BR112014012609A2 - peptídeos citotóxicos e conjungados de droga de anticorpo dos mesmos - Google Patents

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Christopher John O'Donnell
Chakarapani Subramanyam
Beth Cooper Vetelino
Russel George Dushin
Pavel Strop
Edmund Idris Graziani
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Abstract

peptídeos citotóxicos e conjugados de droga de anticorpo dos mesmos. a presente invenção refere-se a pentapeptídeos citotóxicos, a conjugados de droga de anticorpo dos mesmos, e a métodos para uso dos mesmos para tratar câncer.

Description

“PEPTÍDEOS CITOTÓXICOS E CONJUGADOS DE DROGA DE ANTICORPO DOS MESMOS”. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório dos Estados Unidos Nº. 61/561.255, depositado em 17 de novembro de 2011, e do Pedido Provisório dos Estados Unidos Nº. 61/676.423, depositado em 27 de julho de 2012, ambos os quais são aqui incorporados em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a novos compostos à base de peptídeos úteis como cargas em conjugados de droga de anticorpo (ADC’s), e compostos de ligante de carga úteis em conexão com ADC’s. A presente invenção refere-se ainda a composições incluindo as cargas acima mencionadas, ligantes de carga e ADC’s, e métodos para uso destas cargas, ligantes de carga e ADC’s, para tratar condições patológicas incluindo câncer.
FUNDAMENTO
[003] A conjugação de drogas a anticorpos, seja diretamente ou através de ligantes, envolve uma consideração de uma variedade de fatores, incluindo a identidade e localização do grupo químico para a conjugação da droga, o mecanismo de liberação da droga, os elementos estruturais que proveem a liberação da droga, e a modificação estrutural para a droga livre liberada. Além disso, se a droga deve ser liberada após a internalização do anticorpo, o mecanismo de liberação da droga deve corresponder ao tráfego intracelular do conjugado.
[004] Embora uma variedade de diferentes classes de droga tenha sido testada para distribuição através de anticorpos, somente poucas classes de droga provaram eficácia como conjugados de droga de anticorpo, enquanto tendo um perfil de toxicidade adequado.
[005] Uma classe são as auristatinas, derivadas do produto natural dolastatina 10.
Auristatinas representativas incluem (N-metilvalina-valina-dolaisoleucina-dolaproina- norefedrina) e (N-metilvalina-valina-dolaisoleucina-dolaproina-fenilalanina). No entanto, permanence a necessidade por auristatinas adicionais com propriedades melhoradas.
SUMÁRIO
[006] A presente invenção refere-se a pentapeptídeos citotóxicos e conjugados de droga de anticorpo dos mesmos representados pela fórmula:
[007] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
[008] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil, ou C1-C8 haloalquil, ou R1 é um ligante ou um ligante-anticorpo, tal como
Y O Z Z
Y , ou ;
[009] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[010] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)- ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-; Z é , , , , , ,
H H N N H N O L N O O O , O O , O H O L N H N O
O NH2 , NH2, -NH2 ou -NHL;
[011] G é halogênio, -OH, -SH ou –S-C1-C6 alquil;
[012] L é um anticorpo;
[013] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[014] R3A e R3B são definidos como um dos seguintes:
[015] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[016] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; ou
[017] R3A e R3B tomados juntos são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[018] R4A e R4B são definidos como um dos seguintes:
[019] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[020] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[021] R4A e R4B tomados juntos são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[022] R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O
[023] ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[024] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
[025] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[026] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[027] R7 é F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3;
[028] h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e
[029] X é O ou S;
[030] desde que quando R3A é hidrogênio, X é S.
[031] A presente invenção refere-se a pentapeptídeos citotóxicos e conjugados de droga de anticorpo dos mesmos representados pela fórmula:
[032] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
[033] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[034] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[035] R3A e R3B são definidos como um dos seguintes:
[036] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[037] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil, halogênio ou hidrogênio; ou
[038] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[039] R4A e R4B são definidos como um dos seguintes:
[040] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[041] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[042] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[043] R5 é
O R11 R11 O , O R11 , , O R11 ,
S 11 N N R R11 R11 H
O O N O O N R11 O , H , , , , N R11
H S
N or NH-R11 ,
[044] opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
[045] R11 é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, ou R11 é um ligante ou ligante-anticorpo, tal como
Y O Z Z
Y , ou ;
[046] Y é C2-C20 alquileno ou C2-C20 heteroalquileno; C3-C8 carbociclo-, -arileno-, - C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl-Cl0alquileno- (C3-
[047] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-; Z é , , , , , ,
H H N N H N O L N O O O , O O , O H O L N H N O
O NH2 , NH2, -NH2 ou -NHL;
[048] G é halogênio, -OH, -SH ou –S-C1-C6 alquil;
[049] L é um anticorpo;
[050] R7 é F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3;
[051] h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e
[052] X é O ou S.
[053] Outro aspecto da invenção refere-se a composições farmacêuticas incluindo uma quantidade eficaz de qualquer um dos compostos acima mencionados e/ou qualquer um dos conjugados de droga de anticorpo acima mencionados e um veículo ou portador farmaceuticamente aceitável.
[054] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de utilização de uma quantidade eficaz de qualquer um dos compostos acima mencionados e/ou qualquer um dos conjugados de droga de anticorpo acima mencionados para tratar câncer pela administração a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz do dito composto e/ou conjugado.
[055] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de tratamento de câncer em que o dito câncer inclui um tumor, metástase, ou outra doença ou distúrbio caracterizado por crescimento celular descontrolado, em que o dito câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinomas do bexiga, mama, colo do útero, cólon, gliomas, endométrio, rim, pulmão, esôfago, ovário, próstata, pâncreas, melanoma, estômago e testículos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[056] Figura 1 representa um gráfico de atividade anti-tumor de quatro conjugados (cada um administrado a 1 mg/kg, Q4dx4) traçada como colume de tumor ao longo do tempo.
[057] Figura 2 representa um gráfico de atividade anti-tumor de seis conjugados (cada um administrado a 1 mg/kg, Q4dx4) traçada como volume de tumor tratado com droga/volume de tumor tratado com veículo ao longo do tempo.
[058] Figura 3 representa os resultados do teste de H(C)-#D54 e H(C)-vcMMAE a 1 mg/kg s
[059] Figuras 4A, 4B e 4C representam [A] resultados de teste de H(C)-#D54 e
H(K)-MCC-DM1 em um modelo de seleção in vivo de xenoenxerto de camundongo MDA-MB-361-DYT2; [B] resultados do teste de H(C)-vcMMAE e H(C)-mcMMAF em um modelo de seleção in vivo de xenoenxerto de camundongo MDA-MB-361-DYT2; e [C] uma comparação do T/C calculado para todos os quarto conjugados. Os camundongos foram tratados q4dx4, começando no dia 1.
[060] Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E e 5F representam os resultados de resposta à dose do teste de [A] H(C)-#D54, [B] H(C)-vcMMAE, [C] H(C)-mcMMAF e [D] H(K)- MCC-DM1 em um modelo in vivo de xenoenxerto de camundongo N87; [E] uma comparação de H(C)-#D54 e H(C)-vcMMAE; e [F] uma comparação de T/C para todos os quarto conjugados. Os camundongos foram tratados q4dx4, iniciando no dia 1.
[061] Figura 6 representa os resultados de resposta à dose do teste H(C)-#A115 a 1 mpk, 3 mpk e 10 mpk, em um modelo in vivo de xenoenxerto de camundongo N87.
Os camundongos foram tratados q4dx4, iniciando no dia 1.
[062] Figura 7 apresenta dados comparando anticorpo humanizado hu08 conjugado a vc-0101 ou mc-3377, testado em um modelo de xenoenxerto in vivo com células PC3MM2, uma linhagem celular de cancer de próstata humana que expressa o receptor IL-13R 2.
[063] Figuras 8A a E apresentam [A] a eficácia de ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano dosados a 5mg/kg em xenoenxertos de pulmão HCC2429; [B e C] a eficácia de ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano dosados a 5mg/kg em xenoenxertos de mama MDA-MB-468; [D e E] a eficácia de ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano dosados a 5mg/kg em xenoenxerto gástrico N87.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[064] A presente invenção refere-se a pentapeptídeos citotóxicos, a conjugados de droga de anticorpo compreendendo os ditos pentapeptídeos citotóxicos, e a métodos para uso dos mesmos para tratar câncer e outras condições patológicas. A invenção também se refere a métodos de utilização de tais compostos e/ou conjugados in vitro, in situ, e in vivo para a detecção, diagnose ou tratamentoo de células de mamíferos, ou condições patológicas associadas.
Definições e Abreviações
[065] Salvo indicação em contrário, os seguintes termos e frases como usados aqui são destinados a terem os seguintes significados. Quando nomes comerciais são usados aqui, o nome comercial inclui a formulação do produto, a droga genérica, e o(s) ingrediente(s) farmacêutico(s) ativo(s) do produto com nome comercial, salvo indicação em contrário pelo contexto.
[066] O termo "anticorpo" (or “Ab”) aqui é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo que apresentam a atividade biológica desejada. Um anticorpo intacto possui primariamente duas regiões: uma região variável e uma região constante. A região variável se liga a e interage com um antígeno alvo. A região variável inclui uma região determonante de complementaridade (CDR) que reconhece e se liga a um sítio de ligação específico em um antígeno particular. A região constante pode ser reconhecida por e interagir com o Sistema imune (ver, por exemplo, Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Um anticorpo pode ser de qualquer tipo ou classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2). O anticorpo pode ser derivado de qualquer espécie adequada. Em algumas modalidades, o anticorpo é de origem humana ou de murino. Um anticorpo pode ser, por exemplo, humano, humanizado ou quimérico.
[067] Os termos "especificamente se liga" e "ligação específica" se referem a aglutinação de anticorpo a um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo se liga com uma afinidade de pelo menos cerca de 1x107 M-1, e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes superior que sua afinidade para aglutinação a um antígeno não-específico (por exemplo, BSA, caseína) que não o antígeno predeterminado ou um antígeno estreitamente relacionado.
[068] O termo "anticorpo monoclonal", como usado aqui, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presents em quantidades pequenas. Anticorpos monoclonais são altamente specíficos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular.
[069] O termo "anticorpos monoclonais" especificamente inclui anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica a ou homóloga com a sequência correspondente de anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou sublasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica a ou homóloga com as sequências de anticorpos correspondentes derivadas de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles apresentem a atividade biológica desejada.
[070] Como usado aqui, “H(C)-” se refere a trastuzumab (nome comercial HERCEPTIN®) que é um anticorpo monoclonal que interfere com o receptor HER2/neu, ligado através de uma de suas cistinas ao composto da invenção. Como usado aqui, “H(K)-” se refere a trastuzumab que é um anticorpo monoclonal que interfere com o receptor HER2/neu, ligado através de uma de suas lisinas ao composto da invenção.
[071] Um "anticorpo intacto" é um que compreende uma região variável de ligação a antígeno bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2, CH3 e CH4, como apropriado para a classe de anticorpo. Os domínios constantes podem ser domínios constants de sequência nativa (por exemplo, domínios constants de sequência native humana) ou variantes de sequência de aminoácido dos mesmos.
[072] Um anticorpo intacto pode ter uma ou mais "funções efetoras", as quais se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (por exemplo, uma região Fc de sequência native ou região Fc variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem citotoxicidade dependente de complemento, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo.
[073] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente compreendendo a região variável ou de aglutinação a antígeno do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia simples, scFv, scFv-Fc, fragmentos de anticorpos multiespecíficos formados de fragmento(s) de anticorpo, um fragmento(s) produzido por uma biblioteca de expressão Fab, ou fragmentos de aglutinação a epítopos de qualquer um acima que imuno especificamente se liga a um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de célula de câncer, um antígeno viral ou um antígeno microbiano).
[074] O termo "variável" no contexto de um anticorpo se refere a determinadas porções dos domínios variáveis do anticorpo que diferem extensivamente na sequência e são usadas na aglutinação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Esta variablidade é concentrada em três segmentos chamados "regiões hipervariáveis" nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas regiões de quadro (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem, cada um, quatro FRs conectadas por três regiões hipervariáveis.
[075] O termo "região hipervariável", quando usado aqui, se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por aglutinação a antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (L3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "ciclo hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (142) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). Resíduos de FR são aqueles resíduos de domínio variável que não os resíduos de região hipervariável como aqui definidos.
[076] Um fragmento de anticorpo " Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreende os domínios V.sub.H e V.sub.L de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes emu ma cadeia de polipeptídeo simples. Tipicamente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios V.sub.H e V.sub.L que permite o scFv formar a estrutura desejada para aglutinação de antígeno. Para uma resenha de scFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994).
[077] O termo "diacorpo" se refere a fragmentos de anticorpos pequenos com dois sítios de aglutinação a antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio pesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo. Pela utilização de um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 0 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:6444-6448.
[078] Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, roedores) são anticorpos quimérico que contem sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são recolocados por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primate não- humano tendo as desejadas especificidade, afinidade, e capacidade. Em alguns casos, resíduos da região de quadro (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos dos ciclos hipervariáveis correspondemàqueles de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todos das FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-
329; e Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
[079] Como usado aqui, "isolado" significa separado de outros componentes de (a) uma fonte natural, tal como uma cultura celular ou célula vegetal ou animal, ou (b) uma mistura de reação química orgânica sintética. Como usado aqui, "purificado" significa que, quando isolado, o isolado contem pelo menos 95%, e em outro aspecto pelo menos 98%, de um composto (por exemplo, um conjugado) em peso do isolado.
[080] Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um component de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materials que podem interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não-proteicos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais do que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não-redução utilizando Coomassie blue ou, preferivelmente, corante prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estja presente. Geralmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[081] Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte celular programada conforme determinado por aglutinação de anexina V, fragmentação de DNA, encolhimento celular, dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (chamadas corpos apoptóticos). A célula é um tumor celular, por exemplo, uma célula de mama, ovário, estômago,
endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiróide, pancreas ou bexiga.
Vários métodos estão disponíveis para avaliação dos eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida por aglutinação de anexina; fragmentação de DNA pode ser avaliada por escalonamento de DNA; e condensação nuclear/de cromatina com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento em células hipodiplóides.
[082] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de uma droga eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o númeor de células de câncer; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, retardar até certo ponto e, preferivelmente, parar) a infiltração de câncer em órgãos periféricos; inibir (isto é, , retardar até certo ponto e, preferivelmente, parar) metástase de tumor; inibir, até certo ponto, crescimento do tumor; e/ou aliviar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Até certo ponto, a droga pode inibir o crescimento de e/ou matar células cancerosas existentes, e pode ser citotósica ou citostática. Para terapia de câncer, a eficácia pode, por exemplo, ser medida por avaliação do tempo para progressão da doença (TTP) e/ou determinação da taxa de resposta (RR).
[083] O termo "quantidade substancial " se refere a uma maioria, isto é, mais de 50% de uma população, de uma mistura ou uma amostra.
[084] O termo "metabólito intracelular" se refere a um composto resultante de um processo metabólito ou reação dentro de uma célula em um conjugado de anticorpo- droga (ADC). O processo ou reação metabólica pode ser um processo enzimático, tal como clivagem proteolítica de um ligante de peptídeo do ADC. Metabólitos intracelulares incluem, mas não são limitados a, anticorpos e droga livre que sofreram clivagem intracellular após entrada, difusão, captação ou transporte em uma célula.
[085] Os termos "intracelularmente clivados" e "clivagem intracelular" se referem a um processo ou reação metabólica dentro de uma célula em um ADC ou semelhante, por meio do que a ligação covalente, por exemplo, o ligante, entre a porção de droga e o anticorpo é quebrada, resultando na droga livre, ou outro metabólito do conjugado dissociado do anticorpo dentro da célula. As porções clivadas do ADC são, assim, metabólitos intracelulares.
