CN117355340A - 缀合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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杨洋
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Abstract

提供了一种缀合物及其制备方法和用途。式1的缀合物，M‑[(L1)a‑(L2)b‑(D)c]1，其中M为具有亲核官能团生物大分子，M利用M的亲核官能团与L1连接，D为功能性分子，L2为连接子，且L1为式I的化合物。

Description

缀合物及其制备方法和用途
背景技术
蛋白质修饰可以为蛋白质赋予新的特性和功能。常见的蛋白质修饰策略是对蛋白质上的氨基酸残基进行修饰。由于赖氨酸和半胱氨酸具有高亲和力反应性，因此蛋白质的修饰通常针对这两种氨基酸。
2019年，德曲妥珠单抗(Fam-trastuzumab Deruxtecan，用于治疗不可切除或转移性HER2阳性乳腺癌)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab Vedotin，用于治疗复发性/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤)和维汀-恩弗妥单抗(Enfortumab Vedotin，用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌)等三种抗体缀合药物获得FDA批准，并且通过修饰抗体上还原的链间二硫键来实现，并且其连接子为马来酰亚胺。众所周知，马来酰亚胺与巯基的加合物不稳定，并且在生理条件下容易发生硫醇交换反应。通过马来酰亚胺与巯基之间加成反应合成的抗体-药物缀合物(ADC)会导致药物提前释放，这可能严重影响ADC的稳定性和疗效。
尽管化学家们在提高马来酰亚胺的稳定性和寻找新的稳定连接子方面取得了成果，但问题尚未被克服。因此，迫切需要开发一种满足缀合物的制备需求，尤其是平衡活性和稳定性的连接子。
发明内容
本申请提供了一种可能的连接子，其有望应用于缀合物(例如ADC)的制备。该连接子能够凭借相对较强的效率和/或化学选择性，与生物大分子的亲核官能团(例如，半胱氨酸的-SH)发生反应。在本申请中，该连接子和/或包含该连接子和/或通过该连接子制备的缀合物可以在体外和体内环境中保持稳定。例如，本申请中所述的缀合物(例如，ADC)可以更有效和/或更高效地杀伤靶细胞，这是因为本申请中所述的缀合物(例如，ADC)具有更好的稳定性和/或安全性(特别是在相对较高的浓度下)。在本申请中，所述的缀合物可以解决活性与稳定性之间的平衡问题。
一方面，本申请提供了一种式1的缀合物，M-[(L1)a-(L2)b-(D)c]1，其中L1为式I的化合物，I，R为-F或-OH，其中M为生物大分子，并且M利用M的亲核官能团与L1连接，L2为连接子，并且L2与R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在某些实施方式中，所述M的亲核官能团选自：-SH、-NH2、-SeH、-OH和
一方面，本申请提供了一种式2的缀合物，M-S-[(L1)a-(L2)b-(D)c]2，其中M-S为具有半胱氨酸的生物大分子，M-S利用所述半胱氨酸与L1连接，L1为式I的化合物，I，R为-F或-OH，L2为连接子，L2与R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，M选自下组：蛋白质、DNA、RNA和病毒。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，M为在细胞表面上表达的生物大分子。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，M为抗原结合蛋白或其片段。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，M为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体scFv或抗体片段。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，L2选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，L2选自下组：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，D具有生物学功能。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，D和/或其衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，D为药物。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，D选自下组：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂、DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，D为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R1'为-H。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R1为-H。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R3为-H。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为任选取代的苯基。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1为1至10的整数，其中R5选自下组：/>和H。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n3-CO-R7，n3为1至10的整数，其中R7选自下组：/>
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n4-R8，n4为1至10的整数，其中R8选自下组：/>
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5为1至10的整数，n6为1至10的整数，其中R9选自下组：H和/>
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：-CF3、-CN和-OCH3。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，R2为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12为其中R13为-CH2N3。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，所述环为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，所述环选自下组：
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，L1选自下组：
在某些实施方式中，在式1的缀合物和/或式2的缀合物中，所述缀合物选自：
另一方面，本申请提供了一种式3的缀合物，(L1)a-(L2)b-(D)c 3，其中L1为式III的化合物，L2为连接子，并且L2与R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，L2选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，L2选自：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，D具有生物学功能。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，D和/或其衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，D为药物。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，D选自下组：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂、DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，D为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R1为-H。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R3为-H。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为任选取代的苯基。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n1-COO-
R5，n1为1至10的整数，其中R5选自下组：和H。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n3-CO-R7，n3为1至10的整数，其中R7选自下组：
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n4-R8，n4为1至10的整数，其中R8选自下组：
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5为1至10的整数，n6为1至10的整数，其中R9选自下组：H和/>
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：-CF3、-CN和-OCH3。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，R2为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12为其中R13为-CH2N3。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，所述环为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，所述环选自：
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，L1选自下组：
/>
/>
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，所述缀合物选自：
/>
另一方面，本申请提供了一种缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：通过使式3的缀合物：3与M缀合，获得式1的缀合物：/> 其中M为生物大分子，并且M利用M的亲核官能团与L1连接，L2为连接子，并且L2与式1中的R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在某些实施方式中，在所述方法中，所述M的亲核官能团选自下组：-SH、-NH2、-SeH、-OH和
一种缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：通过使式3的缀合物： 与M缀合，获得式2的缀合物：/>R为-OH或-F，其中M-S为具有半胱氨酸的生物大分子，M-S利用所述半胱氨酸与L1连接，L2为连接子，并且L2与式3中的R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在某些实施方式中，在所述方法中，M选自：蛋白质、DNA、RNA和病毒。
在某些实施方式中，在所述方法中，M为在细胞表面上表达的生物大分子。
在某些实施方式中，在所述方法中，M为抗原结合蛋白或其片段。
在某些实施方式中，在所述方法中，M为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体scFv或抗体片段。
在某些实施方式中，在所述方法中，M包含用于亲核加成反应的官能团。
在某些实施方式中，在所述方法中，L2选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、预带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
在某些实施方式中，在所述方法中，L2选自下组：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯SPP、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
在某些实施方式中，在所述方法中，D具有生物学功能。
在某些实施方式中，在所述方法中，D和/或其衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长。
在某些实施方式中，在所述方法中，D为药物。
在某些实施方式中，在所述方法中，D选自下组：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂和DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
在某些实施方式中，在所述方法中，D为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
在某些实施方式中，在所述方法中，R1为-H。
在某些实施方式中，在所述方法中，R3为-H。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为任选取代的苯基。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1为1至10的整数，其中R5选自下组：/>和H。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n3-CO-R7，n3为1至10的整数，其中R7选自下组：
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n4-R8，n4为1至10的整数，其中R8选自下组：
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5为1至10的整数，n6为1至10的整数，其中R9选自下组：H和/>/>
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：-CF3、-CN和-OCH3。
在某些实施方式中，在所述方法中，R2为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12为其中R13为-CH2N3。
在某些实施方式中，在所述方法中，所述环为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
在某些实施方式中，在所述方法中，所述环选自：
在某些实施方式中，所述方法在约16℃至约37℃的范围内的温度下进行。
在某些实施方式中，所述方法在约7.4至约8的范围内的pH下进行。
在某些实施方式中，所述方法用催化剂进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：纯化所述式3的缀合物。
另一方面，本申请提供了一种式III的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中R1选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
在某些实施方式中，R1选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
在某些实施方式中，所述化合物选自：
另一方面，本申请提供了一种式IV的化合物，或其药学上可接受的盐：其中R1选自下组：NH-(CH2)n1-CO-R2、-OH、NH-(CH2)n2-R3、NH-(CH2CH2-O)n3-(CH2)n4-NH-CO-O-R4、或/>其中n1、n2、n3、或n4独立地为1至10的整数，其中R2选自下组：/>其中R3选自下组：/>其中R4为/>
在某些实施方式中，R1选自下组：NH-(CH2)2-CO-R2、-OH、NH-(CH2)-R3、NH-(CH2CH2-O)3-(CH2)2-NH-CO-O-R4。
在某些实施方式中，所述化合物选自下组：
/>
另一方面，本申请提供了一种式V的化合物，或其药学上可接受的盐：其中R1、R2和R4为任意取代基，其中R3选自下组：H、任选取代的烷基-F3、任选取代的烷基-N或O-任选取代的烷基，其中R5选自下组：-COOH、-NH2和/>
在某些实施方式中，R1为H。
在某些实施方式中，R2为H。
在某些实施方式中，R4为H。
在某些实施方式中，R3选自下组：H、CF3、CN和OCH3。
在某些实施方式中，所述化合物选自：
另一方面，本申请提供了一种式VI的化合物，或其药学上可接受的盐：
