CN113924304A - 四官能性化学探针和使用所述探针鉴定来自于活细胞或活组织的靶膜蛋白的方法 - Google Patents

四官能性化学探针和使用所述探针鉴定来自于活细胞或活组织的靶膜蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

一种四官能性化合物，其根据需要通过间隔物连接配体结合性位点(A)或配体、反应性位点(D)、潜在的可切割位点(E)和生物素位点(B)而形成，其中：所述配体结合性位点(A)是活化的官能团例如胺反应性基团或反应性官能团例如–COOH；所述反应性位点(D)是具有化合物例如2‑芳基‑5‑羧基四唑的结构的基团；所述潜在的可切割位点(E)是具有化合物例如1‑(4,4‑二甲基‑2,6‑二氧代环己‑1‑亚基)乙基的结构的基团；并且所述间隔物是通过用交联基团取代获得的基团，例如具有一个或多个碳原子的直链或支链亚烷基。

Description

四官能性化学探针和使用所述探针鉴定来自于活细胞或活组 织的靶膜蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种能够利用化学蛋白质组学直接从反映表型的活细胞或组织中无偏倚且全面地鉴定特定配体的靶蛋白的探针，并且还涉及一种使用所述探针的鉴定方法。具体来说，本发明涉及一种能够从活细胞或作为活组织的脑切片检测包括离子通道、GPCR或形成多个跨膜区段或多聚体的受体的各种不同靶膜蛋白的探针，并且还涉及一种使用所述探针鉴定靶膜蛋白的方法。
背景技术
在化学生物学研究领域中，有机化学方法和分子生物学方法已被用于对少量生物分子例如蛋白质或生理活性物质的检测和定量，以及对这些生物分子的功能或反应的理解的研究。作为这些努力的一部分，正在开发特异性作用于生物分子的化合物(即化学探针)，目的是揭示生物分子的功能和反应。
在该研究领域中，化学蛋白质组学是利用有机化学方法阐明蛋白质的结构和功能的方法之一。
化学蛋白质组学是一种允许直接从反映表型的活细胞或组织中无偏倚且全面地鉴定靶蛋白的方法。它被认为对药物的开发有极大贡献，例如在对于表型筛选中发现的候选药物的未知靶蛋白的鉴定或对于抗原未知的抗体的抗原鉴定中。
存在已知的用于检测已知膜蛋白的常规技术：使用具有光亲和性的反应性基团来标记活细胞的方法(NPL 1)，通过蛋白质组学从活细胞的细胞膜级分中鉴定膜蛋白的方法(NPL 2)，使用化学探针从遗传工程改造的细胞检测靶膜蛋白的方法(NPL 3和4)，使用化学探针从培养的细胞或原代培养细胞检测靶膜蛋白的方法(NPL 5)，使用化学探针从培养的细胞检测细胞内或膜上的靶蛋白的方法(NPL 6)，使用化学探针对脑切片上的靶膜蛋白进行荧光成像的方法(NPL 7)，以及使用蛋白质例如生长因子(例如EGF和FGFR抗体)鉴定靶膜蛋白的方法(NPL 8)。
这样的靶蛋白鉴定使用具有特异性结合到所述靶蛋白的部分(配体组成部分)的探针。例如，使用在一个末端结合有生物素并在另一个末端结合有对所述靶蛋白具有亲和性的配体的化合物来鉴定靶蛋白的方法是已知的(例如NPL 1和9)。使用这种探针如下所述鉴定靶蛋白：通过配体将所述靶蛋白结合到所述探针，然后通过生物素形成生物素和亲和素的复合物，并使用这种复合物作为指标分离和纯化所述靶蛋白。然而，具有低表达水平的膜蛋白不容易鉴定。
具体来说，NPL 1公开了一种使用含有位于配体附近的四唑的探针来检测对所述配体具有亲和性的靶蛋白的方法。这种方法在所述靶蛋白配位到所述配体后用UV光进行辐照，以在四唑与所述蛋白质之间形成共价键；因此，所述方法具有配位到所述配体的蛋白质在例如纯化步骤中不脱离的特点。
NPL 9公开了一种具有并入在配体与生物素之间的适合位置处的可切割组成部分的探针，以便在温和条件下除去非特异性蛋白，包括亲和素。
作为鉴定活细胞或生物流体中存在的靶糖蛋白的探针，PTL 1公开了一种三官能性交联试剂，其带有：(i)配体反应性基团，用于偶联到在靶糖蛋白受体上具有至少一个结合位点的感兴趣的配体，(ii)腙基团，用于捕获氧化的受体-糖蛋白，和(iii)选自叠氮化物和炔的亲和性基团，用于被捕获的糖蛋白的检测、分离和纯化。
然而，上述方法均不被认为是从准确反映其表型的活细胞或组织中以高的可重复性和实用性鉴定靶膜蛋白的技术。这是因为细胞膜上的许多蛋白质表达水平低，而在已知的化学蛋白质组学技术中广泛使用的反应性基团在捕获靶膜蛋白方面效率不高；这使得以高灵敏度特异性检测真正的靶膜蛋白变得困难。此外，由亲和素珠子的热处理或所述珠子上的蛋白质消化产生的非特异性蛋白混合在纯化样品中。由于这些原因，目前还没有关于使用化学蛋白质组学从活组织中鉴定靶膜蛋白的案例的报道。
引文列表
专利文献
PTL 1：WO2017/081069A
非专利文献
NPL 1：J.Am.Chem.Soc.,138,14609-14615(2016)
NPL 2：Cell Chemical Biology 2017,24,3-8
NPL 3：ChemBioChem 2017,18,1639-1649
NPL 4：Mol.Pharmacol.2019,95,196-209
NPL 5：J.Am.Chem.Soc.2018,140,6067-6075
NPL 6：J.Am.Chem.Soc.2018,140,4259-4268
NPL 7：Nature Communications,8,14850(2017)
NPL 8：Nature Communications,9,1519(2018)
NPL 9：Chem Commun,49,5366(2013)
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种可以作为探针用于鉴定活细胞或活组织中表达的蛋白质的新化合物。更优选地，本发明的目的是提供一种可用作探针的新化合物，其能够鉴定极低表达水平的膜蛋白。本发明的另一个目的是提供一种使用所述化合物作为探针鉴定活细胞或活组织中存在的靶蛋白、优选为靶膜蛋白的方法。
技术解决方案
本发明设计了一种具有四种官能性的四官能性化合物作为实现所述目的的手段：所述四种官能性具体来说是1)配体结合性组成部分，用于偶联对靶蛋白具有亲和性(结合性质)的配体，2)反应性组成部分，用于捕获所述靶蛋白，3)可切割组成部分，其是一个切割位点，用于选择性洗脱被亲和素珠子捕获的靶蛋白，和4)生物素标签，用于富集或纯化所述被捕获的靶蛋白。本发明人发现，通过将对靶蛋白具有亲和性(结合性质)的小分子化合物或抗体作为配体结合到所述四官能性化合物并将它用作四官能性化学探针，可以在活细胞或作为活组织的脑切片中检测靶膜蛋白。
本发明通过在这些发现的基础上进行进一步研究得以完成，并包括下述主题内容。
条目1.一种四官能性化合物，其包含
配体结合性组成部分(A)，
反应性组成部分(D)，
可切割组成部分(E)，和
生物素标签(B)，所述组成部分(A)、(D)、(E)和(B)任选地通过间隔物相连，
其中
所述配体结合性组成部分(A)是选自胺反应性基团、羟基反应性基团、硫醇反应性基团、醛反应性或酮反应性基团、烷基卤化物反应性或芳基卤化物反应性基团、烷基磺酸酯反应性或芳基磺酸酯反应性基团、酰胺反应性基团、磺酰胺反应性基团、芳基反应性基团、二醇反应性基团和羧基反应性基团的至少一种活化的官能团，或选自-COOH、-NH2、-OH、-SH、-CH＝CH-、-(C＝O)-CH＝CH-、烷基卤化物、乙烯基卤化物、芳基卤化物、烷基磺酸酯、乙烯基磺酸酯、芳基磺酸酯、炔基、叠氮基、环氧基和点击标签的至少一种反应性官能团，
所述反应性组成部分(D)是具有选自2-芳基-5-羰基四唑、苯基叠氮化物、二氮杂环丙烯、α-酮基酰胺、4-羟基苯、邻苯二甲酰肼和二苯甲酮的至少一种化合物的结构的基团，
所述可切割组成部分(E)是具有选自1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基、乙酰丙酸酯、邻二醇、重氮苯、二芳基腙、二烷氧基二苯基甲硅烷、二硫化物、含有序列ENLYFQG(SEQ ID NO：1)的肽和含有序列ENLYFQS(SEQ ID NO：2)的肽的至少一种化合物的结构的基团，
所述生物素标签(B)是由下式(1)表示的基团
Figure BDA0003390983040000051
其中符号*表示与相邻基团的键；
所述间隔物是具有一个或多个碳原子的直链或支链亚烷基，或具有3个或更多个碳原子的直链或支链亚烷基，其中不相邻的-CH2-基团独立地被选自下述的至少一个交联基团代替：-O-，-OCH2-，-CH2O-，-CO-，-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，其同样适用于下文)，-CO-NRa-，-NRa-CO-，由下式(1-1)表示的基团和由下式(1-2)表示的基团
Figure BDA0003390983040000052
其中m表示0或1，并且n表示1或2。
条目2.根据条目1所述的四官能性化合物，其中所述反应性组成部分(D)是由下式(2)或(2’)表示的基团，
Figure BDA0003390983040000061
其中符号*表示与相邻基团的键，并且n表示0或1，
和/或
所述可切割组成部分(E)是由下式(3)表示的基团
Figure BDA0003390983040000062
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地表示氢原子或C1-6烷基，并且符号*表示与相邻基团的键。
条目3.根据条目1或2所述的四官能性化合物，其由下式(I)或式(II)表示：
Figure BDA0003390983040000063
其中A、B、C、D和E表示条目1中的相应组成部分，并且S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7各自独立地表示间隔物。
条目4.根据条目1至3中的任一项所述的四官能性化合物，其中所述配体结合性组成部分(A)是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
条目5.根据条目4所述的四官能性化合物，其由下式(i)、(ii)或(iii)表示：
Figure BDA0003390983040000071
其中p表示2。
条目6.一种四官能性化学探针，其包含：
条目1至5中的任一项所述的四官能性化合物，和
与所述四官能性化合物的配体结合性组成部分(A)结合的配体。
条目7.根据条目6所述的四官能性化学探针，其中所述配体是选自均对源自于活细胞或活组织的膜蛋白具有亲和性的蛋白质、肽、脂类、糖类和小分子化合物的一个成员。
条目8.根据条目6或7所述的四官能性化学探针，其由式(iv)表示：
Figure BDA0003390983040000072
其中S1表示间隔物，并且p表示2。
条目9.一种使用条目6至8中的任一项所述的四官能性化学探针检测细胞或组织中的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(1)将细胞或组织与所述四官能性化学探针反应，以使所述四官能性化学探针中的配体与靶蛋白结合，
(2)在所述四官能性化学探针中的反应性组成部分(D)与所述靶蛋白之间形成共价键，
(3)纯化含有结合到所述四官能性化学探针的靶蛋白的级分，
(4)将所述四官能性化学探针中的生物素标签结合到亲和素，以形成所述四官能性化学探针和所述亲和素的偶联物，
(5)在所述四官能性化学探针中的可切割组成部分处切开所形成的所述四官能性化学探针和所述亲和素的偶联物，以及
(6)检测含有所述靶蛋白的级分。
有利效果
根据本发明所述的四官能性化合物包括任选地通过间隔物相连的配体结合性组成部分(A)、反应性组成部分(D)、可切割组成部分(E)和生物素标签(B)，并且通过将对待检测或鉴定的靶蛋白具有亲和性(结合性质)的配体结合到所述配体结合性组成部分，所述四官能性化合物可以用作四官能性化学探针。
根据本发明所述的四官能性化学探针具有显示出高反应性和高选择性的反应性组成部分和在温和条件下切开的可切割组成部分，两者都源自于所述四官能性化合物的结构。由于这种结构，根据本发明所述的四官能性化学探针特别地显示出出色的膜蛋白收集量、检测灵敏度和可重复性。因此，根据本发明所述的四官能性化学探针的使用能够以比现有技术更高的灵敏度鉴定活细胞中的靶膜蛋白。此外，根据本发明所述的四官能性化学探针也可用于在作为更精密复杂的生理环境的活组织中鉴定靶膜蛋白。
附图说明
图1示出了试验例1的结果，其中靶分子使用化合物(CPP-127)从活细胞分离。
图2示出了试验例2的结果，其中靶分子使用化合物(CPF-224)从活组织分离。
图3示出了试验例2的结果，其中靶分子使用化合物(CPF-202)从活组织分离。
图4示出了试验例2的结果，其中靶分子使用化合物(CPF-242)从活组织分离。
图5示出了试验例3的结果，其中细胞表面抗原使用标记的抗体(CPA-321标记的抗CD71抗体)捕获。
图6是示出了使用用具有不同连接物长度的化合物标记的抗CD71抗体从THP-1细胞检测的作为抗原的CD71的量的结果的图。
图7是示出了使用用具有不同交联基团的探针标记的抗CD71抗体从A431细胞检测的作为抗原的CD71的量的结果的图。
图8是示出了使用用不同探针标记的His标签EGF从MDA-MB-231细胞检测的作为抗原的EGF受体的量的结果的图。
图9是示出了使用用不同方法标记的抗CD71抗体从A431细胞检测的作为抗原的CD71的量的结果的图。
图10是示出了使用通过第二抗体方法标记的抗CD71抗体DF1513从THP-1细胞检测的作为抗原的CD71的量的结果的图。
具体实施方式
(I)本说明书中使用的术语的解释
除非另有指明，否则本说明书中使用的术语和短语以下文描述的意义使用。
术语“四官能性”是指存在四个官能团。正如上文陈述的，在所述四个官能团中，一个是构成配体结合性组成部分或在所述配体结合性组成部分处形成的配体组成部分的官能团，一个是构成反应性组成部分的官能团，一个是构成可切割组成部分的官能团，最后一个是可以与亲和素结合的生物素残基。生物素是指(5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧杂六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸)，其是被分类为B族维生素的一种水溶性维生素。
在本说明书中，术语“亚烷基”是指由式-(CHR)n-表示的二价游离基，其中R表示氢原子或源自于烃的任何取代基。亚烷基优选地具有约1至30个碳原子(n＝1至30)或优选地约1至10个碳原子。
在本说明书中，术语“烷基”是指具有1至6个碳原子(C1-6)的直链或支链短链烷基。此类烷基的具体实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基和3-甲基戊基。烷基优选为具有1至3个碳原子的直链短链烷基。“C1-6烷基”还包括其中1至3个氢原子被氘原子代替的短链烷基。
在本说明书中，术语“蛋白质”和“肽”具有相同的含义，并且是指具有任何长度的氨基酸聚合物(通常，肽被称为“蛋白质的片段”)。这种聚合物可以具有直链、支链或环状链。所述氨基酸可以是天然或非天然氨基酸或突变的氨基酸。
在本发明中，所述蛋白质可以是天然存在的蛋白质或合成蛋白质。所述蛋白质也可以具有通过对天然存在的蛋白质进行合成工程而制备的序列。所述蛋白质可以是细胞内蛋白、细胞表面蛋白(即结合到细胞表面的蛋白质)或溶液中的蛋白质(即分泌到培养基中的蛋白质)。所述蛋白质也可以是糖蛋白或膜蛋白。在本发明中感兴趣的蛋白质可以是具有有用的生物或化学活性的任何药物或商业相关蛋白，例如受体、抗体、酶、激素、调控物、抗原和结合物。下文列出的在根据本发明的方法中使用的蛋白质仅仅是示例，并且在本发明中感兴趣的蛋白质不限于这些蛋白质。本领域技术人员会理解，任何蛋白质可以是本发明的探针和方法的靶蛋白。
在本说明书中，短语“靶蛋白”是指可以与一种或多种特定类型的配体结合的蛋白质。这些靶蛋白优选为在源自于哺乳动物包括人类和非人类动物的生物流体中、细胞上或组织中存在的蛋白质，尽管不限于此。这些靶蛋白更优选为在活细胞或活组织中表达和存在的蛋白质。因此，如果所述靶蛋白是例如在细胞表面上表达的膜蛋白，则所述蛋白与所述活细胞的细胞膜结合并可能具有暴露到细胞外空间的至少一个氨基酸，使得一个或多个配体能够与所述蛋白结合。
本发明中的靶蛋白优选为膜蛋白，尽管不特别限于此。膜蛋白是指可以直接或间接地与脂质膜、特别是脂质双层膜相互作用的蛋白，其中构成所述膜蛋白的氨基酸分子中的至少一者存在于细胞外环境中。实例包括G蛋白偶联受体、7次跨膜受体、受体酪氨酸激酶、免疫球蛋白超家族和相关蛋白、清道夫受体、其他类似受体、转运蛋白、离子通道、溶液转运蛋白、主动转运蛋白、共转运蛋白、酶和其他类似蛋白。
更具体来说，G蛋白偶联受体和7次跨膜受体的实例包括卷曲受体、核酸受体、腺苷受体、肾上腺素能受体、血管紧张肽受体、爱帕琳肽受体、血管加压素受体、缓激肽受体、铃蟾肽受体、趋化因子受体、缩胆囊肽受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、大麻素受体、半胱氨酰白三烯受体、多巴胺受体、鞘脂受体、溶血磷脂受体、单磷酸鞘氨醇受体、内皮素受体、蛋白酶活化受体、游离脂质受体、甘丙肽受体、生长激素促分泌素受体、促性腺激素受体、胆汁酸受体、烟酸受体、溶血磷脂酸受体、过敏毒素趋化受体、胃泌素释放肽受体、食欲肽受体、组胺受体、血清素受体、白介素受体、含有富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体、白三烯受体、促肾上腺皮质激素受体、黑皮质素受体、黑素浓集激素受体、褪黑素受体、神经调节肽受体、神经肽受体、神经降压肽受体、阿片样受体、孤啡肽受体、氧代戊二酸受体、催产素受体、P2Y嘌呤受体、前列腺素受体、视紫红质、松弛肽受体、生长抑素受体、琥珀酸受体、物质P受体、物质K受体、凝血
Figure BDA0003390983040000121
烷受体、尾加压素受体、降钙素受体、味觉受体、代谢型谷氨酸受体和嗅觉受体。
受体酪氨酸激酶的实例包括激活素受体、骨形态发生蛋白受体、TNF-β受体、AXL受体、表皮生长因子受体、肝配蛋白受体、胰岛素受体、神经生长因子受体、盘状结构域受体、血管内皮生长因子受体、白细胞受体、肝细胞生长因子受体、巨噬细胞刺激蛋白受体、血小板衍生生长因子受体、肠毒素受体和它们的前体。
免疫球蛋白超家族和相关蛋白的实例包括免疫球蛋白受体、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、白细胞免疫球蛋白样受体、轴突导向因子受体、T-细胞受体、各种不同的细胞因子受体、T-细胞表面糖蛋白CD的各种不同片段和超家族及其前体。其他受体的实例包括脂联素受体、孕激素受体、接触蛋白相关蛋白、delrin、整合蛋白及其前体、轴突蛋白、神经纤毛蛋白、Notch受体、丛状蛋白及其前体、受体酪氨酸磷酸酶、选择素及其前体、多配体聚糖受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体、Toll样受体、转铁蛋白受体和sortilin及其前体。
转运蛋白的实例包括水孔蛋白、氯离子通道、bestrophin、鱼尼丁受体、电压门控钾通道、环状核苷酸门控通道、钙激活钾通道、瞬时受体电位通道(TRP通道)、电压门控钠通道、潜在的电压门控钙通道、其他电压门控通道、血清素受体、乙酰胆碱受体、γ-单剂丁酸受体、甘氨酸受体、促离子型谷氨酸受体和P2X嘌呤受体。溶液转运蛋白的实例包括各种不同的SLC家族蛋白。主动转运蛋白的实例包括运输离子的ATP降解酶类和ABC转运蛋白。此外，酶的实例包括NADH-泛醌氧化还原酶、细胞色素c、含黄素单加氧酶、细胞色素P450、其他氧化还原酶；酰基转移酶、葡萄糖转移酶、磺基转移酶、其他转移酶；连接酶、酪氨酸磷酸酶、磷酸二酯酶、糖苷酶、丝氨酸肽内部水解酶、金属内肽酶、核苷二磷酸磷酸酶和其他水解酶。
在本说明书中，短语“样品”或“生物样品”是指从生物体获得的任何活细胞或固体或流体样品(生物样品)。它们包括例如组织培养物、生物反应器、人类或非人类动物组织、植物(包括水果和蔬菜)、单细胞微生物(例如细菌和酵母)和多细胞生物。所述生物样品也可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、精液、脑脊液、房水或玻璃体液、任何身体分泌物、渗漏液或渗出物(例如脓液或来自于任何其他感染或炎症部位的流体)获得的生物流体，或来自于关节(例如正常关节或受疾病例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或化脓性关节炎影响的关节)的流体。所述生物样品也可以是例如从任何器官或组织获得的样品，包括活检或尸检样本。所述细胞还包括原代细胞和培养细胞。
所述生物样品优选为源自于人类或非人类动物的活细胞或活组织。可以在本发明中使用的活细胞优选为可以使用配体检测的蛋白质、优选为膜蛋白在其中表达的细胞，尽管不限于此。实例包括但不限于CHO细胞、MDCK细胞、3T3-L1、293细胞、MCF7细胞、A431细胞、3T3细胞、CV-I细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、通过转化获得的其他细胞系、从活生物体分离的血细胞和源自于原代组织或原代移植物的体外培养的细胞系。除了在二维培养中培养的细胞之外，实例还包括在三维培养系统例如类器官培养中培养的细胞。所述生物样品也可以是作为宿主生物体使用载体在其中引入编码特定蛋白的基因的细胞。不构成任何限制，例如可以使用其中稳定地表达多巴胺D2受体的CHO-K1细胞。
可以在本发明中使用的组织可以是其中表达可以通过使用配体检测的蛋白质、优选为膜蛋白的任何组织，并且没有特别限制。实例包括但不限于脑、肝、肾等的组织切片和器官切片培养物。
在本说明书中，短语“活细胞”是指源自于哺乳动物(人类或非人类动物)的作为细胞系建立的细胞，或源自于非哺乳动物来源的作为细胞系建立的已被培养并且未变性的细胞。所述活细胞还包括在非变性条件下从任何器官或组织分离的细胞(例如血细胞、构成器官的细胞和原代培养细胞)。除了在二维培养中培养的细胞之外，实例还包括在三维培养系统例如类器官培养中培养的细胞。在本说明书中，短语“活组织”是指在非变性条件下从哺乳动物(人类或非人类动物)的任何器官或组织分离的组织切片或组织培养样品(例如脑、肝、肾等的组织切片和器官切片培养物)。
在本发明中，术语“配体”是指对靶蛋白具有亲和性并因此可以与靶蛋白结合的化合物。所述配体优选为结合到细胞膜并可以与细胞表面中表达的和其上存在的靶膜蛋白相互作用或结合的任何化合物，尽管不限于此。配体的实例包括但不限于肽、多肽、含有糖蛋白或磷蛋白的蛋白质、糖类、糖脂、磷脂、寡核苷酸、多核苷酸、适体、维生素、抗原及其片段、半抗原、受体激动剂、部分激动剂、混合激动剂、拮抗剂、药物、趋化因子、激素(例如LH、FSH、TRH、TSH、ACTH、CRH、PRH、MRH、MSH、胰高血糖素和催乳素，转铁蛋白，乳铁蛋白，血管紧张素，组胺，胰岛素和外源凝集素)、递质、自体活性物质、生长因子(例如PDGF、VEGF、EGF、TGFa、TBFβ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、FGF、IGF、铃蟾肽、血小板生成素、红细胞生成素、抑瘤素和内皮素1)、白介素(例如白介素1至15)、淋巴因子、细胞信号传导分子、细胞因子(例如包括肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子α和β)和干扰素(例如干扰素α、β和γ))、辅基、辅酶、辅因子、调控物、可以与受体特异性结合的天然或合成的有机分子、这些配体的维持相同结合性质的片段、类似物和其他衍生物。
所述配体可以是抗体。抗体具有与特定抗原特异性结合的能力。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体优选为单克隆抗体，并且可以例如特别是治疗性抗体例如曲妥珠单抗和贝伐珠单抗。所述抗体也可以是人源化抗体。
第一抗体方法或第二抗体方法均可以使用。所述第一抗体方法使用对靶蛋白具有亲和性的抗体(第一抗体)作为配体。所述第二抗体方法使用与探针的配体结合性组成部分整合的第二抗体，并且所述第一抗体(配体)与所述第二抗体(配体结合性组成部分)形成偶联物。不能通过所述第一抗体方法灵敏地检测的抗体对靶蛋白的亲和性，可能通过所述第二抗体方法灵敏地检测。
所述配体也可以是操作过的亲和结合物，例如锚蛋白重复序列结合物、特别是His标签结合物、通过噬菌体展示产生的亲和结合物、寡核酸或肽适体。所述配体也可以是蛋白质例如蛋白受体或细胞表面蛋白例如细胞表面蛋白受体的结构域。此外，所述配体可以是微生物或病毒。
在本发明中，所述配体通过结合位点与其靶蛋白相互作用。所述结合位点是靶蛋白的特定肽片段，例如所述靶蛋白的特定氨基酸序列或三维结构的片段，并且被称为“结合位点”。对于与靶蛋白(细胞表面或分泌的靶蛋白)的结合位点结合的配体来说，术语“相互作用”包括细胞表面或分泌的靶蛋白与所述配体之间暂时或永久的直接或间接接触，并且可以通过它的结合亲和性即解离平衡常数Kd来表征。配体对其靶蛋白的典型结合亲和性可以是至少10-5M，优选为10-6M或更高，例如约10-7M至约10-12M。
如上所述，配体可以是对靶蛋白具有亲和性的任何化合物；然而，所述配体优选为在用于治疗人类或非人类动物的疾病的药物产品中用作活性成分的化合物(药物化合物)。所述药物化合物可以是小分子化合物、中分子量化合物、天然产物或包括抗体在内的蛋白质。所述药物化合物可以被修饰以便与根据本发明所述的四官能性化合物的配体结合性组成部分结合，只要修饰不影响对靶蛋白的亲和性即可。在根据本发明所述的四官能性化学探针中，所述配体可以通过间隔物与所述反应性组成部分结合。
在本说明书中，烷基化、水解、胺化、酯化、酰胺化、醚化、亲核取代、加成、氧化和还原是指本身已知的方法。这些方法是例如在下述文献中描述的方法：Jikken Kagaku Koza(第5版，The Chemical Society of Japan，Maruzen Publishing)，《有机官能团制备》(Organic Functional Group Preparations)(第2版，Academic Press,Inc.，1989年出版)，《综合有机转化》(Comprehensive Organic Transformations)(VCH PublishersInc.，1989年出版)，和《Greene的有机合成中的保护基团》(Greene’s Protective Groupsin Organic Synthesis)(作者是P.G.M.Wuts和T.W.Greene，第4版，2006)。
在本说明书中，对“钯化合物”没有特别限制。实例包括四价钯催化剂，例如四水合六氯钯(IV)钠和六氯钯(IV)钾；二价钯催化剂，例如[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]钯(II)二氯化物二氯甲烷加成物(Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2)、(2-二环己基膦-2’,4’,6’-三异丙基-1,1’-联苯基)[2-(2’-氨基-1,1’-联苯基)]钯(II)甲磺酸盐(XPhos Pd G3)、氯化钯(II)、溴化钯(II)、乙酸钯(II)、乙酰丙酮酸钯(II)、二氯双(苯甲腈)钯(II)、二氯双(乙腈)钯(II)、二氯双(三苯基膦)钯(II)、二氯四氨基钯(II)、二氯(环辛-1,5-二烯)钯(II)、三氟乙酸钯(II)和1,1’-双(二苯基膦)二茂铁二氯钯(II)-二氯甲烷络合物；和零价钯催化剂，例如三(二亚苯甲基丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3)、三(二亚苯甲基丙酮)二钯氯仿络合物(0)和四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)。这些钯化合物可以单独使用或两种或更多种组合使用。
在本说明书中，碳二亚胺的实例包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、3-乙基-1-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(WSC)、N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N’-乙基碳二亚胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]-N’-乙基碳二亚胺甲碘化物、N-叔丁基-N’-乙基碳二亚胺、N-环己基-N’-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基-对甲苯磺酸酯、N,N’-二叔丁基碳二亚胺和N,N’-二对甲苯基碳二亚胺。
在本说明书中，保护基团的实例包括叔丁氧基羰基(BOC)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)、苯甲氧基羰基(Z)、烯丙氧基羰基(Alloc)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基(Ts)和2-硝基苯磺酰基(Ns)。
在本说明书中，术语“溶剂”是指对反应无活性的溶剂。实例包括水、醚类(例如二氧杂环己烷、四氢呋喃、二乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、二乙二醇二甲醚和乙二醇二甲醚)、卤代烃类(例如二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷和四氯化碳)、芳香族烃类(例如苯、甲苯和二甲苯)、短链醇类(例如甲醇、乙醇和异丙醇)、极性溶剂(例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、六甲基磷酰三胺和乙腈)。这些溶剂可以单独使用或两种或更多种组合使用。
在本说明书中，胺包括三烷基胺(例如三甲胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺)和二烷基胺(例如二乙胺和二异丙基胺)。
在本说明书中，碱的实例包括无机碱和有机碱。无机碱包括碱金属氢氧化物(例如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾)、碱土金属氢氧化物(例如氢氧化镁、氢氧化钙和氢氧化钡)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯)、碱土金属碳酸盐(例如碳酸镁、碳酸钙和碳酸钡)、碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和碳酸氢钾)、碱金属磷酸盐(例如磷酸钠、磷酸钾和磷酸铯)、碱土金属磷酸盐(例如磷酸镁和磷酸钙)、碱金属醇化物(例如甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾)和碱金属氢化物(例如氢化钠和氢化钾)。有机碱包括三烷基胺(例如三甲胺、三乙胺(TEA)、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA))、二烷基胺(例如二乙胺和二异丙基胺)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、N-甲基吗啉、甲基吡啶、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷和1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯(DBU)。它们中的一者或多者可以被适合地选择并混合使用。