[086] O termo "biodisponibilidade" se refere à disponibilidade sistêmica (isto é, níveis de sangue/plasma) de uma dada quantidade de uma droga administrada a um paciente. Biodisponibilidade é um termo absolute que indica a medição de ambos o tempo (taxa) e a quantidade total (dimensão) de droga que alcança a circulação geral de uma forma de dosage administrada.
[087] O termo "atividade citotóxica" se refere a um efeito anti-proliferativo, citostático ou assassino de célula de um ADC ou um metabólito intracellular do dito ADC. A atividade citotóxica pode ser expressa como o valor de IC50, que é a concentração (molar ou massa) por volume de unidade em que metade das células sobrevivem.
[088] Um "distúrbio" é qualquer condição que pode se beneficar de um tratamento com um conjugado de droga ou de anticorpo-droga. Isto inclui distúrbios ou doença crônicos ou agudos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem um mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não-limitantes de distúrbios a serem tratados aqui incluem cânceres benignos malignos; malignidades linfóides e leucemia, distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, angiogênicos e imunológicos.
[089] Os termos "câncer" e "canceroso" se referem a ou descrevem a condição ou distúrbio fisiológico em mamíferos que é tipicamente caracterizado por crescimento celular desregulado. Um "tumor" compreende uma ou mais células cancerosas.
[090] Exemplos de um "paciente" incluem, mas não são limitados a, um ser humano, rato, camundongo, porquinho-da-índia, macaco, porco, cabra, vaca, cavalo, cachorro, gato, pássaro e frango. Em uma modalidade exemplar, o paciente é um ser humano.
[091] Os termos "tratar" ou "tratamento," salvo indicação em contrário pelo contexto, se referem a tratamento terapêutico e medidas profiláticas para prevenir reincidência, em que o objeto é para inibir ou reduzir (atenuar) um distúrbio ou alteração fisiológica indesejada, tal como o desenvolvimento ou propagação do câncer. Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não agravamento) de doença, retardo ou diminuição da progressão da doença, melhora ou paliação do estado de doença, e remissão (seja parcial ou total), se detectável ou indetectável.
"Tratamento" pode também significar prolongamento da sobrevivência quando comparado a sobrevivência esperado se não receber tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles que já apresentam a condição ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio.
[092] No contexto de câncer, o termo "tratamento" inclui qualquer ou toda a inibição de crescimento de células de tumor, células de câncer, ou um tumor; inibição da replicação de células de tumor ou células de câncer, redução da carga de tumor total ou diminuição do número de células de câncer, e melhora de um ou mais sintomas associados com a doença.
[093] No contexto de uma doença autoimune, o termo "tratar" inclui qualquer ou toda a inibição de replicação de células associadas com um estado de doença autoimune incluindo, mas não limitado a, células que produzem um anticorpo autoimune, redução da carga de anticorpo autoimune e melhora de um ou mais sintomas de uma doença autoimune.
[094] No contexto de uma doença infecciosa, o termo "tratar" inclui qualquer ou toda: inibição do crescimento, multiplicação ou replicação do patógeno que causa a doença infecciosa e melhora de um ou mais sintomas de uma doença infecciosa.
[095] O termo "bula" é usado para se referir a instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contem informações sobre a indicação(s), uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou precauções referents ao uso de tais produtos terapêuticos.
[096] Como usado aqui, os termos "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usados intercambiavelmente e tais designações incluem descedência. As palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem as culturas e células principais primárias ou descendentes derivadas das mesmas sem relação com o número de transferências. É também entendido que todas descendentes podem njao ser precisamente idênticas em teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Descendentes mutantes que possuem a mesma função ou atividade biológica como pesquisado na célula originalmente transformada são incluídas.
Onde designações distintas são pretendidas, será claro pelo contexto.
[097] Salvo indicação em contrário, o termo "alquil" sozinho ou como parte de outro termo se refere a um hidrocarboneto saturado, ramificado ou de cadeia reta tendo o número indicado de átomos de carbono (por exemplo, "C1-C8" alquil se refere a um grupo alquil tendo de 1 a 8 átomos de carbono). Quando o number de átomos de carbono não é indicado, o grupo alquil tem de 1 a 8 átomos de carbono.
C1-C8 alquils de cadeia reta representativos incluem, mas não são limitados a, metil, etil, n-propil, n-butil, n-pentil, n-hexil, n-heptil e n-octil; enquanto C1-C8 alquils ramificados incluem, mas não são limitados a, -isopropil, -sec-butil, -isobutil, -tent- butil, -isopentil, e -2-metilbutil; C2-C8 alquils insaturados incluem, mas não são limitados a, vinil, alil, 1-butenil, 2-butenil, isobutilenil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-metil-1- butenil, 2-metil-2-butenil, 2,3-dimetil-2-butenil, 1-hexil, 2-hexil, 3-hexil, acetilenil,
propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, 2-pentinil e 3-metil-1-butinil.
[098] Salvo indicação em contrário, "alquileno," sozinho ou como parte de outro termo, se refere a um radical hidrocarboneto cíclico ou de cadeia reta ou ramificado, saturado do definido númeor de átomos de carbono, tipicamente 1-18 átomos de carbono, e tendo dois centros radicais monovalentes derivados por remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois diferentes átomos de carbono de um alcano parente. Radicais alquileno típicos incluem, mas não são limitados a: metileno (-CH2-), 1,2-etileno -CH2CH2-), 1,3-propileno (-CH2CH2CH2-), 1,4-butileno (- CH2CH2CH2CH2-), e semelhantes. Um alquileno "C1-C10" de cadeia reta é um grupo hidrocarboneto saturado de cadeia reta da fórmula -(CH2)1-10-. Exemplos de um C1- C10 alquileno incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno e decaleno.
[099] Salvo indicação em contrário, o termo "heteroalquil", sozinho ou em combinação com outro termo, significa, salvo indicação em contrário, um hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada estável, ou combinações do mesmo, totalmente saturado ou contendo de 1 a 3 graus de insaturação, que consiste no número definido de átomos de carbono, e de um a três heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de enxofre e nitrogênio podem opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode opcionalmente ser quaternizado. Os heteroátomo(s) O, N e S podem ser colocados em qualquer posição interior do grupo heteroalquil. O heteroátomo Si pode ser colocado em qualquer posição do grupo heteroalquil, incluindo a posição em que o grupo alquil é ligado ao restante da molécula. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos.
[0100] Salvo indicação em contrário, o termo "heteroalquileno" sozinho ou como parte de outro substituto significa um grupo divalente derivado de heteroalquil (como discutido acima). Para grupos heteroalquileno, heteroátomos podem também ocupar um ou ambos os terminais de cadeia.
[0101] Salvo indicação em contrário, "aril", sozinho ou uma parte de outro termo, significa um radical hidrocarboneto aromático carbocíclico monovalente insubstituído ou substituído de 6-20, preferivelmente 6-14, átomos de carbono derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono simples de um sistema de anel aromático parente. Grupos aril típicos incluem, mas não são limitados a, radicais derivados de benzeno, benzene substituído, naftaleno, antraceno, bifenil, e semelhantes. Um grupo aromático carbocíclico substituído (por exemplo, um grupo aril) pode ser substituído com um ou mais, preferivelmente 1 a 5, dos seguintes grupos: C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado de -H, C1-C8 alquil e aril insubstituído. Em algumas modalidades, um grupo aromático carbocíclico substituído pode ainda incluir um ou mais de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR'. “Arileno” é a porção divalente correspondente.
[0102] "Alquil substituído" significa um alquil em que um ou mais átomos de hidrogênio são, cada um, independentemente substituído com um substituto.
Substitutos típicos incluem, mas não são limitados a, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO32-, PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, ou -C(=NR)NR2, em que cada X é independentemente um halogênio: -F, -Cl, -Br, ou -I; e cada R é independentemente -H, C1-C20 alquil, C1-C20 heteroalquil, C6-C20 aril, C1- C10 heterociclil, um grupo de proteção ou uma porção de prodroga. Grupos aril, alquileno e heteroalquileno, como descritos acima, podem também ser similarmente substituídos.
[0103] Salvo indicação em contrário, “aralquil” sozinho ou parte de outro termo, significa um grupo alquil, como definido acima, substituído com um grupo aril, como definido acima.
[0104] Salvo indicação em contrário, "C1-C10 heterociclil" sozinho ou como parte de outro termo, se refere a um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou tricíclico, aromático ou não-aromático, substituído ou insubstituído monovalente tendo de 1 a 10, preferivelmente 3 a 8, átomos de carbono (também referidos como membros de anel) e um a quarto membros de anel de heteroátomo independentemente selecionados de N, O, P ou S, e derivados por remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de anel de um sistema de anel parente. Um ou mais N, C ou S átomos no heterociclil podem ser oxidados. O anel que inclui o heteroátomo pode ser aromático ou não-aromático. A menos que definido de outra forma, o heterociclil é ligado a seu grupo suspenso em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulta emu ma estrutura estável. Exemplos representativos de um C1-C10 heterociclil incluem, mas não são limitados a, tetrahidrofuranil, oxetanil, piranil, pirrolidinil, piperidinil, piperazinil, benzofuranil, benzotiofeno, benzotiazolil, indolil, benzopirazolil, pirrolil, tiofenil (tiofeno), furanil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, quinolinil incluindo porções, tais como 1,2,3,4-tetrahidro-quinolinil, pirimidinil, piridinil, piridonil, pirazinil, piridazinil, isotiazolil, isoxazolil, tetrazolil, epóxido, oxetano e BODIPY (substituído ou insubstituído). Um C1-C10 heterociclil pode ser substituído com até sete grupos incluindo, mas não limitados a, C1-C8 alquil, C1-C8 heteroalquil, -OR', aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(O)R', halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado de -H, C1-C8 alquil, C1-C8 heteroalquil e aril. Em algumas modalidades, um heterociclil substituído pode também incluir um ou mais de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR'. “Heterociclo” “C1-C10 heterociclo” é a porção divalente correspondente.
[0105] Salvo indicação em contrário, “heteroaralquil” sozinho ou parte de outro termo, significa um grupo alquil, como definido acima, substituído com um grupo heterociclil aromático, como definido acima. Heteroaralquil é a porção divalente correspondente.
[0106] Salvo indicação em contrário, “C3-C8 carbociclil” sozinho ou como parte de outro termo, é um anel carbocíclico monocíclico ou bicíclico não-aromático, saturado ou insaturado, substituído ou insubstituído, monovalente de 3-, 4-, 5-, 6-, 7- ou 8- membros derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de anel de um sistema de anel parente. C3-C8 carbociclil representativos incluem, mas não são limitados a, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclopentadienil, ciclohexil, ciclohexenil, 1,3-ciclohexadienil, 1,4-ciclohexadienil, cicloheptil, 1,3-cicloheptadienil, 1,3,5-cicloheptatrienil, ciclooctil, ciclooctadienil, biciclo(1.1.1.)pentano, e biciclo(2.2.2.)octano. Um grupo C3-C8 carbociclil pode ser insubstituído ou substituído com até sete grupos incluindo, mas não limitados a, C1-C8 alquil, C1-C8 heteroalquil, -OR', aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(=O)R', -OH, -halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado de -H, C1-C8 alquil, C1-C8 heteroalquil e aril. “C3-C8 carbociclo” é a porção divalente correspondente.
[0107] O termo "quiral" se refere a moléculas que tem a propriedade de não- sobreposição da imagem de espelho correspondente, embora o termo "aquiral" se refira a moléculas que são passíveis de sobreposição em sua imagem de espelho correspondente.
[0108] O termo "estereoisômeros" se refere a compostos que possuem constituição química idêntica, mas diferem com relação ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço.
[0109] "Diastereômero" se refere a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens de espelho umas das outras.
Diastereômeros possuem diferentes propriedades físicas, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. Misturas de diastereômeros podem se separar sob procedimentos analíticos de alta resolução, tais como eletroforese e cromatografia.
[0110] Definições e convenções estereoquímicas usadas aqui geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary de Chemical Terms, McGraw-Hill Book Company, New York (1984); e Eliel e Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, isto é, possuem a capacidade de girar o plano de luz polarizada por plano. Ao descrever um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usados para representar a configuração absoluta da molécula sobre seu centro(s) quiral(is). Os prefixos d e l ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação de luz polarizada por plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levorrotatório. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrorrotatório. Para uma dada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos, exceto que eles são imagens de espelho um do outro. Um estereoisômero específico pode também ser referido como um enantiômero, e uma mistura de atis isômeros é geralmente chamada de uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é referida como uma mistura racêmica ou um racemato, que pode ocorrer onde não há estereosseleção ou estereoespecificidade em um processo ou reação química. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" se referem a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, isentas de atividade ótica.
[0111] Um "derivado" de aminoácido inclui um aminoácido tendo substituições ou modificações por ligação covalente de um aminoácido parente, tal como, por exemplo, por alquilação, glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes.
Adicionalmente incluído na definição de "derivado" está, por exemplo, um ou mais análogos de um aminoácido com ligações substituídas, bem como outras modificações conhecidas na técnica.
[0112] Um "aminoácido natural" se refere a arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptofano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutâmico, ácido aspártico, treonina, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina e valina, salvo indicação em contrário pelo contexto.
[0113] "Grupo de proteção" se refere a uma porção que, quando ligada a um grupo de reação em mascaras de molécula, reduz ou previne aquela reatividade. Exemplos de grupos de proteção podem ser encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999, e Harrison e Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols.
1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996), que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Grupos de proteção hidróxi representativos incluem grupos acil, benzil e tritil éteres, tetrahidropiranil éteres, trialquilsilil éteres e alil éteres. Grupos de proteção amino representativos incluem, formil, acetil, trifluoroacetil, benzil, benziloxicarbonil (CBZ), terc-butoxicarbonil (Boc), trimetil silil (TMS), 2-trimetilsilil- ethanossulfonil (SES), tritil e grupos tritil substituídos, aliloxicarbonil, 9- fluorenilmetiloxicarbonil (FMOC), nitro-veratriloxicarbonil (NVOC) e semelhantes.
[0114] Exemplos de um "grupo de proteção hidroxil" incluem, mas não são limitados a, metoximetil éter, 2-metoxietoximetil éter, tetrahidropiranil éter, benzil éter, p-metoxibenzil éter, trimetilsilil éter, trietilsilil éter, triisopropil silil éter, t- butildimetil silil éter, trifenilmetil silil éter, acetato éster, acetato ésteres substituídos, pivaloato, benzoato, metanossulfonato e p-toluenossulfonato.
[0115] "Grupo de partida" se refere a um grupo funcional que pode ser substituído por outro grupo funcional. Tais grupos de partida são bem conhecidos na técnica, e exemplos incluem, mas não são limitados a, um haleto (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metanossulfonil (mesil), p-toluenossulfonil (tosil),
trifluorometilsulfonil (triflato), e trifluorometilsulfonato.
[0116] A frase "sal farmaceuticamente aceitável", como usado aqui,, se refere a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto. O composto tipicamente contem pelo menos um grupo amino, e consequentemente sais de adição de ácido podem ser formados com este grupo amino. Sais exemplares incluem, mas não são limitados a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrate de ácido, tartarato, oleato, tannato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, malato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, e sais de pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis- (2-hidróxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula, tal como um íon de acetato, um íon de succinate ou outro contra- íon. O contra-íon pode ser qualquer porção orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga no composto parente. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais do que um átomo carregado em sua estrutura. Casos em que vários átomos carregados são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter múltiplos contra- íons. Por isso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-íons.
[0117] "Solvato farmaceuticamente aceitável" ou "solvato" se refere a uma associação de uma ou mais moléculas de solvente e um composto ou conjugado da invenção. Exemplos de solventes que formam solvatos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, etil acetato, ácido acético, e etanolamina.
