CN107660208B - 包含cti药效团的双功能细胞毒性剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式F1–L1–T–L2–F2的新型双功能CTI‑CTI和CBI‑CTI二聚体，其中F1、L1、T、L2和F2如本文中所定义，其可用于治疗增殖性疾病，其中本发明的二聚体可用作单独的药物、抗体‑药物‑缀合物(ADC)中的有效负载(payload)以及可用于这样的ADC的制备或给药的连接基‑有效负载化合物；还涉及包含上述二聚体、连接基‑有效负载及ADC的组合物，以及使用这些二聚体、连接基‑有效负载及ADC来治疗包括癌症的病理学病况的方法。

Description

包含CTI药效团的双功能细胞毒性剂
发明领域
本发明涉及用于治疗增殖性疾病的新型双功能CTI-CTI和CBI-CTI二聚体。本发明的二聚体可用作单独的药物、抗体-药物-缀合物(ADC)中的有效负载(payload)以及可用于这样的ADC的制备或给药的连接基-有效负载化合物。本发明还涉及包含上述二聚体、连接基-有效负载及ADC的组合物，以及使用这些二聚体、连接基-有效负载及ADC来治疗包括癌症的病理学病况的方法。
背景
含两个活性DNA烷基化基序(即CBI或CPI)的双功能类似物含有两个稠合在一起的烷基化(例如两个CPI基序)。由于存在两个反应性烷基化基序，这些化合物为活性DNA交联剂，而仅有一个烷基化基序的化合物(例如，多卡米星(duocarmycin))为DNA单烷基化剂。
Figure BDA0001474068160000011
以上所示化合物是文献中的代表性实例，并且被报道为有效的细胞毒素：A(“Glycosidic Prodrugs of Highly Potent Bifunctional Duocarmycin Derivativesfor Selective Treatment of Cancer”,Angew.Chem. Int.Ed.2010,49,7336–7339；“Duocarmycin Analogues Target Aldehyde Dehydrogenase 1in LungCancer Cells”,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,2874–2877；“Bifunctional prodrugs and drugs”,WO2011/054837, DE 10 2009 051 799；“The Two Faces of Potent AntitumorDuocarmycin-Based Drugs:A Structural Dissection Reveals Disparate Motifs forDNA versus Aldehyde Dehydrogenase 1Affinity”,Angew.Chem. Int.Ed.2013,52,1–6；B(“Interstrand DNA Cross-linking with Dimers of the SpirocyclopropylAlkylating Moiety of CC-1065”,J.Am.Chem.SOC.1989,11 1,6428-6429；“CC-1065analogs having two CPI subunits useful as antitumor agents andultraviolet light absorbers”,Eur.Pat.Appl.(1990),EP 359454,以及对于化合物C和D；C(“Synthesis and DNACross-Linking by a Rigid CPI Dimer”,J.Am.Chem.SOC.1991,113,8994-8995；“Nucleotide Preferences for DNAInterstrand Cross-LinkingInduced by the Cyclopropylpyrroloindole Analogue U-77,779”,Biochemistry 1993,32,2592-2600；“Determination of the Structural Role of the Internal Guanine-Cytosine Base Pair in Recognition of a Seven-Base-Pair Sequence Cross-Linkedby Bizelesin”,Biochemistry 1995,34,11005-11016；“Analysis of theMonoalkylation and Cross-Linking Sequence Specificity of Bizelesin,aBifunctional Alkylation AgentRelated to(+)-CC-1065”, J.Am.Chem.SOC.1993,115,5925-5933；“Mapping of DNA Alkylation Sites Induced by Adozelesin andBizelesin in Human Cells by Ligation-Mediated Polymerase Chain Reaction”,Biochemistry 1994,33, 6024-6030；“DNAInterstrand Cross-Links Induced by theCyclopropylpyrroloindole Antitumor Agent Bizelesin Are Reversible uponExposure to Alkali”,Biochemistry 1993,32,9108-9114；“Replacement of theBizelesin Ureadiyl Linkage by a Guanidinium Moiety Retards Translocation fromMonoalkylation to Cross-Linking Sites on DNA”,J.Am.Chem.Soc.1997,119,3434-3442；“DNAinterstrand cross-linking, DNAsequence specificity,and inducedconformational changes produced by a dimeric analog of (+)-CC-1065”,Anti-Cancer Drug Design(1991),6,427-452；“A phase I study of bizelesin,a highlypotent and selective DNAinteractive agent,in patients with advanced solidmalignancies”,Ann Oncol.2003 May；14(5):775-782；“A Phase I study of bizelesin(NSC 615291)in patients with advanced solid tumors”, Clin Cancer Res.2002,3,712-717；“Solution conformation of a bizelesin A-tract duplex adduct: DNA-DNAcross-linking of an A-tract straightens out bent DNA”,J Mol Biol.1995,252,86-101；“Preclinical pharmacology of bizelesin,a potent bifunctional analog ofthe DNA-binding antibiotic CC-1065”,Cancer Chemother Pharmacol.1994,34,317-322；和D(“CC-1065analogs having two CPI subunits useful as antitumor agentsand ultraviolet light absorbers”,Eur.Pat.Appl.(1990),EP 359454。活性DNA烷基化基序理论上可以前药形式(其在生物介质中转化成活性药物)或者其活性状态(其不需要另外的转化)存在。以下所示的CBI二聚体中对双功能交联剂的前药到活性药物的转化进行了举例说明：
Figure BDA0001474068160000021
相应的转化在所有以其前药状态存在的双功能交联剂中均会发生。
已报道其它相关的双功能交联连接基。(“Chemical and BiologicalExplorations of the Family of CC-1065and the Duocarmycin Natural Products”,Current Topics in Medicinal Chemistry,2009,9, 1494-1524；“DNAinterstrandcross-linking agents and their chemotherapeutic potential”,Curr Med Chem.2012,19,364-385；“Design and Synthesis of a Novel DNA-DNAInterstrand Adenine-Guanine Cross-Linking Agent”,J.Am.Chem.Soc.2001,123,4865-4866；“Effect of basesequence on the DNA cross-linking properties of pyrrolobenzodiazepine(PBD)dimers”,Nucleic Acids Res.2011,39,5800-5812；“Sequence-selective recognitionof duplex DNAthrough covalent interstrand cross-linking:kinetic and molecularmodeling studies with pyrrolobenzodiazepine dimers”,Biochemistry.2003,42,8232-8239；“Bifunctional alkylating agents derived from duocarmycin SA:potentantitumor activity with altered sequence selectivity”,Bioorg Med ChemLett.2000,10,495-498；“Design,Synthesis and Cytotoxicity Evaluation of 1-Chloromethyl-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indole(seco-CBI)Dimers”,Bioorganic & Medicinal Chemistry 2000,8,1607-1617.
Zhao等人(“Synthesis and biological evaluation of antibody conjugatesof phosphate prodrugs of cytotoxic DNAalkylators for the targeted treatmentof cancer”,J.Med.Chem.2012,55,766-782)和Zhang 等人(“Immunoconjugatescontaining phosphate-prodrugged DNA minor groove binding agents, compositionscontaining them,and methods of making them and their use for treatingcancer”,WO 2012/162482)描述了用于包含细胞毒素的单聚开环(seco)-CBI的磷酸酯前药策略。
近期某些CBI二聚体被描述为可用作ADC有效负载(“I-(Chloromethyl)-2,3-Dihydro- IH-Benzo[e]indole Dimer Antibody-Drug Conjugate Compounds,andMethods of Use and Treatment”, WO2015/023355)。
药物与抗体的缀合(直接或经由连接基)涉及多种因素的考虑，包括供药物缀合的化学基团的识别和位置、药物释放机制、提供药物释放的结构要素以及对所释放的游离药物的结构修饰。此外，如果药物要在抗体内化之后释放，则药物释放机制必需与缀合物的细胞内运输相一致。
尽管己尝试将一些不同的药物类别用于经由抗体递送，但仅有少数药物类别已证实为有效的抗体药物缀合物，尽管其具有适当的毒性谱。其中一种此类药物是奥里斯他汀(auristatin)(天然产物多拉司他汀10的衍生物)。代表性奥里斯他汀包括(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)- 海兔脑氨酸(dolaproine)-去甲麻黄碱)与(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脑氨酸-苯丙氨酸)。其它相关的微管蛋白结合剂包括美坦辛(例如参见“Cell-binding agent-maytansinoid conjugates linked via anoncleavable linker,preparation methods,and methods using them for targetingspecific cell populations”，以WO 2005/037992公布)。其他已用于与抗体连接的细胞毒性药物包括DNA结合药物，诸如导致序列特异性双链DNA切割的卡奇霉素。另一类在ADC中使用的结合DNA的细胞毒性药物包括二聚吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001474068160000022
(例如参见“Preparation ofunsymmetrical pyrrolobenzodiazepines dimers for inclusion in targetedconjugates”以WO2013/041606公布)。另一类尝试进行抗体递送的药物是DNA结合烷化剂，诸如多卡米星类似物CC1065(参见“Preparation of CC-1065analogs and theirconjugates for treatment of cancer”，以WO2010/062171公布)和相关的化合物(参见“Antibody-drug peptide conjugates for use as cytotoxins in cancer treatment”，以WO 2007/038658公布,以及“Immunoconjugates containing phosphate-prodruggedDNA minor groove binding agents,compositions containing them,and methods ofmaking them and their use for treating cancer”，以WO2012/162482公布)。然而，这些药物都有关于疾病适应症和治疗谱的限制，因此仍需要其他可通过抗体缀合递送且具有改善性能的药物。因此，本发明提供具有二聚体作为有效负载的新型ADC。
另一种已知为有效的DNA烷基化基序的杂环用“CTI”基团(CTI:1,2,8,8a-四氢-4H-环丙烷并噻吩并[3,2-e]吲哚-4-酮,“Fundamental relationships betweenstructure,reactivity,and biological activity for the duocarmycins and CC-1065”,J.Med.Chem.2009,52(19),5771-5780,“Rational Design,Synthesis, andEvaluation of Key Analogues of CC-1065and the Duocarmycins”,J.AM.CHEM.SOC.2007,129, 14092-14099)表示。含多卡米星单体的CTI被称为ADC有效负载(“Synthesis of functionalized thieno-indole derivs.optionally containing apeptidic residue for the treatment of cancer and their use in the preparationof conjugates”,WO 2013/149946,“Preparation of new functionalized alkylatingagents containing a thieno-indole moiety linked to a DNA-binding moiety fortreating cancers and their use in the prepn.of conjugates”,WO 2013/149948)。下图解 示出了“CBI”、“CPI”和“CTI”之间的结构差异：
Figure BDA0001474068160000031
CBI、CPI和CTI差异在于第一芳环，CBI具有苯基，CPI具有吡咯，且CTI具有噻吩杂环。该图解 还示出了氯化物前药。在损失氯化氢下，这些前药在生物介质中转化成活性药物。因此，氯化物前药和活性环丙基物质需被视为生物学活性等效的。文献中已很好地记载了针对CBI、CPI以及相关基团的氯化物前药的概念(“Design,Synthesis,and Evaluationof Duocarmycin O-Amino Phenol Prodrugs Subject”,J.Med.Chem.2010,53,7731–7738,以及其中的文献8)。
关于CTI基团，两种结构变体收到特别关注，即下图解 所示的Me-CTI和异-Me-CTI基团：
Figure BDA0001474068160000032
在多卡米星的内容中对Me-CTI和异-Me-CTI基团都进行了描述(“Chemical andbiological explorations of the family of CC-1065and the duocarmycin naturalproducts”,Curr Top Med Chem.2009, 9(16),1494-1524)。
发明概述
本发明描述基于CTI基序的新结构二聚体类似物。本发明还描述用于相应CTI二聚体和CBI-CTI 混合结构的间隔元素。术语CBI和CTI既用于氯化物前药形式，也用于活性环丙基物质。此外，对这些二聚体物质的连接基取代以及抗体药物缀合物的制备进行了描述。
已知尚无含CTI基序的二聚体，并且与之前记载的二聚体物质相比，在本发明中使用CTI二聚体导致化学反应性和生物学性质的显著变化。因此，用CTI物质制备的二聚体代表了独特的药物实体。在本发明中，我们描述含两个CTI基团或具有一个CBI和一个CTI基团的杂合体的新二聚体。此外，我们公开如何将这些二聚体物质连接到用于连接抗体的合适的连接基分子上。
更具体地，本发明涉及包含基于CTI/CTI二聚体和/或基于CTI/CBI(包括如本文中详细描述的 CBI和CTI的开环形式)二聚体的细胞毒性二聚体，涉及包含这种二聚体的抗体药物缀合物以及使用所述抗体药物缀合物治疗癌症和其他适应症的方法。如本文中详细描述，CTI和CBI结构可以由它们的开环形式表示，并且可以被取代和衍生。此外，开环形式中的苯酚官能团可以利用乙酸酯基团衍生。苯酚乙酸酯官能团在功能上与苯酚等同，因为在生物介质中乙酸酯基团容易水解得到游离的苯酚。
因此，本发明涉及化合物以及包含它们的药物组合物，其制备，以及所述化合物的用途(主要但不限于用作抗癌药物)。根据一个方面，本发明涉及式I的“有效负载”化合物：
F1–L1–T–L2–F2 (式I)
或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
F1和F2各自独立地选自环系A、B、C、D、E、F、G和H：
Figure BDA0001474068160000041
Figure BDA0001474068160000051
其中：
环系A、B、C和D中的至少一个存在；
对于其中出现R的各个环系，R各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、卤素、氘、羟基、烷氧基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-NO2、-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基，其中两个或更多个R任选地结合以形成一个或多个环，并且其中所述-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基任选地被1至5个独立地选自下列的取代基取代：-C1-C10烷基、-C1-C10烷氧基、-卤素、-C1-C10烷硫基、-三氟甲基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-C1-C10烷基-N(C1-C8烷基)2、-C1-C3烷硫基、-NO2或-C1-C10杂环基；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为键、O、N(R)或S；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O、N(R)或S；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-苯基、-C(O)OR、-C(O)SR、-C(O)NHN(R)2或-C(O)N(R)2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地为-OH、-O-酰基、叠氮基、卤素、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或
Figure BDA0001474068160000052
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自H、-C1-C6烷基-RA、-C(O)RA、-C(S)RA、-C(O)ORA、 -S(O)2ORA、-C(O)N(RA)2、-C(S)N(RA)2、碳水化合物、糖基、-NO2、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(例如被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基 N(R)2任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
对于其中出现Z的各个环系，Z各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素，并且其中所述C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键、羰基或在酰基部分键连至F1或F2的羰基酰基，其中所述羰基酰基选自：
Figure BDA0001474068160000053
Figure BDA0001474068160000061
其中
U1选自H、-CH3、-OH、-OCH3、-NO2、-NH2、-NHNHAc、-NHNHC(O)CH3、-NHC(O)苯基或-卤素，
U2为H、-OH或-OCH3，
U3为H、-CH3或-C2H5，
U4为H或CH3S-，
U5和U6各自独立地选自H、-卤素、-C1-C4烷基、-C1-C3烷氧基、-C1-C6二烷基氨基、-NO2、-NHC(O)C1-C10烷基、-OH、-NH2、-NHC(O)NH2、-NHC(O)CH3或-NHC(O)苯基，
Q1为-O-、-S-或-NH-，并且
Q2和Q3各自独立地为-CH-或-N-；
T选自：
-NHC(O)-，
-C(O)NH-，
-C(O)O-，
-OC(O)-，
-NRB-T1-NRC-，其中RB和RC各自独立地为H或-C1-C8烷基，或者RB和RC结合在一起形成环，并且一起为(CH2)2-3，其中T1选自-C(O)-、-C(O)(CH2)nC(O)-(其中n为0至50的整数)和-C(O)PhC(O)-(其中Ph为1,3-或1,4-亚苯基)，并且其中T1任选地被1-2个R取代，
-C(O)hetC(O)-，其中het为5至12元单-、双-或三环杂芳基，其包含一个、两个或三个独立地选自 O、N、S、P和B的杂原子，其中het任选地被1个至8个各自独立地选自下列的取代基取代：-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-NH2、-NHRD和-NO2，并且het上所述任选的取代基任选地被RE取代，
其中RD各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，其任选地被RE取代，
其中RE各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，并且其中RE各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代，
-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000062
其中X1各自独立地为键、-NRE-、-O-或-S-，其中A1和B1各自独立地为＝O或＝S，其中R1、R2、 R3和R4各自独立地为RE，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，
其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，或者R1、R2、R3和R4各自键连至D上的不同碳，其中g和j各自独立地为0至50的整数，并且m为1-50的整数，并且其中D为键或者选自–S-、-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基(heterocyclo)和-C3-C8亚碳环基(carbocyclo)，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和--C3-C8亚碳环基任选地被–RE、-C(O)RE、-C(O)ORE、-N(RE)2、-N(R)C(O)RE或-N(R)C(O)ORE取代，并且D另外任选地被1至2 个R取代，以及
-G1-T2-G2-，其中G1和G2各自独立地为-S(O)X1-或-S(O)2X1-。
在本发明的实施方案中，变量n为0至50，优选0至25，优选0至10，并且优选1-5。优选地，变量 n可为0、1、2、3、4或5。
在本发明的其它实施方案中，所述变量-Y-为C(O)N(RA)2或C(S)N(RA)2，其中一个RA为氢或-C1-C20烷基并且另一个RA为–C1-C20烷基-N(R)2，使得形成以下结构：
Figure BDA0001474068160000071
其中A为氧或硫。
如上所说明，本发明的实施方案包括其中R1、R2、R3和R4各自键连至D上的不同碳的那些。当D 为6-元碳环(加粗，见下)，该实施方案可为立方烷的形式：
Figure BDA0001474068160000072
其它形式的立方烷(例如如本文中所列的取代的形式)以及非立方烷也是可能的，并且包括在本发明中。
根据本发明的另一方面提供式IIA的“连接基-有效负载”化合物：
L–P(式IIA)
或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
P为：
F1–L1–T–L2-F2
其中：
F1和F2各自独立地选自环系A、B、C、D、E、F、G和H：
Figure BDA0001474068160000073
Figure BDA0001474068160000081
其中：
环系A、B、C和D中的至少一个存在；
对于其中出现R的各个环系，R各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、卤素、氘、羟基、烷氧基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-NO2、-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基，其中两个或更多个R任选地结合以形成一个或多个环，并且其中所述-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基任选地被1至5个独立地选自下列的取代基取代：-C1-C10烷基、-C1-C10烷氧基、-卤素、-C1-C10烷硫基、-三氟甲基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-C1-C10烷基-N(C1-C8烷基)2、-C1-C3烷硫基、-NO2或-C1-C10杂环基；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为键、O、N(R)或S；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O、N(R)或S；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-苯基、-C(O)OR、-C(O)SR、-C(O)NHN(R)2或-C(O)N(R)2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地选自-OH、-O-酰基、叠氮基、卤素、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或
Figure BDA0001474068160000082
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自键、H、-C(O)RA、-C(S)RA、-C(O)ORA、-S(O)2ORA、 -C(O)N(RA)2、-C(S)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO2、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C1-C20烷基N(R)2、-C1-C20亚烷基、-C1-C8亚杂烷基、-C6-C14亚芳基、亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基、-C3-C8亚碳环基和-C1-C20烷基N(R)-以及RF，其中所述RA任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代，并且其中一个Y是二价的并且键连至L，
RF为-N(R6)QN(R5)C(O)-，并且在与N(R5)相邻的羰基处键连至L，其中R5和R6各自独立地选自 H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基和-C3-C8碳环基，或者R5或R6与Q上取代的碳结合形成-C1-C10杂环基或-C6-C14杂芳基环，或者R5和R6结合在一起形成-C1-C10杂环基或-C6-C14杂芳基环系，并且其中Q为-C1-C8亚烷基-、-C1-C8亚杂烷基-、-C6-C14亚芳基-、-亚芳烷基-、-C1-C10亚杂环基-或者-C3-C8亚碳环基-，其中Q、R5和R6各自独立地任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
对于其中出现Z的各个环系，Z各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素，并且其中所述C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键、羰基或在酰基部分键连至F1或F2的羰基酰基，其中所述羰基酰基选自：
Figure BDA0001474068160000091
Figure BDA0001474068160000092
其中
U1选自H、-CH3、-OH、-OCH3、-NO2、-NH2、-NHNHAc、-NHNHC(O)CH3、-NHC(O)苯基或-卤素，
U2为H、-OH或-OCH3，
U3为H、-CH3或-C2H5，
U4为H或CH3S-，
U5和U6各自独立地选自H、-卤素、-C1-C4烷基、-C1-C3烷氧基、-C1-C6二烷基氨基、-NO2、-NHC(O)C1-C10烷基、-OH、-NH2、-NHC(O)NH2、-NHC(O)CH3或-NHC(O)苯基，
Q1为-O-、-S-或-NH-，并且
Q2和Q3各自独立地为-CH-或-N-；
T选自：
-NHC(O)-，
-C(O)NH-，
-C(O)O-，
-OC(O)-，
-NRB-T1-NRC-，其中RB和RC各自独立地为H或-C1-C8烷基，或者RB和RC结合在一起形成环，并且一起为(CH2)2-3，其中T1选自-C(O)-、-C(O)(CH2)nC(O)-(其中n为0至50的整数)和-C(O)PhC(O)-(其中Ph为1,3-或1,4-亚苯基)，并且其中T1任选地被1-2个R取代，
-C(O)hetC(O)-，其中het为5至12元单-、双-或三环杂芳基，其包含一个、两个或三个独立地选自 O、N、S、P和B的杂原子，其中het任选地被1个至8个各自独立地选自下列的取代基取代：-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-NH2、-NHRD和-NO2，并且het上所述任选的取代基任选地被RE取代，
其中RD各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，其任选地被RE取代，
其中RE各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，并且其中RE各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代，
-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000101
其中X1各自独立地为键、-NRE-、-O-或-S-，其中A1和B1各自独立地为＝O或＝S，其中R1、R2、 R3和R4各自独立地为RE，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，或者R1、R2、R3和R4各自键连至D上的不同碳，其中g和j各自独立地为0至50的整数，并且m为1-50的整数，并且其中D为键或者选自–S-、-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基任选地被–RE、-C(O)RE、-C(O)ORE、-N(RE)2、-N(R)C(O)RE或-N(R)C(O)ORE取代，并且D另外任选地被1至2 个R取代，以及
-G1-T2-G2-，其中G1和G2各自独立地为-S(O)X1-或-S(O)2X1-；
L为LA-LB-(LC)1-3，其中LA选自-卤素、-N(R)2、-CON(R)2、任选地被-NO2或–CON(R)2取代的-S-芳基、任选地被-NO2取代的-S-杂芳基、烷基-SO2-杂芳基、芳基SO2-杂芳基-、
Figure BDA0001474068160000102
LB为LB1-LB2-LB3，其中LB1不存在或者为选自下列的一个或多个组分：-C(O)-、-C(S)-、-C(O)NR-、 -C(O)C1-C6烷基-、-C(O)NRC1-C6烷基-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)C1-C6烷基NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-C6烷基-S-S-C1-C6烷基 NRC(O)CH2-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)CH2-、-C(O)C1-C6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR- 苯基-O-C1-C6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-C6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基-苯基(NR-C(O)C1-C6烷基)1-4-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-C6烷基-、 -C1-C6烷基-、-S-、-C(O)-CH(NR-C(O)C1-C6烷基)-C1-C6烷基-和(-CH2-CH2-O-)1-20，
其中LB2为AA0-12，其中AA为天然氨基酸、非天然氨基酸或者-(CR15)o-S-S-(CR15)p，其中o和 p各自独立地为1-20的整数，
LB3为-PABA-、-PABC-、-C(O)(CH2)nC(O)-或者不存在；