在本说明书中，缩合剂的实例包括1-羟基苯并三唑(HOBt)、3-羟基-3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(HOOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮-3-氧基四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HDTU)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基三-(吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐(PyBop)、(3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮-3-氧基)二乙基磷酸酯(DEPBt)、3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮-3-氧基三-(吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐(PDOP)、2-(苯并三唑-1-基氧基)-1,3-二甲基-2-吡咯烷-1-基-1,3,2-二氮杂鏻六氟磷酸盐(BOMP)、5-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)-3,4-二氢-1-甲基2H-吡咯鎓六氯锑酸盐(AOMP)、(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(AOP)、5-(1H-苯并三唑-1-基)-3,4-二氢-1-甲基2H-吡咯鎓六氯锑酸盐:N-氧化物(BDMP)、2-溴-3-乙基-4-甲基噻唑鎓四氟硼酸盐(BEMT)、2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、2-溴-1-乙基吡啶鎓六氯锑酸盐(BEPH)、苯并三唑-1-基氧基-N,N-二甲基甲基亚胺六氯锑酸盐(BOMI)、N,N’-双(2-氧代-3-
Figure BDA0003390983040000181
唑烷基)次膦氯(BOP-Cl)、1-(1H-苯并三唑-1-基氧基)苯基亚甲基吡咯烷鎓六氯-锑酸盐(BPMP)、1,1,3,3-双(四亚甲基)氟脲鎓六氟磷酸盐(BTFFH)、4-(氯-4-吗啉基亚甲基)六氟磷酸吗啉鎓(CMMM)、2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑鎓六氟磷酸盐(CMBI)、2-氟-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(FEP)、2-氟-1-乙基吡啶鎓六氯锑酸盐(FEPH)、1-(1-吡咯烷基-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐N-氧化物(HAPyU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-双(五亚甲基)脲鎓六氟磷酸盐(HBPipU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N0,N0-双(四亚甲基)脲鎓六氟磷酸盐(HBPyU)、(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、溴-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBrOp)、氯-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyClOP)、1,1,3,3-双(四亚甲基)氯脲鎓六氟磷酸盐(PyClU)、四甲基氟-脒鎓六氟磷酸盐(TFFH)、三光气、基于三嗪的试剂(三聚氯氰、三聚氟氰、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT))、双(2-氯苯基)氯磷酸酯、二苯基氯磷酸酯、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、N-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基(吗啉)]脲鎓六氟磷酸盐(COMU)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)。
在本说明书中，所述去保护试剂可以是能够脱去保护基团的任何试剂。实例包括碱例如哌啶和二异丙基酰胺锂，酸例如锌和TFA，与零价钯催化剂共存的亲核试剂、水性碱溶液、甲胺、肼、单电子还原剂和硫醇。
(II)四官能性化合物和四官能性化学探针
根据本发明所述的四官能性化合物是含有任选地通过间隔物相连的配体结合性组成部分(A)、反应性组成部分(D)、可切割组成部分(E)和生物素标签(B)的化合物。在靶蛋白的检测、鉴定或纯化中有用的四官能性化学探针可以通过将对所述靶蛋白具有亲和性(结合性质)的配体与该化合物的配体结合性组成部分结合来制备。具体来说，所述四官能性化学探针是含有通过或不通过间隔物相连的配体组成部分、反应性组成部分(D)、可切割组成部分(E)和生物素标签(B)的化合物。
下文描述了根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针的四个官能性组成部分以及连接所述四个组成部分的间隔物。
配体结合性组成部分
根据本发明所述的四官能性化合物的配体结合性组成部分(A)是配体与所述四官能性化合物结合的位点(偶联位点)。因此，所述配体结合性组成部分(A)可以是与所述配体上存在的反应性对应基团反应的反应性官能团或活化的官能团(这些基团被合称为“配体反应性基团”)。
所述活化的官能团是指通过标准化学技术活化以便获得相应的活化的官能团的反应性官能团。在具体实施方式中，所述活化的官能团选自胺反应性基团、羟基反应性基团、硫醇反应性基团、醛反应性或酮反应性基团、烷基卤化物反应性或芳基卤化物反应性基团、烷基磺酸酯反应性或芳基磺酸酯反应性基团、酰胺反应性基团、磺酰胺反应性基团、芳基反应性基团、二醇反应性基团和羧基反应性基团。
所述胺反应性基团是指与伯胺或仲胺反应的活化的官能团。典型的胺反应性基团包括芳基活化的或烷基活化的羧酸酯-COOR，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或其衍生物(例如磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)和苯酚酯或其衍生物(例如R表示苯酚、对硝基苯酚或四氟苯酚)。其他胺反应性基团包括酰氯(-COCl)、芳基或烷基亚氨酸酯(-C(NH)OMe)烷基或芳基异氰酸酯(-NCO)、异硫氰酸酯(-NCS)、醛特别是2-吡啶羧基醛、羰基、环氧基、α,β-不饱和羰基、烷基或芳基卤化物和烷基或芳基磺酸酯。
所述羟基反应性基团是指与羟基反应的活化的官能团。典型的羟基反应性基团的实例包括烷基或芳基异氰酸酯-NCO、芳基活化或烷基活化的羧酸酯-COOR、环氧基、α,β-不饱和羰基、烷基或芳基卤化物和烷基或芳基磺酸酯。
所述硫醇反应性基团是指与硫醇反应的活化的官能团。典型的硫醇反应性基团的实例包括马来酰亚胺、α-卤代酰胺(-NH-CO-CH2-Hal)、环氧基、α,β-不饱和羰基、烷基或芳基卤化物和烷基或芳基磺酸酯。
所述醛反应性或酮反应性基团是指与醛或酮反应的活化的官能团。典型的醛反应性或酮反应性基团的实例包括芳基或烷基胺、芳基或烷基肼(-NHNH2)、芳基或烷基酰肼(-CO-NHNH2)、烷基或芳基羟胺(-ONH2)和烷基或芳基卤化镁。
所述烷基卤化物反应性或芳基卤化物反应性基团是指与烷基卤化物或芳基卤化物反应的活化的反应性基团。典型的烷基卤化物活化或芳基卤化物活化的反应性基团包括胺、醇、巯基、酰胺、磺酰胺、羧酸、烯烃、炔烃、硼酸、硼酸酯和烷基锡。
所述烷基磺酸酯反应性或芳基磺酸酯反应性基团是指与烷基磺酸酯或芳基磺酸酯反应的活化的反应性基团。典型的烷基磺酸酯或芳基磺酸酯活化的反应性基团包括胺、醇、巯基、酰胺、磺酰胺、羧酸、烯烃、炔烃、硼酸、硼酸酯和烷基锡。
所述酰胺反应性基团是指与未取代或取代的酰胺反应的活化的反应性基团。典型的酰胺反应性基团包括环氧基、α,β-不饱和羰基、烷基或芳基卤化物和烷基或芳基磺酸酯。
所述磺酰胺反应性基团是指与未取代或取代的磺酰胺反应的活化的反应性基团。典型的磺酰胺反应性基团包括环氧基、α,β-不饱和羰基、烷基或芳基卤化物和烷基或芳基磺酸酯。
所述芳基反应性基团是指与芳基反应的活化的官能团。典型的芳基反应性基团的实例包括4-羟基苯和邻苯二甲酰肼。
所述二醇反应性基团是指与二醇基团反应的活化的官能团。典型的二醇反应性基团的实例包括硼酸。
所述羧基反应性基团是指与羧基反应的活化的官能团。典型的羧基反应性基团的实例包括卤素、烷基或芳基磺酸酯、羟基、环氧基、巯基、氨基、异氰酸基和碳二亚胺。
除非另有指明，否则所述反应性官能团是指不被保护的游离官能团。具体来说，所述反应性官能团可以选自-COOH、-NH2、-OH、-SH、-CH＝CH-、-(C＝O)-CH＝CH-、烷基、乙烯基或芳基卤化物、烷基、乙烯基或芳基磺酸酯、炔基、叠氮基、环氧基和点击标签。
用于活化反应性官能团的活化试剂的实例包括但不限于1-羟基苯并三唑(HOBt)、3-羟基-3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(HOOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮-3-氧基四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HDTU)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基三-(吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐(PyBop)、(3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮-3-氧基)二乙基磷酸酯(DEPBt)、3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪-4-酮-3-氧基三-(吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐(PDOP)、2-(苯并三唑-1-基氧基)-1,3-二甲基-2-吡咯烷-1-基-1,3,2-二氮杂鏻六氟磷酸盐(BOMP)、5-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)-3,4-二氢-1-甲基2H-吡咯鎓六氯锑酸盐(AOMP)、(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(AOP)、5-(1H-苯并三唑-1-基)-3,4-二氢-1-甲基2H-吡咯鎓六氯锑酸盐:N-氧化物(BDMP)、2-溴-3-乙基-4-甲基噻唑鎓四氟硼酸盐(BEMT)、2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、2-溴-1-乙基吡啶鎓六氯锑酸盐(BEPH)、苯并三唑-1-基氧基-N,N-二甲基甲基亚胺六氯锑酸盐(BOMI)、N,N’-双(2-氧代-3-
Figure BDA0003390983040000221
唑烷基)次膦氯(BOP-Cl)、1-(1H-苯并三唑-1-基氧基)苯基亚甲基吡咯烷鎓六氯-锑酸盐(BPMP)、1,1,3,3-双(四亚甲基)氟脲鎓六氟磷酸盐(BTFFH)、4-(氯-4-吗啉基亚甲基)吗啉鎓六氟磷酸盐(CMMM)、2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑鎓六氟磷酸盐(CMBI)、2-氟-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(FEP)、2-氟-1-乙基吡啶鎓六氯锑酸盐(FEPH)、1-(1-吡咯烷基-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐N-氧化物(HAPyU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-双-(五亚甲基)脲鎓六氟磷酸盐(HBPipU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)N,N,N0,N0-双(四亚甲基)脲鎓六氟磷酸盐(HBPyU)、(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、溴-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBrOp)、氯-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyClOP)、1,1,3,3-双(四亚甲基)氯脲鎓六氟磷酸盐(PyClU)、四甲基氟-脒鎓六氟磷酸盐(TFFH)、三光气、基于三嗪的试剂[三聚氯氰、三聚氟氰、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)]、双(2-氯苯基)氯磷酸酯、二苯基氯磷酸酯、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、N-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基(吗啉)]脲鎓六氟磷酸盐(COMU)、碱、路易斯酸、乙酸钯、1,1’-双(二苯基膦)二茂铁、硫酸铜、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、抗坏血酸钠、三[(1-苯甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)、三(2-苯并咪唑基甲基)胺、3,3′,3″-(4,4′,4″-(次氮基三(亚甲基))三(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))三(丙-1-醇)以及它们的任何组合。
本领域技术人员将能够容易地理解为了与所选配体偶联应该选择何种配体反应性基团，并且将能够从上文列出的基团中适合地选择配体反应性基团以备使用。
在优选实施方式中，所述配体结合性组成部分(A)是选自胺反应性基团、羟基反应性基团、硫醇反应性基团、醛反应性或酮反应性基团、烷基卤化物反应性或芳基卤化物反应性基团、烷基磺酸酯反应性或芳基磺酸酯反应性基团、酰胺反应性基团、磺酰胺反应性基团、芳基反应性基团、二醇反应性基团和羧基反应性基团的活化的官能团。特别优选地，所述配体结合性组成部分(A)是芳基活化或烷基活化的羧酸酯-COOR，例如由下式表示的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
Figure BDA0003390983040000241
其中符号*表示与相邻基团的结合位点。
在另一个优选实施方式中，所述配体结合性组成部分(A)是选自-COOH、-NH2、-OH、-SH、-CH＝CH-、-(C＝O)-CH＝CH-、烷基、乙烯基或芳基卤化物、烷基、乙烯基或芳基磺酸酯、炔基、叠氮基、环氧基和点击标签的反应性官能团。所述点击标签是用于生物正交反应的官能团。实例包括二苯基氧膦基苯基、1,2,4,5-四嗪-3-基、反式环辛烯基、降冰片烯基、环丙烯基、二羟硼基乙烯基、二羟硼基芳基和卤代芳基。
反应性组成部分：D
作为根据本发明所述的四官能性化合物的另一个官能性组成部分的反应性组成部分(D)，是能够与靶蛋白形成共价键的基团。这个基团可以是具有这种作用的任何基团，并优选为在简单反应条件下形成共价键的基团。此类基团的实例包括具有选自2-芳基-5-羰基四唑(ACT)、苯基叠氮化物、二氮杂环丙烯、α-酮基酰胺、4-羟基苯、邻苯二甲酰肼和二苯甲酮的至少一种化合物的结构(组成部分)的基团。ACT主要可以共价结合到蛋白质的羧基，并且苯基叠氮化物主要可以共价结合到蛋白质的氨基。4-羟基苯和邻苯二甲酰肼主要可以共价结合到蛋白质的4-羟基苯基。二氮杂环丙烯、α-酮基酰胺和二苯甲酮可以非特异性地与蛋白质形成共价键。
优选的基团是具有由下式(2)表示的ACT的结构的基团：
Figure BDA0003390983040000251
其中符号*表示与相邻基团的结合位点；n表示0或1；n是0是指没有基团配位到苯环(即ACT位于根据本发明所述的四官能性化合物的末端处)。当n是1时，所述与相邻基团的键可能在相对于配位到苯环的四唑基团的邻位、间位或对位处，并优选在对位处。
在上述实施方式中，所述简单的反应是例如用UV光辐照。辐照的UV光的波长和辐照时间没有特别限制，只要根据本发明所述的四官能性化合物的反应性组成部分可以共价结合到靶蛋白即可。所述波长优选为254至365nm，更优选为302nm。所述辐照时间优选为1秒至10分钟，更优选为30秒至5分钟，更优选为1分钟。
另一个优选基团是具有由下式(2’)表示的二氮杂环丙烯的结构的基团：
Figure BDA0003390983040000252
其中符号*表示与相邻基团的结合位点。
在上述实施方式中，所述简单的反应是例如用UV光辐照。辐照的UV光的波长和辐照时间没有特别限制，只要根据本发明所述的四官能性化合物的反应性组成部分可以共价结合到靶蛋白即可。所述波长优选为254至380nm，更优选为365nm。所述辐照时间优选为5分钟至30分钟，更优选为10分钟至20分钟，更优选为15分钟。
可切割组成部分：E
作为根据本发明所述的四官能性化合物的另一个官能性组成部分的可切割组成部分(E)，是能够在特定条件下切开的基团。这种基团可以是具有这种作用的任何基团，并优选为可以在温和条件下切开的基团。此类基团的实例包括具有选自1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)、乙酰丙酸酯、邻二醇、重氮苯、二芳基腙、二烷氧基二苯基甲硅烷、二硫化物、含有序列ENLYFQG(SEQ ID NO：1)的肽和含有序列ENLYFQS(SEQ ID NO：2)的肽或二硫化物基团的至少一种化合物的结构(组成部分)的基团。所述基团优选地具有由下式(3)表示的Dde的结构：
Figure BDA0003390983040000261
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地表示氢原子或C1-6烷基；在优选实施方式中，R1和R2是烷基，并且R3、R4、R5和R6是氢原子；所述烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基；并且符号*表示与相邻基团的键。
在上述实施方式中，所述温和条件是指在该条件下通过处理捕获的蛋白质不被降解并且非特异性结合到亲和素珠子的污染蛋白质不被洗脱的条件。具体来说，所述温和条件是指在该条件下所述可切割组成部分(E)可以被化学或生物化学切开的条件；例如用稀的水性肼溶液、稀的水性高碘酸钠溶液、稀的水性连二亚硫酸钠溶液、稀的甲酸溶液、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶溶液、稀的水性(三(2-羧基乙基)膦溶液或稀的水性二硫苏糖醇溶液处理。更优选地，所述温和条件是指用稀的水性肼溶液处理。当在这里使用时，术语“稀的”是指5质量％或更低，优选地3质量％或更低的浓度，但不限于此。
生物素标签：B
作为根据本发明所述的四官能性化合物的另一个官能性组成部分的生物素标签(E)，是具有由下式(1)表示的生物素的结构的基团：
Figure BDA0003390983040000271
其中符号*表示与相邻基团的键。
所述生物素标签是指能够与结合有亲和素或链霉亲合素的固体支持物(例如磁性粒子、珠子、板、滤膜、膜和层析用树脂)特异性结合的标签。所述生物素标签在检测、鉴定或纯化靶蛋白中有效发挥作用。
间隔物
上述四个官能性组成部分通过独立的间隔物彼此相连，由此形成根据本发明所述的四官能性化合物。连接这四个官能性组成部分的间隔物可以是具有一个或多个碳原子的直链或支链亚烷基，或者是具有三个或更多个碳原子的直链或支链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-、-NRa-CO-、由下式(1-1)表示的基团和由下式(1-2)表示的基团的至少一个交联基团代替。所述交联基团可以代替亚烷基链内的-CH2-基团或在亚烷基链的末端处的-CH2-基团。Ra优选为氢原子。
Figure BDA0003390983040000272
其中m表示0或1，并且n表示1或2。
由式(1-1)表示的基团或由式(1-2)表示的基团的具体实例包括以下式(1-3)至式(1-16)。
Figure BDA0003390983040000281
可以选择所述间隔物的类型和长度，以便最小化空间拥挤并且不损害上述四个官能团的作用。就此而言，对所述亚烷基的碳原子数目(亚烷基链长)没有限制；例如，所述亚烷基的碳原子数目优选为1至20，更优选为2至10。
根据本发明所述的四官能性化合物包括由下式(I)表示的直链化合物和由下式(II)表示的支链化合物。
Figure BDA0003390983040000291
(II-1)直链四官能性化合物和四官能性化学探针
在式(I)中，由A表示的配体结合性组成部分、由D表示的反应性组成部分、由E表示的可切割组成部分和由B表示的生物素标签如上所定义。在式(I)中，由S1、S2和S3表示的组成部分各自独立地表示间隔物基团。
由S1表示的间隔物基团可以是例如由下式(5)表示的基团。
Figure BDA0003390983040000292
其中a表示0至10的整数；并且b、c、d、e、f、g和h各自独立地表示选自0至6的整数。
在一个实施方式中，S1是具有一个或多个碳原子的直链亚烷基。这对应于式(5)中g、c和h是0并且a是1或更大的整数的实施方式。尽管a可以是1或更大的整数，但a优选为1至30的整数，更优选为1至10的整数。
在另一个实施方式中，S1是具有3个或更多个碳原子的直链或支链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-、-CO-和-NH-CO-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是3至40，更优选为10至35，但不限于此。具体来说，实例包括其中在式(5)中g是0，a、b、d和e是2，c和f是4并且h是1的情况，和其中在式(5)中g、c和f是0，a是3，d是4并且h是1的情况下。
由S2和S3表示的间隔物基团可以例如独立地是由下式(6)表示的基团。
Figure BDA0003390983040000301
其中a、b、c、d、e、f、g和h各自独立地表示选自0至6的整数；i表示0或1；然而，a、c、h和i不同时为0。
在一个实施方式中，S2是具有一个或多个碳原子的直链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-、-NH-和-NH-CO-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是1至20，更优选为1至5，但不限于此。具体来说，实例包括其中在式(6)中a和c是0，d是3，f和g是0并且i是1的情况。
在一个实施方式中，S3是具有3个或更多个碳原子的直链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-和-NH-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是3至20，更优选为5至15，但不限于此。具体来说，实例包括其中在式(6)中a和b是2，c是4并且h和i是0的情况。
对配体结合性组成部分具有与其结合的配体的直链四官能性化合物(即四官能性化学探针)的分子量没有限制，只要所述直链四官能性化合物能够适合地配位对所述配体具有高亲和性的蛋白质即可；所述分子量通常为500至3000，优选为800至2000，更优选为1000至1500。具有这些范围内的分子量的直链四官能性化合物可以抑制膜通透性。根据讨论各种不同配体的细胞膜通透性的文献(Methods Mol Biol.2015；1266:29-53)，从抑制膜通透性的观点来看，优选情况下，氢键供体的数目为6或更大，氢键受体的数目为15或更大，或者极性表面积为
Figure BDA0003390983040000311
或更大、更优选地
Figure BDA0003390983040000312
或更大。后文中描述的根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针，具有6至9个氢键供体，15至28个氢键受体和
Figure BDA0003390983040000313
或更大的极性表面积。近年中，还已相信膜通透性取决于分子尺寸而不是分子量。存在着在中等分子的情况下实际测量的环状肽的实例。已知膜通透性在分子尺寸为
Figure BDA0003390983040000314
或更大时减弱，并且在分子尺寸为
Figure BDA0003390983040000315
或更小时极端减弱。后文中描述的根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针具有
Figure BDA0003390983040000316
或更大的分子尺寸。根据上面提到的文献，当可旋转键的数目为10或更少时，膜通透性良好。更具体来说，从抑制膜通透性的观点来看，据信可旋转键的数目优选为10或更大，更优选为30或更大。根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针具有33至60个可旋转键。由此设计的根据本发明所述的四官能性化学探针表现出受抑制的细胞膜通透性并且不允许膜渗透；因此，所述四官能性化学探针可以有效地配位到膜蛋白。
下面以化合物(CPA-306)(参见生产例15)为例，描述了生产所述直链四官能性化合物中其配体结合性组成部分是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团(NHS酯基团)的化合物的方法。使用所述其配体结合性组成部分是NHS酯基团的化合物，可以通过将抗体结合到所述配体结合性组成部分来制备能够识别并结合作为靶蛋白的特定抗原的抗体探针。
生产其配体结合性组成部分是NHS酯基团的直链四官能性化合物的方法(实例)
1]
Figure BDA0003390983040000321
2]
Figure BDA0003390983040000322
3]
Figure BDA0003390983040000323
4]
Figure BDA0003390983040000324
5]
Figure BDA0003390983040000325
6]
Figure BDA0003390983040000326
7]
Figure BDA0003390983040000331
8]
Figure BDA0003390983040000332
其中q独立地表示0至6的整数。
第一步
这个步骤可以通过将PEG-NH2和烯丙醇在亚硫酰氯存在下，不使用溶剂或在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二步
这个步骤可以通过将在第一步中获得的化合物和2-芳基-5-羧基四唑(ATC)在N-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基(吗啉)]脲鎓六氟磷酸盐(COMU)和胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第三步：去保护
这个步骤可以通过将在第二步中获得的化合物在吗啉和钯化合物存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第四步：侧链延伸
这个步骤可以通过将在第一和第三步中获得的化合物在COMU和胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第五步：去保护
这个步骤可以通过将在第四步中获得的化合物和去保护剂在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第六步
这个步骤可以通过将在第五步中获得的化合物和去保护化合物在胺存在下，在对反应惰性的反应溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第七步：去保护
这个步骤可以通过将在第六步中获得的化合物在1,3-二甲基巴比妥酸和钯化合物存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第八步
这个步骤可以通过将在第七步中获得的化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺(WSC)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
可以按照已知方法将所需抗体附连到由此制备的直链四官能性化合物的配体结合性组成部分(NHS酯基团)，由此产生根据本发明所述的直链四官能性化学探针。将所需抗体结合到所述NHS酯基团的方法的实例在下文描述，尽管所述方法不限于这个实例。
用四官能性化合物标记抗体的方法
使用常用的NHS标记缓冲液调整对靶蛋白具有亲和性的所需抗体的浓度，并向其添加根据本发明所述的四官能性化合物，然后在0至37℃的温度下反应约5至60分钟。随后，添加赖氨酸溶液，并将所述混合物在0至37℃反应约5至60分钟。因此，可以获得含有根据本发明所述的四官能性化合物并在其配体结合性组成部分(NHS酯基团)上结合有所需抗体(标记抗体)的直链四官能性化学探针。
在所述直链四官能性化合物中，其配体结合性组成部分是NHS酯基团之外的其他配体反应性基团的化合物，可以被生产成所需配体被直接结合到所述配体结合性组成部分(即四官能性化学探针)。下面描述了生产这些化合物的方法的实例。
生产直链四官能性化学探针的方法(实例)
第一步
Figure BDA0003390983040000351
其中r表示1至6的整数；并且R1和R2如上所定义。
这个步骤可以通过将化合物1-1、碳二亚胺和环己烷-1,3-二酮在N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二和第三步
Figure BDA0003390983040000361
其中m表示1至6的整数。
第二步
这个步骤可以通过将化合物1-3和化合物1-4在COMU和胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第三步