[0118] Os termos “carga” ou “carga de droga” ou “carga” representam ou se referem ao número médio de cargas (“carga” e “cargas” são usados intercambiavelmente aqui com “droga” e “drogas”) por anticorpo em uma molécula
ADC. Carga de droga pode variar de l a 20 drogas por anticorpo. Isto é, às vezes, referido como o DAR, ou razão de droga para anticorpo. Composições dos ADCs descritos aqui tipicamente tem DAR’s de 1-20, e em determinadas modalidades de 1-8, de 2-8, de 2-6, de 2-5 e de 2-4. Valores de DAR típicos são 2, 4, 6 e 8. O númeo médio de drogas por anticorpo, ou valor DAR, pode ser caracterizado por meios conventionais, tais como espectroscopia UV/visível, espectrometria de massa, ensaio ELISA e HPLC. O valor DAR quantitative pode também ser determinado. Em alguns casos, separação, purificação e caracterização de ADCs homogêneos tendo um valor DAR particular podem ser alcançados por meios, tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese. DAR pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, onde a ligação é uma cisteína tiol, um anticorpo pode ter somente um ou vários grupos cisteína tiol, ou pode ter somente um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através do que uma unidade ligante pode ser ligada. Em algumas modalidades, a cisteína tiol é um grupo tiol de um resíduo de cisteína que forma uma ligação dissulfeto intercadeia. Em algumas modalidades, a cisteína tiol é um grupo tiol de um resíduo de cisteína que não forma uma ligação dissulfeto intercadeia. Tipicamente, menos do que o máximo teórico de porções de droga são conjugados a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com um ligante ou intermediário de ligante. Somente os grupos lisina mais reativos podem reagir com um reagente de ligante reativo.
[0119] Geralmente, anticorpos não contem muitos, se algum, grupos cisteína livres e reativos que podem ser ligados a uma droga através de um ligante. A maior parte dos resíduos de cisteína tiol nos anticorpos existe como posntes dissulfeto e deve ser reduzida com um agente de redução, tal como ditiotreitol (DTT). O anticorpo pode estar sujeito a condições de desnaturação para reveler grupos nucleofílicos reativos, tais como lisina ou cisteína. A carga (razão droga/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras, incluindo: (i) limitação do excess molar de droga-ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação da temperature ou tempo da reação de conjugação, e (iii) condições redutoras parciais ou limitantes para modificação de cisteína tiol. Onde mais do que um grupo nucleofílico reage com um droga-ligante, então, o produto resultante é uma mistura de ADC com uma distribuição de uma ou mais porções de droga por anticorpo. O número médio de drogas por anticorpo pode ser calculado da mistura por, por exemplo, ensaio de anticoprpo ELISA duplo, específico para anticorpo e específico para a droga. ADC individuais podem ser identificados na mistura por espectroscopia de massa, e separados por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica.
[0120] Abaixo está uma lista de abreviações e definições que não podem ser de outra forma definidos ou descritos neste pedido: DMSO (se refere a dimetil sulfóxido), HRMS (se refere a espectrometria de massa de alta resolução), DAD (se refere a detecção de matriz de diodo), TFA (se refere a ácido 2,2,2-trifluoroacético ou ácido trifluoroacético), TFF (se refere a filtração de fluxo tangencial), EtOH (se refere a etanol), MW (se refere a peso molecular), HPLC (se refere a cromatografia líquida de alto desempenho), HPLC prep (se refere a cromatografia líquida de alto desempenho preparativa), etc. (se refere a e assim por diante), tritil (se refere a 1,1',1''-etano-1,1,1-triiltribenzeno), THF (se refere a tetrahidrofurano), NHS (se refere a 1-hidróxi-2,5-pirrolidinadiona), Cbz (se refere a carboxibenzil), eq. (se refere a equivalente), n-BuLi (se refere a n-butillítio), OAc (se refere a acetato), MeOH (se refere a metanol), i-Pr (se refere a isopropil ou propan-2-il), NMM (se refere a 4- metilmorfolina), e “-“ (em uma tabela, se refere a nenhum dado disponível no momento).
[0121] Compostos e Conjugados de droga de anticorpo dos mesmos
[0122] Um aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula I:
I
[0123] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1
[0124] W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
[0125] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0126] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0127] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0128] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; e
[0129] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; ou
[0130] R3A e R3B , tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0131] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0132] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0133] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0134] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[0135] R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O
[0136] ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[0137] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
[0138] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[0139] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[0140] X é O ou S;
[0141] desde que quando R3A é hidrogênio X é S.
[0142] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IIa: IIa
[0143] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O ,
R3A
N R1 1-2 ou O ;
Y O Z Z
Y R1 é , ou ;
[0144] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-; -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[0145] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)- ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
H N
O R10 N O
O
[0146] Z é , , , O
O O H N
O NH2 ou -NH2;G é halogênio, -OH, -SH ou –S-C1-C6 alquil;
[0147] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0148] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0149] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0150] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil ou halogênio; ou
[0151] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0152] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0153] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0154] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0155] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[0156] R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O
[0157] ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[0158] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
[0159] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[0160] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[0161] R7 é independentemente selecionado para cada ocorrência do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3;
[0162] R10 é hidrogênio, -Cl-Cl0alquil, -C3-C8carbociclil, -aril, -Cl-C10heteroalquil, -C3- C8heterociclo, -Cl-Cl0alquileno-aril, -arileno-Cl-Cl0alquil, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Cl-Cl0alquil, -Cl-Cl0alquileno-(C3-C8heterociclo), e - (C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquil, em que aril em R10 compreendendo aril é opcionalmente substituído por [R7]h;
[0163] h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e
[0164] X é O ou S;
[0165] desde que quando R3A é hidrogênio X é S.
[0166] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IIIa: IIIa
[0167] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
[0168] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0169] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0170] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0171] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0172] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou
[0173] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0174] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0175] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0176] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0177] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0178] R5 é
O R11 R11 O , O R11 , , O R11 ,
S 11 N N R R11 R11 H
O O N O O N R11 O , H , , , , N R11
H S
N or NH-R11 ,
[0179] opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
[0180] R11 é ou ;
[0181] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[0182] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
H N
O R10 N O
O Zé , , , O
O O H N
O NH2 ou -NH2;
[0183] R7 é independentemente selecionado para cada ocorrência do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3;
[0184] R10 é hidrogênio, -Cl-Cl0alquil, -C3-C8carbociclo, aril, -Cl-C10heteroalquil, -C3- C8heterociclo, -Cl-Cl0alquileno-aril, -arileno-Cl-Cl0alquil, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Cl-Cl0alquil, -Cl-Cl0alquileno-(C3-C8heterociclo), e - (C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquil, em que aril em R10 compreendendo aril é opcionalmente substituído por [R7]h;
[0185] h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e
[0186] X é O ou S.
[0187] R6 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; e
[0188] h é 1, 2, 3, 4 ou 5.
[0189] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IIb: IIb
[0190] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
Y O Z Z
Y R1 é , ou ;
[0191] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[0192] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-; Z é , , ,
O H L N O H N H
L N O O O , NH2 ou -NHL;
[0193] L é um anticorpo;
[0194] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0195] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0196] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0197] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou
[0198] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0199] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0200] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0201] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0202] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[0203] R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O
[0204] ou R5 é , R13 , or
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[0205] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
[0206] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[0207] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[0208] X é O ou S;
[0209] desde que quando R3A é hidrogênio X é S.
[0210] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IIIb: IIIb
[0211] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1
[0212] W é , O ,
R3A
N R1 1-2 ou O ;
[0213] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0214] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0215] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0216] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0217] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou
[0218] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0219] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0220] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0221] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0222] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0223] R5 é
O R11 R11 O , O R11 , , O R11 ,
S 11 N N R R11 R11 H
O O N O O N R11 O , H , , , , N R11
H S
N or NH-R11 ,
[0224] opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído; R11 é ou ;
[0225] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[0226] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-; Z é , , ,
O H L N O H N H
L N O O O , NH2 ou -NHL;
[0227] L é um anticorpo;
[0228] X é O ou S.
[0229] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IIc: R3B' R3A' H O H L Z' R1' N N N N D N R5 R2' O O X
O O 1-20 IIc
[0230] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência,
O O O O H N Y N N H H O O NH
Y R1’ é ou O NH2 ;
[0231] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[0232] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
O H O
N N Z’ é O , O , ,
O H N O H N H
N O O O , NH2 , ou –NH-;
[0233] L é um anticorpo;
[0234] D é –C(R4A’)(R4B’)- ou é ausente;
[0235] R2’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, ou é ausente se está presente;
[0236] R3A’ e R3B’ são algum dos seguintes:
[0237] R3A’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0238] R3B’ é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil, ou R3B’ é C2-C4 alquileno e forma anel de 5-7 membros como indicado por ; ou
[0239] R3A’ e R3B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0240] R4A’ e R4B’ são algum dos seguintes:
[0241] R4A’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0242] R4B’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0243] R4A’ e R4B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[0244] R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O R6
O
[0245] ou R5 é ,
O R12 O
O
N R12 R12 R6
O N
H R13 , ou R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3- C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[0246] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
[0247] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[0248] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[0249] X é O ou S;
[0250] desde que quando R3A é hidrogênio X é S.
[0251] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IIIc:
H O H
N N N W N R5' R11'Z' L
O O O X 1-20 IIIc
[0252] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
[0253] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0254] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0255] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0256] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0257] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou
[0258] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0259] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0260] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0261] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0262] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0263] R5 é
O R11' R11' O , O R11' , , O R11' ,
S 11' N N R R11' R11' H
O O N O O N R11' O , H , , , , N R11'
H S
N or NH-R11' ,
[0264] opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
O O O O H N Y N N H H O O NH
Y R11’ é ou O NH2 ;
[0265] Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-
[0266] C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
O H O
N N Z’ é O , O , ,
O H N O H N H
N O O O , NH2 , ou –NH-;
[0267] L é um anticorpo;
[0268] X é O ou S.
[0269] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula IId: R3B' R3A' H O H L [linker] N N N N D N R5 R2 '
O O O O X 1-20 IId
[0270] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência,
[0271] L é um anticorpo;
[0272] [ligante] é um ligante divalente;
[0273] D é –C(R4A’)(R4B’)- ou é ausente;
[0274] R2’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, ou é ausente se está presente;
[0275] R3A’ e R3B’ são algum dos seguintes:
[0276] R3A’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0277] R3B’ é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil, ou R3B’ é C2-C4 alquileno e forma anel de 5-7 membros como indicado por ; ou
[0278] R3A’ e R3B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0279] R4A’ e R4B’ são algum dos seguintes:
[0280] R4A’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0281] R4B’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0282] R4A’ e R4B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[0283] R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR',
-C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O
[0284] ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[0285] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
[0286] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[0287] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[0288] X é O ou S;
[0289] desde que quando R3A é hidrogênio X é S.
[0290] Outro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula fórmula IIId:
H O H
N N N W N R5' [linker] L
O O O X 1-20 IIId
[0291] ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
[0292] R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0293] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
[0294] R3A e R3B são algum dos seguintes:
[0295] R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
[0296] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou
[0297] R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0298] R4A e R4B são algum dos seguintes:
[0299] R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
[0300] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0301] R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0302] R5 é
O R11' R11' O , O R11' , , O R11' ,
S 11' N N R R11' R11' H
O O N O O N R11' O , H , , , , N R11'
H S
N or NH-R11' ,
[0303] opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
[0304] [ligante] é um ligante divalente;
[0305] L é um anticorpo;
[0306] X é O ou S.
[0307] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que o composto é representado por .
[0308] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que W é .
[0309] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que W é 1-2 R3A
N R1 ou O .
[0310] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que W é .
[0311] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A
N R1 1-2
[0312] W é ou O .
[0313] Em determinadas modalidades da invenção, W é:
1-3
N R1 R3A
O W é , , ou R3A
N R1 1-3 O .
[0314] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil.
[0315] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é hidrogênio.
[0316] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é C1-C8 alquil.
[0317] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é metil.
[0318] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil.
[0319] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R2 é hidrogênio.
[0320] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R2 é C1-C8 alquil.
[0321] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R2 é metil.
[0322] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é hidrogênio; e R2 é metil.
[0323] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é metil; e R2 é metil.
[0324] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil.
[0325] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio.
[0326] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é halogênio.
[0327] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é hidrogênio.
[0328] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é C1-C8 alquil.
[0329] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é metil.
[0330] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3B é C1-C8 alquil.
[0331] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3B é metil.
[0332] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3B é isopropil.
[0333] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3B é C3-C8 carbociclil.
[0334] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3B é ciclohexil.
[0335] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é C1-C8 alquil; e R3B é C1-C8 alquil.
[0336] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é metil; e R3B é metil.
[0337] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é hidrogênio; e R3B é C1-C8 alquil.
[0338] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A é hidrogênio; e R3B é isopropil.
[0339] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno.
[0340] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno.
[0341] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são –CH2CH2–.
[0342] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são –CH2CH2CH2–.
[0343] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são –CH2CH2CH2CH2–.
[0344] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são C1-C8 heteroalquileno.
[0345] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R3A e R3B, tomados juntos, são –CH2OCH2–.
[0346] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil.
[0347] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é hidrogênio.
[0348] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é C1-C8 alquil.
[0349] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é metil.
[0350] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4B é hidrogênio.
[0351] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4B é C1-C8 alquil.
[0352] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4B é metil.
[0353] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é C1-C8 alquil; e R4B é C1-C8 alquil.
[0354] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é metil; e R4B é metil.
[0355] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é hidrogênio; e R4B é hidrogênio.
[0356] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A é hidrogênio; e R4B é C1-C8 alquil.
[0357] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno.
[0358] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno.
[0359] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são –CH2CH2–.
[0360] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são –CH2CH2CH2–.
[0361] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são –CH2CH2CH2CH2–.
[0362] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são C1-C8 heteroalquileno.
[0363] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R4A e R4B, tomados juntos, são –CH2OCH2–.
[0364] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0365] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0366] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0367] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0368] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0369] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0370] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0371] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0372] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0373] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0374] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0375] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0376] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0377] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0378] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é
.
[0379] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0380] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R5 é .
[0381] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R6 é hidrogênio.
[0382] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R6 é C1-C8 alquil.
[0383] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R6 é metil.
[0384] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que X é O.
[0385] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que X é S.
