada in vacuo y colocada bajo alto vacío. El material crudo fue disuelto después con 30 mL de 10% Na2C03. Esta solución fue agregada después a una solución sometida a agitación de 1-{[(9H-fluoren- 9-¡lmetox¡)carbonil]oxi}p¡rrolidin-2,5-d¡ona (2.96 g, 8.77 mmol, 1.05 eq.) en 30 mL de DME. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente hasta que TLC (20% metanol/40% acetato de etilo/40% heptanos) indicó el consumo del material de partida Boc desprotegido. La reacción fue concentrada in vacuo a un volumen menor, lavada dos veces con éter, acidificada hasta pH 2 utilizando HCI concentrado y después extraída tres veces con una solución de 90% diclorometano 10%metanol. Los elementos orgánicos fueron lavados con bicarbonato de sodio saturado y salmuera antes de ser secados sobre sulfato de sodio, filtrados, y concentrados in vacuo para dar un sólido de color café #119 (3.4 g, cuant.). LC-MS (Protocolo Q): m/z 410.0 [M+H+], tiempo de retención = 1.81 minutos.
Etapa 2. Síntesis de ter-butil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato (#120). A una solución sometida a agitación de ter-butil L-fenilalaninato, sal de clorhidrato (1.67 g, 6.5 mmol, 1.0 eq.) y #119 (5.9 g, 6.5 mmol, 1.0 eq.) en 50 mL de diclorometano y 5 mL de DMF, se agregó HATU (2.9g, 7.9 mmol, 1.2 eq.) seguido por base de Hunig (5.6 mL, 32 mmol, 5.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 45 minutos. La reacción fue reducida, diluida con acetato de etilo, lavada con 0.5 N HCI y salmuera antes de ser concentrada sobre sílice. Se efectuó después la cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-25% acetona en heptano) produciendo #120 (3.14 g, 79%) como un sólido de color blanco-amarillo. LC-MS (Protocolo Q): m/z 613.1 [M+H+] tiempo de retención = 2.37 minutos.
Etapa 3. Síntesis de ter-butil N-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3- [(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato (#121). A una solución sometida a agitación #120 (2.87 g, 4.68 mmol, 1.00 eq.) en 20 mL de diclorometano, se agregó dietilamina (10 mL, 95 mM, 20.5 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se agregaron (10 mL, 95 mmol, 20.5 eq.) de dietilamina y se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas más. La reacción fue concentrada in vacuo y colocada bajo alto vacio produciendo #121 (1.8 g, cuant.) mezcla sólido aceite de color amarillo-blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 391.1 [M+H+] tiempo de retención = 1.05 minutos.
Etapa 4. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -ter-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#122). A una solución sometida a agitación #121 (0.55 g, 1.0 mmol, 1.0 eq.) en 10 mL de diclorometano y 1 mL de DMF, se agregó #32 (0.62 g, 1.0 mmol, 1.0 eq.) seguido por HATU (0.42 g, 1.1 mmol, 1.1 eq.) y base de Hunig (0.72 mL, 4.1 mmol, 4.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante aproximadamente 21 horas. La reacción fue reducida, diluida con acetato de etilo, y después lavada con 0.5 N HCI y salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada a un volumen menor antes de ser concentrada sobre sílice. Se efectuó después la cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-40% acetona en heptano) produciendo #122 (0.62 g, 62%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 982.3 [M+H+] tiempo de retención = 2.44 minutos.
Etapa 5. Síntesis de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-ter-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#123). A una mezcla sometida a agitación de #122 (600 mg, 0.611 mmol, 1.00 eq.) en 15 mL de diclorometano, se agregó dietilamina (5 ml_, 50 mmol, 80 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y la mezcla fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-40% metanol en diclorometano) produciendo #123 (0.46 g, 99%) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 760.3 [M+H+j tiempo de retención = 0.83 minutos. 1H RMN (400 MHz, CD3OD), d 7.14-7.30 (m), 4.70-4.78 (m), 4.56-4.64 (m), 4.05-4.19 (m), 3.87 (dd), 3.79-3.84 (m), 3.72-3.77 (m), 3.62-3.70 (m), 3.46-3.56 (m), 3.37- 3.45 (m), 3.33-3.36 (m), 3.16-3.24 (m), 3.09-3.11 (m), 2.98-3.05 (m), 2.95 (d), 2.91 (d), 2.87 (d), 2.83 (d),2.73-2.79 (m), 2.40-2.51(m), 2.29-2.39 (m), 2.16-2.28 (m), 2.04-2.15 (m), 2.01 (s), 1.73-1.96 (m), 1.50-1.68 (m), 1.47-1.49 (m), 1 .46 (s), 1.43 (s), 1.38 (s), 1.35 (d), 1.23-1.32 (m), 1.17-1.22 (m), 1.15 (d), 1.04-1.11 (m), 0.94- 1.03 (m), 0.82-0.91 (m).
Preparación de metil N-í(2R.3R)-3-((2S)-1-r(3R.4S,5S)-4-([N-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-L-val¡ll(metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoinpirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoin-L-fenilalaninato (#126). #114 HATU, dietilamina Etapa 1. Síntesis de ácido 3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanóico (#124). Una solución de clorhidrato de ácido 3-amino-2,2-dimetilpropanóico (1.0 g, 6.5 mmol, 1.0eq.) en 10 mL de 10% Na2C03 fue agregada a una solución de 1-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]oxi}pirrolidin-2,5-diona (2.3 g, 6.5 mmol, 1.0 eq.) en 10 mL de D E. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante la noche. La reacción fue concentrada a un volumen menor y después lavada dos veces con éter. La capa acuosa fue acidificada hasta pH <2 con HCI concentrado y después extraída tres veces con una solución de 10% metanol 90% diclorometano. Los elementos orgánicos fueron combinados antes de ser lavados con 1 M HCI y salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y concentrada in vacuo produciendo #124 (2.2 g, 98%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 362.0 [M+Na+] tiempo de retención = 0.89 minutos.
Etapa 2. Síntesis de metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4- {[N-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-L- valil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2- metilpropanoil]-L-fenilalaninato (#125). A una solución sometida a agitación #114 (200 mg, 0.316 mmol, 1.00 eq.) en 2 mL de diclorometano, se agregó #124 (107 mg, 0.316 mmol, 1.00 eq.) seguido por base de Hunig (0.167 mL, 0.948 mmol, 3.00 eq.) y HATU (149 mg, 0.379 mmol, 1.20 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante -12 horas. La reacción fue concentrada a un volumen menor, absorbida en 10 mL de acetato de etilo, y lavada dos veces con 5 mL de 1 M HCI, y una vez con 5 mL de salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. Los elementos orgánicos fueron concentrados in vacuo y el material crudo fue absorbido en diclorometano. El precipitado fue filtrado. La capa orgánica fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-50% acetona en heptano) produciendo #125 (235 mg, 78%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 954.2 [M+H+] tiempo de retención = 2.28 minutos.
Etapa 3. Síntesis de metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato (#126). A una solución sometida a agitación #125 (235 mg, 0.246 mmol, 1.00 eq.) en 2 mL de THF, se agregó (1 mL, 10 mM, 40.6 eq.) de dietilamina. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% metanol en acetato de etilo) produciendo #126 (101 mg, 56%) como un sólido de color blanco. LC- S (Protocolo Q): m/z 732.2 [M+H+] tiempo de retención = 1.32 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), d 8.51 (dd), 8.28 (d), 7.15-7.29 (m), 5.77 (s), 4.55-4.77 (m), 4.44-4.54 (m), 3.94-4.10 (m), 3.73-3.79 (m), 3.66 (d), 3.49-3.60 (m), 3.40-3.48 (m), 3.10-3.36 (m), 3.00-3.09 (m), 2.83-2.98 (m), 2.57-2.77 (m), 2.19- 2.46 (m), 1.87- 2.14 (m), 1.61- 1.86 (m), 1.36-1.55 (m), 1.23-1.36 (m), 1.12-1.22 (m), 0.97-1.11 (m), 0.82-0.96 (m), 0.73-0.81 (m).
Preparación de N,2-Dimetilalanil-N-f(3R.4S.5S)-1 -((2S)-2-f(1 R.2R)-3-(f(2S)-1-ter-butoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il1amino!-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il|-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamida (#130).
Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-ter-butoxi-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#127). A un matraz de fondo redondo que contiene #6 (4.7 g, 7.9 mmol, 1.0 eq.) y N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-d¡metilalanina (3.2 g, 9.4 mmol, 1.2 eq.) y una barra de agitación bajo nitrógeno, se agregaron 50 ml_ de diclorometano seguidos por HATU (3.6 g, 9.4 mmol, 1.2 eq.) y base de Hunig (5.5 ml_, 32 mmol, 4.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante -12 horas. La reacción fue reducida a un volumen menor, absorbida en acetato de etilo, antes de ser lavada con 1 N HCI, y salmuera. Los elementos orgánicos fueron secados sobre sulfato de sodio, filtrados y después reducidos sobre sílice. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% acetona en heptano) produciendo #127 (4.2 g, 78%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 680.2 [M+H+] tiempo de retención = 2.52 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(2R,3S,4S)-1 -carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida, (#128). A una solución sometida a agitación #127 (4.2 g, 6.1 mmol, 1.0 eq.) en 21 mL de diclorometano bajo nitrógeno, se agregaron (7 mL, 90 mmol, 10 eq.) de TFA. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~4 horas. La reacción fue concentrada in vacuo, formada como azeotropo una vez con heptano, y después colocada bajo alto vacio produciendo #128 como un sólido blanco-amarillo claro (3.8 g, cuant.). LC-MS (Protocolo Q): m/z 624.2 [M+H+] tiempo de retención = 2.01 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-ter-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#129). A una solución sometida a agitación #128 (1.67 g, 3.1 mmol, 1.0 eq.) en 20 de diclorometano y 2 mL de DMF, se agregó #121 (2.4 g, 3.1 mmol, 1.0 eq.) seguido por HATU (1.29 g, 3.39 mmol, 1.1 eq.) y después base de Hunig (2.2 mL, 12.3 mmol, 4.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~2 horas. La reacción fue reducida, diluida con acetato de etilo antes de ser lavada con 0.5 N HCI y salmuera. Los elementos orgánicos fueron secados sobre sulfato de sodio y después reducidos sobre sílice. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-50% acetona en heptanos) produciendo #129 (1.9 g, 62%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 996.3 [M+H+] tiempo de retención =2.53 minutos.
Etapa 4. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -ter-butoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#130). A una solución sometida a agitación #129 (823 mg, 0.826 mmol, 1.00 eq.) en 15 mL de diclorometano, se agregó dietilamina (4 mL, 40 mmol, 50 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~14 ½ horas. La reacción fue concentrada in vacuo y formada como azeotropo una vez con heptanos. El residuo fue diluido con diclorometano y una pequeña cantidad de metanol antes de ser reducido sobre sílice. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-20% metanol en acetato de etilo) produciendo #130 (518 mg, 81 %) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 774.3 [M+H+] tiempo de retención =1.48 minutos. HPLC (Protocolo A a 25°C): m/z 774.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.733 minutos (pureza > 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.36 (d). 8.14(d), 7.81 (t), 7.14-7.25 (m), 7.01-7.07 (m), 4.87-4.94 (m), 4.78-4.85 (m,), 4.67-4.76 (m), 4.46-4.65 (m), 4.29-4.40 (m), 3.93-4.03 (m), 3.70- 3.81 (m), 3.49- 3.60 (m), 3.38-3.47 (m), 3.29- 3.36 (m), 3.15-3.28 (m), 2.98-3.13 (m), 2.94 (br s), 2.74-2.89 (m), 2.64-2.69 (m), 2.18-2.45 (m), 2.02-2.14 (m), 1.90-2.01 (m), 1.62-1.87 (m), 1.40-1.55 (m), 1.37 (d), 1.20-1.33 (m), 1.16(d), 1.01-1.10(m), 0.90-0.98 (m), 0.82 -0.89 (m), 0.69-0.79 (m).
Preparación de 2-metil-D-prolil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1 -((2S)-2-f(1 R.2R)-1-metoxi-3-{f(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-illam¡no)-2-metil-3-oxopropil1pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (#131).
Etapa 1. Síntesis de 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#131). A una solución sometida a agitación #114 (164 mg, 0.259 mmol, 1.0 eq.) y 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-D-prolina (71.3 mg, 0.311 mmol, 1.2 eq.) en 4 mL de diclorometano, se agregó HATU (118 mg, 0.311 mmol, 1.2 eq.) seguido por base de Hunig (0.180 mL, 1.04 mmol, 4 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~30 minutos. La reacción fue reducida. La reacción fue absorbida en 3.5 mL de diclorometano y placed bajo nitrógeno. A esta solución sometida a agitación, se agregó TFA (1.5 mL, 20 mmol, 76 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~1 hora. La reacción fue reducida y colocada bajo alto vacío. La purificación a través de (Método J*) proporciona #131 (119 mg, 54%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo A at 45 °C): m/z 744.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.342 minutos (pureza > 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 9.08-9.18 (m), 8.79-8.89 (m), 8.76 (t), 8.54 (d), 8.29 (d), 7.14-7.31 (m), 4.70-4.79 (m), 4.57- 4.66 (m), 4.45-4.55 (m), 3.96-4.04 (m), 3.74- 3.80, 3.66 (d), 3.48-3.61 (m), 3.40-3.48 (m), 3.09- 3.34 (m), 3.00-3.09 (m), 2.95-3.00 (m), 2.83- 2.93 (m), 2.36- 2.53 (m), 2.21-2.35 (m), 2.10-2.19 (m), 1.99-2.10 (m), 1.61-1.09 (m), 1.36-1.53(m), 1.21-1.35 (m), 1.02-1.10 (m), 0.94- 1.0 (m), 0.86- 0.93 (m), 0.73- 0.82 (m).
Preparación de 2-metil-L-prolil-N-f(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-f(1 R,2R)- 3-(f(1 S.2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-illamino}-1-nnetoxi-2-metil-3- oxopropillpirrolidin-1 -il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#134). #110 HATU, base de Hunkj Etapa 1. Síntesis de N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1 -hidroxi-1 -fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-rnetil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#132). A un matraz que contiene #@5 (1.14 g, 2.17 mmol, 1.0 eq.), se agregaron 10 mL de diclorometano seguidos por base de Hunig (1.15 mL, 6.52 mmol, 3.0 eq.), HATU (1.02 g, 2.61 mmol, 1.2 eq.), y #110 (0.776 g, 2.17 mmol, 1.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y después fue concentrada in vacuo. El material crudo fue absorbido en 50 mL de acetato de etilo, lavado dos veces con 25 mL de 1 M HCI, y una vez con 25 mL de salmuera. Los elementos orgánicos fueron secados sobre sulfato de sodio y decantados. Los elementos orgánicos fueron concentrados in vacuo, absorbidos en 30 mL de diclorometano, y se filtró el precipitado resultante. Los elementos orgánicos fueron concentrados in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-50% acetona en heptanos) produciendo #132 (1.33 g, 81 %) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 849.2 [M+Na+] tiempo de retención =2.19 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#133). A una solución sometida a agitación se agregó #132 (1.33 g, 1.60 mmol, 1.0 eq) en 10 mL de THF dietilamina (5 mL, 50 mM, 31.3 eq). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% metanol en acetato de etilo) produciendo #133 (418 mg, 43%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 605.2 [M+H+] tiempo de retención =1.48 minutos.
Etapa 3. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#134). HATU (151 mg, 0.398 mmol, 1.2 eq), #133 (201 mg, 0.332 mmol, 1.0 eq.) y 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (91.3 mg, 0.398 mM, 1.2 eq.) fueron combinados en un matraz de fondo redondo que contiene una barra de agitación bajo nitrógeno. Se agregaron 5 mL de diclorometano seguidos por base de Hunig (0.231 mL, 1.33 mmol, 4.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante -15 horas. La reacción fue concentrada después in vacuo y colocada bajo alto vacío. Se agregaron después 4 mL de dioxano al residuo seguidos por 4M HCI en dioxano (4 mL, 20 mmol, 50 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada después in vacuo y la reacción fue purificada mediante cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 90% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) #134 (237 mg, 86%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 716.3 [M+H+], tiempo de retención = 1.16 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C): /z 716.5 [M+H+], tiempo de retención = 6.930 minutos (pureza > 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), 9.12-9.21(m), 8.79-8.90 (m), 8.70-8.78 (m), 7.95 (d), 7.64 (d), 7.25-7.36 (m), 7.16- 7.23 (m), 4.74- 4.80 (m), 4.61- 4.69 (m), 4.41- 4.59 (m), 3.91- 4.06 (m), 3.78 (dd), 3.54- 3.64 (m), 3.45- 3.51 (m), 3.17- 3.36 (m), 3.02- 3.15 (m), 3.00 (br s), 2.40-2.48 (m), 2.24- 2.35 (m), 1.91- 2.21 (m),. 1.68- 1.90 (m), 1.61-1.68 (m), 1.48- 1.59 (m), 1.22- 1.35 (m), 0.97- 1.09 (m), 0.84- 0.97 (m), 0.74-0.83 (m).
Preparación de N.2-Dimetilalanil-N-((1S.2R)-4- (2S)-2-í(1 R.2R)-3-(f(1S)-1-bencil-2-(metilamino)-2-oxoetillamino>-1-metoxi-2-metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il)-2-metoxi-1-f(1S)-1-metilprop¡n-4-oxobutil>-N-metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (#140). N,2-Dimetilalanil-N- 1S.2R)-4-((2S)-2-f(1 R.2RV3-{r(1S)-2-amino-1-bencil-2-oxoetillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-f(1S)-1-metilpropill-4-oxobutil)-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#141). N,2-Dimetilalanil-N-((1S,2R)-4- ((2S)-2-f(1 R,2R)-3-(r(1S)-1-bencil-2-oxo^ metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il)-2-metox¡ metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#142), N,2-Dimetilalanil-N-((1 S,2R)-4-((2S)-2-r(1 R.2R)-3-(í(1S)-1-bencil-2-(diethylamino)-2-oxoetil|amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-f(1S)-1-metilpropin-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#143). v N,2-Dimetilalanil-N-((1S.2R)-4-((2S)-2-f(1R,2R)-3-miS)-1-bencil-2-(ter-butilamino)-2-oxoetillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il)-2-metoxi-1-f(1S)-1-metilpropill-4-oxobutil>-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#144). #139 Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S, 5S)-3-metoxi-5-metil- 1 -oxo- 1 - (pentafluorofenoxi)heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#135). Pentafluorofenil 3,3,3-trifluoropropanoato (2.44 mL, 13.4 mmol, 2.0 eq.) fue agregado a una solución de #128 (4.18 g, 6.70 mmol, 1.0 eq.) en 50 mL de diclorometano seguido por piridina (1.61 mL, 20.1 mmol, 3.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-70% acetona en heptanos) produciendo #135 (5.2 g, 98%) como una espuma de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 812.1 [M+Na+] tiempo de retención =1.24 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#136). A una solución sometida a agitación 4M HCI en dioxano (10 mL, 25 mmol, 3.7 eq.) en 10 ml_ de dioxano se agregó #11 (2.31 g, 8.05 mmol, 1.2 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 6 horas. La reacción fue concentrada in vacuo produciendo una goma de color amarillo. Una solución de #135 (5.3 g, 6.7 mmol, 1.0 eq.) en 30 mL de diclorometano fue agregada al residuo previo seguida por base de Hunig (3.5 mL, 20 mmol, 3 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción fue diluida con diclorometano antes de ser lavada con una solución acuosa de HCI al 1 % HCI y después salmuera. La capa de elementos orgánicos fue secada sobre sulfato de sodio, concentrada in vacuo, y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 20%-50% acetato de etilo en heptanos seguido por 93% acetato de etilo 6.6% metanol y 0.4% ácido acético) produciendo #136 (4.87 g, 92%) como un sólido blanquecino. LCTMS (Protocolo Q1): m/z 793.3 [M+H+] tiempo de retención =1 .07 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ílmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3- oxo-3-(pentafluorofenox¡)propil]pirrol¡d¡n-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#137). Pentafluorofenil 3,3,3-trifluoropropanoato (1.3 mL, 7.1 mmol, 2.0 eq.) fue agregado a una solución de #136 (2.8 g, 3.5 mmol, 1.0 eq.) en 30 mL de diclorometano seguido por la adición de piridina (0.85 mL, 10.6 m ). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción fue concentrada in vacuo, y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-70% acetona en heptano) produciendo #137 (3.1 g, 92%) como un polvo de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 959.2 [M+H+] tiempo de retención =1.28 minutos.
Etapa 4. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2- Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida(#138). A una solución sometida a agitación #137 (493 mg, 0.514 mmol, 1.0 eq.) en 4 mL of DMF, se agregó L-fenilalanina (84.9 mg, 0.514 mmol, 1.0 eq) seguida por base de Hunig (0.27 mL, 1.54 mmol, 3.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-100% acetato de etilo en heptano) produciendo #138 (200 mg, 41 %) como una espuma de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 940.3 [M+H+] tiempo de retención =1.08 minutos.
Etapa 5. Síntesis de N-[(9H-fIuoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3- oxo-3-{[(2S)-1-oxo-1-(pentafluorofenoxi)-3-fenilpropan-2- il]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#139). A una solución sometida a agitación #138 (200 mg, 0.213 mmol, 1.0 eq.) en 5 ml_ de diclorometano, se agregó pentafluorofenil 3,3,3-trifluoropropanoato (126 mg, 0.426 mM, 2.0 eq.) seguido por piridina (0.051 ml_, 0.64 mmol, 3.0 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante -12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%- 100% acetato de etilo en heptanos) produciendo #139 (174 mg, 74%) como un aceite de color amarillo. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1128 [M+Na+] tiempo de retención =1.23 minutos.
Etapa 6A. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -bencil-2-(metilamino)-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#140). A una solución sometida a agitación de #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) en 1mL de THF se agregó metilamina (1 M en THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10 eq.), y la mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción fue reducida, y diluida con dmso, y sometida a purificación (Método J*). Las fracciones fueron recolectadas y concentradas in vacuo para dar #140 (4.0 mg, 30%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 731.2 [M+H+l, tiempo de retención = 0.70 minutos. 'H RMN (400 MHz, metanol-d4), 7.30-7.41 (m), 4.71-4.78 (m), 4.58-4.69 (m), 4.04-4.15 (m), 3.86-3.98 (m), 3.73-3.78 (m), 3.61-3.70 (m), 3.50-3.58 (m), 3.32-3.47 (m), 3.23-3.26 (m), 3.17-3.22 (m), 3.07-3.15 (m), 2.95-2.98 (m), 2.76-2.91 (m), 2.68-2.75 (m), 2.63-2.66 (m), 2.43-2.51 (m), 2.22-2.28 (m), 1.99-2.11 (m), 1.74-1.96 (m), 1.21-1.31 (m), 1.17-1.20 (m), 0.92-1.10 (m), 0.79-0.89 (m).