这个步骤可以通过将化合物1-5在碱存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第四步
Figure BDA0003390983040000371
其中s表示1至10的整数；并且m如上所定义。
这个步骤可以通过将化合物1-7和在第三步中获得的化合物1-6在HATU和胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第五步
Figure BDA0003390983040000372
其中m、r、s、R1和R2如上所定义。
这个步骤可以按以下方式进行，通过将在第四步中获得的化合物1-8在弱酸存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天以进行浓缩操作，并将浓缩的产物在第一步中获得的化合物1-2和胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天。用于该反应的弱酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸和草酸。在该反应中使用的胺包括二异丙基乙基胺和三乙胺。
由此产生的化合物1-9含有根据本发明所述的四官能性化合物和结合到其配体结合性组成部分的所需配体，因此可用作四官能性化学探针。这里使用的配体的实例包括但不限于上文中描述的除了抗体之外的配体。
(II-2)支链四官能性化合物和四官能性化学探针
在上述式(II)中，由A表示的配体结合性组成部分、由D表示的反应性组成部分、由E表示的可切割组成部分和由B表示的生物素标签如上所定义。在式(II)中，由S4、S5、S6和S7表示的位点独立地表示间隔物基团。
由S4表示的间隔物基团是例如由下式(7)表示的基团：
Figure BDA0003390983040000381
其中a、b、c、d、e、f、g、h和i独立地表示选自0至6的整数；然而，a、c和i不同时为0，并且d、f和g不同时为0。
在一个实施方式中，S4是具有3个或更多个碳原子的直链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-和-NH-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是1至20，优选为1至15，更优选为3至10，但不限于此。具体来说，实例包括其中上式中a是2，b是2，c是2，h是0并且i是0的情况。
由S5表示的间隔物基团是例如由下式(8)至(10)表示的基团。
Figure BDA0003390983040000391
其中w、x、y和z各自独立地表示选自0至6的整数；然而，x和y不同时为0。
在一个实施方式中，S5是具有3个或更多个碳原子的直链亚烷基(具有取代基)，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-CO-、-NH-、-CO-NH-和-NH-CO-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是3至20，优选为3至15，更优选为5至15，但不限于此。具体来说，实例包括其中式(8)中x和y是4的情况。
由S6表示的间隔物基团是例如由下式表示的基团。
Figure BDA0003390983040000392
其中a、b、c和d各自独立地表示选自0至6的整数；然而，a和c不同时为0。
在一个实施方式中，S6是具有3个或更多个碳原子的直链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-和-NH-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是3至20，优选为5至15，但不限于此。具体来说，实例包括其中式(11)中a是3，b是2，c是3并且d是1的情况。
由S7表示的间隔物基团是例如由下式表示的基团。
Figure BDA0003390983040000401
其中a、b、c、d、e、f、g和h各自独立地表示选自0至6的整数；然而，a和c不同时为0，并且a、c、g和h不同时为0。
在一个实施方式中，S7是具有3个或更多个碳原子的直链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-和-NRa-CO-的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-、-CO-和-NH-CO-的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是3至40，优选为3至30，更优选为3至20，但不限于此。具体来说，实例包括其中上式中g是0，a是5，c是0，d是2，f是0并且h是1的情况。
在另一个实施方式中，由S7表示的间隔物是例如由下式表示的基团。
Figure BDA0003390983040000402
其中a、b、c、d、e、f和g各自独立地表示选自0至6的整数；然而，a和c不同时为0，并且a、c和h不同时为0。
在另一个实施方式中，S7是具有3个或更多个碳原子的直链亚烷基，在其亚烷基链中不相邻的-CH2-基团独立地被选自-O-、-OCH2-、-CH2O-、-CO-、-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，同样适用于下文)、-CO-NRa-、-NRa-CO-、由下式(1-1)表示的基团和由下式(1-2)表示的基团的至少一个交联基团代替，优选地被选自-O-、-CO-、-NH-CO-、由下式(1-3)表示的基团、由下式(1-7)表示的基团和由下式(1-15)表示的基团的至少一个交联基团代替。例如，碳原子数目可以是3至40，优选为3至30，更优选为3至20，但不限于此。具体来说，实例包括其中式(13)中g是0，a是5，c是0，d是2，f是0并且h是1的情况。
Figure BDA0003390983040000411
其中m表示0或1，并且n表示1或2。
Figure BDA0003390983040000412
对配体结合性组成部分具有与其结合的配体的支链四官能性化合物(即四官能性化学探针)的分子量没有限制，只要所述支链四官能性化合物能够适合地配位对所述配体具有高亲和性的蛋白质即可；所述分子量通常为500至3000，优选为800至2000，更优选为1000至1500。具有这些范围内的分子量的支链四官能性化合物可以抑制膜通透性。根据讨论各种不同配体的细胞膜通透性的文献(Methods Mol Biol.2015；1266:29-53)，从抑制膜通透性的观点来看，优选情况下，氢键供体的数目为6或更大，氢键受体的数目为15或更大，或者极性表面积为
Figure BDA0003390983040000421
或更大、更优选地
Figure BDA0003390983040000422
或更大。后文中描述的根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针，具有6至9个氢键供体，15至28个氢键受体和
Figure BDA0003390983040000423
或更大的极性表面积。近年中，还已相信膜通透性取决于分子尺寸而不是分子量。存在着在中等分子的情况下实际测量的环状肽的实例。已知膜通透性在分子尺寸为
Figure BDA0003390983040000424
或更大时减弱，并且在分子尺寸为
Figure BDA0003390983040000425
或更小时极端减弱。后文中描述的根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针具有
Figure BDA0003390983040000426
或更大的分子尺寸。根据上面提到的文献，当可旋转键的数目为10或更少时，膜通透性良好。更具体来说，从抑制膜通透性的观点来看，据信可旋转键的数目优选为10或更大，更优选为30或更大。根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针具有33至60个可旋转键。由此设计的根据本发明所述的四官能性化学探针表现出受抑制的细胞膜通透性并且不允许膜渗透；因此，所述四官能性化学探针可以有效地配位到膜蛋白。
下面以化合物(CPA-306)(参见生产例15)为例，描述了生产所述支链四官能性化合物中其配体结合性组成部分是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团(NHS酯基团)的化合物的方法。使用所述其配体结合性组成部分是NHS酯基团的化合物，可以通过将抗体结合到所述配体结合性组成部分来制备能够识别并结合作为靶蛋白的特定抗原的抗体探针。生产其配体结 合性组成部分是NHS酯基团的支链四官能性化合物的方法(实例)
所述反应过程被宽泛地分成5个部分，以便于下述解释。
反应路线I
Figure BDA0003390983040000431
其中t表示0至6的整数，并且v表示1至5的整数。
第一步
这个步骤可以通过将二胺和酰基氯在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二步
这个步骤可以通过将在第一步中附连有保护基团的二胺和具有支链胺的连接物在碳二亚胺(WSC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第三步
这个步骤可以通过将在第二步中获得的化合物在1,3-二甲基巴比妥酸和钯化合物存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第四步
这个步骤可以通过将在第三步中获得的化合物和生物素化合物在胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第五步
这个步骤可以通过将在第三步中获得的化合物在哌啶存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
反应路线II
Figure BDA0003390983040000441
其中w表示0至6的整数。
第一步
这个步骤可以通过将1-氨基烷基羧酸和烯丙醇在亚硫酰氯存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二步
这个步骤可以通过将在第一步中获得的1-氨基烷基羧酸和烷基二甲酸酐在胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。在所述反应中使用的烷基二甲酸酐的实例包括但不限于琥珀酸酐、戊二酸酐和己二酸酐。
反应路线III
Figure BDA0003390983040000451
其中c和d各自表示0至6的整数。
第一步
这个步骤可以通过将用BOC保护的二胺和含有四唑的羧酸在胺和HATU存在下，在对反应惰性的反应溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二步
这个步骤可以通过将在第一步中获得的化合物和去保护剂在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第三步
这个步骤和第四步是用于进一步延长连接物长度的可选步骤。这个步骤可以通过将在第二步中获得的化合物和其氨基被BOC保护的氨基羧酸在胺和COMU存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第四步
这个步骤可以通过将在第三步中获得的化合物和去保护剂在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
反应路线IV
Figure BDA0003390983040000471
其中t和u各自独立地表示0至6的整数，并且v、w、R1和R2如上所定义。
第一步
这个步骤可以通过将在反应路线II和III中获得的化合物在水溶性碳二亚胺(WSC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二步
这个步骤可以通过将在第一步中获得的化合物和去保护剂在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第三步
这个步骤可以通过将在第二步中获得的化合物和烷基二甲酸酐在胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第四步
这个步骤可以通过将在第三步中获得的化合物和环己二酮在水溶性碳二亚胺(WSC)和N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
反应路线V
Figure BDA0003390983040000491
其中c、u、v、w、t、R1和R2如上所定义。
第一步
这个步骤可以通过将在反应路线III和IV中获得的化合物在胺存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第二步
这个步骤可以通过将在第一步中获得的化合物在钯化合物和1,3-二甲基巴比妥酸存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第三步
这个步骤可以通过将在第二步中获得的化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在碳二亚胺(WSC)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
第四步
这个步骤是用于转化所述配体结合性组成部分的任选步骤。这个步骤可以通过将在第三步中获得的化合物和6-(哌嗪-1-基甲基)甲基吡啶醛在胺(DIPEA)存在下，在对反应惰性的溶剂中，在0℃至达到加热回流的温度范围内的温度下搅拌通常0.1小时至5天来进行。
可以按照已知的方法将所需抗体附连到由此制备的支链四官能性化合物的配体结合性组成部分(NHS酯基团)，由此产生根据本发明所述的支链四官能性化学探针。用于将所需抗体结合到所述NHS酯基团的方法的实例是用上述四官能性化合物标记抗体的方法，尽管所述方法不限于这个实例。
在上述反应路线的每个反应中，产物可以照原样作为反应溶液或作为粗产物用于随后的反应中。然而，所述产物也可以按照常用的方法从反应混合物分离，并通过典型的分离方法容易地纯化。典型分离方法的实例包括重结晶、蒸馏和层析。
每个步骤中的起始原料化合物、中间体化合物和靶化合物(根据本发明所述的四官能性化合物、四官能性化学探针)包括几何异构体、立体异构体、光学异构体和互变异构体。这些异构体可以通过典型的光学拆分方法分离，并且也可以从适合的光学活性起始原料化合物生产。
根据本发明所述的四官能性化合物和四官能性化学探针不受上述反应路线中示出的合成方法限制，并且可以通过与那些方法类似的方法或其他方法生产。除非另有指明，否则在所述生产中使用的起始原料化合物可以是可商购化合物或按照本身已知的方法或与此类已知方法相似的方法生产的化合物。
每个步骤中的起始原料化合物和靶化合物可以以适合的盐形式使用。取决于取代基的类型，这些盐包括但不限于酸加成盐和与碱的盐。形成此类酸加成盐的酸的实例包括无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸)和有机酸(例如甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、延胡索酸、苹果酸和乳酸)。形成盐的碱的实例包括无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾)和有机碱(例如甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、三(羟甲基)甲基胺、二环己胺、N,N’-二苯甲基乙二胺、胍、吡啶、甲基吡啶和胆碱)和铵盐。盐也可以用例如氨基酸如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸形成。
(II)检测靶蛋白的方法
样品中的靶蛋白可以使用上述根据本发明所述的四官能性化学探针来检测。靶蛋白可以使用根据本发明所述的四官能性化学探针，通过包括下述步骤的方法来检测，尽管方法不限于此。
(1)将所述四官能性化学探针与样品中的细胞或组织反应，以使所述四官能性化学探针的配体与靶蛋白结合的步骤。
(2)在所述四官能性化学探针的反应性组成部分(D)与所述靶蛋白之间形成共价键的步骤。
(3)纯化含有与所述四官能性化学探针结合的靶蛋白的级分的步骤。
(4)将所述四官能性化学探针的生物素标签结合到亲和素，以形成所述四官能性化学探针和所述亲和素的偶联物的步骤。
(5)在所述四官能性化学探针的可切割组成部分处切开所形成的所述四官能性化学探针和所述亲和素的偶联物的步骤。
(6)检测或鉴定所述靶蛋白的步骤。
下面描述每个步骤。
(1)将配体结合到蛋白质的步骤
尽管没有限制，但这个步骤可以如下进行。将表达靶蛋白的细胞在5％CO2气氛中在37℃下培养。在确认所述细胞已变得合生后，向其添加用DMSO调整到所需浓度的根据本发明所述的四官能性化学探针，并允许所述细胞在5％CO2气氛中在37℃放置约30至60分钟。
(2)在四官能性化学探针的反应性组成部分(D)与靶蛋白之间形成共价键的步骤
尽管没有限制，但这个步骤可以通过使用UV交联剂，在254至365nm、优选地302nm的波长处进行1秒至10分钟、优选地30秒至5分钟、更优选地1分钟的辐照来进行。
(3)纯化含有结合到四官能性化学探针的靶蛋白的级分的步骤
尽管没有限制，但这个步骤可以例如通过下述方法来进行。首先，向细胞添加tris匀浆缓冲液，并将所述混合物匀浆，然后离心。分离沉淀物并向其添加碳酸钠缓冲液，然后均化，然后温育。通过离心分离沉淀物，以纯化并收集含有结合到四官能性化学探针的靶蛋白的级分(例如膜级分)。
(4)将四官能性化学探针的生物素标签与亲和素结合以形成四官能性化学探针和 亲和素的偶联物的步骤
尽管没有限制，但这个步骤可以如下进行。例如，向所述收集的级分添加含有8M脲的RIPA缓冲液，并使用超声粉碎机将所述级分溶解在所述缓冲液中。通过离心分离上清液，然后向其添加链霉亲合素磁性粒子。因此，所述化学探针中的生物素标签与亲和素结合，由此形成四官能性化学探针和亲和素的偶联物。此外，可以通过按照常规方法进行磁性分离并舍弃上清液，来纯化并收集所述四官能性化学探针和亲和素的偶联物。
(5)在四官能性化学探针的可切割组成部分处切开形成的四官能性化学探针和亲 和素的偶联物的步骤
尽管没有限制，但这个步骤可以如下进行：向在前一步中收集的四官能性化学探针和亲和素的偶联物(磁性粒子偶联物)添加SDS(十二烷基硫酸钠)和水性肼溶液，并允许所述混合物在室温(1至30℃)放置30分钟。该反应允许切开所述四官能性化学探针中的可切割组成部分，由此将所述四官能性化学探针和亲和素的偶联物分成靶蛋白结合结构域和生物素-亲和素结合结构域。将反应溶液磁性分离以获得上清液；由此可以收集所述靶蛋白的结合结构域片段。
(6)检测或鉴定靶蛋白的步骤
在检测或鉴定靶蛋白中，可以任选地将前述收集的靶蛋白的结合结构域片段纯化并水解。尽管没有限制，但具体来说，例如向所述获得的上清液添加二硫苏糖醇，并将混合物在70℃搅拌15分钟。随后向其添加碘代乙酰胺，并允许混合物在室温放置30分钟。向由此获得的溶液添加SP3珠子，然后添加MeCN，然后温育18分钟。在温育完成后进行磁性分离，以舍弃上清液。对于肽降解来说，例如向所收集的残留物添加胰蛋白酶溶液，并将混合物在37℃温育12至16小时。添加MeCN，并将混合物温育18分钟，然后进行磁性分离以舍弃上清液。向残留物添加TFA水溶液并将混合物温育3分钟。进行磁性分离以获得上清液。
将由此制备的肽脱盐并重悬浮在适合的缓冲溶液中，用于使用高质量精确度质谱仪进行分析。所述质谱仪在数据依赖性获取模式下运行，其中所述装置对于超过预定阈值的离子信号自动开始从MS切换到MS/MS模式，以便产生所述肽的碰撞诱导解离(CID)谱或高能碰撞解离(HCD)谱。将所有MS/MS谱图在标准蛋白质数据库中进行搜索。
对由此获得的肽进行分析。可以使用在本领域中可用的用于分析此类化合物的任何方法，并且优选的方法是质谱术。用于执行质谱术的方法对于本领域技术人员来说是公知的(参见例如Yates,J.Mass Spect.33:1-19(1998)；Kinter和Sherman，《使用串联质谱术的蛋白质测序和鉴定》(Protein Sequencing and Identification Using Tandem MassSpectrometry)，John Wiley and Sons,New York(2000)；以及Aebersold和Goodlett，Chem.Rev.101:269-295(2001))。对于高分辨率多肽片段分离来说，可以使用利用毛细管反相层析的液相色谱ESI-MS/MS或自动LC-MS/MS作为分离方法(Yates等，MethodsMol.Biol.112:553-569(1999))。优选地，使用涉及动态排除的数据依赖性碰撞诱导解离(CID)或高能碰撞解离(HCD)作为选定的质谱术(Goodlett等，Anal.Chem.72:1112-1118(2000))。对于此类分析来说，质谱仪通常在数据依赖性获取模式下运行，其中所述装置对于超过预定阈值的离子信号自动开始从MS切换到MS/MS模式，以便产生所述肽的碰撞诱导解离(CID)谱或高能碰撞解离(HCD)谱。
在蛋白质鉴定中，使用标准算法(例如SEQUEST、Mascot、X！tandem和MS Aanda)将所有MS/MS谱图在标准蛋白质数据库中进行搜索，并进行典型过滤以将假阳性蛋白质鉴定降低到低于1％。
在一个实施方式中，可以将样品中的膜蛋白浓度与对照样品进行定量比较。这允许检测靶膜蛋白受体的特异性富集。对于这种未标记的质谱术来说，在质谱术之前立即进行的反相色谱可以被显示为MS特点图，其将保留时间的特点相对于质量/电荷比作图。正如通过质谱仪检测的，这种图中的肽在预定时间内以清晰的同位素模式出现，并根据它们在样品中的量以确定的离子电流强度出现。一旦肽已被片段化并通过MS/MS分析鉴定后，这个信息就可以被分派给所述MS图上的特定肽特点，并且可以与使用开源或商业化算法例如MaxQuant(Cox等，Nature Biotechnology(2008)第26卷,第1367-1372页)或ProteomeDiscoverer(Thermo Fischer Scientific)的半定量数据分析相组合。不同样品(例如样品与对照)的MS特点图可以被叠加和比较，以确定肽的量的比率。源自于膜蛋白的随机标记的肽的比率应该约为1。基于配体而被特异性捕获的膜蛋白肽具有比对照样品更高的比率。
在另一个实施方式中，可以使用可选的基于质谱术的定量方法，例如单反应监测(SRM)、在细胞培养中通过氨基酸进行的稳定同位素标记(SILAC；例如Nilsson等，NatMethods(2010)第7卷(9),第681-5页)、不依赖于质谱数据的获取(SWATH MS；参见例如Gillet等，通过数据不依赖性获取产生的MS/MS谱图的定向数据提取：用于一致和准确蛋白质组分析的新概念(Targeted Data Extraction of the MS/MS Spectra Generated byData-independent Acquisition:A New Concept for Consistent and AccurateProteome Analysis))和串联质量标签(TMT；参见例如Dayon等，使用6-Plex等重标签通过MS/MS对人类脑脊液中的蛋白质进行相对定量(Relative Quantification of Proteinsin Human Cerebrospinal Fluids by MS/MS using 6-Plex Isobaric Tags))。
可以将MS分析用其他分析方法代替。这些其他的方法包含在本发明中作为其一部分。
根据本发明所述的化学探针的使用，允许通过使用质谱术鉴定添加有探针结构的一部分的肽序列来确定靶蛋白结合到配体的位点。这使得能够识别所述靶蛋白与配体的结合位点，并因此使所述靶蛋白的鉴定更加准确。此外，这使得可以设计具有增强的检测靶蛋白的能力的探针。
本说明书中引用的所有专利和非专利文献的公开内容整体通过参考并入本文。
实施例
下面参考试验例和生产例进一步详细描述本发明；然而，这些实施例不限制本发明，并且可以做出修改而不背离本发明的范围。
在本说明书中，可以使用下述缩略语。
表1
Figure BDA0003390983040000561
Figure BDA0003390983040000571
在下面的实施例中，“室温”通常是指约10至35℃。除非另有规定，否则为混合溶剂指示的比例是指体积比。除非另有规定，否则％是指质量％。
质子核磁共振(1HNMR)谱通过傅里叶变换NMR测量(使用Bruker AVANCE III 400(400MHz)和Bruker AVANCE III HD(500MHz)中的任一者)。使用四甲基甲硅烷作为标准品测量的光谱分裂模式被指定为单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重或更多重叠信号(m)和宽信号(br)。溶剂在括号中示出。
质谱使用Waters ACQUITY H-Class结合SQD质谱仪，通过电喷雾电离方法(ESI)来测量。高分辨率质谱术(HRMS)使用Waters Xevo G2-XS QTof质谱仪通过电喷雾电离方法(ESI)来进行。[M+H]+是指单同位素分子量。
对于实施例中的硅胶柱层析来说，使用了Hi-Flash柱(Yamazen Corporation)或SNAP Ultra HP-Sphere 25μm(Biotage)。对于ODS柱层析来说，使用了十八烷基C18(Yamazen Corporation)或SNAP Ultra C18(Biotage)。
在试验例中，使用了由Thermo Fisher Scientific Inc.生产的抗CD71抗体OKT9(目录号16-0719-85)、由Abcam生产的抗CD71抗体DF1513(ab212863)、由Oriental YeastCo.,Ltd.生产的His标签EGF(47061000)和由Southern Biotech生产的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号1030-01)。
生产例1：化合物(CPI-003)的生产
化合物(CPI-003)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000581
(1)化合物(CPI-002)的生产
将N-(叔丁氧基羰基)-4-氨基丁酸(0.24g)、上述路线中示出的化合物(CPI-001)(0.31g)、COMU(0.55g)和DIPEA(0.44ml)溶解在DMF(2ml)中，然后在室温搅拌17小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(CPI-002)(0.45g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.31(s,1H),8.08(d,J＝9.0Hz,2H),7.89(d,J＝9.0Hz,2H),6.86(t,J＝5.5Hz,1H),4.47(q,J＝7.0Hz,2H),2.98(q,J＝6.5Hz,2H),2.36(t,J＝7.5Hz,2H),1.71(m,J＝7.2Hz,2H),1.38(t,J＝7.1Hz,12H)；
HRMS(ESI)为C19H27N6O5的计算值为419.2043[M+H]+，实测值为419.2054。
(2)化合物(CPI-003)的生产
在冰冷却下添加上述合成的CPI-002(0.45g)在MeOH(15ml)中的溶液和0.2M LiOH水溶液(5.9ml)，然后搅拌30分钟。向反应混合物添加AcOH(0.30μL)，然后除去溶剂。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(0.45g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.30(s,1H),8.06(d,J＝9.1Hz,2H),7.89(d,J＝9.1Hz,2H),6.86(t,J＝5.5Hz,1H),2.98(q,J＝6.6Hz,2H),2.36(t,J＝7.4Hz,2H),1.71(m,J＝7.2Hz,2H),1.38(s,9H)；HRMS(ESI)为C17H23N6O5的计算值为391.1730[M+H]+，实测值为391.1724。
生产例2：化合物(CPI-005)的生产
化合物(CPI-005)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000591
将双甲酮(63mg)、如上所示的化合物(CPI-004)(0.20g)、WSC盐酸盐(82mg)和DMAP(50mg)在DMF(3ml)中的混合物在室温搅拌14小时，然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(0.14g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.82(t,J＝5.6Hz,1H),6.41(br,1H),6.35(br,1H),4.30(dd,J＝7.9,5.0Hz,1H),4.14-4.11(m,1H),3.68(t,J＝6.4Hz,2H),3.52-3.49(m,12H),3.39(t,J＝5.9Hz,2H),3.23(t,J＝6.4Hz,2H),3.18(q,J＝5.7Hz,2H),3.11-3.07(m,1H),2.82(dd,J＝12.5,5.1Hz,1H),2.63(s,2H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.33(s,2H),2.06(t,J＝7.5Hz,2H),1.64-1.57(m,1H),1.54-1.42(m,3H),1.36-1.24(m,2H),1.00(s,6H)；HRMS(ESI)为C29H48N3O9S的计算值为614.3111[M+H]+，实测值为614.3112。
生产例3：化合物(CPI-104)的生产
化合物(CPI-104)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000601
(1)化合物(CPI-102)的生产
使用微波反应器将如上所示的化合物(CPI-101)(0.21g)和1-溴-3-氯丙烷(5.0ml)在NMP(5ml)中的混合物在120℃反应6小时。向反应混合物添加水，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥，并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)以给出中间体(0.18g)。将所述中间体(0.18g)、邻苯二甲酰亚胺(0.20g)、碳酸钾(0.19g)和碘化钠(14mg)在DMF(9ml)中的悬液在70℃搅拌10小时。在蒸馏掉溶剂后，向其添加水，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出化合物(0.24g)。将得到的化合物(0.24g)溶解在DCM(9ml)中，并向其添加氯代乙酰氯(0.15ml)和三乙胺(0.25ml)，然后在室温搅拌2小时。向反应混合物添加水，然后用DCM萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(0.18g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.69(m,6H),7.63-7.59(m,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.49-7.45(m,3H),4.15-4.05(m,1H),3.99(d,J＝13.0Hz,1H),3.87(d,J＝13.0Hz,1H),3.64(t,J＝7.5Hz,2H),3.02-2.95(m,1H),1.82-1.75(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝495.04。