[0386] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a quaisquer dos compostos acima mencionados, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, e definições dos mesmos, em que o composto é selecionado do grupo que consiste em:
[0387] N-Metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-
3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0388] N2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0389] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0390] N-Metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- 3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L- valinamida;
[0391] N-Metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0392] N-Metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)- 1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0393] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0394] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1- metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0395] N2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0396] N2-[(1-Aminociclopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-
1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0397] 1-Amino-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]ciclohexanecarboxamida;
[0398] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0399] 2-Metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L- valinamida;
[0400] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida;
[0401] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1- il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0402] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0403] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1- metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0404] N2-[(3-Aminooxetan-3-il)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2- {(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1- oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida;
[0405] N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-
{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0406] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0407] N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0408] N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0409] N2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0410] N2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2- {(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1- oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida;
[0411] 2-Metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-vaLinamida;
[0412] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4.2.0]octa-1,3,5- trien-7-il)-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0413] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[biciclo [4.2.0]octa-1,3,5- trien-7-il(carboxi)metil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0414] 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1-
fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0415] N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0416] 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)- 1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3 oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0417] 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0418] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butóxi-1-oxo- 3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0419] Metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)- L-valil](metil)amino}-3-metóxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metóxi-2- metilpropanoil]-L-fenilalaninato;
[0420] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butóxi-1- oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0421] 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)- 1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0422] 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1- fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0423] N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2- (metilamino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1- [(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0424] N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2-amino-1-benzil-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0425] N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-oxo-2- (propilamino)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0426] N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2- (dietilamino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1- [(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0427] N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-(terc- butilamino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1- [(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0428] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1- fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0429] 3-metil-D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0430] 3-metil-L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0431] L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0432] D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0433] 1,2-dimetil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0434] 1,2-dimetil-D-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida;
[0435] N~2~-[2,2-dimetil-3-(metilamino)propanoil]-N-{(1S,2R)-2-metóxi-4-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida;
[0436] Metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-dimetil-3- (metilamino)propanoil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3- metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato;
[0437] Metil N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil(N- {[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato;
[0438] Metil N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil(N- {[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato;
[0439] N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil(N- {[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalanina;
[0440] N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil(N- {[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalanina;
[0441] Metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3- il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato;
[0442] Metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3- il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato;
[0443] (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien- 1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2- carboxamida;
[0444] (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien- 1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2- carboxamida; i. 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6- trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0445] N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1- il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida;
[0446] N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1- il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida;
[0447] (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2- carboxamida;
[0448] (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2- carboxamida;
[0449] N-2-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0450] N-2-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0451] 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4- aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0452] 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4- aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0453] 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0454] 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4- aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0455] 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0456] N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}- L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalanina;
[0457] N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}- L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalanina;
[0458] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2R,4S)-4-carboxi-1- fenilpentan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0459] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-(biciclo[1.1.1]pent-1- ilamino)-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida;
[0460] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(1R)-2- metóxi-2-oxo-1-(1-fenilciclopropil)etil]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0461] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(1S)-2- metóxi-2-oxo-1-(1-fenilciclopropil)etil]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0462] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1R)-1-[(7R)- biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il]-2-metóxi-2-oxoetil}amino)-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0463] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)-1-[(7S)- biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il]-2-metóxi-2-oxoetil}amino)-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0464] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0465] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)-1-[(7R)- biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il]-2-metóxi-2-oxoetil}amino)-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0466] N,N,2-trimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0467] N,N,2-trimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0468] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)-carboxi(1- fenilciclopropil)metil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0469] difluoro{2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(3R,4R,7S)-7-benzil-15-{2- [(3,5-dimetil-1H-pirrol-2-il-kappaN)metilideno]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-4-metil-5,8,13- trioxo-2-oxa-6,9,12-triazapentadecan-3-il]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamidato}boro;
[0470] 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0471] Metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(3-aminooxetan-3-il)carbonil]- L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato;
[0472] 2-metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S,12S)-7-benzil-14-[3-cloro- 4-(propan-2-iloxi)fenil]-4-metil-12-[4-(8-metilimidazo[1,2-a]piridin-2-il)benzil]-5,8,14-
trioxo-2,9-dioxa-6,13-diazatetradecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida;
[0473] 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[4-(5-fluoro-1,3- benzotiazol-2-il)-2-metilfenil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil- 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0474] 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0475] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)- 1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0476] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fenil-1-(prop-2-en-1-iloxi)propan-2- il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0477] 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butóxi-1- oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0478] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-({(2S)-1-oxo-3-fenil-1-[(1H-1,2,3-triazol-4-ilmetil)amino]propan-2- il}amino)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0479] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fenil-1-(prop-2-yn-1-ilamino)propan-2- il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0480] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-imidazol-4- il)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0481] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)- 1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0482] N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1R)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0483] 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-3-fenil-1-(piperazin-1-il)propan-2-il]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida;
[0484] 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3- fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida; e
[0485] 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6- trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida.
[0486] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é
Y Z .
[0487] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é .
[0488] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R1 é
.
[0489] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Y é C2-C20 alquileno.
[0490] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Y é –(CH2)p–; e p é 1-10.
[0491] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 1. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 2. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 3. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 4. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 5. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 6. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 7. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 8. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 9. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que p é 10.
[0492] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Y é C2-C20 heteroalquileno.
[0493] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Y é –(CH- 2CH2O)qCH2CH2–; e q é 1-10.
[0494] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 1. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 2. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 3. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 4. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 5. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 6. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 7. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 8. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 9. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que q é 10.
[0495] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é .
[0496] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é .
[0497] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é .
[0498] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é
O R10
O .
[0499] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é
H N N O O O .
[0500] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é
O H N
O NH2 .
[0501] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R7 é F ou Cl; e h é 4 ou 5.
[0502] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R7 é F; e h é 3, 4 ou 5.
[0503] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que R7 é F; e h é 5.
[0504] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é -NH2.
[0505] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que G é Cl. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que G é Br. Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que G é I.
[0506] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que o composto é selecionado do grupo que consiste nos compostos da Tabela 18B.
[0507] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que o composto é selecionado do grupo que consiste em:
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
O O O O O N S
[0508] ,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
O O O O O N S
[0509] ,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
[0510] O O O O O ,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
[0511] O O O O O ,
O O O
H H H2N N N N
O N N OH 6 H
O O O O O
[0512] and
O O O
H H H2N N N N
O N N OH 6
O O O O O
[0513] .
[0514] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é .
[0515] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é .
[0516] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é .
[0517] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z é -NHL.
[0518] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que Z
H N H
L N O is O O .Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas
O H L N
O definições, em que Z é NH2.
[0519] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que L é H(C)-.
[0520] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos compostos acima mencionados e suas definições, em que L é um anticorpo selecionado de um anticorpo de murino para o tratamento de câncer de ovário, tal como oregovomab (OVAREX® ); um anticorpo de murino IgG2a para o tratamento de câncer colorretal, tal como edrecolomab (PANOREX®) ; um anticorpo quimérico anti- EGFR IgG para o tratamento de cânceres positivos para fator de crescimento epidérmico, tal como câncer de cabeça e pescoço, por exemplo cetuximab (ERBITUX® ); um anticorpo humanizado para o tratamento de sarcoma,, tal como um Anticorpo Monoclonal Humanizado para o Receptor Vitronectina ( v 3) como Vitaxin®; um anticorpo IgG1 humanizado para o tratamento de leukemia linfocítca crônica (CLL), tal como alemtuzumab (CAMPATH I/H®); SMART ID10 que é anticorpo anti-HLA-DR humanizado para o tratamento de linfoma de non- Hodgkin;131I Lym-1 (ONCOLYM®) que é um anticorpo anti-HLA-Dr10 de murino radio-rotulado para o tratamento de linfoma de non-Hodgkin; um mAb anti-CD2 humanizado para o tratamento de Doença de Hodgkin ou linfoma de non-Hodgkin, tal como ALLOMUNE® ; labetuzumab (CEACIDE®) que é um anticorpo anti-CEA humanizado para o tratamento de câncer colorretal; bevacizumab (AVASTIN®) que é um mAb anti-VEGF-A humanizado para o tratamento de câncer de cérebro, cólon, rim ou pulmão; Ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN®) que é um anticorpo monoclonal anti-CD20 para o tratamentoo de linfoma de non-Hodgkin; ofatumumab (ARZERRA® ) que é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humano para o tratamento de leukemia linfocítica crônica; panitumumab (VECTIBIX®) que é um anticorpo monoclonal anti- EGFR humano para o tratamento de câncer de cólon; rituximab (RITUXAN®) que é um anticorpo monoclonal quimérico anti-CD20 para o tratamento de leucemia linfocítica crônica e linfoma de non-Hodgkin; tositumomab (BEXXAR®) que é um anticorpo monoclonal anti-CD20 para o tratamento de linfoma de non-Hodgkin; trastuzumab (HERCEPTIN®) que é um anticorpo monoclonal de receptor anti-HER2 para o tratamento de câncer de mama e estômago; ipilimumab (YERVOY®) que é um anticorpo monoclonal humano anti-CTLA4 para o tratamento de melanoma; gemtuzumab e inotuzumab ozogamicina.
[0521] Em outra modalidade específica, L inclui anticorpos selecionados de anticorpos anti-I-13, incluindo anticorpos anti-I-13 usados no tratamento de câncer, por exemplo, anticorpos anti-IL-13R 2.
[0522] Em ainda outra modalidade específica, L inclui anticorpos selecionados de anticorpos anti-Notch, incluindo anticorpos anti-Notch usados no tratamento de câncer.
[0523] Em determinadas modalidades, o anticorpo L é ligado ao ligante via uma ligação de enxofre ou via uma ligação de enxofre-enxofre.
[0524] Outro aspecto da invenção refere-se a um conjugado de droga de anticorpo compreendendo quaisquer dos compostos acima mencionados.
[0525] Outro aspecto da invenção refere-se a um conjugado de droga de anticorpo compreendendo um anticorpo e quaisquer um dos compostos acima mencionados.
[0526] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a quaisquer dos conjugados de droga de anticorpo acima mencionados e definições dos mesmos, em que o composto é covalentemente ligado ao anticorpo.
[0527] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a quaisquer dos conjugados de droga de anticorpo acima mencionados e definições dos mesmos, em que o composto no dito conjugado de droga de anticorpo é selecionado do grupo que consiste nos compostos da Tabela 18B,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
O O O O O N S
[0528] ,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
O O O O O N S
[0529] ,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
[0530] O O O O O ,
O O H
H H2N N N N
O N N 6 H
[0531] O O O O O ,
O O O
H H H2N N N N
O N N OH 6 H
O O O O O
[0532] and
O O O
H H H2N N N N
O N N OH 6
O O O O O
[0533] .
[0534] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a quaisquer dos conjugados de droga de anticorpo acima mencionados e definições dos mesmos, em que o conjugado de droga de anticorpo compreende entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 compostos da invenção.
[0535] Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a quaisquer dos conjugados de droga de anticorpo acima mencionados e definições dos mesmos, em que o conjugado de droga de anticorpo compreende 3 ou 4 compostos da invenção.
[0536] A Unidade de Anticorpo (Ab)
[0537] Como observado acima, o termo "anticorpo" (ou "Ab"), que aqui é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos,
anticorpos policlonais, anticorpos mono-específicos, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos bi-específicos), e fragmentos de anticorpos que exibem a atividade biológica desejada. Além disso, enquanto que certos aspectos da invenção aqui descritos referem-se a conjugados de droga de anticorpo, é ainda previsto que a porção de anticorpo do conjugado pode ser substituída por qualquer coisa que se liga especificamente ou associa reativamente ou complexos com um receptor, o antígeno ou outra porção receptiva associada com uma determinada população de células-alvo. Por exemplo, em vez de conter um anticorpo, um conjugado da presente invenção pode conter uma molécula alvo que se liga a, complexos com, ou reage com um receptor, antígeno ou outra porção receptiva de uma população de célula procurada ser terapeuticamente ou de outra forma biologicamente modificada.
Exemplo de tais moléculas inclui as proteínas de peso molecular menores, polipeptídeo ou peptídeos, lectinas, glicoproteínas, não-peptídeos, vitaminas, moléculas transportadoras de nutrientes (tal como, mas não limitado a, transferrina), ou qualquer outra molécula ou substâncias de aglutinação de célula. Em certos aspectos, o anticorpo ou outra molécula alvo atua para distribuir uma droga para a população de células alvo em particular com a qual o anticorpo ou outra molécula alvo interage.
[0538] Os heteroátomos que podem estar presentes em uma unidade de anticorpo incluem enxofre (em uma modalidade, a partir de um grupo sulfidril de um anticorpo), oxigênio (em uma modalidade, a partir de um grupo carbonil, carboxil ou hidroxil de um anticorpo) e nitrogênio (em uma modalidade, a partir de um grupo amino primário ou secundário de um anticorpo). Estes heteroátomos podem estar presentes no anticorpo no estado natural do anticorpo, por exemplo, um anticorpo que ocorre naturalmente, ou podem ser introduzidos no anticorpo por meio da modificação química.
[0539] Em uma modalidade, uma unidade de anticorpo tem um grupo sulfidril e a unidade de anticorpo se liga através do átomo de enxofre do grupo sulfidril.
[0540] Em outra modalidade, o anticorpo tem resíduos de lisina que pode reagir com ésteres ativados (tais ésteres incluem, mas não são limitados a, N- hidroxissuccinimida, pentafluorofenil, e os ésteres de p-nitrofenil) e, assim, forma uma ligação amida que consiste em um átomo de nitrogênio da unidade de anticorpo e um carbonil.
[0541] Em ainda outro aspecto, a unidade de anticorpo tem um ou mais resíduos de lisina que pode ser quimicamente modificado para introduzir um ou mais grupos sulfidril. Os reagentes que podem ser usados para modificar as lisinas incluem, mas não são limitados a, N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA ) e 2-iminotiolano cloridrato (reagente de Traut).
[0542] Em outra modalidade, a unidade de anticorpo pode ter um ou mais grupos de carboidratos que podem ser quimicamente modificados para ter um ou mais grupos sulfidril.
[0543] Em ainda outra modalidade, a unidade de anticorpo pode ter um ou mais grupos de carboidratos que podem ser oxidados para fornecer um grupo aldeído (ver, por exemplo, Laguzza et al., 1989, J. Med. Chem. 32 (3):548-55). O aldeído correspondente pode formar uma ligação com um local reativo, tal como, por exemplo, hidrazina e hidroxilamina. Outros protocolos para a modificação de proteínas para a ligação ou associação de drogas estão descritos em Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002) (aqui incorporado por referência).
[0544] Quando os conjugados compreendem proteína não-imunorreativa, polipeptídeo, ou unidades de peptídeo em vez de um anticorpo, proteínas não- imunorreativas úteis, polipeptídeo, ou unidades de peptídeo incluem, mas não são limitados a, transferrina, fatores de crescimento epidérmico ("EGF"), bombesina,
gastrina, peptídeo liberador de gastrina, fator de crescimento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, fatores de crescimento transformadores ("PARA CIMA"), tais como TGF- e TGF- , fator de crescimento de vacina ("VGF"), insulina e fatores de crescimento I e II do tipo insulina, somatostatina, lectinas e apoproteína a partir de lipoproteína de baixa densidade.
[0545] Os anticorpos policlonais úteis são populações heterogêneas de moléculas de anticorpo derivadas do soro de animais imunizados. Os anticorpos monoclonais úteis são populações homogêneas de anticorpos para um determinante antigênico particular (por exemplo, um antígeno de células de câncer, um antígeno viral, um antígeno microbiano, uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um químico, ácido nucléico, ou fragmentos dos mesmos). Um anticorpo monoclonal (mAb) de um antígeno de interesse pode ser preparado utilizando qualquer técnica conhecida na área, que proporciona para a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura.
[0546] Os anticorpos monoclonais úteis incluem, mas não são limitados aos, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, fragmentos de anticorpos, ou anticorpos monoclonais quiméricos. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos por qualquer uma das numerosas técnicas conhecidas na área (por exemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; e Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
[0547] O anticorpo também pode ser um anticorpo bi-específico. Os métodos para produzir os anticorpos bi-específicos são conhecidos na técnica e são discutidos infra.
[0548] O anticorpo pode ser um fragmento funcionalmente ativo, um derivado ou análogo de um anticorpo que se liga imuno-especificamente a células alvo (por exemplo, antígenos de células de câncer, antígenos virais, ou antígenos microbianos), ou outros anticorpos que se ligam às células tumorais ou matriz. A este respeito, "funcionalmente ativo" significa que o fragmento, derivado ou análogo é capaz de induzir os anticorpos anti-anti-idiotipos que reconhecem o mesmo antígeno que o anticorpo a partir do qual o fragmento, derivado ou análogo é derivado reconhecido. Especificamente, em uma modalidade exemplar, a antigenicidade do idiotipo da molécula de imunoglobulina pode ser aumentada pela remoção de estruturas e sequências de CDR que estão no C-terminal para a sequência de CDR que reconhece especificamente o antígeno. Para determinar quais as sequências de CDR se ligam ao antígeno, peptídeos sintéticos contendo as sequências de CDR podem ser utilizados em ensaios de aglutinação com o antígeno por qualquer método de ensaio de aglutinação conhecido na técnica (por exemplo, o ensaio de núcleo de BIA) (para a localização das sequências de CDR, ver, por exemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat E et al., 1980, J.
Immunology 125 (3):961-969).