LC不存在或者独立地选自-C1-C6亚烷基-、-NRC3-C8-杂环基NR-、-NRC3-C8-碳环基NR-、 -NRC1-C6烷基NR-、-NRC1-C6亚烷基-、-S-、-NR-、-NRNR-、-O(CR2)1-4S-S(CR2)1-4N(R)-、-NRC1-C6- 亚烷基亚苯基NR-、-NRC1-C6亚烷基亚苯基SO2NR-、-OC1-C6烷基S-SC1-C6烷基C(COOR)NR-、 -NRC(COOR)C1-C6烷基S-SC1-C6烷基O-、
Figure BDA0001474068160000111
其中
XA为CR或N，
XB为CH、CR(C(R)2)1-3NR、CR(C(R)2)1-3O、CR(C(R)2)1-3C(O)NR、CR-(C(R)2)1-3C(O)NRNR、 CR(C(R)2)1-3SO2NR、CR(C(R)2)1-3NRNR、CR(C(R)2)1-3NRC(O)或N，
XC各自为R，
XD各自为-(CH2)1-5-，或者不存在；
XE为O、S、C(R)2、C(R)(C(R)2)1-3-NR2或NR，并且
XF各自为(C(R)2)1-3-NR或C(R)2-(C(R)2)1-3-O。
在本发明的其它实施方案中，所述变量-Y-为C(O)N(RA)2或C(S)N(RA)2，其中一个RA为氢或 -C1-C20烷基并且另一个RA为–C1-C20烷基-N(R)-，使得形成以下结构：
Figure BDA0001474068160000112
其中A各自独立地为氧或硫。
根据本发明的另一方面提供式IIIA的抗体药物缀合物化合物：
AB–(L–P)1-20 (式IIIA)
或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
AB为抗体；
P为：
F1–L1–T–L2-F2
其中：
F1和F2各自独立地选自环系A、B、C、D、E、F、G和H：
Figure BDA0001474068160000113
Figure BDA0001474068160000121
其中：
环系A、B、C和D中的至少一个存在；
对于其中出现R的各个环系，R各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、卤素、氘、羟基、烷氧基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-NO2、-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基，其中两个或更多个R任选地结合以形成一个或多个环，并且其中所述-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基任选地被1至5个独立地选自下列的取代基取代：-C1-C10烷基、-C1-C10烷氧基、-卤素、-C1-C10烷硫基、-三氟甲基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-C1-C10烷基-N(C1-C8烷基)2、-C1-C3烷硫基、-NO2或-C1-C10杂环基；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为键、O、N(R)或S；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O、N(R)或S；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-苯基、-C(O)OR、-C(O)SR、-C(O)NHN(R)2或-C(O)N(R)2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地选自-OH、-O-酰基、叠氮基、卤素、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或
Figure BDA0001474068160000122
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自键、H、-C(O)RA、-C(S)RA、-C(O)ORA、-S(O)2ORA、 -C(O)N(RA)2、-C(S)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO2、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C1-C20烷基N(R)2、-C1-C20亚烷基、-C1-C8亚杂烷基、-C6-C14亚芳基、亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基、-C3-C8亚碳环基和-C1-C20烷基N(R)-以及RF，其中所述RA任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代，并且其中一个Y是二价的并且键连至L，
RF为-N(R6)QN(R5)C(O)-，并且在与N(R5)相邻的羰基处键连至L，其中R5和R6各自独立地选自 H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基和-C3-C8碳环基，或者R5或R6与Q上取代的碳结合形成-C1-C10杂环基或-C6-C14杂芳基环，或者R5和R6结合在一起形成-C1-C10杂环基或-C6-C14杂芳基环系，并且其中Q为-C1-C8亚烷基-、-C1-C8亚杂烷基-、-C6-C14亚芳基-、-亚芳烷基-、-C1-C10亚杂环基-或者-C3-C8亚碳环基-，其中Q、R5和R6各自独立地任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
对于其中出现Z的各个环系，Z各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素，并且其中所述C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键、羰基或在酰基部分键连至F1或F2的羰基酰基，其中所述羰基酰基选自：
Figure BDA0001474068160000131
Figure BDA0001474068160000132
其中
U1选自H、-CH3、-OH、-OCH3、-NO2、-NH2、-NHNHAc、-NHNHC(O)CH3、-NHC(O)苯基或-卤素，
U2为H、-OH或-OCH3，
U3为H、-CH3或-C2H5，
U4为H或CH3S-，
U5和U6各自独立地选自H、-卤素、-C1-C4烷基、-C1-C3烷氧基、-C1-C6二烷基氨基、-NO2、-NHC(O)C1-C10烷基、-OH、-NH2、-NHC(O)NH2、-NHC(O)CH3或-NHC(O)苯基，
Q1为-O-、-S-或-NH-，
Q2和Q3各自独立地为-CH-或-N-；
T选自：
-NHC(O)-，
-C(O)NH-，
-C(O)O-，
-OC(O)-，
-NRB-T1-NRC-，其中RB和RC各自独立地为H或-C1-C8烷基，或者RB和RC结合在一起形成环，并且一起为(CH2)2-3，其中T1选自-C(O)-、-C(O)(CH2)nC(O)-(其中n为0至50的整数)和-C(O)PhC(O)-(其中Ph为1,3-或1,4-亚苯基)，并且其中T1任选地被1-2个R取代，
-C(O)hetC(O)-，其中het为5至12元单-、双-或三环杂芳基，其包含一个、两个或三个独立地选自 O、N、S、P和B的杂原子，其中het任选地被1个至8个各自独立地选自下列的取代基取代：-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-NH2、-NHRD和-NO2，并且het上所述任选的取代基任选地被RE取代，
其中RD各自独立地选自H或-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，其任选地被RE取代，
其中RE各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，并且其中RE各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代，
-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000141
其中X1各自独立地为键、-NRE-、-O-或-S-，其中A1和B1各自独立地为＝O或＝S，其中R1、R2、 R3和R4各自独立地为RE，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，或者R1、R2、R3和R4各自键连至D上的不同碳，其中g和j各自独立地为0至50的整数，并且m为1-50的整数，并且其中D为键或者选自–S-、-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基任选地被–RE、-C(O)RE、-C(O)ORE、-N(RE)2、-N(R)C(O)RE或-N(R)C(O)ORE取代，并且D另外任选地被1至2 个R取代，以及
-G1-T2-G2-，其中G1和G2各自独立地为-S(O)X1-或-S(O)2X1-；
L为LA-LB-(LC)1-3；
LA选自：与AB连接的键、-NR-(与AB连接的键)、-杂芳基-(与AB连接的键)、
Figure BDA0001474068160000142
LB为LB1-LB2-LB3，其中LB1不存在或者为选自下列的一个或多个组分：-C(O)-、-C(S)-、-C(O)NR-、 -C(O)C1-C6烷基-、-C(O)NRC1-C6烷基-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)C1-C6烷基NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-C6烷基-S-S-C1-C6烷基 NRC(O)CH2-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)CH2-、-C(O)C1-C6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR- 苯基-O-C1-C6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-C6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基-苯基(NR-C(O)C1-C6烷基)1-4-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-C6烷基-、 -C1-C6烷基-、-S-、-C(O)-CH(NR-C(O)C1-C6烷基)-C1-C6烷基-和(-CH2-CH2-O-)1-20；
LB2为AA0-12，其中AA为天然氨基酸、非天然氨基酸或者-(CR15)o-S-S-(CR15)p，其中o和p各自独立地为1-20的整数，
LB3为-PABA-、-PABC-、-C(O)(CH2)nC(O)-或者不存在；
LC不存在或者独立地选自-C1-C6亚烷基-、-NRC3-C8-杂环基NR-、-NRC3-C8-碳环基NR-、 -NRC1-C6烷基NR-、-NRC1-C6亚烷基-、-S-、-NR-、-NRNR-、-O(CR2)1-4S-S(CR2)1-4N(R)-、-NRC1-C6- 亚烷基亚苯基NR-、-NRC1-C6亚烷基亚苯基SO2NR-、-OC1-C6烷基S-SC1-C6烷基C(COOR)NR-、 -NRC(COOR)C1-C6烷基S-SC1-C6烷基O-、
Figure BDA0001474068160000151
其中
XA为CR或N，
XB为CH、CR(C(R)2)1-3NR、CR(C(R)2)1-3O、CR(C(R)2)1-3C(O)NR、CR-(C(R)2)1-3C(O)NRNR、CR(C(R)2)1-3SO2NR、CR(C(R)2)1-3NRNR、CR(C(R)2)1-3NRC(O)或N，
XC各自为R，
XD各自为-(CH2)1-5-，或者不存在；
XE为O、S、C(R)2、C(R)(C(R)2)1-3-NR2或NR，并且
XF各自为(C(R)2)1-3-NR或C(R)2-(C(R)2)1-3-O。
根据本发明的另一方面提供式IIB的“连接基-有效负载”化合物：
Figure BDA0001474068160000152
或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
F1和F2各自独立地选自环系A、B、C、D、E、F、G和H：
Figure BDA0001474068160000153
Figure BDA0001474068160000161
其中：
环系A、B、C和D中的至少一个存在；
对于其中出现R的各个环系，R各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、卤素、氘、羟基、烷氧基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-NO2、-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基，其中两个或更多个R任选地结合以形成一个或多个环，并且其中所述-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基任选地被1至5个独立地选自下列的取代基取代：-C1-C10烷基、-C1-C10烷氧基、-卤素、-C1-C10烷硫基、-三氟甲基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-C1-C10烷基-N(C1-C8烷基)2、-C1-C3烷硫基、-NO2或-C1-C10杂环基；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为键、O、N(R)或S；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O、N(R)或S；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-苯基、-C(O)OR、-C(O)SR、-C(O)NHN(R)2或-C(O)N(R)2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地为-OH、-O-酰基、叠氮基、卤素、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或
Figure BDA0001474068160000162
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自H、-C1-C6烷基-RA、-C(O)RA、-C(S)RA、-C(O)ORA、 -S(O)2ORA、-C(O)N(RA)2、-C(S)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO2、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基 N(R)2任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
对于其中出现Z的各个环系，Z各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素，并且其中所述C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键、羰基或在酰基部分键连至F1或F2的羰基酰基，其中所述羰基酰基选自：
Figure BDA0001474068160000171
Figure BDA0001474068160000172
其中
U1选自H、-CH3、-OH、-OCH3、-NO2、-NH2、-NHNHAc、-NHNHC(O)CH3、-NHC(O)苯基或-卤素，
U2为H、-OH或-OCH3，
U3为H、-CH3或-C2H5，
U4为H或CH3S-，
U5和U6各自独立地选自H、-卤素、-C1-C4烷基、-C1-C3烷氧基、-C1-C6二烷基氨基、-NO2、-NHC(O)C1-C10烷基、-OH、-NH2、-NHC(O)NH2、-NHC(O)CH3或-NHC(O)苯基，
Q1为-O-、-S-或-NH-，并且
Q2和Q3各自独立地为-CH-或-N-；
T选自-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000173
其中X1各自独立地为键、-NRE-、-O-或-S-，其中A1和B1各自独立地为＝O或＝S，其中R1、R2、 R3和R4各自独立地为RE，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，或者R1、R2、R3和R4各自键连至D上的不同碳，其中g和j各自独立地为0至50的整数，并且m为1-50的整数，并且其中D选自-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和--C3-C8亚碳环基被选自以下基团中的一员取代：N(RE)C(O)-(其中所述羰基键连至L)和-C(O)-(其中所述羰基键连至L)，并且另外任选地被1个至2个R取代；
其中RE各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，并且其中RE各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L为LA-LB-(LC)1-3；
LA选自-卤素、-N(R)2、-CON(R)2、任选地被-NO2或–CON(R)2取代的-S-芳基、任选地被-NO2取代的-S-杂芳基、烷基-SO2-杂芳基、芳基SO2-杂芳基-、
Figure BDA0001474068160000181
LB为LB1-LB2-LB3，其中LB1不存在或者为选自下列的一个或多个组分：-C(O)-、-C(S)-、-C(O)NR-、 -C(O)C1-C6烷基-、-C(O)NRC1-C6烷基-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)C1-C6烷基NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-C6烷基-S-S-C1-C6烷基 NRC(O)CH2-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)CH2-、-C(O)C1-C6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR- 苯基-O-C1-C6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-C6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基-苯基(NR-C(O)C1-C6烷基)1-4-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-C6烷基-、 -C1-C6烷基-、-S-、-C(O)-CH(NR-C(O)C1-C6烷基)-C1-C6烷基-和(-CH2-CH2-O-)1-20；
LB2为AA0-12，其中AA为天然氨基酸、非天然氨基酸或者-(CR15)o-S-S-(CR15)p，其中o和p各自独立地为1-20的整数，
LB3为-PABA-、-PABC-、-C(O)(CH2)nC(O)-或者不存在；
LC不存在或者独立地选自-C1-C6亚烷基-、-NRC3-C8-杂环基NR-、-NRC3-C8-碳环基NR-、 -NRC1-C6烷基NR-、-NRC1-C6亚烷基-、-S-、-NR-、-NRNR-、-O(CR2)1-4S-S(CR2)1-4N(R)-、-NRC1-C6- 亚烷基亚苯基NR-、-NRC1-C6亚烷基亚苯基SO2NR-、-OC1-C6烷基S-SC1-C6烷基C(COOR)NR-、 -NRC(COOR)C1-C6烷基S-SC1-C6烷基O-、
Figure BDA0001474068160000182
其中
XA为CR或N，
XB为CH、CR(C(R)2)1-3NR、CR(C(R)2)1-3O、CR(C(R)2)1-3C(O)NR、CR-(C(R)2)1-3C(O)NRNR、 CR(C(R)2)1-3SO2NR、CR(C(R)2)1-3NRNR、CR(C(R)2)1-3NRC(O)或N，
XC各自为R，
XD各自为-(CH2)1-5-，或者不存在；
XE为O、S、C(R)2、C(R)(C(R)2)1-3-NR2或NR，并且
XF各自为(C(R)2)1-3-NR或C(R)2-(C(R)2)1-3-O。
根据本发明的另一方面提供式IIIB的抗体药物缀合物化合物：
Figure BDA0001474068160000183
或者其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
AB为抗体；
F1和F2各自独立地选自环系A、B、C、D、E、F、G和H：
Figure BDA0001474068160000191
其中：
环系A、B、C和D中的至少一个存在；
对于其中出现R的各个环系，R各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C2-C6烯基、-C2-C6炔基、卤素、氘、羟基、烷氧基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-NO2、-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基，其中两个或更多个R任选地结合以形成一个或多个环，并且其中所述-C6-C14芳基和-C6-C14杂芳基任选地被1至5个独立地选自下列的取代基取代：-C1-C10烷基、-C1-C10烷氧基、-卤素、-C1-C10烷硫基、-三氟甲基、-NH2、-NH(C1-C8烷基)、-N(C1-C8烷基)2、-C1-C10烷基-N(C1-C8烷基)2、-C1-C3烷硫基、-NO2或-C1-C10杂环基；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为键、O、N(R)或S；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O、N(R)或S；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-苯基、-C(O)OR、-C(O)SR、-C(O)NHN(R)2或-C(O)N(R)2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地选自-OH、-O-酰基、叠氮基、卤素、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯或
Figure BDA0001474068160000201
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自H、-C1-C6烷基-RA-C(O)RA、-C(S)RA、-C(O)ORA、 -S(O)2ORA、-C(O)N(RA)2、-C(S)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基 N(R)2任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
对于其中出现Z的各个环系，Z各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素，并且其中所述C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2、-C(O)OH、-C(O)NHNH2和-C(O)-卤素各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键、羰基或在酰基部分键连至F1或F2的羰基酰基，其中所述羰基酰基选自：
Figure BDA0001474068160000202
Figure BDA0001474068160000203
其中
U1选自H、-CH3、-OH、-OCH3、-NO2、-NH2、-NHNHAc、-NHNHC(O)CH3、-NHC(O)苯基或-卤素，
U2为H、-OH或-OCH3，
U3为H、-CH3或-C2H5，
U4为H或CH3S-，
U5和U6各自独立地选自H、-卤素、-C1-C4烷基、-C1-C3烷氧基、-C1-C6二烷基氨基、-NO2、-NHC(O)C1-C10烷基、-OH、-NH2、-NHC(O)NH2、-NHC(O)CH3或-NHC(O)苯基，
Q1为-O-、-S-或-NH-，并且
Q2和Q3各自独立地为-CH-或-N-；
T选自：
-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000211
其中X1各自独立地为键、-NRE-、-O-或-S-，其中A1和B1各自独立地为＝O或＝S，其中R1、R2、 R3和R4各自独立地为RE，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，或者R1、R2、R3和R4各自键连至D上的不同碳，其中g和j各自独立地为0至50的整数，并且m为1-50的整数，并且其中D选自-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C8亚杂烷基-、-亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基和--C3-C8亚碳环基被选自以下基团中的一员取代：N(RE)C(O)-(其中所述羰基键连至L)和-C(O)-(其中所述羰基键连至L)，并且另外任选地被1个至2个R取代；
其中RE各自独立地选自H、-C1-C8烷基、-C1-C8杂烷基、芳基、-芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C(O)OC1-C8烷基、-C(O)N(C1-C8烷基)2和-C(O)-卤素，并且其中RE各自任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L为LA-LB-(LC)1-3；
LA选自：与AB连接的键、-NR-(与AB连接的键)、-杂芳基-(与AB连接的键)、
Figure BDA0001474068160000212
LB为LB1-LB2-LB3，其中LB1不存在或者为选自下列的一个或多个组分：-C(O)-、-C(S)-、-C(O)NR-、 -C(O)C1-C6烷基-、-C(O)NRC1-C6烷基-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)C1-C6烷基NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-C6烷基-S-S-C1-C6烷基 NRC(O)CH2-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)CH2-、-C(O)C1-C6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR- 苯基-O-C1-C6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-C6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)-、 -C(O)C1-C6烷基-苯基(NR-C(O)C1-C6烷基)1-4-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-C6烷基-、 -C1-C6烷基-、-S-、-C(O)-CH(NR-C(O)C1-C6烷基)-C1-C6烷基-和(-CH2-CH2-O-)1-20；
LB2为AA0-12，其中AA为天然氨基酸、非天然氨基酸或者-(CR15)o-S-S-(CR15)p，其中o和p各自独立地为1-20的整数，
LB3为-PABA-、-PABC-、-C(O)(CH2)nC(O)-或者不存在；
LC不存在或者独立地选自-C1-C6亚烷基-、-NRC3-C8-杂环基NR-、-NRC3-C8-碳环基NR-、 -NRC1-C6烷基NR-、-NRC1-C6亚烷基-、-S-、-NR-、-NRNR-、-O(CR2)1-4S-S(CR2)1-4N(R)-、-NRC1-C6- 亚烷基亚苯基NR-、-NRC1-C6亚烷基亚苯基SO2NR-、-OC1-C6烷基S-SC1-C6烷基C(COOR)NR-、 -NRC(COOR)C1-C6烷基S-SC1-C6烷基O-、
Figure BDA0001474068160000213
其中
XA为CR或N，
XB为CH、CR(C(R)2)1-3NR、CR(C(R)2)1-3O、CR(C(R)2)1-3C(O)NR、CR-(C(R)2)1-3C(O)NRNR、CR(C(R)2)1-3SO2NR、CR(C(R)2)1-3NRNR、CR(C(R)2)1-3NRC(O)或N，
XC各自为R，
XD各自为-(CH2)1-5-，或者不存在；
XE为O、S、C(R)2、C(R)(C(R)2)1-3-NR2或NR，并且
XF各自为(C(R)2)1-3-NR或C(R)2-(C(R)2)1-3-O。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中
R各自独立地选自H、氘、-C1-C20烷基和-NH2；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为O或者N(R)；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O或者N(R)；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-C(O)OR或-C(O)NR2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地为卤素；
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自H、-C(O)RA、-C(O)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO2、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键和羰基；并且
T选自：
-NRB-T1-NRC-，其中RB和RC各自独立地为H或-C1-C8烷基，
-C(O)hetC(O)-，其中het为5至12元的单环杂芳基，其包含一个或两个独立地选自O、N和S的杂原子，其中het任选地被1个至8个各自独立地选自下列的取代基取代：-C1-C8烷基、-NH2和-NH2，并且het上所述任选的取代基任选地被-C1-C8烷基取代，以及
-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000221
其中X1各自为键，其中A1和B1各自独立地为＝O，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为H，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，并且其中D为键或者选自–S-、-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C10亚杂环基和--C3-C8亚碳环基任选地被-NH2、-N(R)C(O)H 或-N(R)C(O)OH取代。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中两个或更多个R任选地结合以形成一个或多个环。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中
R各自独立地选自H、氘、-C1-C20烷基和-NH2；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为O或者N(R)；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O或者N(R)；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-C(O)OR或-C(O)NR2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地为卤素；
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自键、H、-C(O)RA、-C(S)RA、-C(O)ORA、-S(O)2ORA、 -C(O)N(RA)2、-C(S)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO2、-P(O)(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中RA各自独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C6-C14芳基、芳烷基、-C1-C10杂环基、-C3-C8碳环基、-C1-C20烷基N(R)2、-C1-C20亚烷基、-C1-C8亚杂烷基、-C6-C14亚芳基、亚芳烷基、-C1-C10亚杂环基、-C3-C8亚碳环基和-C1-C20烷基N(R)-以及RF，其中所述RA任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代，并且其中一个Y是二价的并且键连至L，
RF为-N(R6)QN(R5)C(O)-，并且在与N(R5)相邻的羰基处键连至L，其中R5和R6各自独立地选自 H、-C1-C8烷基和-C1-C8杂烷基，或者R5或R6与Q上未取代的碳结合形成-C1-C10杂环基或-C6-C14杂芳基环，或者R5和R6结合在一起形成-C1-C10杂环基或-C6-C14杂芳基环系，并且其中Q为-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-或-C3-C8亚碳环基-，其中Q、R5和R6各自独立地任选地被1个至3个独立地选自R 的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键和羰基；并且
T选自：
-NRB-T1-NRC-，其中RB和RC各自独立地为H或-C1-C8烷基，
-C(O)hetC(O)-，其中het为5至12元的单环杂芳基，其包含一个或两个独立地选自O、N和S的杂原子，其中het任选地被1个至8个各自独立地选自下列的取代基取代：-C1-C8烷基、-NH2和-NH2，并且het上所述任选的取代基任选地被-C1-C8烷基取代，以及
-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000231
其中X1各自为键，其中A1和B1各自独立地为＝O，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为H，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，并且其中D为键或者选自–S-、-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C10亚杂环基和--C3-C8亚碳环基任选地被-NH2、-N(R)C(O)H 或-N(R)C(O)OH取代。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中
R各自独立地选自H、氘、-C1-C20烷基和-NH2；
对于其中出现V1的各个环系，V1各自独立地为O或者N(R)；
对于其中出现V2的各个环系，V2各自独立地为O或者N(R)；
对于其中出现W1和W2的各个环系，W1和W2各自独立地为H、-C1-C5烷基、-C(O)OR或-C(O)NR2；
对于其中出现X的各个环系，X各自独立地为卤素；
对于其中出现Y的各个环系，Y各自独立地选自H、-C(O)RA、-C(O)N(RA)2、碳水化合物(诸如糖基)、-NO2、-PO(ORA)2、氨基酸和肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)，其中各个RA独立地选自H、-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C8杂烷基、-C3-C8碳环基和-C1-C20烷基N(R)2任选地被1个至3个独立地选自R的取代基取代；
L1和L2各自独立地选自直接键和羰基；并且
T为-C(A1)X1-T2-X1C(B1)-，其中T2为：
Figure BDA0001474068160000232