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请的缀合物和药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了一种用于调节受试者的肿瘤微环境的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请的缀合物，或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于调节受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请的缀合物，或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请的缀合物，或本申请的药物组合物。
在某些实施方式中，所述疾病包括肿瘤和/或自身免疫性疾病。
另一方面，本申请提供了一种诊断试剂，所述诊断试剂包含本申请的缀合物。
在某些实施方式中，所述诊断试剂被标记。
在某些实施方式中，所述标记选自：放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
根据以下具体实施方式，本领域技术人员将显而易知本申请的其他方面和优势，在具体实施方式中仅示出和描述本申请的示例性实施方式。如将认识到，本申请能够具有其它不同的实施方式，其若干细节可以在各种明显的方面进行修改，但均不脱离本公开。因此，附图和说明书在本质上均被视为是示例性的而非限制性的。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其引用程度如同各个单独的出版物、专利或专利申请被具体地并且分别地指出以引用的方式并入一样。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考阐述使用本发明原理的示例性实施方式的以下具体实施方式以及附图，将更好地理解本发明的特征和优势，在附图(在本文中也称为“图(figure)”和“图(FIG.)”)中：
图1示出了用于筛选候选迈克尔接受体作为连接子的反应过程。
图2示出了迈克尔接受体候选物的化学结构。
图3示出了经修饰迈克尔接受体候选物的化学结构。
图4示出了用于筛选经修饰候选迈克尔接受体作为连接子的反应过程。
图5示出了迈克尔接受体候选物的化学结构。
图6示出了用于筛选经修饰候选迈克尔接受体作为连接子的反应过程。
图7示出了先前报道的连接子的化学结构。
图8示出了sfGFP E124C与先前报道的连接子之间的反应过程。
图9示出了sfGFP E124C与先前报道的连接子之间的反应结果。
图10示出了本申请的连接子与先前报道的连接子的竞争性实验结果。
图11a至图11c示出了本申请的连接子的稳定性。
图12a至图12c示出了用本申请的连接子生成缀合物并且验证了缀合物的稳定性。
图13a至图13c示出了通过本申请的连接子获得的缀合物的质谱结果，显示了在血清中的稳定性。
图14a至图14c示出了用本申请的连接子生成缀合物的步骤。
图15a至图15c示出了通过本申请的连接子获得的DAR为3.2的缀合物的质谱结果。
图16a至图16b示出了通过本申请的连接子获得的DAR为3.8的缀合物的质谱结果。
图17a至图17h示出了通过本申请的连接子获得的缀合物的肿瘤细胞杀伤试验的结果。
图18示出了SSF-PEG4-vc-PAB-MMAE 1的LC-MS色谱图和质谱图。
图19示出了SSF-PEG4-GGFG-Dxd 3的LC-MS色谱图。
图20示出了连接子稳定性研究的过程。
图21示出了MA 5与MA 2的水解稳定性结果。
图22A至图22B示出了MA 2与先前报道的稳定Cys特异性标记试剂的比较。
图23示出了用MA 2修饰的GFP片段的MS/MS谱图。
图24A至图24G示出了使用SSF对不同蛋白质进行的Cys特异性修饰。
图25A至图25D示出了通过本申请的连接子获得的缀合物的抗肿瘤活性的结果。
图26A至图26B示出了MA 2与马来酰亚胺在水性缓冲液中的稳定性的对比。
图27A至图27H示出了通过本申请的连接子获得的包含SSF-ssDNA的缀合物的制备及其在单细胞测序上的应用。
图28示出了通过本申请的连接子获得的缀合物的去卷积完整蛋白MS。
图29示出了通过本申请的连接子获得的缀合物的去卷积完整蛋白MS。
图30示出了细胞系(N87)的细胞活力测定结果。
具体实施方式
虽然本文已展示和描述本发明的各种实施方式，但对本领域的技术人员显而易见的是，这些实施方式仅仅通过示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变型、改变和替代方案。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方式的各种替代方式。
如本文所使用的，术语“缀合物”一般是指由单独部分连接在一起而形成的任何物质。在缀合物中，单独部分可以在一个或多个活性位点相互接合。此外，单独部分可以共价或非共价地相互关联或连接，并且表现出不同的化学计量摩尔比。缀合物可以包括肽、多肽、蛋白质、在体内代谢为活性剂的前药、聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子和放射性同位素。例如，缀合物可以包含药物和抗原结合蛋白，并且可以是抗体药物缀合物ADC。
如本文所使用的，术语“ADC”一般是指抗原结合蛋白与药物的连接。该连接可以是共价键，也可以是诸如通过静电力的非共价相互作用。可以采用各种连接子来形成免疫缀合物。另外，免疫缀合物可以以融合蛋白的形式提供，该融合蛋白可以从编码免疫缀合物的多核苷酸表达。如本文所使用的，“融合蛋白”是指通过接合两个或更多个基因或基因片段而产生的蛋白质，这些基因或基因片段最初编码用于单独的蛋白质(包括肽和多肽)。
如本文所使用的，术语“生物大分子”一般是指生物分子，诸如核酸、蛋白质、抗体、碳水化合物、多糖、脂质等。
如本文所使用的，术语“连接子”一般是指附接两个或更多个分子的化学部分或键。连接子可以是能够接合或连接两个或更多个支架的任意分子组件。连接子可以是其功能是充当支架中模块之间的柔性连接子的分子，也可以是具有附加功能的分子。在本公开中，连接子可以用于将岩藻糖或岩藻糖衍生物连接到活性部分。不同长度的连接子允许以与活性部分不同的距离来附接岩藻糖或岩藻糖衍生物。
如本文所使用的，术语“功能分子”一般是指作为本申请的缀合物的组分并且可以在缀合物的功能中发挥作用的任何分子。
如本文所使用的，术语“生物学功能”一般是指由本申请的功能分子在生物学中进行的任何活动或过程。例如，生物学功能可以包括由功能分子在体外和/或体内进行的任何活动或过程，生物学功能可以包括由包含功能分子的缀合物在体外和/或体内进行的任何活动或过程。
如本文所使用的，术语“官能团”一般是指能够参与加成反应(例如，用于亲核加成反应)的生物大分子基团。在本申请中，亲核加成反应可以是化学加成反应，其中亲核试剂与缺电子物质形成西格玛键。亲核加成反应可以使羰基基团能够转化为多种官能团。例如，生物大分子的亲核官能团可以是-SH、-NH2、-SeH、-OH或
如本文所使用的，术语“加成反应”一般是指两个或更多个分子组合形成较大分子(加合物)的有机反应。该加成反应可以包括亲电加成和亲核加成。该加成反应可以限于具有多个键的化合物，诸如具有碳-碳双键(烯烃)或具有三键(炔烃)的分子，以及具有环的化合物，这些环也被认为是不饱和的环不饱和点。例如，包含碳-杂双键(如羰基(C＝O)基团或亚胺(C＝N)基团)的分子可以进行加成反应。
如本文所使用的，术语“抗原结合蛋白”一般是指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。例如，抗原结合蛋白可以指向靶位点，例如，可以用特定类型的肿瘤细胞或抗原决定附接到肿瘤基质上的实体(例如，效应部分或第二抗原结合部分)。是可能的。进一步地，如本文所定义的，抗原结合蛋白可以包含抗体及其片段。例如，抗原结合蛋白可以包括抗体抗原结合结构域，其包括抗体重链可变区和抗体轻链可变区。例如，抗原结合蛋白可以包含如本文进一步定义且本领域已知的抗体恒定区。有效的重链恒定区可以包括五种亚型：α、δ、ε、γ或μ。有效的轻链恒定区可以包括两种亚型：κ和λ。有效的轻链恒定区可以包括两种亚型之一：κ和λ。
如本文所使用的，术语“抗体”一般是指特异性结合抗原表位或其模拟物的多肽或蛋白质复合物。抗体包括完整抗体或其结合片段，该接合片段与完整抗体竞争特异性结合，并且包括嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体和双特异性抗体。结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体。在某些实施方式中，抗体被称为免疫球蛋白，并且包括各种类别和亚型，诸如IgA(IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgG(IgGl、IgG3和IgG4)等。在某些实施方式中，如本文所用的，术语“抗体”是指多克隆或单克隆抗体以及器功能性片段。抗体包括经修饰或衍生化的抗体变体，其保留了特异性结合表位的能力。抗体能够选择性地结合靶抗原或表位。抗体可以包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化和其他嵌合抗体、单链抗体(scFvs)、Fab片段、F(ab’)2片段和二硫键连接的Fvs(sdFv)片段。在某些实施方式中，抗体来自任何来源，诸如小鼠或人，包括其嵌合抗体。在某些实施方式中，抗体是人源化的。
如本文所使用的，术语“衍生物”一般是指预期表现出与主体(母体)化合物所表现出的(例如，物理、或/和化学或/和生物)活性相似的化合物。例如，衍生物可以是主体化合物的前体、代谢物、盐和/或酯。
如本文所使用的，术语“药物”一般是指对细胞生长和增殖有害并且可以用于减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何药剂。例如，药物可以包含毒素。例如，药物可以包含化疗剂。
如本文所使用的，术语“细胞因子”一般是指介导和/或调节生物或细胞功能或过程(例如，免疫、炎症和造血)的分子。在本申请中，细胞因子还可以包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单因子”和“白细胞介素”。细胞因子的示例可以包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、和TNF-β，但不限于此。例如，细胞因子可以包括IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ。例如，细胞因子可以是人细胞因子。如本文所使用的，术语“细胞因子”也可以指索韦(Sauve)等人，《美国国家科学研究院学报》(Proc Natl Acad Sci USA)88，4636-40(1991)；胡(Hu)等人，《血液学》(Blood)101，4853-4861(2003)以及美国专利申请公开第2003/0124678号；沙纳费尔特(Shanafelt)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnol)18，1197-1202(2000)；希顿(Heaton)等人，《癌症研究》(Cancer Res)53，2597-602(1993)以及美国专利第5,229,109号；野生型细胞因子，诸如美国专利申请公开第2007/0036752号中描述的IL-2突变体；国际公开第2008/0034473号；国际公开第2009/061853号；PCT专利申请PCT/EP2012/051991。包括含有相应氨基酸序列中一个或多个氨基酸突变的细胞因子变体。另外，本文还描述了细胞因子变体，诸如IL-15变体。例如，细胞因子可以突变以消除糖基化。
如本文所使用的，术语“芳基”一般是指具有带有烃环自由基(即单环烃环)或二至四个稠合环的碳原子的烃环体系，该环状烃环可以是具有5或6个碳原子的芳族，并且形成烃环体系的每个环可以是芳族的并且独立地具有5或6个碳原子。例如，芳基基团的示例可以包括苯基、萘基(即萘)和蒽基。例如，芳基可以优选地包括苯基。
如本文所使用的，术语“烷基”一般是指至少一个碳原子(例如，1至20个碳原子。“1至20个碳原子”可以指具有最多1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等的烷基基团的直链和/或支链基团，包括最多20个碳原子)，并且饱和脂肪族(即非芳香族)无环烃(即由碳原子和氢原子组成的基团)包括相邻碳-碳双键或碳-碳三键。例如，烷基可以包含1至10个碳原子。例如，烷基可以包含1至6个碳原子。
如本文所使用的，术语“药物”一般是指改变受试者生理机能的任何物质。在本申请中，药物可以包含具有所需生物活性和反应功能性、可用于制备本申请的缀合物的任何化合物。所需生物活性可以包括可用于诊断、治愈、减少、治疗或预防人类或其它动物疾病的活性。因此，只要其具有必要的反应性官能团，这些化合物就可以与可在官方《中国药典》(例如，在官方《顺势疗法药典》中，或在官方《国家处方集》中，或其任何修正版本中)中提及的术语“药物”相关联。示例性药物可在《美国医生案头参考》(PDR)和美国食品和药物管理局(FDA)维护的橙皮书中描述。新药可能会不断被发现和开发，并且本申请还将这些新药并入本申请的药物缀合物的“药物”中。
如本文所使用的，术语“Toll样受体激动剂”一般是指Toll样受体的任何激动剂。在本申请中，Toll样受体可以被TLR识别，TLR可以激活免疫细胞反应。TLR可以包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、和TLR13。例如，Toll样受体激动剂可以包含抗肿瘤疗法中的疫苗佐剂，因为该疫苗佐剂能够激活免疫细胞并且促发炎症。
如本文所使用的，术语“Sting激动剂”一般是指能够与STING结合并且激活STING的试剂。例如，STING活性的激活可以包括刺激炎症性细胞因子，包括干扰素，诸如1型干扰素(包括IFN-a、IFN-b)、3型干扰素(例如CXCL9、CCL4、CXCL11、CCL5、CCL3或CCL8)。STING激动剂的活性还可以包括刺激TANK结合激酶(TBK)1磷酸化、干扰素调节因子(IRF)激活(例如，IRF3激活)、干扰素-y诱导蛋白(IP-10)或其它炎症性蛋白和细胞因子的分泌。STING激动剂的活性可以例如通过化合物对STING通路激活的刺激能力进行确定，该能力使用干扰素刺激测定法、报告基因测定法(例如，hSTING wt测定法或THP-1双重测定法)、TBK1激活测定法、IP-10测定法或本领域技术人员已知的其他测定法进行检测。STING激动剂的活性也可以通过化合物对编码由STING或STING通路激活的蛋白质的基因的转录水平的提高能力进行确定。例如，可以使用RNAseq测定法检测此类活性。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”一般是指用于形成药物产品的非API(API意指药物活性成分)，诸如崩解剂、粘合剂、填料和润滑剂。药学上可接受的载体可符合制定的政府标准(包括美国食品和药物管理局和欧洲食品和药物管理局颁布的标准)，并且一般对人类施用是安全的。例如，药学上可接受的载体可以包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液、乳液和/或仅在使用之前的无菌注射溶液或分散液。
术语“肿瘤”一般是指以细胞生长失调或不受控制为特征的恶性肿瘤。例如，肿瘤可以包括原发性恶性肿瘤(例如，细胞未迁移到受试者体内原始肿瘤部位以外的部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，由转移引起的那些，肿瘤细胞迁移到与原始肿瘤部位不同的继发部位)。肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。
术语“肿瘤微环境”一般是指肿瘤细胞的复杂的周围微环境。例如，肿瘤微环境可以包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓衍生的炎症细胞、各种信号分子和/或细胞外基质(ECM)。例如，肿瘤微环境可能存有癌症干细胞和其他有助于肿瘤发展和进展的分子。因此，在治疗期间，靶向和操纵肿瘤微环境中的细胞和因子可以有助于控制恶性肿瘤并且取得积极的健康结果。
术语“免疫反应”一般是指受试者对外来物质和/或病原体的防御。免疫反应可能导致免疫应答，例如，通过其特异性抗体或通过先前致敏的淋巴细胞对抗原进行识别和结合。
术语“自身免疫性疾病”一般是指由免疫介导的对受试者自身器官的攻击所引起的任何疾病和/或病症。自身免疫性疾病的示例可以包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(狼疮)、炎症性肠病(IBD)、多发性硬化症(MS)、1型糖尿病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、银屑病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力和/或血管炎。
如本文所使用的，术语“治疗”一般是指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减少疾病(例如肿瘤)的发展或其至少一种临床症状)。例如，治疗可以包括减轻或改善至少一个物理参数，包括患者可能无法识别的那些。