[0549] Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos tais como, mas não limitados a, F (ab')2, fragmentos de Fab, Fvs, anticorpos de cadeia simples, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, scFv, scFv-FV, ou qualquer outra molécula com o mesma especificidade como o anticorpo.
[0550] Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tais como os anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, compreendendo tanto as porções não- humanas e humanas, que podem ser feitas utilizando técnicas de DNA recombinante padrão, são os anticorpos úteis. Um anticorpo quimérico é uma molécula, na qual as porções diferentes são derivadas de diferentes espécies animais, tais como, por exemplo, as que possuem uma região variável derivada de um monoclonal de murino e regiões constantes de imunoglobulina humana. (Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567; e Patente U.S. No. 4.816.397, as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade). Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo a partir de espécies não-humanas possuindo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a partir de espécies não-humanas e uma região de estrutura a partir de uma molécula de imunoglobulina humana. (Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.585.089, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, utilizando os métodos descritos na Publicação Internacional No. WO 87/02671; Publicação da Patente Européia No. 0 184 187; Publicação da Patente Européia No. 0 171 496; Publicação da Patente Européia No. 0 173 494; Publicação Internacional No. WO 86/01533; Patente U.S. No. 4.816.567; Publicação da Patente Européia No. 012 023; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202- 1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente U.S. No. 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; e Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060; cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[0551] Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis e podem ser produzidos utilizando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar os genes de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina endógena, mas que podem expressar os genes de cadeia pesada e leve humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados da forma normal com um antígeno selecionado, por exemplo, totalidade ou uma porção de um polipeptídeo da invenção. Os anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humanos abrigados pelos camundongos transgênicos reorganizam durante a diferenciação de célula B e, posteriormente, submetem-se à mudança de classe e mutação somática. Assim, usando esta técnica, é possível produzir anticorpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, por exemplo, Patentes U.S. Números 5.625.126;
5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Outros anticorpos humanos podem ser obtidos comercialmente a partir de, por exemplo, Abgenix, Inc. (agora Amgen, Freemont, Califórnia) e Medarex (Princeton, N.J.).
[0552] Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados utilizando uma técnica conhecida como "seleção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não-humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é utilizado para orientar a seleção de um anticorpo completamente humano reconhecendo o mesmo epítopo. (Ver, por exemplo, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na área, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (ver, por exemplo, Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan e Carter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, In anti-IgE e Allergic Disease, Jardieu e Fick, eds., Marcel Dekker, New York, N.Y., Chapter 20, pp. 427- 469).
[0553] Em outras modalidades, o anticorpo é uma proteína de fusão de um anticorpo, ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, por exemplo, em que o anticorpo é fundido por meio de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação de peptídeo), quer o N-terminal ou o C-terminal a uma sequência de aminoácido de outra proteína (ou porção do mesmo, de preferência pelo menos 10, 20 ou 50 porção de aminoácido da proteína) que não é de um anticorpo. De preferência, o anticorpo ou fragmento do mesmo é ligado de forma covalente à outra proteína no N-terminal do domínio constante.
[0554] Anticorpos incluem análogos e derivados que são modificados, isto é, por meio da ligação covalente de qualquer tipo de molécula, assim como tal ligação covalente permite que o anticorpo retenha a sua imuno-especificidade de aglutinação de antígeno. Por exemplo, mas não por meio de limitação, derivados e análogos dos anticorpos incluem aqueles que têm sido adicionalmente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas incluindo, mas não limitadas a, clivagem química específica, acetilação, formilação, sínteses metabólicas na presença de tunicamicina, etc. Além disso, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não-naturais.
[0555] Os anticorpos podem ter modificações (por exemplo, substituições, deleções ou adições) nos resíduos de aminoácido que interagem com os receptores de Fc. Em particular, os anticorpos podem ter modificações em resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interação entre o domínio de anti-Fc e o receptor de FcRn (ver, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 97/34631, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade).
[0556] Os anticorpos imuno-específicos para um antígeno de células de câncer podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido a um versado na técnica, tais como, por exemplo, sínteses químicas ou técnicas de expressão recombinantes. A sequência de nucleotídeo que codifica os anticorpos imuno-específicos para um antígeno de células de câncer pode ser obtida, por exemplo, a partir da base de dados GenBank ou uma base de dados similar a mesma, publicações de literatura, ou por clonagem e sequenciação de rotina.
[0557] Em uma modalidade específica, os anticorpos conhecidos para o tratamento do câncer podem ser usados. Os anticorpos imuno-específicos para um antígeno de células de câncer podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido de um versado na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de expressão recombinantes. A sequência de nucleotídeo que codifica os anticorpos imuno-específicos para um antígeno de células de câncer pode ser obtida, por exemplo, a partir da base de dados de GenBank, ou uma base de dados como a mesma, as publicações de literatura, ou por clonagem e sequenciação de rotina.
Exemplos de anticorpos disponíveis para o tratamento de câncer incluem, mas não são limitados a, OVAREX®, que é um anticorpo de murino para o tratamento de câncer do ovário; PANOREX® (Glaxo Wellcome, NC), que é um anticorpo de IgG2a de murino para o tratamento do câncer colo-retal; cetuximab ERBITUX® (Imclone Systems Inc., NY), que é um anticorpo quimérico anti-EGFR IgG para o tratamento de cânceres positivos do fator de crescimento epidérmico, tais como câncer de cabeça e pescoço; Vitaxin® (MedImmune, Inc., MD) que é um anticorpo humanizado para o tratamento de sarcoma; CAMPATH I/H® (Leukosite, MA), que é um anticorpo de IgG1 humanizado para o tratamento de leucemia linfocítica crônica (CLL); SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA), que é um anticorpo anti-HLA-DR humanizado para o tratamento de linfoma de não-Hodgkin; ONCOLYM® (Techniclone, Inc., CA), que é um anticorpo anti-HLA-Dr10 de murino radio-rotulado para o tratamento de linfoma de não-Hodgkin; ALLOMUNE® (BioTransplant, CA), que é um mAb anti-CD2 humanizado para o tratamento da doença de Hodgkin ou linfoma de não-Hodgkin; CEACIDE® (Immunomedics, NJ), que é um anticorpo de anti-CEA humanizado para o tratamento de câncer colo-retal; AVASTIN® (Genentech/Roche, CA), que é um mAb anti-VEGF-A humanizado para o tratamento do cérebro, cólon, rim, ou câncer do pulmão; ZEVALIN® (Spectrum Pharmaceuticals, NV), que é um anticorpo monoclonal anti-CD20 para o tratamento de linfoma de não-Hodgkin; ARZERRA® (GSK, Reino Unido), que é um anticorpo monoclonal de anti-CD20 humano para o tratamento de leucemia linfocítica crônica; VECTIBIX® (Amgen, CA), que é um anticorpo monoclonal de anti-EGFR humano para o tratamento de câncer do cólon; RITUXAN® (Genentech/BioGen, CA), que é um anticorpo monoclonal quimérico de anti-CD20 para o tratamento de leucemia linfocítica crônica e linfoma de não- Hodgkin; BEXXAR® (GSK, Reino Unido), que é um anticorpo monoclonal de anti- CD20 para o tratamento de linfoma de não-Hodgkin; HERCEPTIN® (Genentech, CA) que é um anticorpo monoclonal de receptor de anti-HER2 para o tratamento de câncer da mama e do estômago; YERVOY® (BMS, NJ), que é um anticorpo monoclonal humano de anti-CTLA4, para o tratamento de melanoma; MYLOTARG® (Wyeth/Pfizer, NY), que é anticorpo monoclonal humanizado de anti-CD33 conjugado a calicheamicina para o tratamento de leucemia mielóide aguda; e, inotuzumab ozogamicina (Wyeth/Pfizer, NY), que é um anticorpo monoclonal humanizado de anti-CD22 conjugado a calicheamicina para o tratamento de leucemia linfocítica aguda e linfoma de não-Hodgkin.
[0558] Em outra modalidade específica, os anticorpos de anti-IL13, incluindo os anticorpos de anti-IL13 utilizados no tratamento de câncer, podem ser usados.
[0559] Em outra modalidade específica, os anticorpos de anti-Notch, incluindo anticorpos de anti-Notch utilizados no tratamento de câncer, podem ser usados.
[0560] Em tentativas para descobrir alvos celulares eficazes para o diagnóstico e terapia do câncer, os investigadores procuraram identificar a transmembrana, ou de outra forma, polipeptídeos associados ao tumor que são especificamente expressos na superfície de um ou mais tipos particulares de célula de câncer em comparação com uma ou mais células não-cancerosas normais. Muitas vezes, estes polipeptídeos associados a tumores são mais abundantemente expressos na superfície das células de câncer em comparação com a superfície das células não- cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfície celular associados a tumor proporcionou a possibilidade para células de câncer especificamente alvo através de terapias baseadas em anticorpo.
[0561] Sínteses de Compostos e Conjugados de Droga de Anticorpo dos Mesmos
[0562] Os compostos e conjugados da presente invenção podem ser feitos utilizando os procedimentos sintéticos descritos abaixo na Exemplificação.
[0563] Como descrito em mais detalhe abaixo, os compostos e conjugados da presente invenção podem ser preparados usando uma seção de uma unidade ligante tendo um local reativo para a aglutinação ao composto.
[0564] Ligante
[0565] Um ligante (algumas vezes referido como "[ligante]" aqui) é um composto bifuncional que pode ser utilizado para ligar uma droga e um anticorpo para formar um conjugado de droga de anticorpo (ADC). Esses conjugados são úteis, por exemplo, na formação de imunoconjugados direcionados contra os antígenos associados ao tumor. Tais conjugados permitem a distribuição seletiva de drogas citotóxicas para as células tumorais.
[0566] Em uma modalidade, o ligante tem a fórmula:
[0567] é ou em que:
[0568] Y é C2-C20 alquileno ou C2-C20 heteroalquileno; C3-C8 carbociclo-, -arileno-, C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno, - C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)- C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-; Zé ,
O H N H O N
O R10 N O
O , O O NH2 ou –NH2;
[0569] R7 é selecionado, independentemente, para cada ocorrência a partir do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3;
[0570] R10 é hidrogênio, -C1-C10 alquil, -C3-C8 carbociclo, aril, -C1-C10 heteroalquil, - C3-C8 heterociclo, -C1-C10 alquileno-aril, -arileno-C1-C10 alquil, -C1-C10 alquileno-(C3- C8 carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquil, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo), e -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquil, onde aril em R10 que compreende aril é opcionalmente substituído com [R7]h; e
[0571] h é 1, 2, 3, 4 ou 5.
[0572] Em um ADC, oo ligante serve para fixar a carga para o anticorpo.
[0573] Em um aspecto, uma segunda seção da unidade ligante é introduzida, a qual tem um segundo local reativo, por exemplo, um grupo eletrofílico que é reativo a um grupo nucleofílico presente em uma unidade de anticorpo (por exemplo, um anticorpo). Grupos nucleofílicos úteis sobre um anticorpo incluem, mas não são limitados a, grupos sulfidril, hidroxil e amino. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofílico para uma unidade ligante e forma uma ligação covalente com uma unidade ligante. Grupos eletrofílicos úteis incluem, mas não são limitados a, grupos maleimida e haloacetamida. O grupo eletrofílico proporciona um local conveniente para a ligação do anticorpo.
[0574] Em outra modalidade, uma unidade ligante tem um local reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente em um anticorpo.
Grupos eletrofílicos úteis sobre um anticorpo incluem, mas não são limitados a, grupos aldeído e cetona carbonil. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de uma unidade ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente ao anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis sobre uma unidade ligante incluem, mas não são limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, hidrazina carboxilato, e arylhidrazida. O grupo eletrofílico de um anticorpo proporciona um local conveniente para a ligação a uma unidade ligante.
[0575] Grupos funcionais amino são também locais reativos úteis para uma unidade ligante, porque os mesmos podem reagir com o ácido carboxílico, ou ésteres ativados de um composto de modo a formar uma ligação amida.
Tipicamente, os compostos à base de peptídeos da invenção podem ser preparados através da formação de uma ligação de peptídeo entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Tais ligações de peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (ver, por exemplo, Schroder e Lubke, "The Peptides", Volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeo.
[0576] Como descrito em mais detalhe abaixo, os conjugados podem ser preparados utilizando uma seção do ligante possuindo um local reativo para a aglutinação a um composto da invenção e introduzindo outra seção da unidade ligante tendo um local reativo para um anticorpo. Em um aspecto, uma unidade ligante tem um local reativo que tem um grupo eletrofílico que é reativo com um grupo nucleofílico presente em uma unidade de anticorpo, tal como um anticorpo. O grupo eletrofílico proporciona um local conveniente para a ligação do anticorpo.
Grupos nucleofílicos úteis sobre um anticorpo incluem, mas não são limitados a, grupos sulfidril, hidroxil e amino. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofílico para uma unidade ligante e forma uma ligação covalente a uma unidade ligante. Grupos eletrofílicos úteis incluem, mas não são limitados a, grupos maleimida e haloacetamida.
[0577] Em outra modalidade, uma unidade ligante tem um local reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo com um grupo eletrofílico presente em uma unidade de anticorpo. O grupo eletrofílico em um anticorpo proporciona um local conveniente para a ligação a uma unidade ligante. Grupos eletrofílicos úteis sobre um anticorpo incluem, mas não são limitados a, grupos aldeído e cetona carbonil. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de uma unidade ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente ao anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis sobre uma unidade ligante incluem, mas não são limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, hidrazina carboxilato e arilhidrazida.
[0578] Como utilizado aqui, "mc-" anteriormente conhecido como "MalC-" refere-se a .
[0579] Como utilizado aqui, "mcValCitPABC-" anteriormente conhecido como "MalCValCitPABC-" refere-se a .
O O N O X
[0580] Como utilizado aqui, "MalPegXC2-" refere-se a O .
O H2N
O
[0581] Como utilizado aqui, "AmPegXC2-" refere-se a X .
[0582] Como utilizado aqui, "mcValCitPABCAmPegXC2-" refere-se a
O O O O O O N H H X N N O N N O H H O
NH O NH2 .
[0583] Como utilizado aqui, "MalPegXC2ValCitPABC-" refere-se a
O O O O O H N N O X N N O H H O
NH O NH2 .
O H
N Br O
X
[0584] Como utilizado aqui, "2BrAcPegXC2" refere-se a O .
O N
[0585] Como utilizado aqui, "mv-" refere-se a O O .
O O N
[0586] Como utilizado aqui, "mb-" refere-se a O .
O N
[0587] Como utilizado aqui, "me-" refere-se a O O .
O N
[0588] Como utilizado aqui, "MalC6-" refere-se a O .
[0589] Como utilizado aqui, "PFPCOPegXC2ValCitPABC-" refere-se a
F O F F O O O O H O N F O X N N H H F O
NH O NH2 .
[0590] Como utilizado aqui, "PFPCOPegXC2AmPegYC2-" refere-se a
F F F O O H N F O O O X X F O .
[0591] Como utilizado aqui, "PFPCOPegXC2AlaAlaAsnPABC-" refere-se a F NH2
F F O O O O H H F O O N N N X N H H F O O O O . F F F O O F O O X
[0592] Como utilizado aqui, "PFPCOPegXC2-" refere-se a F .
[0593] Como utilizado aqui, "PFPCOPegXC2AmPegYC2PABC-" refere-se a
F F F O O O H N O F O O O N X X H F O . O O N N H
[0594] Como utilizado aqui, "mcGly-" refere-se a O O .
[0595] Como utilizado aqui, "AzCOC2Ph4AmPeg1C1-" refere-se a
O O O H H N N O N N H H N O O O
O O NH H2 N O .
[0596] Como utilizado aqui, "AcLysValCitPABC-" refere-se a .