其中X1各自为键，其中A1和B1各自独立地为＝O，其中R1、R2、R3和R4各自独立地为H，或者R1和R2形成环系，或者R3和R4形成环系，或者R1和R2以及R3和R4均各自独立地形成环系，或者R1和R3形成环系，或者R2和R4形成环系，或者R1和R3以及R2和R4均各自独立地形成环系，其中所述环系独立地选自-C1-C10杂环基或-C3-C8碳环基，并且其中D为键或者选自–S-、-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C10亚杂环基和-C3-C8亚碳环基，其中所述-C1-C8亚烷基-、-C6-C14亚芳基-、-C6-C14亚杂芳基-、-C1-C10亚杂环基和--C3-C8亚碳环基任选地被-NH2、-N(R)C(O)H 或-N(R)C(O)OH取代。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中
LA选自-卤素、-N(R)2、-CON(R)2、任选地被-NO2或-CONR2取代的-S-芳基、任选地被-NO2取代的-S-杂芳基、烷基-SO2-杂芳基、芳基SO2-杂芳基-和
Figure BDA0001474068160000241
LB为LB1-LB2-LB3，其中LB1不存在或者为选自下列的一个或多个组分：-C(O)-、 -C(S)-、-C(O)NR-、-C(O)C1-C6烷基-、-C(O)NRC1-C6烷基-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)C1-C6烷基NRC(O)-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-C6烷基-S-S-C1-C6烷基NRC(O)CH2-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)CH2-、-C(O)C1-C6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-C(O)-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)-、-C(O)C1-C6烷基-苯基(NR-C(O)C1-C6烷基)1-4-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-C6烷基-、-C1-C6烷基-、-S-、-C(O)-CH(NR-C(O)C1-C6烷基)-C1-C6烷基-和(-CH2-CH2-O-)1-20，其中LB2为AA0-12，其中AA为天然氨基酸、非天然氨基酸或者-(CR15)o-S-S-(CR15)p，其中o和p各自独立地为1-20的整数，并且LB3为-PABA-、 -PABC-、-C(O)(CH2)nC(O)-或者不存在；并且
LC不存在。
本发明的其它方面包括抗体药物缀合物(诸如本文中提到的那些)，其中LA选自：与AB连接的键、-NR-(与AB连接的键)、-杂芳基-(与AB连接的键)、
Figure BDA0001474068160000242
Figure BDA0001474068160000243
LB为LB1-LB2-LB3，其中LB1不存在或者为选自下列的一个或多个组分：-C(O)-、 -C(S)-、-C(O)NR-、-C(O)C1-C6烷基-、-C(O)NRC1-C6烷基-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)C1-C6烷基NRC(O)-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-C6烷基-S-S-C1-C6烷基NRC(O)CH2-、-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)CH2-、-C(O)C1-C6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-C(O)-C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6NRC(O)-、-C(O)C1-C6烷基-苯基(NR-C(O)C1-C6烷基)1-4-、-C(O)C1-C6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-C6烷基-、-C1-C6烷基-、-S-、-C(O)-CH(NR-C(O)C1-C6烷基)-C1-C6烷基-和(-CH2-CH2-O-)1-20，其中LB2为AA0-12，其中AA为天然氨基酸、非天然氨基酸或者-(CR15)o-S-S-(CR15)p，其中o和p各自独立地为1-20的整数，并且LB3为-PABA-、 -PABC-、-C(O)(CH2)nC(O)-或者不存在。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中RF选自：
Figure BDA0001474068160000244
其中q为1-10，并且b各自独立地为CRD、N、NRD、O或S。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中一个或多个W为C1-C3烷基。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中X为氯。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中一个Y为H或–C(O)C1-C10烷基。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中一个或多个Z为H。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中T选自酰胺，或者式-NH-C(O)-NH- 或-NH-C(O)-het-C(O)-NH-的氨基-系链(tether)-氨基。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，所述酰胺为-C(O)NH-或–NHC(O)-。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中het为杂芳基，其选自吡咯-2-,5-二基-、呋喃-2,5-二基-、吲哚-2,5-二基、苯并呋喃-2,5-二基和3,6-二氢苯并[1,2-b:4,3-b]二吡咯-2,7-二基。
本发明的其它方面包括化合物(诸如本文中提到的那些)，其中L1和L2选自羰基、2-羰基吲哚-5- 基、2-羰基-6-羟基-7-甲氧基吲哚-5-基、2-羰基-1,2,3,6-四氢苯并[1,2-b:4,3-b]二吡咯-7-基、2-羰基-4- 羟基-5-甲氧基-1,2,3,6-四氢苯并[1,2-b:4,3-b’]二吡咯-7-基和2-羰基-4-羟基-5-甲氧基-1,2,3,6-四氢苯并 [1,2-b:4,3-b’]二吡咯-7-基。
本发明的另外方面是本文中记载的那些化合物，其中下列中的一条多条适用：W为甲基；X为卤素；Y为氢或-COR，其中R为C1-C10烷基；并且Z为氢。
本发明还包括本文中所述化合物，其中T选自酰胺(即-C(O)NH-或-NHC(O)-)；或者式-NH-T’–NH 的氨基-系链-氨基，其中T’为羰基或-C-(O)-het-C(O)-。其中T为式NH-T’–NH的氨基-系链-氨基，T’可为羰基(即-C-(O)-)或-C(O)-het-C(O)-，其中het为选自下列的杂芳基：吡咯-2-,5-二基-；呋喃-2,5-二基-；吲哚-2,5-二基；苯并呋喃-2,5-二基；或3,6-二氢苯并[1,2-b:4,3-b]二吡咯-2,7-二基。
本发明的实施方案中还包括本文中所述的那些化合物，其中L1和L2选自2-羰基吲哚-5-基；2-羰基-6-羟基-7-甲氧基吲哚-5-基；2-羰基-1,2,3,6-四氢苯并[1,2-b:4,3-b]二吡咯-7-基；2-羰基-4-羟基-5-甲氧基-1,2,3,6-四氢苯并[1,2-b:4,3-b’]二吡咯-7-基；和2-羰基-4-羟基-5-甲氧基-1,2,3,6-四氢苯并 [1,2-b:4,3-b’]二吡咯-7-基。
本发明的另一方面包括本文中所述化合物，其中LA为
Figure BDA0001474068160000251
本发明还包括连接基-有效负载或者包含本文中所述的有效负载化合物的基团的抗体-药物-缀合物。
重要地是，本发明包括本文中所述的化合物及其任意药学上可接受的盐或溶剂合物的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者给药治疗有效量的一种或多种本文中所述的化合物，或者包含一种或多种这些化合物的药物组合物或组合物。
一些化合物(包括本文中所示有效负载、连接基-有效负载和ADC)以特定的立体异构体形式显示。然而本发明意图包括这些化合物的所有立体异构形式。例如，具有两个立体异构中心的化合物可被描绘为化合物的R,S形式，但是本发明涵盖所有立体异构形式，例如R,R；R,S；S,R和S,S。
发明详述
本发明涉及细胞毒性双功能化合物、包含所述细胞毒性双功能化合物的抗体药物缀合物(ADC)、以及使用其来治疗癌症及其他病理学病况的方法。本发明还涉及体外、原位和体内使用此类化合物和/或缀合物来检测、诊断或治疗哺乳动物细胞或相关的病理学病况的方法。
定义及缩写
除非另外规定，则本文所用的下列术语和措辞旨在具有以下含义。除非上下文另外指出，当在本文中使用商品名时，商品名包括产品配方、非专利药以及商品名产品的活性药物成分。
本文中术语"抗体"(或"Ab")以最广义的含义使用且特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单一特异性抗体、多重特异性抗体(例如双特异性抗体)以及表现出期望的生物学活性的抗体片段。完整的抗体主要具有两个区域：可变区和恒定区。可变区结合至目标抗原并与之相互作用。可变区包括互补决定区(CDR)，其识别特定抗原上的特异性结合位点并与之结合。恒定区可被免疫系统识别并与之相互作用(参见例如Janeway等人，2001,Immuno.Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。抗体可为任何类型或类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可源自任何适当的物种。在一些实施方案中，抗体为人类或鼠类来源。抗体可(例如)为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
术语"特异性地结合"和"特异性结合"是指与预定抗原结合的抗体。通常，抗体以至少约1×107M-1的亲和力结合，并且以比其结合至除预定抗原或密切相关的抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高至少2倍的亲和力与预定抗原结合。
本文所用的术语"单克隆抗体"是指从基本同质性抗体的族群获得的抗体，即，包含该族群的各抗体除了可能的天然存在的突变(其可少量存在)之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原基。修饰词"单克隆"表示从抗体的基本同质性族群获得的抗体的特性，而不应解释成需要通过任何特定方法来产生该抗体。
术语"单克隆抗体"特别包括"嵌合"抗体(其中一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类别的抗体的相应序列相同或同源，而其余的链则与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类别的抗体的相应序列相同或同源)以及此类抗体的片段，只要其表现出期望的生物学活性即可。
"完整抗体"为包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2、CH3和 CH4的抗体，视抗体类别而定。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人类天然序列恒定结构域) 或其氨基酸序列变体。
完整抗体可具有一个或多个"效应子功能"，其意指可归因于抗体的Fc区(例如天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。
"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、 Fab'、F(ab')2、及Fv片段、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、线性抗体、单链抗体分子、scFv、 scFv-Fc、由一个或多个抗体片段形成的多重特异性抗体片段、由Fab表达库产生的一个或多个片段、或上述中任一种的表位结合片段，其免疫特异性地与目标抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)结合。
在抗体上下文中的术语"可变"是指抗体的可变结构域的某些部分，其在序列方面普遍不同且用于每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。这种可变性集中在轻链和重链可变结构域中称为" 高变区"的三个片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括通过三个高变区连接的四个FR。
当用于本文时，术语"高变区"是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自"补体决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(L3)；Kabat等人，(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)) 和/或来自"高变环(hypervariable loop)"的那些残基(例如轻链可变结构域中的26-32(L1)、50-52(L2) 和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(142)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987, J.Mol.Biol.196:901-917)。FR残基为除了本文所定义的高变区之外的那些可变结构域残基。
"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的V.sub.H和V.sub.L结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包括在V.sub.H与V.sub.L结构域之间的多肽连接基，其可使scFv形成用于抗原结合的期望结构。对于scFv，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语"双特异抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与相同的多肽链中可变轻结构域(VL)连接的可变重结构域(VH)。通过使用过短以致于不能在同一链上的两个结构域之间进行配对的连接基，结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双特异抗体更完整地描述于例如EP 0 404 097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。
非人(例如啮齿目动物)抗体的"人源化"形式为嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的高变区的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长目动物的高变区的残基替代。一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包括受者抗体或供者抗体中未发现的残基。这些修饰用于进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体会包含基本所有的至少一种且通常两种的可变结构域，其中所有的或基本所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本所有的FR为人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体还任选地包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。对于进一步详情，参见Jones等人，1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-329；和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
如本文所用，"分离"意指从(a)天然来源如植物或动物细胞或细胞培养物，或(b)合成有机化学反应混合物的其他组份中分离。如本文所用，"纯化"意指当分离时，该分离物含有占所述分离物重量的至少95％(另一方面至少98％)的化合物(例如缀合物)。
"分离"的抗体为已从其天然环境的组份中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组份为会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，所述抗体会被(1)纯化至大于95重量％，最优选大于99重量％的抗体(如通过Lowry 法测定的)，(2)纯化至足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列残基的程度(通过使用旋转杯序列分析仪)，或(3)纯化成同质(通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选使用银染色的SDS-PAGE)。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组份将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
"诱导细胞凋亡"的抗体为诱导程序性细胞死亡的抗体，如通过膜联蛋白V结合、DNA片段化 (fragmentation)、细胞皱缩、内质网扩张、细胞片段化和/或膜囊泡(称为凋亡小体)形成而测定的。所述细胞为肿瘤细胞，例如乳房细胞、卵巢细胞、胃细胞、子宫内膜细胞、唾液腺细胞、肺细胞、肾细胞、结肠细胞、甲状腺细胞、胰脏细胞或膀胱细胞。多种方法可用于评估与细胞凋亡有关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可通过膜联蛋白结合而测量；DNA片段化可经由DNA梯度化 (DNA laddering)而评估；并且核/染色质凝聚连同DNA片段化可通过亚二倍体细胞的任何增加而评估。
术语"治疗有效量"是指药物有效地治疗哺乳动物的疾病或病症的量。对于癌症，药物的治疗有效量可降低癌细胞数；降低肿瘤大小；抑制(即某种程度上减缓且优选中止)癌细胞浸润至周边器官中；抑制(即某种程度上减缓且优选中止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；和/或某种程度上减轻与癌症有关的一种或多种症状。在药物可抑制癌细胞生长和/或杀灭现存的癌细胞的程度上，其可能为细胞抑制性或细胞毒性的。对于癌症疗法，可例如通过评价疾病进展时间(TTP)和/或测定应答率(RR) 来测量功效。
术语"大量"是指大多数，即大于50％的族群、混合物或样品。
术语"细胞内代谢物"是指由细胞内部对抗体-药物缀合物(ADC)的代谢过程或反应所产生的化合物。代谢过程或反应可为酶促过程如ADC的肽连接基的蛋白水解性裂解。细胞内代谢物包括但不限于在进入、扩散、摄取或运送到细胞中之后经历细胞内裂解的抗体和游离药物。
术语"细胞内裂解的"和"细胞内裂解"是指在细胞内部对ADC等的代谢过程或反应，从而药物部分与抗体之间的共价连接(例如连接基)被破坏，导致游离药物或缀合物的其他代谢物从细胞内部的抗体中解离。ADC的裂解部份因此为细胞内代谢物。
术语"生物利用度"是指向患者给药的规定量的药物的全身利用度(即血液/血浆水平)。生物利用度为绝对术语，其表示药物从所给药的剂型到达一般循环的时间(速率)和总量(程度)的测量值。
术语"细胞毒性活性"是指ADC或所述ADC的细胞内代谢物的细胞杀灭、细胞抑制或抗增殖作用。细胞毒性活性可以IC50值表示，其为一半细胞活存时每单位体积的浓度(摩尔或质量)。
"病症"为会因为使用药物或抗体-药物缀合物的治疗而获益的任何病况。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所涉及的病症的那些病理学病况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括良性和恶性癌症；白血病和淋巴恶性肿瘤；神经元病症、神经胶质病症、星形胶质细胞病症、下丘脑病症及其他腺的病症、巨噬细胞病症、上皮病症、基质病症和囊肧腔病症；以及炎性病症、血管生成病症和免疫学病症。
术语"癌症"和"癌"是指或描述哺乳动物的生理学病况或病症，其典型特征为失调细胞生长。"肿瘤"包括一种或多种癌细胞。
"患者"的实例包括(但不限制于)人类、大鼠、小鼠、豚鼠、猴、猪、山羊、母牛、马、狗、猫、鸟和家禽。在示例性实施方案中，患者为人类。
除非上下文另外指出，否则术语"治疗"是指治疗性治疗和预防复发的预防性措施，其中目标是抑制或减缓(减轻)不期望的生理学变化或病症，诸如癌症的产生或扩散。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病的稳定化(即未恶化)状态、疾病进展的延缓或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测出或不可检测出的。“治疗”还可以表示与未接受治疗的情况下的预期存活相比延长存活。需要治疗的个体包括已患有病况或病症的个体以及易于患有病况或病症的个体。
在癌症的情形下，术语"治疗"包括以下中的任一种或全部：抑制肿瘤细胞、癌细胞的生长或肿瘤的生长；抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制、减轻整体肿瘤负担或降低癌细胞数目、以及改善与该疾病有关的一种或多种症状。
在自身免疫疾病的情形下，术语"治疗"包括以下中的任一种或全部：抑制与自身免疫疾病状态有关的细胞(包括但不限于产生自身免疫抗体的细胞)的复制、减轻自身免疫抗体负担及改善自身免疫疾病的一种或多种症状。
在感染疾病的情形下，术语"治疗"包括以下中的任一种或全部：抑制导致感染疾病的病原体的生长、增殖或复制，以及改善感染疾病的一种或多种症状。
术语"药品说明书"用于指治疗产品的商业包装内通常包括的使用说明，其包括与适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告相关的信息。
如本文所用，术语"细胞"、"细胞系"以及"细胞培养物"可互换地使用并且所有此类指代均包括后代。词语"转化体"和"转化细胞"包括初代个体细胞和培养物或由其衍生的后代而无关于转移次数。还应理解，所有后代由于有意或无意的突变而可能在DNA成分方面未必精确相同。包括具有与在原始转化的细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的突变后代。当意欲不同的指代时，其根据上下文会变得明确。
如本文中所使用，CBI是指1,2,9,9a-四氢-4H-苯并[e]环丙烷并[c]吲哚-4-酮，或其取代的或衍生化的形式。CBI还可指CBI的开环形式或者开环-CBI，已知其为1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5- 醇或其取代的或衍生化的形式。
如本文中所使用，CPI是指1,2,8,8a-四氢环丙烷并[c]吡咯并[3,2-e]吲哚-4(5H)-酮，或其取代的或衍生化的形式。CPI还可指CPI的开环形式或者开环-CPI，已知其为8-(氯甲基)-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-醇或其取代的或衍生化的形式。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"烷基"是指具有指定碳原子数的直链或支化的饱和烃(例如"C1-C8"烷基是指具有1至8个碳原子的烷基)。烷基通常包含1-20个碳原子，优选1-8 个碳原子，并且更优选1-4个碳原子。当碳原子数未指定时，则烷基具有1至8个碳原子。典型的直链C1-C8烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基；而支化的C1-C8烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和C2-C8烃基包括但不限于乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1-丁炔基。本文中提及“烷基”是指如上文所述的未取代的和取代的基团。
除非另有指定，否则本身或作为其他术语一部分的"亚烷基"是指具有规定数量的碳原子(通常1 至18个碳原子)且具有通过从母体烷烃的同一碳原子或两个不同的碳原子中移除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心的饱和支链或直链或环状烃基团。亚烷基通常包含1-18个碳原子，优选1-10 个碳原子，更优选1-8个碳原子，并且最优选1-4个碳原子。典型的亚烷基包括但不限于：亚甲基 (-CH2-)、1,2-亚乙基(-CH2CH2-)、1,3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。"C1-C10" 直链亚烷基为式-(CH2)1-10-的直链饱和烃基。C1-C10亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基以及亚癸基。本文中提及“亚烷基”是指如上文所述的未取代的和取代的基团。
除非另外指出，否则本身或与其他术语组合使用的术语"杂烷基"是指稳定的直链或支链烃或其组合，其是完全饱和的或具有1至3不饱和度，由规定数量的碳原子和1至3个选自O、N、Si和S 的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N 和S可以位于杂烷基的任何内部位置。杂原子Si可位于杂烷基的任何位置，包括烷基连接至分子其余部分的位置。至多两个杂原子可以是连贯的。杂烷基通常包含1-15个碳原子，优选1-12个碳原子，更优选1-8个碳原子，并且最优选1-4个碳原子。本文中提及“杂烷基”是指如上文所述的未取代的和取代的基团。
除非另外指出，否则本身或作为其他取代基一部分的术语"亚杂烷基"是指由杂烷基(如上所讨论) 衍生的二价基团。对于亚杂烷基，杂原子还可以占据链端的一端或两端。本文中提及“亚杂烷基”是指如上文所述的未取代的和取代的基团。
本文中术语H或氢通常是指包含单个质子且不含中子的氢原子，但是还包括氢同位素(已知为包含单个质子和单个中子的氘)。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的“芳基”是指具有5至20个碳原子、优选5至 14个或6至14个碳原子的，通过从母体芳族环系的单个碳原子中移除一个氢原子而衍生的取代或未取代的单价碳环芳族烃基团。典型的芳基包括但不限于由苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等衍生的基团。取代的碳环芳族基团(例如芳基)可被1个或多个、优选1至5个下列基团取代：C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-C(O)R9、-OC(O)R9、-C(O)OR9、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、C(O)N(R’)2、NHC(O)R’、 -S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、卤素、-N3、-NH2、-NH(R9)、-N(R9)2和-CN；其中各个R9独立地选自-H、 C1-C8烷基和未取代的芳基。在一些实施方案中，取代的碳环芳族基团可进一步包含下列中的一个或多个：-NHC(＝NH)NH2、-NHCONH2、-S(＝O)2R9和-SR9。“亚芳基”为相应的二价基团。
“取代的烷基”(或者“取代的亚烷基”、“取代的杂烷基”或“取代的亚杂烷基”)意指包含上文所讨论的基团的相关烷基烷基-，其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基代替。代表性取代基包括但不限于-X、-R10、-O-、-OR10、-SR10、-S-、-NR10 2、-NR10 3、＝NR10、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、 -NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR10C(＝O)R10R10、-C(＝O)NR10 2、-SO3-、-SO3H、-S(＝O)2R10、-OS(＝O)2OR10、 -S(＝O)2NR10、-S(＝O)R10、-OP(＝O)(OR10)2、-P(＝O)(OR10)2、-PO3 2-、PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R10、 -C(＝O)X、-C(＝S)R10、-CO2R10、-CO2-、-C(＝S)OR10、-C(＝O)SR10、-C(＝S)SR10、-C(＝O)NR10 2、-C(＝S)NR10 2或-C(＝NR10)NR10 2，其中各个X独立地为卤素：-F、-Cl、-Br或-I，并且各个R10独立地为-H、C1-C20烷基、C1-C20杂烷基、C6-C20芳基、C1-C10杂环基、保护基或前药基团。如上文所述芳基、亚烷基和亚杂烷基也可被类似地取代。
除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“芳烷基”表示被如前所定义的芳基取代的如前所定义的烷基。
除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“C3-C10杂环基”指一价取代或未取代芳族或非芳族的单环、双环或三环系统，其具有2-10个、2-14个或2-20个(优选3至8个)碳原子(也被称为环成员)与1至4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员，并通过从母体环系统的环原子除去一个氢原子而得到。杂环基中的一或多个N、C或S原子可被氧化。包含杂原子的环可以是芳环或非芳环。芳族杂环在本文中有时也称作杂芳基。除非另外指明，杂环基在产生稳定结构的任一杂原子或碳原子上与其侧基连接。C2-C10杂环基的代表性实例包括但不限于：四氢呋喃基、环氧丙烷基、吡喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、包括例如1,2,3,4-四氢喹啉基在内的喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基、四唑基、环氧基、环氧丙烷和BODIPY(取代或未取代的)。C2-C10杂环基可被多达七个基团取代，所述基团包括但不限于：C1-C8烷基、C1-C8杂烷基、-OR11、芳基、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)OR11、-C(O)NH2、 -C(O)NHR11、-C(O)N(R11)2、-NHC(O)R11、-S(＝O)2R11、-S(O)R11、卤素、-N3、-NH2、-NH(R11)、-N(R11)2和-CN；其中R11各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基。在一些实施方案中，取代的杂环基还可包含下列中的一个或多个：-NHC(＝NH)NH2、-NHCONH2、-S(＝O)2R11和-SR11。亚杂环基 (heterocyclo)或C2-C10亚杂环基(heterocyclo)为相应的二价基团。二价芳族杂环有时在本文中称作亚杂芳基或C2-C10亚杂芳基。
如上文说明，芳族杂环在本文中有时称作杂芳基，并且除了杂原子还优选包含5-14、6-14或6-20 个碳原子。杂芳基可为单环、双环或三环环系。代表性杂芳基包括但不限于三唑基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、嘧啶基、氮杂
Figure BDA0001474068160000291
基、氧杂
Figure BDA0001474068160000292
基和喹噁啉基。杂芳基任选地被取代。代表性取代基包括但不限于-X、-Rh、-O-、-ORh、-SRh、-S-、-NRh 2、-NRh 3、＝NRh、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRhC(＝O)Rh、-C(＝O)NRh 2、 -SO3-、-SO3H、-S(＝O)2Rh、-OS(＝O)2ORh、-S(＝O)2NRh、-S(＝O)Rh、-OP(＝O)(ORh)2、-P(＝O)(ORh)2、-PO3 2-、 PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)Rh、-C(＝O)X、-C(＝S)Rh、-CO2Rh、-CO2-、-C(＝S)ORh、-C(＝O)SRh、-C(＝ S)SRh、-C(＝O)NRh 2、-C(＝S)NRh 2、-C(＝NR)NRh 2、C1-C20杂烷基、C6-C20芳基、C3-C8杂环基、保护基或前药基团，其中X各自独立地为卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并个Rh各自独立地为–H或C1-C6烷基。二价芳族杂环在本文中有时称作亚杂芳基或C1-C10亚杂芳基。
除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“杂芳烷基”表示被如前所定义的芳族杂环基取代的如前所定义的烷基。杂芳亚烷基(heteroaralklo)是相应的二价基团。
除非另外指定，本身或作为另一术语的一部份的“C3-C8碳环基”是通过从母体环系统的环原子除去一个氢原子而得到的3-、4-、5-、6-、7-、或8-元单价的取代或未取代的饱和或不饱和非芳族单环或双环碳环。代表性C3-C8碳环基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基、环辛二烯基、双环(1.1.1.)戊烷和双环(2.2.2.)辛烷。C3-C8碳环基可以是未取代的或被多达七个基团取代，所述基团包括但不限于：C1-C8烷基、C1-C8杂烷基、-OR11、芳基、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)OR11、-C(O)NH2、-C(O)NHR11、-C(O)N(R11)2、-NHC(O)R11、-S(＝O)2R11、-S(＝O)R11、-OH、-卤素、-N3、 -NH2、-NH(R11)、-N(R11)2和-CN；其中R11各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基。“C3-C8亚碳环基(carbocyclo)”为相应的二价基团。
如本文中所使用，叠氮基取代基是指–N＝N＝N；氰酸酯取代基是指-O-CN；硫氰酸酯取代基是指–S-CN；异氰酸酯取代基是指-N＝C＝O；并且异硫氰酸酯取代基是指–S-N＝C＝O。
术语"手性"是指具有与镜像分子不可重合的性质的分子，而术语"非手性"是指可与其镜像分子重合的分子。
术语"立体异构体"是指具有相同的化学构造，但原子或基团在空间中的排列不同的化合物。
“非对映异构体"是指具有二个或更多个手性中心，且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、波谱性质和反应性。非对映异构体混合物可在高分别率分析操作下(诸如电泳和色谱法)分离。
“糖基”是指以下结构：
Figure BDA0001474068160000301
或其取代的形式，例如包括被取代的上述结构，其形成诸如下列的结构：
Figure BDA0001474068160000302
等。