Etapa 6B. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(1S)-2-amino-1-bencil-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#141). Siguiendo el mismo procedimiento que en #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.), solución de amoniaco (7M en metanol, 0.026 mL, 0.18 mmol, 10eq.) y purificación (Método J*), se obtuvo #141 (3.0 mg, 20%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 717.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.79 minutos. 1H RMN (400 MHz, metanol-d4), 7.22-7.30 (m), 7.14-7.21 (m), 4.57-4.4.80 (m), 4.02-4.17 (m), 3.92-3.98 (m), 3.84-3.91 (m), 3.32-3.74 (m), 3.17-3.27 (m), 3.06-3.14 (m), 2.77-3.05 (m), 2.65 (s), 2.43-2.51 (m), 2.21-2.26 (m), 1.98-2.13 (m), 1.70-1.94 (m), 1.32-1.69 (m), 1.16-1.31 (m), 0.89-1.13 (m), 0.80-0.88 (m).
Etapa 6C. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- [(1 S)-1-bencil-2-oxo-2-(propilamino)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-metoxi-1 -[(1 S)-1 -metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#142). Siguiendo el mismo procedimiento que en #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) n-propilamina (1 M en THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10. eq) y purificación (Método J*), se obtuvo #142 (3.0 mg, 20%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 759.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.74 minutos. H RMN (400 MHz, metanol-d4), 7.15-7.29 (m), 4.71-4.79 (m), 4.52-4.68 (m), 4.04^.17 (m), 3.87-3.99 (m), 3.73-3.99 (m), 3.73-3.79 (m), 3.50-3.70 (m), 3.34-3.49 (m), 3.06-3.23 (m), 2.79-2.99 (m), 2.44-2.50 (m), 2.28-2.43 (m), 2.22-2.27 (m), 1.75-2.10 (m), 1.34-1.61 (m), 1.16-1.29 (m), 0.92-1.10 (m), 0.77-0.89 (m).
Etapa 6D. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[( 1 R,2R)-3-{[( 1 S )- 1 -bencil-2-(diethylamino)-2-oxoetil]amino}- -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#143). Siguiendo el mismo procedimiento que en #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) dietilamina (1M en THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10 eq.) y purificación (Método J*), se obtuvo #143 (4.0 mg, 30%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 773.3 [M+H+], tiempo de retención = 0.77 minutos. 1H RMN (400 MHz, metanol-d4), 7.16-7.33 (m), 5.10-5.17 (m), 4.96-5.07 (m), 4.68-4.75 (m), 4.60-4.65 (m), 3.61-4.23 (m), 3.35-3.67 (m), 3.16-3.26 (m), 2.99-3.15 (m), 2.78-2.94 (m), 2.30-2.52 (m), 2.19-2.28 (m), 1.73-2.13 (m), 1.83-1.45 (m), 1.19-1.31 (m), 0.92-1.18 (m), 0.80-0.89 (m).
Etapa 6E. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -bencil-2-(ter-butilamino)-2-oxoetil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético #144. Siguiendo el mismo procedimiento que en #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) ter- butilamina (1M en THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10 eq.) y purificación (Método J*), se obtuvo #144 (3.4 mg, 24%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 773.3 [M+H+], tiempo de retención = 0.74 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.21 (d), 8.03-7.98 (m), 7.92 (d), 7.81-7.62 (m), 7.46-7.16 (m), 4.83-4.69 (m), 4.68-4.56 (m), 4.21-4.07 (m), 3.92-3.86 (m), 3.83-3.80 (m), 3.74-3.65 (m), 3.60-3.48 (m), 3.47-3.36 (m), 3.28-3.13 (m), 3.11-3.01 (m), 2.96-2.82 (m), 2.69-2.62 (m), 2.54-2.43 (m), 2.38-2.12 (m), 2.00-1.76 (m), 1.69-1.161 (m), 1.60-1.53 (m), 1.52-0.98 (m), 0.94-0.86 (m).
Preparación de N.2-Dimetilalanil-N-f(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-f(1R.2R)-3-(f 1S.2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-illamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil1pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#145). 1. (1 S,2R)-2-am¡no-1 -fenilpropan-1 -ol, base de Munlg, DMF Etapa 1. Síntesis de N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 R,2S)-2-hidroxi-1-metil-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#145). A una solución sometida a agitación #137 (300 mg, 0.313 mmol, 1.0 eq.) en 3 mL de DMF, se agregó (1S,2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol (54.8 mg, 0.344 mmol, 1.1 eq.) seguido por base de Hunig (0.164 mL, 0.939 mmol, 3.0 eq). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~12 horas. Se agregó después solución de piperidina al 20% en DMF (1 mL, 2.2 mmol, 7.0 eq.) y se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La purificación (Método J*) seguida por concentración de los tubos de ensayo apropiados produjo #145 (190 mg, 74%) como un polvo de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 704.3 [M+H+], tiempo de retención = 0.67 minutos. 1H RMN (400 MHz, CD3OD), d 7.97 (d), 7.73 (d), 7.37-7.41 (m), 7.27-7.36 (m), 7.19-7.25 (m), 4.70- 4.75 (m), 4.58-4.63 (m), 4.49-4.54 (m), 4.14-4.30 (m), 4.04-4.11 (m), 3.87 (dd), 3.63-3.77 (m), 3.51-3.58 (m), 3.46-3.49 (m), 3.38-3.43 (m), 3.25-3.37 (m), 3.15- 3.23 (m), 3.11- 3.14 (m), 3.01- 3.02 (m), 2.59-2.64 (m), 2.52-2.55 (m), 2.44-2.52 (m), 2.41-2.43 (m), 2.07-2.26 (m), 1.73-2.0 (m), 1.65- 1.73 (m), 1.59- 1.65 (m), 1.51-1.59 (m), 1.32- 1.46 (m), 1.23- 1.26 (m), 1.08-1.21 (m), 0.94- .07 (m), 0.83-0.92 (m).
Preparación de 3-metil-D-isovalil-N-inS.2R)-4-í(2S)-2-f(1R,2R)-3-(G( 1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetillamino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il>-2-metoxi-1 -f(1 S)-1 -metilpropil1-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (#1 6). 3-metil-L-isovalil-N-((1 S.2R)-4-((2S)-2-f(1 R.2R)-3-(í( 1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetiHamino>-1-metoxi-2-metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-f(1S)-1-metilDropil]-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (#147). L-isovalil-N-((1 S.2R)-4-((2S)-2-f(1 R.2R)-3-(f(1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetinamino)-1 - metoxi-2-rnetil-3-oxopropillpirrolidin-1-il>-2-metoxi-1 1 S)-1 -metilpropill-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (#148). v D-isovalil-N-((1 S.2R)-4-((2S)-2-ínR.2R)-3-(f(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil1amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1 -il}-2-metoxi-1 -f(1 S)-1 -metilpropin-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (#149).
Etapa 1A. Síntesis de 3-metil-D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoet¡l]amino}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxopropil]pirrol¡din-1 -il}-2-metoxi-1 -[(1 S)-1 -metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#146). Una solución de #114 (225 mg, 0.356 mmol, 1.0 eq.) en 2 mL de diclorometano fue agregada a una solución de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-3-metil-D-isovalina (126 mg, 0.356 mmol, 1.0eq.) en 4 mL de diclorometano. Se agregó base de Hunig (0.188 mL, 1.07 mmol, 3.0 eq.) seguida por HATU (167 mg, 0.427 mmol, 1.2 eq). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y después absorbida en acetato de etilo antes de ser lavada dos veces con 1 M HCI y una vez con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. El solvente orgánico fue removido en un dispositivo Genevac. Se agregó THF (4 mL) seguido por dietilamina (2 mL, 19 mmol, 53.4 eq ). Se permitió la agitación de la reacción durante ~12 horas. La reacción fue concentrada utilizando un dispositivo Genevac seguida por cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% metanol en acetato de etilo) produciendo #146 (183 mg, 69%) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 746.4 [M+H+] tiempo de retención =1.37 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.55 (d), 8.26- 8.36 (m), 7.88-8.03 (m), 7.81 (d), 7.41-7.53 (m), 7.13-7.30 (m), 7.01 (s), 4.71-4.79 (m), 4.44-4.70 (m), 3.96-4.04 (m), 3.70-3.80 (m), 3.62-3.69 (m), 3.40-3.61 (m), 2.76-3.35 (m), 2.67-2.71 (m), 2.56-2.58 (m), 2.06-2.46 (m), 1 .61-1.90 (m), 1.14-1.54 (m), 0.72-1.12 (m).
Etapa 1 B. Síntesis de 3-metil-L-isovalil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#147). Una solución de #114 (224 mg, 0.354 mmol, 1.0 eq.) en 2 mL de diclorometano fue agregada a una solución de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-3-metil-L-isovalina (125 mg, 0.354 mmol, 1.0 eq.) en 4 mL de diclorometano. Se agregó base de Hunig (0.187 mL, 1.06 mmol, 3.0 eq.) seguida por HATU (167 mg, 0.425 mmol, 1.2 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y después absorbida en acetato de etilo antes de ser lavada dos veces con 1 M HCI y una vez con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. El solvente orgánico fue removido en un dispositivo Genevac. Se agregó THF (4 mL) seguido por dietilamina (2 mL, 19 mmol, 53.7 eq.). Se permitió la agitación de la reacción durante -12 horas. La reacción fue concentrada utilizando un dispositivo Genevac seguida por cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% metanol en acetato de etilo) produciendo #147 (216 mg, 82%) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 746.6 [M+H+] tiempo de retención =1.29 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), d 8.56 (m), 8.31-8.39 (m), 8.50 (d), 8.30 (br d), 7.87-8.01 (m), 7.80 (d), 7.40-7.53 (m), 7.14-7.30 (m), 4.45-4.78 (m), 3.94-4.04 (m), 3.70-3.79 (m), 3.61-3.69 (m), 3.42-3.59 (m), 2.97-3.37 (m), 2.80-2.92 (m), 2.32-2.49 (m), 2.05-2.30 (m), 1.61-1.89 (m), 1.37-1.56 (m), 1.14-1.135 (m), 0.70-1.11 (m).
Etapa 1C. Síntesis de L-isovalil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3- {[(1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#148). Una solución de #114 (447 mg, 0.707 mmol, 1.0 eq.) en 2 mL de diclorometano fue agregada a una solución de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-isovalina (240 mg, 0.707 mmol, 1.0eq.) en 4 mL de diclorometano. Se agregó base de Hunig (0.373 mL, 2.12 mmol, 3.0 eq.) seguida por HATU (332 mg, 0.425 mmol, 1.2 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y después absorbida en acetato de etilo antes de ser lavada dos veces con 1 M HCI y una vez con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. El solvente orgánico fue removido en a genevac. Se agregó THF (4 mL) seguido por dietilamina (2 mL, 19 mmol, 26.9 eq.). Se permitió la agitación de la reacción durante -12 horas. La reacción fue concentrada utilizando un dispositivo Genevac seguida por cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% metanol en acetato de etilo) produciendo #148 (182 mg, 35%) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 732.3 [M+H+] tiempo de retención =0.71 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), d 8.56 (d), 8.46-8.52 (m), 8.30 (d), 8.02-8.15 (m), 7.98 (d), 7.80 (d), 7.40-7.53 (m), 7.15-7.30 (m), 4.70-4.80 (m), 4.44-4.69 (m), 3.96-4.05 (m), 3.70-3.79 (m), 3.62-3.69 (m), 3.41-3.59 (m), 2.99-3.35 (m), 2.31-2.95 (m), 2.67-2.71 (m), 2.55-2.59 (m), 2.32-2.48 (m), 2.20-2.31 (m), 1.97-2.19 (m), 1.61-1.88 (m), 1.37-1.56 (m), 1.20-1.34 (m), 1.14-1.19 (m), 1.02-1.11 (m), 0.97-1.01 (m), 0.86-0.96 (m), 0.71-0.83 (m).
Etapa 1 D. Síntesis de D-isovalil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[( 1 S)-1 -bencil-2-metoxi-2-oxoetil]amino}- 1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#149). Una solución de #114 (447 mg, 0.707 mmol, 1.0 eq.) en 2 mL de diclorometano fue agregada a una solución de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-D-isovalina (240 mg, 0.707 mmol, 1.0 eq.) en 4 mL de diclorometano. Se agregó base de Hunig (0.373 mL, 2.12 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (332 mg, 0.425 mmol, 1.2 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y después absorbida en acetato de etilo antes de ser lavada dos veces con 1 M HCI y una vez con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. El solvente orgánico fue removido en un dispositivo Genevac. Se agregó THF (4 mL) seguido por dietilamina (2 mL, 19 mmol, 26.9 eq.). Se permitió la agitación de la reacción durante -12 horas. La reacción fue concentrada utilizando un dispositivo Genevac seguido por cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0%-30% metanol en acetato de etilo) produciendo #149 (154 mg, 30%) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 732.0 [M+H+] tiempo de retención =1.24 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.55 (d), 8.38-8.46 (m), 8.29 (d), 8.03-8.14 (m), 7.97 (d), 7.81 (d), 7.40-7.53 (m), 7.14-7.28 (m), 7.02 (s), 4.71^.79 (m), 4.43-4.69 (m), 3.96-4.05 (m), 3.71-3.80 (m), 3.62-3.70 (m), 3.49-3.60 (m), 3.40-3.48 (m), 3.15-3.34 (m), 3.10-3.14 (m), 3.01-3.09 (m), 2.94-3.00 (m), 2.83-2.93 (m), 2.65-2.71 (m), 2.55-2.59 (m), 2.32-2.48 (m), 2.04-2.31 (m), 1.61-1.89 (m), 1.37-1.52 (m), 1.21-1.35 (m), 1.15-1.20 (m), 1.02-1.10 (m), 0.75-1.01 (m).
Preparación de 1.2-dimetil-L-prolil-N-((1 S.2Rl-4-((2S)-2-f(1 R.2R1- 3-(f(1 S)-1-carboxi-2-feniletillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-i 2-metoxi-1-f(1 S)-1-metilprop¡ll-4-oxobutilVN-metil-L-valinamida (#151 ).
Etapa 1. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolina (#150). Un matraz Parr que contiene 2-metil-L-prolina (1.0 g, 7.7 mmol, 1.0 eq.), 40 ml_ de metanol, Formaldehido 37% en peso en agua (2.1 ml_, 77 mmol, 10 eq.), y Paladio 10% en peso en Carbono (313 mg, 2.94 mmol, 0.38 eq.) fue colocado en un agitador Parr y se permitió la agitación bajo 40 psi de hidrógeno durante -12 horas. El hidrógeno fue removido y la reacción fue filtrada a través de una almohadilla de celita la cual fue enjuagada con una solución de 50% metanol 50% diclorometano. El residuo fue concentrado in vacuo produciendo #150 (1.1 g, 100%) como un sólido de color blanco-negro claro. LC-MS (Protocolo Q): m/z 144.0 [M+H+] tiempo de retención =0.17 minutos.
Etapa 2. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#151 ). A una mezcla sometida a agitación de #114 (125 mg, 0.198 mmol, 1.0 eq), #150 (37 mg, 0.26 mmol, 1.3 eq.), y HATU (98 mg, 0.26 mmol, 1.3 eq.) en 5 ml_ de diclorometano, se agregó base de Hunig (0.14 mL, 0.80 mmol, 4.1 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada in vacuo. Se agregó THF (6 mL) al material crudo. A esta mezcla sometida a agitación se agregó LiOH (14 mg, 0.59 mmol, 3.0 eq) disuelto en 2 mL de agua. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos. La reacción fue concentrada in vacuo y la reacción fue purificada mediante cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 40% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) #151 (147 mg, 69%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 744.3 [M+H*], tiempo de retención = 1.19 minutos; HPLC (Protocolo A at 45 °C): m/z 744.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.631 minutos (pureza > 98%). H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 9.57-9.71 (m), 8.75 (d), 8.42 (d), 8.15 (d), 7.14-7.29 (m), 4.70-4.79 (m), 4.40-4.68 (m), 3.95-4.03 (m), 3.73-3.80 (m), 3.37-3.61 (m), 2.97-3.31 (m), 2.79-2.88 (m), 2.66-2.76 (m), 2.54-2.58 (m), 2.31-2.43 (m), 1.94-2.29 (m), 1.57-1.91 (m), 1.21 -1.52 (m), 0.85-1.10 (m), 0.74-0.82 (m).
Preparación de 1.2-dimet¡l-D-prolil-N-((1 S.2R)-4-((2S)-2-f(1 R.2F - 3-(r(1 S)-1-carbox¡-2-feniletillamino)-1-rnetoxi-2-metil-3-oxopropil1pirrolidin-1-ill- 2-metoxi-1-f(1 S)-1-metilpropin-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (#153).
Etapa 1. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolina (#152). A un matraz Parr que contiene 2-metil-D-prolina (432 mg, 3.34 mmol, 1.0 eq.), Formaldehido 37 % en peso en agua (1.0 mL, 37 mM, 11 eq.), 3.5 mL de metanol y 1 mL de agua, se agregó Palladium 10 % en peso sobre Carbono (108 mg, 0.304 mmol, 0.304 eq.). El matraz fue colocado en un agitador Parr y se permitió la agitación bajo 30 psi de hidrógeno durante ~48 horas. Se removió el hidrógeno y la reacción fue lavada a través de una almohadilla de celita, la cual fue lavada subsecuentemente con metanol. Los elementos orgánicos fueron concentrados in vacuo y después formados como azeotropo con tolueno produciendo #152 (517 mg, 100%) como un sólido. 1H RMN (400 MHz, metanol-d4): d [3.61-3.56 (m, 1 H), 3.07-2.96 (m, 1 H), 2.68 (br s, 3H), 2.34-2.22 (m, 1 H), 2.01-1.88 (m, 1 H), 1.87-1.73 (m, 1 H), 1.40 (br s, 3H)].
Etapa 2. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2- [(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-met¡l-L-valinamida (#153). A una mezcla sometida a agitación de #114 (240 mg, 0.379 mmol, 1.0 eq.), #152 (71 mg, 0.49 mmol, 1.3 eq.), y HATU (188 mg, 0.49 mmol, 1.3 eq.) en 10 ml_ de diclorometano, se agregó base de Hunig (0.27 mL, 4.1 mM, 4.1 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada in vacuo. Se agregó THF (6 mL) al material crudo. A esta mezcla sometida a agitación se agregó LiOH (36 mg, 1.5 mmol, 4 eq.) disuelto en 2 mL de agua. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada in vacuo y la reacción fue purificada mediante cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 40% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) #153 (220 mg, 78%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 744.8 [M+H*], tiempo de retención = 1.16 minutos; HPLC (Protocolo A at 45°C): /z 744.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.713 minutos (pureza > 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 9.72-9.85 (m), 8.65 (t), 8.41 (d), 8.14 (d), 7.14-7.28 (m), 4.69-4.79 (m), 4.38-4.53 (m), 3.95-4.04 (m), 3.73-3.79 (m), 3.37-3.62 (m), 3.13-3.33 (m), 2.95-3.10 (m), 2.79-2.89 (m), 2.67-2.75 (m), 2.00-2.46 (m), 1.61-1.90 (m), 1.22-1.54 (m), 1.02-1.09 (m), 0.95-1.01 (m), 0.85-0.94 (m), 0.75-0.83 (m).
Preparación de N~2~-f2,2-dimeti[-3-fmetilamino)propanoill-N- ((1 S.2R)-2-metoxi-4-((2S)-2-f(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-frn S)-2-fenil-1- (1.3-tiazol-2-il)etil1amino}propil1pi^ N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (# 54).
Etapa 1. Síntesis de N~2~-[2,2-dimetil-3-(metilamino)propanoilJ-N-{( 1 S , 2 R)-2-metoxi-4-{(2S)-2-[( 1 R ,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-1 -[(1 S)-1 -metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#154). A un envase que contiene #50 (100 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) y 1 mL de diclorometano, se agregó ácido 2,2-dimetil-3-(metilamino)propanóico (36 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) seguido por base de Hunig (0.080 mL, 0.456 mmol, 3.0 eq.) y HATU (66 mg, 0.17 mmol, 1.1 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada in vacuo y después absorbida en acetato de etilo antes de ser lavada dos veces con 1 M HCI y una vez con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. La reacción fue concentrada in vacuo. Se agregó dioxano (1 mi) seguido por 4M HCI en dioxano (1.0 mL, 4.0 mmol, 26 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 10% hasta 100% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) produciendo #154 (55.8 mg, 41 %) como un sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 771.8 [M+H+]. H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.70 (d), 8.45 (d), 7.90- 8.15 (m), 7.82 (d), 7.75 (d), 7.55 (dd), 7.40 (dd), 6.90-7.10 (m), 5.10-5.30 (m), 4.45-4.55 (b), 4.30-4.45 (m), 4.20-4.30 (m), 3.75-3.90 (m), 3.50-3.60 (m), 3.15- 3.40 (m), 3.05-3.15 (m), 2.85-3.05 (m), 2.60-2.85 (m), 2.25-2.40 (m), 1.80-2.25 (m), 1.70-1.80 (m), 1.20-1.60 (m), 0.80-1.10 (m), 0.05-0.80 (m).
Preparación de metil N-((2R.3R)-3-r(2S)-1-((3R.4S.5S)-4-f(N-í2.2- dimetil-3-(metilamino)propanoil1-L-valil)(metinamino1-3-metoxi-5- metilheptanoil)pirrolidin-2-in-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#155).
Etapa 1. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4- [{N-[2,2-dimetil-3-(metilamino)propanoil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5- metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-met¡lpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#155). A un envase que contiene #114 (96.2 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) y 1 mL de diclorometano, se agregó 2,2-dimetil-3- (metilamino)propanóico (36.1 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) seguido por base de Hunig (0.080 mL, 0.456 mmol, 3.0 eq.) y HATU (66 mg, 0.17 mmol, 1.1 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada in vacuo y después absorbida en acetato de etilo antes de ser lavada dos veces con 1 M HCI y una vez con salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y decantada. La reacción fue concentrada in vacuo. Se agregó dioxano (1 mi) seguido por 4M HCI en dioxano (1.0 mL, 4.0 mmol, 26 eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante ~12 horas. La reacción fue concentrada in vacuo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 10% hasta 100% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) produciendo #155 (22.2 mg, 17%). 1H RMN (400 MHz, D SO-de), d 8.55 (d), 8.22 (d), 8.15-8.35 (m), 7.90-8.05 (m) 7.10-7.25 (m) 4.70-4.80 (m), 4.55-4.65 (m), 4.45-4.52 (m), 3.93-4.00 (m), 3.72-3.78 (m), 3.60-3.70 (m), 3.50-3.60 (m), 3.40-3.50 (m), 2.80-3.30 (m), 2.45-2.60 (m), 2.00-2.45 (m), 1.60-1.80 (m), 1.35-1.50 (m), 1.10-1.35 (m).