(2)化合物(CPI-103)的生产
将如上所述合成的化合物(CPI-102)(0.18g)溶解在EtOH(5ml)中。向其添加六亚甲基四胺(0.10g)和AcONH4(56mg)，并将混合物在回流下加热9小时。向其进一步添加六亚甲基四胺(51mg)和AcONH4(28mg)，并将混合物在回流下加热9小时。向反应混合物添加水，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(0.14g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83-7.79(m,2H),7.73-7.68(m,2H),7.67-7.64(m,2H),7.50-7.40(m,4H),7.31-7.29(m,2H),4.80(d,J＝10.6Hz,1H),4.38(dt,J＝14.4,7.9Hz,1H),3.74(d,J＝10.6Hz,1H),3.71-3.52(m,3H),1.93(tt,J＝7.2,7.2Hz,2H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝458.08。
(3)化合物(CPI-104)的生产
向如上所述合成的化合物(CPI-103)(10mg)在MeOH中的溶液(0.5ml)添加甲胺和40％MeOH溶液(22μL)，然后在室温搅拌2小时。向其进一步添加甲胺和40％MeOH溶液(22μL)，然后在室温搅拌2小时。向反应混合物添加水，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(1.6mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.66(d,J＝1.4Hz,2H),7.58-7.45(m,6H),7.24(t,J＝1.4Hz,1H),4.64(d,J＝10.6Hz,1H),4.53-4.43(m,1H),3.86(d,J＝10.7Hz,1H),3.82-3.76(m,1H),2.46-2.43(m,2H),1.73-1.53(m,2H)；LC-MS：[M+H]+＝328.17。
生产例4：化合物(CPP-112)的生产
化合物(CPP-112)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000621
将上述路线中示出的化合物(CPP-111)(0.44g)、羟胺盐酸盐(0.18g)、吡啶(1.0ml)和EtOH(20ml)的混合物在回流下加热2小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物用2M盐酸酸化，然后用DCM萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥。蒸馏掉溶剂，以给出无色油状粗产物(0.51g)。在冰冷却下向DMAP(0.26g)在DCM(15ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.31ml)，并将混合物搅拌30分钟。在冰冷却下向其添加在前一步中获得的粗产物(0.51g)在DCM中的溶液(5ml)和DMAP(0.39g)，将混合物升温至室温并搅拌3天。向反应混合物添加水，然后用DCM萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(0.30g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94-7.89(m,1H),7.87(s,1H),7.42-7.37(m,2H),3.92(s,3H),2.84(t,J＝7.3Hz,2H),2.34(t,J＝7.3Hz,2H),2.02(tt,J＝7.3,7.3Hz,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝204.02。
生产例5：化合物(CPP-117)的生产
化合物(CPP-117)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000631
(1)CPP-114的生产
在-78℃下向在上述路线中示出的化合物(CPP-113)(100mg)和THF(3ml)的混合物添加1.6M正丁基锂和正己烷溶液(0.53ml)，并将混合物搅拌1小时。向其添加在生产例4中生产的化合物(CPP-112)(84mg)在THF中的溶液(2ml)，并将混合物在-78℃搅拌5小时。在3小时时间段内将所述混合物升温至室温，并在室温搅拌13小时。向反应混合物添加水，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(48mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66-7.36(m,6H),7.31-7.13(brm,1H),3.14-2.92(brm,3H),2.90-2.77(brs,2H),2.34(t,J＝6.9Hz,2H),2.00(tt,J＝6.9,6.9Hz,2H),1.26(s,9H)；
LC-MS：[M+Na]+＝434.94。
(2)CPP-115的生产
向如上所述生产的化合物(CPP-114)(48mg)在DCM中的溶液(2ml)添加TFA(0.45ml)。将混合物在室温搅拌2小时，并蒸馏掉溶剂。将残留物用DCM(2ml)稀释。向其添加TEA(49μL)和氯代乙酰氯(28μL)，并将混合物在室温搅拌3小时。向反应混合物添加水，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)。将纯化的产物(38mg)、六亚甲基四胺(33mg)、AcONH4(18mg)和EtOH(2ml)的混合物在回流下加热6小时。蒸馏掉溶剂，并通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(28mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.50(s,1H),7.41-7.30(m,4H),7.27(d,J＝2.5Hz,1H),4.84(d,J＝10.8Hz,1H),3.77(d,J＝10.8Hz,1H),3.40(s,3H),2.88-2.77(m,2H),2.36(t,J＝7.0Hz,2H),2.05-1.97(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝352.08。
(3)CPP-116的生产
将如上所述生产的化合物(CPP-115)(28mg)、30％过氧化氢溶液(0.16ml)、K2CO3(11mg)和DMSO(1ml)的混合物在室温搅拌2小时。向其添加硫代硫酸钠水溶液，并将混合物搅拌，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，AcOEt/MeOH)，以给出所需产物(28mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),7.50-7.46(brm,1H),7.37-7.28(m,5H),5.60-5.18(brm,2H),4.82(d,J＝10.8Hz,1H),3.77(d,J＝10.8Hz,1H),3.40(s,3H),2.79-2.65(m,2H),2.23(t,J＝7.5Hz,2H),2.08-1.91(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝370.00。
(4)CPP-117的生产
将如上所述生产的化合物(CPP-116)(28mg)、四乙酸铅(40mg)和t-BuOH(0.72ml)的混合物在80℃搅拌3小时。向其进一步添加四乙酸铅(40mg)，并将混合物在80℃搅拌3小时。然后向其添加水/AcOEt，并将混合物通过硅藻土过滤。将滤液用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(19mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53-7.49(m,2H),7.33-7.28(m,5H),4.83(d,J＝10.8Hz,1H),4.62-4.47(brs,1H),3.77(d,J＝10.8Hz,1H),3.40(s,3H),3.22-3.10(brm,2H),2.68(t,J＝7.6Hz,2H),1.82(tt,J＝7.6,7.6Hz,2H),1.44(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝442.11。
生产例6：化合物(CPP-124)的生产
化合物(CPP-124)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000651
(1)化合物(CPP-122)的生产
将上述路线中示出的化合物(CPP-121)(0.51g)、60％NaH(72mg)和DMF(50ml)的混合物在室温搅拌30分钟。向反应混合物添加1-溴-3-氯丙烷(0.18ml)，并将所述混合物在室温搅拌60小时。向反应混合物添加水，然后浓缩。向残留物添加AcOEt。将所述混合物用水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，AcOEt/MeOH)，以给出所需产物(0.45g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝2.7Hz,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝5.5Hz,1H),7.38(d,J＝5.5Hz,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),6.99(dd,J＝8.3,2.7Hz,1H),6.90(d,J＝7.6Hz,1H),4.11(t,J＝6.3Hz,2H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H),3.63(t,J＝6.4Hz,2H),3.59(t,J＝6.7Hz,2H),3.20(br,4H),2.94(t,J＝6.6Hz,2H),2.73(br,4H),2.64(t,J＝7.3Hz,2H),2.15(m,J＝6.7Hz,2H),2.04(m,J＝6.5Hz,2H)；HRMS(ESI)为C27H33N3O2S的计算值为498.1982[M+H]+，实测值为498.1979。
(2)化合物(CPP-123)的生产
将如上所述生产的化合物(CPP-122)(0.45g)、邻苯二甲酰亚胺(0.16mg)、K2CO3(0.15g)和NaI(41mg)在DMF(10ml)中的悬液在70℃搅拌17小时。将反应混合物浓缩，并向残留物添加水，然后用EtOAc萃取。将有机层在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，AcOEt/MeOH)，以给出所需产物(0.43g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝3.0Hz,1H)7.83(d,J＝3.0Hz,1H),7.60(d,J＝2.7Hz,1H),7.54(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(dd,J＝5.5,0.6Hz,1H),7.38(d,J＝5.5Hz,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),6.98(dd,J＝8.3,2.8Hz,1H),6.90(dd,J＝7.7,0.6Hz,1H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),3.77(t,J＝7.3Hz,2H),3.66(t,J＝7.1Hz,2H),3.57(t,J＝6.7Hz,2H),3.20(br,4H),2.96(t,J＝6.6Hz,2H),2.75(br,4H),2.65(t,J＝7.4Hz,2H),2.07-2.01(m,4H)；
HRMS(ESI)为C35H37N4O4S的计算值为609.2535[M+H]+，实测值为609.2538。
(3)化合物(CPP-124)的生产
将如上所述生产的化合物(CPP-123)(0.43g)、单水合肼(0.069ml)和EtOH(12ml)的混合物在回流下加热8小时。将反应混合物浓缩，并向残留物添加1M NaOH水溶液(50ml)，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥并蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，DCM/MeOH)。将纯化的产物溶解在MeOH(10ml)中。向其逐滴添加2M HCl水溶液(2.1ml)，并将混合物在室温搅拌15小时。然后蒸馏掉溶剂。向残留物添加AcOEt，然后搅拌。通过过滤收集形成的固体，以给出所需产物(0.35g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.4(br,1H),7.98(br,3H),7.78(d,J＝5.5Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(d,J＝5.5Hz,1H),7.43(d,J＝2.7Hz,1H),7.33(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(d,J＝8.4Hz,1H),7.10(dd,J＝8.3,2.7Hz,1H),6.98(d,J＝7.6Hz,1H),4.13(t,J＝5.9Hz,2H),3.66(br,2H),3.57-3.53(m,6H),3.37(br,在水信号下),3.27(t,J＝11.9Hz,2H),2.92(t,J＝6.5Hz,2H),2.82-2.76(m,2H),2.30-2.25(m,2H),1.88(m,J＝7.3Hz,2H)；
HRMS(ESI)为C27H35N4O2S的计算值为479.2481[M+H]+，实测值为479.2482。
生产例7：化合物(CPP-125)的生产
化合物(CPP-125)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000671
将在生产例6中生产的化合物(CPP-124)(20mg)、Boc-5-氨基-正戊酸(7.9mg)、COMU(17mg)、DIPEA(27μL)和DMF(1ml)的混合物在室温搅拌5小时，并将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(15mg)。
1H NMR(500MH,DMSO-d6)δ7.78(t,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.6Hz,1H),7.61(d,J＝7.9Hz,1H),7.40(d,J＝5.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.7Hz,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.05(dd,J＝8.3,2.6Hz,1H),6.90(d,J＝7.7Hz,1H),6.77(t,J＝5.4Hz,1H),4.06(t,J＝6.3Hz,2H),3.50(t,J＝7.0Hz,在水信号下),3.46(t,J＝6.6Hz,在水信号下),3.08-3.03(m,6H),2.91-2.87(m,4H),2.64(br,4H),2.54(t,J＝7.1Hz,2H),2.04(t,J＝7.3Hz,2H),1.93(m,J＝6.7Hz,2H),1.82(s,3H),1.67(m,J＝7.0Hz,2H),1.46(m,J＝7.5Hz,2H),1.36-1.31(m,11H)；HRMS(ESI)为C37H52N5O5S的计算值为678.3689[M+H]+，实测值为678.3693。
生产例8：化合物(CPF-202)的生产
化合物(CPF-202)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000691
(1)CPF-201的生产
将在生产例3中生产的化合物(CPI-104)(9.0mg)、在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(11mg)、COMU(13mg)、DIPEA(11μL)和DMF(1ml)的混合物在室温搅拌2小时。蒸馏掉溶剂，并通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(10mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.57(s,1H),8.13(dt,J＝9.1,2.4Hz,2H),7.87(d,J＝8.9Hz,2H),7.64-7.59(m,3H),7.54-7.47(m,2H),7.45-7.39(m,3H),7.30(d,J＝2.4Hz),4.88-4.83(m,2H),4.54-4.47(m,1H),3.81-3.71(m,2H),3.64-3.56(m,1H),3.29(dt,J＝6.1,6.1Hz,2H),3.11-3.03(m,1H),2.44-2.41(m,2H),2.00-1.86(m,3H),1.77-1.65(m,1H),1.50(s,9H)；LC-MS：[M+H]+＝700.29。
(2)CPF-202的生产
将如上所述生产的化合物(CPF-201)(10mg)、TFA(0.11ml)和DCM(1ml)的混合物在室温搅拌2小时，然后蒸馏掉溶剂。将所述残留物、在生产例2中生产的化合物(CPI-005)(10mg)、DIPEA(10μL)和DMF(1ml)的混合物在60℃搅拌小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(11mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.69-13.66(m,1H),9.41(s,1H),8.09(dt,J＝9.0,2.4Hz,2H),7.88-7.86(m,3H),7.61-7.59(m,2H),7.54-7.48(m,2H),7.45-7.39(m,3H),7.30(d,J＝2.4Hz,1H),6.44-6.39(m,1H),5.61-5.58(m,1H),4.85(d,J＝10.5Hz,1H),4.68(d,J＝7.4Hz,1H),4.53-4.46(m,2H),4.35-4.32(m,1H),3.81-3.48(m,20H),3.37-3.29(m,4H),3.17-3.05(m,2H),2.95-2.90(m,1H),2.72(dd,J＝12.8,4.0Hz,1H),2.57(t,J＝7.1Hz,2H),2.34(s,4H),2.14(dd,J＝7.1,7.1Hz,4H),1.99-1.91(m,1H),1.77-1.52(m,6H),1.47-1.41(m,2H),1.00(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1195.3。
生产例9：化合物(CPF-212)的生产
Figure BDA0003390983040000711
(1)CPF-211的生产
向在生产例5中生产的化合物(CPP-117)(19mg)在DCM(1ml)中的溶液逐滴添加TFA(0.17ml)。将混合物在室温搅拌2小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，给出中间体化合物(13mg)。将所述中间体化合物(13mg)和在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(16.78mg)溶解在DMF(1ml)中。向其添加COMU(18mg)和DIPEA(0.23ml)，并将混合物在室温搅拌3小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(18mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.62(s,1H),8.14(dt,J＝9.1,2.4Hz,2H),7.90-7.87(m,2H),7.53-7.50(m,2H),7.38-7.33(m,3H),7.30(dd,J＝5.6,3.1Hz,2H),7.26-7.22(m,1H),4.84-4.82(m,2H),3.77(d,J＝10.8Hz,1H),3.60(dt,J＝6.8,6.8Hz,2H),3.40(s,3H),3.29(dt,J＝6.1,6.1Hz,2H),2.79(t,J＝7.7Hz,2H),2.44-2.41(m,2H),2.07-2.00(m,2H),1.92-1.86(m,2H),1.50(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝714.08。
(2)CPF-212的生产
向如上所述生产的化合物(CPF-211)(18mg)在DCM(1ml)中的溶液逐滴添加TFA(97μL)。将混合物在室温搅拌1.5小时，然后蒸馏掉溶剂。向所述残留物和在生产例2中生产的化合物(CPI-005)(22mg)在DMF(1ml)中的溶液添加DIPEA(18μL)，并将混合物在60℃搅拌3小时。向其进一步添加DIPEA(18μL)，并将混合物在60℃继续搅拌3小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(13mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.53(t,J＝5.1Hz,1H),10.37(s,1H),9.19(t,J＝5.7Hz,1H),8.06(dt,J＝9.1,2.3Hz,2H),7.89(dt,J＝9.1,2.3Hz,2H),7.81(t,J＝5.6Hz,1H),7.70(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),7.60(d,J＝8.9Hz,1H),7.49(s,1H),7.42-7.36(m,2H),7.30(dt,J＝7.4,1.6Hz,1H),7.22(d,J＝2.5Hz,1H),6.40(s,1H),6.35(s,1H),4.57(d,J＝10.7Hz,1H),4.31-4.28(m,1H),4.13-4.10(m,1H),3.78(d,J＝10.7Hz,1H),3.63-3.58(m,3H),3.47-3.46(m,9H),3.38-3.05(m,在水信号下),2.80(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.71-2.66(m,3H),2.58-2.49(m,与DMSO信号重叠),2.28(s,4H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.97-1.84(m,4H),1.64-1.55(m,1H),1.52-1.40(m,3H),1.32-1.24(m,2H),0.94(s,6H)；LC-MS：[M+H]+＝1209.12。
生产例10：化合物(CPF-224)的生产
化合物(CPF-224)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000731
(1)化合物(CPF-222)的生产
将在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(20mg)和在上述路线中示出的化合物(CPF-221)(23mg)溶解在DMF(2ml)中。向其添加COMU(24mg)和DIPEA(0.020ml)，并将混合物搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(33mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.46(br,1H),10.30(s,1H),9.43(t,J＝6.1Hz,1H),8.06(d,J＝9.2Hz,2H),7.89(d,J＝9.1Hz,2H),7.60(s,1H),7.52(br,1H),6.88-6.83(m,3H),6.28(dd,J＝2.9,1.7Hz,1H),5.00(s,2H),4.41(d,J＝6.0Hz,2H),4.13(q,J＝7.1Hz,2H),2.98(q,J＝6.6Hz,2H),2.36(t,J＝7.3Hz,2H),1.71(m,J＝7.3Hz,2H),1.38(s,9H),1.17(t,J＝7.1Hz,3H)；
LC-MS：[M+H]+＝783.31。
(2)化合物(CPF-223)的生产
向如上所述合成的化合物(CPF-222)(33mg)在MeOH(2ml)中的溶液添加1M LiOH水溶液(0.13ml)和水(0.36ml)，并将混合物搅拌21小时。将反应混合物用0.1％AcOH水溶液中和，并将得到的溶液浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(30mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.46(s,1H),10.30(s,1H),9.43(t,J＝5.9Hz,1H),8.06(d,J＝9.1Hz,2H),7.88(d,J＝9.1Hz,2H),7.61(s,1H),7.47(br,1H),6.90-6.83(m,3H),6.28(dd,J＝2.9,1.7Hz,1H),4.92(s,2H),4.41(d,J＝5.9Hz,2H),2.98(q,J＝6.5Hz,2H),2.36(t,J＝7.4Hz,2H),1.71(m,J＝7.2Hz,2H),1.38(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝754.99。
(3)化合物(CPF-224)的生产
将如上所述合成的化合物(CPF-223)(29mg)溶解在DCM(3ml)中。向其逐滴添加TFA(0.29ml)，然后在室温搅拌2小时。然后将得到的溶液浓缩。向残留物添加DIPEA(27μL)、在生产例2中生产的化合物(CBI-455)(39mg)和DMF(2ml)，然后在60℃搅拌5小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％TFA)，以给出所需产物(17mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.53(t,J＝5.5Hz,1H),12.47(s,1H),10.38(s,1H),9.44(t,J＝6.2Hz,1H),8.07(d,J＝9.1Hz,2H),7.89(d,J＝9.1Hz,2H),7.82(t,J＝5.7Hz,1H),7.61(s,1H),7.49(br,1H),6.90(br,1H),6.84(t,J＝2.4Hz,1H),6.41(br,1H),6.35(br,1H),6.28(dd,J＝2.8,1.7Hz,1H),4.95(s,2H),4.41(d,J＝5.9Hz,2H),4.30(dd,J＝7.8,4.4Hz,1H),4.12(dd,J＝7.6,4.4Hz,1H),3.61(t,J＝6.3Hz,4H),3.49-3.46(m,在水信号下),3.30-3.25(m,4H),3.17(q,J＝5.7Hz,2H),3.10-3.06(m,1H),2.81(dd,J＝12.5,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.47(t,与DMSO信号重叠),2.28(s,4H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.93(m,J＝6.9Hz,2H),1.60-1.55(m,1H),1.53-1.40(m,3H),1.33-1.23(m,2H)),0.94(s,6H)；
HRMS(ESI)为C57H71N13O14F3S的计算值为1250.4916[M+H]+，实测值为1250.4919。
生产例11：化合物(CPF-232)的生产
化合物(CPF-232)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000751
(1)化合物(CPF-231)的生产
将在生产例6中生产的化合物(CPP-124)(40mg)和在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(26mg)用DMF(2ml)稀释。向其添加HATU(26mg)和DIPEA(0.036ml)，然后搅拌5小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％TFA)，以给出所需产物(50mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.96(br,1H),10.30(s,1H),9.16(t,J＝5.8Hz,1H),8.06(d,J＝9.1Hz,2H),7.89(d,J＝9.1Hz,2H),7.74(d,J＝5.1Hz,1H),7.67(d,J＝7.7Hz,1H),7.46(d,J＝4.1Hz,1H),7.43(d,J＝2.3Hz,1H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.07(dd,J＝8.3,2.7Hz,1H),6.95(d,J＝7.4Hz,1H),6.86(t,J＝5.4Hz,1H),4.10(t,J＝5.4Hz,2H),3.62-3.51(m,6H),3.38-3.35(m,在水信号下),3.10(br,2H),2.98(q,J＝6.5Hz,2H),2.92(t,J＝6.5Hz,2H),2.36(t,J＝7.4Hz,2H),2.08(br,2H),1.91(s,3H),1.86(m,J＝7.0Hz,2H),1.72(m,J＝7.2Hz,2H)；LC-MS：[M+H]+＝609.52。