本文所用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms,McGraw-Hill Book Company,New York(1984)；以及Eliel和Wilen,Stereochemistry of Organic 化合物,John Wiley & Sons,Inc.,NewYork(1994)。许多有机化合物以旋光形式存在，即，它们具有将平面偏振光的平面旋转的能力。在描述旋光化合物时，前缀D和L，或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于指示平面偏振光被化合物旋转的现象，并且(-)或 l意指化合物为左旋的。以(+)或d为前缀的化合物则为右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体为相同的，但它们彼此为镜像的除外。特异性立体异构体也称为对映异构体，并且此类异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可发生在化学反应或过程中没有立体选择或立体特异性的情况下。术语"外消旋混合物"和"外消旋物"是指两种对映异构体物质的等摩尔混合物，其没有旋光性。
如本文中所使用，“-PABA-”或“PABA”是指对氨基苯甲酸以及衍生自其的结构，例如以下结构：
Figure BDA0001474068160000303
或其变体。
如本文中所使用，“-PABC-”或“PABC”是指对氨基苄氧基羰基以及衍生自其的结构，例如以下结构：
Figure BDA0001474068160000304
或其变体。
氨基酸“衍生物”包括通过母体氨基酸的共价连接(例如通过烷基化、糖基化、乙酰化、磷酰化等) 取代或修饰的氨基酸。“衍生物”的定义还包括(例如)具有取代连接基以及本领域已知的其它修饰的氨基酸的一或多种类似物。
“天然氨基酸”指精氨酸、谷氨酸(glutamine)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸(glutamic acid)、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸，除非另外由上下文来指出。
“保护基”指在连结到分子内的反应性基团时掩蔽、减少或阻止反应性的部分。保护基实例可参见下列：T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis,3rd edition,John Wiley & Sons,New York,1999与Harrison和Harrison等人,Compendium of Synthetic Organic Methods,Vols.1-8 (John Wiley and Sons,1971-1996)，其整体援引加入本文。代表性羟基保护基包括酰基、苄基醚与三苯甲基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚与烯丙基醚。代表性氨基保护基包括甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄氧羰基(CBz)、叔丁氧羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、2-三甲基甲硅烷基 -乙磺酰基(SES)、三苯甲基与取代三苯甲基、烯丙氧羰基、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、硝基-藜芦基氧羰基(NVOC)等。
“羟基保护基”的实例包括但不限于：甲氧基甲醚、2-甲氧基乙氧基甲醚、四氢吡喃醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、三异丙基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、三苯基甲基甲硅烷基醚、乙酸酯、取代乙酸酯、新戊酸酯、苯甲酸酯、甲磺酸酯与对甲苯磺酸酯。
“离去基团”指可被另一官能团取代的官能团。此类离去基是本领域公知的且实例包括但不限于：卤素(例如氯、溴、碘)、甲磺酰基(mesyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、三氟甲磺酰基(triflate)与三氟甲磺酸酯。
本文中所用的短语“药学上可接受的盐”指化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。化合物通常含有至少一个氨基，因此可以此氨基形成酸加成盐。示例性的盐包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、丁二酸盐、顺丁烯二酸盐、苹果酸盐、龙胆酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸)盐)。药学上可接受的盐可包含另一分子，例如乙酸根离子、丁二酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任一有机部分或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可能具有多于一个带电原子。在多个带电原子是药学上可接受的盐的一部份的情况下可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一或多个带电原子和/或一或多个抗衡离子。
“药学上可接受的溶剂合物”或“溶剂合物”指一或多个溶剂分子与本发明的化合物或缀合物的结合。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂实例包括但不限于：水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸与乙醇胺。
术语“负载”或“药物负载”或“有效负载”表示或指在ADC分子内每个抗体的平均有效负载数(在本文中“有效负载”可与“药物”互换使用)。药物负载可为1-20/抗体。这有时被称为DAR或药物/抗体比。本文中所述的ADS的组合物通常具有1-20的DAR，在某些实施方案中具有1-8、2-8、2-6、2-5 和2-4的DAR。代表性DAR值是2、4、6和8。平均药物数/抗体或DAR值可通过常规方式例如 UV/可见光光谱法、质谱法、酶标记免疫分析(ELISA)与HPLC进行表征。也可测得定量DAR值。在有些情况下具有特定DAR值的同源ADS的分离、纯化与表征可通过例如反相HPLC或电泳的方式达成。DAR可能受限于抗体上的连结位点数目。例如，在连结位点是半胱氨酸硫醇的情形下，抗体可能只有一或几个半胱氨酸硫醇基或可能只有一或几个具有充分反应性的硫醇基(通过此硫醇基可连结连接单元)。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇是形成链间二硫键的半胱氨酸残基的硫醇基。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇是不形成链间二硫键的半胱氨酸残基的硫醇基。通常，在缀合反应期间比理论最大值少的药物部分与抗体缀合。抗体可能含有(例如)许多不与连接基或连接基中间体反应的赖氨酸残基。只有具有最大反应性的赖氨酸基团可能与反应性连接基试剂反应。
一般抗体即使含有可能通过连接基与药物连结的游离的反应性半胱氨酸基团，但也不会很多。在抗体中大多数的半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在且必须被还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT))还原。可使抗体经受变性条件以展现反应性亲核基(例如赖氨酸或半胱氨酸)。ADC的负载(药物/抗体比) 可以下列几种不同的方式控制：(i)限制相对抗体来说摩尔过量的药物-连接基，(ii)限制缀合反应时间或温度，与(iii)部分限制或限制半胱氨酸硫醇变性的还原条件。在多于一个亲核基与药物-连接基反应的情形下，所得产物是具有一或多的药物部分/抗体分布的ADC混合物。通过(例如)对抗体特异并对药物特异的双重ELISA抗体分析可从混合物计算出平均药物数/抗体。通过质谱法可识别混合物中的单个ADC并通过HPLC(例如疏水相互作用色谱法)分离。
下面是在本申请中不可能另外定义或说明的缩写与定义的列表：DMSO(指二甲亚砜)、HRMS (指高分辨率质谱法)、DAD(指二极管阵列检测)、TFA(指2,2,2-三氟乙酸或三氟乙酸)、TFF(指切线流过滤)、EtOH(指乙醇)、MW(指分子量)、HPLC(指高效液相色谱法)、制备HPLC(指制备级高效液相色谱法)、etc.(指等等)、trityl(指1,1',1”-乙烷-1,1,1-三基三苯基)、THF(指四氢呋喃)、NHS(指 1-羟基-2,5-吡咯烷二酮)、Cbz(指羧基苄基)、eq.(指当量)、n-BuLi(指正丁基锂)、OAc(指乙酸根/酯)、 MeOH(指甲醇)、i-Pr(指异丙基或丙-2-基)、NMM(指4-甲基吗啉)，且“-”(在表中指在当时未得到数据)。
本文中所用的二价基团和取代基是指在任一方向或两个方向上键连或连接的所述基团或取代基。例如，基团-C(O)NR-(在LB1的定义中，以及别处)意在表达-C(O)NR-以及–NRC(O)-，基团 -C(O)C1-C6烷基-意在表达-C(O)C1-C6烷基-以及-C1-C6烷基C(O)-，等等。更一般地，连接在它“左”侧和“右”侧的非对称二价基团的描述意在既表达所呈现的基团(基团的左侧在书面上的左侧连接，基团右侧在书面上的右侧连接)，也表达所呈现基团的反向(基团的左侧在书面上的右侧连接，基团右侧在书面上的左侧连接)。
术语“键”和“不存在”在本文中都用于描述不包含原子的变量。因此，当二价变量“不存在”时，理解为相邻基团彼此键连。例如，如果LB2不存在，理解为LB1可以键连至LB3；或者如果LB1和LB2均不存在，理解为LA可以键连至LB3。类似地，如果二价变量定义为“键”，这理解为意指没有原子存在且相邻基团彼此键连。因此，例如，当变量“D”定义为键时，理解为与D相邻的碳(在限定T2的结构中)彼此键连。缺失的单价变量理解为氢或能进一步共价键连的电子对。
抗体单元(A、Ab或AB)
如上所述，本文中术语"抗体"(或"Ab"、"Ab"或者"AB")以最广义的含义使用且特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多重特异性抗体(例如双特异性抗体)以及表现出期望的生物学活性的抗体片段。此外，虽然本文所述的本发明的某些方面是指抗体药物缀合物，但进一步设想到缀合物中的抗体部分可被特异性地同受体、抗原或与给定靶标细胞族群相关的其他各部分结合或反应性联合或复合的任何事物所替代。例如，本发明的缀合物会含有靶向分子而非含有抗体，所述靶向分子可与受体、抗原或寻求治疗修饰或其他生物学修饰的细胞族群的其他接受性部分结合、复合或反应。此类分子的实例包括较小分子量的蛋白质、多肽或肽、凝集素、糖蛋白、非肽、维生素、营养物运输分子(诸如但不限定于转铁蛋白)、或任何其他细胞结合分子或物质。在某些方面，抗体或其他此类靶向分子用于将药物递送至与抗体或其他靶向分子相互作用的特定靶标细胞族群。
在另一方面，本发明涉及式IIIA或IIIB的抗体药物缀合化合物，其中抗体AB选自：曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体(例如在本文中或在国际专利申请PCT/IB2012/056234中公开的曲妥珠单抗突变体)、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿仑珠单抗、包括用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗体在内的抗-HLA-DR抗体、131I Lym-1、包括用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的鼠抗-HLA-Dr10抗体的抗-HLA-Dr10抗体、抗-cd33抗体、包括用于治疗霍金奇氏病或非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-CD22mAb在内的抗-cd22抗体、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗和吉妥珠单抗。
可存在于抗体单元上的杂原子包括硫(在一个实施方案中，来自抗体的巯基)、氧(在一个实施方案中，来自抗体的羰基、羧基或羟基)以及氮(在一实施方案中，来自抗体的伯氨基或仲氨基)。这些杂原子可存在于处于抗体自然状态的抗体(例如天然存在的抗体)上，或者可经由化学修饰而引入抗体中。
在一实施方案中，抗体单元具有巯基且抗体单元经由巯基的硫原子结合。
在另一实施方案中，所述抗体具有赖氨酸残基，其可与活化酯(此类酯包括但不限定于，N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酯和对硝基苯酯)反应，因此形成由抗体单元的氮原子与羰基组成的酰胺键。
在又一方面，抗体单元具有一个或多个赖氨酸残基，其可经化学修饰以引入一个或多个巯基。可用于修饰赖氨酸的试剂包括但不限定于N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)和2-亚氨基硫烷盐酸盐(特劳特试剂(Traut's Reagent))。
在另一实施方案中，抗体单元可具有一个或多个糖基(carbohydrate group)，其可经化学修饰以具有一个或多个巯基。
在又一实施方案中，抗体单元可具有一个或多个糖基，其可经氧化以提供醛基(例如参见Laguzza 等人，1989,J.Med.Chem.32(3):548-55)。相应的醛可与反应位点如肼和羟胺形成键。用于蛋白质修饰以供药物连接或联合的其他方案描述于Coligan等人，CurrentProtocols in Protein Science,vol.2, John Wiley & Sons(2002)中(援引加入本文)。
当所述缀合物包含非免疫反应性蛋白质、多肽或肽单元以代替抗体时，可用的非免疫反应性蛋白质、多肽或肽单元包括但不限定于转铁蛋白、表皮生长因子("EGF")、铃蟾素、胃泌素、胃泌素释放肽、血子板衍生性生长因子、IL-2、IL-6、转化生长因子("TOP")如TGF-α和TGF-β、牛痘生长因子("VGF")、胰岛素和类胰岛素生长因子I和II、生长激素抑制素、凝集素以及源自低密度脂蛋白的脱辅基蛋白。
可用的多克隆抗体为由受免疫的动物的血清中衍生的异质性抗体分子族群。可用的单克隆抗体为针对特定抗原决定位(例如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、糖、化学物、核酸或其片段)的同质性抗体族群。针对所关注的抗原的单克隆抗体(mAb)可通过使用本领域已知的提供通过培养物中的连续细胞系来产生抗体分子的任何技术而制备。
可用的单克隆抗体包括但不限定于人类单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合单克隆抗体。人类单克隆抗体可通过本领域已知的许多技术中的任一种而制得(例如，Teng等人，1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308-7312；Kozbor等人，1983,Immunology Today 4:72-79；以及Olsson 等人，1982,Meth.Enzymol.92:3-16)。
抗体还可以为双特异性抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的并且在下文讨论。
抗体可为免疫特异性地结合至靶标细胞(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的抗体或其他结合至肿瘤细胞或基质的抗体的功能活性片段、衍生物或类似物。对此，"功能活性"意指该片段、衍生物或类似物能够引起抗-抗-个体基因型抗体，其识别与衍生该片段、衍生物或类似物的抗体所识别的抗原相同的抗原。具体地，在示例性实施方案中，免疫球蛋白分子的个体基因型的抗原性可通过删除框架以及CDR序列(其为特异性地识别抗原的CDR序列的C端)而增强。为了测定那个CDR 序列结合抗原，可将含CDR序列的合成肽与抗原通过本领域已知的任何结合测定法(例如BIA核测定)一起用于结合测定中(对于CDR序列的位置，参见，例如Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.；Kabat E等人,1980,J.Immunology 125(3):961-969)。
其他可用的抗体包括抗体的片段，诸如但不限定于F(ab')2片段、Fab片段、Fvs、单链抗体、双特异抗体、三特异抗体、四特异体、scFv、scFv-FV或具有与抗体相同的特异性的任何其他分子。
另外，重组抗体(诸如嵌合和人源化单克隆抗体(包含人和非人部分，其可通过使用标准重组DNA 技术制得))是有用的抗体。嵌合抗体为其中不同部分由不同的动物物种衍生(例如具有由鼠单克隆和人免疫球蛋白恒定区衍生的可变区)的分子。(参见，例如，第4,816,567号美国专利；以及第4,816,397 号美国专利，其整体援引加入本文。)人源化抗体为来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)以及具有来自人免疫球蛋白分子的框架区。(参见，例如，第5,585,089 号美国专利，其整体援引加入本文。)此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA 技术而制备，例如使用第WO 87/02671号国际公开；第0 184 187号欧州专利公开；第0 171 496号欧州专利公开；第0 173 494号欧州专利公开；第WO 86/01533号国际公开；第4,816,567号美国专利；第012023号欧州专利公开；Berter等人,1988,Science 240:1041-1043；Liu等人,1987,Proc.Natl. Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu等人,1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人,1987,Cancer.Res.47:999-1005；Wood等人,1985,Nature 314:446-449；以及Shaw等人,1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science 229:1202-1207；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214；第5,225,539号美国专利；Jones等人,1986,Nature 321:552-525；Verhoeyan等人,1988,Science 239:1534；以及Beidler等人,1988,J.Immunol. 141:4053-4060中所述的方法；其各自整体援引加入本文。
完全的人类抗体是特别期望的，并且可使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因但可表达人类重链和轻链基因的转基因小鼠产生。转基因小鼠以正常方式使用经选定的抗原如本发明的所有或一部分多肽进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可使用常用的杂交瘤技术而获得。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重新排列，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此类技术，可能制备治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于制备人类抗体的这种技术，参见Lonberg和Huszar,1995,Int.Rev.Immunol.13：65-93。对于制备人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术以及制备此类抗体的方案的详细讨论，参见例如第5,625,126、5,633,425、5,569,825、 5,661,016、5,545,806号美国专利，其各自整体援引加入本文。其他人类抗体可购自例如Abgenix,Inc.(现在的Amgen,Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)。
识别所选定的抗原决定位的完全人类抗体可使用称为"导向选择"的技术而生成。在该方法中，所选定的非人类单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于引导认识相同表位的完全人类抗体的选择。(参见，例如，Jespers等人,1994,Biotechnology 12:899-903)。人类抗体也可使用本领域已知的各种技术制备，包括噬菌体展示库(例如，参见，Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等人.,1991, J.Mol.Biol.222:581；Quan和Carter,2002,The rise of monoclonal antibodies as therapeutics,In Anti-IgE 和AllergicDisease,Jardieu and Fick,eds.,Marcel Dekker,New York,N.Y.,Chapter 20,pp.427-469)。
在另一实施方案中，所述抗体为抗体的融合蛋白，或其功能活性片段，例如其中抗体在N端或 C端经由共价键(例如肽键)融合至非来自抗体的另一蛋白质的氨基酸序列(或其部分，优选地蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的那些。优选地，抗体或其片段在恒定结构域的N端共价连结至其他蛋白质。
抗体包括经修饰(即通过分子的任何类型的共价连接，只要这样的共价连接允许抗体保留其抗原结合免疫特异性即可)的类似物和衍生物。例如但非限制地，抗体的衍生物和类似物包括已进一步例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知的保护基/阻断基的衍生化、蛋白水解性裂解、与细胞抗体单元或其他蛋白质连接等修饰的那些。诸多化学修饰中的任一种可通过已知技术进行，包括但不限定于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸。
抗体可在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如取代、删除或增加)。特别地，抗体可在经鉴定涉及抗-Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基中具有修饰(参见，例如，第 WO 97/34631号国际公开，其整体援引加入本文)。
对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体可商业获得或可通过本领域技术人员已知的任何方法如化学合成法或重组表达技术制备。编码对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可由例如 GenBank数据库或与其类似的数据库、文献公开、或通过常规克隆和测序而获得。
在一特定实施方案中，可使用用于治疗癌症的已知抗体。对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体可商业获得或可通过本领域技术人员已知的任何方法如重组表达技术制备。编码对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可由例如GenBank数据库或与其类似的数据库、文献公开、或通过常规克隆和测序而获得。可用于治疗癌症的抗体的实例包括但不限定于：OVAREX，其为用于治疗卵巢癌的鼠抗体；PANOREX(Glaxo Wellcome,NC)，其为用于治疗结肠直肠癌的鼠IgG2a抗体；Cetuximab ERBITUX(Imclone Systems Inc.,NY)，其为用于治疗表皮生长因子阳性癌症如头颈癌的抗-EGFR IgG 嵌合抗体；Vitaxin(MedImmune,Inc.,MD)，其为用于治疗肉瘤的人源化抗体；CAMPATH I/H (Leukosite,MA)，其为用于治疗慢性淋巴球性白血病(CLL)的人源化IgG1抗体；SMART ID10(Protein Design Labs,Inc.,CA)，其为用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗体；ONCOLYM (Techniclone,Inc.,CA)，其为用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的放射性标记的鼠抗-HLA-Dr10抗体；ALLOMUNE(BioTransplant,CA)，其为用于治疗霍金奇氏病或非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-CD2 mAb；以及CEACIDE(Immunomedics,NJ)，其为用于治疗结肠直肠癌的人源化抗-CEA抗体。
尝试发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标，研究者已寻求鉴别跨膜或其他的肿瘤相关性多肽，所述多肽与一种或多种正常非癌性细胞相比在一个或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性地表达。通常，与在非癌性细胞的表面上相比，此类肿瘤相关性多肽更为丰富地在癌细胞的表面上表达。此类肿瘤相关性细胞表面抗原多肽的鉴别产生了特异性地靶向癌细胞以经由基于抗体的疗法进行破坏的能力。
连接基单元(L)
连接基(本文有时称为“[连接基]”)为双官能化合物，其可用于连接药物和抗体以形成抗体药物缀合物(ADC)。此类缀合物可用于例如形成针对肿瘤相关性抗原的免疫缀合物。此类缀合物使细胞毒性药物选择性地递送至肿瘤细胞。
在ADC中，连接基用于将有效负载连接至抗体。
在一方面，连接基单元的第二区段被引入，其具有第二反应位点，例如亲电子基，可与抗体单元(例如抗体)上存在的亲核基团反应。抗体上可用的亲核基团包括但不限定于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接基单元上的亲电子基团反应且形成与连接基单元的共价键。可用的亲电子基团包括但不限定于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。亲电子基团提供用于抗体连接的便利位点。
在另一实施方案中，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上可用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。连接基单元的亲核基的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体的共价键。连接基单元上可用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸盐以及芳基酰肼。抗体上的亲电子基提供了用于与连接基单元连接的便利位点。
氨基官能基也是连接基单元可用的反应位点，因为它们可与化合物的羧酸或活化酯反应以形成酰胺键。通常，基于肽的本发明化合物可通过在二个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。此类肽键可例如根据肽化学领域中公知的液相合成法(参见，例如，Schroder和Lubke,"The Peptides",第1卷,pp 76-136,1965,Academic Press)制备。
在本发明的上下文中，特别是但不限定于连接基组份如L1、L2(包括L2 A、L2 B和L2 C)以及L3，语言"选自...中的一个(种)或多个(种)"或"一个(种)或多个(种)"表示多种组份，其可相同或不同，为或可为连续排列的。因此，例如，L3可为-C1-6烷基-、-NR-或其他个别列出的组份，但也可为-C1-6烷基 -NR-，或2个或更多个所列组份的任意其他组合。
在另一实施方案中，连接基单元具有可与抗体亲核体(诸如半胱氨酸)反应的反应位点。所述反应位点包含在被砜取代的杂环中。然后所述砜被抗体亲核体(即半胱氨酸)替换，并且抗体和杂环之间新形成的键将抗体连接至连接基，参见WO 2014/144878。
化合物及其抗体药物缀合物的合成
本发明的化合物和缀合物可使用以下在实例中所述的合成步骤制得。如以下更详细地描述，本发明的化合物和缀合物可使用具有用于与化合物结合的反应位点的连接基单元区段来制备。在一方面，连接基单元的第二区段被引入，其具有第二反应位点，例如亲电子基，可与抗体单元(例如抗体) 上存在的亲核基团反应。抗体上可用的亲核基团包括但不限于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接基单元上的亲电子基团反应且形成与连接基单元的共价键。可用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。亲电子基团提供用于抗体连接的便利位点。
在另一实施方案中，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上可用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。连接基单元的亲核基的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体的共价键。连接基单元上可用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲、肼羧酸盐以及芳基酰肼。抗体上的亲电子基提供了用于与连接基单元连接的便利位点。
氨基官能基也是连接基单元可用的反应位点，因为它们可与化合物的羧酸或活化酯反应以形成酰胺键。通常，基于肽的本发明化合物可通过在二个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。此类肽键可例如根据肽化学领域中公知的液相合成法(参见，例如，Schroder和Lubke,"The Peptides",第1卷,pp 76-136,1965,Academic Press)制备。
如以下更详细地描述，缀合物可使用具有用于与本发明化合物结合的反应位点的连接基区段以及引入具有用于抗体的反应位点的连接基单元的另一区段来制备。在一方面，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体单元(诸如抗体)上存在的亲核基团反应的亲电子基团。亲电子基团提供用于抗体连接的便利位点。抗体上可用的亲核基团包括但不限于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接基单元上的亲电子基团反应且形成与连接基单元的共价键。可用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
在另一实施方案中，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体单元上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上的亲电子基提供了用于与连接基单元连接的便利位点。抗体上可用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。连接基单元的亲核基的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体的共价键。连接基单元上可用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲、肼羧酸盐以及芳基酰肼。
在本发明的另一实施方案中，本发明的连接使用工程化抗体的恒定域多肽或其部分，其中所述工程化恒定域包含至少一个氨基酸取代以引入可用于缀合的半胱氨酸残基，并且其中所述恒定域多肽是工程化的人IgG重链恒定域(Cy)多肽或其部分，其包含在选自下列位置处的至少一个氨基酸取代：K246、D249、D265、S267、D270、N276、Y278、E283、R292、E293、E294、Y300、V302、 V303、L314、N315、E318、K320、I332、E333、K334、1336、E345、Q347、S354、R355、M358、 K360、Q362、K370、Y373、D376、A378、E380、E382、Q386、E388、N390、K392、T393、D401、 F404、T411、D413、K414、R416、Q418、Q419、N421、M428、A431、L432、T437、Q438、K439、 L443和S444(根据Kabat的EU索引)。
在本发明的另一实施方案中，本发明的连接使用工程化抗体的恒定域多肽或其部分，其中所述工程化恒定域包含至少一个氨基酸取代以引入可用于缀合的半胱氨酸残基，并且其中所述恒定域多肽是工程化的人λ轻链恒定域(CA)多肽或其部分，其包含在选自下列位置处的至少一个氨基酸取代： K110、A111、L125、K149C、V155、G158、T161、Q185、S188、H189、S191、T197、V205、E206、 K207、T208和A210(根据Kabat的编号)。
在本发明的又一实施方案中，本发明的连接使用工程化抗体的恒定域多肽或其部分，其中所述工程化恒定域包含至少一个氨基酸取代以引入可用于缀合的半胱氨酸残基，并且其中所述恒定域多肽是工程化的人κ轻链恒定域(CK)多肽或其部分，其包含在选自下列位置处的至少一个氨基酸取代： A111、K183和N210(根据Kabat的编号)。
在本发明的又一实施方案中，本发明的连接使用工程化抗体的恒定域多肽或其部分，其中所述工程化恒定域包含至少一个氨基酸取代以引入可用于缀合的半胱氨酸残基，并且其中所述恒定域多肽是工程化的Cy多肽或其部分，其包含至少一个选自下列的氨基酸序列：WO2013/093809(以其整体援引加入本文)中所公开的SEQ ID NO:97-100、102、104、107-127以及129-163的氨基酸序列。
在本发明的另一一实施方案中，本发明的连接使用工程化抗体的恒定域多肽或其部分，其中所述工程化恒定域包含至少一个氨基酸取代以引入可用于缀合的半胱氨酸残基，并且其中所述恒定域多肽是工程化的CK多肽或其部分，其包含至少一个选自下列的氨基酸序列：WO2013/093809(以其整体援引加入本文)中所公开的SEQ ID NO:90、92、95、164、166和169的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，本发明的连接使用工程化的抗体恒定域多肽或其部分，其中所述工程化的恒定域包含至少一个氨基酸取代以引入可用于缀合的半胱氨酸残基，并且其中所述恒定域多肽是工程化的CA多肽或其部分，其包含至少一个选自下列的氨基酸序列：WO2013/093809(以其整体援引加入本文)中所公开的SEQ ID NO:172-186的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，上述工程化的Cy多肽还包含至少一个选自下列的突变：在氨基酸位置284、287、A327、N384、L398和V422处(根据Kabat的EU索引)的突变。
与转谷氨酰胺酶的缀合
在某些实施方案中，本发明的化合物可在转谷氨酰胺酶的存在下共价交联至用含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如含Gln的肽标签或Q-标签)工程化的含Fc或含Fab的多肽、或通过多肽工程化(例如经由在多肽上的氨基酸删除、插入、取代、突变或其任何组合)而有反应性的内源性谷氨酰胺(即，在胺和转谷氨酰胺酶的存在下作为酰基供体形成共价键的能力)，条件是本发明的化合物包含胺供体物质(例如包含或连接至反应性胺的小分子)，由此与胺供体物质形成工程化含Fc的多肽缀合物的稳定且同质的族群，其中所述胺供体物质以位点特异性方式通过含酰基供体谷氨酰胺的标签或暴露/可进入/有反应性的内源性谷氨酰胺而缀合至含Fc或含Fab的多肽。例如，本发明的化合物可如第 PCT/IB2011/054899号国际专利申请所述的那样缀合，其全部内容援引加入本文。在某些实施方案中，为了促进本发明的化合物在转谷氨酰胺酶的存在下缀合于用含酰基供体谷氨酰胺的标签工程化的含 Fc或含Fab的多肽、或通过多肽工程化而有反应性的内源性谷氨酰胺，Z为NH2。
与人类轻链κ结构域恒定区的缀合
在某些实施方案中，本发明的化合物可共价连接至人类轻链κ结构域恒定区(CLκ)的K188侧链(根据Kabat的全轻链编号)。例如，本发明的化合物可如第13/180,204号美国申请所述的那样缀合，其全部内容援引加入本文。在某些实施方案中，为了促进与K188 CLκ的结合，Z为
Figure BDA0001474068160000361
R7每次出现时独立地选自：F、Cl、I、Br、NO2、CN和CF3；并且h 为1、2、3、4或5。