如本文所使用的，术语“预防”一般是指对疾病或病症的预防性治疗；或者延缓疾病或病症的发作或进展。
如本文所使用的，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾，否则在本申请上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”和“所述”以及类似术语应被解释为涵盖单数和复数。
缀合物
一方面，本申请提供了一种式1的缀合物，M-[(L1)a-(L2)b-(D)c]1，其中L1为式I的化合物，R为-F或-OH，其中M为生物大分子，并且M利用M的亲核官能团与L1连接，L2为连接子，并且L2与R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
例如，M的亲核官能团可以选自：-SH、-NH2、-SeH、-OH和
另一方面，本申请提供了一种式2的缀合物，M-S-[(L1)a-(L2)b-(D)c]2，其中M-S为具有半胱氨酸的生物大分子，M-S利用所述半胱氨酸与L1连接，L1为式I的化合物，R为-F或-OH，L2为连接子，L2与R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
例如，M可以选自：蛋白质、DNA、RNA和病毒。
例如，M可以为在细胞表面上表达的生物大分子。
例如，M可以为抗原结合蛋白或其片段。
例如，M可以为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体scFv或抗体片段。
例如，M可以包含用于亲核加成反应的官能团。
例如，L2可以选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
例如，L2可以选自下组：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
例如，D可以具有生物学功能。
例如，D和/或其衍生物可以能够抑制肿瘤细胞的生长。
例如，D可以为药物。
例如，D可以选自下组：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、海尾兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂、DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
例如，D可以为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
例如，R1’可以为-H。例如，R1为-H.例如，R3为-H。
例如，R2可以为任选取代的苯基。
例如，R2可以为其中R4可以选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
例如，R2可以为其中R4可以选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
例如，R2可以为其中R4可以为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1可以为1至10的整数，其中R5可以选自下组：/>和H。
例如，R2可以为其中R4可以为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2可以为1至10的整数，其中R6可以为-(CH2)n3-CO-R7，n3可以为1至10的整数，其中R7可以选自下组：
例如，R2为其中R4可以为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2可以为1至10的整数，其中R6可以为-(CH2)n4-R8，n4可以为1至10的整数，其中R8可以选自下组：
/>
例如，R2可以为其中R4可以为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2可以为1至10的整数，其中R6可以为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5可以为1至10的整数，n6可以为1至10的整数，其中R9可以选自下组：H和/>
例如，R2可以为其中R4可以为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7可以为1至10的整数，n8可以为1至10的整数，其中R10可以选自下组：-COOH、-NH2和/>
例如，R2可以为其中R4可以为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7可以为1至10的整数，n8可以为1至10的整数，其中R10可以选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11可以选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
例如，R2可以为其中R4可以为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7可以为1至10的整数，n8可以为1至10的整数，其中R10可以选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11可以选自下组：-CF3、-CN和-OCH3。
例如，R2可以为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12可以为其中R13可以为-CH2N3。
例如，该环可以为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
例如，该环可以选自下组：
例如，L1可以选自下组：/>
/>
例如，该缀合物可以选自下组：
/>
例如，式1或式2的缀合物可以如下：
其中R为-F或-OH。
另一方面，本申请提供了一种式3的缀合物，(L1)a-(L2)b-(D)c 3，其中L1为式III的化合物，L2为连接子，并且L2与R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在某些实施方式中，在式3的缀合物中，L2选自：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
例如，L2可以选自：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
例如，D可以具有生物学功能。例如，D和/或其衍生物可以能够抑制肿瘤细胞的生长。例如，D可以为药物。
例如，D可以选自下组：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂、DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。例如，D可以为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
例如，R1可以为-H。
例如，R3可以为-H。
例如，R2可以为任选取代的苯基。
例如，R2可以为其中R4可以选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
例如，R2可以为其中R4可以选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
例如，R2可以为其中R4可以为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1为1至10的整数，其中R5可以选自下组：/>和H。
例如，R2可以为其中R4可以为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2可以为1至10的整数，其中R6可以为-(CH2)n3-CO-R7，n3可以为1至10的整数，其中R7可以选自下组：
例如，R2为其中R4可以为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6可以为-(CH2)n4-R8，n4可以为1至10的整数，其中R8可以选自下组：
例如，R2可以为其中R4可以为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6可以为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5可以为1至10的整数，n6可以为1至10的整数，其中R9可以选自下组：H和/>
例如，R2可以为其中R4可以为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7可以为1至10的整数，n8可以为1至10的整数，其中R10可以选自下组：-COOH、-NH2和/>/>
例如，R2可以为其中R4可以为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7可以为1至10的整数，n8可以为1至10的整数，其中R10可以选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11可以选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
例如，R2可以为其中R4可以为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7可以为1至10的整数，n8可以为1至10的整数，其中R10可以选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11可以选自下组：-CF3、-CN和-OCH3。
例如，R2可以为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12可以为其中R13可以为-CH2N3。
例如，该环可以为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
例如，该环可以选自下组：
例如，该L1可以选自下组：/>
/>
例如，所述缀合物可以选自下组：
/>
方法
另一方面，本申请提供了一种缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：通过使式3的缀合物：与M缀合，获得式1的缀合物：/> 为生物大分子，并且M利用M的亲核官能团与L1连接，L2为连接子，并且L2与式1中的R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
例如，该M的亲核官能团可以选自下组：-SH、-NH2、-SeH、-OH和
另一方面，本申请提供了一种缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：通过使式3的缀合物：与M缀合，获得式2的缀合物：/> R为-OH或-F，其中M-S为具有半胱氨酸的生物大分子，M-S利用所述半胱氨酸与L1连接，L2为连接子，并且L2与式3中的R1、R3或R2连接，D为功能性分子，a为1至10的整数，b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R1'为H或其同位素，其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
在本申请中，该方法可以在约16℃至约37℃的范围内的温度下进行。例如，该方法可以在至少约16℃、至少约17℃、至少约18℃、至少约19℃、至少约20℃、至少约21℃、至少约22℃、至少约23℃、至少约24℃、至少约25℃、至少约26℃、至少约27℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、或至少约37℃的温度下进行。
在本申请中，该方法可以在约7.4至约8的范围内的pH下进行。例如，该方法可以在至少约7.4、至少约7.5、至少约7.6、至少约7.7、至少约7.8、至少约7.9或至少约8.0的pH下进行。
在本申请中，该方法可以用催化剂进行。例如，该催化剂可以包含Pd(OAc)2。
在本申请中，该方法还可以包括以下步骤：纯化所述式3的缀合物。
在本申请中，该方法中的缀合可以包括加成反应(例如，可以是亲核加成反应)，其可以属于“点击化学”。例如，M的-SH可以参与该方法中的加成反应。
化合物
另一方面，本申请提供了一种式III的化合物，或其药学上可接受的盐：其中R1选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
例如，R1可以选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
在某些情况下，式III的化合物可以是表1中的化合物中的一种。
表1
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另一方面，本申请提供了一种式IV的化合物，或其药学上可接受的盐：其中R1选自下组：NH-(CH2)n1-CO-R2、-OH、NH-(CH2)n2-R3、NH-(CH2CH2-O)n3-(CH2)n4-NH-CO-O-R4、或/>其中n1、n2、n3、或n4独立地为1至10的整数，其中R2选自下组：/>其中R3选自下组：其中R4为/>
例如，R1可以选自下组：NH-(CH2)2-CO-R2、-OH、NH-(CH2)-R3、NH-(CH2CH2-O)3-(CH2)2-NH-CO-O-R4。
在某些情况下，式IV的化合物可以是表2中的化合物中的一种。
表2
/>
另一方面，本申请提供了一种式V的化合物，或其药学上可接受的盐：其中R1、R2和R4为任意取代基，其中R3选自下组：H、任选取代的烷基-F3、任选取代的烷基-N或O-任选取代的烷基，其中R5选自下组：-COOH、-NH2和/>
例如，R1可以为H。例如，R2可以为H.例如，R4可以为H。
例如，R3可以选自：H、CF3、CN和OCH3。
在某些情况下，式V的化合物可以是表3中的化合物中的一种。
表3
另一方面，本申请提供了一种式VI的化合物，或其药学上可接受的盐：
如本文所使用的，术语“式III”(或式IV、式V、式VI)也可被定义为包括“式III”(或式IV、式V、式VI)的化合物的所有形式，包括水合物、溶剂化物、异构体、结晶和非结晶形式、同晶体、多晶体以及它们的代谢物。例如，式VI的化合物或其药学上可接受的盐可以以非溶剂化和溶剂化得形式存在。当溶剂或水紧密结合时，复合物将具有与湿度无关的明确化学计量。然而，当溶剂或水为弱结合时，如在通道溶剂化物和吸湿性化合物中，水/溶剂含量将取决于湿度和干燥条件。在此类情况下，非化学计量将作为标准。
“式III”(或式IV、式V、式VI)的化合物可以具有不对称碳原子。例如，式VI化合物的碳-碳键可以在本文中使用实线、实线楔形或虚线楔形进行描绘。使用实线来描绘与不对称碳原子的键意在表明包括该碳原子处所有可能的立体异构体(例如，特定的对映异构体、外消旋混合物等)。使用实线或虚线楔形来描绘与不对称碳原子的键意在表明仅包括所示的立体异构体。本申请的化合物可能含有一个以上的不对称碳原子。在这些化合物中，使用实线来描绘与不对称碳原子的键意在表明所有可能的立体异构体都被包括在内。例如，除非另有说明，否则旨在使“式III”(或式IV、式V、式VI)的化合物可以作为对映异构体和非对映异构体或作为外消旋体以及它们的混合物存在。使用实线来描绘与“式III”(或式IV、式V、式VI)的化合物中的一个或多个不对称碳原子的键，以及使用实线或虚线楔形来描绘与同一化合物中其他不对称碳原子的键，意在表明存在非对映异构体的混合物。
本申请的化合物(例如，“式III”(或式IV、式V、式VI)的化合物)可以作为笼合物或其它复合物存在。本发明范围内包括诸如笼合物、药物-宿主包合物等复合物，其中，与前述溶剂化物相比，药物和宿主以化学计量或非化学计量量存在。还包括含有两种或更多种有机和/或无机成分的“式III”(或式IV、式V、式VI)的复合物，这些成分可以是化学计量的量或非化学计量的量。所得复合物可以是电离的、部分电离的或非电离的。有关此类复合物的综述，请参见哈勒布利安(Haleblian)《美国药学杂志》(J.Pharm.Sci.)，64(8)，1269-1288(1975年8月)。
“式III”(或式V、式V、式VI)的立体异构体包括“式III”(或式V、式V、式VI)的化合物的顺式和反式异构体、诸如R和S对映异构体等光学异构体、非对映异构体、几何异构体、旋转异构体、构象异构体和互变异构体，包括表现出一种以上异构类型的化合物；以及它们的混合物(诸如外消旋体和非对映异构体对)。还包括酸加成盐或碱加成盐，其中反离子具有光学活性(例如，D-乳酸盐或L-赖氨酸)，或外消旋性(例如，DL-酒石酸盐或DL-精氨酸)。
药物组合物及用途
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请的缀合物和药学上可接受的载体。
在本申请中，该药物组合物可以包含用药学上可接受的载体呈递的本申请缀合物。该载体可以是固体产品、液体或两者兼而有之，并且可以与该化合物配制成单位剂量组合物(例如片剂)，其按重量计可以含有0.05％至95％的活性化合物。还可以存在其他药理学活性物质。
在本申请中，本发明的缀合物和/或药物组合物可以通过任何合适的途径施用。