(2)化合物(CPF-232)的生产
将如上所述生产的化合物(CPF-231)(19mg)溶解在DCM(2ml)中。向其逐滴添加TFA(0.16ml)，然后在室温搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩。向残留物添加在生产例2中生产的化合物(CPI-005)(15mg)、DIPEA(17μL)和DMF(2ml)，然后在60℃搅拌2小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％TFA)，以给出所需产物(8.7mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.53(t,J＝5.3Hz,1H),10.38(s,1H),9.51(br,1H),9.17(t,J＝5.9Hz,1H),8.06(d,J＝9.1Hz,2H),7.89(d,J＝9.1Hz,2H),7.81(t,J＝5.5Hz,1H),7.78(d,J＝5.5Hz,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,1H),7.51(d,J＝5.6Hz,1H),7.45(d,J＝2.7Hz,1H),7.33(t,J＝7.9Hz,1H),7.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.08(dd,J＝8.3,2.7Hz,1H),6.99(d,J＝7.7Hz,1H),6.41(br,1H),6.36(br,1H),4.29(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H),4.14-4.10(m,3H),3.70(br,2H),3.62-3.55(m,在水信号下),3.41-3.34(m,在水信号下),3.27(t,J＝6.2Hz,2H),3.16(q,J＝5.8Hz,2H),3.10-3.06(m,3H),2.92(t,J＝6.6Hz,2H),2.80(dd,J＝12.3,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.28(s,4H),2.22-2.17(m,2H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.93(m,J＝7.1Hz,2H),1.86(m,J＝6.8Hz,2H),1.63-1.56(m,1H),1.51-1.40(m,3H),1.33-1.22(m,2H),0.94(s,6H)；HRMS(ESI)为C68H92N13O12S2的计算值为1346.6429[M+H]+，实测值为1346.6445。
生产例12：化合物(CPP-127)的生产
化合物(CPP-127)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000771
(1)化合物(CPP-126)的生产
将在生产例7中生产的化合物(CPP-125)(15mg)溶解在DCM(3ml)中。向其逐滴添加TFA(0.15μL)，然后在室温搅拌2小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物用在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(9.1mg)和DMF(2ml)稀释。向其添加COMU(9.35mg)和DIPEA(15μL)，然后在室温搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(16mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.94(br,1H),10.29(s,1H),9.14(t,J＝5.9Hz,1H),8.04(d,J＝9.1Hz,2H),7.87(d,J＝9.1Hz,2H),7.81(t,J＝5.5Hz,1H),7.69(br,1H),7.61(br,1H),7.41-7.38(m,2H),7.28(t,J＝7.6Hz,1H),7.19(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(dd,J＝8.5,2.7Hz,1H),6.90(br,1H),6.86(t,J＝5.4Hz,1H),4.05(br,2H),3.50(t,J＝6.5Hz,2H),3.46(t,J＝7.1Hz,2H),3.09-3.04(m,6H),2.98(q,J＝6.5Hz,2H),2.87(t,J＝6.7Hz,2H),2.64(br,4H),2.36(t,J＝7.4Hz,2H),2.10(br,2H),1.94(br,2H),1.91(s,3H),1.71(m,J＝7.2Hz,2H),1.67(m,J＝7.0Hz,2H),1.55(br,4H),1.37(s,9H)；
HRMS(ESI)为C49H64N11O7S的计算值为950.4711[M+H]+，实测值为950.4713。
(2)化合物(CPP-127)的生产
将如上所述生产的化合物(CPP-126)(14mg)溶解在DCM(5ml)中。向其逐滴添加TFA(0.23ml)，然后在室温搅拌12小时。然后将反应混合物浓缩。向残留物添加在生产例2中生产的化合物(CPI-005)(9.2mg)、DIPEA(12μL)和DMF(2ml)，然后在60℃搅拌2小时。然后将反应混合物浓缩。将残留物通过硅胶层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％TFA)，以给出所需产物(13mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.53(t,J＝5.4Hz,1H),10.38(s,1H),9.63(br,1H),9.15(t,J＝5.9Hz,1H),8.05(d,J＝9.1Hz,2H),7.88(d,J＝9.1Hz,2H),7.84-7.81(m,2H),7.78(d,J＝5.6Hz,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,1H),7.51(t,J＝5.5Hz,1H),7.43(d,J＝2.8Hz,1H),7.33(t,J＝7.9Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.06(dd,J＝8.4,2.8Hz,1H),6.99(d,J＝7.3Hz,1H),6.41(br,1H),6.36(br,1H),4.29(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H),4.13-4.10(m,在水信号下),3.70(br,2H),3.62-3.58(m,6H),3.52-3.49(m,4H),3.47-3.46(m,12H),3.41(br,4H),3.37(t,J＝5.9Hz,2H),3.32(br,2H),3.27(t,J＝6.1Hz,2H),3.17(q,J＝5.8Hz,2H),3.11-3.04(m,5H),2.88(t,J＝6.4Hz,2H),2.81(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.3Hz,1H),2.48(d,与DMSO信号重叠),2.28(s,4H),2.22-2.17(m,2H),2.11(br,2H),2.05(t,J＝7.3Hz,2H),1.93(m,J＝7.0Hz,2H),1.68(m,J＝6.9Hz,2H),1.62-1.41(m,8H),1.33-1.23(m,2H),0.94(s,6H)；HRMS(ESI)为C73H101N14O13S2的计算值为1445.7114[M+H]+，实测值为1445.7126。
生产例13：化合物(CPP-133)的生产
化合物(CPP-133)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000791
(1)CPP-132的生产
将化合物(CPP-131)(15mg)和在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(16mg)溶解在DMF溶液(1ml)中，并向其添加COMU(19mg)和DIPEA(15μL)。将混合物在室温搅拌20小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(22mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.30(s,1H),9.11(s,1H),8.10(dt,J＝9.1,2.4Hz,2H),7.85(d,J＝9.1Hz,2H),7.31-7.25(m,2H),7.05(d,J＝2.4Hz,1H),7.01(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),6.86(dd,J＝7.7,0.7Hz,1H),6.82(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),6.65(d,J＝8.3Hz,1H),5.21(s,1H),4.87-4.78(brm,1H),3.70(dt,J＝5.6,5.6Hz,2H),3.66-3.50(brs,4H),3.28(dt,J＝6.0,6.0Hz,2H),2.67-2.64(m,6H),2.43-2.40(m,2H),1.93-1.84(m,4H),1.48(s,9H)；LC-MS：[M+H]+＝742.29。
(2)CPP-133的生产
将如上所述生产的化合物(CPP-132)(22mg)用DCM(1ml)稀释。向其逐滴添加TFA(0.11ml)，并将混合物在室温搅拌20小时。然后蒸馏掉溶剂。向残留物添加在生产例2中生产的化合物(CPI-005)(18mg)、DIPEA(21μL)和DMF(1.5ml)，并将混合物在60℃搅拌3小时。向其进一步添加DIPEA(26μL)，并将混合物在60℃继续搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(16mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.73-13.66(brm,1H),9.28-9.16(brm,2H),8.06(dt,J＝9.1,2.4Hz,2H),7.86(d,J＝9.1Hz,2H),7.31-7.26(m,2H),7.04(d,J＝2.4Hz,1H),7.00(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),6.87(d,J＝7.9Hz,1H),6.81(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),6.68(d,J＝8.3Hz,1H),6.49-6.39(brs,1H),5.58(s,1H),5.39(s,1H),4.65(s,1H),4.52-4.49(m,1H),4.34-4.31(m,1H),3.77(t,J＝11.4Hz,2H),3.72-3.48(m,23H),3.38-3.28(m,4H),3.16-3.12(m,1H),2.92(dd,J＝12.9,5.0Hz,1H),2.72-2.54(m,8H),2.35(s,4H),2.19-2.09(m,4H),1.90-1.82(m,2H),1.73-1.41(m,6H),1.01(s,6H)；LC-MS：[M+H]+＝1237.14。
生产例14：化合物(CPA-302)的生产
化合物(CPA-302)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000811
(1)CPA-301的生产
向3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(22mg)和烯丙醇(78μL)的混合物添加亚硫酰氯(0.17ml)，然后在室温搅拌1小时。在向其添加水后，将混合物在减压下浓缩。将残留物和在生产例1中生产的化合物(CPI-003)(30mg)溶解在DMF(2ml)中，并向其添加DIPEA(40μL)和COMU(36mg)。将混合物在室温搅拌3小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(37mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.60(s,1H),8.14(dt,J＝9.0,2.5Hz,2H),7.88(d,J＝9.0Hz,2H),7.71(t,J＝5.4Hz,1H),5.95-5.86(m,1H),5.31(ddt,J＝17.2,1.4,1.4Hz,1H),5.22(ddt,J＝10.4,1.4,1.4Hz,1H),4.86-4.82(m,1H),4.59(dt,J＝5.6,1.4Hz,2H),3.78-3.60(m,18H),3.32-3.27(m,2H),2.63(t,J＝6.5Hz,2H),2.44-2.41(m,2H),1.92-1.86(m,2H),1.50(s,9H)；LC-MS：[M+H]+＝678.27。
(2)CPA-302的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-301)(36mg)、吗啉(9.3μL)、Pd(PPh3)4(3.1mg)和THF(1ml)的混合物在室温搅拌6小时。向其进一步添加吗啉(4.6μL)和Pd(PPh3)4(3.1mg)，然后在室温搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(27mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.54(s,1H),9.09(t,J＝5.7Hz,1H),8.05(dt,J＝9.2,2.4Hz,2H),7.91(dt,J＝9.2,2.3Hz,2H),6.91(t,J＝5.2Hz,1H),3.60-3.42(m,18H),2.98(dt,J＝6.4,6.4Hz,2H),2.66(t,J＝6.4Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,2H),2.29(t,J＝6.4Hz,2H),1.71(tt,J＝6.4,6.4Hz,2H),1.37(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝638.23。
生产例15：化合物(CPA-306)的生产
化合物(CPA-306)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000831
(1)CPA-303的生产
将3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(11mg)、亚硫酰氯(8.8μL)和烯丙醇(35μL)的混合物在室温搅拌1小时。在向其添加水后，将混合物在减压下浓缩。将残留物和在生产例14中生产的化合物(CPA-302)(22mg)溶解在DMF(1ml)中，并向其添加COMU(16mg)和DIPEA(18μL)。将混合物在室温搅拌5小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需化合物(17mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.63(s,1H),8.13(dt,J＝9.0,2.3Hz,2H),7.89(d,J＝9.0Hz,2H),7.78(t,J＝5.3Hz,1H),6.72(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.31(ddt,J＝17.2,1.4,1.4Hz,1H),5.23(ddt,J＝10.4,1.4,1.4Hz,1H),4.89(s,1H),4.59(dt,J＝5.7,1.4Hz,2H),3.78-3.60(m,32H),3.54(t,J＝5.3Hz,2H),3.43(dt,J＝5.3,5.3Hz,2H),3.28(dt,J＝5.9Hz,2H),2.62(t,J＝6.5Hz,2H),2.48-2.42(m,4H),1.93-1.87(m,2H),1.49(s,9H)；LC-MS：[M+H]+＝925.27。
(2)CPA-304的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-303)(17mg)溶解在DCM(1ml)中。向其逐滴添加TFA(0.14ml)，并将化合物在室温搅拌2小时。然后蒸馏掉溶剂。向残留物和生产例2中生产的化合物(CPI-005)(17mg)在DMF中的溶液(1ml)添加DIPEA(13μL)，并将混合物在60℃搅拌4小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(22mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.68(t,J＝5.0Hz,1H),9.50(s,1H),8.10(d,J＝9.0Hz,2H),7.89-7.87(m,3H),6.79-6.76(m,1H),6.66-6.63(m,1H),5.96-5.86(m,2H),5.31(ddt,J＝17.2,1.4,1.4Hz,1H),5.23(ddt,J＝10.4,1.4,1.4Hz,1H),5.11-5.06(m,1H),4.59(dt,J＝5.6,1.4Hz,2H),4.54-4.51(m,1H),4.34-4.31(m,1H),3.78-3.50(m,50H),3.43(dt,J＝5.4,5.4Hz,2H),3.38(dt,J＝5.3,5.3Hz,2H),3.33(dt,J＝5.5,5.5Hz,2H),3.17-3.12(m,1H),2.92(dd,J＝12.8,4.9Hz,1H),2.74(d,J＝12.8Hz,1H),2.63(t,J＝6.5Hz,2H),2.58(t,J＝7.1Hz,2H),2.47(t,J＝6.1Hz,2H),2.34(s,4H),2.18(t,J＝7.2Hz,2H),2.12(t,J＝6.9Hz,2H),1.82-1.60(m,6H),1.47-1.40(m,2H),1.01(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1420.69。
(3)CPA-305的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-304)(10mg)、1,3-二甲基巴比妥酸(2.2mg)、Pd(PPh3)4(0.81mg)和AcOEt/DCM(1:1，0.5ml)的混合物在室温搅拌1小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(9.5mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.53(t,J＝10.4Hz,1H),10.57(s,1H),9.10(t,J＝5.2Hz,1H),8.06(d,J＝9.1Hz,2H),7.95(s,1H),7.91(d,J＝9.1Hz,2H),7.84(t,J＝5.4Hz,1H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.29(dd,J＝5.6,5.2Hz,1H),4.13-4.10(m,1H),3.63-3.25(m,在水信号下),3.17(tt,J＝5.8,5.8Hz,4H),3.10-3.06(m,1H),2.81(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.58-2.49(m,与DMSO信号重叠),2.35-2.28(m,8H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.93(tt,J＝7.0Hz,2H),1.64-1.40(m,4H),1.34-1.23(m,2H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1380.38。
(4)CPA-306的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-305)(8.5mg)、NHS(1.4mg)、WSC·HCl(2.4mg)和DMF(0.5ml)的混合物在室温搅拌4小时。向其进一步添加NHS(1.4mg)和WSC·HCl(2.4mg)，并将混合物搅拌2小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(7.7mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.55-13.52(m,1H),10.38(s,1H),9.12-9.07(m,1H),8.08-7.80(m,6H),6.41(s,1H),6.35(s,1H),4.31-4.28(m,1H),4.13-4.10(m,1H),3.71(t,J＝6.0Hz,1H),3.63-3.25(m,在水信号下),3.17(tt,J＝6.0,6.0Hz,4H),3.10-3.06(m,1H),2.92(t,J＝6.0Hz,2H),2.83-2.79(m,4H),2.58-2.44(m,与DMSO信号重叠),2.34-2.28(m,8H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.97-1.90(m,2H),1.64-1.40(m,4H),1.32-1.23(m,2H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1478.07。
生产例16：化合物(CPA-310)的生产
化合物(CPA-310)按照下述路线中示出的方法来生产。
Figure BDA0003390983040000861
(1)CPA-307的生产
将二乙二醇双(3-氨基丙基)醚(2.1ml)溶解在DCM(200ml)中，并在冰冷却下向其逐滴添加氯甲酸烯丙酯(1.0ml)，然后搅拌4小时。将所述混合物升温至室温并搅拌14小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.50g)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26-7.37(brs,2H),7.19(t,J＝5.4,1H),5.95-5.85(m,1H),5.26(ddt,J＝13.8,1.6,1.6Hz,1H),5.17(ddt,J＝6.2,1.6,1.6Hz,1H),4.45(d,J＝5.3Hz,2H),3.54-3.36(m,12H),3.03(dt,J＝6.6,6.6Hz,2H),2.83(t,J＝7.0Hz,2H),1.78(tt,J＝6.6,6.6Hz,2H),1.62(tt,J＝7.0,7.0Hz,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝305.16。
(2)CPA-308的生产
在室温下向如上所述生产的化合物(CPA-307)(0.50g)在DMF中的溶液(20ml)添加Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.77g)、WSC·HCl(0.38g)和HOBt·H2O(0.30g)，并将混合物搅拌15小时。然后蒸馏掉溶剂。向其添加饱和NaHCO3水溶液，然后用AcOEt萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥。蒸馏掉溶剂，并通过柱层析进行纯化(硅胶，AcOEt/MeOH)，以给出所需产物(0.80g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝7.6Hz,2H),7.60(d,J＝7.4Hz,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.31(td,J＝7.4,1.0Hz,2H),6.83-6.73(brs,1H),5.92-5.84(m,1H),5.72-5.62(brs,1H),5.44-5.34(brs,1H),5.26(d,J＝17.4Hz,1H),5.17(d,J＝10.6hz,2H),4.75-4.63(brs,1H),4.52(d,J＝5.3Hz,2H),4.42(d,J＝7.0Hz,2H),4.21(t,J＝6.9Hz,1H),4.14-4.10(m,1H),3.59-3.43(m,13H),3.35-3.25(m,3H),3.11-3.08(brm,2H),1.85-1.73(m,4H),1.66-1.60(m,1H),1.50-1.35(m,13H)；
LC-MS：[M+H]+＝755.21。
(3)CPA-309的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-308)(0.80g)和1,3-二甲基巴比妥酸(0.33g)在DCM(10ml)中的溶液添加Pd(PPh3)4(0.12g)，并将混合物在室温搅拌2小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，AcOEt/MeOH)以给出中间体(0.41g)。向所述中间体(0.41g)添加生物素-NHS(0.31g)、DIPEA(0.16ml)和DMF(10ml)，并将混合物在室温搅拌2小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.15g)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.85(t,J＝5.5Hz,1H),7.74-7.72(m,3H),7.44-7.40(m,3H),7.33(td,J＝7.4,0.9Hz,2H),6.76(t,J＝5.3Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.31-4.19(m,4H),4.13-4.10(m,1H),3.91-3.86(m,1H),3.50-3.44(m,8H),3.39-3.33(m,4H),3.14-3.03(m,5H),2.91-2.85(m,2H),2.81(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.64-1.43(m,10H),1.36-1.21(m,15H)；LC-MS：[M+H]+＝897.11。
(4)CPA-310的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-309)(0.15g)、哌啶(24μL)和DMF(3ml)的混合物在室温搅拌2小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.11mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(t,J＝5.7Hz,1H),7.75(t,J＝5.5Hz,1H),6.75(t,J＝5.5Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.53-3.45(m,8H),3.41-3.33(m,4H),3.13-3.03(m,6H),2.90-2.80(m,3H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.66-1.57(m,5H),1.54-1.43(m,4H),1.37-1.20(m,16H)；LC-MS：[M+H]+＝675.21。
生产例17：化合物(CPA-311)的生产
Figure BDA0003390983040000881
向6-氨基己酸(0.20g)和烯丙醇(1.0ml)逐滴添加亚硫酰氯(0.33ml)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。向残留物添加琥珀酸酐(0.18g)、DIPEA(0.80ml)和DMF(5ml)，并将混合物在室温搅拌20小时。向其进一步添加琥珀酸酐(0.15g)和DIPEA(0.4ml)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.40g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.02(s,1H),5.97-5.87(m,1H),5.32(ddt,J＝14.1,1.4,1.4Hz,1H),5.24(ddt,J＝10.4,1.4,1.4Hz,1H),4.58(dt,J＝5.8,1.4Hz,2H),3.27(dt,J＝6.6,6.6Hz,2H),2.71-2.68(m,2H),2.52-2.49(m,2H),2.36(t,J＝7.3Hz,2H),1.65(tt,J＝7.5,7.5Hz,2H),1.53(tt,J＝7.3,7.3Hz,2H),1.40-1.32(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝272.21。
生产例18：化合物(CPA-314)的生产
Figure BDA0003390983040000891
(1)CPA-312的生产
将在生产例16中生产的化合物(CPA-310)(0.11g)和在生产例17中生产的化合物(CPA-311)(43mg)溶解在DMF(4ml)中。向其添加WSC·HCl(37mg)和HOBt·H2O(29mg)，并将混合物在室温搅拌14小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.13g)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(d,J＝8.0Hz,1H),7.86-7.82(m,2H),7.74(t,J＝5.5Hz,1H),6.74(t,J＝5.4Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.28(ddt,J＝17.3,1.5,1.5Hz,1H),5.20(ddt,J＝10.5,1.5,1.5Hz,1H),4.54(dt,J＝5.4,1.4Hz,2H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.06(m,2H),3.52-3.45(m,8H),3.40-3.33(m,4H),3.12-2.98(m,7H),2.89-2.80(m,3H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.37-2.25(m,6H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.65-1.19(m,31H)；LC-MS：[M+H]+＝928.30。