在某些实施方案中，本发明提供包含与抗体(或其抗原结合部分)共价缀合的本发明化合物的组合物，其中所述组合物中至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的本发明化合物与抗体或其抗原结合部分在K188 CLκ处缀合。
在某些实施方案中，本发明的化合物可缀合至催化性抗体如醛缩酶抗体或其抗原结合部分的结合位点。醛缩酶抗体包含结合位点部分，其在不受阻碍(例如通过缀合)时催化脂族酮供体与醛受体之间的醛醇加成反应。第US 2006/205670号美国专利申请公开的内容援引加入本文，特别是描述连接基的第78-118页，以及描述抗体、其可用的片段、变体和修饰、h38C2、结合位点和互补决定区(CDR) 以及相关抗体技术的段落[0153]-[0233]。术语"结合位点"包括(CDR)和涉及抗原结合的邻近框架残基。
组合物及给药方法
在其他实施方案中，本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含有效量的本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物以及药学上可接受的载体或媒介物。在某些实施方案中，所述组合物适于兽医学或人类给药。
本发明的药物组合物可为允许组合物向患者给药的任何形式。例如，所述组合物可以为液体或固体形式。典型的给药途径包括(非限制)肠胃外、眼部和肿瘤内。肠胃外给药包括皮下注射、静脉内、肌内或胸骨注射或输注技术。在一方面，将所述组合物肠胃外给药。在一特定实施方案中，将所述组合物静脉内给药。
药物组合物可经配制以使本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物在将组合物给药患者后成为生物可利用的。所述组合物可采用一种或多种剂量单位的形式，其中例如，片剂可为单一剂量单位，并且液态形式的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物的容器则可容纳多个单位剂量。
用于制备药物组合物的物质在所用的量下可为无毒的。本领域普通技术人员清楚，药物组合物中活性成分的最佳剂量会取决于多种因素。相关的因素包括(但非限制)动物类型(例如人类)、本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物的特定形式、给药方式、以及所用的组合物。
药学上可接受的载体或媒介物可为固体或颗粒，以使所述组合物为例如片剂或散剂形式。所述载体可以为液体。此外，所述载体可以为颗粒。
所述组合物可为液体形式，例如溶液剂、乳胶剂混悬剂。在通过注射来给药所述组合物时，也可包含一种或多种表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。
无论液体组合物是溶液剂、混悬剂还是其他类似形式，其也可包含下列中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、非挥发油如合成的单酸和二酸甘油酯(其可用作溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、环糊精、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或氨基酸及用于调整张度的试剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外组合物可包封在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是示例性辅剂。可注射组合物优选是无菌的。
本发明化合物和/或其抗体药物缀合物在特定病症或病况的治疗中的有效量会取决于病症或病况的性质，并且可通过标准临床技术而确定。此外，体外或体内测定可任选地用于辅助鉴定最佳剂量范围。组合物中所用的精确剂量也会取决于给药途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据医师的诊断及每个患者的情况而确定。
所述组合物包含有效量的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物，从而会获得适当的剂量。通常，该量以组合物重量计为至少约0.01％的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。在示例性实施方案中，制备药物组合物，以使肠胃外单位剂量包含约0.01重量％至约2重量％的的量本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。
对于静脉内给药，所述组合物可包含每公斤患者体重约0.01mg至约100mg本发明化合物和/ 或其抗体药物缀合物。在一方面，所述组合物可包含每公斤患者体重约1mg至约100mg本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。在另一方面，所给药的量会为约0.1mg/kg至约25mg/kg体重的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。
通常，向患者给药的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物的剂量通常为约0.01mg/kg至约20 mg/kg患者体重。在一方面，向患者给药的剂量为约0.01mg/kg至约10mg/kg患者体重。在另一方面，向患者给药的剂量为约0.1mg/kg至约10mg/kg患者体重。在又一方面，向患者给药的剂量为约0.1mg/kg至约5mg/kg患者体重。在又一方面，所给药的剂量为约0.1mg/kg至约3mg/kg患者体重。在又一方面，所给药的剂量为约1mg/kg至约3mg/kg患者体重。
本发明化合物和/或其抗体药物缀合物可通过任何便利的途径来给药，例如通过输注或快速浓注 (bolus injection)。给药可以为全身或局部的。各种递送系统是已知的，例如封装在脂质体、微粒、微囊、胶囊等中，并且可用于给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。在某些实施方案中，向患者给药多于一种的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。
在特定实施方案中，期望向需要治疗的区域局部给药一种或多种本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。这可通过以下实现：例如但非限制地，外科手术期间的局部输注；外科手术后的局部施用，例如与伤口敷料一起局部施用；通过注射；通过导管；或通过植入物，该植入物为多孔的、无孔的、或凝胶状材料，包括膜如硅橡胶膜或纤维。在一实施方案中，给药可通过在癌症、肿瘤或癌变组织或癌变前组织的部位(或较早的部位)处直接注射。在另一实施方案中，给药可通过自身免疫疾病表现的部位(或较早部位)处的直接注射。
在又一实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物可经控释系统而递送，诸如但不限定于，可以使用泵或各种聚合物材料。在又一实施方案中，控释系统可放置在本发明化合物和/或其抗体药物缀合物的靶标(例如肝脏)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson的 Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。可以使用由Langer (Science 249：1527-1533(1990))的综述中所讨论的其他控释系统。
术语"载体"是指可与化合物或其抗体药物缀合物一起给药的稀释剂、辅剂或赋形剂。此类药物载体可为液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。载体可为盐水等。此外，可以使用辅剂、稳定剂及其他物质。在一个实施方案中，当向患者给药时，化合物或缀合物以及药学上可接受的载体为无菌的。当静脉内给药化合物或缀合物时，水为示例性载体。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，尤其用于注射液。如有需要，本发明的组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。
本发明的组合物可采用溶液剂、丸剂、散剂、缓释制剂形式、或任何其他适于使用的形式。合适的药物载体的其他实例描述于E.W.Martin的"Remington's PharmaceuticalSciences"中。
在一实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物根据常规操作而配制成适合于向动物 (尤其是人类)静脉内给药的药物组合物。通常，用于静脉内给药的载体或媒介物为无菌等渗缓冲水溶液。当需要时，所述组合物也可包含增溶剂。用于静脉内给药的组合物可任选地包含局部麻醉剂如利诺卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，各成分被分别供应或一起混合于单位剂型中，例如作为在指示活性剂的量的诸如安瓶或药囊的密封容器中的干燥冻干粉末或不含水的浓缩物。当本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物要通过输注来给药时，其可例如使用含无菌药物等级的水或盐水的输注瓶来分配。当本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物要通过注射来给药时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓶以便将各成分在给药前混合。
所述组合物可包含多种改变固体或液体剂量单位的物理形式的物质。例如，所述组合物可包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常为惰性的，并可选自例如糖、虫胶或其他肠溶衣剂。或者，活性成分可以包封在明胶胶囊中。
无论处于固体或液体形式，本发明的组合物可包含用于治疗癌症的药剂。
化合物及其抗体药物缀合物的治疗用途
本发明的另一方面涉及使用本发明的化合物及其抗体药物缀合物来治疗癌症的方法。
本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物可用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖，导致肿瘤或癌细胞的细胞凋亡，或用于治疗患者的癌症。因此可在治疗动物癌症的多种情况下使用本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。所述缀合物可用于将本发明的化合物递送至肿瘤细胞或癌细胞。不受理论所束缚，在一实施方案中，所述缀合物的抗体与癌细胞或肿瘤细胞相关性抗原结合或联合，并且可通过受体介导的内吞作用或其他内化机制而在肿瘤细胞或癌细胞的内部摄取(内化)缀合物。抗原可连接至肿瘤细胞或癌细胞，或可为与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。在某些实施方案中，一旦在细胞内部，则一种或多种特异性肽序列通过一种或多种肿瘤细胞或癌细胞相关性蛋白酶而酶促裂解或水解裂解，导致本发明的化合物从缀合物中释放。所释放的本发明化合物随后自由地在细胞内迁移并诱导细胞毒性或细胞抑制活性。所述缀合物也可通过细胞内蛋白酶而裂解，以释放本发明的化合物。在又一实施方案中，本发明的化合物从肿瘤细胞或癌细胞外部的缀合物中裂解，并且本发明的化合物随后穿透细胞。
在某些实施方案中，所述缀合物提供缀合特异性肿瘤或癌症药物靶向，从而降低了本发明化合物的全身毒性。
在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞结合。
在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞抗原结合，所述抗原位于肿瘤细胞或癌细胞的表面上。
在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞抗原结合，所述抗原为与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。
抗体单元对特定肿瘤细胞或癌细胞的特异性对于确定最有效地治疗的那些肿瘤或癌症而言可为重要的。
可用本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物治疗的特定类型的癌症包括但不限定于：膀胱、乳房、子宫颈、结肠、子宫内膜、肾、肺、食道、卵巢、前列腺、胰脏、皮肤、胃和睪丸的癌症；以及血液癌症，包括但不限定于白血病和淋巴瘤。
癌症的多模式疗法：包括但不限于肿瘤、转移或以不受控的细胞生长为特征的其他疾病或病症的癌症可通过给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物而得到治疗或抑制。
在其他实施方案中，提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者给药有效量的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物以及化学治疗剂。在一实施方案中，所述化学治疗剂为这样的化学治疗剂，即，使用其治疗癌症未被发现是难治的。在另一实施方案中，所述化学治疗剂为这样的化学治疗剂，即使用其治疗癌症已被发现是难治的。可向也经历作为癌症治疗的外科手术的患者给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，患者也接受额外的治疗，诸如放射疗法。在一特定实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物与化学治疗剂或与放射疗法同时给药。在另一特定实施方案中，化学治疗剂或放射疗法在给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物之前或之后给药。
化学治疗剂可在一系列疗程(session)内给药。可以给药化学治疗剂中的任一种或组合，诸如标准护理化学治疗剂。
另外，在化疗或放射疗法已证实或可证实毒性过大(例如对被治疗的患者产生不可接受或不能忍受的副作用)的情况下，可提供使用本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物治疗癌症的方法以作为化疗或放射疗法的替代方案。被治疗的患者可任选地用另一癌症治疗如外科手术、放射疗法或化疗法治疗，这取决于发现治疗为可接受或可忍受的。
本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物也可以体外或间接体外的形式使用，诸如用于治疗某些癌症，包括但不限定于白血病和淋巴瘤，此类治疗涉及自体干细胞移植。这可涉及多步骤过程，其中获取动物自体造血干细胞并清除所有癌细胞，然后经由给药高剂量的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物(具有或不具有伴随的高剂量放射疗法)将动物的剩余骨髓细胞族群根除，并将干细胞移植物输注回动物。然后，在骨髓功能恢复且患者复原时提供支持性护理。
在下列实例中进一步描述本发明，其不旨在限制本发明的范围。
一般方法
合成实验操作
实验通常在惰性气氛(氮气或氩气)下进行，尤其在使用氧敏感性或水分敏感性试剂或中间体的情况下。商业溶剂和试剂通常在不进一步纯化的情况下使用，在适当的情况下包括无水溶剂(通常得自 Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin的Sure-SealTM产品)。通过液相色谱-质谱法(LC-MS) 或大气压化学电离(APCI)来报告质谱数据。参考所用的氘化溶剂的残峰以百万分之份数(ppm,δ)形式表示核磁共振(NMR)的化学位移数据。
对于在其他实施例或方法中的合成参考操作，反应方案(反应时间和温度)可以变化。通常，反应之后是薄层色谱、LC-MS或HPLC，在合适时进行后处理。纯化可随不同实验而变化：通常，选择用于洗脱液/梯度的溶剂和溶剂比以提供合适的保留时间。除非另外规定，否则反相HPLC流分可经由冻干/冻干而浓缩。中间体和最终化合物在0℃或室温下储存在氮气下的封闭小瓶或烧瓶中。化合物名称通过ACD Labs软件生成。
用于溶剂和/或试剂的缩写基于American Chemical Society指南，并且在下文中强调：
Ac＝乙酰基
Boc＝N-叔丁氧羰基
CDI＝N,N'-羰基二咪唑
DCC＝1,3-二环己基碳二亚胺
DCE＝二氯乙烷
DCM＝二氯甲烷
DEA＝N,N-二乙胺
DEAD＝偶氮二甲酸二乙酯
DIAD＝偶氮二甲酸二异丙酯
DIBAL-H＝二异丁基氢化铝
DIPEA(或)Hunig’s碱＝N,N-二异丙基乙基胺
DMA＝二甲基乙酰胺
DMAP＝4-二甲基氨基吡啶
DME＝二甲氧基乙烷
DMF＝N,N-二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲基亚砜
DPPA＝二苯基磷酰基叠氮
EDCI＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EtOAc＝乙酸乙酯
Fmoc＝芴基甲氧基羰基
h＝小时
HATU＝o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基六氟磷酸脲
HBTU＝N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲
HOAc＝乙酸
HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt＝1-羟基苯并三唑水合物
LDA＝二异丙基氨基锂
Me＝甲基
MS＝分子筛
MTBE＝甲基叔丁基醚
n-BuLi＝正丁基锂
NBS＝N-溴琥珀酰亚胺
NMM＝N-甲基吗啉
Ph＝苯基
PPTS＝对甲苯磺酸吡啶
p-TsOH＝对甲苯磺酸
rt＝室温
TBAI＝四丁基碘化铵
TEA＝三乙胺
Tf＝三氟甲磺酸酯
TFA＝TFA
THF＝四氢呋喃
TPTU＝O-(2-氧代-1(2H)吡啶基)-N,N,N,’N’-四甲基四氟硼酸脲
用于分析的HPLC和LC-MS条件
方案A：柱：Waters Acquity UPLC HSS T3,2.1×50mm,C18,1.7μm；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时1分钟5％B，历时2.5分钟5％至95％B，历时0.35分钟95％B；流速：1.25mL/分钟；温度：60℃；检测：200-450nm；MS(+)范围100-2000 道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。
方案B：柱：Waters Acquity UPLC HSS T3,C18,2.1×50mm,1.7μm；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时0.1分钟5％B,历时1.5分钟5％至95％ B,历时0.35分钟95％B；流速：1.25mL/分钟；温度：60℃；检测：200-450nm；MS(+)范围100-2000 道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。
用于纯化的HPLC条件
方法A：柱：Phenomenex Luna苯基己基150x 21.2mm,5μm；流动相A:含0.02％TFA的水(v/v)；流动相B:含0.02％TFA的乙腈(v/v)；梯度：历时1.5分钟20％B,历时8.5分钟20％B至100％B，然后历时2.0分钟100％B；流速:27mL/分钟；温度：未控制；检测:DAD 210-360nm；MS(+)范围 150-2000道尔顿；仪器:305RP Waters Fractional Lynx LCMS。
方法B：柱：Phenomenex Luna C18,100x 30mm,5μm；流动相A:含0.02％TFA的水(v/v)；流动相B:含0.02％TFA的乙腈(v/v)；梯度：历时1.5分钟20％B,历时8.5分钟20％B至100％B，然后历时2.0分钟95％B；流速:30mL/分钟；温度：未控制；检测:UV 215nm；仪器:Gilson。
方法C：Phenomenex Luna C18,100x 30mm,5μm；流动相A:含0.02％TFA的水(v/v)；流动相 B:含0.02％TFA的乙腈(v/v)；梯度：历时10至20分钟含可变增加梯度的B；流速:27至30mL/分钟；温度：未控制；检测:UV 215nm；仪器:Gilson。
一般操作：
一般操作A：在0℃下，向单或二酸在THF、二氯甲烷或二者的混合物中的搅拌的溶液加入草酰氯(1-2.5eq.)，随后加入催化量的DMF。将反应物在0℃下搅拌数分钟，然后温热至室温，然后在室温下搅拌30分钟至数小时。然后将反应物真空浓缩。在一些情况中，然后将粗品物质与庚烷或其它相关的一种或多种溶剂共沸一至数次。然后将粗品物质在高真空下干燥，然后在下一步骤中使用。
一般操作B：在0℃下，向胺(2-2.5eq.)在THF、二氯甲烷或二者的混合物(或者在一些情况中其它相关的一种或多种溶剂)加入酰氯或二酰氯，随后加入吡啶(3-6eq.)、三乙胺(3-6eq.)或其它相关碱(3-6eq.)。将反应物在0℃下搅拌数秒至数分钟，然后温热至室温，然后在室温下搅拌10分钟至数小时。然后将反应物真空浓缩。在一些情况中，然后将粗品物质与庚烷或其它相关的一种或多种溶剂共沸一至数次。在大多数情况中，然后将粗品物质通过所描述的方法纯化(诸如硅胶色谱法或中压反相C18色谱法)。
实施例：
(S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基乙酸酯(4)的制备.
Figure BDA0001474068160000411
步骤1：(S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(2)的合成。向(8S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(1)[如J.Am.Chem. Soc.,2007,129,14092-14099中所述制备](100mg,0.225mmol)在THF(1.5mL)中的搅拌的溶液加入 10％Pd/C(33mg)，随后加入25％甲酸铵水溶液(0.15mL)。将溶液搅拌2h。将溶液用乙醚(6mL)稀释，并加入硫酸钠。将混合物通过硅藻土过滤，并将溶剂真空移除，以得到白色固体形式的期望产物2(79mg,100％)。
步骤2：(S)-4-乙酰氧基-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(3)的合成。将(S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(2,69mg,0.19mmol) 在CH2Cl2(2ml)中溶解。加入吡啶(46mg,0.585mmol)、乙酰氯(16mL,0.234mmol)，并将反应物搅拌2h。将溶剂真空移除。将粗品残渣通过快速色谱法(0-100％EtOAc/庚烷)纯化，以得到期望产物(45 mg,58％)。
步骤3：(S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基乙酸酯(4)的合成：将(S)-4-乙酰氧基-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(3)(45mg,0.11mmol)在二氧六环(1mL)中溶解。加入二氧六环中的4N HCl(1mL)，并将溶液搅拌2h。将溶剂移除，以定量收率得到粗品目标物质，并将所述物质直接使用。
双环[1.1.1]-1,3-二酰氯(6)的制备
Figure BDA0001474068160000412
将双环[1.1.1]戊烷-1,3-二羧酸(50mg)置于小瓶中，并在THF(1mL)中溶解，加入一滴DMF。缓慢加入草酰氯(122mg,0.961mmol,0.0825mL)，并将溶液快速鼓泡。2h后移除溶剂，并将二酰氯6 在随后的反应中使用。
(8S,8’S)-(双环[1.1.1]戊烷-1,3-二羰基)双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4- 二基)二乙酸酯(7)的制备.
Figure BDA0001474068160000413
步骤1：(8S,8'S)-(双环[1.1.1]戊烷-1,3-二羰基)双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(7)：如下制备标题化合物：依照一般操作B，使用4(20.0mg,0.060mmol)、6(5.81 mg,0.0301mmol,0.0301mL,THF中1M)、吡啶(14.30.181mmol)和THF(1.0mL)，并将物质通过中压反相C18色谱法(梯度：含0％至80％乙腈的水，在各相中含0.02％TFA)纯化，提供期望的产物7 (8.0mg,20％)。LC-MS(方案B):m/z711.3[M+H]+,保留时间＝1.12分钟。
(R)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基乙酸酯(11)的制备.
Figure BDA0001474068160000414
步骤1：(R)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(9)的合成。向(8R)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(8)[如J.Am. Chem.Soc.,2007,129,14092-14099中所述制备](100mg,0.225mmol)在THF(1.5mL)中的搅拌的溶液加入10％Pd/C(33mg)，随后加入25％甲酸铵水溶液(0.15mL)。将溶液搅拌2h。将溶液用乙醚(6mL) 稀释，并加入硫酸钠。将混合物通过硅藻土过滤，并将溶剂真空移除，以得到白色固体形式的期望产物9(79mg,100％)。
步骤2：(R)-4-乙酰氧基-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(10)的合成：将(R)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(2)(69mg,0.19 mmol)在CH2Cl2(2ml)中溶解。加入吡啶(46mg,0.585mmol)。加入乙酰氯(16mL,0.234mmol)，并将反应物搅拌2h。将溶剂真空移除。将粗品残渣通过快速色谱法(0-100％EtOAc/庚烷)纯化，以得到期望产物10(53mg,69％)。
步骤3：(R)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基乙酸酯(11)的合成：将(R)-4- 乙酰氧基-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(10)(53mg,0.13mmol)在二氧六环(1mL)中溶解。加入二氧六环中的4N HCl(1mL)，并将溶液搅拌2h。移除溶剂，以定量收率得到粗品目标物质，并将物质直接使用，这为(8R,8’R)-(双环[1.1.1]戊烷-1,3-二羰基)双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(11)的制备。
(8R,8’R)-(双环[1.1.1]戊烷-1,3-二羰基)双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4- 二基)二乙酸酯(12)的制备
Figure BDA0001474068160000421
步骤1：(8R,8’R)-(双环[1.1.1]戊烷-1,3-二羰基)双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e] 吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(12)的合成.
如下制备标题化合物：依照一般操作B，使用11(20.0mg,0.060mmol)和6(5.81mg,0.0301mmol, 0.0301mL,THF中1M)、吡啶(14.3 0.181mmol)和THF(1.0mL)，并使用中压反相C18色谱法(梯度：含0％至80％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，以得到期望产物12(5.9mg,14％)。LC-MS(方案B):m/z 711.2[M+H]+,保留时间＝1.12分钟。
(S)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-4-基乙酸酯(16)的制备：
Figure BDA0001474068160000422
步骤1：(S)-8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(14)的合成：将(S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(13)[如J.Am. Chem.Soc.,2007,129,14092-14099中所述制备](250mg,0.563mmol)在THF(5.63mL)中溶解。加入 10％Pd/C(80mg)。加入新鲜制备的25％甲酸铵盐水溶液(500mg,2mmol,0.5mL)，并将反应物搅拌 30分钟。将反应混合物用乙醚(15mL)稀释，并加入Na2SO4。将溶液通过硅藻土过滤，并将溶剂真空移除，以得到标题化合物14(191mg,95％)。
步骤2：(S)-4-乙酰氧基-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(15)的合成：将(S)-8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(14,171mg,0.483 mmol)在CH2Cl2(5.0mL)中溶解。加入吡啶(213mg,2.69mmol)，随后加入乙酰氯(114mg,1.45mmol)。将反应物搅拌过夜，溶液变为橙色/褐色。将溶剂真空移除，剩下粗品橙色固体。将粗品残渣通过快速色谱法(0-100％EtOAc/庚烷)纯化，移除溶剂后得到期望产物15(171.0mg,89.4％)。
步骤3：(S)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-4-基乙酸酯(16)的合成：将(S)-4- 乙酰氧基-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(15,20mg,0.051mmol)在二氧六环中4N HCl(1mL)中溶解。将反应物放置过夜，并将溶剂移除，以定量收率得到粗品目标物质16，并将物质直接使用。
双环[1.1.1]戊烷-1,3-二基双[羰基(8S)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6,4-二基]二乙酸酯(17)的制备
Figure BDA0001474068160000431
步骤1：双环[1.1.1]戊烷-1,3-二基双[羰基(8S)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚 -6,4-二基]二乙酸酯(17)的合成：如下制备标题化合物：依照一般操作B，使用16(17mg,0.051)和6 (4.94mg,0.026mmol,0.0301mL,THF中1M)、吡啶(14.30.181mmol)和THF(1.0mL)，并且使用中压反相C18色谱法(梯度：含0％至80％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，提供期望的产物17(10.0 mg,27％)LC-MS(方案B):m/z711.1[M+H]+,保留时间＝1.12分钟
(R)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-4-基乙酸酯(21)的制备
Figure BDA0001474068160000432
步骤1：(R)-8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(19)的合成：将(R)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(18)[如J.Am. Chem.Soc.,2007,129,14092-14099中所述制备](250mg,0.563mmol)在THF(5.63mL)中溶解。加入 10％Pd/C(80mg)。加入新鲜制备的25％甲酸铵盐水溶液(500mg,2mmol,0.5mL)，并将反应物搅拌 30分钟。将反应混合物用乙醚(15mL)稀释，并加入Na2SO4。将溶液通过硅藻土过滤，并将溶剂真空移除，留下白色固体粗品19(156mg,78％)。
步骤2：(R)-4-乙酰氧基-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(20)的合成：将(R)-8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(19,136mg,0.384 mmol)在DCM(5.0mL)中溶解。加入吡啶(213mg,2.69mmol)，随后加入乙酰氯(114mg,1.45mmol)。将反应物搅拌过夜，溶液变为橙色/褐色。将溶剂真空移除，剩下粗品橙色固体。将粗品残渣通过快速色谱法(0-100％EtOAc/庚烷)纯化，移除溶剂后得到期望产物20(113.0mg,74％)。
步骤3：(R)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-4-基乙酸酯(21)的合成：将(R)-4- 乙酰氧基-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(20,25mg,0.051mmol)在二氧六环中4N HCl(1mL)中溶解。将反应物放置过夜，并将溶剂移除，以定量收率得到粗品目标物质21，并将物质直接使用。
双环[1.1.1]戊烷-1,3-二基双[羰基(8R)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6,4-二基]二乙酸酯(22)的制备
Figure BDA0001474068160000441
步骤1：双环[1.1.1]戊烷-1,3-二基双[羰基(8R)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚 -6,4-二基]二乙酸酯(22)的合成：如下制备标题化合物：依照一般操作B，使用21(17mg,0.051mmol) 和6(4.94mg,0.026mmol,0.0301mL,THF中1M)、吡啶(14.30.181mmol)和THF(1.0mL)，并且使用中压反相C18色谱法(梯度：含0％至80％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，提供期望的产物 22(8.6mg,19％)LC-MS(方案B):m/z 711.1[M+H]+,保留时间＝1.12分钟。
(8S,8’S)-戊二酰基双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(24) 的制备
Figure BDA0001474068160000442
步骤1：(8S,8’S)-戊二酰基双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(24)的合成：将3(10mg,0.025mmol)的溶液用4M HCl(二氧六环中0.5mL)在室温下处理1h，并真空浓缩。将残渣在THF(2mL)中溶解，加入戊二酰氯(2.13mg,0.0125mmol)，随后加入DIPEA(13 uL,0.074mmol)。将所得混合物在室温下搅拌30min。将反应混合物浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(使用MeOH/DCM(0-10％))纯化，以得到灰白色固体形式的产物，将其用MeOH处理，过滤，以得到灰白色固体形式的24，6mg(70％)。LC-MS(方案B):m/z 687.1[M+H]+,保留时间＝1.11分钟.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.24(s,2H),7.13(s,2H),4.36(d,J＝10.5Hz,2H),4.17(m,2H), 4.06(m,2H),3.74(d,J＝10.9Hz,2H),3.39(t,J＝10.9Hz,2H),2.80(m,2H),2.66(m,2H),2.55(s,6H), 2.37(s,6H),2.22(m,2H).