另一方面，本申请提供了一种用于调节受试者的肿瘤微环境的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请的缀合物，或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于调节受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请的缀合物，或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请的缀合物，或本申请的药物组合物。
该方法可以是体外法、离体法或体内法。例如，本申请的缀合物可以在体外施用于一个或多个细胞。又如，本申请的缀合物可以施用于有需要的受试者。
在另一方面，本申请提供了本申请的缀合物用于预防和/或治疗有需要的受试者的疾病。
在另一方面，本申请提供了一种用于治疗疾病的药物的制备方法。
例如，该疾病可以是肿瘤。例如，该肿瘤可以是实体瘤。例如，该肿瘤可以是非实体瘤。例如，该实体瘤可以包括肉瘤和癌。该肉瘤可以是指血管、骨骼、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱中的肿瘤。癌可以是指在上皮细胞中形成的肿瘤。设想该实体瘤是非淋巴瘤实体瘤。例如，该实体瘤可以根据形成其的细胞类型命名。
例如，该疾病可以包括肿瘤和/或自身免疫性疾病。
例如，自身免疫性疾病可以包括肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、坏死性血管炎、淋巴结炎、结节性动脉周围炎、系统性红斑狼疮、类风湿、关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、溃疡性结肠炎、系统性硬化症、皮肌炎/多肌炎、抗磷脂抗体综合征、硬皮病、寻常型天疱疮、ANCA相关性血管炎(例如韦格纳氏肉芽肿病、显微镜下多血管炎)、葡萄膜炎、干燥综合征、克罗恩病、赖特综合征、强直性脊柱炎、莱姆关节炎、吉兰-巴雷综合症、桥本甲状腺炎和心肌病。
通常，本申请的缀合物可以以治疗本文所述疾病的有效量施用。本申请的缀合物可以以适合于此类途径的药物组合物的形式，并且以对预期治疗有效的剂量，通过任何合适的途径施用。治疗医学病况进展所需的缀合物的治疗有效剂量，很容易由本领域普通技术人员使用医学领域熟悉的临床前和临床方法进行确定。如本文所使用的，术语“治疗有效量”一般是指将在某种程度上缓解所治疗疾病的一种或多种症状的、正在施用的缀合物的量。
缀合物和/或包含该缀合物的组合物的剂量方案可以基于多种因素，包括患者的类型、年龄、体重、性别和医学病况；病况的严重程度；施用途径；以及所采用的特定化合物的活性。因此，剂量方案可能差异很大。
根据本发明的合适受试者包括哺乳动物受试者。例如，该受试者可以是哺乳动物，例如，受试者可以是人类。
另一方面，本申请提供了一种诊断试剂，所述诊断试剂包含本申请的缀合物。
例如，该诊断试剂可以被标记。
例如，该标记可以选自：放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
实施例
阐述以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并非旨在限制本发明人认为是其发明的范围，也并非旨在表示下面的实验是所有或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应该考虑一定的实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp：一个或多个碱基对；kb：一千或数千碱基；pl：一或数皮升；s或sec：一或数秒；min：一或数分钟；h或hr：一或数小时；aa：一个或多个氨基酸；nt：一个或多个核苷酸；i.m.：肌内(地)；i.p.：腹膜内(地)；s.c.：皮下(地)；等等。
硅胶柱色谱法
硅胶柱色谱法使用硅胶60(200-300目)进行。分析薄层色谱法(TLC)使用硅胶(硅胶60F254)进行。TLC使用短波紫外光作为可视化剂、KMnO4和热能作为显影剂，在预涂硅胶板上进行。
SSF-DNA的合成
向装有5'-NH2-20/59nt ssDNA(50μM最终浓度，1当量)的PBS(50mM，pH 8.0)的Eppendorf管中，加入SSF-NHS(100当量，100mM于DMF中)和DMF。涡旋反应混合物并且在30℃下振荡。孵育过夜后，通过LC-MS分析反应混合物。
Mal-DNA的合成
向装有5'-NH2-20(50μM最终浓度，1当量)的PBS(50mM，pH 8.0)的Eppendorf管中，加入SSF-NHS(100当量，100mM于DMF中)和DMF。涡旋反应混合物并且在30℃下振荡。孵育过夜后，通过LC-MS分析反应混合物。
SSF-DNA与Mal-DNA的水解稳定性
SSF-20nt ssDNA/Mal-20nt ssDNA(100μM终浓度)于PBS(50mM，pH 7.4)中在37℃下振荡48h。通过LC-MS分析20μL反应混合物。
蛋白质-DNA缀合物的合成
将SSF/Mal-DNA(56μL，450mM于H2O中)和PBS(10μL，pH＝8.0，50mM)加入到Nb-PD-L1或其他蛋白质的溶液(50μL，100μM，HEPES缓冲液)中。将反应物在37℃下孵育12h，产生均质的蛋白质-DNA缀合物。
LC-MS
蛋白质缀合和蛋白质-DNA的LC-MS分析(GFP-20ntssDNA，neo2-20ntssDNA)：在与Acquity高效液相色谱(UPLC)系统耦合的Xevo G2-S TOF质谱仪上，使用Acquity UPLC蛋白BEH C4色谱柱(1.7mm，2.1×50mm)，进行LC–MS。使用溶剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)作为流动相，流速为0.5ml/min。使用的梯度：无梯度95％ H2O保持2min，然后在4min内95％至10％ H2O，然后在1min内10％ H2O，然后在1min内10％至95％ H2O，然后95％ H2O保持2min。电喷雾离子源在正离子模式下运行，其中毛细管的毛细管电压为2.0kV，锥孔电压为40V。使用氮气作为脱溶剂气体，总流量为850L/h。根据制造商的说明，使用预装在MassLynx软件上的MaxEnt算法(4.1版，来自Waters)从离子系列重建总质谱。为了获得所述离子系列，选择色谱图的主峰进行积分和进一步分析。
SSF-DNA、Mal-DNA和Nb-PD-L1-ssDNA的LC-MS分析：在与Acquity高效液相色谱(UPLC)系统耦合的Xevo G2-S TOF质谱仪上，使用Acquity UPLC蛋白BEH C8色谱柱(1.7mm，2.1×50mm)，进行LC–MS。使用溶剂A(10mM甲酸铵水溶液)和溶剂B(100％甲醇)作为流动相，流速为0.5ml/min。使用的梯度：无梯度95％ H2O保持2min，然后在4min内95％至5％ H2O，然后在1min内5％ H2O，然后在1min内5％至95％ H2O，然后95％ H2O保持2.5min。电喷雾离子源在负模式下运行，其中毛细管电压为2.0kV，锥孔电压为80V。使用氮气作为脱溶剂气体，总流量为850L/h。根据制造商的说明，使用预装在MassLynx软件上的MaxEnt算法(4.1版，来自Waters)从离子系列重建总质谱。为了获得所述离子系列，选择色谱图的主峰进行积分和进一步分析。
肽-MA缀合的LC-MS分析：在与Acquity高效液相色谱(UPLC)系统耦合的Xevo SQDetector 2质谱仪上，使用Acquity UPLC BEH300 C18色谱柱(1.7mm，2.1×50mm)，进行LC–MS。使用溶剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(乙腈)作为流动相，流速为0.4ml/min。方法A：使用的梯度：无梯度90％ H2O保持2min，然后在5min内90％至10％ H2O，然后10％ H2O保持1min，然后在1min内10％至90％ H2O，然后95％ H2O保持1min。方法B：使用的梯度：无梯度90％ H2O保持2min，然后在15min内90％至70％ H2O，然后70％至10％ H2O保持20min，然后在1min内10％至90％ H2O，然后95％ H2O保持2min。电喷雾离子源在正离子模式下运行，其中毛细管电压为2.0kV，锥孔电压为40V。使用氮气作为脱溶剂气体，总流量为850L/h。根据制造商的说明，使用预装在MassLynx软件上的MaxEnt算法(4.1版，来自Waters)从离子系列重建总质谱。为了获得所述离子系列，选择色谱图的主峰进行积分和进一步分析。
蛋白质缀合的LC-MS/MS分析：对于凝胶内酶切，首先通过SDS-PAGE分解所标记的GFP，并且用考马斯亮蓝色对凝胶进行染色。切除GFP条带，切成小颗粒并且转移到预清洁的微量离心管中。所得凝胶颗粒用50％ ACN于25mM碳酸氢铵(ABC)中脱盐两次，并且之后在ACN中脱水。凝胶颗粒用20mM DTT于25mM ABC中进行再水化，并且在55℃孵育45min。凝胶颗粒用25mM ABC洗涤并且用乙腈再次脱水，然后在室温下，用55mM碘乙酰胺于25mM ABC中避光孵育30min。处理后的凝胶颗粒用25mM ABC洗涤，并且在乙腈中再次脱水。然后，凝胶颗粒于胰蛋白酶溶液(20ng/μL)中进行再水化，并且在37℃孵育16h。为了提取胰蛋白酶肽，将凝胶颗粒浸泡在ACN/水/FA溶液(v:v:v＝50:45:5)中，涡旋30min。小心地除去溶液，并且重复提取一次。将提取物合并，并且在真空离心机中干燥。在与Easy-nLC 1200LC系统耦合的Orbitrap Fusion Lumosmass光谱仪(Thermo Fisher Scientific)上，进行LC-MS/MS。将肽样品上样到分析柱(1.9μm，C18，250mm*75μm内径)并且以65min梯度洗脱。质谱仪在数据依赖模式下运行。使用Orbitrap质量分析仪，在350-1500的m/z范围内采集全扫描光谱。使用HCD模式进行MS/MS裂解。归一化碰撞能量为30V。通过Pfind3分析原始数据，并且依据UniProt数据库中的牛蛋白质组进行搜索。将半胱氨酸的氨基甲酰甲基化设定为固定修饰。将蛋氨酸的氧化和半胱氨酸残基的修饰设定为可变修饰。当评分(PSM评分、肽谱匹配评分)高于26时，认为2b-1a或2b+1a修饰的肽被正确鉴定，并且手动验证经修饰位点。
NMR
在Bruker AVANCE III-400或500光谱仪上并且在氘氯仿(CDCl3)中，进行NMR实验测量。1H NMR和13C NMR光谱分别在400MHz或500MHz和100MHz或125MHz光谱仪上记录。19FNMR光谱在376MHz或470MHz光谱仪上记录。化学位移被报告为相对于内部TMS(1H NMR为δ0.00)、氯仿(1H NMR为δ7.26)和氯仿(13C NMR为δ77.00)的δ值。以下缩写用于多重性：s：单峰，d：双重峰，dd：双重双重峰，t：三重峰，q：四重峰，m：多重峰，br：质子光谱的宽信号。质谱通过ESI-MS(LCQ Fleet，Thermo Fisher Scientific)进行测量。
细胞条形码和scRNA-seq
Jurkat、A549、JIMT-1和MDA-MB-231的细胞混合物在4℃下，用Nb-PD-L1-59ntssDNA染色30min。在洗涤并且检测细胞数量和细胞活力后，将细胞池化并且上样到Singleron(GEXSCOPE单细胞RNA-seq试剂盒，新格元(南京)生物科技有限公司，中国南京)上靶向20,000个细胞的微孔芯片中。scRNA-seq库根据制造商的说明制备(新格元(南京)生物科技有限公司，中国南京)。扩增后，cDNA和Nb-PD-L1-59ntssDNA标签分别通过SPRI大小选择(SPRI为0.6×和1.4×)进行分离。对Nb-PD-L1-59ntssDNA标签库进行定量(Qubit，Invitrogen)并且使用引物SGR-微珠-1/SGR-标签-1扩增，并且用引物SGR-微珠-2/SGR-标签-2，通过额外的PCR进行索引。最终Nb-PD-L1-59ntssDNA标签库和转录组库在BioAnalyzer高灵敏度DNA试剂盒(Agilent)上进行分析，并且在Illumina NovaSeq 6000上进行测序。
用于制备Nb-PD-L1-标记库的引物
蛋白质序列
工程化Neo2序列：工程化Neo2由124个氨基酸和1个游离半胱氨酸组成。
MLVNRICGKGIDGGSPKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFSAVDHHHHHH(SEQ ID NO.5)
工程化Nb-Pd-L1序列：工程化Nb-Pd-L1由143个氨基酸和1个游离半胱氨酸组成。
MDQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTTSGSTYLADSVKGRFTISQNNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTQVTVSSLPETGGCHHHHHH(SEQ ID NO.6)
GFP序列：工程化GFP由243个氨基酸和3个游离半胱氨酸组成。
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRICLKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGGGGLEHHHHHH(SEQ ID NO.7)
曲妥珠单抗轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO.8)；
曲妥珠单抗重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESLTQPEGKNNTTKPPKVSNKALPAPIEKTISKSRKQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKSLKSPK(SEQ ID NO.9)
KN026的轻链和重链的氨基酸序列可参考US2018/0291103，KN046的轻链和重链的氨基酸序列可参考US20210095031A1。
DNA序列
20ntssDNA：5'-NH2-C6-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG(SEQ ID NO.10)
59ntssDNA：5’-NH2-C6-TGT CAA GAT GCT ACC GTT CAG AGC GCA AGA CAC TCCACA AAA AAA AAA AAA AAA AAA*A*A*硫代修饰(SEQ ID NO.11)
数据分析
原始序列读取使用CeleScope管道(1.3.1版)和默认参数进行处理(https://github.com/singleron-RD/CeleScope)。Nb-PD-L1-59ntssDNA标签库使用CeleScope的新功能条形码处理插件(“teg”)进行处理，该插件受启发于以前的scRNA-seq多路复用算法。然后，使用R语言分析基因表达基质。
用MA修饰GFP
将MA(1μL，20mM于DMSO中)和PBS(15μL，pH＝7.4/9.0，50mM)加入到GFP溶液(4μL，250μM，HEPES缓冲液)中。在37℃孵育2h后，将溶液脱盐得到GFP-MA。
连接子稳定性研究
将GSH(0.8μL，100mM)和PBS(20μL，pH＝8.0，50mM)在37℃加入到GFP-连接子溶液(20μL，40μM，PBS溶液)中，保持48h(图20)
实施例1：筛选迈克尔接受体作为连接子
迈克尔接受体是在抗体上与半胱氨酸进行加成反应的常用试剂。已对一种新型迈克尔接受体进行了研究，以便其可以有效且化学选择性地在抗体上与半胱氨酸发生化学反应。并且用抗体修饰迈克尔接受体后，血清中没有发生降解。基于此，使用候选迈克尔接受体作为反应试剂，其中将绿色荧光蛋白视为模板蛋白，用于筛选迈克尔接受体。考虑到反应性、化学选择性和稳定性，筛选出能够与半胱氨酸高效反应的迈克尔接受体。
反应过程见图1。并且下列迈克尔接受体候选物的化学结构在图2中显示。
表4.迈克尔接受体的筛选
条目1 迈克尔接受体 时间(h) 加成数 转化率(％)
1 MA 1 2 -2 >99
2 MA 2 2 2 >99
3 MA 3 2 1 60
4 MA 4 2 0 0
5 MA 5 2 0 0
6 MA 6 2 2 60
7 MA 7 2 2 <20
8 MA 8 2 0 60
9 MA 9 2 0 0
1反应条件：sfGFP E124C(320μM，5μL)，迈克尔接受体(6.4μL，5mM)，PBS缓冲液(40μL，pH＝8)，37℃，2h。2加成数无归属。
并且将迈克尔接受体MA 2命名为试剂1或PhESF。
实施例2：连接子的修饰
修饰实施例1中的试剂1(经修饰迈克尔接受体候选物的化学结构在图3中显示)。
当试剂1的苯环用不同的取代基(迈克尔接受体1-1至1-4)修饰时，研究了不同取代基对加成反应(例如，加成活性)的影响(表5)。迈克尔接受体1-1至1-4与sfGFP-TEV反应。当硫氟基团的对位与强吸电子基团三氟甲氧基连接时，加成活性显著降低(条目4)；当供电子基团甲氧基和羟甲基附接到硫代氟基团的对位，并且吸电子基团三氟甲基附接到间位时，加成反应活性没有显著变化(条目2-3，条目5)。当磺酰氟基团附接到丙二烯1-5时，其加成反应活性显著降低(条目6)。
反应过程可见图4。