Preparación de metil N-((2R.3R)-3-metoxi-3-f(2S)-1-((3R,4S.5S)-3-metoxi-5-metil-4-fmetil(N-(f(2S)-2-met¡lpiperidin-2-illcarbonil}-L-valil)amino1heptanoil)pirrolidin-2-il1-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#158) y metil N-((2R.3R)-3-metoxi-3-f(2S)-1-((3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-fmetil(N-ff(2R)-2-metilpiperidin-2-illcarbonil)-L-valil)amino1heptanoil)pirrolidin-2-il1-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#159) Etapa 1. (Síntesis de ácido (2S)-1-(ter-butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-carboxílico (#156) y ácido (2R)-1-(ter-butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-carboxílico (#157). Se separó ácido 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-carboxílico (500 mg, 2.06 mmol, 1 eq.) por medio de cromatografía de fluido supercrítica (Columna: Chiralcel OJ-H, 250 x 21 mm; Eluyente: 90:10 dióxido de carbono/etanol; Velocidad de flujo: 65 g/min; para dar los enantiómeros correspondientes. El primer pico de elución (tiempo de retención = 1.57 minutos) fue aislado para dar #156 como una goma (140 mg, 28%) (estereoquímica asignada de manera arbitraria como el enantiómero S). 1H R N (400 MHz, CDCI3) d 3.83-3.90 (m, 1 H), 2.93-3.01 (m, 1 H), 1.87-1.97 (m, 1 H), 1.67-1.77 (m, 3H), 1.48-1.66 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.44 (s, 9H). Rotación óptica: [a]D25 -21.7° (c 0.40, cloroformo). El Segundo pico de elución (tiempo de retención = 2.22 minutos) fue aislado para dar #157 como un aceite (255 mg, 51 %) (estereoquímica asignada de manera arbitraria como el enantiómero R). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 3.83-3.90 (m, 1 H), 2.93-3.01 (m, 1 H), 1.87-1.97 (m, 1 H), 1.67-1.77 (m, 3H), 1.48-1.66 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.44 (s, 9H). Rotación óptica: [a]D25 +30.2°(cloroformo).
Etapa 2A. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-Lvalil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#158). A una solución de #156 (8.3 mg, 0.034 mmol, 1 eq.) en diclorometano (0.3 mL) y N,N-dimetilformamida (0.05 mL), se agregó N,N-diisopropiletilamina (0.018 mL, 0.102 mmol, 3 eq.), seguida por HATU (16.1 mg, 0.041 mmol, 1.2 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 15 minutos y se agregó #114 (23.4 mg, 0.037 mmol, 1.1 eq.) y fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas. La reacción fue diluida con diclorometano (2.5 mL) y se agregó ácido cítrico al 10% (1.5 mL). Las capas fueron separadas utilizando un cartucho separador de fase y la capa acuosa extraída con diclorometano (2 X 2.5 mL) y las capas orgánicas combinadas fueron concentradas in vacuo. El residuo fue disuelto en diclorometano (4 ml_) y se agregó ácido trifluoroacético (0.5 mL). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, concentrada después in vacuo. La purificación por medio de cromatografía de fase inversa (método M*) produjo #158 (10.6 mg, 49%). HPLC (Protocolo T): m/z 758.4 [M+H+], tiempo de retención = 2.53 minutos (pureza >99%). H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.74-8.90 (m), 8.49-8.55(m), 8.24 (d), 8.08-8.12 (m), 7.94-8.01 (m), 7.14-7.26 (m), 4.71-4.77 (m), 4.57-4.68 (m), 4.44-4.55(m), 3.94-4.0 (m), 3.73-3.78 (m), 3.40-3.72 (m), 3.16-3.32 (m), 2.98-3.16 (m), 2.82-2.92 (m), 2.47-2.56 (m), 2.38-2.44 (m), 2.20-2.37 (m), 2.08-2.19 (m) 1.74-1.88 (m), 1.61-1.73 (m), 1.52-1.59 (m), 1.22-1.52 (m), 1.05 (dd), 0.94-1.00 (m), 0.85-0.93 (m), 0.74-0.79 (m).
Etapa 2B. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbon¡l}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#159). A una solución de #157 (7.8 mg, 0.032 mmol, 1 eq.) en diclorometano (0.3 mL) y ?,?-dimetilformamida (0.05 mL), se agregó ?,?-diisopropiletilamina (0.017 mL, 0.096 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (14.9 mg, 0.038 mmol, 1.2 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 15 minutos y se agregó #114 (22.1 mg, 0.035 mmol, 1.1 eq.) y fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas y después concentrada in vacuo. La purificación del residuo a través de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 80% acetona en heptano) produjo un sólido de color blanco el cual fue disuelto en dioxano (0.2 mL) y se agregó 4N HCI en dioxano (0.2 mL). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas y se agregó 4N HCI en dioxano (0.1 mL) adicional. La reacción fue sometida a agitación durante 2 horas a temperatura ambiente, concentrada in vacuo. La purificación por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) produjo #159 (6.6 mg, 33 %). HPLC (Protocolo T): m/z 758.4 [M+H+], tiempo de retención = 2.46 minutos (pureza = 89%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.86-8.95 (m), 8.75-8.84(m), 8.48-8.54 (m), 8.33-8.45 (m), 8.22-8.27 (m), 8.17-8.19 (m), 7.99-8.12 (m), 7.83-7.91 (m), 7.13-7.29 (m), 7.04-7.08 (m), 4.69-4.76 (m), 4.55-4.66 (m), 4.45-4.53 (m), 3.96-4.01 (m), 3.41-3.78 (m), 3.28-3.33 (m), 3.24-3.27 (m), 3.16-3.23 (m), 3.11-3.15 (m), 3.02-3.10 (m), 2.93-3.02 (m), 2.91-2.93 (m), 2.84-2.91 (m), 2.76-2.82 (m), 2.69-2.71 (m), 2.60-2.63 (m), 2.53-2.55 (m), 2.47-2.53 (m), 2.40-2.46 (m), 2.30-2.38 (m), 2.20-2.30 (m), 2.06-2.17 (m), 1.75-1.87 (m), 1.52-1.74 (m), 1.35-1.51 (m), 1.14-1.34 (m), 1.01 -1.08 (m), 0.92-1.0 (m), 0.85-0.94 (m), 0.74-0.82 (m).
Preparación de N-((2R.3R)-3-metoxi-3-f(2S)-1-f(3R.4S,5S)-3- metox¡-5-metil-4-fmetil(N-(r(2S)-2-metilpiperidin-2-¡ncarbonil>-L-valil)amino1heptanoil)pirrolidin-2-il]-2-metilpropano¡l>-L-fenilalanina. sal de ácido trifluoroacético (#162) v N-((2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-((3R.4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-fmetil(N-(r(2R)-2-metilpiperidin-2-il1carbonil>-L-valil)am¡nolheptanoil}pirrolidin-2-in-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético. (#163).
Etapa 1A. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2S)-1 -(ter-butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#160). A una solución de #156 (106 mg, 0.436 mmol, 1 eq.) en diclorometano (3 mL) y N,N-dimetilformamida (0.5 mL) se agregó diisopropiletilamina (0.228 mL, 1.31 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (205 mg, 0.523 mmol, 1.2 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 15 minutos y se agregó #114 (276 mg, 0.436 mmol, 1 eq.) y fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción fue diluida con diclorometano (10 mL) y lavada con ácido cítrico al 10% (3 X 5 mL). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada y el filtrado concentrado in vacuo. La purificación por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 80% acetona en heptano) produjo #160 (145 mg, 39%). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 858.8 [M+H+], tiempo de retención = 1.12 minutos.
Etapa 1 B. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4- [(N-{[(2R)-1 -(ter-butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#161 ). A una solución de #157 (109 mg, 0.448 mmol, 1 eq.) en diclorometano (3 mL) y N,N-dimetilformamida (0.5 mL), se agregó diisopropiletilamina (0.234 mL, 1.34 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (205 mg, 0.538 mmol, 1.2 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 15 minutos y se agregó #114 (284 mg, 0.448 mmol, 1 eq.). Después de ser sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla fue diluida con diclorometano (10 mL), lavada con ácido cítrico al 10% (3 X 5 mL). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada in vacuo. La purificación por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 100% acetona en heptano) produjo #161 (185 mg, 48%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 858.3 [M+H+], tiempo de retención = 2.25 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#162). A una solución de #160 (145 mg, 0.169 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (1.25 mL) se agregó hidróxido de litio (8 mg, 0.338 mmol, 2 eq.) disuelto en agua (0.75 ml_). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas y evaporada hasta deshidratación in vacuo. El residuo fue disuelto en diclorometano (2.5 ml_) y se agregó ácido trifluoroacético (1 ml_). La reacción fue sometida a agitación durante 30 minutos, concentrada in vacuo y purificada por medio de cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 0% hasta 100% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) para obtener el compuesto de título #162 (145 mg, cuantitativo) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo U): m/z 744.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.121 minutos (pureza = 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6). d 8.76-8.96 (m), 8.52-8.58 (m), 8.38-8.43 (m), 8.11- 8.16 (m), 7.27-7.30 (m), 7.12-7.27 (m), 7.01-7.05 (m), 4.71-4.79 (m), 4.48-4.67 (m), 4.39-4.47 (m), 3.79-4.22 (m), 3.71-3.78 (m), 3.38-3.57 (m), 3.22-3.30 (m), 3.14-3.23 (m), 3.07-3.13 (m), 2.96-3.06 (m), 2.76-2.87 (m), 2.66-2.68 (m), 2.47-2.57 (m), 2.42-2.44 (m), 2.06-2.40 (m), 1.73-1.89 (m), 1.51-1.72 (m), 1.36-1.49 (m), 1.20-1.35 (m), 1.00-1.09 (m), 0.95-0.99 (m), 0.83-0.94 (m), 0.73-0.80 (m).
Etapa 2B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#163). El compuesto #161 (185 mg, 0.216 mmol, 1 eq.) fue convertido al compuesto de título crudo #163, usando el procedimiento descrito para la Preparación de #162. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 0% hasta 85% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) a fin de producir #163 (127 mg, 68%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo U): m/z 744.5 [M+H+], tiempo de retención = 7.077 minutos (pureza = 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-de). d 8.79-8.99 (m), 8.36-8.49 (m), 8.12-8.17 (m), 7.31-7.34 (m), 7.11 -7.27 (m), 7.05-7.09 (m), 4.71-4.77 (m), 4.54-4.68 (m), 4.40-4.53 (m), 3.88-4.39 (m), 3.71-3.77 (m), 3.39-3.58 (m), 3.22-3.32 (m), 3.10-3.22 (m), 3.04-3.09 (m), 2.92-3.03 (m), 2.77-2.88 (m), 2.68-2.71 (m), 2.47-2.57 (m), 2.43-2.45 (m), 2.30-2.42 (m), 2.03-2.29 (m), 1.74-1.88 (m), 1.52-1.73 (m), 1.37-1.51 (m), 1.17-1.37 (m), 1.00-1.07 (m), 0.95-0.99 (m), 0.84-0.93 (m), 0.73-0.81 (m).
Preparación de metil N-((2R.3R)-3-í(2S)-1-((3R,4S.5S)-4-f(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-illcarbonil)-L-valil)(metil)aminol-3-metoxi-5-met¡lheptano¡l)pirrolidin-2-in-3-metoxi-2-metilpropanoil>-L-fenilalaninato. sal de ácido trifluoroacético (#172) v metil N-((2R.3R)-3-f(2S)-1-((3R.4S,5S)-4-f(N-{r(3R)-3-fluorop¡rrolidin-3-illcarbonil)-L-valil)(metil)amino1-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-ill-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#173).
Etapa 1. Síntesis de metil (3R)-1-bencil-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato (#164) y metil (3S)-1-bencil-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato (#165). El (metil 1-bencil-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato (3900 mg, 16.4 mmol, 1 eq.) fue separado por medio de cromatografía de fluido supercrítica (Columna: Chiralpak IC, 250 x 21 mm; Eluyente: 95:5 dióxido de carbono/propanol; Velocidad de flujo: 65 g/min; a fin de proporcionar los enantiómeros correspondientes. El primer pico de elución (tiempo de retención = 3.37 minutos) fue aislado para obtener #164 (1720 mg, 36%) como un enantiómero individual (estereoquímica asignada de manera arbitraria como enantiómero R). 1H RMN (400 MHz, TMS-CDCI3; d 7.17-7.30 (m, 5H), 3.74 (s, 3H), 3.65 (d, J = 12.9 Hz, 1 H), 3.63 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.86-3.03 (m, 3H), 2.61 (q, J = 8.0 Hz, 1 H), 2.34-2.46 (m, 1 H), 2.13-2.26 (m, 1 H). Rotación óptica: [a]D25 +24.7° (cloroformo). El Segundo pico de elución (tiempo de retención = 3.91 minutos) fue aislado para producir #165 (1600 mg, 33%) como un enantiómero individual (estereoquímica asignada de manera arbitraria como enantiómero S). 1 H RMN (400 MHz, CDCI3; (CH3)4Si), d 7.17-7.30 (m, 5H), 3.74 (s, 3H), 3.65 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 12.9 Hz, 1 H), 2.86-3.03 (m, 3H), 2.61 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 2.34-2.46 (m, 1 H), 2.13-2.26 (m, 1 H). Rotación óptica: [a]D25 - 23.3° (cloroformo).
Etapa 2A. Síntesis de 1-ter-butil 3-metil (3R)-3-fluoropirrolidin- 1 ,3-dicarboxilate (#166). A una solución que contiene #164 (355mg, 1.50 mmol, 1 eq.) y Di-ter-butil carbonato (400mg, 1.8 mmol, 1.2 eq.) en metanol (15.5 mL) se agregó 10% Pd/C (70 mg). La reacción fue hidrogenada a 45 psi en un agitador Parr durante 22 horas, filtrada sobre celita, y el filtrado concentrado in vacuo y purificada por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 30% acetato de etilo en heptano) para obtener #166 como un aceite transparente. (272 mg, 74%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3), d 3.87 (s, 3H), 3.85-3.66 (m, 3H), 3.56 (m, 1H), 2.53-2.28 (m, 2H), 1.51 (s, 9H).
Etapa 2B. Síntesis de 1-ter-butil 3-metil (3S)-3-fluoropirrolidin- 1 ,3-dicarboxilato (#167). El compuesto #165 (362mg, 1.53 mmol, 1 eq.) fue convertido a #167 con un rendimiento de 63% utilizando el método descrito con anterioridad para #164. 1H RMN (400 MHz, CDCI3), d 3.87 (s, 3H), 3.85-3.66 (m, 3H), 3.56 (m, 1 H), 2.53-2.28 (m, 2H), 1.51 (s, 9H).
Etapa 3A. Síntesis de ácido (3R)-1 -(ter-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxílico (#168). A una solución de #166 (272mg, 1.10 mmol, 1 eq.) disuelto en metanol (2.96 ml_) se agregó una solución acuosa de hidróxido de sodio (2.5 M, 0.88 ml_) y la reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 3.5 horas. La reacción fue apagada con ácido cítrico acuoso al 10% (5 mL), se agregó acetato de etilo (100 mL) y las capas fueron separadas. La capa orgánica fue lavada con ácido cítrico al 10%, agua y salmuera, secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada in vacuo para generar #168 como un sólido de color blanco. (253mg, 99%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3), d 3.96-3.69 (m, 3H), 3.59 (m, 1 H), 2.59-2.33 (m, 2H), 1.51 (s, 9H). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 232.1 [M-H+], tiempo de retención = 0.67 minutos. HPLC Quiral, tiempo de retención: 3.39 min (pureza = 99%). (Columna: Chiralpak AD-H, 4.6mm x 25cm, Fase móvil 5-60% C02/Metanol, velocidad de flujo 3.0 mL/min); Rotación óptica: [a]D25 4.8 (c= 0.52, MeOH) Etapa 3B. Síntesis de ácido (3S)-1-(ter-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxílico (#169). A una solución de #167 (238 mg, 0.963 mmol, 1 eq.) disuelta en metanol (2.6 mL) se agregó una solución acuosa de hidróxido de sodio (2.5 M, 0.88 mL) y la reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción fue apagada después con ácido cítrico acuoso al 10% (5 mL) y se agregó acetato de etilo (100 mL), y se separaron las capas. La capa orgánica fue lavada con ácido cítrico al 10%, agua y salmuera, secada después sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada in vacuo para producir #169 como un sólido de color blanco (221 mg, 99%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3), d 3.96-3.69 (m, 3H), 3.59 (m, 1 H), 2.59-2.33 (m, 2H), 1.51 (s, 9H). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 232.1 [M-H+], tiempo de retención = 0.67 minutos. HPLC Quiral, tiempo de retención: 3.95 min (pureza = 98%) (Columna: Chiralpak AD-H, 4.6mm x 25cm, Fase móvil 5-60% C02/Metanol, velocidad de flujo 3.0 mL/min); Rotación óptica: [a]?25 -3.6 (c= 0.55, MeOH) Etapa 4A. Síntesis de litio (3R)-1 -(ter-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato (#170). A una solución de #168 (50 mg, 0.21 mmol, 1 eq.) en metanol (0.2 mL) se agregó una solución de hidróxido de litio (9.2 mg, 0.38 mmol, 1.8 eq.) disuelto en agua (0.1 mL). A continuación, se agregó tetrahidrofurano (0.3 mL) y la reacción fue sometida a agitación a 45°C durante 18 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el material fue formado como azeotropo (3X) con tolueno (2 mL) para obtener #170 (51 mg, 100%) como un sólido de color blanco el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 4B. Síntesis de litio (3S)-1-(ter-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-carboxilato (#171). A una solución de #169 (75 mg, 0.32 mmol, 1 eq.) en metanol (0.3 mL) se agregó una solución de hidróxido de litio (13.8 mg, 0.572 mmol, 1.8 eq.) en agua (0.4 mL). A continuación, se agregó tetrahidrofurano (0.45 mL) y la reacción fue sometida a agitación a 45°C durante 18 horas. La reacción fue concentrada in vacuo y el material fue formado como azeotropo (3X) con tolueno (4 mL) para obtener #171 (77 mg, 100%) como un sólido de color blanco, el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 5A. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1 -{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#172). A una suspensión de #168 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) y #114 (100 mg, 0.158 mmol, 1.0 eq.) en N,N-dimetilformamida (0.8 mL) y diclorometano (3.6 mL) se agregó N,N-diisopropiletilamina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1.0 eq.) y la reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas. La reacción fue diluida con acetato de etilo y lavada sucesivamente con agua, ácido cítrico acuoso al 10% (P/V), y salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y concentrada in vacuo para dar 220 mg (164% de nivel teórico) de un crudo intermedio. Una porción de este crudo intermedio (50 mg, 23%) fue disuelta en diclorometano (1.5 mL) y se agregó ácido trifluroacético (0.4 mL). La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas y evaporada hasta deshidratación in vacuo. La purificación por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) produjo #172 (15.8 mg, 51 %) LC-MS (Protocolo Q): m/z 748.9 [M+H+] tiempo de retención = 1.29 minutos. 1H RMN (DMSO-de), 9.16-9.43 (m), 8.48-8.53 (m), 8.40-8.44 (m), 8.34-8.39 (m), 8.22-8.30 (m), 8.09-8.16 (m), 7.87-7.91 (m), 7.77-7.83 (m), 7.12-7.24 (m), 4.56-4.72 (m), 4.41-4.54 (m), 3.92-4.00 (m), 3.70-3.75 (m), 3.39-3.66 (m), 3.20-3.25 (m), 3.12-3.20 (m), 2.97-3.11 (m), 2.94 (br s), 2.75-2.89 (m), 2.63- 2.69 (m), 2.47-2.54 (m), 2.29- 2.45 (m), 2.15- 2.27 (m), 2.02-2.15 (m), 1.57- 1.87 (m), 1.33- .51 (m), 1.19-1.30 (m),1.02 (dd), 0.82-0.97 (m), 0.70-0.79 (m).
Etapa 5B. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato, sal de ácido trifluoroacético (#173). A una suspensión de #169 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1eq.) y #114 (100.0 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) en N,N-dimetilformamida (0.8 ml_) y diclorometano (3.6 ml_) se agregó N,N-diisopropiletilamina (0.083 ml_, 0.474 mmol, 3 eq.), seguida por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1 eq.). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 14 horas, diluida con acetato de etilo, y lavado de manera sucesiva con agua, ácido cítrico acuoso al 10% (P/V), y salmuera. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y concentrado in vacuo para dar 180 mg (134% de nivel teórico) de un crudo intermedio. Una porción de este crudo intermedio (50 mg, 27%) fue disuelta en diclorometano (1.5 mL) y se agregó ácido trifluroacético (0.4 mL) y la mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas y evaporada hasta deshidratación in vacuo. La purificación por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) produjo #173 (17.6 mg, 45%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 748.9 [M+H+] tiempo de retención =1.29 minutos. 1H RMN (DMSO-d6) 9.35-9.50 (m), 9.22-9.34 (m), 8.47-8.52 (m), 8.39-8.45 (m), 8.30-8.37 (m), 8.22-8.24 (m), 8.09-8.13 (m), 7.80-7.85 (m), 7.67-7.72 (m), 7.09-7.24 (m), 6.97-6.98 (m), 4.65-4.72 (m), 4.55-4.64 (m), 4.41-4.50 (m), 3.92-3.99 (m), 3.42-3.75 (m), 3.32-3.39 (m), 3.25-3.31 (m), 3.21-3.24 (m), 3.11-3.20 (m), 3.06-3.11 (M), 2.97-3.05 (m), 2.95 (br s), 2.83-2.88 (m), 2.76-2.82 (m), 2.65-2.70 (m), 2.44-2.54 (m), 2.15-2.42 (m), 2.02-2.14 (m), 1.57-1.84 (m), 1.33-1.48 (m), 1.19-1.30 (m), 1.02 (dd), 0.92-0.97(m), 0.82-0.91 (m), 0.70-0.77 (m).
Preparación de (2S)-N-f(2S)-1-m3R.4S.5S)-1-{(2S)-2-f(1 R.2R)-3-(f2-(ciclohepta-2A6-trien-1-il)etil1amino)-1-m 1 -ill-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-ill(metil)amino)-3-metil-1 -oxobutan-2-ill-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal de clorhidrato (#178) v (2R)-N-Í(2S)-1-m3R.4S.5S)-1- (2S)-2-fn R.2R)-3-ff2-(ciclohepta-2.4.6-trien-1-il)etil^ metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il1(metil)amino}-3-metil-1 -oxobutan-2-ill-2-metilpiperidin-2-carboxamida. sal de clorhidrato (#180).
Etapa 1. Síntesis de pentafluorofenil (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H- fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoato (#174). A una solución de #@5 (19.43 g, 37.03 mmol, 1 eq.) en diclorometano (100 ml_) y piridina (5.86 g, 74.1 mmol, 2 eq.) se agregó pentafluorofenil trifluoroacetato (20.7 g, 74.1 mmol, 2 eq.) y la reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción fue concentrada in vacuo y purificada por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 52% acetato de etilo en heptano) a fin de producir #174 (23.58 g, 92%) como un aceite de color amarillo. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 691.2 [ +H+], tiempo de retención = 1.23 minutos.- Etapa 2. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il];-N~'2~-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-metil-L-valinamida (#175). A una solución de #174 (706 mg, 1.02 mmol, 1 eq.) y #64 (311 mg, 1.02 mmol, 1 eq.) en diclorometano (3 ml_) se agregó N,N-diisopropiletilamina (400 mg, 3.07 mmol, 3 eq.). Después de 18 horas de agitación a temperatura ambiente, la reacción fue concentrada in vacuo y purificada por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 100% acetato de etilo en heptano) para obtener #175 (560 mg, 68%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 611.8 [M+H+], tiempo de retención = 1.15 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#176). De acuerdo con el procedimiento general A, a partir de #1 5 (560 mg, 0.690 mmol, 1 eq.) en diclorometano (9 ml_), y N,N-dietilamina (6.0 ml_), se sintetizó el compuesto crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 50% metanol en diclorometano) para obtener #176 (351 mg, 87%) como un aceite de color amarillo. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 589.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.72 minutos.