(8R,8’R)-戊二酰基双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(25) 的制备：
Figure BDA0001474068160000443
步骤1：(8R,8’R)-戊二酰基双(8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(25)的合成：
将10(10mg,0.025mmol)的溶液用4M HCl(二氧六环中0.5mL)在室温下处理1h，并真空浓缩。将残渣在THF(2mL)中溶解，并加入戊二酰氯(2.13mg,0.0125mmol)，随后加入吡啶(12mg,0.15 mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4h，真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到灰白色固体形式的产物25，1.5mg(17％)。LC-MS(方案B):m/z 687.1[M+H]+,保留时间＝1.11。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.24(s,2H),7.13(s,2H),4.37(d,J＝10.5Hz,2H),4.18(m,2H), 4.06(m,2H),3.73(d,J＝10.9Hz,2H),3.39(t,J＝10.9Hz,2H),2.77(m,2H),2.66(m,2H),2.55(s,6H), 2.37(s,6H),2.22(m,2H).
(8S,8’S)-戊二酰基双(8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(26) 的制备
Figure BDA0001474068160000451
步骤1：(8S,8'S)-戊二酰基双(8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[2,3-e]吲哚-6,4-二基)二乙酸酯(26)：将15(12mg,0.03mmol)的溶液用4M HCl(二氧六环中0.5mL)在室温下处理1h，并真空浓缩。将残渣在THF(2mL)中溶解，并加入戊二酰氯(2.5mg,0.015mmol)，随后加入DIPEA(16uL,0.09 mmol)。将所得混合物在室温下搅拌30min，真空浓缩，并将残渣通过ISCO(使用MeOH/DCM(0 -10％))纯化，以得到灰白色固体形式的产物26，6mg(60％)：LC-MS(方案B):m/z 687.1[M+H]+,保留时间＝1.11.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.12(s,2H),6.84(s,2H),4.32(m,2H),4.2(m,2H),4.05(d,J＝10.9 Hz,2H),3.93(m,2H),3.62(m,2H),2.68(br.s.,4H),2.56(s,6H),2.37(s,6H),2.19(br.s.,2H).
(8S)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚 -6-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基4-硝基苯基碳酸酯 (33)的制备.
Figure BDA0001474068160000452
步骤1：(8S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(2)的合成。在0℃下，向(8S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯1[如 J.Am.Chem.Soc.,2007,129,14092-14099中所述制备](575mg,1.30mmol)在18mL THF中的搅拌的溶液加入钯/碳10wt.％(250mg)，随后缓慢滴加2.0mL水中的25％甲酸铵。将反应物在0℃下搅拌约90分钟。将反应物用乙醚稀释，随后加入硫酸钠。将反应物通过硅藻土的薄垫过滤，然后用乙醚洗涤两次。将有机物合并，然后浓缩(reduce)，在置于真空下后得到灰白色固体形式的2(458mg,定量)。LC-MS(方案A):m/z352.2[M-H],保留时间＝1.96分钟。
步骤2：(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基乙酸酯(4)的合成。在0℃下，向2(209mg,0.591mmol)在8mL二氯甲烷中的搅拌的溶液加入乙酰氯(0.0462mL,0.650mmol)，随后立即加入吡啶(0.0714mL,0.886mmol)。将反应物在0℃下搅拌约10分钟。将反应物在硅胶上浓缩。然后进行硅胶色谱法(梯度：庚烷中0％-15％丙酮)。在适合的试管中浓缩，并置于高真空下，以得到白色固体。向该白色固体中加入二氧六环中4MHCl(10mL,40mmol)，并将反应物在室温下搅拌约90分钟。将反应物用庚烷稀释，真空浓缩，然后置于高真空下，以制备淡橙色固体形式的4(170 mg,80％收率,2步)。LC-MS(方案A):m/z 296.1[M+H]+,保留时间＝1.56分钟.1H NMR(400MHz, DMSO-d6):δ 7.53(s,1H),7.05(s,1H),4.27-4.19(m,1H),3.93-3.86(m,1H),3.80-3.75(m,1H),3.72-3.64 (m,2H),2.54(s,3H),2.37(s,3H).
步骤3：3-(氯羰基)双环[1.1.1]戊烷-1-羧酸甲酯(28)的合成。依照一般操作A，使用3-(甲氧基羰基)双环[1.1.1]戊烷-1-羧酸27(86.8mg,0.510mmol)、草酰氯(0.0525mL,0.612mmol)、THF(6mL)和 1滴DMF，制备白色固体形式的28(97mg,定量)。将粗品28在未进一步纯化下使用。
步骤4：二苄基(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基磷酸酯(29)的合成。向2(4.5g,13.4mmol)在8mL THF和8mL乙腈中的搅拌的溶液加入四氯化碳(0.997mL,10.3mmol)，随后加入Hunig’s碱(0.512mL,2.94mmol)、二苄基亚磷酸酯(0.974mL,4.41mmol)和DMAP(18mg, 0.147mmol)。将反应物在室温下搅拌约10分钟。将反应物在硅胶上浓缩。然后进行硅胶色谱法(梯度：庚烷中0％-25％丙酮)。在适合的试管中浓缩，并置于高真空下，以得到白色固体。将粗品物质在5mL二氯甲烷中溶解，随后加入三氟乙酸(5mL,70mmol)。将反应物在室温下搅拌60秒，立即真空浓缩，然后置于高真空下，得到白色且澄清的油和固体混合物形式的29(321mg,70％收率,2步)。 LC-MS(方案A):m/z 514.1[M+H]+,保留时间＝2.14分钟.
步骤5：3-{[(8S)-4-{[双(苄氧基)磷酰基]氧基}-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚 -6-基]羰基}双环[1.1.1]戊烷-1-羧酸(30)的合成。依照一般操作B，使用29(315mg,0.502mmol)、28 (94.6mg,0.502mmol)、三乙胺(0.210mL,1.50mmol)和THF(20mL)，并使用硅胶色谱法(梯度：庚烷中0％-35％丙酮)纯化。在适合的试管中合并并真空浓缩以制备白色固体。将物质在THF(10mL)中溶解，随后加入溶解于2.5mL水的中氢氧化锂。将反应物在室温下搅拌约45分钟。将反应物用二氯甲烷稀释，并通过加入1N HCl(aq.)猝灭。将反应物转移至分液漏斗中。将有机层分离，并将水层用二氯甲烷洗涤两次。将有机层合并，用盐水洗涤一次，用水洗涤一次，用硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，然后置于高真空下，制备得到30(178mg,57％收率,2步)。LC-MS(方案A):m/z 652.2[M+H]+, 保留时间＝1.97分钟.
步骤6：二苄基(8S)-6-{[3-(氯羰基)双环[1.1.1]戊-1-基]羰基}-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基磷酸酯(31)的合成。依照一般操作A，使用30(174mg,0.267mmol)、草酰氯(0.0298 mL,0.347mmol)、THF(5mL)、二氯甲烷(1mL)和1滴DMF，制备白色固体形式的31(182mg,定量)。将粗品31在未进一步纯化下使用。
步骤7：(8S)-6-[(3-{[(8S)-4-{[双(苄氧基)磷酰基]氧基}-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并 [3,2-e]吲哚-6-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4- 基乙酸酯(32)的合成。依照一般操作B，使用31(167mg,0.249mmol)、4(99.3mg,0.299mmol)、三乙胺(0.104mL,0.747mmol)和THF(20mL)，并使用硅胶色谱法(梯度：庚烷中0％-50％丙酮)纯化。在适合的试管中合并，并真空浓缩以制备白色固体形式的32(103mg,45％)。LC-MS(方案A):m/z 929.3[M+H]+,保留时间＝2.44分钟.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ 8.37(s,1H),8.09(s,1H), 7.54-7.50(m,2H),7.39-7.33(m,10H),5.23-5.14(m,4H),4.53-4.46(m,2H),4.38-4.25(m,4H),4.02-3.95 (m,2H),3.78-3.69(m,2H),2.63(s,6H),2.57-2.53(m,6H),2.39(s,3H).
步骤8：(8S)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e] 吲哚-6-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基4-硝基苯基碳酸酯(33)的合成。向32(99mg,0.11mmol)在6mL甲醇中的搅拌的溶液加入二氧六环中4M HCl(6.0 mL,20mmol)。将反应物在室温下搅拌约15分钟。将反应物浓缩，然后置于高真空下。在0℃下，向粗品物质在6mL二氯甲烷和6mLTHF中的搅拌的溶液加入对硝基苯基氯甲酸酯(38.6mg,0.192 mmol)，随后立即加入三乙胺(0.0742mL,0.532mmol)。将反应物在0℃下搅拌约5分钟，然后在搅拌下温热至室温。将反应物在室温下搅拌约10分钟。将反应物浓缩。向粗品物质在3mL二氯甲烷中的搅拌的溶液加入TFA(3.0mL,39mmol)在3mL二氯甲烷中的溶液，随后加入噻吩(0.109mL,1.06 mmol)。将反应物在室温下搅拌约6小时。将反应物浓缩。将粗品物质用数毫升DMSO稀释，然后注射入25gC18制备-柱(其之前用乙腈然后水平衡，各相中含0.02％TFA)。将物质通过中压反相C18 色谱法(梯度：含20％至65％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，使用genevac在适合的试管中浓缩，制备白色固体形式的33(37mg,40％,3步)。LC-MS(方案A):m/z 872.3[M+H]+,保留时间＝1.86 分钟.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ 8.44(s,1H),8.40-8.33(m,3H),7.78-7.72(m,2H),7.59(m,1H), 7.47(m,1H),4.53-4.44(m,2H),4.38-4.22(m,4H),4.04-3.94(m,2H),3.81-3.75(m,1H),3.72-3.65(m, 1H),2.62(s,6H),2.58(s,3H),2.54(s,3H).
N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-{4-[({甲基[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}-L-鸟氨酰胺(40) 的制备.
Figure BDA0001474068160000471
步骤1：N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21- 基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(36)的合成。向包含1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸的圆底烧瓶中加入34(628mg,1.45 mmol)、20mL二氯甲烷、2mL DMF、HATU(501mg,1.32mmol)和Hunig’s碱(0.92mL,5.3mmol)。将反应物在室温下搅拌2分钟，然后加入L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺,35(500mg,1.32mmol)。将反应物在室温下搅拌约90分钟，然后通过加入TFA猝灭。将反应物浓缩至较小体积，用数毫升DMSO稀释，然后注射入25g C18制备-柱(其之前用乙腈然后水平衡，各相中含0.02％TFA)。将物质通过中压反相C18色谱法(梯度：含5％至40％乙腈的水，各相中含0.02％ TFA)纯化，使用genevac在适合的试管中浓缩，制备剔透固体形式的36(514mg,49％)。LC-MS(方案A):m/z 795.5[M+H]+,保留时间＝1.01分钟.
步骤2：N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21- 基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(37)的合成。向36(210mg,0.264mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(161mg,0.528mmol)在4mL DMF中的搅拌的溶液加入Hunig’s碱(0.096mL,0.554mmol)。将反应物在室温下搅拌约2小时。将反应物注射入25g C18制备-柱(其之前用乙腈然后水平衡，各相中含0.02％TFA)。将物质通过中压反相C18色谱法(梯度：含5％至55％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，使用genevac在适合的试管中浓缩，制备固体形式的37(180mg,71％)。LC-MS(方案A):m/z 960.5[M+H]+,保留时间＝1.48分钟.
步骤3：N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21- 基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-[4-(4,7,10,10-四甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一碳-1- 基)苯基]-L-鸟氨酰胺(39)的合成。向37(640mg,0.667mmol)和38[如J.Med.Chem.1992,33,559-567 中所述制备](127mg,0.674mmol)在6mL DMA中的搅拌的溶液加入2,6-二甲基吡啶(0.154mL,1.33 mmol)，随后加入Hunig’碱(0.232mL,1.33mmol)和HOAT(9.1mg,0.67mmol)。将反应物在室温下搅拌约15分钟。将反应物注射入25g C18制备-柱(其之前用乙腈然后水平衡，各相中含0.02％TFA)。将物质通过中压反相C18色谱法(梯度：含5％至40％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，使用 genevac在适合的试管中浓缩，制备蜡样白色固体形式的39(564mg,84％)。LC-MS(方案A):m/z 1009.7[M+H]+,保留时间＝1.43分钟.
步骤4：N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21- 基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-{4-[({甲基[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}-L-鸟氨酰胺(40)的合成。向39(470mg,0.466mmol)在6mL二氯甲烷中的搅拌的混合物加入TFA(3.0mL, 40mmol)。将反应物在室温下搅拌约10分钟。将反应物浓缩。将残渣通过中压反相C18色谱法(梯度：含5％至30％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，使用genevac在适合的试管中浓缩，制备白色油/固体混合物形式的40(326mg,68％)。LC-MS(方案A):m/z 909.8[M+H]+,保留时间＝0.91分钟.
N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰氧基)-7,8- 二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(41)的制备.
Figure BDA0001474068160000481
步骤1：N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-21-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21- 基]-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺 (41)的合成。向包含33(8.0mg,0.0092mmol)和40(10.3mg,0.0101mmol)的2微量小瓶中加入1.0mL DMA，随后加入Hunig’s碱(0.00639mL,0.0367mmol)、2,6-二甲基吡啶(0.00425mL,0.0367mmol)和 HOAT(1.25mg,0.0367mmol)。将反应物在室温下搅拌约5分钟。将粗品反应物注射入4g C18制备-柱 (其之前用乙腈然后水平衡，各相中含0.02％TFA)。将物质通过中压反相C18色谱法(梯度：含15％至50％乙腈的水，各相中含0.02％TFA)纯化，然后通过方法A进行第二次纯化，使用genevac在适合的试管中浓缩，制备白色固体形式的41(8.9mg,59％)。LC-MS(方案A):m/z 1642.9[M+2H]+,保留时间＝1.61分钟.
LP的制备：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-23-异丙基-21,24-二氧代-26-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22,25-二氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢 -6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(49)
Figure BDA0001474068160000491
步骤1：5-氯-5-氧代戊酸叔丁酯(44)的合成：在0℃下，向5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(110mg,0.58 mmol)在THF(3mL)中的溶液加入草酰氯(0.58mL,1.2mmol,DCM中2M)，随后加入1滴DMF。将混合物在0℃下搅拌30min，并真空浓缩，以得到相应的白色固体形式的酰氯44。
步骤2.(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(叔丁氧羰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(43)的合成
向2(226mg,0.64mmol)在DCM(23mL)中的溶液加入4AMS(1.17g,粉末,<5micro,活化的)，并将混合物在室温下搅拌30min。向反应混合物中加入α-D-葡糖苷酸甲基酯2,3,4-三乙酸酯1-2,2,2- 三氯乙亚胺酯(42,367mg,0.77mmol)，并将混合物冷却至-25℃。缓慢加入BF3·Et2O(0.13mL,0.32 mmol)在DCM(10mL)中的溶液，并将混合物在低于-20℃下搅拌1h。将反应混合物过滤，并将溶液真空浓缩。将残渣通过硅胶色谱法(使用含0-60％EtOAc的庚烷的梯度)纯化，以得到黄色固体形式的产物43，261mg(61％)。
LC-MS(方案B):m/z 692.1(M+Na),保留时间＝1.09min.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝7.29(s, 1H),7.13(s,1H),5.40(br.s.,3H),4.30(d,J＝7.4Hz,2H),4.06-3.92(m,2H),3.85-3.73(m,4H),3.69(d, J＝10.5Hz,1H),3.36(t,J＝10.5Hz,1H),2.56(s,3H),2.10(s,6H),2.08(s,3H),1.62(s,9H).
步骤2.(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H- 噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(45)的合成
将43(261mg,0.39mmol)的溶液用二氧六环中4M HCl(3mL)处理1h。真空浓缩，并将残渣在 THF(3.0mL)中溶解，加入酰氯44(0.58mmol)在THF(3.0mL)中的溶液，随后加入TEA(0.163mL,1.2 mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min。将混合物浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(施用含EtOAc (0-70％)的庚烷的梯度)纯化，以得到灰白色固体形式的产物224mg(78％)。LC-MS(方案B):m/z 740.2 [M+H]+,保留时间＝1.07分钟.1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.26(br.s.,1H),7.13(s,1H),5.45-5.25 (m,4H),4.32(d,J＝9.0Hz,2H),4.12(t,J＝8.8Hz,1H),4.05(d,J＝8.6Hz,1H),3.79-3.66(m,5H),3.33(t, J＝10.9Hz,1H),2.63(d,J＝7.0Hz,1H),2.58-2.47(m,4H),2.45-2.35(m,2H),2.06(m,11H),1.47(s, 9H).
步骤3.(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(甲氧基羰基) 四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(46)的合成
将45(116mg,0.16mmol)的溶液用DCM(1.5mL)和TFA(1mL)在室温下处理1h，真空浓缩，并在0℃下，将残渣在THF中溶解，加入草酰氯(0.16mL,0.32mmol,DCM中2M)和DMF(1滴)。将混合物在0℃下搅拌30min，并真空浓缩，以得到相应的酰氯。
在单独的小瓶中，将化合物2(83mg,0.24mmol)用二氧六环中4M HCl(2mL)在室温下处理1h，并真空浓缩，将残渣在0℃下于THF(5mL)中溶解，并加入Et3N(100uL,0.78mmol)，随后加入上述酰氯在THF(5mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌20min。将混合物浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(使用含EtOAc(0-100％)的庚烷的梯度)纯化，以得到灰白色固体形式的产物46，114mg(79％)。 LC-MS(方案B):m/z 919.1[M+H]+,保留时间＝1.05分钟,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.41(s, 1H),8.22(s,1H),7.93(s,1H),7.47(s,1H),7.38(s,1H),5.81-5.70(m,4H),5.63-5.52(m,1H),5.19(t, J＝8.6Hz,1H),5.12(t,J＝9.8Hz,1H),4.76(d,J＝9.8Hz,1H),4.30-4.16(m,3H),3.86(m,2H),3.68(s, 3H),3.64-3.51(m,2H),2.73(br.s.,1H),2.62(m,2H),2.50(s,6H),2.10-2.02(m,12H).
步骤4.(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基) 氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8- 二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(47)的合成：在0℃下，向46(50mg,0.054mmol)在THF(3mL)中的溶液加入4-硝基苯基氯甲酸酯(22mg, 0.10mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液，随后加入DIPEA(57uL,0.33mmol)，并将混合物在0℃下搅拌1h。向上述混合物中加入38[如J.Med.Chem.1992,33,559-567中所述制备](31mg,0.16mmol) 在THF(0.5mL)中的溶液，并将混合物在0℃下搅拌30min，并真空浓缩，将残渣通过硅胶色谱法(使用含EtOAc(0-100％)的庚烷的梯度)纯化，以得到白色固体形式的产物47，56mg(91％)。LC-MS(方案B):m/z 1150.2[M+NH4],保留时间＝1.14分钟。
步骤5.(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基) 氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8- 二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(48)的合成：在0℃下，向 47(56mg,0.049mmol)在THF/MeOH(1/1,6mL)中的溶液加入LiOH·H2O(21mg,0.49mmol)在水(0.5 mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌1h。加入乙酸(50mg)，并将反应物真空浓缩，以得到白色固体形式的粗品产物48，45mg(90％)。LC-MS(方案B):m/z 1014.9[M+Na],保留时间＝1.0分钟。
步骤6：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-23-异丙基-21,24-二氧代-26-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22,25- 二氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(49)和(8S)-8-(氯甲基)-6-{5-[(8S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8- 二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基]-5-氧代戊酰基}-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基β-D-吡喃葡糖苷酸(57)的合成：将化合物48(23mg,0.02mmol)用预冷却的TFA(1mL)在0℃下处理5min，并真空浓缩。将残渣在DMF(2mL)中溶解，并加入化合物37(19mg,0.02mmol)、二甲基吡啶(14uL, 0.12mmol)、DIPEA(21uL,0.12mmol)和HOAt(2.7mg,0.02mmol)。将混合物在30℃下搅拌1h。将混合物通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到灰白色固体形式的化合物49，8mg(20％)(LC-MS(方案B):m/z 1714.6[M+H]+,保留时间＝0.89分钟)以及胶状物形式的化合物57，7mg(50％):LC-MS (方案B):m/z 779.1[M+H]+,保留时间＝0.90分钟。
(S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6- 基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基(4-((23S,26S)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-23-异丙基-21,24-二氧代-26-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22,25-二氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(56)的制备
Figure BDA0001474068160000511
步骤1：5-氯-5-氧代戊酸甲酯(51)的合成：将5-甲氧基-5-氧代戊酸(128mg,0.88mmol,)在0℃下于THF(5mL)中溶解，并加入草酰氯(0.9mL,1.8mmol,DCM中2M)和DMF(1滴)，将混合物在0℃下搅拌30min.，真空浓缩，以得到白色固体形式的相应的酰氯51，将其在未进一步纯化下使用。
步骤2.(S)-4-((双(苄氧基)磷酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(50)的合成
向2(260mg,0.74mmol)在ACN(8mL)和THF(8mL)中的溶液加入CCl4(1mL)、DIPEA(0.52 mL,2.94mmol)、二苄基亚磷酸酯(1.03mL,4.41mmol)和DMAP(18mg)。将混合物在室温下搅拌在 15min，真空浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(使用含(0-60％)EtOAc的庚烷的梯度)纯化，以得到无色油形式的产物50，365mg(81％)。LC-MS(方案B):m/z 631.2[M+H]+,保留时间＝1.18分钟。
步骤3.(S)-5-(4-((双(苄氧基)磷酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6- 基)-5-氧代戊酸甲酯(52)的合成
向50(365mg,0.58mmol)在DCM(3mL)中的溶液加入TFA(3mL)，并将混合物在室温下搅拌2 min，并真空浓缩。将残渣在THF(5.0mL)中溶解，并加入酰氯51(0.88mmol)在THF(5.0mL)中的溶液，随后加入Et3N(0.37mL,0.24mmol)，并将混合物在0℃下搅拌30min。将反应物浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(含(0-80％)EtOAc的庚烷的梯度)纯化，以得到无色油形式的产物52，240mg (64％)。LC-MS(方案B):m/z 642.1[M+H]+,保留时间＝1.09分钟。
步骤4.(S)-5-(4-((双(苄氧基)磷酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6- 基)-5-氧代戊酸(53)的合成
在0℃下，向52(235mg,0.37mmol)在THF(10mL)中的溶液加入LiOH/H2O(155mg,3.7mmol) 在水(2.5mL)中的溶液，并将混合物在0℃下搅拌1.5h。将混合物用DCM稀释，通过1M HCl酸化，并将有机层分离，将水相用DCM萃取两次。将合并的有机相用MgSO4干燥。将混合物真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到灰白色泡沫形式的产物53，27mg(12％)。LC-MS(方案B):m/z 628.1[M+H]+,保留时间＝1.01分钟。
步骤5.二苄基((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)磷酸酯(54)的合成
在0℃下，向53(27mg,0.043mmol)在THF(5mL)中的溶液加入草酰氯(0.043mL,0.086mmol, DCM中2M)和DMF(1滴)。将混合物在0℃下搅拌30min，并真空浓缩，以得到相应的黄色泡沫形式的酰氯。
在单独的小瓶中，将化合物2(23mg,0.064mmol)用4M HCl(1mL)在室温下处理1h，并真空浓缩。将残渣在THF(5mL)中溶解，冷却至0℃，并加入上述酰氯在THF(5mL)和Et3N(0.018mL,0.13 mmol)中的溶液。将混合物真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到灰白色固体形式的产物54，28mg(75％)。LC-MS(方案B):m/z 863.2[M+H]+,保留时间＝1.16分钟。
步骤6.(S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基(4-硝基苯基)碳酸酯(55)和 (8S)-8-(氯甲基)-6-{5-[(8S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基]-5-氧代戊酰基}-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基磷酸二氢酯(61)的合成
在0℃下，向54(40mg,0.046mmol)在THF(5mL)中的溶液加入4-硝基苯基氯甲酸酯(19.4mg, 0.092mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液和DIPEA(0.049mL,0.28mmol)。将混合物在0℃下搅拌30 min。将反应物真空浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(使用含(0-60％)丙酮的庚烷的梯度)纯化，以得到白色固体形式的中间体PNP碳酸酯48mg。将其在DCM(2mL)中溶解，并加入TFA(2mL)和噻吩 (0.047mL,0.46mmol)，将混合物在室温下搅拌3h。将反应物真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到白色固体形式的17.8mg(46％)产物55(17.8mg,46％)。LC-MS(方案B):m/z 848.2 [M+H]+,保留时间＝1.09分钟，以及5.2mg(17％)胶状物形式的产物61，LC-MS(方案B):m/z 683.2 [M+H]+,保留时间＝0.93分钟。
步骤7.(S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基(4-((23S,26S)-1-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)-23-异丙基-21,24-二氧代-26-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22,25-二氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(56)的合成
向55(10.5mg,0.012mmol)在DMF(1mL)中的溶液加入40(13.9mg,0.014mmol)、二甲基吡啶 (0.009mL,0.074mmol)、DIPEA(0.013mL,0.074mmol)和HOAt(1.7mg,0.012mmol)。将混合物在室温下搅拌20分钟，真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到白色泡沫形式的产物 56，12mg(60％)。LC-MS(方案B):m/z 1619.6[M+2H]+,保留时间＝0.95分钟
戊环[4.2.0.0～2,5～.0～3,8～.0～4,7～]辛烷-1,4-二基双[羰基(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并 [3,2-e]吲哚-6,4-二基]二乙酸酯(60)的制备
Figure BDA0001474068160000521
步骤1：戊环[4.2.0.0～2,5～.0～3,8～.0～4,7～]辛烷-1,4-二基双[羰基(8S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H- 噻吩并[3,2-e]吲哚-6,4-二基]二乙酸酯(60)的合成：将3(47mg,0.12mmol)的溶液用4M HCl(二氧六环中1.5mL)在室温下处理90min，并真空浓缩，且将残渣在DCM(4mL)和TEA(0.025mL)中溶解，并加入至1,4-立方烷二羧酸(11.5mg,0.06mmol,72)溶解于1mL无水二氯甲烷中的溶液，随后加入 HATU(47mg,0.12mmol)。将反应物在室温下搅拌16h。将混合物通过反相HPLC柱纯化： (Phenomenex Column Luna C18 5u150x21.5mm,梯度20％-90％AcCN/水(在各相中含0.02％AcOH) 历时20min(加上初始6分钟在20％AcCN/水下的等度时间)，以得到3.1mg 60(白色固体,7％)。 LC-MS(方案A):m/z:747.1(M+H)+,保留时间＝2.39min。
(S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H- 噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基磷酸二氢酯(62)的制备
Figure BDA0001474068160000531
步骤1：(S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚(63)的合成：在0℃下，向化合物1(300mg,0.676mmol)在干燥DCM(5mL)中的搅拌的溶液滴加EtOAc中的4.0M HCl(5 mL)。加入后，将混合物在室温下搅拌1.5h。将混合物真空浓缩，然后与DCM共蒸发一次，以得到产物63(260mg,100％)，并将其以此在在下一步中使用。
步骤2：(S)-5-(4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酸叔丁酯(63)的合成
在包含(S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(1)(500 mg,1.13mmol)的圆底烧瓶中加入DCM中25％TFA(10mL)。将反应物搅拌30分钟。将反应物浓缩，并置于真空下30分钟，以得到脱boc残渣63，将其在5mL DCM中溶解，并在下一步骤中使用。
在用N2吹扫的，包含5mL无水DCM中的5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(212mg,1.13mmol))的圆底烧瓶中加入草酰氯(0.101mL,1.13mmol)。向该溶液中加入1滴DMF，并将体系搅拌3小时。注意到立即形成气体。将反应物真空浓缩，以得到粗品酰氯44，将其在DCM中溶解，并加入至包含上述脱保护残渣63和TEA(0.144mL)的圆底烧瓶中。将反应物在室温下搅拌2小时。将粗品反应混合物真空浓缩，并在25mL DCM中溶解，转移至分液漏斗中。用1MHCl(3x)、水(3x)和盐水(2x)洗涤有机层。用硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩滤液以得到粗品固体。将粗品产物通过硅胶色谱法(梯度：含0％至10％MeOH的DCM)纯化，以得到黄色固体形式的64(525mg,90％)。LC-MS(方案A):m/z 514 [M+H]+,保留时间＝2.43分钟.