表5：试剂1衍生物对sfGFP-TEV的修饰
实施例3：连接子的修饰
使用不同构型的烯基磺酰氟(经修饰迈克尔接受体候选物的化学结构在图5中显示)，研究不同构型的烯烃磺酰氟对加成反应的作用(表6)。当使用5当量的迈克尔接受体与sfGFP E124C反应时，迈克尔接受体1、1a、1b和1a-1均表现出良好的化学选择性；而迈克尔接受体1b-1不仅与半胱氨酸反应，还与赖氨酸反应。当使用20当量的迈克尔接受体与sfGFPE124C反应时，只有迈克尔接受体1具有良好的化学选择性。
反应过程可见图6。
表6
实施例4：所选连接子的特征
4.1选择性
为了进一步验证迈克尔接受体1的反应性、化学选择性和稳定性，选择先前文献中报道的连接子(例如，ADC中使用的连接子)作为比较例，以证明迈克尔接受体1具有良好的反应选择性。
先前报道的连接子的化学结构在图7中显示。sfGFP E124C与先前报道的连接子之间的反应的反应过程可见图8。反应结果在图9中显示；反应条件：sfGFP E124C(320μM，5μL)，连接子(5mM，6.4μL)，PBS缓冲液(40μL，pH＝8)，37℃，2h。
4.2竞争性
为了验证它们在反应性方面的差异，在竞争性试验中做了比较例(图10)，并且结果显示迈克尔接受体1的反应性适中：这意指其反应性高于烯基磺酸酰胺和炔基磷酸酯，低于马来酰亚胺(5)和羰基丙烯酰胺(4)(表7)。
表7
/>
1反应条件：sfGFP E124C(320μM，5μL)，1(5mM，3.2μL)，x(5mM，3.2μL)，PBS缓冲液(40μL，pH＝8)，37℃，2h。
4.3稳定性
使用具有较高反应性的连接子5和4作为对照，验证经sfGFP修饰的PhESF作为连接子的稳定性。sfGFP经修饰后，将其加入到含有GSH的缓冲液中，并且在37℃下放置不同的时间，并且进行质谱分析。从质谱结果可以看出，具有经修饰sfGFP的连接子4和5均明显地发生硫醇交换。然而，在相同的条件下，迈克尔接受体1没有硫醇交换(图11a至图11c)。
实施例5：生成包含连接子和抗体的缀合物
使用迈克尔接受体1修饰抗体(例如，赫赛汀)(图12a至图12b)，并且验证对抗体的修饰不会影响其与抗原的结合能力(图12c)。
实施例6：连接子的进一步修饰
迈克尔接受体1没有另外可修饰的基团。因此，将迈克尔接受体1修饰为具有叠氮基团，然后使用经修饰迈克尔接受体1修饰抗体，并且在血清中测试缀合抗体的稳定性。
质谱检测揭示，经修饰抗体在血清中7天后未发生消除反应(图13a至图13C)。在图13中，图13a显示了经N3-PhESF化学选择性修饰的赫赛汀；图13b显示了经N3-PhESF修饰的抗体质谱的结果；图13c显示了赫赛汀-PhESF-N3在血清稳定性试验中的结果。
实施例7：生成包含连接子和药物的缀合物
使用迈克尔接受体1作为连接子来合成ADC。为了提高迈克尔接受体1的溶解度，在迈克尔接受体1上对聚乙二醇进行修饰(图14a)，然后将毒素MMAE缀合到可切割的vc-PAB(图14b)，并且最后进行缩合反应得到ADC：PhESF-PEG4-MMAE(图14c)。
实施例8：生成ADC
8.1DAR＝3.2
使用实施例7中获得的PhESF-PEG4-MMAE与还原的抗体反应，以合成DAR约为3.2的ADC(赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE)。作为比较例，还合成了DAR约为3.2的ADC(赫赛汀-马尔-MMAE)。
首先研究两种ADC在血清中的稳定性，并且发现以迈克尔接受体1为连接子的ADC的DAR值在7天后没有明显下降，而使用马来酰亚胺的ADC的DAR值下降了70％(图15a至图15c)。
图15a至图15c显示了ADC稳定性测试的结果。图15a显示了人血清中ADC稳定性测试结果；图15b显示了赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE在血清中不同时间点的质谱结果；图15c显示了赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE在血清中不同时间点的质谱结果。
8.2DAR＝3.8
以MMAE为药物的ADC的DAR值一般不超过4。为了增强杀伤效果，合成DAR值约为3.8的ADC，并且用质谱法进行验证(图16a至图16b)。作为比较例，还合成了DAR约为3.8的ADC(赫赛汀-马尔-MMAE)。
图16a显示了赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE的结构和质谱结果；图16b显示了赫赛汀-Mal-MMAE的结构和质谱结果。
实施例9：肿瘤细胞杀伤试验
使用两种ADC(实施例8制备的赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE和赫赛汀-Mal-MMAE)进行肿瘤细胞杀伤试验，从结果可以看出，两种ADC对HER2+细胞SKBR3、NCI-N87、MDA-MB-435的杀伤效率相似(图17a至图17c)。
赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE对3种细胞的IC50值分别为18.3ng/mL、7.76ng/mL、14.66ng/mL，并且赫赛汀-Mal-MMAE的IC50值分别为24.48ng/mL、10.94ng/mL和12.03ng/mL。
对于HER-细胞MDA-MB-231和HER-细胞MDA-MB-435，两种ADC均未表现出明显的杀伤效果(图17d至图17e)。
发现赫赛汀-Mal-MMAE在高浓度下能够显著杀死HER2-细胞，而赫赛汀-PhESF-PEG4-MMAE在高浓度下未显示明显的杀伤效果(图17f)。
然后，对ADC进行旁观者致死性试验，发现稳定的迈克尔接受体1不影响其旁观者致死性(图17g)。
图17a至图17h显示了肿瘤细胞杀伤试验的结果。图17a显示了对SKBR3细胞的杀伤结果，图17b显示了对NCI-N87细胞的杀伤结果；图17c显示了对HER+MDA-MB-435细胞的杀伤结果；图17d显示了对HER-MDA-MB-435细胞的杀伤结果；图17e显示了对MDA-MB-231细胞的杀伤结果；图17f显示了相对高浓度的ADC对MDA-MB-231细胞的杀伤结果；图17g显示了ADC旁观者杀伤试验结果，并且图17h显示了浓度为10ug/mL的ADC对MDA-MB-231细胞的杀伤结果。
实施例10：化学合成与分析
实施例10.1：SSF-PEG4-PAB-MMAE 1的合成
化合物S2是基于先前公开的程序合成的。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.52(2H,d,J＝8.8Hz),6.68(2H,d,J＝8.8Hz),4.07(2H,t,J＝4.6Hz),4.00(2H,s),3.83(2H,t,J＝4.6Hz),3.70-3.65(12H,m),1.46(9H,s)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ169.68,158.69,138.17,117.06,82.92,81.58,70.83,70.71,70.60,69.60,69.03,67.53,28.12。HRMS m/z(ESI)：C20H31IO7[M+H]+计算值：511.1193，实测值511.1192。
叔丁基(E)-14-(4-(2-(氟磺酰基)乙烯基)苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷酸酯(化合物S4)：
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有AgTFA(2.4mmol，1.2当量)、Pd(OAc)2(22mg，5mol％)、丙酮(5mL)、S2(1.02g，2mmol)和乙烯S3(440mg，4.0mmol，2当量)。所得混合物在60℃下回流12h。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到S4。(403mg,82％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.71(1H,d,J＝15.2Hz),7.48(2H,d,J＝8.8Hz),6.97(2H,d,J＝8.8Hz),6.70(1H,dd,J＝15.2Hz,2.4Hz),4.17(2H,t,J＝4.6Hz),4.00(2H,s),3.86(2H,t,J＝4.6Hz),3.72-3.64(12H,m),1.46(9H,s)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：169.65,162.50,148.60,131.08,123.68,115.43,114.82,114.54,81.59,70.87,70.70,70.58,69.45,69.00,67.75,28.09；19F(376MHz,CDCl3)：δ+63.01；HRMS m/z(ESI)：C22H33FO9S[M+H]+计算值：493.1908，实测值493.1904：
(E)-14-(4-(2-(氟磺酰基)乙烯基)苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷酸(化合物S5)
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有S4(286mg，0.5mmol)、TFA(2mL)和CH2Cl2(2mL)。所得混合物室温孵育4h。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到S5(192mg，90％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.73(1H,d,J＝15.2Hz),7.49(2H,d,J＝8.8Hz),6.98(2H,d,J＝8.8Hz),6.70(1H,dd,J＝15.2Hz,2.4Hz),4.19(2H,t,J＝4.6Hz),4.11(2H,s),3.89(2H,t,J＝4.6Hz),3.75-3.71(4H,m),3.68-3.65(8H,m)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：171.77,162.38,148.61,131.10,123.77,115.46,114.87,114.59,71.13,70.90,70.58,70.35,70.23,70.15,69.44,69.17,67.53；19F(376MHz,CDCl3)：δ+63.00；HRMS m/z(ESI)：C18H25FO9S[M-H]-计算值：435.1125，实测值435.1138。
SSF-PEG4-vc-PAB-MMAE 1
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有EDC(0.1mmol，2当量)、DIPEA(0.15mmol，3当量)、干DMF(2mL)、S5(22mg，0.05mmol，1当量)和S6(67mg，0.06mmol，1.2当量)。所得混合物在室温下孵育12h。粗产物通过制备型HPLC纯化，得到6(26mg，34％)。HRMS m/z(ESI)：C76H117FN10O20S[M+H]+计算值：1541.8229，实测值1541.8230。产物1通过LC-MS进行分析。
1的LC-MS色谱图和质谱图
结果在图18中示出。
实施例10.2：SSF-PEG4-GGFG-Dxd 3的合成
(E)-2-(4-(((S)-10-苄基-1-(((1R,9R)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15,18-六氧杂-3,20,23,26,29-五氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂三十一烷-31-基)氧基)苯基)乙烯-1-磺酰氟(化合物SSF-PEG4-GGFG-Dxd 3)
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有EDC(0.04mmol，2当量)，DIPEA(0.06mmol，3当量)，干DMF(2mL)，S7(16.8mg，0.02mmol，1当量)和S5(10.5mg，0.024mmol，1.2当量)。将所得混合物在室温下孵育12h。粗产物通过制备型HPLC纯化，得到3(8.0mg，32％)。HRMS m/z(ESI)：C76H117FN10O20S[M+Na]+计算值：1281.4238，实测值1281.4196。产物3通过LC-MS进行分析。
结果在图19中显示。
实施例10.3：MA 16-生物素的合成
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(E)-2-(4-(叠氮甲基)苯基)乙烯-1-磺酰氟(化合物MA 16)：
在惰性气体氛围下，向S9(432mg，2mmol，1当量)的无水DMF(2mL)溶液中滴加二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)(2mmol，1当量)。混合物冷却至0℃，并且滴加二氮杂双环十一烯(DBU)(2mmol，1当量)。所得混合物在室温下搅拌12h，并且用水淬灭。溶液用DCM提取。用盐水合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到MA 16(120mg，25％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.81(1H,d,J＝15.4Hz),7.58(2H,d,J＝6.8Hz),7.43(2H,d,J＝6.8Hz),6.88(1H,dd,J＝15.4Hz,2.8Hz),4.43(2H,s)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：148.01,140.31,129.48,128.93,118.61,118.33,54.16；19F(376MHz,CDCl3)：δ+62.32；HRMS m/z(ESI)：C9H8FN3O2S[M+H]+计算值：242.0400，实测值242.0402。
(E)-2-(4-((4-(15-氧代-19-((3aS,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-2,5,8,11-四氧杂-14-氮杂十九烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)苯基)乙烯-1-磺酰氟(化合物MA 16-生物素)
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有CuSO4·5H2O(0.005mmol，0.1当量)、BTTP(0.01mmol，0.2当量)、ASC(0.02mmol，0.4当量)、DMSO(1.5mL)、H2O(0.5mL)和S10(0.055mmol，1.1当量)和MA 16(0.05摩尔，1当量)。所得混合物在37℃下反应12h。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到MA 16-生物素(31mg，89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.80(1H,s),7.58(1H,d,J＝15.2Hz),7.45(1H,d,J＝8.0Hz),7.19-7.13(3H,m),5.40(2H,s),4.40(2H,s),4.22-4.19(1H,m),4.03-4.00(1H,m),3.38-3.33(4H,m),3.31-3.28(6H,m),3.23-3.20(2H,m),3.05-3.00(3H,m),2.92-2.87(1H,m),2.64-2.60(1H,m),2.42-2.39(1H,m),1.91(2H,t,J＝7.4Hz),1.41-1.28(4H,m),1.16-1.10(2H,m)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：174.83,164.69,147.83,139.64,131.68,129.65,128.57,119.23,118.95,70.12,70.01,70.07,69.82,69.52,69.12,63.43,62.10,60.39,55.57,53.15,39.61,38.98,35.28,28.33,28.06,25.43；19F(376MHz,CDCl3)：δ+59.81；HRMS m/z(ESI)：C30H43FN6O8S2[M+H]+计算值：699.2946，实测值699.2942。
实施例10.4：SSF-NHS的合成
化合物S10是基于先前公开的程序合成的。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.54(2H,d,J＝8.9Hz),6.66(2H,d,J＝8.9Hz),3.92(2H,t,J＝6.4Hz),2.40(2H,t,J＝7.4Hz),1.83-1.74(2H,m),1.73-1.67(2H,m),1.56-1.78(2H,m)；HRMS m/z(ESI)：C12H15IO3[M-H]-计算值：332.9988，实测值332.9985。