[0597] Conjugação com Transglutaminase
[0598] Em certas modalidades, um composto da invenção pode ser covalentemente reticulado a um polipeptídeo contendo Fc ou contendo Fab construído com uma etiqueta contendo glutamina doadora de acil (por exemplo,
etiquetas de peptídeo contendo Gln ou etiquetas Q) ou uma glutamina endógena feita reativa (isto é, a capacidade de formar uma ligação covalente como um doador de acil, na presença de uma amina e de uma transglutaminase) por construção de polipeptídeo (por exemplo, através de deleção de aminoácido, inserção, substituição, mutação, ou qualquer combinação dos mesmos no polipeptídeo), na presença de transglutaminase, desde que o composto da invenção compreende um agente doador de amina (por exemplo, pequena molécula que compreende ou acoplada a uma amina reativa), formando assim uma população estável e homogênea de um conjugado de polipeptídeo contendo Fc de construção com o agente doador de amina sendo local especificamente conjugado com o polipeptídeo contendo Fc ou contendo Fab através da etiqueta contendo glutamina doadora de acil ou a glutamina endógena exposta/acessível/reativa. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser conjugados, como descritos no Pedido de Patente Internacional No. de série PCT/IB2011/054899, cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência. Em certas modalidades, para facilitar a conjugação do composto da invenção a um polipeptídeo contendo Fc ou contendo Fab de construção com uma etiqueta contendo glutamina doadora de acil ou uma glutamina endógena feita reativa por construção de polipeptídeo na presença de transglutaminase, Z é NH2.
[0599] Conjugação à Região Constante de Domínio Kappa de Cadeia Leve Humana
[0600] Em certas modalidades, um composto da invenção pode ser ligado de forma covalente à cadeia lateral de K188 da região constante de domínio kapa de cadeia leve humana (CL ) (numeração da cadeia leve completa de acordo com Kabat).
K188 também pode ser denominado CL K80, quando contando apenas a região constante kappa humana, por exemplo, das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 e 4).
[0601] Por exemplo, os compostos da invenção podem ser conjugados, como descritos no Pedido de Patente U.S. Número de Série 13/180.204, ou WO2012/007896 cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência. Em certas modalidades, para facilitar a conjugação para K188 CL (CL -K80), Z é ; R7 é selecionado, independentemente, para cada ocorrência a partir do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3; e h é 1, 2, 3, 4 ou 5.
[0602] Em certas modalidades, para facilitar a conjugação de K188 CL (CL -K80), Z é ;
[0603] A presente invenção ainda proporciona os conjugados de droga de anticorpo que compreendem um anticorpo, ou porções de aglutinação de antígeno dos mesmos, que compreende um domínio kappa constante covalentemente conjugado a uma toxina da invenção, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma toxina da invenção é covalentemente conjugada com K80 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 (Tabela 1). Em alguns aspectos, o número de toxinas da invenção conjugada de forma covalente ao K80 pode ser uma faixa, cujo limite inferior é selecionado a partir do grupo que consiste em cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, e cerca de 2,0, e cujo limite superior é selecionado a partir do grupo que consiste em cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5. Em alguns aspectos, p é cerca de 2.
[0604] A conjugação da toxina com o domínio leve constante de um anticorpo é particularmente desejável para minimizar ou prevenir, qualquer interferência com a aglutinação da porção Fc do anticorpo a receptores de Fc (tais como. Fc R e FcRn) ou aglutinação do anticorpo ao seu respectivo alvo. Reciprocamente, a conjugação da respectiva toxina para a porção Fe de um anticorpo pode reduzir a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou a sua capacidade de interagir com o sistema imune (função efetora). A conjugação da toxina na região de cadeia pesada variável (VH) ou cadeia leve variável (VL) do anticorpo transporta um risco de diminuir a aglutinação do anticorpo para o seu cognato.
[0605] Além disso, ao passo que a conjugação a CL -K80 é confiável e robusta a outras lisinas de superfície de anticorpo, cada uma da reatividade ligeiramente diferente e pI podem resultar em uma amostra heterogênea de anticorpos conjugados que podem distribuir as moléculas conjugadas em momentos inoportunos ou irregulares, tais como durante a circulação e antes da distribuição da Porção Efetora para o alvo pelo reconhecimento de anticorpo.
[0606] Além disso, a presente invenção proporciona para polimorfismos conhecidos da cadeia kappa V/A na posição 45 e A/L na posição 83 (fornecendo os 3 polimorfismos kappa constantes humanos identificados Km (1): V45/L83 (SEQ ID NO: 2), Km (1,2): A45/L83 (SEQ ID NO: 3), e Km (3) A45/V83 (SEQ ID NO: 4)). A variabilidade dos resíduos nas posições 45 e 83 na SEQ ID NO: 1 pode ser selecionada de modo a proporcionar apenas para qualquer um, dois ou todos os três de polimorfismos Km (1), Km (1,2), e Km (3).
Tabela 1
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA
NO 1 região GENUS TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN de hLC FYPREAKVQW KVDNxLQSGN SQESVTEQDS constante KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKxYACEVTH
QGLSSPVTKS FNRGEC 2 Polimorfismo TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN Km(1) de região FYPREAKVQW KVDNVLQSGN constant h LC SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK (V45/L83) HKLYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC 3 Polimorfismo Km (1,2) de TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN região constant FYPREAKVQW KVDNALQSGN h LC A45/L83 SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
HKLYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC 4 Polimorfismo Km (3) de TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN região constant FYPREAKVQW KVDNALQSGN h LC A45/V83 SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
[0607] em que X na posição 45 é A ou V, e X na posição 83 é L ou V.
[0608] Em certas modalidades, a invenção proporciona uma composição que compreende um composto da invenção conjugado de forma covalente a um anticorpo (ou porção de aglutinação de antígeno do mesmo), em que pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% do composto da invenção, em que a composição é conjugada com o anticorpo ou porção de aglutinação de antígeno do mesmo em K188 CL .
[0609] Em certas modalidades, os compostos da invenção , ,
[0610] e podem ser conjugados ao local de combinação de um anticorpo catalítico, tais como anticorpos aldolase, ou porção de aglutinação de antígeno dos mesmos. Anticorpos aldolase contêm anticorpos, porções de local de combinação que, quando livres (por exemplo, por conjugação), catalisam uma reação de adição de aldol entre um doador de cetona alifático e um aceptor de aldeído. Os conteúdos da Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US 2006/205670 são incorporados aqui por referência, em particular, as páginas 78-118 descrevem os ligantes, e parágrafos [0153]-[0233] descrevem os anticorpos, fragmentos úteis, variantes e modificações dos mesmos, h38C2, locais de combinação e regiões determinantes complementares (CDRs), e tecnologia de anticorpo relacionada (Tabela 2, e compostos exemplares abaixo):
O H O H O H N N N N O OH O N N O O O O O O N
[0611] O O ,
N O O H H N N N S O O N N H H H O O N N O O O O N N H H N O O O O O NH
[0612] H2N O ,
N O O H H N N N S O O N N H H H O O N N O O O O N N H H N O O O O O NH
[0613] H 2N O e
N H O O H H N N O N N S O N N H O O N O O O O
[0614] O O
[0615] O termo "local de combinação" inclui CDRs e os resíduos de estrutura adjacentes que estão envolvidos na aglutinação de antígeno.
Tabela 2
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA
NO 5 h38C2 VL ELQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLL
HTYGSPYLNW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAV
YFCSQGTHLP YTFGGGTKVE IK 6 h38C2 VH EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
NYWMSWVRQS PEKGLEWVSE IRLRSDNYAT HYAESVKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTGIYYCKT YFYSFSYWGQ GTLVTVSS
7 h38C2 LC ELQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLL
HTYGSPYLNW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAV YFCSQGTHLP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE
VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 8 h38C2 HC EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
NYWMSWVRQS PEKGLEWVSE IRLRSDNYAT HYAESVKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTGIYYCKT YFYSFSYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
[0616] Conjugação com ligantes que compreendem succinimidas, incluindo as versões de anel aberto
[0617] Em certas modalidades, a presente invenção inclui um composto da invenção conjugado através de um ligante à base de succinimida ou um ligante à base de succinimida de anel aberto. A estabilidade da ligação de succinimida- cisteína tornou-se uma área de interesse crescente. Succinimidas podem ser transferidas tanto in vitro como in vivo para os nucleófilos de tiol exógenos, presumivelmente através de uma reação de retro-Michael resultando em uma maleimida que é, subsequentemente, atacada por um tiol. Acredita-se que a hidrólise dos resultados do anel em uma espécie que é resistente à reação de retro- Michael. Isto torna o conjugado resultante mais estável e potencialmente mais eficaz. As condições podem ser otimizadas para abrir forçosamente o anel de succinimida no conjugado. Condições básicas resultaram na hidrólise fácil do anel.
Por exemplo, os ligantes contendo uma cadeia de polietileno glicol (PEG) podem ser hidrolisados a pH 9,2 a 37°C em cerca de 12 horas, e ligantes que contêm uma cadeia de alquil, tal como "mc", podem exigir uma temperatura mais elevada e tempo de reação maior, a fim de direcionar o anel de abertura para conclusão.
O 50 mM borate buffer, pH 9.2
O O Payload 37° C, 12h N S O Payload x N
O H x O O CO 2H
S "MalPegx C2" "Mal(H2O)Pegx C2" 50 mM borate buffer, pH 9.2 O CO2 H O 45° C, 48h O
H
N S N Payload S Payload
O O "mc" "m(H2O)c"
[0618] Exemplo de hidrólises forçadas de conjugados à base de maleimida
[0619] A fim de avaliar a estabilidade destes conjugados e dar prioridade às amostras para a avaliação in vivo, um ensaio foi desenvolvido que envolve o tratamento dos conjugados ligados à maleimida com excesso de glutationa aquosa (GSH) ou plasma. Alíquotas da mistura de reação foram analisadas em vários pontos de tempo para determinar o carregamento do conjugado, utilizando a metodologia descrita acima. Os resultados (Tabela 24) mostram que a ligação de droga-anticorpo é lentamente clivada de um modo dependente de GSH. Como esperado, a taxa de clivagem é altamente dependente da hidrólise do anel succinimida. Mais importante, estes resultados parecem traduzir a exposição de PK melhorada, como medido por um aumento na área sob a curva (AUC) do conjugado e por um aumento na taxa de exposição de conjugado/Ab.
[0620] Método para avaliar a estabilidade de ADCs
[0621] A amostra de ADC (30 µg) em PBS é misturada com uma solução de glutationa (GSH) para produzir uma concentração final de 0,5 mM de GSH e 3 mg/mL de concentração de proteína. Uma amostra de controle (sem GSH) foi igualmente preparada a partir de 30 µg de ADC diluída para 3 mg/mL em PBS. A amostra de ADC tratada com GSH e amostra de ADC de controle foram incubadas a 37°C e foram amostradas a 0, 3, e 6 dias. As alíquotas foram reduzidas com excesso de TCEP, acidificadas por adição de 0,1% de solução de ácido fórmico com 10% de acetonitrila e analisadas para o carregamento por LC/MS como descrito abaixo.
[0622] Análises da amostra: As análises foram realizadas utilizando uma HPLC capilar Aglient 1100 acoplada com espectrômetro de massa Waters Xevo G2 Q- TOF. Os analitos foram carregados para uma coluna Zorbax Poroshell 300SB C8 (0,5 mm x 75 mm mantida a 80⁰C) com 0,1% de ácido fórmico, e eluídos usando um gradiente de 20-40% de tampão B (80% de acetonitrila, 18% de 1-propanol, 2% de água com 0,1% de ácido fórmico), a uma taxa de fluxo de 20 µl/min durante 5,5 minutos. Detecção por espectrometria de massa foi realizada no modo positivo, sensibilidade com a tensão capilar fixada em 3,3 kV. As análises dos dados foram realizadas com a função MaxEnt 1 em MassLynx e intensidades foram usadas para o cálculo de carga com base na fórmula descrita anteriormente.
[0623] Composições e Métodos de Administração
[0624] Em outras modalidades, um outro aspecto da invenção refere-se a composições farmacêuticas incluindo uma quantidade eficaz de um composto da invenção e/ou o conjugado da droga de anticorpo do mesmo, e um transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, as composições são adequadas para administração humana ou veterinária.
[0625] As presentes composições farmacêuticas podem ser em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um líquido ou sólido. As vias típicas de administração incluem, sem limitação, parentérica, ocular e intratumoral. A administração parenteral inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular ou intrasternal ou técnicas de infusão. Em um aspecto, as composições são administradas por via parentérica. Em uma modalidade específica, as composições são administradas por via intravenosa.
[0626] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo a permitir que um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo para ser biodisponível por administração da composição a um paciente. As composições podem assumir a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que, por exemplo, um comprimido pode ser uma única unidade de dosagem, e um recipiente de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo sob a forma líquida pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem.
[0627] Os materiais utilizados na preparação das composições farmacêuticas podem ser não-tóxicos nas quantidades utilizadas. Será evidente para os versados na técnica que a dose ótima de ingredientes ativos na composição farmacêutica dependerá de uma variedade de fatores. Os fatores relevantes incluem, sem limitação, o tipo de animal (por exemplo, ser humano), a forma particular de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo, o modo de administração, e a composição empregada.
[0628] O transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável pode ser sólido ou em partículas, de modo que as composições estão, por exemplo, em forma de comprimido ou pó. Os veículos podem ser líquidos. Além disso, os veículos podem ser em partículas.
[0629] A composição pode estar na forma de um líquido, por exemplo, uma solução, emulsão, ou suspensão. Em uma composição para a administração por injeção, um ou mais de um tensoativo, conservante, agente umedecedor, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotônico podem também ser incluídos.
[0630] As composições líquidas, quer sejam soluções, suspensões ou outra forma similar, podem também incluir um ou mais dos seguintes: diluentes estéreis, tais como água para injeção, solução salina, de preferência solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como mono sintéticos ou diglicerídeos que podem servir como o solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões, tais como acetatos, citratos, fosfatos ou aminoácidos e agentes para o ajustamento da tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. Uma composição parenteral pode ser fechada em ampolas, uma seringa descartável ou um frasco de dose múltipla feito de vidro, plástico ou outro material. Solução salina fisiológica é um adjuvante exemplar. Uma composição injetável é, de preferência, estéril.
[0631] A quantidade de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo, que seja eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição particular, dependerá da natureza do distúrbio ou condição, e pode ser determinado por técnicas clínicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro ou em in vivo podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ótimas. A dose precisa a ser empregada nas composições também irá depender da via de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente.
[0632] As composições compreendem uma quantidade eficaz de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo, de tal modo que uma dosagem adequada será obtida. Tipicamente, esta quantidade é, pelo menos, cerca de 0,01% de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo, em peso, da composição. Em uma modalidade exemplar, as composições farmacêuticas são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral contém entre cerca de 0,01% a cerca de 2%, em peso, da quantidade de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo.
[0633] Para administração intravenosa, a composição pode compreender de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo por kg de peso corporal do paciente. Em um aspecto, a composição pode incluir de cerca de 1 a cerca de 100 mg de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo por kg de peso corporal do paciente. Em outro aspecto, a quantidade administrada irá estar na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo.
[0634] Geralmente, a dosagem de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo administrado a um paciente é tipicamente de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 20 mg/kg de peso corporal do paciente. Em um aspecto, a dosagem administrada a um paciente é dentre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal do paciente. Em outro aspecto, a dosagem administrada a um paciente é dentre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do paciente. Em ainda outro aspecto, a dosagem administrada a um paciente é dentre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 5 mg/kg de peso corporal do paciente. Em ainda outro aspecto, a dosagem administrada é dentre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 3 mg/kg de peso corporal do paciente. Em ainda outro aspecto, a dosagem administrada é dentre cerca de 1 mg/kg a cerca de 3 mg/kg de peso corporal do paciente.
[0635] Um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolus. Administração pode ser sistêmica ou local. Vários sistemas de distribuição são conhecidos, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., e podem ser utilizados para administrar um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo. Em certas modalidades, mais do que um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo são administrados a um paciente.