Etapa 4A. Síntesis de ter-butil (2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato (#177). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #176 (100 mg, 0.170 mmol, 1 eq.), #156 (53.8 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.), diclorometano (4.5 ml_), HATU (84.9 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.) y N,N-diisopropiletilamina (0.123 mL, 0.697 mmol, 4.1 eq.), se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 100% acetato de etilo en heptano) a fin de producir #177 (145 mg, se asume rendimiento cuantitativo) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 814.7 [M+H+], tiempo de retención = 1.14 minutos.
Etapa 4B. Síntesis de ter-butil (2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1- {(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato (#179). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #176 (100 mg, 0.170 mmol, 1 eq.), #157 (53.8 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.), diclorometano (4.5 ml_), HATU (84.9 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.) y N,N-diisopropiletilamina (0.123 ml_, 0.697 mmol, 4.1 eq.), se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 100% acetato de etilo en heptano) a fin de producir #179 (155 mg, se asume rendimiento cuantitativo) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 814.7 [M+H+], tiempo de retención = 1.14 minutos.
Etapa 5A. Síntesis de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal de clorhidrato (#178). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #177 (143 mg, 0.176 mmol, 1 eq.) y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (2.0 ml_) se sintetizó el material deseado como una goma (145 mg). Una porción de este residuo crudo (25 mg) fue formada como azeotropo con una mezcla de metanol/acetonitrilo a fin de producir #178 (20 mg, rendimiento 89%) como un sólido de color blanco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.96-9.07 (m), 8.79-8.96 (m), 8.58 (d), 8.02- 8.08 (m), 7.77-7.83 (m), 7.25-7.31 (m), 7.19-7.24 (m), 6.56-6.67 (m), 6.12-6.21(m), 5.13-5.22 (m), 4.72-4.81 (m), 4.63-4.70 (m), 4.50-4.59 (m), 4.07-4.16 (m), 3.98-4.05 (m), 3.80-3.86 (m), 3.55-3.76 (m), 3.46-3.54 (m), 3.38 -3.44 (m), 3.26-3.35 (m), 3.18-3.24 (m), 3.05-3.18 (m), 2.98-3.04 (m), 2.40-2.55 (m), 2.27-2.35 (m), 2.08-2.27 (m), 1.74-1.98 (m), 1.50-1.74 (m), 1.20-1.46 (m), 0.73-1.16 (m). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 714.6 [M+H+], tiempo de retención = 0.76 minutos. HPLC (Protocolo U): m/z 714.5 [M+H+] tiempo de retención = 7.124 minutos (pureza =91%).
Etapa 5B. Síntesis de (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal de clorhidrato (#180). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #179 (162 mg, 0.199 mmol, 1 eq.) y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (2.0 ml_) se sintetizó el material deseado como una goma (155 mg). Una de esta goma (25 mg) fue formada como azeotropo con una mezcla 1/1 de metanol/acetonitrilo a fin de producir #180 (20 mg, 83%) como un sólido. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), d 9.02-9.13 (m), 8.83-8.93 (m), 8.39-8.46 (m), 8.00-8.06 (m), 7.78 (t), 7.24-7.30 (m), 7.16-7.21 (m), 6.54-6.65 (m), 6.09-6.19 (m), 5.11-5.18 (m), 4.69-4.78 (m), 4.59-4.68 (m), 4.46-4.56 (m), 4.08-4.13 (m), 3.95-4.03 (m), 3.77-3.85 (m), 3.54-3.73 (m), 3.43-3.53 (m), 3.37-3.42 (m), 3.24-3.33 (m), 3.16-3.22 (m), 3.03- 3.15 (m), 2.99-3.02 (m), 2.89-2.98 (m), 2.65-2.76 (m), 2.41-2.54 (m), 2.15-2.39 (m), 2.07-2.15 (m), 1.51-1.94 (m), 1.49 (d), 1.38 (t), 1.20-1.32 (m), 1.02-1.09 (m), 0.84-0.97 (m), 0.73-0.81 (m). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 714.6 [M+H+], tiempo de retención =0.76 HPLC (Protocolo U): m/z 714.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.409 minutos (pureza =90%).
Preparación de 2-metil-L-prolil-N-í(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-f(1 R.2R)- 3-lf2-(ciclohepta-2^,6-trien-1-il)etillamino -1-metoxi-2-metil-3- oxopropillpirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N-metil-L- valinamida. sal de ácido fórmico (#182) v N-í(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-f(1R.2R)-3- (f2-(ciclohepta-2,4.6-trien-1-il)etiHamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidi 1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N~2~-(f(3R)-3-fluoropirrolidin-3- incarbonil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#184) y N- K3R.4S.5SH -l(2S)-2-f(1 R,2R)-3-f r2-(ciclohepta-2.4.6-trien-1 -il)etillamino)-1 - metoxi-2-met¡l-3-oxopropil|pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill- N~2~-(r(3S)-3-fluoropirrolidin-3-illcarbonil>-N-metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (#186).
Etapa 1A. Síntesis de 1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolil-N- [(3Rl4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1- metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida (#181). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #176 (100 mg, 0.170 mmol, 1 eq.), (S)-1-(ter-butoxicarbonil)-2-metil-L- prolina (50.7 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.), diclorometano (4.3 ml_), HATU (84.9 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.) y N,N-diisopropiletilamina (0.123 ml_, 0.697 mmol, 4.1 eq.), se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 hasta 100% acetato de etilo en heptano) a fin de producir #181 (142 mg, se asume rendimiento cuantitativo). LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 800.6 [M+H+], tiempo de retención = 1.11 minutos.
Etapa 1 B. Síntesis de ter-butil (3R)-3-{[(2S)-1 -{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-3-fluoropirrolidin-1-carboxilato (#183). A una solución de #170 (18.2 mg, 0.076 mmol, 1 eq.) en diclorometano (1.8 ml_) y N,N-dimetilformamida (0.3 mL) se agregó N,N-diisopropiletilamina (0.040 ml_, 0.228 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (29.2 mg, 0.076 mmol, 1 eq.). Después de someter a agitación durante 10 minutos a temperatura ambiente, se agregó #176 (45 mg, 0.076 mmol, 1 eq.). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y se agregó HATU adicional (29 mg, 0.076 mmol, 1 eq.). Después de 8 horas the la reacción fue concentrada in vacuo a fin de proporcionar #183 (61.0 mg, cuantitativo) el cual fue llevado a la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 826.6 [M+Na+], tiempo de retención = 1.05 minutos.
Etapa 1 C. Síntesis de ter-butil (3S)-3-{[(2S)-1 -{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3- oxopropil]p¡rrolidin-1-¡l}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](met¡l)amino}-3-m 1-oxobutan-2-il]carbamoil}-3-fluorociclopentanecarboxilato (#185). A una solución de #171 (24 mg, 0.1 mmol, 1 eq.) en diclorometano (2.35 mL) y N,N-dimetilformamida (0.33 mL) se agregó N,N- diisopropiletilamina (0.053 mL, 0.300 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (38.4 mg, 0.100 mmol, 1 eq.). Después de someter a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos, se agregó #176 (58.9 mg, 0.1 mmol, 1 eq.). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y se agregó una cantidad adicional de HATU (38.4 mg, 0.100 mmol, 1 eq.) y N,N-dimetilformamida (0.2 mL) y se sometió a agitación durante 9 horas adicionales. La reacción fue concentrada in vacuo para dar #185 (80 mg, cuantitativo), el cual fue llevado a la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 804.6 [M+H+], tiempo de retención = 1.05 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido fórmico (#182). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #181 (136 mg, 0.170 mmol, 1 eq.) y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (2 mL) se sintetizó el material deseado como una goma (142 mg). Una porción de este residuo crudo (20 mg, 14%) fue formada como azeotropo con una mezcla 1/1 de metanol/acetonitrilo y después purificada por medio de cromatografía de fase inversa (Método O) para obtener #182 (10 mg, 57% durante dos etapas) como un sólido. HPLC (Protocolo U): m/z 700.4 [ +H+], tiempo de retención = 7.106 minutos (pureza > 90%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.25-8.39 (m), 8.20-8.25 (m), 7.96- 7.99 (m), 7.74-7.77 (m), 6.55-6.63 (m), 6.10-6.18 (m), 5.11- 5.18 (m), 4.66-4.72 (m), 4.51-4.61 (m), 4.46-4.50 (m), 3.96-4.01 (m), 3.37-3.86 (m), 3.20-3.36 (m), 3.11-3.19 (m), 3.03-3.11 (m), 2.98-3.03 (m), 2.90-2.96 (m), 2.77-2.79 (m), 2.65-2.73 (m), 2.57-2.63 (m), 2.47-2.56 (m), 2.36-2.46 (m), 2.26-2.32 (m), 2.14-2.25 (m), 2.03-2.10 (m), 1.92-2.03 (m), 1.72-1.92 (m), 1.64-1.72 (m), 1.60-1.64 (m), 1.50-1.59 (m), 1.39-1.48 (m), 1.23-1.32 (m), 1.18-1.22 (m), 1.12-1.14 (m), 1.01-1.09 (m), 0.83-1.00 (m), 0.74-0.83 (m), 0.70- 0.74 (m).
Etapa 2B. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1 -il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3R)-3-fluorop¡rrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida sal de ácido trifluoroacético (#184). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #183 (61.1 mg, 0.076 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.3 mL), y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (0.9 mL) se sintetizó el material crudo deseado (140 mg). Una porción del material crudo (98 mg, 69 %) fue purificada por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #184 (7.6 mg, 20% durante dos etapas). HPLC (Protocolo T): m/z 704.5 [M+H+], tiempo de retención = 2.50 minutos (pureza = 84%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.67-8.71 (m), 8.44-8.48 (m), 8.27-8.33 (m), 8.22-8.27 (m), 7.97-8.03 (m), 7.84-7.89 (m), 7.74-7.81 (m), 7.43-7.48 (m), 7.23-7.29 (m), 7.17-7.21 (m), 6.55-6.66 (m), 6.10-6.19 (m), 5.10-5.19 (m), 4.66-4.75 (m), 4.51-4.63 (m), 3.96-4.04 (m), 3.78-3.85 (m), 3.65-3.73 (m), 3.46-3.62 (m), 3.37-3.45 (m), 3.24-3.37 (m), 3.21-3.24 (m), 3.13-3.21 (m), 3.02-3.13 (m), 2.95-3.00 (m), 2.80-2.82 (m), 2.66-2.71 (m), 2.47-2.57 (m), 2.24-2.46 (m), 2.09-2.24 (m), 1.95-2.05 (m), 1.49-1.93 (m), 1.22-1.34 (m), 1.02-1.09 (m), 0.83-1.01 (m), 0.74-0.82 (m).
Etapa 2C. Síntesis de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N---2---{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#186). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #185 (80.3 mg, O. mmol, 1 eq.), diclorometano (0.4 mL), y una 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (1.2 mL) se sintetizó el material crudo deseado, en el cual una porción (94 mg, 53%) fue purificada por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #186 (11.8 mg, 32% durante dos etapas). 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), d 8.85-9.07 (m), 8.29-8.41 (m), 7.99-8.04 (m), 7.76-7.84 (m), 6.56-6.68 (m), 6.12-6.21 (m), 5.12-5.21 (m), 4.87-4.99 (m), 4.69-4.79 (m), 4.49-4.67 (m), 3.98-4.06 (m), 3.80-3.87 (m), 3.64-3.76 (m), 3.55-3.64 (m), 3.47-3.54 (m), 3.39-3.46 (m), 3.26-3.39 (m), 3.22-3.25 (m), 3.18- 3.22 (m), 3.06-3.14 (m), 2.98-3.01 (m), 2.55- 2.57 (m), 2.42-2.49 (m), 2.11-2.38 (m), 2.09 (s), 1.78-1.97 (m), 1.72-1.77 (m), 1.51-1.71 (m), 1.24-1.36 (m), 1.07 (dd), 0.83-1.03 (m), 0.75- 0.82 (m). HPLC (Protocolo T): m/z 704.5 [M+H+], tiempo de retención = 2.48 minutos (pureza = 100%).
Preparación de (2S)-N-f(2S)-1-(í(3R^S,5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-f(1 R.2F -1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-(f(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etillamino)propil1pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)ami 1-oxobutan-2-ill-2-metilpiperidin-2-carboxamide, sal de formato (#188) y (2R)-N-f(2S)-1-(f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-f(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(r(1S)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-¡l)etillamino}propillpirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-ill-2-metilpiperidin-2-carboxamide. sal de formato (#190) v N~2~-(í(3R)-3-fluoropirrolidin-3-incarbonil>-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-r(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(r(1S)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-il)etinamino)prop¡llpirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#192) y N~2~-(f(3S)-3-fluoropirrolidin-3-illcarbonil)-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-f(1 R.2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(f(1S)-2-fenil-1-(1.3-tiazol-2-il)etillamino)propillpirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamid sal de ácido trifluoroacético (#194).
Etapa 1A. Síntesis de ter-butil (2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3- metox¡-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metox¡^ 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3^ metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-met¡lpiperid¡n-1-carboxilato (#187). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #86 (280 mg, 0.4 mmol, 1 eq.), #156 (100 mg, 0.4 mmol, 1 eq.)t diclorometano (5ml_), HATU (182 mg, 0.48 mmol, 1.2 eq.) y N,N-diisopropiletilamina (100 mg, 0.8 mmol, 2 eq.) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0.01 hasta 0.05% metanol en diclorometano) a fin de producir #187 (220 mg, 62%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo V): m/z 883.57 [M+H+], tiempo de retención = 3.23 minutos (pureza = 95%).
Etapa 1 B. Síntesis de ter-butil (2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi- 1 -{(2S)-2-[( 1 R, 2R)- 1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-fenil- 1 -( 1 , 3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidin-1-carboxilato (#189). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #86 (400 mg, 0.6 mmol, 1 eq.), #157 (146 mg, 0.6 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 ml_), HATU (259 mg, 0.72 mmol, 1.2 eq.) y N,N-diisopropiletilamina (158 mg, 1.2 mmol, 2 eq.) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0.01 hasta 0.05% metanol en diclorometano) a fin de producir #189 (220 mg, 37%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo W): m/z 883.7 [M+H+], tiempo de retención = 4.12 minutos (pureza = 95%).
Etapa 1C. Síntesis de ter-butil (3R)-3-fluoro-3-{[(2S)-1- {[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4- il](met¡l)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}pirrolidin-1-carboxilato (#191). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #86 (300 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), #168 (106 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL), HATU (194 mg, 0.54 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (117 mg, 0.9 mmol, 2 eq.) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método P) a fin de producir #191 (159 mg, 40%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo X): m/z 873.4 [M+H+], tiempo de retención = 3.32 minutos (pureza = 99%).
Etapa 1D. Síntesis de ter-butil (3S)-3-fluoro-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}pirrolidin-1-carboxilato (#193). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #86 (300 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), #169 (106 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL), HATU (194 mg, 0.54 mmol, 1.2 eq.) y diisopropiletilamina (117 mg, 0.9 mmol, 2 eq.) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método P) a fin de producir #193 (149 mg, 37%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo X): m/z 873.4 [M+H+], tiempo de retención = 3.34 minutos (pureza = 98%).
Etapa 2A. Síntesis de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1- {(2S)-2-[(1 R.2R)- 1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil- 1 -(1 , 3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-m 1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal de ácido fórmico (#188). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #187 (20 mg, 0.023 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 mL), acetonitrilo (0.1 mL) y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (0.26 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método NT) para obtener #188 (11.6 mg, 61%,); HPLC (Protocolo T): m/z 783.8[M+H+], tiempo de retención = 2.53 minutos (pureza= 96%). 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.82-8.87 (m), 8.60-8.63 (m), 8.26-8.29 (m), 7.84-7.90 (m), 7.75-7.81 (m), 7.60-7.67 (m), 7.21-7.31 (m), 7.14-7.19 (m), 5.49-5.55 (m), 5.37-5.42 (m), 4.69-4.75 (m), 4.59-4.65 (m), 4.50-4.56 (m), 3.95-4.01 (m), 3.77-3.82 (m), 3.54-3.61 (m), 3.47-3.53 (m), 3.24-3.45 (m), 3.14-3.23 (m), 3.03-3.08 (m), 2.96-3.03 (m), 2.78-2.80 (m), 2.64-2.73 (m), 2.60-2.62 (m), 2.47-2.56 (m), 2.31-2.45 (m), 2.13-2.28 (m), 2.00-2.07 (m), 1.92-1.99 (m), 1.71-1.86 (m), 1.58-1.70 (m), 1.50-1.56 (m), 1.38-1.49 (m), 1.15-1.36 (m), 1.08-1.14 (m), 1.03-1.07 (m), 0.90-1.02 (m), 0.83-0.90 (m), 0.73-0.80 (m), 0.70-0.73 (m).
Etapa 2B. Síntesis de (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidin-2-carboxamida, sal de ácido fórmico. (#190). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #189 (20 mg, 0.022 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 ml_), acetonitrilo (0.1 mL) y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (0.26 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método N*) para obtener #190 (13.2 mg, 73%,) HPLC (Protocolo T): m/z 783.7[M+H+], tiempo de retención = 2.5 minutos (pureza= 100%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 8.83-8.86 (m), 8.60-8.62 (m), 8.24-8.27 (m), 7.83-7.89 (m), 7.78-7.80 (m), 7.75-7.77 (m), 7.64-7.66 (m), 7.60-7.63 (m), 7.20-7.31 (m), 7.13-7.19 (m), 5.49- 5.55 (m), 5.36-5.42 (m), 4.65-4.74 (m), 4.60-4.65 (m), 4.50-4.56 (m), 3.95-4.01 (m), 3.76-3.81 (m), 3.53-3.62 (m), 3.47-3.52 (m), 3.22-3.45 (m), 3.14-3.21 (m), 2.97-3.05 (m), 2.93-2.96 (m), 2.79-2.86 (m), 2.76-2.78 (m), 2.65-2.68 (m), 2.48-2.56 (m), 2.37-2.43 (m), 2.29-2.35 (m), 2.17-2.27 (m), 2.04-2.11 (m), 1.93-2.00 (m), 1.70-1.85 (m), 1.53-1.69 (m), 1.36-1.48 (m), 1.28-1.36 (m), 1.13-1.26 (m), 1.08-1.12 (m), 0.98-1.07 (m), 0.91-0.97 (m), 0.84-0.91 (m), 0.73-0.78 (m).
Etapa 2C. Síntesis de N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}- N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#192). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #191 (10 mg, 0.011 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 mL), acetonitrilo (0.1 mL) y 4M solución de ácido clorhídrico en dioxano (0.13 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para obtener #192 (5.1mg, 60 %) HPLC (Protocolo T): m/z 773.5[M+H+ ], tiempo de retención = 2.43 minutos (pureza = 100%).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 9.32-9.44 (m), 9.17-9.21 (m), 8.91 (d), 8.63-8.69 (m), 8.38-8.43 (m), 8.22-8.27 (m), 7.80 (dd), 7.66 (dd), 7.14-7.33 (m), 5.49-5.57 (m), 5.37-5.45 (m), 4.10-4.78 (m), 3.97-4.06 (m), 3.77-3.83 (m), 3.33-3.65 (m), 3.15-3.29 (m), 2.95-3.09 (m), 2.82-2.83 (m), 2.67-2.71 (m), 2.55-2.57 (m), 2.32-2.54 (m), 2.10-2.31 (m), 2.09 (s), 1.72-1.90(m), 1.57-1.72 (m). 1.38-1.50 (m), 1.15-1.38 (m), 1.09 (dd), 0.85-1.0 (m), 0.75-0.83 (m).
Etapa 2D. Síntesis de N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(1 ,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#194). De acuerdo con el procedimiento general C, a partir de #193 (10 mg, 0.011 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 mL), acetonitrilo (0.1 ml_) y 4 solución de ácido clorhídrico en dioxano (0.13 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para obtener #194 (9 mg, 93%) HPLC (Protocolo T): m/z 773.8 [M+H+], tiempo de retención = 2.42 minutos (pureza = 100%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 9.39-9.52 (m), 9.21-9.35 (m), 8.90 (d), 8.63-8.69 (m), 8.42-8.48 (m), 8.29 -8.34 (m), 7.80 (dd), 7.66 (dd), 7.22-7.33 (m), 7.13-7.21 (m), 5.47-5.57 (m), 5.36-5.44 (m), 4.43-4.93 (m), 3.97-4.05 (m), 3.64-3.83 (m), 3.32-3.61 (m), 3.15-3.29 (m), 3.06-3.09 (m), 2.95-3.05 (m), 2.89-2.95 (m), 2.82-2.84 (m), 2.67-2.72 (m), 2.54-2.56 (m), 2.48-2.53 (m), 2.28-2.48 (m), 2.11-2.28 (m), 2.09 (s), 1.57-1.72 (m), 1.38-1.47 (m), 1.15-1.37 (m), 1.09 (dd), 0.85-0.99 (m), 0.78 (t).
Preparación de 1,2-dimetil-D-prolil-N-f(3R.4S,5S)-1-f(2S)-2- f(1 R,2R)-3-(f(2S)-3-(4-aminofeniO-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il1amino)-1 -metoxi- 2-metil-3-oxoprop¡npirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N-metil-L- valinamida. sal de formato (#200) v 1.2-dimetil-D-prolil-N-f(3R,4S.5S)-1-((2S)- 2-f(1 R.2R)-3-ff(2S)-3-(4-aminofenil)-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-illamino>-1 - metoxi-2-metil-3-oxoprop¡l1pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N- metil-L-valinamida, sal de formato (#201).
Etapa 1. Síntesis de 1 ,2-dimet¡l-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-ter- butoxi-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#195). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #6 (7.75 g, 21.6 mmol, 1 eq.), #152 (3.88 g, 21.6 mmol, 1 eq.), diclorometano (100 mL), HATU (9.8 g, 25.9 mmol, 1.2 eq.), y düsopropiletilamina (11.1 g, 86.4 mmol, 4 eq.) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 20 hasta 55% acetato de etilo en éter de petróleo) a fin de producir #195 (11.1 g, rendimiento cuantitativo) como un aceite de color amarillo.
Etapa 2. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#196). De acuerdo con el procedimiento general B, a partir de #195 (11.1 g, 21.6 mmol, 1 eq.), diclorometano (100 ml_) y ácido trifluoroacético (40 ml_) se sintetizó el material crudo deseado, para obtener #196 (10.1 g, rendimiento cuantitativo) que fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional. LC-MS (Protocolo Z): m/z 428.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.9 minutos.