叔丁基6-(4-碘苯氧基)己酸酯(化合物S12)：
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有S11(501mg，1.5mmol，1当量)，tBuOH(5当量)，无水DCM(2mL)。混合物冷却至0℃，滴加DMAP(0.1当量)。然后加入DCC(1.1当量)。所得混合物在室温下搅拌过夜。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到S12。(444.6mg,76％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.53(2H,d,J＝8.9Hz),6.66(2H,d,J＝8.9Hz),3.91(2H,t,J＝6.4Hz),2.24(2H,t,J＝7.4Hz),1.81-1.74(2H,m),1.68-1.60(2H,m),1.51-1.46(2H,m),1.44(9H,s)；HRMS m/z(ESI)：C16H23IO3[M+H]+计算值：391.0770，实测值391.0773。
叔丁基(E)-6-(4-(2-(氟磺酰基)乙烯基)苯氧基)己酸酯(化合物S13)：
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有AgTFA(0.6mmol，1.2当量)、Pd(OAc)2(5.5mg，5mol％)、丙酮(2mL)，S12(1.02g，0.5mmol)和乙烯S3(220mg，1mmol，2当量)。所得混合物在60℃下回流12h。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到S13。(163.7mg,88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.74(1H,d,J＝15.4Hz),7.49(2H,d,J＝8.8Hz)6.93(2H,d,J＝8.8Hz),6.68(1H,dd,J＝2.8Hz),4.02(2H,t,J＝6.4Hz),2.25(2H,t,J＝7.4Hz),1.86-1.79(2H,m),1.70-1.63(2H,m),1.54-1.51(2H,m),1.44(9H,s)；19F(376MHz,CDCl3)：δ+63.07；HRMS m/z(ESI)：C18H25FO5S[M+H]+计算值：373.1485，实测值373.1486。
(E)-6-(4-(2-(氟磺酰基)乙烯基)苯氧基)己酸(化合物S14)：
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有S12(93mg、0.25mmol)、TFA(2mL)和DCM(2mL)。所得混合物室温搅拌4h。粗品通过硅胶柱色谱法纯化，得到S13(72mg，92％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.74(1H,d,J＝15.4Hz),7.49(2H,d,J＝8.8Hz)6.94(2H,d,J＝8.8Hz),6.69(1H,dd,J＝2.6Hz),4.02(2H,t,J＝6.4Hz),2.41(2H,t,J＝7.4Hz),1.91-1.81(2H,m),1.77-1.69(2H,m),1.58-1.52(2H,m)；19F(376MHz,CDCl3)：δ+63.05；HRMS m/z(ESI)：C14H17FO5S[M-H]-计算值：315.0702，实测值315.0703。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基(E)-6-(4-(2-(氟磺酰基)乙烯基)苯氧基)己酸酯(化合物SSF-NHS)
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有S14(63mg，0.2mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(1.2当量)、EDC(1.2当量)和CH2Cl2(4mL)。所得混合物在室温下搅拌12h。完成后，用20mL水淬灭反应，并且用20mL DCM提取3次。合并有机相，用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到SSF-NHS(67mg，81％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.74(1H,d,J＝15.4Hz),7.49(2H,d,J＝8.8Hz)6.94(2H,d,J＝8.8Hz),6.69(1H,dd,J＝15.4Hz 2.6Hz),4.03(2H,t,J＝6.4Hz),2.84(4H,s),2.66(2H,t,J＝7.4Hz),1.88-1.82(4H,m),1.64-1.59(2H,m)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：169.17,168.46,162.70,148.68,131.12,123.48,115.31,114.35,67.87,33.96,30.84,28.54,25.60,24.29；19F(376MHz,CDCl3)：δ+63.06；HRMS m/z(ESI)：C18H20FNO7S[M+H]+计算值：436.0842，实测值436.0827。
实施例10.5：SSF-OSO2F的合成
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有SN38(98.3mg，0.25mmol)、Et3N(3当量)和DCM(2mL)。混合物在SO2F2球囊下室温搅拌24h。通过加入盐水(30mL)淬灭反应并用DCM(30mL)提取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤并且减压浓缩。残余物通过柱色谱法纯化，得到黄色泡沫形式的SN38-OSO2F(100.5mg，85％)。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.37(1H,d,J＝2.6Hz),8.33(1H,d,J＝9.4Hz)7.66(1H,s)5.60(1H,d,J＝16.4Hz),5.41-5.37(3H,m),3.29-3.27(2H,m),1.99-1.94(2H,m),1.43(3H,t,J＝7.6Hz),1.01(3H,t,J＝7.4Hz)。
体内细胞毒性研究
在37℃下，在5％ CO2的存在下，以每孔5,000个细胞将细胞接种在96孔板中，保持24h。将SN38、SN38-OSO2F的连续稀释液添加到完全生长培养基中的细胞中，并且在5％CO2的存在下在37℃下孵育96h。使用Cell Counting-Lite 2.0发光细胞活力测定(Vazyme，DD1101-01)评价细胞活力。将细胞活力绘制为未处理细胞的百分比。每次测量一式三份。
图30显示了使用细胞系(N87)评估SN38、SN38-OSO2F的细胞活力测定结果。
步骤10.7：SSF-PEG4-T785的合成
加入烘箱干燥的反应管(20mL)，其中装有EDC(0.1mmol，2当量)、DIPEA(0.15mmol，3当量)、干DMF(2mL)、T785(15.6mg，0.05mmol，1当量)和S5(26mg，0.06mmol，1.2当量)。所得混合物在室温下孵育12h。粗产物通过制备型HPLC纯化，得到SSF-PEG4-T785(15.6mg，24％)。HRMS m/z(ESI)：C36H48FN5O8S[M+H]+计算值：730.3286，实测值730.3253。
实施例11：抗体-生物素缀合物的合成
实施例11.1：曲妥珠单抗-MA 16-Cy5.5缀合物的合成
用MA 16进行半胱氨酸选择性蛋白质修饰
将MA 16(1μL，20mM于DMSO中)和PBS(15μL，pH＝7.5，50mM)加入到蛋白质溶液(4μL，250μM，于PBS缓冲液中)中。在37℃孵育2h后，溶液脱盐，在LC-MS分析之前得到产物。
抗体的还原
将TCEP·HCl(2.6μL，25mM于PBS中)加入到抗体(KN026、KN046、曲妥珠单抗)溶液(40μL，160μM于PBS溶液中)中，并且所得溶液在37℃下孵育2h。在进行LC-MS分析之前，溶液脱盐，得到还原的抗体。
将MA 16-生物素(1.6μL，5mM于DMSO中)和PBS(34.5μL，pH＝7.4，50mM)加入到抗体溶液(4μL，100μM，于PBS缓冲液中)中。在37℃孵育2h后，溶液脱盐，在LC-MS分析之前获得抗体生物素缀合物。
曲妥珠单抗-MA 16-Cy5.5缀合物的合成
将MA 16(1.6μL，5mM于DMSO中)和PBS(34.5μL，pH＝7.4，50mM)加入到曲妥珠单抗溶液(4μL，100μM，于PBS缓冲液中)中。在37℃孵育2h后，溶液脱盐，得到曲妥珠单抗-MA 16。
将DBCO-Cy5.5(0.8μL，5mM于DMSO中)和PBS(15μL，pH＝7.4，50mM)加入到曲妥珠单抗-MA 16溶液(4μL，50μM，于PBS缓冲液中)中。在37℃孵育12h后，溶液脱盐，在LC-MS分析之前获得曲妥珠单抗--MA 16-Cy5.5。
抗体缀合物的SDS–PAGE分析
2μL曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-MA 16-Cy5.5和曲妥珠单抗-MA 16-生物素与10μL超纯水和含有2-巯基乙醇的4μL SDS–PAGE上样缓冲液混合。样品加热至95℃或加热10min，并且完全上样到SDS-PAGE凝胶上。
实施例11.2：曲妥珠单抗-1(赫赛汀-PhESF-MMAE)的合成
1(即SSF-PEG4-PAB-MMAE 2.6μL，25mM于DMSO中)，将DMSO(17.4μL)和PBS(280μL，pH＝7.4，50mM)加入到曲妥珠单抗溶液(100μL，130μM，PBS缓冲液)中。在25℃孵育2h后，溶液脱盐，得到曲妥珠单抗-1。
实施例11.3：曲妥珠单抗-2(赫赛汀-Mal-MMAE)的合成
2(即Mal-vc-PAB-MMAE 1.8μL，25mM于DMSO中)，将DMSO(18.2μL)和PBS(280μL，pH＝7.4，50mM)加入到曲妥珠单抗溶液(100μL，130μM，PBS缓冲液)中。在25℃孵育2h后，溶液脱盐，得到曲妥珠单抗-2。Mal-VC-PAB-MMAE购自山东美泰医药有限公司。
实施例11.4：曲妥珠单抗-3(赫赛汀-PhESF-Dxd)的合成
3(即SSF-PEG4-GGFG-Dxd 1.5μL，25mM于DMSO中)，将DMSO(0.5μL)和PBS(10μL，pH＝9.0，50mM)加入到曲妥珠单抗溶液(10μL，130μM，PBS缓冲液)中。在37℃孵育12h后，溶液脱盐，得到曲妥珠单抗-3。
图28显示了曲妥珠单抗-3的去卷积完整蛋白MS。
步骤11.5：曲妥珠单抗-T785的合成
SSF-PEG4-T785(13μL，10mM于DMSO中)，将DMSO(27μL)和PBS(560μL，pH＝9.0，50mM)加入到曲妥珠单抗溶液(200μL，130μM，PBS缓冲液)中。在25℃孵育2h后，溶液脱盐，获得曲妥珠单抗-T785。
图29显示了曲妥珠单抗-T785的去卷积完整蛋白MS。
实施例12：MA 16相关缀合物的分析
抗体缀合物的SDS-PAGE分析
2μL曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-MA 16-Cy5.5和曲妥珠单抗-MA 16-生物素与10μL超纯水和含有2-巯基乙醇的4μL SDS–PAGE上样缓冲液混合。样品加热至95℃或加热10min，并且完全上样到SDS-PAGE凝胶上。
使用MA 16衍生物的检测探针对曲妥珠单抗进行修饰的结果如图24所示。
图24A显示了使MA16-生物素和MA16-Cy5.5附接到曲妥珠单抗上的合成方案。曲妥珠单抗-MA16-生物素的反应条件：20μM曲妥珠单抗，400μM MA16-生物素，PBS，37℃，2h。曲妥珠单抗-MA16的反应条件：20μM曲妥珠单抗，400μM MA16，PBS，37℃，2h。曲妥珠单抗-MA16-Cy5.5的反应条件：10μM曲妥珠单抗-MA16，200μM DBCO-Cy5.5，PBS，37℃，12h。图24B和图24C显示了曲妥珠单抗与MA16-生物素反应前后的SDS-PAGE凝胶、蛋白质印迹和LC-MS分析。
流式细胞法测定
细胞悬浮在含有曲妥珠单抗-MA 16-生物素或对照曲妥珠单抗的流式细胞术缓冲液(含2％ FBS的PBS)中，并且在4℃下孵育45min。用流式细胞术缓冲液洗涤两次后，细胞与APC-链霉亲和素(BioLegend，405207)在4℃下进一步孵育30min，重悬并且用流式细胞术缓冲液洗涤两次，并且使用Agilent流式细胞仪(Angilent NovoCyte Quanteon)进行分析。采用同种型对照抗体染色来确定阳性和阴性细胞的门限。使用Agilent Novoexpress用于所有流量数据分析。
图24D显示了曲妥珠单抗-MA16-生物素染色的癌细胞的流式细胞术分析。NCI-N87(HER2+)和MDA-MB-468细胞(HER2-)与曲妥珠单抗-MA16-生物素一起孵育，而对照组则用曲妥珠单抗处理。染色后，细胞进一步用SA-APC染色以检测生物素。
图24E和图24F显示了用Cy5.5修饰前后通过荧光成像(右)、考马斯染色(左)和LC-MS对曲妥珠单抗进行的分析。
荧光成像
MDA-MB-231和NCI-N87细胞在37℃下在无菌玻璃盖玻片或载玻片上生长过夜。用DPBS短暂洗涤后，将切片与20μg/mL曲妥珠单抗-MA 16-Cy5.5一起在37℃下孵育1h。用编码GFP的质粒转染MDA-MB-231细胞。然后，共培养的细胞在显微镜下以40X的放大倍数成像。
图24G显示了启用曲妥珠单抗-MA16-Cy5.5的特定细胞表面HER2检测(比例尺50μm)的荧光成像。
实施例13：曲妥珠单抗相关缀合物的分析
实施例13.1：人体稳定性研究
在Eppendorf中，针对每个样品，将90μL人血清与10μL曲妥珠单抗-1(20mg/ml)或曲妥珠单抗-2分别混合，得到0.2mg/mL ADC于人血清中的最终溶液。样品在人和小鼠中于37℃孵育3天和7天。样品在小鼠血清中于37℃孵育3天。第0天的样品直接进一步处理。
实施例13.2：体外细胞毒性研究
在37℃下，在5％ CO2的存在下，以每孔5,000个细胞将细胞接种在96孔板中，保持24h。将曲妥珠单抗-1、曲妥珠单抗-2和曲妥珠单抗的连续稀释液添加到完全生长培养基中的细胞中，并且在5％ CO2的存在下在37℃下孵育96h。使用Cell Counting-Lite 2.0发光细胞活力测定(Vazyme，DD1101-01)评价细胞活力。将细胞活力绘制为未处理细胞的百分比。每次测量一式三份。
实施例13.3：旁观者杀伤试验
将SKBR-3和MDA-MB-231的细胞混合物以每孔1:1接种在96孔板中，并且单独将MDA-MB-231细胞以相同的密度接种在96孔板中，在37℃和5％ CO2下保持24h。然后，加入2μg/mL曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-1和曲妥珠单抗-2，并且在37℃下与5％ CO2孵育96h。MDA-MB-231是一种过表达荧光素酶的稳定细胞系。通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Vazyme，DL101-01)评价细胞活力。
实施例13.4：裸鼠异种移植试验
所有体内研究均按照实验动物管理和使用委员会的当地指南进行(批准号：IACUC-2101001)。NCI-N87细胞(200万)皮下接种到特定的无病原体雌性裸鼠中。荷瘤小鼠随机分为治疗组和对照组。当肿瘤的平均体积达到约100mm3至200mm3时，在第0天开始给药。在第0天和第14天，向小鼠静脉内施用每种物质，1mg/kg曲妥珠单抗-1或曲妥珠单抗-2以及媒剂(PBS)。肿瘤体积限定为1/2*长*宽2，并且每三天记录一次肿瘤大小。
结果在图25中显示。
图25A显示了ADC(5mg/kg)在BALB/c裸鼠NCI-N87肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性。图25B显示了ADC(1mg/kg)在BALB/c裸鼠NCI-N87肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性。每组七只小鼠的肿瘤体积单独显示。图25C显示了图25B所示研究的卡普兰-迈耶存活分析。图25D显示在20mg/kg ADC剂量后，在大鼠中观察到中性粒细胞减少。四只动物给予曲妥珠单抗-1、曲妥珠单抗-2或溶媒，并且取样以获取血液学标志物。
实施例13.5：安全性研究
所有体内研究均按照实验动物管理和使用委员会的当地指南进行(批准号：ZJCLA-IACUC-20040026)。在12至14周龄的雌性大鼠中，以20mg/kg(每个剂量组四只大鼠，随机分配)静脉内给药ADC或PBS。给药前和给药后数天，取4份血清样品进行血液学分析。
实施例14：MA 2相关缀合物的分析
MA 2与MA 5的水解稳定性
在37℃下，MA 2(即5mM最终浓度)或MA 5(即/>5mM最终浓度)于100μL 50mM PBS(pH 9.0)中振荡48h。然后，将1μL反应混合物和PBS(15μL，pH＝7.4，50mM)分别加入到GFP溶液(4μL，250μM，HEPES缓冲液)中。在37℃孵育2h后，溶液脱盐，在LC-MS分析之前得到产物。