(2)CPA-313的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-312)(0.13g)在DCM(3ml)中的溶液逐滴添加TFA(1.1ml)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物用DMF(2ml)稀释。然后向其添加DIPEA(0.12ml)和己二酸酐(36mg)，并将混合物在室温搅拌2小时。停止搅拌，并允许混合物放置4天。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(75mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02-7.95(m,1H),7.89-7.84(m,2H),7.78-7.75(m,2H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.28(ddt,J＝17.2,1.5,1.5Hz,1H),5.20(ddt,J＝10.5,1.5 1.5Hz,1H),4.53(dt,J＝5.5,1.5,2H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.06(m,2H),3.52-3.33(m,12H),3.12-2.96(m,9H),2.82(dd,J＝12.5,5.2Hz,1H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.38-2.27(m,6H),2.21-2.16(m,2H),2.06-2.02(m,4H),1.65-1.21(m,26H)；LC-MS：[M+H]+＝956.19。
(3)CPA-314的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-313)(75mg)溶解在DMF(2ml)中。向其添加双甲酮(12mg)、WSC·HCl(16mg)和DMAP(9.6mg)，并将混合物在室温搅拌14小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(31mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.89-7.82(m,2H),7.74(t,J＝10.6Hz,2H),6.61(d,J＝6.0Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.28(ddt,J＝17.2,1.6,1.6Hz,1H),5.20(ddt,J＝10.5,1.5,1.5Hz,1H),4.53(dt,J＝5.4,1.4Hz,2H),4.32-4.28(m,1H),4.14-4.06(m,2H),3.52-3.43(m,8H),3.40-3.33(m,4H),3.12-2.96(m,11H),2.86-2.79(m,3H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.36-2.30(m,8H),2.06-1.96(m,4H),1.65-1.21(m,26H),0.97(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1079.50。
生产例19：化合物(CPA-318)的生产
Figure BDA0003390983040000911
(1)CPA-317的生产
将上述路线中示出的化合物(CPA-315)(0.11g)和上述路线中示出的化合物(CPA-316)(0.087g)溶解在DMF(5ml)中。在室温下向其添加HATU(0.209g)和DIPEA(0.160ml)，并将混合物搅拌20小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(0.11mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22-8.19(m,2H),7.74-7.64(brs,1H),7.61-7.52(m,3H),5.15-5.02(brs,1H),3.80-3.71(m,4H),3.69-3.64(m,4H),3.58(t,J＝5.2Hz,2H),3.36-3.33(m,2H),1.43(s,9H)；LC-MS：[M+H]+＝421.08。
(2)CPA-318的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-317)(0.11mg)溶解在DCM(2ml)中。向其逐滴添加TFA(0.97ml)，并将混合物在室温搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(89mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(t,J＝5.4Hz,1H),8.15-8.12(m,2H),7.74-7.64(m,6H),3.61-3.58(m,8H),3.54-3.49(m,2H),2.97(t,J＝5.2Hz,2H)；LC-MS：[M+H]+＝321.06。
生产例20：化合物(CPA-321)的生产
Figure BDA0003390983040000921
(1)CPA-319的生产
将在生产例19中生产的化合物(CPA-318)(12mg)和在生产例18中生产的化合物(CPA-314)(30mg)溶解在DMF(1ml)中。向其添加DIPEA(19μL)，并将混合物在60℃搅拌2小时。通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(30mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(t,J＝4.5,1H),9.08(t,J＝5.9Hz,1H),8.13-8.10(m,2H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.86-7.82(m,2H),7.75-7.63(m,5H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.95-5.85(m,1H),5.28(ddt,J＝17.2,1.5,1.5Hz,1H),5.20(ddt,J＝10.4,1.5,1.5Hz,1H),4.53(dt,J＝5.5,1.5Hz,2H),4.32-4.28(m,1H),4.13-4.05(m,2H),3.63-3.60(m,8H),3.50-3.43(m,10H),3.39-3.33(m,4H),3.11-2.90(m,11H),2.81(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz.,1H),2.36-2.27(m,8H),2.23(s,4H),2.11-2.02(m,4H),1.65-1.21(m,26H),0.91(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1380.98。
(2)CPA-320的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-319)(29mg)、1,3-二甲基巴比妥酸(6.6mg)、Pd(PPh3)4(2.4mg)和DCM(1ml)的混合物在室温搅拌1小时，然后蒸馏掉溶剂。将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(26mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(t,J＝4.3Hz,1H),9.09(t,J＝5.5,1H),8.13-8.10(m,3H),7.99-7.89(brs,1H),7.85(t,J＝5.5Hz,1H),7.78-7.75(m,2H),7.72-7.63(m,3H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),4.32-4.28(m,1H),4.14-4.05(m,2H),3.63-3.60(m,8H),3.50-3.45(m,10H),3.39-3.33(m,4H),3.11-2.90(m,11H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.36-2.27(m,6H),2.23(s,4H),2.16-2.02(m,6H),1.65-1.21(m,26H),0.91(s,6H)；LC-MS：[M+H]+＝1339.89。
(3)CPA-321的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-320)(25mg)、NHS(4.3mg)、WSC·HCl(7.2mg)和DMF(0.4ml)的混合物在室温搅拌3小时。向其进一步添加NHS(4.3mg)和WSC·HCl(7.2mg)，并将混合物在室温继续搅拌3小时。通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(21mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(t,J＝4.4Hz,1H),9.08(t,J＝5.6Hz,1H),8.13-8.10(m,2H),7.96(d,J＝7.9Hz,1H),7.87-7.83(m,2H),7.75-7.63(m,5H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.32-4.28(m,1H),4.14-4.05(m,2H),3.63-3.60(m,8H),3.50-3.43(m,10H),3.39-3.33(m,4H),3.11-2.90(m,11H),2.84-2.79(m,5H),2.65(t,J＝7.4Hz,2H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.38-2.28(m,6H),2.23(s,4H),2.09-2.02(m,4H),1.65-1.21(m,26H),0.91(s,6H)；LC-MS：[M+H]+＝1437.12。
生产例21：CPF-242的合成
Figure BDA0003390983040000941
(1)CPF-241的合成
向CPI-104(14mg)和DMF(1ml)的混合物添加CPI-006(6.6mg)、WSC·HCl(6.8mg)和HOBt·H2O(5.4mg)，并将混合物在室温搅拌3小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)。向所述纯化的产物(8.9mg)和DMF(1ml)的混合物添加N-Boc-1,5-二氨基戊烷(12μL)、WSC·HCl(11mg)和HOBt·H2O(9.0mg)，并将混合物在室温搅拌16小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(7.4mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.77(t,J＝5.4Hz,1H),7.72-7.65(m,3H),7.57-7.50(m,3H),7.47-7.43(m,2H),7.20(d,J＝2.3Hz,1H),6.75(t,J＝5.5Hz,1H),4.55(d,J＝10.5Hz,1H),4.25-4.18(m,1H),3.77(d,J＝10.5Hz,1H),3.70-3.63(m,1H),2.98(dt,J＝6.5,6.5Hz,2H),2.90-2.80(m,4H),1.86-1.77(m,4H),1.58-1.31(m,19H),1.24-1.18(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝680.53。
(2)CPF-242的合成
向如上所述生产的化合物(CPF-241)(6.6mg)和DCM(1ml)的混合物添加TFA(149μL)，并将混合物在室温搅拌2小时。蒸馏掉溶剂。向残留物添加DMF(1ml)、CPI-005(6.0mg)和DIPEA(17μL)，并将混合物在60℃搅拌3小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(7.9mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.46(t,J＝4.9Hz,1H),7.84-7.79(m,2H),7.72-7.65(m,3H),7.57-7.50(m,3H),7.47-7.43(m,2H),7.20(d,J＝2.4Hz,1H),6.41(s,1H),6.35(s,1H),4.55(d,J＝10.5Hz,1H),4.31-4.28(m,1H),4.25-4.18(m,1H),4.14-4.10(m,1H),3.76(d,J＝10.5Hz,1H),3.70-3.58(m,3H),3.52-3.48(m,14H),3.42-2.99(m,与水信号重叠),2.85-2.79(m,3H),2.59-2.49(m,与DMSO信号重叠),2.28(s,4H),2.06(t,J＝7.4Hz,2H),1.87-1.77(m,4H),1.65-1.23(m,18H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1175.70。
生产例22：CPA-325的生产
Figure BDA0003390983040000951
(1)CPA-322的生产
将上述路线中示出的化合物(CPA-316)(40mg)、N-Boc-1,3-二氨基丙烷(61μL)和COMU(99mg)溶解在DMF(1ml)中。向其添加DIPEA(121μL)，并将混合物在室温搅拌26小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(53mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.15(br,1H),8.13(d,J＝7.9Hz,2H),7.72-7.64(m,3H),6.84(br,1H),3.30(br,与水信号重叠),2.99(br,2H),1.67(quin,J＝6.5Hz,2H),1.38(s,9H)；
LC-MS：[M+Na]+＝369.41。
(2)CPA-323的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-322)(51mg)溶解在DCM(1ml)中。在冰冷却下向其添加TFA(113μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂。向残留物添加15-(Boc-氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷酸(56mg)、COMU(76mg)、DIPEA(85μL)和DMF(1ml)，并将混合物在室温搅拌12小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(76mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.15(t,J＝5.7Hz,1H),8.13(d,J＝7.7Hz,2H),7.89(t,J＝5.4Hz,1H),7.72-7.69(m,2H),7.66(t,J＝7.2Hz,1H),6.74(t,J＝5.2Hz,1H),3.60(t,J＝6.4Hz,2H),3.49-3.46(m,12H),3.37-3.36(m,与水信号重叠),3.12(q,J＝6.4Hz,2H),3.05(q,J＝5.9Hz,2H),2.32(t,J＝6.4Hz,2H),1.68(quin,J＝7.0Hz,2H),1.36(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝594.60。
(3)CPA-324的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-323)(67mg)溶解在DCM(1ml)中。向其添加TFA(130μL)，并将混合物在室温搅拌2小时。蒸馏掉溶剂，以给出所需产物(68mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(t,J＝5.8Hz,1H),8.15-8.11(m,2H),7.92(t,J＝5.6Hz,1H),7.75-7.64(m,6H),3.62-3.48(m,16H),3.34(dt,J＝6.7,6.7Hz,2H),3.12(dt,J＝6.7,6.7Hz,2H),3.01-2.94(m,2H),2.33(t,J＝6.4Hz,2H),1.69(tt,J＝6.7,6.7Hz,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝494.38。
(4)CPA-325的生产
所需产物以与生产例20中相同的方式生产，区别在于使用如上所述生产的化合物(CPA-324)代替CPA-318。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),9.15(t,J＝5.9Hz,1H),8.14-8.11(m,2H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.91-7.83(m,3H),7.76-7.63(m,5H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.05(m,2H),3.61-3.34(m,32H),3.17-2.91(m,13H),2.84-2.79(m,5H),2.65(t,J＝7.4Hz,2H),2.57(d,J＝12.4Hz,2H),2.37-2.26(m,10H),2.09-2.02(m,4H),1.71-1.19(m,28H),0.93(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1611.63。
生产例23：CPA-326的生产
Figure BDA0003390983040000971
所需产物以与生产例21中相同的方式生产，区别在于使用N-Boc-3,3’-((氧基双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(丙-1-胺)代替N-Boc-1,3-二氨基丙烷。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),9.14(t,J＝5.8Hz,1H),8.14-8.11(m,2H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.85(dd,J＝9.9,5.4Hz,2H),7.79(t,J＝5.6Hz,1H),7.87-7.63(m,5H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.05(m,2H),3.61-3.34(m,40H),3.11-2.92(m,15H),2.84-2.79(m,5H),2.65(t,J＝7.4Hz,2H),2.57(d,J＝12.4,1H),2.37-2.26(m,12H),2.09-2.02(m,4H),1.83-1.77(m,2H),1.65-1.19(m,28H),0.93(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1757.83。
生产例24：CPA-332的生产
Figure BDA0003390983040000981
(1)CPA-328的生产
将上述路线中示出的化合物(CPA-327)(60mg)和Nα,Nε-二-Boc-L-赖氨酸(87mg)溶解在DMF(2ml)中。向其添加COMU(108mg)和DIPEA(109μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(129mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.13(d,J＝7.4Hz,1H),6.77-6.39(m,3H),5.88(ddt,J＝17.3,10.5,5.3Hz,1H),5.30(dd,J＝17.3,1.6Hz,1H),5.20(dd,J＝10.5,1.5Hz,1H),4.59-4.52(m,2H),4.22(br,1H),3.91(br,1H),2.92-2.82(m,4H),1.72-1.66(m,1H),1.64-1.52(m,2H),1.49-1.42(m,1H),1.37-1.24(m,35H)；
LC-MS：[M+H]+＝615.68。
(2)CPA-329的生产
将如上所述合成的化合物(CPA-328)(126mg)溶解在DCM(2ml)中。向其添加TFA(474μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂。向残留物添加上述路线中示出的化合物(CPA-316)(128mg)、DMF(2ml)、COMU(288mg)和DIPEA(235μL)，将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(132mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.18(t,J＝6.0Hz,1H),9.15(t,J＝6.0Hz,1H),8.92(d,J＝8.0Hz,1H),8.52(d,J＝7.3Hz,1H),8.12-8.09(m,6H),7.70-7.62(m,9H),5.87(ddt,J＝17.3,10.5,5.3Hz,1H),5.29(dq,J＝17.2,1.6Hz,1H),5.17(dq,J＝10.5,1.5Hz,1H),4.60(q,J＝7.3Hz,1H),4.56(dq,J＝5.4,1.6Hz,2H),4.32-4.27(m,1H),3.32-3.30(m,与水信号重叠),1.86-1.77(m,3H),1.73-1.66(m,1H),1.64-1.55(m,4H),1.49-1.36(m,4H)；
LC-MS：[M+H]+＝831.77。
(3)CPA-330的生产
将如上所述生产的化合物(CPA-329)(42mg)溶解在DCM(3ml)中。向其添加Pd(PPh3)4(5.8mg)和N-甲基苯胺(27μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(31mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.60(br,1H),9.18(t,J＝5.8Hz,1H),9.15(t,J＝5.8Hz,1H),8.92(d,J＝8.0Hz,1H),8.36(d,J＝7.7Hz,1H),8.12-8.07(m,5H),7.80-7.77(m,1H),7.71-7.62(m,9H),4.60(q,J＝7.5Hz,1H),4.24-4.19(m,1H),3.34-3.29(m,与水信号重叠),1.87-1.76(m,3H),1.70-1.54(m,5H),1.49-1.35(m,4H)；
LC-MS：[M+H]+＝791.46。
(4)CPA-331的生产
所需产物以与生产例22中相似的方式来生产。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.18-9.14(m,2H),8.99(d,J＝8.0Hz,1H),8.17-8.07(m,7H),7.97(t,J＝5.4Hz,1H),7.71-7.62(m,12H),4.56(dt,J＝7.2,7.2Hz,2H),4.26(dt,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.59-3.53(m,6H),3.42-3.16(m,8H),3.00-2.96(m,2H),1.86-1.80(m,2H),1.70-1.28(m,10H)；
LC-MS：[M+H]+＝921.30。
(5)CPA-332的生产
所需产物以与生产例21中相同的方式生产，区别在于使用CPA-331代替CPA-318。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,1H),9.17-9.12(m,2H),8.98(d,J＝8.4Hz.1H),8.17(d,J＝8.1Hz,1H),8.12-8.06(m,6H),8.06-7.96(m,2H),7.87-7.83(m,2H),7.76-7.74(m,2H),7.70-7.53(m,9H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.57(dt,J＝7.5,7.5Hz,1H),4.32-4.24(m,2H),4.14-4.05(m,2H),3.60-2.90(m,37H),2.84-2.79(m,5H),2.66-2.50(m,3H),2.36-2.25(m,10H),2.09-2.02(m,4H),1.86-1.80(m,2H),1.68-1.20(m,36H),0.91(s.6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝2039.42。
生产例25：CPA-403的生产
Figure BDA0003390983040001011
(1)CPA-401的生产
向4-苯甲酰基苯甲酸(50mg)、N-Boc-2,2’-(亚乙基二氧基)二乙胺(55mg)和DMF(3ml)的混合物添加WSC·HCl(42mg)和HOBt·H2O(34mg)，并将混合物在室温搅拌15小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(硅胶，己烷/AcOEt)，以给出所需产物(61mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.07-7.88(brm,2H),7.86-7.79(m,4H),7.62(tt,J＝7.4,1.2Hz,1H),7.50(t,J＝7.6Hz,2H),6.99-6.88(brs,1H),5.03-4.91(brs,1H),3.71-3.56(m,10H),3.36-3.23(brm,2H),1.42(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝457.45。
(2)CPA-402的生产
向如上所述生产的化合物(CBI-712)(61mg)和DCM(2ml)的混合物添加TFA(515μL)，并将混合物在室温搅拌14小时。蒸馏掉溶剂，以给出所需产物(63mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.73(t,J＝5.6Hz,1H),8.01-7.98(m,2H),7.82-7.69(m,8H),7.61-7.57(m,2H),3.60-3.56(m,8H),3.49-3.38(m,2H),3.00-2.93(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝357.36。
(3)CPA-403的生产
所需产物以与生产例22中相同的方式生产，区别在于使用CPA-402代替CPA-316。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.38-13.32(brm,1H),8.72(t,J＝5.6Hz,1H),8.00-7.96(m,3H),7.87-7.83(m,2H),7.80-7.68(m,7H),7.60-7.56(m,2H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.30(dd,J＝7.6,5.1Hz,1H),4.14-4.05(m,3H),3.62-3.36(m,22H),3.11-2.91(m,11H),2.84-2.79(m,5H),2.65(t,J＝7.2Hz,2H),2.57(d,J＝12.6Hz,1H),2.37-2.24(m,10H),1.68-1.19(m,26H),0.91(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1474.68。
生产例26：CPA-503的生产
Figure BDA0003390983040001021
(1)CPA-502的生产
将上述路线中示出的化合物(CPA-501)(40mg)溶解在DCM(2ml)中。向其添加TFA(258μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，以给出所需产物(41mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(t,J＝5.4Hz,1H),7.87-7.66(brs,3H),3.60-3.52(m,6H),3.41(t,J＝6.0Hz,2H),3.20(dt,J＝5.9,5.9Hz,2H),2.97(t,J＝5.2Hz,2H),1.97(m,2H),1.56(m,2H),0.98(s,3H)；
LC-MS：[M+H]+＝259.28。
(2)CPA-503的生产
所需产物以与生产例22中相同的方式生产，区别在于使用CPA-502代替CPA-316。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),7.98-7.84(m,4H),7.77-7.74(m,2H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.06(m,2H),3.61-3.16(m,22H),3.12-2.92(m,11H),2.84-2.80(m,5H),2.65(t,J＝7.3Hz,2H),2.59-2.56(m,1H),2.37-2.27(m,10H),2.10-2.02(m,4H),1.97(t,J＝7.7Hz),1.65-1.23(m,28H),0.97(s,3H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1376.31。
生产例27：CPA-334的生产
Figure BDA0003390983040001031