Etapa 3. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-1 -oxo-1 -(pentafluorofenoxi)heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#197). A una solución enfriada (0°C) de #196 (4.0 g, 9.4 mmol, 1 eq.) en diclorometano (40 ml_) se agregó mediante goteo piridina (2.95 g, 37.6 mmol, 4eq.) seguida por una solución de pentafluorofenil trifluoroacetato (3.9 g, 13.6 mmol, 1.4 eq.) en diclorometano (5 mL). La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante una hora, y el solvente fue concentrado in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 1 hasta 10% metanol en diclorometano) a fin de producir el compuesto #197 (4.5 g, 81.2% (durante tres etapas) como un sólido de color blanco.
Etapa 4. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1 R,2R)-2-carbox¡-1 -metoxipropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan- 4-¡l]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#198). A una solución enfriada (0°C) de #197 (4.0 g, 7.4 mmol, 1 eq.) en diclorometano (25 mL) se agregó mediante goteo diisopropiletilamina (3.4 g, 26.3 mmol, 3.5 eq.) seguida por una solución #103 (2.3 g, 7.6 mmol, 1.02 eq.) en diclorometano (15 mL). Después de la adición, la mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas y se removió el solvente in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 1 hasta 10% metanol en diclorometano) seguida por una segunda purificación por medio de cromatografía de fase inversa (Método Q) para dar #198 (1.57 g, 57.5%) como un sólido de color blanco HPLC (Protocolo X): m/z 597.49 [M+H+] tiempo de retención = 8.879 minutos (pureza = 98%). HPLC Quiral, tiempo de retención: 3.328 min (pureza = 98%) Columna: Columna: Chiralcel OJ-H, 250 x 4.6 mm, 5 µ?t?; Fase móvil: metanol (0.05% dietilamina) en CO2 a partir de 5% hasta 40% durante 15 minutos; Velocidad de flujo: 2.35 mUminuto.
Etapa 5. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(pentafluorofenoxi)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#199). A una solución de #198 (280 mg, 0.394 mmol, 1 eq.) en diclorometano (2 mL) se agregó piridina (75 mg, 0.94 mmol, 2.4 eq.) seguida por una solución de pentafluorofenil trifluoroacetato (268 mg, 0.94 mmol, 2.4 eq.) en diclorometano (1.5 mL). La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2.5 horas, y el solvente fue concentrado in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 1 hasta 10% metanol en diclorometano) a fin de producir el compuesto #199 (279 mg, 39%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 763.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.93 minutos.
Etapa 6A. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi- 1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-1 -oxo-3-(1 ,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#200). A una mezcla de #199 (25 mg, 0.033 mmol, 1 eq) y #215 ((7.7 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) en diclorometano (1.5 ml_), se agregó N,N-diisopropiletilamina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 5 minutos y se agregó N,N-dimetilformamida (0.5 mL). Después de someter a agitación durante 2 ½ horas, se agregó N,N-diisopropiletilamina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) adicional. Después de 3 ½ horas, se agregó más N,N-dimetilformamida (0.75 mL) y la mezcla fue sometida a agitación durante 18 horas. Se agregaron N,N-diisopropiletilamina (15.1 mg, 1.15 mmol, 3.6 eq.) y ?,?-dimetilformamida (0.25 mL) adicionales y la reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 48 horas. La mezcla de reacción fue concentrada in vacuo y el producto crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #200 (12.9 mg, 48 %). HPLC (Protocolo T): m/z HPLC (Protocolo T): m/z 407.7, cambio doble [2+], tiempo de retención = 1.69 minutos (pureza = 100 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 9.72-9.82 (m), 8.61-8.67 (m), 8.42-8.48 (m), 8.19-8.24 (m), 7.25-7.27 (m), 7.12-7.14 (m), 6.94-7.01 (m), 6.88- 6.94 (m), 6.78- 6.84 (m), 6.67- 6.74 (m), 6.57-6.64 (m), 4.69-4.77 (m), 4.60-4.68 (m), 4.53-4.60 (m), 4.46-4.53 (m), 4.37-4.45 (m), 3.97-4.05 (m), 3.76-3.81 (m), 3.62-3.67 (m), 3.53-3.62 (m), 3.44-3.52 (m), 3.32-3.38 (m), 3.27-3.32 (m), 3.22-3.27 (m), 3.15-3.22 (m), 3.06-3.14 (m), 2.97-3.01 (m), 2.92-2.96 (m), 2.74-2.83 (m), 2.61-2.74 (m), 2.57-2.61 (m), 2.48-2.56 (m), 2.37-2.46 (m), 2.25-2.36 (m), 2.00-2.20 (m), 1.67-1.91 (m), 1.47-1.60 (m), 1.37-1.47 (m), 1.24-1.35 (m), 1.03-1.10 (m), 0.95-1.00 (m), 0.88-0.94 (m), 0.76-0.83 (m).
Etapa 6B. Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#201 ). A una mezcla de #199 (25 mg, 0.033 mmol, 1eq) y el metil 4-amino-L-fenilalaninato comercialmente disponible (8.8 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) en diclorometano (1.5 mL), se agregó N,N-diisopropiletilamina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 5 minutos y se agregó ?,?-dimetilformamida (0.5 mL). Después de 4 horas, se agregó ?,?-diisopropiletilamina adicional (37.75 mg, 2.88 mmol, 8.25 eq.) y la mezcla fue sometida a agitación durante 50 minutos. Se agregó N,N-dimetilformamida (0.75 mL) adicional y la reacción fue sometida a agitación durante 66 horas, concentrada in vacuo y el producto crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #201 (14.3 mg, 56 %); HPLC (Protocolo T): m/z 387.2, carga doble [2+], tiempo de retención = 1.50 minutos (pureza= 100%).; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 9.68-9.84 (m), 8.57-8.66 (m), 8.46-8.51 (m), 8.23-8.29 (m), 7.18-7.28 (m), 7.11-7.16 (m), 7.03-7.08 (m), 6.97-7.02 (m), 4.67-4.75 (m), 4.58-4.66 (m), 4.34-4.57 (m), 3.95-4.03 (m), 3.85-3.90 (m), 3.73-3.81 (m), 3.66-3.72 (m), 3.57-3.66 (m), 3.50-3.57 (m), 3.42-3.49 (m), 3.32-3.38 (m), 3.14-3.30 (m), 2.95-3.11 (m), 2.84-2.94 (m), 2.78-2.81 (m), 2.63-2.74 (m), 2.46-2.57 (m), 2.34-2.45 (m), 2.19-2.34 (m), 1.97-2.19 (m), 1.67-1.90 (m), 1.45-1.62 (m), 1.34-1.41 (m), 1.21-1.34 (m), 1.01-1.10 (m), 0.82-0.99 (m), 0.72-0.81 (m).
Preparación de 1.2-dimetil-L-prolil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-f(1 R,2R)-1 -metoxi-3-(f(2S)-1 -metoxi-1 -???-3-? .2.3.4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2-il1amino>-2-metil-3-oxopropil1pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-in-N-metil-L-valinamida. sal de formato. (#207) y 1.2-dimetil-L-prolil-N-f(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-f(1 R.2R)-3-ir(2S)-3-(4-aminofenil)-1-metoxi-1 -oxopropan-2-il1amino)-1 -metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolidin-1 -ilj-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamida sal de formato (#208) y 1.2-dimetil-L-prolil-N-f(3R.4S.5S)-3-metoxi-1-((2S)-2-r(1R.2R)-1-metoxi-3-ff(2S)-1 -metoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-inamino)-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1 -il)-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida. sal de ácido trifluoroacético (#209) Etapa 1. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-ter-butoxi-3-metoxí-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida (#202). De acuerdo con el procedimiento general D, a partir de #6 (4.3 g, 12 mmol, 1 eq.), #150 (2.15 g, 12 mmol, 1 eq.), diclorometano (50 mL), HATU (5.46 g, 14 mmol, 1.2 eq.), y diisopropiletilamina (8.17 mL) se sintetizó el material crudo deseado, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 20 hasta 55% acetato de etilo en éter de petróleo) a fin de producir #202 (5.2 g, 89 %) como un aceite de color amarillo.
Etapa 2. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(2R,3S,4S)-1-carboxi- 2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#203). De acuerdo con el procedimiento general B, a partir de #202 (5.2 g, 10.77 mmol, 1 eq.), diclorometano (45 mL), y ácido trifluoroacético (20 mL) se sintetizó el material crudo deseado, para obtener #203 (7 g, rendimiento cuantitativo) el cual fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 3. Síntesis de 1 ,2-dimet¡l-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi- 5-metil-1 -oxo-1 -(pentafluorofenoxi)heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#204). A una solución enfriada (0°C) de #203 (7.0 g, 10.77 mmol, 1 eq.) en diclorometano (15 mL) se agregó mediante goteo piridina (3.41 g 43.08 mmol, 4eq.) seguida por una solución de pentafluorofenil trifluoroacetato (6.03 g, 21.54 mmol, 2 eq.) en diclorometano (7 mL). La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante una hora, y el solvente fue concentrado in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 1 hasta 10% metanol en diclorometano) a fin de producir el compuesto #204 (8 g, 82% durante dos etapas) como un sólido de color amarillo.
Etapa 4. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#205). A una solución enfriada (0°C) de #204 (8.0 g, 10.77 mmol, 1 eq.) en diclorometano (25 mL) se agregó mediante goteo diisopropiletilamina (5.6 g, 43.08 mmol, 4 eq.) seguida por una solución de #103 (3.22 g, 10.77 mmol, 1 eq.) en diclorometano (15 mL). Después de la adición, la mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas y se removió el solvente in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 1 hasta 10% metanol en diclorometano) para dar #205 (2.2 g, 33 %) como un sólido de color amarillo HPLC (Protocolo X): m/z 597.42 [M+H+], tiempo de retención = 8.729 minutos (pureza > 97%), HPLC Quiral, tiempo de retención: 2.87 min (pureza = 89%) Columna: Chiralcel OD-3, 150 x 4.6 mm, 3 pm; Fase móvil: etanol (0.05% dietilamina) en C02 desde 5% hasta 40% durante 12 minutos; Velocidad de flujo: 2.5 mlJminuto.
Etapa 5. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi- 1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(pentafluorofenoxi)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#206). A una solución de #198 (0.28 g, 0.47 mmol, 1 eq.) en diclorometano (2 mL) se agregó piridina (75 mg, 0.94 mmol, 2 eq.) seguida por una solución de pentafluorofenil trifluoroacetato (268 mg, 0.94 mmol, 2 eq.) en diclorometano (1.5 mL). La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2.5 horas, y el solvente fue concentrado in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 1 hasta 10% metanol en diclorometano) a fin de producir el compuesto #206 (348 mg, 97%) como un sólido de color blanco. LC-MS (protocolo Q1): m/z 763.5 [M+H+], tiempo de retención = 0.9 minutos.
Etapa 6A. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-1 -oxo-3-(1 ,2,3,4- tetrahidroquinolin-6-¡l)propan-2-il]am metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metíl-L-val¡nam¡da, sal de ácido trifluoroacético. (#207). Se preparó el compuesto de título a partir de #206 (25 mg, 0.033 mmol, 1eq.) y #215 (7.7 mg, 0.033 mmol, 1 eq) utilizando el método descrito con anterioridad para Preparación de #200. El producto crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #207 (11.7 mg, 44%). HPLC (Protocolo T): m/z 407.6, carga doble [2+], tiempo de retención = 1.59 minutos (pureza = 100%). 1H RMN (DMSO-d6) 9.57-9.69 (m), 8.68- 8.76 (m), 8.42-8.47 (m), 8.23-8.29 (m), 8.18-8.23 (m), 7.24-7.27 (m), 6.95-7.01 (m), 6.89-6.94 (m), 6.80-6.86 (m), 6.70-6.78 (m), 6.60-6.67 (m), 4.69- 4.77 (m), 4.60-4.68 (m), 4.46-4.60 (m), 4.34-4.46 (m), 3.95-4.03 (m), 3.87-3.91 (m), 3.79-3.85 (m), 3.74-3.79 (m), 3.60-3.66 (m), 3.49-3.60 (m), 3.41-3.49 (m), 3.12-3.35 (m), 3.04-3.12 (m), 2.89-3.04 (m), 2.68-2.83 (m), 2.61-2.67 (m), 2.45-2.55 (m), 2.34-2.44 (m), 2.08-2.33 (m), 2.05-2.08 (m), 1.92-2.05 (m), 1.75-1.91 (m), 1.65-1.75 (m), 1.59-1.64 (m), 1.34-1.58 (m), 1.20-1.31 (m), 1.01-1.09 (m), 0.94-0.99 (m), 0.84-0.93 (m), 0.80-0.83 (m), 0.72-0.80 (m).
Etapa 6B. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il]am¡no}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida sal de ácido trifluoroacético (#208). A una mezcla de #206 (25.0 mg, 0.033 mmol, 1 eq.), y el metil 4-amino-L-fenílalaninato comercialmente disponible (8.8 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) en diclorometano (1.5 mL), se agregó N,N-diisoprop¡let¡lam¡na (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.). La reacción fue sometida a agitación durante 5 minutos y se agregó N,N-dimetilformamida (0.5 ml_). Después de 2 ½ horas, se agregó ?,?-düsopropiletilamina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) adicional. Después de someter a agitación durante 3 1/2 horas, se agregó N,N-dimetilformamida (0.75 ml_) adicional y la reacción fue sometida a agitación durante 66 horas, concentrada in vacuo y el producto crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #208 (13 mg, 51 %); HPLC (Protocolo T): m/z 387.2, carga doble [2+], tiempo de retención = 1.58 minutos (pureza= 100%).; 1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 9.54-9.69 (m), 8.68-8.75 (m), 8.46-8.50 (m), 8.33-8.37 (m), 8.22-8.31 (m), 8.09-8.14 (m), 7.17-7.27 (m), 7.07-7.16 (m), 6.99-7.05 (m), 6.92-6.99 (m), 4.69-4.75 (m), 4.60-4.68 (m), 4.42-4.59 (m), 4.34-4.42 (m), 3.95-4.03 (m), 3.85-3.90 (m), 3.74-3.80 (m), 3.65-3.72 (m), 3.62-3.65 (m), 3.42-3.62 (m), 3.31-3.36 (m), 3.24-3.30 (m), 3.11-3.24 (m), 3.03-3.11 (m), 2.96-3.03 (m), 2.81-2.92 (m), 2.65-2.76 (m), 2.43-2.55 (m), 2.34-2.43 (m), 2.06-2.33 (m), 1.93-2.05 (m), 1.75-1.89 (m), 1.66-1.74 (m), 1.58-1.65 (m), 1.47-1.57 (m), 1.34-1.43 (m), 1.20-1.32 (m), 1.10-1.14 (m), 1.00-1.09 (m), 0.83-0.99 (m), 0.72-0.81 (m).
Etapa 6C. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#209). Se preparó el compuesto de título a partir de #206 (25.0 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) y clorhidrato de metil-L- fenilalaninato (7.1 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) utilizando el método descrito con anterioridad para Preparación de #200. El producto crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para dar #209 (10.3 mg, 41%). HPLC (Protocolo T): m/z 758.7 [M+H+], tiempo de retención = 1.787 minutos (pureza= 100%).1H RMN (DMSO-d6) 9.57-9.70 (m), 8.70-8.75 (m), 8.50-8.56 (m), 8.32-8.42 (m), 8.24-8.26 (m), 8.10-8.15 (m), 7.14-7.27 (m), 7.12-7.13 (m), 6.98-7.00 (m), 4.69-4.77 (m), 4.55-4.67 (m), 4.43-4.53 (m), 3.94-4.02 (m), 3.73-3.78 (m), 3.62-3.68 (m), 3.48-3.60 (m), 3.39-3.48 (m), 3.23-3.33 (m), 3.13-3.22 (m), 3.08-3.13 (m), 3.02-3.08 (m), 2.96-3.01 (m), 2.81 -2.94 (m), 2.76-2.80 (m), 2.66-2.75 (m), 2.62-2.66 (m), 2.46-2.55 (m), 2.31-2.45 (m), 2.09-2.29 (m), 2.05-2.09 (m), 1.93-2.04 (m), 1.74-1.88 (m), 1.65-1.74 (m), 1.59-1.65 (m), 1.36-1.52 (m), 1.21 -1.35 (m), 1.01-1.08 (m), 0.94-1.00 (m), 0.83-0.94 (m), 0.73-0.81 (m).
Preparación de metil (2S)-2-amino-3-(1.2.3.4-tetrahidroauinolin-6- ¡Dpropanoato Etapa 1. Síntesis de 6-(bromometil)quinolina (#210). Una solución de 6-metilquinolina (5 g, 35 mmol, 1 eq.), N-Bromosuccinimida (8.1 g, 45.5 mmol, 1.3 eq.) y peróxido de benzoilo (840 mg, 3.5mmol, 0.1 eq.) en tetracloruro de carbono (100 mL) fue sometida a agitación a reflujo durante 3 horas y después enfriada hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción fue filtrada y el filtrado fue concentrado in vacuo. El residuo fue disuelto en tetrahidrofurano (100 mL) y filtrado. El filtrado fue utilizado de manera directa en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 2. Síntesis de 6-{[(2S,5R)-3,6-dimetoxi-5-(propan-2-il)-2,5-dihidropyrazin-2-il]metil}quinolina (#211 ). A una solución enfriada (-70X) de (2R)-3,6-dimetoxi-2-(propan-2-il)-2,5-dihidropirazina (25.8 g, 140 mmol, 2 eq.) en tetrahidrofurano (200 mL) se agregó mediante goteo n-butillitio (2.5 M, 64.4 mL, 161 mmol. 2.3eq.) y después fue sometida a agitación durante 30 minutos. Una solución de #210 (15.4 g, 70 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (150 mL) se agregó mediante goteo a -65°C y después la solución fue sometida a agitación durante 2 horas a esta temperatura. La reacción fue apagada por medio de cloruro de amonio acuoso saturado (100 mL) y extraída con acetato de etilo (100 mL). La fase orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y concentrada in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía de columna en gel de sílice (Gradiente: 10 hasta 16% acetato de etilo en éter de petróleo) a fin de producir #211 (7.3g, 32%, durante dos etapas) como un sólido de color amarillo. LC-MS (Protocolo Z): m/z 326.2[M+H+], tiempo de retención = 0.88 minutos.
Etapa 3. Síntesis de metil (2S)-2-amino-3-(quinolin-6- il)propanoato (#212). A una solución de #211 (7.3 g, 22.5 mmol, 1 eq.) en agua (25 mL) y acetonitrilo (80 mL) se agregó ácido trifluoroacético (9 mL) a 0°C y la solución fue sometida a agitación a10°C durante la noche. La capa orgánica fue removida in vacuo y la capa acuosa remanente fue basificada hasta pH 9 con carbonato de sodio, que fue utilizado de manera directa en la siguiente etapa.
Etapa 4. Síntesis de metil (2S)-2-[(ter-butoxicarbonil)amino]-3- (quinolin-6-il)propanoato (#213). A una solución de #212 (5.2 g, 22.5 mmol, 1 eq.) y trietilamina (9.1 g, 90 mmol, 4eq.) en solvente mezclado de metanol (30 mL) y agua (50 mL) se agregó di-ter-butil dicarbonato (17.5 g, 78.75 mmol, 3.5 eq.) a 0°C y después la solución fue sometida a agitación a 10°C durante la noche. La mezcla de reacción fue filtrada y la torta de filtro fue lavada con metanol (20 mL X 2). El filtrado fue extraído con acetato de etilo (50 mL X 2) y la fase orgánica fue concentrada in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía de columna en gel de sílice (Gradiente: 25 hasta 50% acetato de etilo en éter de petróleo) a fin de producir #213 (5.5 g, 74% durante dos etapas) como un aceite de color amarillo. LC-MS (Protocolo Z): m/z 331.2[M+H+], tiempo de retención = 0.76 minutos.
Etapa 5. Síntesis de metil (2S)-2-[(ter-butoxicarbonil)amino]-3-(1 ,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propanoato (#214) Una suspensión de #213 (1.5 g, 4.55 mmol, 1 eq.) y paladio en carbono (150 mg) en etanol (20 mL) fue sometida a agitación a 50°C bajo 30 psi de hidrógeno durante la noche. La mezcla de reacción fue filtrada a través de una almohadilla de celita y el filtrado fue concentrado in vacuo. La reacción fue purificada mediante cromatografía de columna en gel de sílice (Gradiente: 40% acetato de etilo en éter de petróleo) a fin de producir #214 (1.2 g, 80%) como un aceite. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 6.70 (d, 2H), 6.40 (m, 1 H), 4.95 (m, 1 H), 4.49 (m, 1 H), 3.77 (s, 3H), 3.28 (m, 2H), 2.97 (m, 2H), 2.71 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.26 (s, 9H), HPLC (Protocolo Y): m/z 357.0 [M+Na+] tiempo de retención = 5.304 minutos (pureza >98%). HPLC Quiral, tiempo de retención: 4.64 min (pureza = 98%) (Columna: Chiralcel OJ-H, 150 x 4.6 mm, 5 pm; Fase móvil: etanol (0.05% dietilamina) en C02 desde 5% hasta 40% durante 15 minutos; Velocidad de flujo: 2.5 mL/minuto.
Etapa 6. Síntesis de metil (2S)-2-amino-3-(1 ,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propanoato (#215). A una solución de #214 (750 mg, 2.25 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 mL) se agregó mediante goteo ácido trifluoracético (2 mL) a 0°C y después la solución fue sometida a agitación a 20°C durante la noche. La mezcla de reacción fue concentrada in vacuo y el residuo fue disuelto en agua (20 mL). La so9lución fue basificada con carbonato de sodio y extraída con acetato de etiloAetrahidrofurano (30 mL X 3). La fase orgánica fue secada sobre sulfato de sodio y concentrada in vacuo a fin de producir #215 (450 mg, 85%) como un aceite de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): d 6.70 (d, 2H), 6.40 (m, 1 H), 3.73 (s, 3H), 3.67 (m, 1 H), 3.30 (m, 2H), 2.96 (m, H), 2.75 (m, 3H), 1.96 (m, 2H), 1.50 (br, 2H), 1.26 (br, 1 H)., HPLC (Protocolo Y): m/z 235.14 [M+H+] tiempo de retención = 4.35 minutos (pureza > 96%). HPLC Quiral, tiempo de retención: 5.71 min (pureza = 98%). (Columna: Chiralcel OJ-H, 150 x 4.6 mm, 5 µ?t?; Fase móvil: etanol (0.05% dietilamina) en C02 desde 5% hasta 40% durante 15 minutos; Velocidad de flujo: 2.5 mL/minuto.
Preparación de N-((2R.3R)-3-f(2S)-1-((3R.4S.5S)-4-f(N-(í(3R)-3- fluoropirrolid¡n-3-il1carbonil>-L-valil)(metil)amino1-3-metox¡-5- metilheptanoil)pirrolidin-2-¡n-3-metoxi-2-metilpropanoil>-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#217) v N-f(2R.3R)-3-f(2S)-1-((3R.4S.5S)-4-f(N-(í(3S)-3- fluoropirrolidin-3-illcarbonil)-L-valil)(metil)amino1-3-metoxi-5- metilheptanoil>p¡rrolidin-2-ill-3-metox1-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#219).