水解稳定性结果在图21中显示。
SSF(MA 2)与马来酰亚胺在水性缓冲液中的稳定性结果在图26中示出。
图26A显示了5'-马来酰亚胺-ssDNA在37℃下振荡48h。然后，反应混合物通过LC-MS进行分析。将5'-马来酰亚胺-ssDNA完全水解为5'-马来酸-ssDNA。图26B显示了SSF的水解稳定性：5'-马来酰亚胺-ssDNA在37℃下振荡48h。然后，反应混合物通过LC-MS进行分析，并且仅获得起始材料。
MA 2类似物对GFP-TEV的修饰
将MA 2或MA 2类似物(即化合物1a、1a-1、1b、1b-1)(1μL，20mM于DMSO中)和PBS(15μL，pH＝7.4，50mM)加入到GFP-TEV溶液(4μL，250μM于HEPES缓冲液中)中。在37℃孵育2h后，溶液脱盐，在LC-MS分析之前得到产物。
动力学实验
将MA 2或先前的稳定连接子(即化合物2、3、6、7)(1μL，5mM于DMSO中)或PBS(15μL，pH＝7.4，50mM)加入到GFP溶液(4μL，250μM，HEPES缓冲液)中。在37℃下孵育不同时间(5min、10min、30min、60min、90min、120min和240min)后，溶液脱盐，以在LC-MS分析之前得到产物。
结果在图22中显示。图22比较了MA 2与先前报道的稳定Cys特异性标记试剂。
图22A显示了所报道的稳定的Cys特异性标记试剂的化学结构。箭头指向半胱氨酸反应位点。图22B显示了GFP(50μM)与5当量标记试剂的反应动力学。
竞争性实验
将MA 2(0.5μL，20mM于DMSO中)、2-5(0.5μL，20mM于DMSO中)和PBS(15μL，pH＝7.4，50mM)加入到GFP溶液(4μL，250μM，于HEPES缓冲液中)中。在37℃孵育2h后，溶液脱盐，在LC-MS分析之前得到产物。
用MA 2修饰的GFP片段的MS/MS谱图结果在图23中显示。
图24显示了使用SSF对不同蛋白质进行Cys特异性修饰。
图24A显示了MA2与不同蛋白质的反应方案。图24B显示了蛋白质-MA6缀合物的去卷积完整蛋白MS，包括neo2、Nb-PD-L1、GFP、KN046、曲妥珠单抗、KN026。
曲妥珠单抗-MA 2缀合物结合亲和力的测定
在200μL流式细胞术缓冲液(PBS含2％FBS)中，使SKBR3细胞在冰上与不同浓度的曲妥珠单抗-MA6或曲妥珠单抗结合30min。结合后，细胞用PBS洗涤两次，并且进一步与曲妥珠单抗-Cy5.5在冰上孵育30min，重悬并且用流式细胞术缓冲液再洗涤两次，并且使用Agilent流式细胞仪(Angilent NovoCyte Quanteon)进行分析。
实施例15：基于LC-MS/SDS-PAGE的Nb-PD-L1-20ntssDNA在存在10％人血清的情况下的缀合完整性研究
将Nb-PD-L1-20ntssDNA(2μL，50μM)、人血清(2μL)和PBS(16μL，pH＝8.0)的混合物在37℃下避光孵育24h、48h、72h。反应混合物通过LC-MS和SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE：10μL Nb-PD-L1-20nt ssDNA与含有2-巯基乙醇的5μL SDS-PAGE上样缓冲液混合。将样品加热至95℃，保持10min，并且完全上样到SDS-PAGE凝胶上。
图27显示了SSF-ssDNA构建的位点特异性DNA-蛋白缀合物以及Nb-PD-L1 ssDNA在单细胞RNA测序中的应用。
图27A显示了使用SSF-ssDNA探针进行蛋白质修饰的方案。图27B显示了通过20ntSSF-ssDNA或59nt SSF-ssDNA探针构建的DNA-蛋白质缀合物的去卷积质谱图。图27C显示了基于LC-MS的Nb-PD-L1-20ntssDNA在存在10％人血清的情况下的缀合物完整性研究，以及在特定时间点采集的样品的去卷积质谱。图27D显示了Nb-PD-L1-ssDNA用于CITE-seq的流程图，用于使用转录组在单细胞水平上检测靶细胞。图27E显示了基于转录组的单细胞表达谱聚类。青色：Jurkat；红色：A549；绿色：JIMT-1；紫色：MDA-MB-231。图27G显示了叠加在图27F所示的UMAP投影上的Nb-PD-L1-ssDNA靶向的相对强度。图27G显示了描述四种细胞系中PD-L1(CD274)的mRNA表达水平的小提琴图。图27H显示了描述四种细胞系中59nt-ssDNA条形码(Nb-PD-L1结合强度)的标度(z分数)归一化UMI计数的小提琴图。
虽然本文已展示和描述本发明的优选实施方式，但本领域技术人员将显而易见的是，这些实施方式仅仅通过示例的方式提供。本发明不受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已参考前述说明书对本发明进行描述，但本文中对实施方式的描述和说明并非是限制性。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变型、变化和替代方案。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文所阐述的具体叙述、配置或相对比例，这些取决于各种条件和变量。应理解的是，可以采用本文所描述的本发明实施方式的各种替代方式来实践本发明。因此，设想本发明应同样涵盖任何此类替代方式、修改、变型或等效物。随附权利要求书旨在限定本发明的范围，并且借此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等效物。
序列表
<110> 南京大学
<120> 缀合物及其制备方法和用途
<130> 0230-PA-004CN
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SGR-beads-1 序列
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctc 49
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SGR-tag-1 序列
<400> 2
tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg ttgtcaagat gctaccgttc agag 54
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SGR-beads-2 序列
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatct 25
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SGR-tag-2 序列
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtgactgg agttcagacg tgtgctc 57
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 工程化Neo2
<400> 5
Met Leu Val Asn Arg Ile Cys Gly Lys Gly Ile Asp Gly Gly Ser Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Ile Gln Leu His Ala Glu His Ala Leu Tyr Asp Ala Leu
20 25 30
Met Ile Leu Asn Ile Val Lys Thr Asn Ser Pro Pro Ala Glu Glu Lys
35 40 45
Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Asn Phe Glu Leu Ile Leu Glu Glu Ile Ala
50 55 60
Arg Leu Phe Glu Ser Gly Asp Gln Lys Asp Glu Ala Glu Lys Ala Lys
65 70 75 80
Arg Met Lys Glu Trp Met Lys Arg Ile Lys Thr Thr Ala Ser Glu Asp
85 90 95
Glu Gln Glu Glu Met Ala Asn Ala Ile Ile Thr Ile Leu Gln Ser Trp
100 105 110
Ile Phe Ser Ala Val Asp His His His His His His
115 120
<210> 6
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 工程化Nb-Pd-L1
<400> 6
Met Asp Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser
20 25 30
Arg Arg Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Arg Val Ala Lys Leu Leu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Asn Ala Lys Ser Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr
100 105 110
Ser Ser Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Cys His His His His His His
130 135 140
<210> 7
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 工程化GFP
<400> 7
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Cys Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Gly Gly Gly Leu Glu His His His
225 230 235 240
His His His
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Trastuzumab轻链:
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Trastuzumab重链
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Leu Thr Gln Pro Glu Gly Lys Asn Asn Thr Thr Lys Pro Pro Lys Val
385 390 395 400
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ser
405 410 415
Arg Lys Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
420 425 430
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Ser
435 440 445
Leu Lys Ser Pro Lys
450
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 20ntssDNA
<400> 10
agcagcacag aggtcagatg 20
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 59ntssDNA
<400> 11
tgtcaagatg ctaccgttca gagcgcaaga cactccacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59

Claims (113)

1.一种式1的缀合物，M-[(L1)a-(L2)b-(D)c]1，
其中L1为式I的化合物，R为-F或-OH，
其中M为生物大分子，M利用M的亲核官能团与L1连接，
L2为连接子，并且L2与R1、R3或R2连接，
D为功能性分子，
a为1至10的整数，
b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，
其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R1'为H或其同位素，
其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述M的亲核官能团选自下组：-SH、-NH2、-SeH、-OH和
3.一种式2的缀合物，
M-S-[(L1)a-(L2)b-(D)c]2，
其中M-S为具有半胱氨酸的生物大分子，M-S利用所述半胱氨酸与L1连接，L1为式I的化合物，R为-F或-OH，
L2为连接子，L2与R1、R3或R2连接，
D为功能性分子，
a为1至10的整数，
b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，
其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R1'为H或其同位素，
其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中M选自下组：蛋白质、DNA、RNA和病毒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中M为在细胞表面上表达的生物大分子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中M为抗原结合蛋白或其片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中M为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体scFv或抗体片段。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中L2选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中L2选自下组：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中D具有生物学功能。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中D和/或其衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的缀合物，其中D为药物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中D选自：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂、DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的缀合物，其中D为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；
T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的缀合物，其中R1'为-H。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的缀合物，其中R1为-H。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的缀合物，其中R3为-H。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的缀合物，其中R2为任选取代的苯基。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4选自：
-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1为1至10的整数，其中R5选自下组：/>和H。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n3-CO-R7，n3为1至10的整数，其中R7选自：/>
23.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n4-R8，n4为1至10的整数，其中R8选自下组：/>
24.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5为1至10的整数，n6为1至10的整数，其中R9选自下组：H和/>
25.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>
26.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
27.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自：-CF3、-CN和-OCH3。