向上述路线中示出的化合物(CPA-333)和DCM(1ml)的混合物添加TFA(80μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂。向残留物添加上述路线中示出的化合物(CPA-321)(15mg)、DMF(1ml)和DIPEA(5.5μL)，并将混合物在室温搅拌8小时。向其进一步添加DIPEA(1.8μL)，并将混合物在室温搅拌14小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(12mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(t,J＝4.5Hz,1H),9.96(d,J＝0.7Hz,1H),9.08(t,J＝5.7Hz,1H),8.13-8.10(m,2H),8.04(t,J＝7.5Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.87-7.82(m,3H),7.78-7.63(m,6H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.30(dd,J＝7.5,5.3Hz,1H),4.14-4.05(m,2H),3.63-3.60(m,8H),3.50-3.29(m,与水信号重叠),3.11-2.89(m,11H),2.83-2.79(m,1H),2.59-2.23(m,与DMSO信号重叠),2.09-2.02(m,4H),1.65-1.24(m,26H),0.91(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1528.03。
生产例28：CPI-007的生产
Figure BDA0003390983040001041
在冰冷却下向己二酸酐(100mg)和DCM(5ml)的混合物添加烯丙醇(96μL)、DMAP(9.5mg)和吡啶(170μL)，并将混合物在冰冷却下搅拌1小时。将所述混合物升温至室温并搅拌15小时。将反应混合物用2M HCl水溶液和饱和盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥。蒸馏掉溶剂，以给出所需产物(101mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.97-5.87(m,1H),5.34-5.29(m,1H),5.26-5.22(m,1H),4.58(ddt,J＝5.7,1.3,1.3Hz,2H),2.42-2.34(m,4H),1.75-1.64(m,4H)；
LC-MS：[M+H]+＝187.20。
生产例29：CPA-338的生产
Figure BDA0003390983040001051
(1)CPA-335的生产
向上述路线中示出的化合物(CPA-310)(139mg)和DCM(5ml)的混合物添加TEA(43μL)和氯代甲酸2,2,2-三氯乙基酯(33μL)，并将混合物在冰冷却下搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(172mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(t,J＝5.6Hz,1H),7.78-7.73(m,2H),6.75(t,J＝5.4Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.82(d,J＝12.4Hz,1H),4.75(d,J＝12.4Hz,1H),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.12(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.52-3.54(m,8H),3.40-3.34(m,4H),3.12-3.04(m,5H),2.88-2.80(m,3H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.65-1.41(m,10H),1.37-1.21(m,15H)；
LC-MS：[M+H]+＝849.56。
(2)CPA-336的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-335)(172mg)和DCM(3ml)的混合物添加TFA(468μL)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂。向残留物添加DMF(3ml)、CBI-741(41mg)、WSC·HCl(47mg)、HOBt·H2O((37mg)和DIPEA(141μL)，并将混合物在室温搅拌13小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(134mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(t,J＝5.6Hz,1H),7.80-7.73(m,3H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.28(ddt,J＝17.2,1.5,1.5Hz,1H),5.20(ddt,J＝10.5,1.5,1.5Hz,1H),4.82(d,J＝12.4Hz,1H),4.75(d,J＝12.4Hz,1H),4.53(dt,J＝5.4,1.5Hz,2H),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.11(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.52-3.44(m,8H),3.39-3.30(m,4H),3.15-3.04(m,5H),3.01-2.96(m,2H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.35-2.31(m,2H),2.06-2.02(m,4H),1.64-1.21(m,20H)；
LC-MS：[M+H]+＝917.63。
(3)CPA-337的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-336)(134mg)和DCM(3ml)的混合物添加Pd(PPh3)4(17mg)和1,3-二甲基巴比妥酸(47mg)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(96mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(t,J＝5.5Hz,1H),7.80-7.74(m,3H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.82(d,J＝12.4Hz,1H),4.75(d,J＝12.4Hz),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.11(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.52-3.35(m,12H),3.12-3.04(m,5H),3.01-2.96(m,2H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.18(t,J＝6.8Hz,2H),2.06-2.01(m,4H),1.64-1.21(m,20H)；
LC-MS：[M+H]+＝877.54。
(4)CPA-338的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-337)(96mg)和DMF(2ml)的混合物添加双甲酮(31mg)、WSC·HCl(42mg)和DMAP(27mg)，然后在60℃搅拌2小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(69mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.12-11.83(brs,1H),7.90(t,J＝5.5Hz,1H),7.78-7.74(m,3H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.82(d,J＝12.4Hz,1H),4.75(d,J＝12.4Hz,1H),4.30(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.14-4.11(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.52-3.30(m,12H),3.12-3.04(m,5H),3.01-2.96(m,2H),2.93-2.90(m,2H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.59-2.43(m,5H),2.04(t,J＝7.3Hz,2H),1.64-1.21(m,20H),0.99(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝999.69。
生产例30：CPI-009的生产
Figure BDA0003390983040001071
向上述路线中示出的化合物(CPI-008)(80mg)、DMF(3ml)和DIPEA(166μL)的混合物添加TSTU(105mg)，然后在室温搅拌5分钟。向其添加6-氨基己酸(41mg)，并将混合物在室温搅拌1小时。将混合物升温至50℃并搅拌5小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(102mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.53(d,J＝2.1Hz,1H),8.37(t,J＝5.4Hz,1H),7.99(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),6.70(d,J＝8.8Hz,1H),3.39-3.32(m,2H),2.31(t,J＝7.3Hz,2H),1.70-1.58(m,4H),1.53-1.33(m,11H)；
LC-MS：[M+H]+＝367.30。
生产例31：CPA-342的生产
Figure BDA0003390983040001081
(1)CPA-339的生产
向上述路线中示出的化合物(CPA-338)(29mg)、在生产例19中生产的化合物(CPA-318)(13mg)和DMF(1ml)的混合物添加DIPEA(25μL)，然后在60℃搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(31mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.36-13.34(m,1H),9.06(t,J＝5.8Hz,1H),8.14-8.11(m,2H),7.89(t,J＝5.5Hz,1H),7.78-7.63(m,6H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.82(d,J＝12.3Hz,1H),4.75(d,J＝12.3Hz,1H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.63-3.60(m,10H),3.52-3.30(m,14H),3.11-3.04(m,5H),3.00-2.96(m,2H),2.93-2.90(m,2H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.23(s,4H),2.09-2.02(m,4H),1.63-1.21(m,20H),0.91(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1301.83。
(2)CPA-340的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-339)(31mg)和1,4-二氧杂环己烷(1ml)的混合物添加锌(16mg)和乙酸(68μL)，然后在60℃搅拌2小时。将反应混合物通过柱层析进行纯化((ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(21mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(t,J＝4.2Hz,1H),9.09(t,J＝5.7Hz,1H),8.14-8.11(m,2H),7.84(t,J＝5.8Hz,1H),7.77-7.63(m,5H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.63-3.04(m,32H),3.01-2.96(m,2H),2.94-2.90(m,2H),2.82(dd,J＝12.5,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.24(s,4H),2.09-2.02(m,4H),1.65-1.21(m,20H),0.91(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1127.92。
(3)CPA-341的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-340)(10mg)、在生产例28(1)中生产的化合物(CPI-009)(4.7mg)和DMF(1ml)的混合物添加WSC·HCl(3.4mg)、HOBt·H2O(2.7mg)和DIPEA(6.2μL)，然后在室温搅拌12小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(5.1mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(t,J＝4.7Hz,1H),9.09(t,J＝5.7Hz,1H),8.91(s,1H),8.63(s,1H),8.52(d,J＝1.6Hz,1H),8.24(t,J＝5.5Hz,1H),8.13-8.10(m,2H),7.93(dd,J＝8.9,1.7Hz,1H),7.86-7.84(m,2H),7.77-7.63(m,5H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),4.32-4.29(m,1H),4.17-4.11(m,2H),3.62-2.89(m,35H),2.81(dd,J＝12.5,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.23(s,4H),2.13-2.02(m,6H),1.67-1.24(m,35H),0.90(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1476.01。
(4)CPA-342的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-341)(4.7mg)和MeOH(50μL)的混合物添加4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液，然后在室温搅拌1小时。向其添加MeOH(100μL)、丙酮(100μL)和DIPEA(70μL)，然后在室温搅拌1小时。将反应混合物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(2.9mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(t,J＝4.6Hz,1H),9.62(s,1H),9.08(t,J＝5.7Hz,1H),8.57(d,J＝1.8Hz,1H),8.26(t,J＝5.6Hz,1H),8.14-8.11(m,2H),7.99(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.86-7.84(m,2H),7.7607.63(m,5H),7.04(d,J＝8.8Hz,1H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),4.31-4.28(m,1H),4.17-4.10(m,2H),3.62-3.59(m,10H),3.50-2.89(m,25H),2.81(dd,J＝12.6,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.6Hz,1H),2.23(s,4H),2.14-2.02(m,6H),1.96(s,3H),1.92(s,3H),1.63-1.15(m,26H),0.90(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1415.76。
生产例32：CPA-344的生产
Figure BDA0003390983040001101
所需产物以与生产例31中相同的方式生产，区别在于使用CPA-343代替CPA-321。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),9.62(s,1H),9.14(t,J＝5.6Hz,1H),8.57(d,J＝1.9Hz,1H),8.26(t,J＝5.5Hz,1H),8.14-8.12(m,2H),7.99(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.86-7.84(m,2H),7.81-7.63(m,6H),7.04(d,J＝8.8Hz,1H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),4.32-4.28(m,1H),4.17-4.10(m,2H),3.60-2.91(m,与水信号重叠),2.81(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.61-2.45(m,与DMSO信号重叠),2.29-2.26(m,6H),2.14-2.02(m,8H),1.96(s,3H),1.93(s,3H),1.80(tt,J＝6.6,6.6Hz,2H),1.68-1.24(m,28H),0.93(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1735.36。
生产例33：CPI-016的生产
Figure BDA0003390983040001111
(1)CPI-012的生产
向上述路线中示出的化合物(CPI-011)(97mg)和DCM(2ml)的混合物添加TFA(683μL)，然后在室温搅拌1小时。然后蒸馏掉溶剂。向残留物添加DMF(2ml)、N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-谷氨酸5-叔丁基酯水合物(75mg)、HATU(81mg)和DIPEA(155μL)，并将混合物在室温搅拌1小时。向其进一步添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-谷氨酸5-叔丁基酯水合物(75mg)和HATU(68mg)，并将混合物在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(136mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝7.4Hz,2H),7.66-7.60(m,2H),7.40(dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.32(ddd,J＝7.4,7.4,1.0Hz,2H),7.28-7.25(m,1H),6.68(s,1H),6.55(s,1H),6.13-6.05(brm,1H),4.89-4.78(brm,1H),4.50-4.47(m,1H),4.38-4.17(m,5H),3.65-3.51(m,12H),3.43-3.28(m,4H),3.16-3.11(m,1H),2.89(dd,J＝12.8,4.9Hz,1H),2.68(d,J＝12.8Hz,1H),2.42-2.28(m,2H),2.19-2.05(m,3H),1.98-1.89(m,1H),1.81-1.57(m,8H),1.49-1.39(m,11H)；
LC-MS：[M+H]+＝854.39。
(2)CPI-013的生产
向如上所述生产的化合物(CPI-012)(136mg)和DMF(2ml)的混合物添加哌啶(24μL)，然后在室温搅拌5小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(87mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.83(t,J＝5.7Hz,1H),7.75(t,J＝5.6Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.53-3.45(m,8H),3.41-3.33(m,6H),3.13-3.04(m,6H),2.82(dd,J＝12.5,5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.5Hz,1H),2.24-2.20(m,2H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.80-1.71(m,1H),1.66-1.43(m,9H),1.39(s,9H),1.35-1.23(m,2H)；
LC-MS：[M+H]+＝632.38。
(3)CPI-015的生产
向如上所述生产的化合物(CPI-013)(87mg)、上述路线中示出的化合物(CPI-014)(22mg)和DMF(2ml)的混合物添加WSC·HCl(32mg)和HOBt·H2O(25mg)，然后在室温搅拌5小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(92mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.80-7.71(brm,1H),7.22(t,J＝5.6Hz,1H),6.85(t,J＝5.3Hz,1H),6.61(s,1H),5.95-5.85(m,1H),5.31(dd,J＝15.8,1.4Hz,1H),5.22(dd,J＝9.2,1.4Hz,1H),5.01-4.79(brs,1H),4.57(d,J＝5.7Hz,2H),4.53-4.50(m,1H),4.39-4.34(m,2H),3.70-3.49(m,12H),3.43-3.34(m,3H),3.28-3.14(m,2H),2.92(dd,J＝12.8,4.8Hz,1H),2.72(d,J＝12.8Hz,1H),2.69-2.65(m,2H),2.61-2.57(m,2H),2.39-2.26(m,2H),2.15-2.03(m,3H),1.98-1.36(m,20H)；
LC-MS：[M+H]+＝772.45。
(4)CPI-016的生产
向如上所述生产的化合物(CPI-015)(92mg)和DCM(1ml)的混合物添加TFA(200μL)，然后在室温搅拌20小时。蒸馏掉溶剂，并向残留物添加DMF(2ml)、双甲酮(33mg)、WSC·HCl(46mg)和DMAP(29mg)，然后在60℃搅拌4小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(45mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(t,J＝5.4Hz,1H),7.74(t,J＝5.6Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.94-5.84(m,1H),5.29(ddt,J＝17.2,1.5,1.5Hz,1H),5.19(ddt,J＝10.5,1.5,1.5Hz,2H),4.52(dt,J＝5.3,1.5Hz,2H),4.32-4.29(m,1H),4.22-4.16(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.52-2.45(m,8H),3.40-3.30(m,4H),3.14-3.02(m,5H),3.01-2.91(brs,2H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.59-2.41(m,9H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.95-1.87(m,1H),1.80-1.71(m,1H),1.65-1.57(m,5H),1.54-1.41(m,3H),1.35-1.24(m,2H),0.99(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝838.42。
生产例34：CPA-346的生产
Figure BDA0003390983040001141
(1)CPA-345的生产
向上述路线中示出的化合物(CPA-316)(8.8mg)和DMF(1ml)的混合物添加N-Boc-1,2-二氨基乙烷(7.3μL)、COMU(22mg)和DIPEA(24μL)，然后在室温搅拌5小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(8.3mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22-8.19(m,2H),7.81-7.70(brs,1H),7.61-7.52(m,3H),4.99-4.87(brs,1H),3.68(dt,J＝5.7,5.7Hz,2H),3.45(dt,J＝5.7,5.7Hz,2H),1.44(s,9H)；
LC-MS：[M+H]+＝333.16。
(2)CPA-346的生产
所需产物使用CPA-345和CPI-016，以与生产例20中相似的方式来生产。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.31(t,J＝5.9Hz,1H),9.43(t,J＝5.6Hz,1H),8.15-8.12(m,2H),7.85(t,J＝5.6Hz,1H),7.75-7.65(m,4H),6.41(s,1H),6.35(s,1H),4.48(dd,J＝10.8,3.5Hz,1H),4.32-4.28(m,1H),4.14-4.10(m,1H),3.70-3.67(m,2H),3.58-3.29(m,14H),3.12-2.89(m,7H),2.84-2.66(m,5H),2.59-2.49(m,5H),2.26-2.19(m,5H),2.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.65-1.41(m,8H),1.35-1.24(m,2H),0.91(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1109.51。
生产例35：CPA-347的生产
Figure BDA0003390983040001151
(1)CPI-018HCL的生产
向上述路线中示出的化合物(CPI-017，异构体比例为4:3)(63mg)和THF(2ml)的混合物添加三苯基膦(78mg)和H2O(0.40ml)，然后在室温搅拌过夜。向其添加1M HCl水溶液(0.10ml)，然后在室温搅拌1小时。向其进一步添加1M HCl水溶液(0.30ml)，然后在室温搅拌1小时。将所述混合物升温至60℃并搅拌6小时，然后在室温搅拌4天。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(39mg，异构体比例为10:9)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.20(dd,J＝8.4,0.8Hz,1H),7.99(d,J＝8.8Hz,0.9H),7.69(d,J＝2.6Hz,0.9H),7.45-7.37(m,2+0.9H),4.21-4.15(m,2+0.9×2H),3.67(s,0.9×3H),3.65(s,3H),2.95(t,J＝7.6Hz,2+0.9×2H),1.94-1.85(m,2+0.9×2H),1.76-1.66(m,2+0.9×2H),1.65-1.45(m,4+0.9×4H)；
LC-MS：[M+H]+＝292.23。
(2)CPI-019的生产
向如上所述生产的化合物(CPI-018HCL)(39mg)、DMF(2ml)和DIPEA(93μL)的混合物添加琥珀酸酐(13mg)，然后在室温搅拌过夜。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(32mg，异构体比例为2:1)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.19(dd,J＝7.6,2.0Hz,1H),7.98(d,J＝8.8Hz,0.5H),7.69(d,J＝2.6Hz,0.5H),7.45-7.37(m,2+0.5H),4.19-4.12(m,2+0.5×2H),3.66(s,0.5×3H),3.64(s,3H),3.19(t,J＝6.9Hz,2+0.5×2H),2.60-2.55(m,2+0.5×2H),2.45(t,J＝6.8Hz,2+0.5×2H),1.91-1.82(m,2+0.5×2H),1.60-1.50(m,4+0.5×4H),1.48-1.39(m,2+0.5×2H)；
LC-MS：[M+H]+＝392.33。
(3)CPA-347的生产
所需产物以与生产例18和生产例20中相似的方式来生产(异构体比例为2:1)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(t,J＝4.9Hz,1H),9.10(t,J＝5.5Hz,1H),8.13-9.10(m,2.3H),8.00(d,J＝7.9Hz,1H),7.89-7.63(m,8.3H),7.52(s,0.7H),7.36(s,0.7H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),4.31-4.28(m,1H),4.13-4.06(m,4H),3.62-2.89(m,36H),2.81(dd,J＝12.5,5.2Hz,1H),2.60-2.49(m,3H),2.37-2.28(m,4H),2.23(s,4H),2.09-2.02(m,4H),1.78-1.71(m,2H),1.65-1.23(m,26H),0.90(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1500.96。
生产例36：CPA-353的生产
Figure BDA0003390983040001171
(1)CPA-348的生产