Etapa 1A. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4- [(N-{[(3R)-1-(ter-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L- valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#216). A una solución de #168 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) y #114 (100 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) en diclorometano (3.6 mL) y N,N-dimetilformamida (0.8 mL), se agregó diisopropiletilamina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 18 horas, diluida con acetato de etilo (25 mL), lavada con agua (1X), ácido cítrico al 10% (1X) y salmuera (1X). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y el filtrado concentrado in vacuo para dar el producto crudo #216 (220 mg, 164% de nivel teórico) que fue usado en la siguiente etapa sin purificación adicional. HPLC (protocolo Q): m/z 848.6 [M+H+], tiempo de retención = 2.10 minutos.
Etapa 1 B. Síntesis de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4- [(N-{[(3S)-1-(ter-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#218). A una solución de #169 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) y #114 (100 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) en diclorometano (3.6 mL) y N,N-dimetilformamida (0.8 mL), se agregó diisopropiletilamina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1eq.). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 18 horas, diluida con acetato de etilo (25 mL), lavada con agua (1 X), ácido cítrico al 10% (1X) y salmuera (1X). La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada, y el filtrado concentrado in vacuo a fin de proporcionar el producto crudo #218 (180 mg, 134% de nivel teórico) el cual fue usado en la siguiente etapa sin purificación adicional. HPLC (protocolo Q): m/z 848.6 [M+H+], tiempo de retención = 2.10 minutos.
Etapa 2A. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fiuoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5- metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#217). A una solución de crudo #216 (134 mg) en tetrahidrofurano (4 mL) se agregó hidróxido de litio (1 M, 0.5 mL). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y concentrada in vacuo. El residuo fue disuelto en diclorometano (2 mL) y se agregó ácido trifluoroacético (2 mL). La reacción fue sometida a agitación durante 4 horas y concentrada in vacuo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para obtener #217 (60 mg, 86% durante dos etapas) como una goma. LC-MS (protocolo Q): m/z 734.93 [?+?G], tiempo de retención = 1.19 minutos. 1H RMN (DMSO-d6) d 12.62-12.83 (m), 9.30-9.43 (m), 9.17-9.28 (m), 8.34-8.41 (m), 8.22-8.31 (m), 8.08-8.15 (m), 7.87-7.93 (m), 7.76-7.81 (m), 7.11-7.23 (m), 4.93-4.99 (m), 4.81 -4.88 (m), 4.55-4.71 (m), 4.48-4.54 (m), 4.37-4.45 (m), 3.92-3.99 (m), 3.69-3.75 (m), 3.31-3.65 (m), 3.25-3.30 (m), 3.20-3.24 (m), 3.12-3.19 (m), 3.08-3.10 (m), 2.97-3.07 (m), 2.92-2.97 (m), 2.75-2.84 (m), 2.64-2.70 (m), 2.43-2.57 (m), 2.28-2.43 (m), 2.15-2.26 (m), 2.02-2.15 (m), 1.56-1.87 (m), 1.31-1.48 (m), 1.05-1.30 (m), 0.97-1.06 (m), 0.82-0.97 (m), 0.71-0.79 (m).
Etapa 2B. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N- {[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#219). A una solución de producto crudo #218 (100 mg) en tetrahidrofurano (4 mL) se agregó 1.0 M hidróxido de litio en agua (0.5 mL). La reacción fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y después fue concentrada in vacuo. El material crudo fue disuelto en diclorometano (2 mL) y se agregó ácido trifluoroacético (2 mL). La reacción fue sometida a agitación durante 4 horas y después concentrada in vacuo. El material crudo fue purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método M*) para obtener #219 como una goma (60 mg, 91% durante dos etapas). LC-MS (protocolo Q): m/z 734.97 [M+l- ], tiempo de retención = 1.14 minutos. H RMN (400 MHz, DMSO-d6), d 12.62-12.85 (m), 9.32-9.43 (m), 9.13-9.26 (m), 8.39-8.46 (m), 8.30-8.39 (m), 8.25-8.29 (m), 8.08-8.13 (m), 7.79-7.85 (m), 7.67-7.72 (m), 7.10-7.23 (m), 4.94-5.01 (m), 4.83-4.89 (m), 4.64-4.73 (m), 4.56-4.63 (m), 4.44-4.50 (m), 4.37-4.44 (m), 3.92-3.99 (m), 3.60-3.74 (m), 3.24-3.55 (m), 3.11-3.24 (m), 3.07-3.10 (m), 3.02-3.06 (m), 2.98-3.02 (m), 2.93-2.97 (m), 2.75-2.85 (m), 2.68-2.69 (m), 2.63-2.67 (m), 2.45-2.55 (m), 2.26 -2.44 (m), 2.15-2.25 (m), 2.03-2.14 (m), 1.55-1.87 (m), 1.31-1.47 (m), 1.15-1.31 (m), 0.98-1.05 (m), 0.91-0.98 (m), 0.82-0.91 (m), 0.71-0.78 (m).
Preparación de 2-Metilalanil-N-((3R,4S.5S)-1-ff2S)-2-f(3R,4RJS)-7-bencil-4-metil-18-f(4S.5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-in-5.8.1 ^ trioxo-2-oxa-6,9.12-triazaoctadecan-3-il)pirrolidin-1 -ill-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#257).
Etapa 1. Síntesis de 9H-fluoren-9-ilmetil[(2S)-1-({2-[(ter butoxicarbonil)amino]etil}amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]carbamato (#253). Siguiendo el procedimiento general D usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-fenilalanina (500 mg, 1.29 mmol, 1.0 eq), ter-butil (2-aminoetil)carbamato (207 mg, 1.29 mmol, 1.0 eq.), HATU (620 mg, 1.55 mmol, 1.2 eq.) y base de Hunig (0.452 mL, 2.58 mmol, 2.0 eq) en 6 mL de DMF se produjo #253 como un sólido de color blanco (620 mg, 91 %) siguiendo con la concentración de solvente y la re-cristalización utilizando acetato de etilo. LC-MS (Protocolo Q1 ): m/z 552.3 [M+Na+], tiempo de retención = 1.01 minutos.
Etapa 2. Síntesis de N-alpha-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N-[2-({6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanoil}amino)etil]-L-fenilalaninamida (#254). Se eliminó la protección Boc usando el procedimiento general C usando #251 (88 mg, 0.17 mmol, 1.0 eq.) y 4M HCI (2.0 ml_, 8.0 mmol, 48 eq.) seguida por la concentración in vacuo. Se efectuó después la reacción de acoplamiento siguiendo el procedimiento general D utilizando el residuo crudo, ácido 6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanóico (35.6 mg, 0.166 mmol, 1.0 eq.), HATU (73.2 mg, 0.18 mmol, 1.1 eq.), y base de Hunig (0.087 ml_, 0.50 mmol, 3.0 eq.) en 2 mL de DMF seguido por purificación (Método J) produciendo #254 (35 mg, 34%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 626.3 [M+l- ], tiempo de retención = 0.86 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-[2-({6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanoil}amino)etil]-L-fenilalaninamida (#255). Siguiendo el procedimiento general A usando #254 (35 mg, 0.056 mmol, 1.0 eq.), piperidina (0.10 mL, 1.0 mmol, 20 eq.) en 0.5 mL de DMF seguido por purificación utilizando cromatografía en gel de sílice (0-30% metanol en diclorometano) produce #253 (19 mg, 84%). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 404.2 [M+H+], tiempo de retención = 0.48 minutos.
Etapa 4. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2- Metilalanil-N-{(3R,4S)5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-bencil-4-metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2-oxo¡midazolidin-4-¡l]-5,8, 13-trioxo-2-oxa-6,9, 12-triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#256). Siguiendo el procedimiento general D usando #105 (36.6 mg, 0.047 mmol, 1.0 eq.), #255 (19 mg, 0.047 mmol, 1.0 eq.), HATU (22.4 mg, 0.056 mmol, 1.2 eq.) y base de Hunig (0.025 mL, 0.141 mmol) en 1.5 mL de DMF seguido por purificación (Método J) produjo #256 (15 mg, 27%) como un sólido de color blanco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1164.8 [M+H+], tiempo de retención = 0.99 minutos.
Etapa 5. Síntesis de 2-Metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2- {(3R,4R,7S)-7-bencil-4-metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]-5,8, 13-trioxo-2-oxa-6,9, 12-triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1 -il]-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#257). Siguiendo el procedimiento general A utilizando #256 (5mg, 0.004 mmol, 1.0 eq.) y piperidina (0.02 mL, 0.2 mmol, 50 eq.) en 0.7 mL de DMF seguido por purificación (Método J) produjo #257 (2 mg, 50%) como un cristal incoloro. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1164.8 [M+H+], tiempo de retención = 0.99 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-de), d 8.44-8.52 (m), 8.06-8.20 (m), 7.96-8.01 (m), 7.69-7.83 (m), 7.20-7.28 (m), 7.11-7.19 (m), 3.38-3.83 (m), 3.19-3.26 (m), 3.03-3.12 (m), 2.98 (s), 2.91 (s), 2.75 (s), 2.65-2.70 (m), 2.01-2.36 (m), 1.65-1.87 (m), 1.39-1.57 (m), 1.13-1.37 (m), 1.04-1.08 (m), 0.74-1.01 (m).
Preparación de N-[5-(2,5-dioxo-2.5-dihidro-1 H-pirrol-1-ii)pentanoyll-N.2-Dimetilalanil-N-((1 S.2R)-4-((2S)-2-f(1 R,2R)-3-(f(1 S)-1 -carboxi-2-feniletillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-¡l)-2-metoxh 1 -G? S)-1 -metilpropill-4-oxobutil>-N-metil-L-valinamida (mv#115).
Etapa 1. Preparación de N-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)pentanoyl]-N,2-Dimetilalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (mv#115). A una solución sometida a agitación ácido 5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-¡l)pentanóico (12 mg, 0.061 mM) en 0.4 mL de diclorometano, y 0.1 mL de DMF, se agregó HATU (23.2 mg, 0.061 mM) seguido por base de Hunig (0.033 mL, 0.188 mM). Se permitió la agitación de la reacción durante 5 minutos antes de que se agregara #115 (39 mg, 0.047 mM) a una solución en 0.4 mL de diclorometano, y 0.1 mL de DMF. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas y 15 minutos antes de ser apagada a través de la adición de agua que contiene una pequeña cantidad de TFA. Se redujo la reacción. El material crudo fue disuelto con DMSO y purificado por medio de cromatografía de fase inversa (Método J). Las fracciones apropiadas fueron concentradas después (Genevac). El material fue purificado después por medio de cromatografía de fase inversa (Método K) con la fracciones apropiadas que son concentradas (Genevac). El material fue transferido después hacia un pequeño envase utilizando diclorometano y metanol antes de ser reducido (Genevac) a fin de producir mv#115 (1.4 mg, 3.3%) mezcla aceite/sólido. HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 897.5 [M+H+], tiempo de retención = 9.149 minutos (pureza > 97%).
Preparación de N-í6-(2.5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)hexanoill-N.2-Dimetilalanil-N-((1S.2R -((2S)-2-r(1 R.2R)-3-(f(1S)-1-carboxi-2-feniletillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropinpirrolidin-1-il>-2-metoxi-1-i(1S)-1 -metilpropiH-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (mc#115) Etapa 1. Síntesis de cloruro de 6-(2,5-d¡oxo-2,5-dihídro-1H-pirrol- -il)hexanoilo (#248). A una solución sometida a agitación de ácido 6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -i()hexanóico (3.15 g, 14.9 mM) en 15 mL de diclorometano, se agregó cloruro de oxalilo (1.61 mL, 17.9 mM) seguido por una gota de DMF. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante tres horas. La reacción fue concentrada in vacuo. El residuo fue disuelto en una solución uno a uno de heptano y diclorometano y después concentrado in vacuo. Este proceso se repitió dos veces más produciendo un sólido #248 (3.43 g, 100%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): d [7.02 (s, 2H), 3.43 (m, 2H), 2.53 (m, 1 H), CH2.18 (m, 1 H), 1.54 (m, 4H), 1.26 (m, 2H).] Etapa 2. Síntesis de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -¡l)hexanoil]-N,2-dimetilalanina (#249). A una solución sometida a agitación #248 (600 mg, 2.61 mM) en 10 mL de diclorometano, se agregó N,2-dimetilalanina (306 mg, 2.61 mM) seguida por trietilamina (1.09 mL, 7.84 mM). Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante tres horas. Se agregó diclorometano a la reacción y la capa orgánica fue lavada tres veces con agua y dos veces con salmuera. La capa orgánica fue separada y después secada sobre sulfato de sodio antes de ser concentrada in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía en gel de sílice (0-30% metanol en diclorometano) sobre sílice que había sido previamente neutralizado con trietilamina produciendo un sólido de color blanco #249 (127 mg, 16%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 309.0 [M-f-T], tiempo de retención = 0.96 minutos.
Etapa 3. Síntesis de N-{(2R,3R)-3-metoxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalanina (#250). A una solución sometida a agitación #113 (2.10 g, 2.46 mM) en 10 mL de THF, se agregó hidróxido de litio (228 mg, 5.16 mM) seguido por 3 mL de agua. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción fue acidificada a través de la adición de 1 M HCI y después concentrada in vacuo. El sólido de color blanco resultante fue absorbido en 20 mL de acetonitrilo y 5 mL de agua. La capa acuosa removida y la capa orgánica fue lavada una vez con agua. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada in vacuo. Se agregó después acetato de etilo (20 mL) y se permitió la agitación del sólido crudo durante 30 minutos, antes de ser filtrada para producir un sólido de color blanco #250 (1.42 g, 94%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 619.5 [M+H+], tiempo de retención = 1.10 minutos. HPLC (Protocolo A a 45°C) m/z 619.4 [M+H+], tiempo de retención = 6.732 minutos.
Etapa 4. Síntesis de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)hexanoil]-N,2-Dimetilalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-metoxi-1 -[(1 S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (mc#115). A una solución sometida a agitación #249 (382 mg, 1.23 mM) en 5 mL de diclorometano, se agregó HATU (482 mg, 1.23 mM) seguido por trietilamina (0.52 mL, 1.23 mM). Se permitió la agitación de la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente seguida por la adición de #250 (762 mg, 1.23 mM). Se permitió la agitación de la reacción durante 3 horas. La reacción fue concentrada in vacuo. La purificación de fase inversa (Método L) seguida por liofilización produjo un sólido de color blanco mc#120 (124 mg, 11 %). HPLC (Protocolo A a 45°C;) miz 911.5 [M+H+], tiempo de retención = 9.676 minutos.
Preparación de N-f4-(2.5-dioxo-2.5-dihidro-1 H-pirrol-1- il)butanovn-N,2-Dimetilalanil-N-((1 S.2R)-4-í(2S)-2-K1 R.2R)-3-(f(1 S)-1 -carboxi- 2-feniletinamino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1 -il)-2-metoxi-1-f(1 S)- 1 -metilpropill-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (mb#115).
Etapa 1 . Síntesis de N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 - il)butanoyl]-N,2-Dimetilalanil-N-{(1 S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi- 2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-metoxi-1 -[( 1 S)- 1 -metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (mb#115). Se permite la agitación de una solución sometida a agitación de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1 H-pirrol-1 -il)butanóico (1.2 equivalentes), HATU (1.2 equivalentes), y base de Hunig (3 equivalentes) en DMF y diclorometano durante 30 minutos. El compuesto #115 (1 equivalente) es agregado después como una solución en diclorometano y DMF. La reacción es monitoreada por medio de LC-MS. La reacción es concentrada y la purificación se completa por medio de cromatografía de fase inversa a presión media Isco (Gradiente: 5%-100% agua en acetonitrilo).
Preparación de N-í7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-p¡rrol-1-il)heptanoill-N,2-Dimetilalanil-N-f(1S.2R)-4-((2S)-2-fn R.2R)-3-(f(1S)-1-carboxi-2-feniletillamino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolid¡n-1-il)-2-metoxi-1-í(1S)- 1-metilpropin-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (me#115).
Etapa 1. Síntesis de N-[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)heptanoil]-N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-met¡lpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (me#115). Se permitió la agitación de una solución sometida a agitación de ácido 7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)heptanóico (1.2 equivalentes), HATU (1.2 equivalentes), y base de Hunig (3 equivalentes) en DMF y diclorometano durante 30 minutos. El compuesto #1 5 (1 equivalente) es agregado después como una solución en diclorometano y DMF. La reacción es monitoreada a través de LC-MS. La reacción es concentrada y la purificación se completa por medio de cromatografía de fase inversa a presión media Isco (Gradiente: 5%-100% agua en acetonitrilo).
Preparación de N-í6-(2.5-d ioxo-2.5-dihid ro-1 H-pirrol- 1 -il)hexanoill-L-valil-N~5~-carbamoil-N-(4-{(8S.11S.12R)-12-(2-((2S)-2-f(1R,2R)-3-([nS)-1-carboxi-2-feniletillamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-8-isopropil-4,5.5, 10-tetrametil-11 -f(1 S)-1 -metilpropill-3,6.9-trioxo-2, 13-dioxa-4,7, 10-tr¡azatetradec-1 -il)fenil)-L-ornithinamida (mcValCitPABC#115).
Etapa 1. Síntesis de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-(4-{(8S, 11 S, 12R)-12-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin 2-oxoetil)-8-isopropil-4,5,5 ,10-tetrametil-11 -[(1 S)-1 -metilpropil]-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7, 10-triazatetradec-1 -il}fenil)-L-ornithinamida (mcValCitPABC#115). Se preparó una solución de mcCValCitPABC (Ligador # D, 1 equivalente) y #115 (1 equivalente) en DMF. Se agregaron base de Hunig (4 equivalentes), 2,6-Luditina (4 equivalentes), y HOAT (0.2 equivalentes). La reacción es monitoreada a través de LC-MS. La reacción es concentrada y la purificación se completa por medio de cromatografía de fase inversa a presión media Isco (Gradiente: 5%-100% agua en acetonitrilo).
Preparación de N-(21-amino-4,7,10,13,16.19-hexaoxahenicosan- 1-oyl)-N,2-Dimetilalanil-N-((1S.2R feniletillamino}-1-metoxi-2-metil-3-o^^ metilpropill-4-oxobutil)-N-metil-L-valinamida (AmPeq6C2#115).
Etapa 1. Síntesis de N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxahenicosan-1-oil)-N,2-Dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2^ metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (AmPeg6C2#115). Se permitió la agitación de una solución de ácido 1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10, 13,16,19,22-heptaoxa-4-azapentacosan-25-oico (1 equivalente), HATU (1 equivalente), y base de Hunig (3 equivalentes) durante 30 minutos. El compuesto #115 es agregado como una solución en DMF. La reacción es monitoreada a través de LC-MS. Cuando la reacción de acoplamiento está cerca de completarse, se agregó piperidina (5 equivalentes). Se monitoreó la desprotección Fmoc a través de LC-MS. La reacción es concentrada y la purificación se completa por medio de cromatografía de fase inversa a presión media Isco (Gradiente: 5%-100% agua en acetonitrilo).
Preparación de 1.2-dimetil-D-prolil-N-f(3R.4S.5S 1-((2S)-2-í(1 R.2R)-3-(((2S)-3-f4-gN-r6-(2.5-dioxo-2.5-dihidro-1 H-pirrol-1 - il)hexanoil1glvcil>amino)fenil1-1 -metoxi-1 -oxopropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxoprop¡llpirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il1-N-metil-L-valinamida mcGlv#201.
Etapa 1 Síntesis de metil N-(ter-butoxicarbonil)-4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H pirrol-1 -il)hexanoil]glicil}amino)-L-fenilalaninato (#251 ): A una solución de metil 4-amino-N-(ter-butoxicarbonil)-L-fenilalaninato (4.1 g, 15.3 mmol, 1eq.) en ?,?-dimetilformamida deshidratada (70 mL) se agregó ?,?'-Diciclohexiicarbodiimida (2.9 g, 15.3 mmol, 1eq.) a 0°C. La mezcla fue sometida a agitación a 0°C durante 30 minutos. Una solución de ácido 2-(6-(2, 5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)hexanamido)acético (3 g, 10.2 mmol, 0.66 eq.) en N.N-dimetilformamida deshidratada (20 mL) se agregó a 0°C. La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla fue filtrada. El filtrado fue vertido en agua con hielo (200 mL) y extraído con EtOAc (200 mLX3). El extracto fue lavado con salmuera (200 mL), secado sobre Na2S04 y concentrado in vacuo a fin de producir #251 (1.8 g, 32.3% de rendimiento) como un sólido de color amarillo claro. HPLC (Protocolo Q2) [M+Na+] 567.3, tiempo de retención = 1.02 min.
Etapa 2: Síntesis de metil 4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H- pirrol-1-il)hexanoil]glycil}amino)-L-fenilalaninato (#252): A una solución de #251 (800 mg, 1.47 mmol, 1 eq.) en diclorometano (16 mL) se agregó TFA (4.8 mL) a 0°C. La mezcla fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla fue concentrada in vacuo. El residuo fue disuelto en agua y filtrado. El filtrado fue liofilizado a fin de producir #252 (800 mg, 97.5%) como un sólido de color blanco. HPLC (Protocolo Q3) [M+H+] 445.4, tiempo de retención = 0.90 min.
Etapa 3: Síntesis de 1 ,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]glíc¡l}amino)fenil]-1 -metox¡-1 -oxopropan-2-il}amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (mcGly#201 ). A una solución de #198 (94 mg, 0.13mmol, 1 eq.) y #252 (60.3 mg, 0.18 mmol, 1.4 eq.) en N,N-dimetilformamida (2 mL) se agregó HATU (64.2 mg, 0.13 mmol, 1 eq.) seguido por N,N- diisopropiletilamina (66 mg, 0.52 mmol). La solución fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción fue neutralizada con ácido cítrico acuoso y concentrado para dar el producto crudo, el cual fue purificado por medio de cromatografía en gel de sílice (eluido con MeOH/DCM a partir de 1 % hasta 7%), purificado después nuevamente a través de TLC preparatoria (Metanol.diclorometano: =1 : 10) para dar mcGly#201 (25 mg, 16.2%) como un sólido de color blanco ESl-MS: m/z 1023.59 [M+H+], HPLC (Protocolo EB) tiempo de retención = 4.0 minutos (Pureza = 96%). 1H RMN (DMSO-d6) d 9.88 (d, 1 H), 8.48 (d, 0.5H), 8.24 (d, 0.5H), 8.11 (m, 1H), 7.82 (m, 1 H), 7.47 (d, 2H), 7.15 (m, 2H), 7.01 (s, 2H), 4.67 (m, 3H), 3.96 (m, 4H), 3.65 (m, 4H), 3.40 (m, 4H), 3.27 (m, 7H), 3.16 (m, 5H), 2.24 (m, 8H), 1.50 (m, 11H), 1.19 (m, 21 H).