步骤3：(S)-5-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e] 吲哚-3-羧酸叔丁酯(66)的合成.
向圆底烧瓶中的15mL DCM中的叔丁基(S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(1000mg,3.0mmol,65)(如WO 2015023355中所述制备)加入(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-氯-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(991mg,3.0mmol，随后加入1.2mLHunigs碱。将反应物搅拌1小时，并浓缩为粗品玻璃状物质。将粗品反应混合物通过硅胶色谱法(梯度：含0％至10％MeOH的DCM)纯化，以得到白色固体形式的66(1529mg,80％)。LC-MS(方案A):m/z 626[M+H]+,保留时间＝2.32分钟.
步骤4：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并 [3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(67)的合成.
向(S)-5-(4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酸叔丁酯 (500mg,0.973mmol,64)在10mL DCM中的搅拌的溶液加入2.5mLTFA，并将反应物搅拌3小时。在反应完成后，将反应物真空浓缩为淡白色固体。然后将固体在5mL无水DCM和草酰氯(0.32mL, 0.93mmol)中溶解。将反应物搅拌3小时，并真空浓缩为白色固体。将(S)-5-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(0.973mmol,66)在含 25％TFA的DCM(5mL)中溶解，并搅拌30min。将反应物真空浓缩，并放回入5mL DCM中。加入Hunigs碱(0.32mL)，随后加入之前所述酰氯。将反应物搅拌2小时。反应完成后，将反应混合物真空浓缩。将粗品产物通过硅胶色谱法(梯度：含0％至10％MeOH的DCM)纯化，以得到白色固体形式的67(510mg,54％)。％)。LC-MS(方案A):m/z 965[M+H]+,保留时间＝2.61分钟.
步骤5：((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚 -6-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1- 氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(68)的合成.
向(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e] 吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(500mg,0.518mmol,67)在5mL DCM中的搅拌的溶液加入5mL二乙胺。将反应物搅拌3小时，并真空浓缩为黄色固体。将黄色粗品固体在10mL无水THF中溶解，随后加入2,5-二氧代吡咯烷-1- 基(叔丁氧羰基)-L-缬氨酸酯(163mg,0.518mmol)，随后加入TEA(0.2mL)。将反应物在70摄氏度下搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物真空浓缩。将粗品产物通过硅胶色谱法(梯度：含0％至10％ MeOH的DCM)纯化，以得到白色固体形式的68(198mg,40％)。LC-MS(方案A):m/z 942[M+H]+,保留时间＝2.49分钟.
步骤6：((S)-1-(((S)-1-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并 [3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1- 氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(69)的合成.
将((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6- 基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(325mg,0.345mmol,68)在7mL THF中的搅拌的溶液在氮气下使用冰浴冷却至0℃。然后加入10wt.％钯/活性碳(10mg)，随后缓慢滴加0.5mL水中的25％甲酸铵。将反应物在0℃下搅拌1小时。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并将滤液真空浓缩。将粗品产物通过硅胶色谱法(梯度：含0％至10％MeOH的DCM)纯化，以得到黄色固体形式的69(181mg, 61％)。LC-MS(方案A):m/z 852[M+H]+,保留时间＝2.18分钟.
步骤7：((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-((双(苄氧基)磷酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H- 噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2- 基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯酯(70)的合成.
向((S)-1-(((S)-1-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁 -2-基)氨基甲酸叔丁酯(165mg,0.193mmol,69)在10mL THF和10mL AcCN中的搅拌的溶液加入四氯化碳(2.04mL,21.0mmol)，随后加入Huenig’碱(1.12mL,6.45mmol)、二苄基亚磷酸酯(320mg,1.16 mmol)和DMAP(催化)。将反应物在室温下搅拌20分钟。将反应物浓缩为粗品玻璃状物质。将粗品反应混合物通过硅胶色谱法(梯度：含0％至10％MeOH的DCM)纯化，以得到白色玻璃状物质的70 (51mg,24％)。LC-MS(方案A):m/z 1113[M-H]-,保留时间＝2.50分钟.
步骤8：(S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢 -6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基磷酸二氢酯(62)的合成.
在装备有搅拌棒的圆底烧瓶中，将((S)-1-(((S)-1-(((S)-3-(5-((S)-4-((双(苄氧基)磷酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(40mg 0.036mmol,70)在5 mL DCM中溶解。加入TFA(2.5mL)和2滴噻吩，并将反应物搅拌6小时。将粗品物质真空浓缩。将粗品残渣在3mLDMF中溶解，并加入五氟苯基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(71)(13.6mg,0.036mmol)，随后加入TEA(0.036mmol)。将反应物搅拌1小时。将反应物真空浓缩，并通过HPLC方法纯化，以得到白色固体形式的62(25mg,68％)，保留时间＝7.115分钟。LC-MS(方案A):m/z 1025[M+H]+,保留时间＝2.01分钟
N～2～-乙酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基-N-{4-[({甲基[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}-L-鸟氨酰胺(74)的制备：
Figure BDA0001474068160000551
步骤1：N～2～-乙酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基 -N-[4-(4,7,10,10-四甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一碳-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(72A)的合成：在0℃于N2气球下，向N～2～-乙酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～- 氨基甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(72)(如US 9169264中所述制备)(1.00g,1.07mmol)在DMF(20mL)中的搅拌的溶液加入38[如J.Med.Chem.1992,33,559-567中所述制备](241mg,1.28mmol)。将所得的混合物在0℃下搅拌30分钟。将混合物倒入TBME(200mL)中。将所得的白色悬浮液过滤，并用TBME(200mL)洗涤，以得到黄色固体形式的标题化合物72A (750mg,71.3％)。
步骤2：N～2～-乙酰基-N～6～-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰基 -N-{4-[({甲基[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}-L-鸟氨酰胺(74)的合成：在0℃下，向化合物72A(10.00g,10.1mmol)在DCM(60.0mL)中的搅拌的悬浮液加入TFA(50.0mL)。将所得的溶液在0℃下搅拌40分钟。将所得的悬浮液过滤。将滤饼用TBME(200mL)洗涤，并真空干燥至干燥，以得到粗品产物。将粗品产物通过制备-HPLC(柱：Phenomenex Synergi Max-RP 250X50mm,10um, 梯度：含25％至55％乙腈的水，在各相中含0.1％TFA，历时17.5min，并且在含100％乙腈的水(包含0.1％TFA)下保持8min,流速:80mL/min)纯化，以得到白色固体形式的标题化合物74(5.2g, 51.3％收率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)10.03(s,1H),8.47(br.s.,2H),8.10(d,J＝7.0Hz,1H),8.03(d,J＝7.8 Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.69(d,J＝7.3Hz,3H),7.60(d,J＝8.5Hz,2H),7.45-7.38(m,2H),7.36 -7.29(m,4H),7.26(t,J＝5.4Hz,1H),6.02(br.s.,1H),5.01(s,2H),4.43-4.33(m,1H),4.32-4.16(m,5H), 3.49(t,J＝6.0Hz,2H),3.06-2.92(m.,6H)2.86(s,3H),2.62-2.53(m,3H),1.99(dd,J＝6.5,13.3Hz,1H), 1.85(s,3H),1.76-1.27(m,10H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H)
LP的制备：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-6-氨基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(76)
Figure BDA0001474068160000561
步骤1：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(((4-硝基苯氧基)羰基) 氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4- 基)氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(73)的合成
在0℃下，向46(120mg,0.13mmol)在THF(5mL)中的溶液加入4-硝基苯基氯甲酸酯(55mg, 0.26mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液，随后加入Et3N(109uL,0.78mmol)，并将混合物在0℃下搅拌30min。将混合物真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到白色固体形式的产物 73，109mg(77％)。LC-MS(方案B):m/z 1086.5(m+H),保留时间＝1.24min
步骤2：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((9S,12S,15S)-9-乙酰胺基-1-(9H-芴-9- 基)-12-异丙基-3,10,13-三氧代-15-(3-脲基丙基)-2-氧杂-4,11,14-三氮杂十六烷-16-酰胺基)苄基)氧基) 羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6- 基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢 -2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(75)的合成
将化合物73(50mg,0.046mmol)在DMF(2mL)中溶解，并向其中加入4-((9S,12S,15S)-9-乙酰胺基-1-(9H-芴-9-基)-12-异丙基-3,10,13-三氧代-15-(3-脲基丙基)-2-氧杂-4,11,14-三氮杂十六烷-16-酰胺基)苄基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(74,55mg,0.055mmol)、二甲基吡啶(0.021mL,0.18 mmol)、DIPEA(0.032mL,0.18mmol)和HOAt(6mg,0.046mmol)。将混合物在rt下搅拌1h。将混合物真空浓缩，并将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以在冻干后得到白色粉末形式的产物75， 72mg(85％)。LC-MS(方案B):m/z1833.3(M+H)，保留时间＝1.17min.1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ＝10.02(br.s.,1H),8.22(s,1H),8.19-8.13(m,1H),8.10(d,J＝6.6Hz,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),7.89 (d,J＝7.4Hz,2H),7.69(d,J＝7.0Hz,3H),7.57(d,J＝7.0Hz,2H),7.54-7.38(m,5H),7.37-7.30(m,3H), 7.26(br.s.,3H),5.99(br.s.,1H),5.74(d,J＝7.0Hz,1H),5.64-5.49(m,1H),5.20(t,J＝8.8Hz,1H),5.13 (t,J＝9.6Hz,1H),5.04(br.s.,1H),5.00(br.s.,1H),4.81-4.70(m,1H),4.39(br.s.,2H),4.32-4.11(m, 14H),3.95-3.80(m,3H),3.62(br.s.,1H),3.56(br.s.,1H),3.48(br.s.,2H),3.12(br.s.,1H),3.03(br.s., 2H),3.00-2.91(m,6H),2.88(br.s.,3H),2.82-2.67(m,4H),2.67-2.55(m,7H),2.10(s,1H),2.08-1.91 (m,14H),1.85(s,3H),1.79-1.64(m,2H),1.61(br.s.,2H),1.54-1.32(m,5H),1.31-1.23(m,2H),1.23 -1.12(m,2H),0.84(d,J＝6.6Hz,3H),0.87(d,J＝6.6Hz,3H).
步骤3.LP的制备：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-6- 氨基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基 -7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(76)
将化合物75(44mg,0.024mmol)在DMF(1mL)和THF(5mL)以及MeOH(1mL)中溶解，冷却至0℃，加入LiOH·H2O(10mg,0.24mmol)，并将混合物在0℃下搅拌60min。将混合物通过加入 HOAc(30uL)酸化，并真空浓缩。将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到25.0mg(66％)白色粉末形式的产物76。
LC-MS(方案B):m/z 1471.1(M+2H)+，保留时间＝0.75min.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝ 8.09(br.s.,2H),7.97(d,J＝8.1Hz,1H),7.68(br.s.,2H),7.48(d,J＝7.6Hz,1H),7.44-7.39(m,1H),7.39 -7.31(m,2H),7.22-7.12(m,1H),5.97(br.s.,1H),5.45-5.32(m,2H),5.18(br.s.,1H),5.06(d,J＝5.6Hz, 1H),4.98(br.s.,1H),4.92(br.s.,1H),4.31(br.s.,1H),4.26-4.05(m,8H),3.82(d,J＝10.0Hz,1H),3.76 (d,J＝10.5Hz,1H),3.70(d,J＝7.6Hz,1H),3.66-3.57(m,1H),3.57-3.44(m,5H),3.43-3.36(m,2H), 3.36-3.28(m,3H),3.12-3.07(m,2H),3.05(br.s.,1H),3.00-2.91(m,2H),2.88(d,J＝9.8Hz,3H),2.80(s, 2H),2.72-2.59(m,4H),2.59-2.37(m,22H),2.02(s,2H),1.97-1.83(m,3H),1.78(s,3H),1.69(td,J＝3.2, 6.4Hz,2H),1.66-1.48(m,3H),1.47-1.32(m,4H),1.32-1.14(m,4H),0.76(d,J＝6.4Hz,3H),0.79(d, J＝5.9Hz,3H).
4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-6-氨基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基 ((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e] 吲哚-4-基)乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(77)的制备
Figure BDA0001474068160000571
Figure BDA0001474068160000581
步骤1.(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(((S)-6-(叔丁氧羰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢 -6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(78)的合成
将化合物2(300mg,0.85mmol)在DCM(30mL)中溶解，并加入4A MS(1.5g,粉末状,<5micro, 活化的)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。向反应混合物中加入α-D-半乳潘糖(galactopanose)、 2,3,4,6-四乙酸酯1-2,2,2-三氯乙亚胺酯(449mg,93％,0.85mmol)，并将混合物冷却至-15℃，且缓慢加入BF3·Et2O(0.052mL,0.42mmol)在DCM(5mL)中的溶液，并将反应混合物在-15℃-20℃下搅拌1 h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用丙酮洗涤，浓缩，以得到残渣。将残渣用MeOH处理，并真空浓缩，以得到灰白色固体形式的580mg(100％)产物78。
LC-MS(方案B):m/z:706.4(M+Na)，保留时间＝1.09min.
步骤2.(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e] 吲哚-4-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(79)的合成
将化合物78(580mg,0.85mmol)用二氧六环中4M HCl(5mL)处理30min，并将混合物真空浓缩，以得到绿色固体形式的粗品产物79，将其在未进一步纯化下稀释。
LC-MS(方案B):m/z 584.3(M+H),保留时间＝0.94min.1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ＝7.53 (s,1H),7.22(s,1H),5.57-5.46(m,3H),5.34(dd,J＝2.0,9.0Hz,1H),4.53(d,J＝6.6Hz,2H),4.42(t,J＝6.4 Hz,1H),4.25(dt,J＝6.4,11.2Hz,2H),4.18-4.01(m,5H),3.74(dd,J＝8.6,11.7Hz,2H),3.69(s,14H), 2.68-2.58(m,4H),2.23(s,3H),2.19-2.14(m,2H),2.14-2.07(m,7H),2.07-1.94(m,6H),1.33(s,3H).
步骤3.(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(((S)-6-(5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1- 甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(80)的合成
将5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(44,191mg,1.02mmol)在THF(10mL)中的溶液冷却至0℃，并加入草酰氯(1.02mL,DCM中2M)，随后加入1滴DMF。将混合物在0℃下搅拌30min，并真空浓缩，以得到相应的蜡形式的酰氯。将其在THF(10mL)中溶解，并加入至79(526mg,0.85mmol)在THF(10 mL)中的溶液，随后加入Et3N(0.354mL,2.54mmol)。将混合物在0℃下搅拌30min。将混合物浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(使用含0％至70％乙酸乙酯的庚烷的梯度)纯化，以得到448mg(70％) 灰白色固体形式的产物80。
LC-MS(方案B):m/z 754.4(M+H),保留时间＝1.06min.
步骤4.(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-羟基-1-甲基 -7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(84)的合成
将化合物80(448mg,0.59mmol)的溶液用DCM(3mL)和TFA(2mL)在室温下处理1h，并将混合物真空浓缩，以得到绿色固体形式的游离酸81(212mg)。将酸81(167mg,0.24mmol)在THF(5mL) 中溶解，并将溶液冷却至0℃，加入草酰氯(0.24mL,DCM中2M)，随后加入DMF(1滴)。将混合物在0℃下搅拌30min，并真空浓缩，以得到相应的酰氯82，将其在未进一步纯化下于下一步中使用。
将化合物2(102mg,0.28mmol)和4M HCl(2mL)在二氧六环中的溶液在室温下搅拌1h，并将混合物真空浓缩，以得到绿色固体形式的化合物83，将其在THF(5mL)中溶解，并冷却至0℃。加入 TEA(0.2mL,1.44mmol)，随后加入粗品酰氯82在THF(5mL)中的溶液，并将混合物在0℃下搅拌 20min。将混合物浓缩，并将残渣通过硅胶色谱法(使用含0％至70％丙酮的庚烷的梯度)纯化，以得到196mg(88％)黄色固体形式的产物84。
LC-MS(方案B):m/z 933.5(M+H),保留时间＝1.05min.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.26 (s,1H),7.94(s,1H),7.46(s,1H),7.39(s,1H),5.51(d,J＝7.8Hz,1H),5.42-5.26(m,3H),4.59-4.46(m, 1H),4.33-4.23(m,2H),4.23-4.15(m,4H),4.15-4.07(m,2H),4.04(s,4H),3.87(dd,J＝10.5,18.0Hz, 2H),3.67(t,J＝9.8Hz,1H),3.57(t,J＝10.1Hz,1H),3.33(s,1H),3.31(s,1H),2.83-2.67(m,2H),2.60(dd, J＝6.4,16.2Hz,3H),2.19(s,3H),2.15-2.09(m,4H),2.07(s,4H),1.97(s,6H).
步骤5：(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(((4- 硝基苯氧基)羰基)氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(85)的合成
在0℃下，向84(100mg,0.107mmol)在THF(5mL)中的溶液加入4-硝基苯基氯甲酸酯(45mg, 0.21mmol)，随后加入Et3N(0.060mL,0.43mmol)。将混合物在0℃下搅拌60min。将混合物真空浓缩，以得到黄色泡沫形式的粗品产物142mg，将其通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到50mg(43％) 灰白色固体形式的产物85。LC-MS(方案B):m/z 1098.5(M+H),保留时间＝1.05min.
步骤6：(2S,3R,4S,5S,6R)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((9S,12S,15S)-9-乙酰胺基-1-(9H-芴-9- 基)-12-异丙基-3,10,13-三氧代-15-(3-脲基丙基)-2-氧杂-4,11,14-三氮杂十六烷-16-酰胺基)苄基)氧基) 羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6- 基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(86)的合成：向85(50mg,0.045mmol)在DMF(2mL)中的溶液加入4-((9S,12S,15S)-9-乙酰胺基-1-(9H-芴-9-基)-12-异丙基-3,10,13-三氧代-15-(3-脲基丙基)-2-氧杂 -4,11,14-三氮杂十六烷-16-酰胺基)苄基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(74 45mg,0.045mmol)和 DIPEA(0.024mL,0.136mmol)。将混合物在室温下搅拌60min，并使用反相HPLC(方法C)纯化，以得到26mg(31％)白色固体形式的产物86：LC-MS(方案B):m/z 1847.1(M+H),保留时间＝1.06 min.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.01(br.s.,1H),8.25(s,1H),8.20-8.12(m,1H),8.09(d,J＝6.6 Hz,1H),8.02(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.69(d,J＝7.0Hz,3H),7.57(d,J＝7.4Hz,2H), 7.47-7.37(m,4H),7.37-7.30(m,3H),7.26(br.s.,3H),5.98(br.s.,1H),5.50(d,J＝7.0Hz,1H),5.46 -5.27(m,5H),5.02(d,J＝19.1Hz,2H),4.52(br.s.,1H),4.39(br.s.,1H),4.32-4.14(m,13H),4.14-4.03 (m,1H),3.95-3.81(m,2H),3.75-3.59(m,6H),3.56(br.s.,2H),3.48(br.s.,2H),3.12(br.s.,1H),3.03 (br.s.,2H),2.94(s,3H),2.97(s,2H),2.87(br.s.,2H),2.83-2.67(m,3H),2.66-2.54(m,7H),2.19(s,4H), 2.12(s,3H),2.09-2.03(m,4H),2.03-1.90(m,7H),1.85(s,3H),1.78(t,J＝6.4Hz,1H),1.68(d,J＝7.8Hz, 1H),1.61(br.s.,2H),1.53-1.33(m,5H),1.32-1.18(m,2H),0.84(d,J＝7.0Hz,3H),0.87(d,J＝6.6Hz, 3H).
步骤7.LP的合成：4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-6-氨基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基) 四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(77)：在0℃下，向86(24mg,0.013mmol)在 THF(2mL)和MeOH(2mL)中的溶液加入LiOH(1M,0.26mL,0.26mmol)在水中的溶液，并将混合物在0℃至室温下搅拌2h。加入乙酸(20uL)，并将混合物浓缩，且将残渣通过反相HPLC(方法C)纯化，以得到14mg(69％)白色泡沫形式的产物77：LC-MS(方案B):m/z 1456.9(M+2H)+,保留时间＝0.75min.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝10.07-9.96(m,1H),8.29-8.18(m,1H),8.18-8.09(m, 2H),8.06(d,J＝8.1Hz,1H),7.73(d,J＝8.6Hz,1H),7.66(br.s.,3H),7.56(d,J＝7.8Hz,2H),7.50(d,J＝9.3 Hz,1H),7.47-7.39(m,2H),7.35(d,J＝7.6Hz,1H),7.32-7.25(m,2H),6.04(br.s.,1H),5.11(d,J＝6.4Hz, 1H),5.05(br.s.,1H),5.01(br.s.,1H),4.40(br.s.,1H),4.36-4.16(m,10H),4.10(d,J＝11.7Hz,3H),4.00 (br.s.,3H),3.96-3.80(m,10H),3.77(br.s.,4H),3.73-3.55(m,11H),3.52(br.s.,1H),3.48(br.s.,3H), 3.12(br.s.,1H),3.05(br.s.,2H),3.01-2.91(m,4H),2.88(br.s.,2H),2.86-2.72(m,4H),2.72-2.53(m, 13H),2.45(t,J＝7.5Hz,1H),2.06-1.92(m,3H),1.86(s,4H),1.71-1.56(m,3H),1.56-1.42(m,4H),1.42 -1.23(m,4H),0.85(dd,J＝6.6,14.7Hz,6H).