将上述路线中示出的化合物(CPA-338)(11mg)、N-Boc-2,2’-(亚乙基二氧基)二乙胺(2.7mg)和DMF(1ml)的混合物在60℃搅拌2小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(10mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),7.89(t,J＝5.6Hz,1H),7.78-7.74(m,3H),6.77(t,J＝5.3Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),4.82(d,J＝12.4Hz,1H),4.75(d,J＝12.4Hz,1H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.61-2.92(m,33H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.59-2.49(m,1H),2.27(s,4H),2.10-2.02(m,4H),1.73-1.21(m,29H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1229.65。
(2)CPA-349的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-348)(10mg)和1,4-二氧杂环己烷(1ml)的混合物添加锌(11mg)和乙酸(47μL)，然后在60℃搅拌30分钟。向其进一步添加锌(11mg)，然后在60℃搅拌30分钟。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN，含有0.1％AcOH)，以给出所需产物(8.6mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),7.98-7.92(brs,1H),7.75(t,J＝5.5Hz,2H),6.77(t,J＝5.4Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),6.32-6.29(m,1H),4.14-4.11(m,1H),3.61-3.28(m,27H),3.14-2.92(m,9H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.59-2.49(m,1H),2.27(s,4H),2.10-2.02(m,4H),1.64-1.23(m,29H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1055.66。
(3)CPA-350的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-349)(8.6mg)、CPA-311(2.2mg)和DMF(1ml)的混合物添加WSC·HCl(3.1mg)和HOBt·H2O(2.5mg)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(2.3mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,1H),7.96(d,J＝7.9Hz,1H),7.87-7.82(m,2H),7.75-7.73(m,2H),6.80-6.74(brs,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.32-5.26(m,1H),5.22-5.19(m,1H),4.54-4.53(m,2H),4.32-4.28(m,1H),4.14-4.04(m,2H),3.61-3.16(m,与水信号重叠),3.12-2.89(m,11H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.61-2.49(m,与DMSO信号重叠),2.33-2.22(m,10H),2.10-2.02(m,4H),1.85(s,2H),1.65-1.21(m,33H),0.94(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1309.01。
(4)CPA-351的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-350)(2.2mg)和DCM(0.50ml)的混合物添加TFA(130μL)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并向残留物添加DMF(0.50ml)、2-噻吩乙醛酸(1.3mg)、COMU(3.6mg)和DIPEA(15μL)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(1.4mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.36-13.33(m,1H),8.88(t,J＝5.5Hz,1H),8.19-8.16(m,2H),7.97(d,J＝8.3Hz,1H),7.87-7.83(m,2H),7.77-7.73(m,2H),7.29(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),6.42(s,1H),6.35(s,1H),5.96-5.86(m,1H),5.31-5.26(m,1H),5.22-5.19(m,1H),4.53(dd,J＝5.4,1.2Hz,2H),4.32-4.28(m,1H),4.14-4.05(m,2H),3.61-2.91(m,与水信号重叠),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.61-2.49(m,与DMSO信号重叠),2.34-2.25(m,10H),2.09-2.02(m,4H),1.63-1.19(m,26H),0.92(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1346.89。
(5)CPA-352的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-351)(1.4mg)和DCM(0.50ml)的混合物添加Pd(PPh3)4(0.1mg)和1,3-二甲基巴比妥酸(0.3mg)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.7mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.35-13.33(m,1H),8.94-8.91(m,1H),8.19-8.16(m,2H),8.07-7.99(m,1H),7.94-7.91(m,2H),7.29(dd,J＝4.8,3.9Hz,1H),6.47(s,1H),6.37(s,1H),4.31-4.28(m,1H),4.14-4.04(m,2H),3.62-2.94(m,与水信号重叠),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.61-2.49(m,与DMSO信号重叠),2.34-2.25(m,10H),2.11-2.03(m,4H),1.94-1.88(brm,2H),1.62-1.11(m,24H),0.92(s,6H)；
LC-MS：[M+H]+＝1306.84。
(6)CPA-353的生产
向如上所述生产的化合物(CPA-352)(0.7mg)和DMF(0.50ml)的混合物添加N-羟基琥珀酰亚胺(0.6mg)和WSC·HCl(1.0mg)，然后在室温搅拌16小时。向其进一步添加N-羟基琥珀酰亚胺(0.6mg)和WSC·HCl(1.0mg)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(0.7mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.37-13.33(m,1H),8.94-8.87(m,1H),8.19-8.16(m,2H),7.98-7.96(m,1H),7.87-7.83(m,2H),7.76-7.73(m,2H),7.29(dd,J＝4.9,3.9Hz,1H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.31-4.28(m,1H),4.14-4.04(m,2H),3.62-2.79(m,与水信号重叠),2.61-2.25(m,与DMSO信号重叠),2.09-2.02(m,4H),1.63-1.15(m,26H),0.92(s,6H)；
LC-MS：[M+2H]2+＝1404.71。
生产例37：CPI-018的合成
Figure BDA0003390983040001201
CPI-018的合成
向上述路线中示出的化合物(CPI-017)(20mg)、DMF(0.5ml)和DIPEA(14μL)的混合物添加琥珀酸酐(2.4mg)，然后在室温搅拌过夜。向所述反应溶液添加AcOEt，并将溶液用水和饱和盐水洗涤，并在Na2SO4上干燥。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(14mg)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)δ4.30-4.23(m,1H),3.53-3.38(m,8H),3.31-3.25(m,2H),3.20-3.13(m,4H),2.54-2.40(m,4H),2.30-2.24(m,2H),2.20-2.10(m,1H),1.89-1.80(m,1H),1.69-1.27(m,66H)；
LC-MS：[M+H]+＝1073.20。
生产例38：CPA-354的生产
Figure BDA0003390983040001211
CPA-353的合成
向如上所述生产的化合物(CPI-018)(5.3mg)、在生产例30(2)中生产的化合物(CPA-340)(5.6mg)和DMF(0.5ml)的混合物添加HATU(2.3mg)和DIPEA(2.6μL)，然后在室温搅拌1小时。蒸馏掉溶剂，并将残留物通过柱层析进行纯化(ODS，水/MeCN)，以给出所需产物(5.8mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.20-8.15(m,2H),7.69-7.59(m,3H),4.52-4.47(m,1H),4.33-4.19(m,3H),3.78-3.38(m,34H),3.29-3.10(m,11H),3.00-2.89(m,3H),2.70(d,J＝12.7Hz,1H),2.64-2.48(m,4H),2.33-2.05(m,11H),1.93-1.27(m,87H),0.97(s,6H)。
CPA-354的合成
向如上所述生产的化合物(CPA-353)(5.8mg)和DCM(1ml)的混合物添加TFA(0.5ml)，然后在室温搅拌9小时。蒸馏掉溶剂，以给出所需产物(4.5mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.19-8.15(m,2H),7.69-7.59(m,3H),4.52-4.46(m,1H),4.34-4.20(m,3H),3.80-3.46(m,34H),3.29-3.10(m,11H),3.00-2.89(m,3H),2.74-2.68(m,1H),2.67-2.48(m,4H),2.33-2.09(m,11H),1.93-1.26(m,33H),0.97(s,6H)；
LC-MS：[M+H]2+＝923.48。
生产例39：标记的抗体(CPA-321标记的抗体)的生产
将抗CD71抗体OKT9(#16-0719-85，Thermo Fisher Scientific)或作为对照抗体的小鼠IgG1同种型对照抗体(#553447，BD Biosciences)置于20-μL管中，并用NHS标记缓冲液(25mM HEPES-NaOH pH 8.2，150mM NaCl)稀释至终浓度为约0.1mg/ml。向其添加约1.5μL在生产例20中生产的化合物(CPA-321)在DMSO中的溶液(10mg/ml，在DMSO中)，并将混合物在室温反应2小时。然后向其添加约5μL赖氨酸溶液(100mM)，并将混合物在室温反应20分钟。通过将得到的混合物施加到脱盐柱(Zeba Spin，Thermo Scientific,89882)将其脱盐，并收集含有CPA-321标记的抗体的溶液(CPA-321标记的抗体溶液)。
试验例
下面通过示出使用本发明的四官能性化合物和四官能性化学探针中的代表性化合物的试验结果，描述了本发明的化合物的作用。然而，本发明不限于这些试验例。
试验例1：使用化合物(CPP-127)从活细胞分离和检测靶分子1.细胞培养和使用这 种化合物处理培养的细胞的方法
将稳定表达人多巴胺受体D2(DRD2)的CHO-K1细胞在10-cm培养板上培养，直至它们变得合生。
将所述细胞用培养基清洗，并将所述培养基用含有DMSO或未修饰的配体的培养基代替，然后反应30分钟。随后，将培养基舍弃并用含有在生产例12中合成的化合物(CPP-127)的培养基代替，并允许细胞在37℃放置30分钟。将培养基舍弃，并将细胞用PBS清洗。向培养板上的细胞添加PBS(1ml)，然后使用UV交联剂将所述细胞用302nm UV光辐照1分钟。在UV辐照后使用细胞刮棒收集细胞，并将收集的细胞团块在-80℃冷冻保存。
2.膜级分蛋白的制备和纯化
将所述冷冻保存的细胞悬浮在50mM Tris匀浆缓冲液(pH 7.4，2.5mM EDTA，5mMMgCl2，320mM蔗糖)中，并使用超声仪均化。使用离心机将均化后的悬液离心(1,000g，15分钟，4℃)。将离心后得到的上清液转移到另一个管中并离心(30,000×g，30分钟，4℃)。离心后，舍弃上清液，并向沉淀物添加100mM碳酸钠缓冲液(Na2CO3)，然后用超声仪均化并在冰上温育10分钟。通过超速离心将所述悬液离心(45,2000×g，30分钟，4℃)，舍弃上清液，并将得到的沉淀物用Milli-Q水漂洗，用作膜级分蛋白。
3.膜蛋白洗脱
向通过上述方法制备的膜级分蛋白添加膜裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，0.1％SDS，0.5％SDC，1％Triton-X-100，8M尿素)，并使用超声仪溶解所述膜级分蛋白。向溶解的膜蛋白溶液添加链霉亲合素珠子(#88816，Thermo Fisher Scientific)，并通过搅拌和混合60分钟使生物素标记的蛋白吸附到所述珠子上。在将珠子用膜裂解缓冲液清洗后，添加40μL含有0.05％SDS的2％N2H4溶液，并允许珠子在室温放置30分钟。通过磁性分离除去珠子并收集溶液。通过添加20％TFA溶液将收集的溶液中和，然后使用离心蒸发器浓缩。向所述浓缩的溶液添加二硫苏糖醇和碘乙酰胺用于还原和烷基化，并添加胰蛋白酶溶液，然后在37℃消化过夜。
4.靶蛋白的LC-MS分析和鉴定
将所得到的胰蛋白酶消化液脱盐和纯化，并通过LC-MS进行蛋白质分析。LC-MS使用利用nano-HPLC装置(Ultimate 3000，Thermo Scientific)和质谱仪(Q Exactive，Thermo Scientific)的组合的LC-MS系统来进行。在nano-HPLC装置中，使用由捕获柱(C18Acclaim PepMap，Thermo Scientific)和chip柱(75μm i.d.，12cm长，3μm C18粒子，NikkyoTechnos,Co.,Ltd.)组成的柱(固定相)并使用0.1％甲酸-乙腈系统作为流动相，通过反相色谱进行梯度分析。流速为300nl/min，并用乙腈浓度在48分钟的时间段内从4％提高到35％的线性梯度来洗脱肽。质谱术通过纳米电喷雾电离以正离子模式进行。在380至1600的m/z范围内获取全扫描MS谱，并以数据依赖性获取模式测量产物离子谱。由LC-MS获得的数据通过Proteome Discoverer 2.2分析软件(PD 2.2，Thermo Fisher Scientific)进行分析。对于蛋白质鉴定来说，使用在PD 2.2中提供的搜索引擎Sequest在从UniProt下载的数据库中进行搜索。使用假发现率进行计算。在进行过滤以使假阳性蛋白鉴定率小于1％后，将PSM值大于或等于5的蛋白视为鉴定到的蛋白，以便选择更可靠的候选蛋白。此外，使用鉴定到的独特肽的数目缩小数据范围。在定量分析中，通过PD 2.2中提供的定量方法LFQ对蛋白质进行定量，并与未修饰配体处理组进行定量比较分析，以区分被特异性收集的蛋白质。分析在两个独立试验中进行，并且结果可以被表示为相对于未修饰配体处理组的比率。
5.结果
图1示出了结果。如图1中所示，当使用本发明的四官能性化学探针(化合物(CPP-127))时，在未修饰配体处理组中多巴胺受体D2的检测被显著抑制，证实了多巴胺受体D2(DRD2)被特异性收集。试验例2：使用化合物(CPF-224、CPF-202和CPF-242)从活组织分离和检测靶分子
通过异氟烷吸入将DBA/2CrSlc小鼠麻醉，然后斩首并迅速取出脑。将取出的脑在人工脑脊液(ACSF)中在0℃下浸泡60秒，同时不断鼓入气体混合物(95％O2，5％CO2)。用手术刀除去嗅球和小脑，并使用即粘胶将脑固定到振动刀片切片机(Leica，VT1200)的载样台。在0℃下不断鼓入所述混合气体的ACSF中制备含有纹状体和海马的脑切片(厚度为0.3mm的薄切片)。将切片置于含有人工脑脊液的培养皿中。添加未修饰的配体或DMSO，并将培养皿在室温放置5分钟。随后添加在生产例10中生产的化合物(CPF-224)或在生产例8中生产的化合物(CPF-202)，并将培养皿在室温放置30分钟。除去溶液，并将切片用UV光辐照(在CPF-224和CPF-202的情况下，用302nm UV光辐照1分钟，在CPF242的情况下，用365nm UV光辐照15分钟)。将切片用PBS清洗并收集，通过离心(3000×g，4℃，5分钟)除去上清液。通过与试验例1中相同的方法对得到的沉积物进行分析。分析在两个独立试验中进行，并且结果可以被表示为相对于未修饰配体处理组的比率。
图2示出了使用化合物(CPF-224)获得的结果。图3示出了使用化合物(CPF-202)获得的结果。图4示出了使用化合物(CPF-242)获得的结果。正如在这些图中所示，在使用本发明的四官能性化学探针即CPF-224、CPF-202和CPF242时，在未修饰配体处理组中，脑组织中的AMPA型谷氨酸受体(Gria1、Gria2、Gria3、Gria4)和GABA受体亚基(Gabra1、Gabra2、Gabra5、Gabrg2)的检测被显著抑制，证实了所述膜蛋白被特异性收集。
试验例3：使用标记的抗体捕获细胞表面抗原
使用用生产例21中生产的CPA-321标记的抗CD71抗体或用生产例21中生产的CPA-321标记的抗小鼠IgG1对照抗体从THP-1细胞获得抗原分子。具体来说，收集THP-1细胞并用SB缓冲液(含有2％FCS的PBS缓冲液)清洗。将清洗后的细胞悬浮在含有0.1％Fc阻断试剂(Invitrogen，16-9161-73)的SB缓冲液中，并在4℃反应15分钟。通过离心(600×g，3分钟，4℃)除去上清液，并添加抗体溶液(通过向用生产例21中生产的CPA-321标记的抗体的溶液(20μg)添加SB缓冲液以使总体积为1ml来获得)，然后在4℃反应20分钟。通过离心除去抗体溶液，将细胞用SB缓冲液清洗，然后悬浮在0.5ml SB缓冲液中。将细胞悬液用302nm UV管辐照1分钟，并通过离心除去SB缓冲液。通过试验例1中示出的方法对得到的细胞进行分析。分析在两个独立试验中进行，并将结果表示为使用抗CD71抗体获得的蛋白质的量与在小鼠IgG1同种型对照抗体(抗小鼠IgG抗体)的情况下获得的蛋白质的量的比率(图5)。
如图5中所示，两个分析试验证实显著获得了TFRC(CD71)。试验例4至13：使用标记抗体捕获细胞表面抗原(1)
来自于表1中示出的细胞的抗原分子的调查，使用表1中示出的标记抗体来进行。具体来说，将表1中示出的细胞用SB缓冲液(含有2％FCS的PBS缓冲液)清洗，悬浮在含有0.1％Fc阻断试剂(Invitrogen，16-9161-73)的SB缓冲液中，并在4℃反应15分钟。通过离心(600×g，3分钟，4℃)单独地除去每种上清液，并单独地添加每种含有下述按照标记抗体生产方法生产的标记抗体的溶液，然后在4℃反应20分钟。通过离心单独地除去每种抗体溶液，并将细胞用SB缓冲液清洗，然后悬浮在0.5ml SB缓冲液中。将每种细胞悬液单独地用表中示出的波长的紫外光辐照表中示出的时间段，并通过离心除去SB缓冲液。通过试验例1中示出的方法分析收集的细胞。分析在两个独立试验中进行，并对表中示出的待分析膜蛋白的检测量进行比较(图6至8)。
标记抗体的生产(试验例4至12)
将表1中示出的抗体单独地放置在独立的管中，并用NHS标记缓冲液(25mM HEPES-NaOH pH 8.2，150mM NaCl)稀释至终浓度为约0.05mg/ml。向其单独地添加约0.9μL每种表1中示出的探针在DMSO中的溶液(10mg/ml，在DMSO中)，然后在室温反应2小时。随后，向其添加约5μL赖氨酸溶液(100mM)，然后在室温反应20分钟。将得到的溶液在4℃储存直至使用。
标记配体的生产(试验例13)
将12.5μg His标签EGF置于管中，并用NHS标记缓冲液稀释至终浓度为约0.25mg/ml。向48μL该溶液添加2μL 5mM CPA-354，以制备标记配体溶液。将该溶液在4℃储存直至使用。
表2
Figure BDA0003390983040001271
试验例14：使用标记抗体捕获细胞表面抗原(2)
来自于A431细胞的抗原分子的调查，使用通过下表中示出的方法生产的标记的OKT9来进行。首先，将细胞用SB缓冲液(含有2％FCS的PBS缓冲液)清洗。然后添加含有0.1％Fc阻断试剂(Invitrogen，16-9161-73)的SB缓冲液，并将细胞在4℃反应15分钟。除去上清液，并添加250μL用SB缓冲液稀释10倍的配体溶液，然后在4℃反应20分钟。除去配体溶液，将细胞用PBS清洗，然后用302nm UV光辐照1.5分钟。使用含有1％NP-40的裂解缓冲液从细胞提取蛋白质，并通过试验例1中示出的方法进行分析。将使用形成在探针中的每种配体时检测到的CD71的量与使用未形成在探针中的OKT9抗体作为阴性对照(无探针)时检测到的量进行比较(图9)。
标记抗体的生产
(1)将10μg抗CD71抗体OKT9(Thermo Fisher Scientific，目录号16-0719-85)置于管中，并用NHS标记缓冲液(25mM HEPES-NaOH pH 8.2，150mM NaCl)稀释至终浓度为约0.1mg/ml。向其添加0.9μLCPA-321溶液(10mg/ml，在DMSO中)，然后在室温反应2小时。随后，向其添加约5μL赖氨酸溶液(100mM)，然后在室温反应20分钟。将得到的溶液在4℃储存直至使用。
(2)将10μg抗CD71抗体OKT9置于管中并添加5μL 30mM高碘酸钠(在磷酸盐缓冲液中，pH 6.5)。然后添加磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，以使总体积为100μL。在室温反应15分钟后，使用Zeba Spin柱(Thermo Scientific)将溶剂更换为PBS。向100μL得到的抗体溶液添加1μL 500mM 5-MA水溶液。随后添加1μL 10mg/ml CPA-342或CPA-344在DMSO中的溶液，然后在避光条件下在室温反应1.5小时。在反应后，使用Zeba Spin柱将溶剂更换为PBS，并除去过量试剂。
表3
试验例 探针 用于标记抗体的生产方法
试验例14 CPA-321 (1)
试验例15 CPA-342 (2)
试验例16 CPA-344 (2)
试验例17：使用标记抗体捕获细胞表面抗原(第二抗体方法)
来自于THP-1细胞的抗原分子的调查，使用通过用于CBP-198标记的第二抗体的生产方法生产的标记的第二抗体来进行。具体来说，将THP-1细胞用SB缓冲液(含有2％FCS的PBS缓冲液)清洗，并悬浮在含有0.1％Fc阻断试剂(Invitrogen，16-9161-73)的SB缓冲液中，然后将细胞在4℃反应15分钟。通过离心(600×g，3分钟，4℃)除去上清液。向细胞添加用SB缓冲液稀释至5μg/mL的抗CD71抗体DF1513溶液，并将细胞在4℃反应20分钟。通过离心除去抗体溶液，并将细胞用SB缓冲液清洗。随后，将细胞悬浮在溶液(通过向通过用于CPA-503标记的第二抗体的生产方法生产的标记的第二抗体添加SB缓冲液至总体积为1ml来获得)中，并在4℃反应20分钟。通过离心除去抗体溶液，并将细胞用SB缓冲液清洗，然后悬浮在0.5ml SB缓冲液中。用365nm UV光辐照15分钟，并通过离心除去SB缓冲液。通过试验例1中示出的方法分析收集的细胞。分析在两个独立试验中进行，并比较检测到的CD71得量。
作为比较例，以与试验例11中相同的方式计算检测到的CD71的量，区别在于使用抗CD71抗体DF1513代替抗CD71抗体OKT9(图10)。
CPA-503标记的第二抗体的生产
将山羊抗小鼠IgG抗体(5μg)置于管中，并用NHS标记缓冲液(25mM HEPES-NaOH pH8.2，150mM NaCl)稀释至终浓度为约0.05mg/ml。添加约0.9μL CPA-503在DMSO中的溶液(10mg/ml，在DMSO中)，然后在室温反应2小时。随后，向其添加约5μL赖氨酸溶液(100mM)，然后在室温反应20分钟。将得到的溶液在4℃储存直至使用。
通过使用所述第二抗体方法，可以检测不能通过第一抗体方法检测的膜蛋白。
序列表自由文本
SEQ ID NO：1和2均为肽的氨基酸序列，其各自是形成本发明的四官能性化合物或四官能性化学探针的可切割组成部分(E)的化合物的实施方式。
序列表
<110> 大塚制药株式会社
<120> 四官能性化学探针和使用所述探针鉴定来自于活细胞或活组织的靶膜蛋白的方法
<130> P20-079WO
<150>JP 2019-107511
<151>2019-06-07
<160> 2
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<230> 为四官能性化合物或四官能性化学探针的可切割组成部分设计的肽
<400>丂1
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<230> 为四官能性化合物或四官能性化学探针的可切割组成部分设计的肽
<400>丂2
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
5

Claims (9)

1.一种四官能性化合物，其包含
配体结合性组成部分(A)，
反应性组成部分(D)，
可切割组成部分(E)，和
生物素标签(B)，所述组成部分(A)、(D)、(E)和(B)任选地通过间隔物相连，
其中
所述配体结合性组成部分(A)是选自胺反应性基团、羟基反应性基团、硫醇反应性基团、醛反应性或酮反应性基团、烷基卤化物反应性或芳基卤化物反应性基团、烷基磺酸酯反应性或芳基磺酸酯反应性基团、酰胺反应性基团、磺酰胺反应性基团、芳基反应性基团、二醇反应性基团和羧基反应性基团的至少一种活化的官能团，或选自-COOH、-NH2、-OH、-SH、-CH＝CH-、-(C＝O)-CH＝CH-、烷基卤化物、乙烯基卤化物、芳基卤化物、烷基磺酸酯、乙烯基磺酸酯、芳基磺酸酯、炔基、叠氮基、环氧基和点击标签的至少一种反应性官能团，
所述反应性组成部分(D)是具有选自2-芳基-5-羰基四唑、苯基叠氮化物、二氮杂环丙烯、α-酮基酰胺、4-羟基苯、邻苯二甲酰肼和二苯甲酮的至少一种化合物的结构的基团，
所述可切割组成部分(E)是具有选自1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基、乙酰丙酸酯、邻二醇、重氮苯、二芳基腙、二烷氧基二苯基甲硅烷、二硫化物、含有序列ENLYFQG(SEQ ID NO：1)的肽和含有序列ENLYFQS(SEQ ID NO：2)的肽的至少一种化合物的结构的基团，
所述生物素标签(B)是由下式(1)表示的基团
Figure FDA0003390983030000011
其中符号*表示与相邻基团的键；
所述间隔物是具有一个或多个碳原子的直链或支链亚烷基，或具有3个或更多个碳原子的直链或支链亚烷基，其中不相邻的-CH2-基团独立地被选自下述的至少一个交联基团代替：-O-，-OCH2-，-CH2O-，-CO-，-NRa-(其中Ra表示氢原子或C1-6烷基，其同样适用于下文)，-CO-NRa-，-NRa-CO-，由下式(1-1)表示的基团和由下式(1-2)表示的基团
Figure FDA0003390983030000021
其中m表示0或1，并且n表示1或2。
2.根据权利要求1所述的四官能性化合物，其中所述反应性组成部分(D)是由下式(2)或(2’)表示的基团，
Figure FDA0003390983030000022
其中符号*表示与相邻基团的键，并且n表示0或1，
和/或
所述可切割组成部分(E)是由下式(3)表示的基团
Figure FDA0003390983030000031
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地表示氢原子或C1-6烷基，并且符号*表示与相邻基团的键。
3.根据权利要求1或2所述的四官能性化合物，其由下式(I)或式(II)表示：
Figure FDA0003390983030000032
其中A、B、C、D和E表示权利要求1中的相应组成部分，并且S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7各自独立地表示间隔物。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的四官能性化合物，其中所述配体结合性组成部分(A)是N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
5.根据权利要求4所述的四官能性化合物，其由下式(i)、(ii)或(iii)表示：
Figure FDA0003390983030000033
其中p表示2。
6.一种四官能性化学探针，其包含：
根据权利要求1至5中的任一项所述的四官能性化合物，和
与所述四官能性化合物的配体结合性组成部分(A)结合的配体。
7.根据权利要求6所述的四官能性化学探针，其中所述配体是选自均对源自于活细胞或活组织的膜蛋白具有亲和性的蛋白质、肽、脂类、糖类和小分子化合物的一个成员。
8.根据权利要求6或7所述的四官能性化学探针，其由式(iv)表示：
Figure FDA0003390983030000041
其中S1表示间隔物，并且p表示2。
9.一种使用根据权利要求6至8中的任一项所述的四官能性化学探针检测细胞或组织中的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(1)将细胞或组织与所述四官能性化学探针反应，以使所述四官能性化学探针中的配体与靶蛋白结合，
(2)在所述四官能性化学探针中的反应性组成部分(D)与所述靶蛋白之间形成共价键，
(3)纯化含有结合到所述四官能性化学探针的靶蛋白的级分，
(4)将所述四官能性化学探针中的生物素标签结合到亲和素，以形成所述四官能性化学探针和所述亲和素的偶联物，
(5)在所述四官能性化学探针中的可切割组成部分处切开所形成的所述四官能性化学探针和所述亲和素的偶联物，以及
(6)检测含有所述靶蛋白的级分。
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