[0636] Em modalidades específicas, pode ser desejável administrar um ou mais compostos da invenção e/ou os conjugados de droga de anticorpo dos mesmos localmente à área com necessidade de tratamento. Isto pode ser conseguido, por exemplo, e não por meio de limitação, por infusão local durante a cirurgia; aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo da ferida depois da cirurgia; por injeção; por meio de um cateter; ou por meio de um implante, o implante sendo de um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas silásticas, ou fibras. Em uma modalidade, a administração pode ser por injeção direta no local (ou local antigo) de câncer, tumor ou tecido neoplásico ou pré- neoplásico. Em outra modalidade, a administração pode ser por injeção direta no local (ou local antigo) de uma manifestação de uma doença auto-imune.
[0637] Em ainda outra modalidade, o composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo podem ser distribuídos em um sistema de liberação controlada, tal como, mas não limitado a, uma bomba ou vários materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo do composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo, por exemplo, o fígado, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada discutidos na revista por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)) podem ser utilizados.
[0638] O termo "transportador" refere-se a um diluente, adjuvante ou excipiente, com o qual um composto ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo é administrado. Tais transportadores farmacêuticos podem ser líquidos, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou de origem sintética. Os transportadores podem ser soro e similares. Além disso, agentes auxiliares, estabilizantes e outros podem ser utilizados. Em uma modalidade, quando administrados a um paciente, os compostos ou conjugados e transportadores farmaceuticamente aceitáveis são estéreis. A água é um transportador exemplar quando o composto ou conjugado é administrado por via intravenosa. As soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. As presentes composições, se desejado, também podem conter quantidades menores de agentes umedecedores ou emulsionantes, ou agentes de tamponamento de pH.
[0639] As presentes composições podem tomar a forma de soluções, péletes, pós, formulações de liberação controlada, ou qualquer outra forma adequada para uso.
Outros exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.
[0640] Em uma modalidade, o composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo são formulados de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a animais, particularmente seres humanos. Tipicamente, os transportadores ou veículos para administração intravenosa são soluções tampão aquosas isotônicas estéreis. Sempre que necessário, as composições podem também incluir um agente solubilizante. As composições para administração intravenosa podem incluir opcionalmente um anestésico local, tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos quer separadamente ou misturados juntos na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente selado, tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de agente ativo.
Onde um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo estão sendo administrados por infusão, os mesmos podem ser dispensados, por exemplo, com um frasco de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou solução salina. Onde o composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo são administrados por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[0641] A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um invólucro de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o invólucro de revestimento são normalmente inertes, e podem ser selecionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes activos podem ser incorporados em uma cápsula de gelatina.
[0642] Seja na forma sólida ou líquida, as presentes composições podem incluir um agente farmacológico utilizado no tratamento de câncer.
[0643] Usos Terapêuticos de Compostos e Conjugados de Droga de Anticorpo dos Mesmos
[0644] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de utilização dos compostos da invenção e conjugados de droga de anticorpo dos mesmos para tratar o câncer.
[0645] Os compostos da invenção e/ou os conjugados de droga de anticorpo dos mesmos, são úteis para a inibição da multiplicação de uma célula de tumor ou célula de câncer, causando apoptose em um tumor ou célula de câncer, ou para tratar o câncer em um paciente. Os compostos da invenção e/ou os conjugados de droga de anticorpo dos mesmos, podem ser utilizados de acordo com uma variedade de configurações para o tratamento de cânceres em animais. Os referidos conjugados podem ser utilizados para distribuir um composto da invenção para uma célula de tumor ou célula de câncer. Sem estar limitado pela teoria, em uma modalidade, o anticorpo do conjugado se liga a, ou se associa com uma célula de câncer ou um antígeno associado a células de tumor, e o conjugado pode ser feito até (internalizado) dentro de uma célula de tumor ou células de câncer através de endocitose mediada por receptor ou outro mecanismo de internalização. O antígeno pode ser ligado a uma célula de tumor ou célula de câncer, ou pode ser uma proteína da matriz extracelular associada à célula de tumor ou célula de câncer. Em certas modalidades, uma vez no interior da célula, uma ou mais sequências de peptídeo específicas são enzimática ou hidroliticamente clivadas por uma ou mais células de tumor ou proteases associadas a células de câncer, resultando na liberação de um composto da invenção a partir do conjugado. O composto liberado da invenção é, em seguida, livre para migrar dentro da célula e induzir as atividades citotóxicas ou citostáticas. O conjugado pode também ser clivado por uma protease intracelular para distribuir um composto da invenção. Em uma modalidade alternativa, o composto da invenção é clivado a partir do conjugado no exterior da célula de tumor ou célula de câncer, e o composto da invenção posteriormente penetra na célula.
[0646] Em certas modalidades, os conjugados fornecem tumor específico de conjugação ou droga de câncer alvo, reduzindo assim a toxicidade geral dos compostos da invenção.
[0647] Em outra modalidade, a unidade de anticorpo se liga à célula de tumor ou célula de câncer.
[0648] Em outra modalidade, a unidade de anticorpo se liga a uma célula de tumor ou antígeno da célula de câncer, que está na superfície da célula de tumor ou célula de câncer.
[0649] Em outra modalidade, a unidade de anticorpo se liga a uma célula de tumor ou antígeno da célula de câncer, que é uma proteína da matriz extracelular associada à célula de tumor ou célula de câncer.
[0650] A especificidade da unidade de anticorpo para uma célula de tumor em particular ou célula de câncer pode ser importante para a determinação desses tumores ou cânceres que são tratados de forma mais eficaz.
[0651] Tipos particulares de cânceres que podem ser tratados com um composto da invenção e/ou conjugado de droga de anticorpo do mesmo, incluem, mas não são limitados a, carcinoma da bexiga, mama, colo do útero, cólon, endométrio, rim, pulmão, esófago, ovário, próstata, pâncreas, pele, estômago, e testículos; e cânceres através do sangue, incluindo mas não limitadosm a, leucemias e linfomas.
[0652] Terapia de Multimodalidade para o Câncer. Cânceres, incluindo, mas não limitados a, um tumor, metástase, ou outra doença ou distúrbio caracterizado por um crescimento celular descontrolado, podem ser tratados ou inibidos pela administração de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo.
[0653] Em outras modalidades, os métodos para o tratamento do câncer são fornecidos, incluindo a administração a um paciente em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo e um agente quimioterapêutico. Em uma modalidade, o agente quimioterapêutico é aquele com o qual o tratamento do câncer não foi encontrado para ser refratário. Em outra modalidade, o agente quimioterapêutico é aquele com o qual o tratamento do câncer foi encontrado para ser refratário. Um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo podem ser administrados a um paciente que foi submetido à cirurgia como tratamento para o câncer.
[0654] Em algumas modalidades, o paciente também recebe um tratamento adicional, tal como terapia de radiação. Em uma modalidade específica, o composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo são administrados concomitantemente com o agente quimioterapêutico ou com terapia de radiação. Em outra modalidade específica, o agente quimioterapêutico ou terapia de radiação é administrado antes ou após a administração de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo.
[0655] Um agente quimioterapêutico pode ser administrado ao longo de uma série de sessões. Qualquer um ou uma combinação dos agentes quimioterapêuticos, tal como um padrão de agente quimioterapêutico cuidadoso, pode ser administrado.
[0656] Além disso, os métodos de tratamento do câncer com um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo são fornecidos como uma alternativa à quimioterapia ou terapia de radiação onde a quimioterapia ou terapia de radiação tem provado ou pode revelar-se muito tóxico, por exemplo, resulta em efeitos colaterais inaceitáveis ou intoleráveis, para o indivíduo a ser tratado. O paciente a ser tratado pode, opcionalmente, ser tratado com um outro tratamento de câncer, tal como cirurgia, terapia de radiação ou quimioterapia, dependendo de qual tratamento é considerado para ser aceitável ou tolerável.
[0657] Os compostos da invenção e/ou conjugados de droga de anticorpo do mesmo também podem ser utilizados em um ensaio in vitro ou ex vivo, tal como para o tratamento de certos tipos de câncer, incluindo, mas não limitados a, leucemias e linfomas, tal tratamento envolve os transplantes de células estaminais autólogas. Isto pode envolver um processo de multi-etapa, no qual as células stein hematopoiéticas autólogas do animal foram colhidas e purgadas de todas as células de câncer, população de célula de medula óssea restante do animal é, em seguida, eliminada através da administração de uma dose elevada de um composto da invenção e/ou o conjugado de droga de anticorpo do mesmo com ou sem o acompanhamento de terapia de radiação de dose elevada, e o enxerto de célula estaminal é administrado de volta para o animal. O tratamento de suporte é, em seguida, fornecido enquanto a função da medula óssea é restaurada e o paciente se recupera.
[0658] Espécies Liberadas
[0659] Outras modalidades da invenção incluem as espécies químicas liberadas, no interior ou na periferia da célula de câncer ou célula de tumor com o que se acredita ser a clivagem enzimática e/ou hidrolítica de uma ou mais células do câncer ou proteases associadas a células tumorais. Tais compostos incluem as espécies aqui descritas, e incluem também os compostos, tais como aqueles descritos na estrutura:
H O H
N N N W' N R5
O O O X IV
[0660] ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que, independentemente em cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 Wé , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
O Z''
Y 1
[0661] R é .
[0662] Y é C2-C20 alquileno ou C2-C20 heteroalquileno; C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C1-C10alquileno- (C3-C8 heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-;
O O
H Z''' N N Z''' Z''' Z’’ é O , O , ,
O H Z''' N O H N
H Z''' N O O O , NH2 ou –NHZ’’’;
O CO2 - -O2C S -O2C +H3N N Z’’’ é NH3+ , H ou NH3+ .
[0663] G é halogêneo, - OH, - SH ou -S-C1-C6 alquil;
[0664] R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C6 haloalquil;
[0665] R3A e R3B são definidos como um dos seguintes: (i) R3A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 halogenoalquil, C3-C8 carbociclil, C1- C10 heterociclil, aril, heteroalquil, aralquil ou halogêneo; e
[0666] R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 halogenoalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogêneo ou aralquil; ou
[0667] (ii) R3A e R3B, considerados juntos são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
[0668] R4A e R4B são definidos como um dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroalquil ou aralquil; e
[0669] R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
[0670] (ii) R4A e R4B, considerados juntos são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12
[0671] R5 é , , ,
[0672] , , , ,
[0673] , , , ,
[0674] , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído com 1, 2, 3, 4 ou grupos independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R')2, -C1-C8 alquil-C(O)R', -C1-C8 alquil-C(O)OR', -O(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', OH, halogêneo, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril não-substituído, ou dois R' podem, juntos com o nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados, formam um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O
[0675] ou R5 é , R13 , ou
O R12
N H
[0676] R13 opcionalmente substituído com 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, - C1-C8 alquil-N(R')2, -C1-C8 alquil-C(O)R', -C1-C8 alquil-C(O)OR', -O(C1-C8 alquil), - C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', OH, halogêneo, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR' e arileno -R', em que cada R' é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 heterociclil, -C1-C10 alquileno-C3-C8 heterociclil e aril, ou dois R' podem, juntos com o nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
[0677] R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou - C1-C8 haloalquil;
[0678] R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril;
[0679] R13 é C1-C10 heterociclil; e
[0680] R7 é selecionado, independentemente, para cada ocorrência, a partir do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3;
[0681] R10 é hidrogênio, -C1-C10 alquil, -C3-C8 carbociclo, aril, -C1-C10 heteroalquil, - C3-C8 heterociclo, -C1-C10 alquileno-aril, -arileno-C1-C10 alquil, - C1-C10 alquileno-(C3- C8 carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquil, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo), e -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquil, onde aril em R10 que compreende aril é opcionalmente substituído com [R7]h;
[0682] h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e
[0683] X é O ou S.
[0684] De interesse particular são os compostos de fórmula IV, tendo as estruturas:
O OH H H N N N
HN N R1 O O O O O , e
N O O O N O N O N O OH HN
O R1 .
[0685] A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos, os quais não são destinados a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLIFICAÇÃO
[0686] Os experimentos foram geralmente realizados sob atmosfera inerte (nitrogênio ou árgon), particularmente nos casos em que foram empregados os reagentes ou intermediários sensíveis à umidade ou oxigênio. Os solventes e reagentes comerciais foram geralmente utilizados sem purificação adicional, incluindo solventes anidros quando apropriados (geralmente, produtos Sure- SealTM a partir de Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin). Os produtos foram geralmente secos sob vácuo antes de serem transportados para outras reações ou submetidos para ensaio biológico. Dados de espectrometria de massa são relatados a partir de qualquer espectrometria de massa de cromatografia líquida (LCMS), ionização química de pressão atmosférica (APCI) ou instrumentação de espectrometria de massa cromatografia de gás (GCMS). Os desvios químicos para os dados de ressonância magnética nuclear (RMN) são expressos em partes por milhão (ppm, ) referenciado a picos residuais dos solventes deuterados empregados.
[0687] Para sínteses referenciando os procedimentos em outros Exemplos ou Métodos, protocolo de reação (comprimento de reação e temperatura) pode variar.
Em geral, as reações foram seguidas por cromatografia de camada fina (TLC) ou por espectrometria de massa, e submetidas a trabalhar quando apropriado. Purificações podem variar entre experimentos: em geral, os solventes e as relações do solvente utilizadas para eluentes/gradientes foram escolhidos para fornecer Rfs adequados ou tempos de retenção.
[0688] As rotações ópticas foram realizadas em um polarímetro Perkin - Elmer 343 (número de série 9506).
[0689] HRMS foram realizados em um Agilent 6220 TOF LC/MS.
[0690] Nomes compostos foram gerados com software ACD Labs.
[0691] Condições HPLC e LC-MS Utilizadas para Análises
[0692] Protocolo A: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 1,5 minutos, 5% a 100% de B durante 8,5 minutos, em seguida, 100% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
[0693] Protocolo B: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 50% de B durante 1,5 minutos, 50% a 100% de B durante 6,5 minutos, em seguida, 100% de B durante 3 minutos; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD 215 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
[0694] Protocolo C: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02 % de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,02 % ácido trifluoroacético em metanol (v/v); Gradiente: 50% a 100% de B durante 10 minutos; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
[0695] Protocolo D: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em metanol (v/v); Gradiente: 5% a 100% de B durante 8 minutos; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
[0696] Protocolo E: Coluna: Phenomenex Lux Amilose - 2, 250 x 4,6 mm, 5 µm; Fase móvel A: heptano; Fase móvel B: etanol (desnaturado); Gradiente: 5% a 100% de B durante 10 minutos; Taxa de fluxo: 1,5 mL/minuto. Temperatura: não-
controlada; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-1500 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
[0697] Protocolo F: Coluna: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 0,1 minuto, 5% a 95% de B durante 0,7 minuto, 95 % de B durante 0,1 minuto; Taxa de Fluxo: 1,25 mL/minuto.
Temperatura: 60°C; Detecção: 200-450 nm; MS (+) varia de 100-1200 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Waters Acquity.
[0698] Protocolo G: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0% a 100% de B durante 8,5 minutos; Taxa de fluxo: 1,5 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD 210 nm; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
[0699] Protocolo H: Coluna: Phenomenex Gemini-NX, C18, 4,6 x 50 mm, 3 µm, 110 Å; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0% a 100% de B durante 4,10 minutos, linear, em seguida, 100% de B durante 0,4 minuto; Taxa de Fluxo: 1,5 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detecção: DAD 200-450 nm; MS (+) varia de 100- 2000 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Agilent.