Preparación de 1.2-dimetil-L-prolil-N-f(3R.4S.5S)-1-((2S)-2-fnR.2R)-3-(f(2S)-1-(f6-(2.5-dioxo-2.5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexyllamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-illamino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropillpirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-ill-N-metil-L-valinamida (MalC6Am#151).
Etapa 1. Síntesis de 1 ,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[6-(2,5-dioxo-2^ 3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (MalC6Am#151). Siguiendo el procedimiento general D usando #151 (20 mg, 0.023 mmol, 1.0 eq ), 1-(6-aminohexil)-1 H-pirrol-2,5-diona (7.0 mg, 0.030 mmol, 1.3 eq.), HATU (11.4 mg, 0.030 mmol, 1.3 eq ), y base de Hunig (0.016 mL, 0.092 mmol, 1.3 eq.) en 2 mL de diclorometano, y 0.2 mL de DMF seguido por purificación utilizando cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 80% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) produjo MalC6Am#151 (18.4 mg, 86%) como una mezcla de aceite transparente/sólido. LC- S (Protocolo Q): m/z 922.3 [M+H+], tiempo de retención = 1 .43 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 922.4 [M+H+], tiempo de retención = 7.203 minutos.
Preparación de N-f6-(2.5-dioxo-2.5-dihidro-1 H-pirrol-1 -inhexanoill-L-valil-N-(4-((6S.9R.10R)-6-bencil-10-fr2S)-1-( 3R.4S.5S)-4-fn ,2-dimetil-L-prolil-L-valil)(metil)amino1-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-¡H-9-metil-3,8-dioxo-2, 11-dioxa-4,7-diazadodec-1-il}fenil)-N~5~-carbamoil-L-ornithinamida (mcValC¡tPABC#246) Etapa 1 . Síntesis de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{(6S,9R 0R)-6-bencil-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5SH-[(1 ,2-dimetil-L-prolil-L-valil)(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-9-metil-3,8-dioxo-2, 11 -dioxa-4,7-diazadodec-1-il}fenil)-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (mcValCitPABC#246). Siguiendo el procedimiento general E usando #246 (29.2 mg, 0.035 mmol, 1.0 eq.), mcValCitPABC-PNP (28.8 mg, 0.039 mmol, 1 .1 eq.), 2,6-Luditina (0.016 mL, 0.14 mmol, 4.0 eq.), base de Hunig (0.025 mL, 0.14 mmol, 4.0 eq.), y HOAT (4.8 mg, 0.035 mmol, 1.0 eq.) en 2.0 mL de DMA seguida por purificación utilizando cromatografía C18 de fase inversa y presión media (Gradiente: 5% hasta 50% acetonitrilo en agua con 0.02% TFA en cada fase) se produjo mcValCitPABC #246 (21 mg, 45%) como una mezcla aceite transparente/sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 1327.9 [M+H+], tiempo de retención = 1.36 minutos.
Estudios in vitro e in vivo de HERCEPTIN Se observa que para los siguientes estudios HERCEPTIN en ausencia de agentes citotóxicos conjugados no muestra significativa potencia in vitro o eficacia in vivo en concentraciones de anticuerpo equivalentes.
Procedimiento de Prueba Celular In vitro Células de expresión (BT474 (cáncer de mama), N87 (cáncer gástrico), HCC1954 (cáncer de mama), MDA-MB-361 -DYT2 (cáncer de mama)) o sin expresión (MDA-MB-468) fueron cultivadas en placas de cultivo celular de 96 pozos durante 24 horas antes del tratamiento. Las células fueron tratadas con conjugados anticuerpo-fármaco diluidos seriamente 3-veces o compuestos libres (es decir, sin anticuerpo conjugado para el fármaco) por duplicado en 10 concentraciones. La viabilidad celular fue determinada a través de CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation MTS Assay (Promega, Madison Wl) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa fue determinada como porcentaje de control no tratado. Los valores IC50 fueron calculados utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros #203 con XLfit v4.2 (IDBS, Guildford, Surry, UK). Los resultados se muestran en los Cuadros 20, 21 A y 21 B.
Los estudios de eficacia in vivo de conjugados anticuerpo- fármaco se realizaron con la línea celular Her2+ MDAMB-361 DYT2. Para estudios de eficacia, 10 millones de células tumorales en 50% matrigel fueron implantadas subcutáneamente en ratones sin pelo de 6-8 semanas de edad. Cuando los tamaños de tumor alcanzaron entre 250-350 mm3 los fármacos o vehículo fueron administrados a través de inyección de bolo en la vena de la cola. Los ratones fueron inyectados con 1 mg/kg de conjugados de anticuerpo-fármaco tratados cuatro veces cada cuatro días (Q4dx4). El volumen del tumor es medido dos veces a la semana durante los primeros 50 días y una vez a la semana posteriormente a través de un dispositivo Caliper y calculado con la siguiente fórmula: Volumen de tumor = (longitud x anchura)/2. Los resultados fueron comparados a través de los estudios mediante normalización de la regresión de tumor de los ratones tratados con fármaco al dividir los volúmenes de tumor entre el volumen de tumor tratado con vehículo (T/C).
Se probaron seis compuestos en tres diferentes estudios de xenoinjerto MDA-MB-361-DYT2 para determinar su actividad anti-tumoral. Los resultados de un estudio representativo con cuatro de los compuestos demuestran una significativa regresión de tumor a partir de los ratones tratados con vehículo durante el período de observación de 50 días (Figura 1 ). Para comparar los resultados de los compuestos en los tres estudios, la actividad anti-tumoral fue normalizada al dividir el volumen de tumor tratado con fármaco entre el volumen de tumor tratado con vehículo (T/C). Una gráfica de los seis valores T/C (Figura 2) demuestra que cada uno de los seis compuestos ocasiona la regresión de tumor completa (o casi completa) durante el período de observación que fue de hasta 107 días para uno de los estudios.
Los resultados de la prueba de H(C)-#D54, H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF y H(K)-MCC-DM1 en los estudios de xenoinjerto MDA-MB-361-DYT2 se muestran en las Figuras 4A-4C. La gráfica de volumen de tumor en el grupo de tratamiento sobre el grupo de control (T/C) permite la comparación entre conjugados (véase la Figura 5C). Estos resultados demuestran que H(C)-#D54 exhibe eficacia equivalente para los conjugados HERCEPTIN® con H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF y es superior a H(K)-MCC-DM1 en este modelo.
Modelo de Xenoinierto de Tumor N87 In vivo (HERCEPTIN®) Los estudios de eficacia in vivo de conjugados de anticuerpo-fármaco se realizaron con modelos de xenoinjerto de expresión de objetivo utilizando las líneas celulares N87. Para el estudio de eficacia, 7.5 millones de células tumorales en 50% matrigel son implantadas subcutáneamente en ratones sin pelo de 6-8 semanas de edad hasta que los tamaños de tumor alanzan entre 250 y 350 mm3. La dosificación se efectúa a través de inyección de bolo en la vena de la cola. Dependiendo de la respuesta del tumor al tratamiento, los animales son inyectados con 1 -10 mg/kg de conjugados de anticuerpo-fármaco tratados cuatro veces cada cuatro días. Todos los animales experimentales son monitoreados semanalmente en cuanto a cambios de peso corporal. El volumen de tumor es medido dos veces por semana durante los primeros 50 días y una vez a la semana posteriormente por medio de un dispositivo Caliper y calculado con la siguiente fórmula: Volumen de tumor = (longitud x anchura)/2. Los animales fueron sacrificados antes de que sus volúmenes de tumor alcanzaran 2500 mm3. Se observa que el tamaño de tumor decrece después de la primera semana de tratamiento. Los animales pueden ser monitoreados de forma continua para Nuevo crecimiento del tumor después de que se ha detenido el tratamiento.
Los resultados de la prueba de H(C)-#D54, H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF y H(K)-MCC-DM1 en el modelo de tamizado in vivo de xenoinjerto de ratón N87 se muestran en las Figuras 3 y 5A-5F. Estos resultados demuestran que H(C)-#D54 es superior/similar al conjugado H(C)-vcMMAE y es más potente que los conjugados H(C)-mcMMAF y H(K)-MCC-DM1 en este modelo.
Farmacocinética y Toxicocinética La farmacocinética de ratón y toxicocinética de rata fueron determinadas a partir de estudios de farmacocinética de ratón y toxicocinética de rata de dosis individual (véanse los Cuadros 22 y 23). La farmacocinética de ratón se determinó a partir de muestras recolectadas a partir de ratones sin pelo a los que se administró una dosis individual de 3 mg/kg. Las muestras fueron recolectadas hasta por 336 h. La toxicocinética de rata se determinó en ratas (Sprague-Dawley (Crl:CD (SD))) a las que se administró una administración individual de H(C)-vc-MMAE o H(C)-#D54 en dosis de 3, 10, y 30 mg/kg, o administrada H(C)-mc-MMAD o H(C)-mc-MMAF a 10, 30, y 100 mg/kg. Las muestras fueron recolectadas hasta por 336 horas. Las concentraciones circulantes de anticuerpo total y ADC se midieron utilizando ensayos ELISA. El área bajo la curva (AUC) se calculó para el anticuerpo total y ADC para cada ADC. Se calcularon también las relaciones ADC a anticuerpo AUC.
La exposición de anticuerpo total H(C)-#D54 y ADC fueron mayores que aquellas observadas para H(C)-vc-MMAE en ratones en 3 mg/kg y todas las dosis evaluadas en ratas. La relación ADC a Ab AUC para H(C)-#D54 también fue mayor que aquella observada para H(C)-vc-MMAE. Estos resultados sugieren que H(C)-#D54 tuvo mayor exposición y que ADC y/o carga útil de ligador son potencialmente más estables que H(C)-vc-MMAE.
Toxicidad La toxicidad independiente de objetivo de #D54 y cargas útiles de ligador de comparación (mcValCitPABC-MMAD y mcValCitPABC-MMAE) conjugado para un anticuerpo monoclonal sin reactividad cruzada (IgGI) se determinaron en un estudio de toxicidad de rata de dosis individual con un periodo de observación de dos semanas. Las dosis de los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs) fueron 0, 3, 10 y 30 mg/kg con una n que es 5 machos/grupo y la carga de ligador-carga útil fue similar entre los conjugados (3.8, 3.2 y 4, respectivamente). Estos estudios incluyeron al menos observaciones clínicas diarias, pesos corporales semanales, patología clínica (final de la vida) y necropsia (Día 15-17) 10 con examinación microscópica de 9 o más tejidos y cualesquiera lesiones graves.
La mortalidad con los cambios de peso corporal relacionados y señales de morbilidad se observaron en la dosis de 30 mg/kg para todos los conjugados y en la dosis de 10 mg/kg para el conjugado MMAD. No hay observaciones clínicas o cambios de peso corporal en los grupos sobrevivientes.
Los órganos de objetivo de los conjugados identificados a través de examinación microscópica en los grupos sobrevivientes fueron como sigue. El conjugado a 10 mg/kg tuvo residuos en el lumen del epidídimo (5/5, mínimo a moderado), inflamación en la base del corazón (1/5 ratas, mínimo) y mitosis incrementada en la cornea (1/5 ratas, mínimo). No hubo hallazgos histológicos para el conjugado a 3 m/kg. Para el conjugado MMAD en el grupo de dosis sobreviviente a 3 mg/kg, hubo cambios en y relacionados con la médula ósea y en los testículos y el epidídimo. Para el conjugado MMAE a 10 mg/kg, hubo cambios en la médula ósea, riñon, hígado y epidídimo. En la dosis de 3 mg/kg para este conjugado, hubo cambios en el riñón y mitosis incrementada en el hígado. Por tanto, en los estudios de diseño similar y en los grupos sobrevivientes, el conjugado no tuvo los hallazgos de médula ósea observados con los conjugados de comparación y tampoco tuvo los hallazgos en hígado o riñon observados con uno de los comparadores.
En resumen, la dosis tolerada máxima (MTD) del conjugado y el conjugado MMAE fue de 10 mg/kg y la MTD del conjugado MMAD fue de 3 mg/kg. El nivel de efecto adverso no observado (NOAEL) del conjugado fue de 3 mg/kg en tanto que el NOAEL de los conjugados ligador-carga útil de comparación fue menor a 3 mg/kg. Este estudio demuestra como el perfil toxicológico para #D54 se compara a ciertos compuestos descritos en la técnica.
Estudios In vitro e In vivo de ADC Anti-IL-13Ra2 Anticuerpos Anti-IL-13Ra2 y ADCs El anticuerpo humanizado hu08 se enlaza de manera específica al receptor IL-13Ra2. Las secuencias de aminoácido y nucleótido para hu08 se muestran en el Cuadro 3. Están subrayados los CDRs de Kabat.
CUADRO 3 Secuencias de aminoácido y nucleótido de anticuerpo hu08 humanizado El anticuerpo hu08 anti-IL-13Ra2 humanizado fue conjugado para varias combinaciones de ligador-carga útil de la presente invención, según se proporciona en el Cuadro 4. Los conjugados anticuerpo-fármaco fueron preparados de acuerdo con los métodos de la presente invención.
Cuadro 4 ADCs anti-IL-13Ra2.
CUADRO 4 Anti-IL-13Ra2 adcs Ensayo de Citotoxicidad In vitro con ADCs anti-IL-13Ra2 Las líneas celulares que expresan el antígeno IL-13Ra2 y una línea celular de control negativo, fueron cultivadas con concentraciones crecientes de ADCs anti-IL-13Ra2 que comprende el anticuerpo hu08 conjugado para varias cargas útiles de ligador de la presente invención. Después de cuatro días, se determine la viabilidad de cada cultivo. Se calcularon los valores IC5o por medio de regresión no lineal logística y son presentados como ng Ab/mL Los datos demuestran que el anticuerpo hu08v1.0/1.0 anti-IL- 13Ra2 conjugado para seis diferentes cargas útiles de auristatina es efectivo contra las líneas celulares positivas IL-13Ra2 probadas (PC3MM2), que tienen un IC50 que varía desde 1.1 hasta 4.9 ng Ab/mL o 7.3-32.7 pM (Cuadro 5). Los ADCs no fueron activos contra la línea celular negativa IL-13Ra2, H460, y los ADCs de control, que no se unen a IL-13Ra2, hulgG8.84-vc0101 y hulgG8.84-mc3377, no fueron activos contra ninguna de las líneas celulares probadas.
CUADRO 5 Valores 1CS0 (ng Ab/mL) de ADCs anti-IL-13Ra2 humanizados.
Modelos de Xenoinjerto Subcutáneo In vivo con ADCs anti-IL13Ra2 El anticuerpo hu08 humanizado se enlaza de manera específica al receptor IL-13Ra2. Los ADCs hu08 con once diferentes combinaciones ligador-carga útil fueron probadas en un modelo de xenoinjerto in vivo.
Ratones atímicos, hembra (sin pelo) recibieron inyección subcutánea con PC3 M2. Ratones con tumores implantados, aproximadamente 0.1 hasta 0.3 g (n = 8 hasta 10 ratones/grupo de tratamiento), recibieron por vía intravenosa q4d x 4 con solución salina normal (vehículo), hu08v1.0/1.0 ADCs con ligador-cargas útiles vc-0101 , vc-6780, vc-3906, mc-8261 , mc-0131 , mc-6121 , mc-3377, MalPeg-8261 , MalPeg-0131 , MalPeg-6121 , o MalPeg-3906, y un Ab (hulgG8.84), que no se enlaza, conjugado con vc-0101 o mc-3377, a una dosis de 2 o 3 mg Ab/kg. Los ADCs fueron dosificados en base al contenido Ab. Se midieron los tumores al menos una vez por semana y se calcularon sus tamaños como mm3 = 0.5 x (anchura de tumor2) x (longitud de tumor).
Los resultados de eficacia in vivo listados en el Cuadro 6 muestra un rango de actividad anti-tumoral con los_diversos ADCs probados. El orden relativo de potencia es hu08-vc-0101 > hu08-vc-6780 > hu08-mc-0131 > hu08-mc-6121 > hu08-mc-3906 > hu08-MalPeg.-0131 >hu08-MalPeg-6121 > hu08-MalPeg-3906 > > hu08-mc-8261. En el nivel de dosis de 3 mg/kg, tanto hu08-vc-0101 como hu08-mc-3377 demostraron actividad antitumoral, en tanto que Ab (hulgG8.84), que no se enlaza conjugado con vc-0101 o mc-3377 no tuvo actividad y fue similar al control de vehículo.
CUADRO 6 Eficacia de ADCs anti-IL-13Ra2 en xenoiniertos PC3MM2.
GT= grupo terminado debido a gran tamaño de tumor Estudios ln vitro e In vivo de ADC Anti-Notch Anticuerpos Anti-Notch v ADCs Los anticuerpos humanizados, hu28 y hu75, y los anticuerpos quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, se enlazan de manera específica al receptor Notch. Las secuencias de aminoácido y de nucléotido para hu28 y hu75 se proporcionan en el Cuadro 7. Los CDRs de Kabat están subrayados.
CUADRO 7 Secuencias de aminoácido y nucléotido de anticuerpos anti-Notch humanizados.
Los anticuerpos anti-Notch humanizados, hu28 y hu75, y los anticuerpos anti-Notch quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, fueron conjugados para varias combinaciones de ligador-carga útil de la presente invención, como se proporcionan en el Cuadro 8. Los conjugados de anticuerpo-fármaco se prepararon de acuerdo con los métodos de la presente invención.
CUADRO 8 ADCs Anti-Notch.
Ensayos de Citotoxicidad In vitro con ADCs Antí-Notch Se determinaron los efectos de ADCs anti-Notch en 1) líneas celulares que expresan de manera endógena la proteína: HCC2429 (cáncer pulmonar), OVCAR3 (cáncer de ovarios) y MDA-MB-468 (cáncer de mama), 2) líneas celulares modificadas genéticamente para sobre-expresar la proteína Notch: MDA-MB-468/hNotch y U20S/hNotch, y 3) una línea celular de control negativo (SW900) utilizando un indicador de viabilidad celular TS (Promega, Madison, Wl). Estas líneas celulares fueron cultivadas con concentraciones incrementadas de ADCs anti-Notch que comprenden anticuerpos anti-Notch humanizados, hu28 y hu75, y anticuerpos anti-Notch quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, conjugados para varias combinaciones de ligador-carga útil de la presente invención. Como un control específico para los ADCs-anti-Notch, se probaron también los ADCs de control, no dirigidos (huNeg8.8-ADCs o ch2H6-ADCs) en las mismas líneas celulares. Después de cuatro días, se determine la viabilidad de cada cultivo. Se calcularon los valores IC5o por medio de regression no lineal logística y presentados como ng Ab/mL Se proporciona también la relación fármaco anticuerpo (DAR).
El Cuadro 9 muestra valores IC5o (ng Ab/mL) de los tratamientos ADC anti-Notch humanizado. Las líneas celulares HCC2429 y MDA-MB-468/hNotch tuvieron dos repeticiones individuales. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch humanizados con varios combinaciones ligador-carga útil fueron activos e indujeron la muerte celular en las líneas celulares de cáncer que expresan y sobre-expresan Notch HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA-MB-468/h Noten, U20S/hNotch, aunque no en la línea celular de control negativo SW900 que carece de expresión Notch. Los ADS de control no dirigidos carecieron ya sea de potencia (LP) y por lo tanto no se generaron valores IC50 como se indicó, o bien fueron mínimamente activos en las dosis más altas probadas. Los ADCs Anti-Notch que tienen valores IC50 iguales a o mayores que los valores IC50 para los ADCs de control fueron considerados como faltos de potencia in vitro y se indica como LP.
CUADRO 9 Valores ICfin (ng Ab/mL) de ADCs anti-Notch humanizados El Cuadro 10 muestra valores IC50 (ng Ab/mL) de los tratamientos ADC anti-Notch quimérico rata-humano. Para los experimentos con 2-4 repeticiones individuales, se calcularon los valores IC50 promedio junto con el error estándar de la media (S.E.M., por sus siglas en inglés). Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano con varias combinaciones ligador-cargas útiles fueron activos e indujeron la muerte celular en las líneas celulares de cáncer que expresan y sobre-expresan Notch HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, M DA-M ?-468/h Notch, U20S/hNotch. Los ADCs de control no dirigidos carecieron de potencia (LP) y por lo tanto no se generaron valores IC50 como se indicó, o bien, fueron mínimamente activos en las dosis más altas probadas. Los ADCs Anti-Notch que tienen valores IC50 ¡guales a o mayores que los valores IC5o para los ADCs de control fueron considerados faltos de potencia in vitro y se indica como LP.
CUADRO 10 Valores ICso fng Ab/mL) de ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano (nd= no determinado) Modelos de Xenoinierto de Tumor ln vivo con ADCs Anti-Notch Los anticuerpos anti-Notch humanizados, hu28 y hu75, y anticuerpos anti-Notch quiméricos rata-humano, ch28 y ch75, fueron conjugados para varias combinaciones de ligador-carga útil y probados en modelos de xenoinjerto 37622A1 de cáncer pulmonar de célula no pequeña (NSCLC), de cáncer pulmonar HCC2429, de cáncer de mama MDA-MB-468 y de cáncer gástrico N87. Para cada uno de los modelos descritos a continuación se dio la primera dosis en el Día 0. Se midieron los tumores al menos una vez por semana y se calcularon sus volúmenes con la fórmula: volumen de tumor (mm3) = 0.5 x (anchura de tumor^longitud de tumor). Se calcularon los volúmenes de tumor medios (± S.E.M.) para cada grupo de tratamiento teniendo un máximo de 10 animales y un mínimo de 6 animales para ser incluidos.
A. Xenoiniertos 37622A1 NSCLC Se examinaron los efectos de ADCs anti-Notch en ratones inmunodeficientes en el crecimiento in vivo de xenoinjertos de tumor humano que se implantaron a partir de fragmentos de tumores 37622A1 NSCLC de reciente resección obtenidos de acuerdo con procedimientos de consentimiento apropiados (Asterand). Los xenoinjertos 37622A1 NSCLC derivados de paciente fueron transferidos a nivel subcutáneo in vivo como fragmentos de un animal a otro en ratones hembra sin pelo (Nu/Nu). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 150 hasta 300 mm3, fueron implantados para asegurar la uniformidad del tamaño de tumor entre varios grupos de tratamiento. El modelo 37622A1 NSCLC fue dosificado por vía intravenosa cuatro veces cada cuatro días (Q4dx4) con vehículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados, ADCs huNeg-8.8 de control y cisplatino en las dosis proporcionadas en el Cuadro 11.
El cisplatino es un agente anticancerígeno en base a platino usado en el tratamiento del cáncer y considerado como una terapia de estándar de atención. El cisplatino se entrelaza al ADN induciendo por tanto apoptosis e inhibición del crecimiento celular. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch hu28-vc0101 , hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos 37622A1 NSCLC. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch inhibieron el crecimiento de tumor de forma más potente que los ADCs huNeg8.8- de control. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch inhibieron el crecimiento de tumor de modo más potente que el cisplatino indicando una mayor potencia que un fármaco quimioterapéutico de estándar de cuidado en base a platino.