4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基甲基 (2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(96)的制备
Figure BDA0001474068160000601
步骤1.2,5-二氧代吡咯烷-1-基(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸酯(88)的合成
在冰浴下，向化合物87(150g,0.442mol)和HOSu(56g,0.487mol)在THF(1800mL)中的溶液分批加入DCC(100g,0.487mol)。加入后，将反应物在室温下搅拌过夜。将反应物冷却至-5℃，过滤，并用冷THF洗涤，将滤液真空浓缩，并将残渣由MTBE重结晶，以得到白色固体形式的化合物88， 175g(91％)
步骤2.(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(90)的合成
在冰浴下，向化合物89(40.14g,0.229mol)和NaHCO3(19.23g,0.229mol)在水(750mL)中的溶液滴加化合物88(100g,0.229mol)在DME(750mL)中的溶液。在加入期间形成白色悬浮液。加入另外的THF(400mL)以改善溶解度。加入后，将溶液在25-30℃下搅拌2天。向反应物中加入饱和 K2CO3水溶液，以调节pH至8-9，然后用EtOAc(500mL×5)萃取。将水层用柠檬酸水溶液调节pH 至3-4。形成凝胶状物质，并将其过滤。将湿饼在THF(1.5L)中溶解。加入甲醇，直至固体溶解。将溶液真空浓缩以移除30％溶剂，然后冷却至室温。向溶液中加入TBME(2L)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，然后将湿饼真空干燥，以得到白色固体形式的化合物90，60g(53％)。
步骤3.(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(92)的合成
向化合物90(70g,0.141mol)在DCM/MeOH(1L/500mL)中的悬浮液加入化合物91(34.7g, 0.282mol)，随后加入EEDQ(69.7g,0.282mol)。将混合物在40℃下搅拌过夜。将反应混合物过滤，并将湿饼在EtOAc/TBME(500mL/200mL)中悬浮，并搅拌30分钟，然后过滤。将固体用EtOAc/TBME 洗涤，以提供灰白色固体形式的化合物92，65g(77％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.98(s,1H), 8.11(d,1H),7.87(d,2H),7.77(m,2H),7.52(d,2H),7.39(m,3H),7.30(m,2H),7.21(d,2H),5.97(m, 1H),5.41(s,2H),5.10(m,1H),4.42(m,3H),4.22(m,3H),3.90(m,1H),2.93(m,2H),1.98(m,1H),1.50 (m,2H),1.30(m,2H),0.84(m,6H).
步骤4.(9H-芴-9-基)甲基((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(94)的合成
在0℃下，向(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(3.74g,8.31mmol,92)在无水DMF(120mL)中的溶液分批加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.78g,12.4mmol,93)，随后滴加DIPEA(1.21g,9.32mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC(MeOH:CH2Cl2＝1:10)表明反应完成。将反应混合物在搅拌下滴加至MTBE (2.5L)。将粗品产物通过过滤收集。将滤饼用MTBE洗涤，并在高真空下干燥，以得到褐色固体形式的化合物94，2.7g(57％)。
步骤5.4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基叔丁基乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(95)的合成
在0℃下，向化合物94(1.7g,2.217mmol)在DMA(15mL)中的溶液加入HOAT(332mg,2.44 mmol)、2,6-二甲基吡啶(950mg,8.87mmol)。将混合物在0℃下搅拌5分钟。然后在0℃下，将叔丁基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(38,459mg,2.44mmol)加入至所述混合物，随后在0℃下加入DIPEA(860mg,6.65mmol)。将混合物在室温下搅拌1h，然后倒入TBME(800mL)，并搅拌30 分钟，过滤，并将滤饼真空浓缩，以得到黄色固体形式的粗品产物(1.06g)。将粗品产物通过硅胶色谱法(梯度：DCM:MeOH＝100:1-10:1)纯化，以得到白色固体形式的产物95，600mg(33％)。
步骤6.4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(96)的合成
在0℃下，向化合物95(600mg,0.735mmol)在干燥DCM(10mL)中的搅拌的溶液加入TFA(5 mL)，并在0℃下搅拌1h。将混合物真空浓缩，以得到白色固体形式的标题化合物96，550mg(100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.09(br,1H),8.40(s,2H),8.14(d,1H),7.90(d,2H),7.74(m,2H), 7.61(d,2H),7.43(m,3H),7.33(m,4H),6.00(s,1H),5.43(s,2H),5.02(s,2H),4.42-4.23(m,4H),3.93 (m,1H),3.50(m,2H),3.08-2.94(m,4H),2.88(s,3H),2.59(m,3H),1.99(m,1H),1.69-1.59(m,2H), 1.46-1.39(m,2H),0.90-0.85(m,6H).
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-23-异丙基-21,24-二氧代-26-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22,25-二氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)-乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-1-甲基-7,8-二氢 -6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5- 三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(49)的其它供选择的制备法
Figure BDA0001474068160000611
步骤1：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基) 氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三苯甲基三乙酸酯(97)的合成
向化合物73(26mg,0.024mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液加入Fmoc-VCPABC-DMEA连接基 96(24mg,0.029mmol)、2,6-二甲基吡啶(0.0167mL,0.14mmol)、DIPEA(0.0253mL,0.14mmol)和 HOAt(3.3mg,0.024mmol)。将混合物在室温下搅拌30分钟，并真空浓缩，以得到残渣。将粗品进行HPLC纯化(方法C)，以得到白色固体形式的产物97，33mg(83％)。LC-MS(方案B):m/z 1660.9 (M+H),保留时间＝1.11min.
步骤2：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-6-(5-((S)-4-(((2-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)-乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H- 噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-8-(氯甲基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(98)的合成：向97(46mg,0.028mmol)在THF(3mL)和MeOH(3 mL)中的溶液(冷却至0℃)加入LiOH·H2O(12mg,0.28mmol)在水(0.5mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌1h。加入AcOH(0.03mL)以中和混合物，并真空浓缩，以得到白色固体残渣。将其通过HPLC 纯化(方法C)纯化，以得到灰白色固体形式的产物98，28mg(72％)。LC-MS(方案B):m/z 1300.6(M+H), 保留时间＝0.78min.1H NMR(400MHz,DMF)δ＝10.33-10.21(m,1H),8.84(d,J＝7.4Hz,1H),8.63 (br.s.,3H),8.41-8.28(m,2H),8.05(s,1H),7.81-7.63(m,2H),7.57-7.41(m,3H),7.38(br.s.,2H),6.52 (br.s.,1H),5.39(d,J＝6.6Hz,1H),5.17(br.s.,1H),5.12(br.s.,1H),4.74(br.s.,1H),4.48-4.28(m,5H), 4.24(br.s.,1H),4.09(s,4H),4.04-3.89(m,2H),3.84-3.67(m,6H),3.67-3.52(m,4H),3.32(s,9H),3.26(br.s.,2H),3.19(br.s.,1H),3.14-3.04(m,4H),3.00(s,2H),2.94(br.s.,2H),2.85(br.s.,2H),2.79-2.68 (m,5H),2.62(s,4H),2.64(s,3H),2.42-2.29(m,1H),2.23-2.05(m,11H),1.92(br.s.,1H),1.78(br.s., 1H),1.60(br.s.,2H),1.15(br.S.,6H).
步骤3：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-4-(((2-((((4-((23S,26S)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-23-异丙基-21,24-二氧代-26-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂-22,25- 二氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5-氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(49)的合成：向98(10mg,0.007mmol)溶解于DMF(1mL)中的溶液加入全氟苯基1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸酯(5.6 mg,0.009mmol,99)和DIPEA(0.007mL,0.042mmol)。将混合物在室温下搅拌30分钟。将混合物通过HPLC(方法C)纯化，以得到白色泡沫形式的产物49，10mg(82％)。LC-MS(方案B):m/z 1715.7 (M+H),保留时间＝0.89min.1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ＝8.21(br.s.,2H),7.56(d,J＝7.4Hz,1H), 7.31-7.10(m,4H),6.78(s,2H),5.25(br.S.,1H),5.11(br.s.,1H),5.02(br.s.,1H),4.50(br.S.,1H),4.18(br. s.,2H),3.77(br.s.,2H),3.71(br.s.,3H),3.66-3.42(m),3.37-3.24(m,4H),3.16(br.s.,1H),3.12-2.95 (m,4H),2.93(s,2H),2.77-2.47(m,H),2.22-2.02(m,4H),1.51(br.s.,2H),0.95(br.S.,6H).
4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-6-氨基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基 ((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5- 氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(100)的制备
Figure BDA0001474068160000621
步骤1：4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰胺基-6-氨基己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-8-(氯甲基)-6-(5-((S)-8-(氯甲基)-1-甲基-4-(膦酰基氧基)-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-6-基)-5- 氧代戊酰基)-1-甲基-7,8-二氢-6H-噻吩并[3,2-e]吲哚-4-基)乙-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(100)的合成：向55(35mg,0.041mmol)在DMF(3mL)中的溶液加入74(45mg,0.045mmol)、二甲基吡啶(0.019 mL,0.16mmol)、DIPEA(0.029mL,0.16mmol)和HOAt(5.6mg,0.041mmol)。将混合物在室温下搅拌3h。向所得混合物加入哌啶(0.3mL,3mmol)，在室温下搅拌20min。将混合物真空浓缩，并将残渣通过HPLC(方法C)纯化，以在冻干后得到白色粉末状的产物100，35mg(62％)。LC-MS(方案 B):m/z 1374.8(M+H),保留时间＝0.92min.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.45(d,J＝13.7Hz, 1H),8.14(s,1H),8.17(s,1H),8.05(d,J＝7.4Hz,1H),7.76(br.s.,3H),7.58(d,J＝8.2Hz,1H),7.52-7.39 (m,2H),7.30-7.16(m,1H),6.09(br.s.,1H),5.15-4.94(m,2H),4.40(br.s.,1H),4.35-4.08(m,8H),3.95 -3.79(m,2H),3.69(br.s.,1H),3.60(d,J＝10.5Hz,3H),3.49(br.s.,3H),3.13(br.s.,1H),3.06(br.s.,1H), 3.03-2.91(m,4H),2.88(s,2H),2.76(br.s.,4H),2.61(d,J＝6.6Hz,2H),2.56(s,6H),1.98(m,3H),1.86 (s,3H),1.65(m,3H),1.58-1.49(m,3H),1.46(m,2H),1.40-1.20(m,3H),0.85(m,6H).
如本文中说明，表1和2中所述化合物可以其乙酸酯或苯酚前药阶段存在，其均快速转化为双环丙基活性药物物质。这种互变在测定介质中快速发生。因此，所有三种化合物形式功能上等同，并且在癌症细胞增殖测定中得到相同的生长抑制值。因此，描述化合物为“双乙酸酯”也涵盖对于它们功能上等同的苯酚-和双环丙基物质的描述。
Figure BDA0001474068160000631
制备以下有效负载。使用一般操作A和B或者通过所指明方法制备所有有效负载。
表1：有效负载的实例
Figure BDA0001474068160000632
Figure BDA0001474068160000641
Figure BDA0001474068160000651
表2：使用一般合成操作A和B制备以下有效负载。
Figure BDA0001474068160000652
Figure BDA0001474068160000661
Figure BDA0001474068160000671
Figure BDA0001474068160000681
Figure BDA0001474068160000691
在以上实例中，变量Pg为H、酰基、磷酸酯PO3H2、碳水化合物、氨基酸或肽(并且特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)。
制备以下连接基/有效负载：
表3.连接基-有效负载的制备
Figure BDA0001474068160000692
Figure BDA0001474068160000701
表4：使用上文对于表3中所示连接基/有效负载类似物的制备所述的操作制备以下连接基/有效负载。
表4的连接基结构
Figure BDA0001474068160000702
Figure BDA0001474068160000711
其中
P表示与所述有效负载的连接点，
R7各自独立地为H或-C1-C20烷基，
R8为-C1-C20烷基、-C6-C14芳基或-C6-C14杂芳基，
n＝0-20，并且
m＝0-20。
表4.另外的连接基/有效负载
以上连接基结构的连接点如所指明，并且位于有效负载苯酚处：
Figure BDA0001474068160000712
Figure BDA0001474068160000721
Figure BDA0001474068160000731
在表4中，Pg为H、酰基、磷酸酯PO3H2、碳水化合物、氨基酸或肽(并且特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)。
表5的连接基结构
来自：
Figure BDA0001474068160000741
其中
P表示与所述有效负载的连接点，
R7各自独立地为H或-C1-C20烷基，
R8为-C1-C20烷基、-C6-C14芳基或-C6-C14杂芳基， n＝0-20，并且
m＝0-20。
表5.另外的连接基-有效负载
以上连接基结构的连接点位于苯胺N官能团上：
Figure BDA0001474068160000742
Figure BDA0001474068160000751
Figure BDA0001474068160000761
在表5中，Pg为H、酰基、磷酸酯PO3H、碳水化合物、氨基酸或肽(特别是被诸如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的蛋白酶裂解的肽)。
有效负载和抗体药物缀合物生物学评价的实验操作
用于有效负载活力测定的细胞系
癌细胞系获自ATCC(Manassas,VA)。N87(源自转移肝位点的人胃癌)、HL60(白血病)和 MDA-MB-361DYT2(人乳腺癌MDA-MB-361)在RPMI 1640培养基中生长。所有培养基都补充有 10％胎牛血清、1％丙酮酸钠和1％L-谷氨酰胺(Invitrogen,Grand Island,NY)。人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)获自Lonza(Allendale,NJ)，并保持在补充有EGM2SingleQuots(Lonza#CC4176)的EGM2 培养基中。所有细胞都保持在加湿培养箱(37℃,5％CO2)中。
有效负载的细胞毒性测定操作
将100μl培养基中的细胞在96孔板进行培养。通过加入10个浓度(一式两份)50μl的3X储液来用指定化合物对癌细胞系进行处理。将细胞与化合物孵育四天，然后将30μl
Figure BDA0001474068160000762
96AQueous 单MTS溶液(Promega Cat#G3582)添加到细胞中，在37℃孵育1.5小时，然后在Victor读板仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)上测量490nm处的吸光度。相对细胞活力以未经处理对照孔的百分比形式测定。利用XLfit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)的四参数逻辑模型#203计算IC50值。
抗IL13Rα2ADC的细胞毒性测定操作
所用细胞系：A375(黑色素瘤)、PC3MM2(前列腺)、PC3(前列腺)
将细胞接种到96孔板过夜，然后暴露于增加浓度的抗IL13Rα2ADC或对照ADC。四天后，针对对照细胞对各培养物的活力进行评价。通过逻辑非线性回归计算IC50值。
抗CD33ADC的细胞毒性测定操作
从美国模式培养物保藏所(Manassas,VA)获得人AML细胞系(HL60、NB4、HEL92.1.7以及Raji)。将细胞在RPMI培养基(补充有10％FBS、1％青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺混合物、1mM丙酮酸钠、 10mM HEPES以及0.27％葡萄糖(Life Technology,Carlsbad,CA))中生长。用商业化的流式细胞仪检测试剂盒(eFLUXX-ID；ENZO Life Sciences,PlymouthMeeting,PA)测定细胞系的P-糖蛋白、多药耐药蛋白和乳腺癌耐药蛋白的内源活性水平。
对于细胞毒性测定，将细胞置于不透明96孔板(Corning)中，并用不同浓度的化合物处理4天。通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒(Promega,Madison,WI)测定活力，并使用Victor X3 读板仪(Perkin Elmer Waltham,MA)测量。将数据相对于对照组(DMASO或PBS)进行标准化。将导致 50％生长抑制的浓度定义为IC50值。使用XLfit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)的逻辑非线性回归模型#203计算IC50值。所有实验点设置两个重复孔并独立进行两次。
抗曲妥珠单抗ADC的细胞毒性测定
在96孔细胞培养板中接种目标表达N87(胃癌)、MDA-MB-361-DYT2(乳腺癌))或非表达(HT-29) 细胞，持续24小时，然后进行处理。用3倍系列稀释的抗体-药物缀合物处理细胞。处理96小时后，通过CellTiter
Figure BDA0001474068160000771
AQueousOne Solution Cell Proliferation MTSAssay(Promega,Madison WI)测定细胞活力。相对细胞活力以未处理对照的百分比的形式测定。使用XLfit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK) 的四参数逻辑模型#203计算IC50值。
有效负载和ADC的细胞毒性结果见表6和10。
表6：示例性游离有效负载效能：
化合物ID N87[nM] HL60[nM] DYT2[nM]
24 0.024 <0.005 0.171
7 0.022 <0.005 0.185
26 0.263 0.014 1.670
12 2.258 0.180 5.077
17 1.296 0.084 6.062
25 41.600 NA >100
60 0.122 0.009 0.079
61 13.646 0.806 28.587
57 11.020 0.873 37.588
87 0.036 0.349 0.002
88 0.041 0.41 0.004
89 0.041 0.302 0.002
抗体药物缀合物的例证
方法D：通过内部二硫化物缀合抗体与连接基-有效负载的一般操作
通过加入3.0-3.5当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，5mM的PBS溶液)将Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(PBS，Lonza，pH 7.4)中的治疗性抗体溶液还原。将反应物在37℃下孵育1-2小时，然后冷却至环境温度。通过加入7当量的连接基-有效负载[10mM的N,N-二甲基乙酰胺(DMA)溶液]进行缀合。将另外的DMA加入到反应混合物中以使最终的反应混合物中总有机溶剂组分为15％(v/v)。将反应物在环境温度下孵育1小时。在环境温度下1小时后，将粗品反应物通过GE Sephadex脱盐柱进行缓冲液交换PBS，或通过添加10当量半胱氨酸(20mM PBS溶液)淬灭过量的连接基-有效负载。在任一情况下，然后将粗品物质通过尺寸排阻色谱法(SEC，方案C)纯化。如有必要合并单体流分并浓缩以获得ADC。
方法E：连接基-有效负载与包含工程化半胱氨酸残基的曲妥珠单抗抗体的位点特异性缀合
在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中制备含有工程化半胱氨酸残基(Kabat编号，参见WO2013093809)的治疗性抗体的溶液。加入PBS、EDTA(0.5M储液)和TCEP(0.5M储液)，使得最终的蛋白质浓度为约10mg/mL，最终的EDTA浓度为约20mM，且最终的TCEP浓度为约6.6mM(100摩尔当量)。将反应物在室温下放置2-48小时，然后按照制造商的说明使用GE PD-10Sephadex G25柱将缓冲液交换到PBS中。诸如渗滤或透析的其它供选择的方法在特定情况下也可使用。将所得溶液用约50当量的脱氢抗坏血酸(在1:1EtOH/水中的50mM储液)处理。将抗体在4℃下过夜，随后按照制造商的说明使用GE PD-10Sephadex G25柱将缓冲液交换到PBS中。另外，诸如渗滤或透析的其它供选择的方法在特定情况下也可使用。
与由此制备的抗体的缀合通过加入10当量的连接基-有效负载[10mM的N,N-二甲基乙酰胺 (DMA)溶液]进行。将另外的DMA加入到反应混合物中，以使最终的反应混合物中总有机溶剂组分达到15％(v/v)。在一些情况下，加入另外的PBS以达到反应物中5-10mg/mL的最终总抗体浓度。在室温下1-2小时后，将反应混合物缓冲交换入PBS(如上所述)，并通过尺寸排阻色谱法(SEC，方案D)纯化。如有必要，合并单体流分并浓缩以获得ADC。在一些情况下，SEC纯化后，将ADC在 23至37℃下用0.5-1.0g Bio-Beads SM-2吸附剂(Bio-Rad)孵育4-18小时，过滤，然后如有必要进行浓缩。
方法F：与携带反应性谷氨酰胺残基的抗体的酶介导缀合：
将携带转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺残基的治疗性抗体透析到无菌水(Lonza)中。通过将水中 5.0-15mg/mL含有抗体的转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺与30mM磷酸钾pH7.4DILUT-IT溶出介质浓缩物(J.T.Baker)、150mM氯化钠(NaCl)、15.0-20.0倍摩尔过量的携带有效负载的氨基烷基连接基(10-30mM的DMSO溶液)以及30-60mg/mL转谷氨酰胺酶粉末(Ajinomoto Activa TI)混合来进行转谷氨酰胺酶介导的缀合。另外，将DMSO加入到反应混合物中以使最终的反应混合物中总有机溶剂组分为15％(v/v)。在一些情况下，加入另外的水以使反应物中最终总抗体浓度为5-10mg/mL。将所得混合物在环境温度下孵育5-6小时。接下来，加入另外30-60mg/mL转谷氨酰胺酶固体，并将混合物在环境温度下进一步温育另外18小时。过夜后，根据制造商的说明，使用GE Healthcare Sephadex 缓冲液交换柱，将粗品反应物缓冲交换到Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4，Lonza)中。将粗品物质通过尺寸排阻色谱法(SEC，方案D)或疏水作用色谱法(HIC，方案G)纯化。纯化后，如有必要，合并单体流分并浓缩以获得ADC。在使用HIC纯化ADC的实例中，根据制造商的说明，使用 GEHealthcare Sephadex缓冲液交换柱，将合并的流分缓冲交换到Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(PBS， pH 7.4，Lonza)中。在一些情况下，纯化后，将ADC在23至37℃下用0.5-1.0g Bio-Beads SM-2吸附剂(Bio-Rad)孵育4-18小时，过滤，然后如有必要进行浓缩。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)和疏水作用色谱法(HIC)来表征ADC的纯度，并且通过液相色谱电喷雾离子化串联质谱(LC-ESI MS)来计算药物-抗体比率(DAR，负载)。
方案C：柱：Agilent Poroshell 300SB-C8,75x 2.1mm,2.6μm；流动相A:含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B:含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：初始条件:20％B至45％B历时4分钟；流速:1.0mL/分钟；温度:60℃；检测:220nm；MS(+)范围400-2000Da；进样量:10μL；仪器:Agilent 1100LC,Waters MicromassZQ MS；使用MaxEnt1进行解卷积.
方案D：柱：GE Superdex 200(10/300GL)；流动相:磷酸盐缓冲盐水(PBS,1X,pH7.4)；等度；流速:1.0mL/分钟；温度:室温；仪器:GE Akta Explorer.
方案E：柱＝Waters BEH300-C4,2.1x 100mm(P/N＝186004496)；仪器＝具有SQD2质谱检测器的Acquity UPLC；流速＝0.7mL/min；温度＝80℃；缓冲剂A＝水+0.1％甲酸；缓冲剂B＝乙腈+ 0.1％甲酸。梯度如下运行：3％B至95％B历时2分钟，在95％B下保持0.75min，然后在3％B下再平衡。将样品在注射前即刻用TCEP或DTT还原。将洗脱物通过LCMS(400-2000道尔顿)监测，并使用MaxEnt1将蛋白质峰解卷积。DAR以如之前描述的重量平均负载的形式报道。
方案F：柱：TSKGel Butyl NPR,4.6mm x 3.5cm(P/N＝S0557-835)；缓冲剂A＝1.5M硫酸铵，其包含10mM磷酸盐,pH 7；缓冲剂B＝10mM磷酸盐,pH 7+20％异丙醇；流速＝0.8mL/min；温度＝环境温度；梯度＝0％B至100％B历时12分钟，在100％B下保持2分钟，然后在100％A 下再平衡；仪器：Agilent 1100HPLC.
方案G：柱：GE HiTrap Butly HP,5mL；流动相:1M磷酸钾,50mM Tris-HCl,pH7(缓冲剂A)； 50mM Tris-HCl,pH7(缓冲剂B)；梯度洗脱:0-100％缓冲剂B历时10-20柱体积；流速:5.0mL/分钟. 温度:室温；仪器:GE Akta Explorer.
表7：ADC的结构以及用于制备它们的有效负载连接基
Figure BDA0001474068160000781
Figure BDA0001474068160000791
X＝在上表中“X”表示用于表5中所示缀合的抗体。
表8：用于制备ADC的一般方法
Figure BDA0001474068160000792
表9：ADC的纯化方法和分析表征
Figure BDA0001474068160000793
表10：ADC#1-6在抗原+ve和抗原-ve细胞系中的体外细胞毒性数据
Figure BDA0001474068160000801
使用适合的缀合方法制备以下ADC(其包括缀合至关注的抗体的表4和5中所示连接基/有效负载)：
Figure BDA0001474068160000802
Figure BDA0001474068160000811
Figure BDA0001474068160000821
Figure BDA0001474068160000831
Figure BDA0001474068160000841
Figure BDA0001474068160000851
Figure BDA0001474068160000861
Figure BDA0001474068160000871
Figure BDA0001474068160000881
Figure BDA0001474068160000891
Figure BDA0001474068160000901
Figure BDA0001474068160000911
Figure BDA0001474068160000921
Figure BDA0001474068160000931

Claims (8)

1.化合物或者其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
Figure FDA0002475493840000011
Figure FDA0002475493840000021
Figure FDA0002475493840000031
Figure FDA0002475493840000041
2.化合物或者其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
Figure FDA0002475493840000042
Figure FDA0002475493840000051
其中Pg为H、酰基或PO3H2。
3.化合物或者其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
Figure FDA0002475493840000052
Figure FDA0002475493840000061
4.化合物或者其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
Figure FDA0002475493840000071
其中X为抗体，所述抗体选自曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿仑珠单抗、抗HLADR抗体、131ILym1、抗HLADr10抗体、抗cd33抗体、抗cd22抗体、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗和吉妥珠单抗。
5.化合物或者其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
Figure FDA0002475493840000081
Figure FDA0002475493840000091
Figure FDA0002475493840000101
Figure FDA0002475493840000111
Figure FDA0002475493840000121
Figure FDA0002475493840000131
Figure FDA0002475493840000141
Figure FDA0002475493840000151
Figure FDA0002475493840000161
Figure FDA0002475493840000171
其中AB为抗体，所述抗体AB选自曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿仑珠单抗、抗HLADR抗体、131ILym1、抗HLADr10抗体、抗cd33抗体、抗cd22抗体、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗和吉妥珠单抗。
6.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的化合物或者其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂。
7.权利要求1-5中任一项的化合物或权利要求6的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述癌症为膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食管癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、白血病和淋巴瘤。
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