28.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中R2为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12为其中R13为-CH2N3。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的缀合物，其中所述环为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的缀合物，其中所述环选自下组：
31.根据权利要求1至30中任一项所述的缀合物，其中L1选自下组：
32.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物选自下组：
33.一种式3的缀合物，
(L1)a-(L2)b-(D)c 3，
其中L1为式III的化合物，
L2为连接子，并且L2与R1、R3或R2连接，
D为功能性分子，
a为1至10的整数，
b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，
其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
34.根据权利要求33所述的缀合物，其中L2选自下组：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
35.根据权利要求33至34中任一项所述的缀合物，其中L2选自下组：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的缀合物，其中D具有生物学功能。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的缀合物，其中D和/或其衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的缀合物，其中D为药物。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的缀合物，其中D选自下组：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂、DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的缀合物，其中D为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；
T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的缀合物，其中R1为-H。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的缀合物，其中R3为-H。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的缀合物，其中R2为任选取代的苯基。
44.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
45.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4选自：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
46.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1为1至10的整数，其中R5选自下组：/>和-H。
47.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n3-CO-R7，n3为1至10的整数，其中R7选自：/>
48.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n4-R8，n4为1至10的整数，其中R8选自下组：/>/>
49.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5为1至10的整数，n6为1至10的整数，其中R9选自下组：H和/>
50.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>
51.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
52.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：-CF3、-CN和-OCH3。
53.根据权利要求33至43中任一项所述的缀合物，其中R2为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12为其中R13为-CH2N3。/>
54.根据权利要求33至53中任一项所述的缀合物，其中所述环为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
55.根据权利要求33至54中任一项所述的缀合物，其中所述环选自：
56.根据权利要求33至55中任一项所述的缀合物，其中所述L1选自下组：
/>
/>
57.根据权利要求33至56中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物选自下组：
/>
58.一种缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
通过使式3的缀合物：与M缀合，获得式1的缀合物：/>
M为生物大分子，并且M利用M的亲核官能团与L1连接，L2为连接子，并且L2与式1中的R1、R3或R2连接，
D为功能性分子，
a为1至10的整数，
b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，
其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R1'为H或其同位素，
其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述M的亲核官能团选自下组：-SH、-NH2、-SeH、-OH和
60.一种缀合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
通过使式3的缀合物：与M缀合，获得式2的缀合物：R为-OH或-F，
其中M-S为具有半胱氨酸的生物大分子，M-S利用所述半胱氨酸与L1连接，
L2为连接子，并且L2与式3中的R1、R3或R2连接，
D为功能性分子，
a为1至10的整数，
b、c各自独立地为0至10的整数，前提是b和c不同时为0，
其中R1为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R1'为H或其同位素，
其中R2为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
其中R3为H、任选取代的烷基或任选取代的芳基，
任选地，连接R1的C和连接R2的C形成环。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中M选自下组：蛋白质、DNA、RNA和病毒。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中M为在细胞表面上表达的生物大分子。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中M为抗原结合蛋白或其片段。
64.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中M为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体scFv或抗体片段。
65.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其中M包含用于亲核加成反应的官能团。
66.根据权利要求58至65中任一项所述的方法，其中L2选自：可切割连接子、不可切割连接子、亲水性连接子、疏水性连接子、带电荷连接子、不带电荷连接子和二羧酸类连接子。
67.根据权利要求58至66中任一项所述的方法，其中L2选自：VC-PAB、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(sulfo-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(sulfo-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-lH-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
68.根据权利要求58至67中任一项所述的方法，其中D具有生物学功能。
69.根据权利要求58至68中任一项所述的方法，其中D和/或其衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长。
70.根据权利要求58至69中任一项所述的方法，其中D为药物。
71.根据权利要求58至70中任一项所述的方法，其中D选自：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、MetAP甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟槽粘合剂和DHFR抑制剂、核苷类似物、HD AC抑制剂；蒽环类药物；NAMPT抑制剂；亲水性前药；SN-38葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯；氮芥、蛋白酶体抑制剂、细胞因子、Toll样受体激动剂和STING激动剂。
72.根据权利要求58至71中任一项所述的方法，其中D为MMAE或其衍生物；马法兰或其衍生物；来那度胺或其衍生物；IL-2或其衍生物；新白细胞介素-2/15或其衍生物；
T785或其衍生物；或MSA-2或其衍生物。
73.根据权利要求58至72中任一项所述的方法，其中R1为-H。
74.根据权利要求58至73中任一项所述的方法，其中R3为-H。
75.根据权利要求58至74中任一项所述的方法，其中R2为任选取代的苯基。
76.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
77.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
78.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n1-COO-R5，n1为1至10的整数，其中R5选自下组：/>和-H。
79.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n3-CO-R7，n3为1至10的整数，其中R7选自下组：/>
80.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2)n4-R8，n4为1至10的整数，其中R8选自下组：/>
81.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-O-(CH2)n2-CO-NH-R6，n2为1至10的整数，其中R6为-(CH2CH2-O)n5-(CH2)n6-NH-CO-O-R9，n5为1至10的整数，n6为1至10的整数，其中R9选自下组：H和/>/>
82.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>
83.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自下组：任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N和O-任选取代的烷基。
84.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为其中R4为-(OCH2CH2)n7-O-(CH2)n8-R10，n7为1至10的整数，n8为1至10的整数，其中R10选自下组：-COOH、-NH2和/>其中R11选自：-CF3、-CN和-OCH3。
85.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中R2为任选取代的烷基-CH＝CH-R12，其中R12为其中R13为-CH2N3。
86.根据权利要求58至85中任一项所述的方法，其中所述环为任选取代的环烯烃，或任选取代的芳基-环烯烃。
87.根据权利要求58至86中任一项所述的方法，其中所述环选自：
/>
88.根据权利要求58至87中任一项所述的方法，其中所述方法在约16℃至约37℃的范围内的温度下进行。
89.根据权利要求58至88中任一项所述的方法，其中所述方法在约7.4至约8的范围内的pH下进行。
90.根据权利要求58至89中任一项所述的方法，其中所述方法用催化剂进行。
91.根据权利要求58至90中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：纯化所述式3的缀合物。
92.一种式III的化合物，或其药学上可接受的盐：其中R1选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、任选取代的烷基-OH、任选取代的烷基-卤素、任选取代的烷基-N3、-B(OH)2、-卤素、-OTf、任选取代的烷基-NH2、-O-任选取代的烷基-C≡CH、-CO-NH-C≡CH-任选取代的烷基。
93.根据权利要求92所述的化合物，其中R1选自下组：-OH、-PO3H2、-SeH、-SH、-CH2OH、-CH2Br、-CH2N3、-B(OH)2、-Br、-OTf、-CH2NH2、-Cl、-OCH2C≡CH或-CO-NH-C≡CH。
94.根据权利要求92至93中任一项所述的方法，其中所述化合物选自下组：
95.一种式IV的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中R1选自下组：NH-(CH2)n1-CO-R2、-OH、NH-(CH2)n2-R3、NH-(CH2CH2-O)n3-(CH2)n4-NH-CO-O-R4、或
其中n1、n2、n3、或n4独立地为1至10的整数，
其中R2选自下组：
其中R3选自下组：
其中R4为
96.根据权利要求95所述的化合物，其中R1选自下组：NH-(CH2)2-CO-R2、-OH、NH-(CH2)-R3、NH-(CH2CH2-O)3-(CH2)2-NH-CO-O-R4。
97.根据权利要求95至96中任一项所述的方法，其中所述化合物选自下组：
98.一种式V的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中R1、R2和R4为任意取代基，
其中R3选自下组：H、任选取代的烷基-F3、任选取代的烷基-N或O-任选取代的烷基，其中R5选自下组：-COOH、-NH2和
99.根据权利要求98所述的化合物，其中R1为H。
100.根据权利要求98至99中任一项所述的化合物，其中R2为H。
101.根据权利要求98至100中任一项所述的化合物，其中R4为H。
102.根据权利要求98至101中任一项所述的化合物，其中R3选自下组：H、CF3、CN和OCH3。
103.根据权利要求98至102中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
104.一种式VI的化合物，或其药学上可接受的盐：
105.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至57中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
106.一种用于调节受试者的肿瘤微环境的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至57中任一项所述的缀合物，或权利要求105所述的药物组合物。
107.一种用于调节受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至57中任一项所述的缀合物，或权利要求105所述的药物组合物。
108.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至57中任一项所述的缀合物，或权利要求105所述药物组合物。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述疾病包括肿瘤和/或自身免疫性疾病。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
111.一种诊断试剂，所述诊断试剂包含权利要求1至57中任一项所述缀合物。
112.根据权利要求111所述的诊断试剂，其中所述诊断试剂被标记。
113.根据权利要求112所述的诊断试剂，其中所述标记选自：放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
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