CUADRO 11 Eficacia de ADCs anti-Notch en xenoiniertos 37622A1 NSCLC B. Xenoinierto de Pulmón HCC2429 Se efectuaron experimentos in vivo similares con la linea celular de cáncer pulmonar HCC2429 como se describió con anterioridad. Para generar xenoinjertos, ratones hembra sin pelo (Nu/Nu) fueron implantados por vía subcutánea con 3.5x106 células HCC2429 en 50% Matrigel (BD Biosciences). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 200 hasta 400 mm3, los tumores fueron implantados para asegurar la uniformidad de la masa tumoral entre los diversos grupos de tratamiento. El modelo de pulmón HCC2429 fue dosificado por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados y ADCs huNeg-8.8 de control en las dosis que se proporcionan en los Cuadros 12 y 13. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch hu28-vc0101 , hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de pulmón HCC2429 en una manera dependiente de dosis. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch inhibieron el crecimiento tumoral de modo más potente que los ADCs huNeg8.8- de control en las dosis de 1 y 3 mg/kg para ADCs anti-Notch con ligador vc0101 -cargas útiles y en las dosis de 3 y 10 mg/kg para ADCs anti-Notch con ligador vc6780-cargas útiles. Además, los datos demuestran que una dosis 3 mg/kg de hu28-vc0101 fue más potente que una dosis de 10 mg/kg de hu28-vc6780.
CUADR0 12 Eficacia de ADCs anti-Notch-vc0101 en xenoinjertos de pulmón HCC2429 CUADRO 13 Eficacia de ADCs anti-Notch-vc6780 en xenoinjertos de pulmón HCC2429 El modelo de pulmón HCC2429 también fue dosificado por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS, ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano y ADCs huNeg-8.8 de control, a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en el Cuadro A. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch con ligadores no escindibles (me) y escindibles (ve) y varias combinaciones de carga útil inhibieron el crecimiento de xenoinjertos de pulmón HCC2429. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano inhibieron el crecimiento de tumor de modo más potente que los ADC huNeg8.8- de control. Además, los datos demuestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano con ligador vc0101-cargas útiles fueron más potentes que los otros ADCs anti-Notch probados.
CUADRO A Eficacia de ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano dosificados a 5 mq/kg en xenoiniertos de pulmón HCC2429 C. Xenoinjertos de Mama MDA-MB-468 Se efectuaron experimentos in vivo similares con la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468 como se describió con anterioridad. Las células MDA-MB-468 son clasificadas como un subtipo similar a basal de cáncer de mama triple-negativo (TNBC) ya que carecen de expresión del receptor estrógeno, receptor progesterona y receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) (Lehmann, BD, et al, J Clin Invest. 2011 ;121 (7):2750-2767). A fín de generar xenoinjertos, ratones hembra SCID No Consanguíneos Sin Pelo (SHO) fuero implantados de manera ortotópica con 10x106 células MDA-MB-468 que contienen 50% Matrigel (BD Biosciences) en el panículo adiposo mamario. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 250 hasta 450 mm3, los tumores fueron implantados para asegurar la uniformidad de la masa tumoral entre varios grupos de tratamiento. El modelo de mama MDA-MB-468 fue dosificado por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados y ADCs huNeg-8.8 de control en las dosis proporcionadas en los Cuadros 14 y 15. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch hu28-vc0101 , hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de xenoinjertos de mama MDA-MB-468 de una manera dependiente de dosis. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch inhibieron el crecimiento de tumor de manera más potente que los ADCs huNeg8.8 de control en las dosis de 1 y 3 mg/kg para ADCs con ligador vc0101 -cargas útiles y dosis de 1 , 3 y 10 mg/kg para ADC con ligador vc6780-cargas útiles. Además, los datos demuestran que una dosis de 1 mg/kg de ADCs anti-Notch con ligador vc0101-cargas útiles fueron más potentes que una dosis de 3 mg/kg de ADCs anti-Notch con ligador vc6780-cargas útiles.
CUADRO 14 Eficacia de ADCs anti-Notch-vc0101 en xenoinjertos de mama MDA-MB- 468 Xenoin ertos de Mama MDA-MB-468 volumen de tumor mmJ ± SEM CUADRO 15 Eficacia de ADCs anti-Notch-vc6780 en xenoiniertos de mama MDA-MB- 468 El modelo de mama MDA-MB-468 también fue dosificado por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS, ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano y ADCs huNeg-8.8 de control, a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en los Cuadros B y C. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano con ligadores no-escindibles (me) y escindibles (ve) y varias combinaciones de cargas útiles inhibieron el crecimiento de xenoinjertos de mama MDA-MB-468. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano inhibieron el crecimiento de tumor de modo más potente que los ADCs huNeg8.8- de control. Además, los datos demuestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano con ligador vc0101 -cargas útiles fueron más potentes que los otros ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano probados.
CUADRO B Eficacia de ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano dosificado a 5 mg/kq en xenoiniertos de mamá MDA-MB-468 Xenoiniertos de mama MDA-MB-468, volumen de tumor (mm3 ± SEM) CUADRO C Eficacia de ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano dosificado a 5 mg/kg en xenoiniertos de mama MDA-MB-468 Xenoinjertos de mama MDA-MB-468, volumen de tumor (mm3 ± SEM) D. Xenoiniertos Gástricos N87 Se efectuaron experimentos in vivo similares con la línea celular de cáncer gástrico N87 como se describió con anterioridad. A fin de generar xenoinjertos, ratones hembra sin pelo (Nu/Nu) fueron implantados por vía subcutánea con 7.5 x106 células N87 en 50% Matrigel (BD Biosciences). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 250 hasta 450 mm3, los tumores fueron implantados para asegurar la uniformidad de la masa tumoral entre varios grupos de tratamiento. El modelo gástrico N87 fue dosificado por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados, ADCs huNeg-8.8 de control y cisplatino en las dosis proporcionadas en los Cuadros 16 y 17. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch hu28-vc0101 , hu28-vc6780, hu75-vc0101 y hu75-vc6780 inhibieron el crecimiento de xenoinjertos gástricos N87 de una manera dependiente de dosis. Además, los datos demuestran que los ADCs anti-Notch inhibieron el crecimiento de tumor de modo más potente que los ADCs huNeg8.8- de control en las dosis de 1 , 3, 5 mg kg para ADCs con ligador vc0101 -cargas útiles y dosis de 3 y 10 mg/kg doses para ADCs con ligador vc6780-cargas útiles. Además, los datos muestran que los ADCs con ligador vc0101 -cargas útiles fueron en general más potentes que la terapia estándar de cuidado con cisplatino y los ADCs con ligador vc6780-cargas útiles.
CUADRO 16 Eficacia de ADCs anti-Notch-vc0101 en xenoinjertos gástricos N87 Xenoin ertos Gástricos N87 volumen de tumor mm ± SEM CUADRO 17 Eficacia de ADCs anti-Notch-vc6780 en xenoiniertos gástricos N87 El modelo gástrico N87 fue dosificado también por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS, ADCs anti-Notch quiméricos rata- humano y ADCs huNeg-8.8 de control, a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en el Cuadro D. Los datos demuestran que ADCs anti-Notch quimérico rata-humano con ligadores no escindibles (me) y escindibles (ve) y varias combinaciones de carga útil inhibieron el crecimiento de xenoinjertos gástricos N87. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano inhibieron el crecimiento de tumor de modo más potente que los ADCs huNeg8.8 de control. Además, los datos muestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano con ligador vc0101 -cargas útiles fueron más potentes que los otros ADCs anti-Notch ADCs probados.
CUADRO D Eficacia de ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano dosificado a 5 mg/kg en xenoinierto gástrico N87 Xenoinjertos gástricas N87, volumen de tumor (mm3 ± SEM) El modelo gástrico N87 también fue dosificado por vía intravenosa Q4dx4 con vehículo PBS y ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano ch28-mc0131 , ch75-mc0131 , ch28-m(H2O)c-0131 y ch75-m(H20)c-0131 a una dosis de 5 mg/kg como se proporciona en el Cuadro E. Los datos demuestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano que tienen ligador mc0131 y m(H2O)c-0131 -cargas útiles inhibieron el crecimiento de xenoinjertos gástricos N87. Además, los datos demuestran que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano que tienen ligador m(H2O)c-0131 -cargas útiles fueron más potentes que los ADCs anti-Notch quiméricos rata-humano que tienen ligador mc0131 -cargas útiles.
CUADRO E Eficacia de ADCs anti-Notch quiméricos en xenoinjertos gástricos N87 CUADRO 18A Compuestos seleccionados (péptídos citotóxicos con liqadores) de la invención CUADRO 18B Compuestos seleccionados (péptidos citotóxicos con liqadores) de la invención CUADRO 19A Conjugados seleccionados de la invención CUADRO 19B Conjugados seleccionados de la invención CUADRO 20 Valores IC?p para compuestos seleccionados fpéptidos citotóxicos) de la invención 5 10 15 20 CUADRO 21A Valores ICso para conjugados seleccionados de la invención CUADRO 21 B Valores ICso para conjugados seleccionados de la invención CUADRO 22 Valores farmacocinéticos seleccionados en ratas para coniugados que comprenden MMAD. MMAE o MMAF. Se calcularon AUCs un nivel mínimo-0 de 0-336 h excepto cuando se anota. denota un nivel mínimo final de 0-312 horas 2 denota un nivel mínimo final de 0-168 horas 3 denota un nivel mínimo final de 0-96 horas CUADRO 23 Valores farmacocinéticos seleccionados en ratones para conjugados de la invención y para conjugados que comprenden MMAD, MMAE o MMAF. Se calcularon AUCs un nivel mínimo-0 de 0-336 h excepto cuando se anota denota un nivel mínimo final de 0-168 horas CUADRO 24 Datos que muestran la estabilidad de conjugados preparados utilizando ligadores en base a succinimida de anillo abierto contra anillo cerrado CUADRO 25A Cargas útiles seleccionadas y sus métodos de síntesis CUADRO 25B Cargas útiles seleccionadas y su nombre IUPAC y datos de caracterización 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S) 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1 - HPLC (Protocolo DB): m/z 700.51 il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil- [M+hf] (2.56 minutos) 3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un compuesto de la formula I: R1 es hidrógeno, CrC8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, C C8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; y R3B es Ci-C8 alquilo, C Ce haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o d-Ca heteroalquileno; R A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R48 es hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; C1-C10 heterociclilo, C3-C8 carbociclilo y C6-C14 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -Ci-C8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2, -C Ce alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR' -0-(C C8 alquilo), -C(O)R\ -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de CrC8 alquilo, -Ci-Cs alquil- N(R')2, -CrC8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(O)OR\ -O-(C C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(O)R\ -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(O)R\ -S(0)2R', -S(0)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R\ -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8heterociclilo, Cr Cioalquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -C C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S. 2.- Un compuesto de la fórmula Ha: lia o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-; -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Ci-Cioalquileno-arileno-, -arileno-Ci-Cioalquileno-, -Ci-Ci0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-C|-C10alquileno-, -C|-C|0alqu¡leno-(C3-C8heterociclo-)- o -(C3-C8 heterociclo-)-C|-C|0alquileno-; G es halógeno, -OH, -SH o -S-CrC6 alquilo; R2 es hidrógeno, C C8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C^Ce alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o halógeno; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o CrC8 heteroalquileno; R A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C^Ce haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, CrC10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o CrC8 heteroalquileno; y C6-C14 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -Ci-C8 alquilo, -C1-C8 alquil-N(R')2, -CrC8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR' -O-(d-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(O)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2l -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C-|-C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un CrC10 heterociclilo; opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de C-i-Ce alquilo, -Ci-C8 alquil- N(R')2l -C C8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR', -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)zR', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR1 y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo, Ci-C8heterociclilo, Ci-C10alquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -C C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -d-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es CrC10 heterociclilo; y R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, NO2, CN y CF3; R10 es hidrógeno, -CrC|0alqu¡lo, -C3-C8 carbociclilo, -arilo, - -C10 heteroalquilo, -C3- C8 heterociclo, -C|-Cioalquileno-arilo, -arileno-C|-C|0 alquilo, -CrCio alquileno-(C3-C8 carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Ci-C|0alquilo, -Ci-C(0alquileno-(C3-C8heterociclo), y -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-C|0 alquilo, en donde el arilo en R10 que comprende arilo es opcionalmente sustituido con [R7]h; h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S. 3 - Un compuesto de la fórmula Illa: Illa o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R1 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, d-C8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, Ci-Ce haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-Ca heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, C^Cs alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R es hidrógeno, C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de CrC8 alquilo, -0-(Ci-C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR\ -0(?)?(^)2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo y arilo no sustituido; Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C2o eteroalquileno-, C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heteroc¡clo-, -Ci-Ci0alquileno-arileno-, -arileno-Ci-C|0alqu¡leno-, -Ci-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carboc¡clo)-Ci-Ci0alquileno-, -Ci-C|0alquileno-(C3-C8heteroc¡clo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-CrC|0alquileno-; R7 es seleccionado de manera independiente para cada ocurrencia a partir del grupo que consta de F, Cl, I, Br, N02, CN y CF3; R10 es hidrógeno, -CrC|0 alquilo, -C3-C8 carbociclo, arilo, -C|-Ci0 heteroalquilo, -C3- C8 heterociclo, -C|-C|0 alquilen-arilo, -arilen-C|-Cio alquilo, -Ci-Cio alquileno-(C3-C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Ci-C|0alquilo, -Ci-C» alquileno-(C3-C8heterociclo), y -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-C|0 alquilo, en donde el arilo en R10 que comprende arilo es opcionalmente sustituido con [R7]h; h es 1 , 2, 3, 4 o 5; y X es O o S¡ R6 es hidrógeno, Ct-C8 alquilo o CrC8 haloalquilo; y h es 1 , 2, 3, 4 o 5. 4.- Un compuesto de la fórmula llb: Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C2o heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C|-Cioalquilen-ar¡leno-, -arileno-C|-Cioalquileno-, -Ci-C|0alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-Ci-C10 alquileno-, -Ci-Cj0 alqu¡leno-(C3-C8 heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-C|-C|0alquileno-; L es un anticuerpo; R2 es hidrógeno, C Ce alquilo o C C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrC8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, CrC10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; R4A y R4B son cua|qUjera de |0S siguientes: (i) R A es hidrógeno, d-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; Ci-Cio heterociclilo, C3-C8 carbociclilo v C6-C14 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -Cr C8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2, -CrC8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR' -0-(CrC8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C Cio heterociclilo; opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-Ce alquilo, -C Cs alquil- N(R')2, -C C8 alquil-C(0)R", -C C8 alquil-C(0)OR', -0-(d-C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2l -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo, CrC8 heterociclilo, C Cioalquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un Ci-C^ heterociclilo; R6 es hidrógeno, -CrC8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -C C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C Ci0 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S. 5.- Un compuesto de la fórmula lllb: lllb o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R1 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, CrC8 alquilo o C C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, C Ce haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R A es hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-Ce alquilo, -O-íd-Ce alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R', -C(0)OR\ -C(O)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo y arilo no sustituido; Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C2o eteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8 heterociclo-, -Ci-C10 alquileno-arileno-, -arileno-Ci-C|0 alquileno-, -CrC|0 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-Ci-Ci0 alquileno-, -CrCi0 alquileno-(C3-C8 heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-C(o alquileno-; L es un anticuerpo; X es O o S. 6.- Un compuesto de la fórmula lie: lie o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -ahleno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-CrC|0 alquileno-, -C|-C|0 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C(-Cio alquileno-, -C|-C|0 alquileno-(C3-Ce heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-Cio alquileno-; L es un anticuerpo; D is -C(R4A')(R4B')- o is absent; R2 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, o está ausente si está presente; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C Ce alquilo, d-Cs haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo, o R3B es C2-C4 alquileno y forma un anillo de 5-7 como se indica mediante; v o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C-i-Ce heteroalquileno; R4A y R B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, C-i-Ce haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, C C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; carbociclilo y C6-Ci4 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -d-Ce alquilo, -d-C8 alquil-N(R')2, -Ci-C8 alquil-C(0)R', -Ci-C8 alquil-C(0)OR' -0-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(O)R\ -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de CrC8 alquilo, -CrC8 alquil- N(R")2, -Ci-C8 alquil-C(O)R', -d-C8 alquil-C(O)OR', -O-(Ci-C8 alquilo), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R", -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR* y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo, d-C8heterociclilo, Ci-C 0alquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un d-Ci0 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -C C8 alquilo, -C2-Ce alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -Ci-C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, CrC4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C Ci0 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S. 7.- Un compuesto de la fórmula lile: lile o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R es hidrógeno, CrC8 alquilo o CrC8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, d-C8 alquilo o C Ca haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, d-Ce alquilo, d-Cs haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es CrCe alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (i¡) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o CrC8 heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes:(i) R A es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, C Ce alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-C8 alquilo, -0-(Ci-Ce alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR'. -C(0)N(R')2, -NHC(0)R\ -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-C8 alquilo y arilo no sustituido; Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C2o heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno -C3-C8 heterociclo-, -C|-C10 alquileno-arileno-, -arileno-Ci-C|0 alquileno-, -C C alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-Ce carbociclo)-Ci-Cio alquileno-, -CrC alquileno-(C3-C8 heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-Ci-Ci0 alquileno-; L es un anticuerpo; X es O o S. 8.- Un compuesto de la fórmula lid: lid o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, L es un anticuerpo; [ligador] es un ligador a divalente; D es -C(R4A')(R4B ')- o está ausente; R2' es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, Ci-C8 haloalquilo, o está ausente si está presente; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, Cr C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo, o R3B es C2-C alquileno y forma un anillo de 5-7 miembros como se indica mediante '' " , o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; R4A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A' es hidrógeno, C-|-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno; - io e eroc c o, 3- 8 carbociclilo y C6-C14 arilo opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de -CrC8 alquilo, -C C8 alquil-N(R')2l -CrC8 alquil-C(0)R', -C C8 alquil-C(0)OR' -0-(C C8 alquilo), -C(0)R', -OC(0)R\ -C(0)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R\ -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2l -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R* es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, C C8 alquilo y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de C C8 alquilo, -CrC8 alquil- N(R')2, -Ci-C8 alquil-C(0)R't -C C8 alquil-C(0)OR', -0-(d-C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R\ -S(0)2R', -S(0)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2) -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=0)2R', -SR" y arileno-R', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 heterociclilo, Ci-Cioalquileno-C3-C8heterociclilo y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al cual se unen, formar un C1-C10 heterociclilo; R6 es hidrógeno, -Ci-C8 alquilo, -C2-C8 alquenilo, -C2-C8 alquinilo o -C C8 haloalquilo; R12 es hidrógeno, C1-C4 alquilo, C1-C10 heterociclilo o C6-Ci4 arilo; R13 es C1-C10 heterociclilo; y X es O o S; a condición de que cuando R3A es hidrógeno X es S. ' compuesto de la fórmula llld llld o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de los mismos, en donde, de modo independiente para cada ocurrencia, R1 es hidrógeno, CrC8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; R2 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o Ci-C8 haloalquilo; R3A y R3B son cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, C Ca haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, Ci-C 0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o CrC8 heteroalquileno; R A y R4B son cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, CrC8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es hidrógeno, Ci-C8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno; R5 es opcionalmente sustituido con 1 , 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de manera independiente a partir del grupo que consta de Ci-Cs alquilo, -0-(C C8 alquilo), -C(0)R\ -OC(0)R\ -C(0)OR', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')z, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R\ -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2l -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en donde cada R' es seleccionado de manera independiente a partir del grupo que consta de hidrógeno, Ci-Ca alquilo y arilo no sustituido; [ligador] es un ligador divalente; L es un anticuerpo; X es O o S. 10.- El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado además porque 11. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 5, 7 o 9, caracterizado además porque R1 es hidrógeno, Ci-C8 alquilo o CrC8 haloalquilo. 12. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con la reivindicación 2 o 4, caracterizado además porque R1 es 13. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado además porque R2 es hidrógeno, o d-Ce alquilo. 14. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9, caracterizado además porque R3A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R3B es CrCe alquilo, Ci-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno. 15.- El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9, caracterizado además porque R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno. 16.- El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9, caracterizado además porque R A es hidrógeno, C C8 alquilo, C C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Cio heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B es C Ce alquilo, C-i-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, CrC10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o R A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o C C8 heteroalquileno. 17. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquier reivindicación 6 u 8, caracterizado además porque R3A y R3B están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R3A es hidrógeno, CrC8 alquilo, C-i-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y R3B es Ci-C8 alquilo, d-C8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo, halógeno o aralquilo, o R3B es C2-C4 alquileno y forma un anillo de 5-7 miembros como se indica mediante ' ; o (ii) R3A y R3B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o Ci-C8 heteroalquileno, 18. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquier reivindicación 6 u 8, caracterizado además porque R4A y R4B están definidos como cualquiera de los siguientes: (i) R4A es hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C Ci0 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y R4B' es hidrógeno, CrC8 alquilo, CrC8 haloalquilo, C3-C8 carbociclilo, C1-C10 heterociclilo, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o (ii) R4A y R4B tomados en conjunto son C2-C8 alquileno o CrC8 heteroalquileno. 19.- El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 4, 6 y 8, caracterizado además porque R5 es 20.- El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 7 y 9, caracterizado además porque R5es 21. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-9 caracterizado además porque Y es -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -C|-Ci0alquileno-arileno-, -ahleno-Ci-C|0alquileno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-C|-C10alquileno-, -C|-Cioalquileno-(C3-C8heterociclo-)-, o -(C3-C8 heterociclo-)-C|-Cioalquileno-. 22. - El compuesto, sal o solvato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-9 caracterizado además porque el anticuerpo es seleccionado a partir de trastuzumab, oregovomab, edrecolomab, cetuximab, un anticuerpo monoclonal humanizado para el receptor vitronectina (a?ß3); alemtuzumab; un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin; 1311 Lym-1 ; un anticuerpo anti-HLA-DMO de murino para el tratamiento de linfoma non-Hodgkin; un mAb anti-CD2 humanizado para el tratamiento de Enfermedad de Hodgkin o linfoma no-Hodgkin; labetuzumab; bevacizumab; ibritumomab tiuxetan; ofatumumab; panitumumab; rituximab; tositumomab; ipilimumab; gemtuzumab; un anticuerpo anti-IL13; y un anticuerpo anti-Notch. 23.- Un compuesto, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, seleccionado a partir de: 542 543 544 545 546 547 548 25.- Una carga útil-ligador o un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un radical de un compuesto de conformidad con la reivindicación 23 o 24. 26. - Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un radical de un compuesto como el que se reclama en las reivindicaciones 1-3. 27. - Un compuesto, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, seleccionado a partir de: 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 j66 ??? ??? 28. - Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un radical de un compuesto como el que se reclama en las reivindicaciones 23-27. 29. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-28, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y excipiente farmacéuticamente aceptable. 30. - El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-28 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 30, en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente. 31. - Un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-28 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 29 para usarse en el tratamiento del cáncer en un paciente.
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