[0700] Protocolo I: Coluna: Atlantis T3, 75 x 3,0 mm, 3 µM; Fase móvel A: 0,05% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: acetonitrila; Gradiente: 5% a 95% de B durante 5,75 minutos; Taxa de Fluxo: 1,2 mL/minuto. Temperatura: 45°C; Detecção: DAD a 215 nm, 230 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-1200 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
[0701] Protocolo J: Coluna: Phenomenex Luna Fenil - Hexil, 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 1,5 minutos, 5% a 100% de
B durante 8,5 minutos, em seguida, 100% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
[0702] Protocolo K: Coluna: Symmetry - C18, 50 x 2,1 mm, 3,5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em metanol (v/v); Gradiente: 10% a 90% de B durante 6,5 minutos; Taxa de fluxo: 0,7 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detecção: DAD a 215 nm; MS (+) varia de 100-1500 dáltons; Volume de injeção: 3 µL; Instrumento: Waters 996 PDA.
[0703] Protocolo L: Coluna: XBridge C - 18, 150 x 4,6 mm, 3,5 µm; Fase móvel A: 5 mM de solução de acetato de amônio aquosa; Fase móvel B: acetonitrila; Gradiente: 10% de B durante 3 minutos, em seguida, 10% a 80% de B durante 14 minutos; Taxa de fluxo: 0,7 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Detecção: DAD a 215 nm; MS (+) varia de 100-1500 dáltons; Volume de injeção: 3 µL; Instrumento: Waters 996 PDA.
[0704] Protocolo M: Coluna: Phenomenex Luna, 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em metanol (v/v); Gradiente: 50% de B durante 1,5 minutos, 50% a 80% de B durante 8,5 minutos, em seguida, 80% de B durante 10 minutos; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: 45°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 90-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
[0705] Protocolo N: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0% a 100% de B durante 23,5 minutos; Taxa de fluxo: 1,5 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD a 210 nm; Volume de injeção: 10 mL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
[0706] Protocolo O: Coluna: Coluna: Agilent Poroshell 300SB - C8, 75 x 2,1 mm, 2,6 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 20% de B a 45% de B durante 4 minutos; Taxa de fluxo: 1,0 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detecção: 220 nm; MS (+) varia de 400 – 2000 Da; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1100 LC, Waters MicromassZQ MS. Desconvolução foi realizada utilizando MaxEnt1.
[0707] Protocolo P: Coluna: Coluna: TSK - gel G3000SWxl, 300 x 7,8 mm, 10 µm; Fase móvel: solução salina de tampão de fosfato (PBS 1X), pH 7,4 com 2% de acetonitrila; Isocrático; Taxa de fluxo: 1 mL/minuto. Temperatura: temperatura ambiente; Volume de injeção: 5 mL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
[0708] Protocolo Q: Coluna: Waters Acquity UPLC HSS T3, C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 0,1 minuto, 5% a 95% de B durante 2,5 minutos, 95% de B durante 0,35 minuto; Taxa de fluxo: 1,25 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detecção: 200 – 450 nm; MS (+) varia de 100-2000 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Waters Acquity.
[0709] Protocolo Q1: Coluna: Waters Acquity UPLC HSS T3, C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 m; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 0,1 minuto, 5% a 95% de B durante 1,5 minutos, 95% de B durante 0,35 minuto; Taxa de fluxo: 1,25 mL/minuto. Temperatura: 60°C; Detecção: 200 – 450 nm; MS (+) varia de 100-2000 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Waters Acquity.
[0710] Protocolo Q2: Coluna: Xtimate C18, 2,1 x 30 mm, 3 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10 a 80% de B durante 0,9 minuto, 80% de B durante 0,6 minuto; 100% de B durante 0,5 minuto;: Taxa de fluxo: 1,2 mL/minuto.
Detecção: DAD a 220 nM; Temperatura: 25oC; Volume de injeção: 1 µL; Instrumento: Agilent.
[0711] Protocolo Q3: Coluna: Xtimate C18, 2,1 x 30 mm, 3 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente 0% a 60% de B durante 0,9 minuto, 60% de B durante 0,6 minuto; 100% de B durante 0,5 minuto; Taxa de fluxo: 1,2 mL/minuto.
Detecção: DAD a 220 nM; Temperatura: 25oC; Volume de injeção: 1 µL; Instrumento: Agilent.
[0712] Protocolo R: Coluna: Phenomenex Luna, 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em metanol (v/v); Gradiente: 5% de B durante 1,5 minutos, 5% a 100% de B durante 8,5 minutos, em seguida, 100% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto.Temperatura: 45°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: 305 RP Agilent 1200 LCMS.
[0713] Protocolo S: Coluna: Phenomenex Luna, 150 x 3,0 mm, 5 m; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 1,5 minutos, 5% a 95% de B durante 8,5 minutos, em seguida, 100% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 1,0 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD 210 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: 305 RP Agilent 1100 HPLC.
[0714] Protocolo T: Coluna: Atlantis dC18, 50 x 4,6 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,05% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,05% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% a 95% de B durante 4,0 minutos; em seguida, mantém a 95% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 2 mL/minuto.
Temperatura: temperatura ambiente; Detecção: DAD a 215 nm; MS (+) varia de 160- 1000 dáltons; Volume de injeção: 3 µL; Instrumento: Waters 996 PDA.
[0715] Protocolo U: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5 % de B durante 1,5 minutos, 5% a 100% de B durante 8,5 minutos, em seguida, 100% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: 45°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 10 µL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
[0716] Protocolo V: Coluna: HPLC - V Ultimate XB - C18, 50 x 3,0 mm, 3 µm; Fase móvel A: 0,225% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,225% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 30% a 90% de B durante 6 minutos; Taxa de fluxo: 1,2 mL/minuto. Temperatura: 40°C; Detecção: DAD a 220 nm; Volume de injeção: 1 µL; Instrumento: SHIMADZU.
[0717] Protocolo W: Coluna: HPLC - V Ultimate XB - C18, 50 x 3,0 mm, 3 µM; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 80% de B durante 6 minutos; Taxa de fluxo: 1,2 mL/minuto. Temperatura: 40°C; Detecção: DAD a 220 nm; Volume de injeção: 3 µL; Instrumento: SHIMADZU.
[0718] Protocolo X: Coluna: YMC - Pack ODS-A, 150 x 4,6 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 80% de B durante 6 minutos; Taxa de fluxo: 1,2 mL/minuto. Detecção: DAD a 220 nm. Temperatura: 40°C; Volume de injeção: 3 µL; Instrumento: SHIMADZU.
[0719] Protocolo Y: Coluna: YMC - Pack ODS-A, 150 x 4,6 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase Móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0% a 95% de B durante 10 minutos, em seguida, 95% de B durante 5 minutos; Taxa de fluxo: 1,5 mL/minuto; Detecção: DAD a 220 nm; Instrumento: Agilent 1100.
[0720] Protocolo Z: Coluna: Xtimate C18, 2,1 x 30 µm, 3 mM; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0% a 60% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 1,2 ml/min. Temperatura: 50°C; Detecção: 220 nm, MS (+) varia de 100-1000 dáltons; Volume de injeção: 1 µL; Instrumento: SHIMADZU.
[0721] Protocolo AB: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 2,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% a 100% de B durante 10 minutos, em seguida, 100% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 0,5 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 210 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Agilent 1100 LCMS.
[0722] Protocolo BB: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 2,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 2,0 minutos, 5% a 100% de B durante 12 minutos e 100% de B durante 2 minutos, em seguida, 100% a 5% de B durante 1,5 min; Taxa de fluxo: 0,75 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Agilent.
[0723] Protocolo CB: Coluna: Waters XBridge C18, 4,6 x 50 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,03% de hidróxido de amônio em água (v/v); Fase móvel B: 0,03% de hidróxido de amônio em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% a 95% de B durante 4,0 minutos, em seguida, 95% de B durante 1 minuto; Taxa de fluxo: 2 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 215 nm, MS (+) varia de 160-1000 dáltons; Volume de injeção: 4 µL; Instrumento: Waters ZQ/Alliance 2795 HPLC.
[0724] Protocolo DB: Coluna: Waters Atlantis dC18, 4,6 x 50 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,05% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,05% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5,0% a /95% de B durante 4,0 minutos, em seguida, 95% de B durante 1 minuto. Taxa de fluxo: 2 mL/minuto.
Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 215 nm, MS (+) varia de 160-1000 dáltons; Volume de injeção: 4 µL; Instrumento: Waters ZQ/Alliance 2795 HPLC.
[0725] Protocolo EB: Coluna: XBridge RP18, 2,1 x 50 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de hidróxido de amônio em água (v/v); Fase móvel B: 0,02% de hidróxido de amônio em acetonitrilo (v/v); Gradiente de 10% a 80% de B durante 6 minutos, em seguida, 80% durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 1,2 mL/minuto. Detecção: DAD a 220 nm; Temperatura: 50°C.
[0726] Protocolo FB: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 2,0 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% de B durante 2,0 minutos, 5% a 100% de B durante 10 minutos, e 100% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 0,50 mL/minuto. Temperatura: 25°C; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 5 µL; Instrumento: Agilent 1200 LCMS.
[0727] Em alguns casos, algumas pequenas alterações para análises de LC - MS e condições de HPLC foram feitas tais como, mas não limitadas, à alteração no gradiente ou taxa de fluxo, a qual é indicada pelo símbolo *.
[0728] Condições de HPLC utilizadas para Purificação
[0729] Método A: Coluna: Phenomenex Lux Amilose - 2, 250 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: heptano; Fase móvel B: etanol (desnaturado); Gradiente: 5% a 100% de B durante 6 min; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
[0730] Método B: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de ácido acético em água; Fase móvel B: 0,02% de ácido acético em acetonitrila; Gradiente: 5% de B durante 1,5 minutos, 5% a 45% de B durante 8,5 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
[0731] Método C: Coluna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 10 µM; Fase móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em metanol (v/v); Gradiente: 10% a 90% de B durante 20 minutos; Taxa de fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD a 210 nm, 254 nm; Volume de injeção: variável; Instrumento: Gilson.
[0732] Método D: Coluna: Fenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21,2 mm, 4 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila; Gradiente: 30% de B durante 1,5 minutos, 30% a 60% de B durante 8,5 minutos, 60 a 100% de B durante 0,5 minuto, em seguida, 100% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
[0733] Método E1: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila; Gradiente: 40% de B durante 1,5 minutos, 40% a 80% de B durante 8,5 minutos, 80 a 100% de B durante 0,5 minuto, em seguida, 100% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
[0734] Método E2: Coluna: Phenomenex Luna Fenil-hexil, 150 x 21,2 mm, 5 µm. O resto dos protocolos é idêntico àqueles descritos para o Método E1.
[0735] Método F: Coluna: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21,2 mm, 4 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em metanol; Gradiente: 44% de B durante 1,5 minutos, 44% a 77% B durante 8,5 minutos, em seguida, 77% de B durante 10 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
[0736] Método G: Coluna: PrincetonSFC 2 - etilpiridina, 250 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: heptano; Fase móvel B: etanol (desnaturado); Gradiente: 1% de B durante
1,5 minutos, 1% a 50% de B durante 8,5 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
[0737] Método H: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de ácido acético em água; Fase móvel B: 0,02% de ácido acético em acetonitrila; Gradiente: 20% de B durante 1,5 minutos, 20% a 60% de B durante 10,5 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
[0738] Método I: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em metanol; Gradiente: 40% de B durante 1,5 minutos, 40% a 70% de B durante 8,5 minutos, em seguida, 70% de B durante 10 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx LCMS.
[0739] Método J: Coluna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 90% de B durante 20 minutos; Taxa de fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não-controlada; Detecção: DAD a 210 nm, 254 nm; Volume de injeção: variável; Instrumento: Gilson.
[0740] Método K: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila; Gradiente: 20% de B durante 1,5 minutos, 20% a 50% de B durante 8,5 minutos, 50 a 100% de B durante 0,5 minuto, em seguida, 100% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters Fraction Lynx LCMS.
[0741] Método L: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila; Gradiente: 30% de B durante 1,5 minutos, 30% a 50% de B durante 8,5 minutos, 50 a 100% de B durante 0,5 minuto, em seguida, 100% de B durante 2 minutos; Taxa de fluxo: 27 mL/minuto; Detecção: Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters Fraction Lynx LCMS.
[0742] Método M: Coluna: Waters Sunfire C18, 19 x 100 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,05% de ácido trifluoroacético em água (v/v); Fase móvel B: 0,05% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0 a 100% durante 8,5 minutos. Taxa de fluxo: 25 mL/minuto. Detecção: DAD a 215 nm. MS (+) varia de 160-1000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
[0743] Método N: Coluna: Waters Sunfire C18, 19 x 100 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,05% de ácido fórmico em água (v/v); Fase móvel B: 0,05% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0 a 100% durante 8,5 minutos. Taxa de fluxo 25 mL/minuto. Detecção: DAD a 215 nm. MS (+) varia de 160-1000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
[0744] Método O: Coluna: Phenomenex Luna C18, 21,2 x 150 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v) de ácido em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente (v/v); Gradiente 20% de B durante 1,5 minutos, 20% a 40% de B durante 8,5 minutos, 40 a 100% de B durante 0,5 minuto, em seguida, mantido a 100% de B durante 1,5 minutos. Taxa de fluxo: 27 mL/minuto. Detecção: DAD a 210-360 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
[0745] Método P: Coluna: Phenomenex GeminiC18, 21,2 × 250 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,225% de hidróxido de amônia em água (pH 10) (v/v); Fase móvel B: 0,225% de hidróxido de amônia em acetonitrila (v/v); Gradiente: 45% a 85% de B durante 10 minutos. Taxa de fluxo 35 mL/minuto. Detecção: DAD a 220 nm. MS (+) varia de 100-1200 dáltons; Instrumento: Shimadzu MS Trigger.
[0746] Método Q: Coluna: Coluna: Phenomenex Synergi C18, 50 x 250 mm, 10 µm; Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v). Fase móvel B: Acetonitrila; Gradiente de 10% a 40% de B durante 25 minutos. Taxa de fluxo 100 mL/minuto. Detecção: UV / Vis 220 nm; Instrumento: Shimadzu LC - 8A.
[0747] Método R: Coluna: Phenomenex Luna C18 (2), 250 x 21,2 mm, 5 µm; Fase móvel A: 0,1% de TFA em água (v/v); Fase móvel B: 0,1% de TFA em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 100% durante 30 minutos; Taxa de fluxo variável.
Temperatura: 25oC; Detecção: DAD a 215 nm, 254 nm; MS (+) varia de 150-2000 dáltons; Volume de injeção: 1,8 mL: Instrumento: Agilent 1100 Prep HPLC.
[0748] Em alguns casos, algumas pequenas alterações para condições de purificação foram efetuadas tais como, mas não limitadas a uma mudança no gradiente ou taxa de fluxo, que está indicado pelo símbolo *.
[0749] Procedimentos Gerais
[0750] Procedimento Geral A: remoção de Fmoc com dietilamina ou piperidina. A uma solução do composto contendo Fmoc em diclorometano ou N,N- dimetilformamida (também referida como DMF), adicionou-se um volume igual de dietilamina ou piperidina. O progresso da reação foi monitorado por LC-MS (ou HPLC ou TLC). Os solventes foram removidos in vacuo, e em alguns casos, o resíduo foi azeotropado uma a quatro vezes com heptano. Resíduo foi geralmente diluído com diclorometano e uma pequena quantidade de metanol, antes de ser reduzido para baixo em sílica e purificado por cromatografia em sílica gel, eluindo com metanol em diclorometano (ou outra mistura adequada de solventes) para fornecer o material desejado (ou material bruto foi usado como tal).
[0751] Procedimento Geral B: remoção de Boc ou clivagem de éster t-Bu utilizando ácido trifluoroacético. A uma solução do composto contendo Boc ou composto contendo terc-butil éster em diclorometano a 0°C (ou à temperatura ambiente), foi adicionado ácido trifluoroacético, para fornecer uma relação de 1:4 de ácido trifluoroacético: diclorometano. O progresso da reação foi monitorado por LC-MS (ou HPLC ou TLC). Os solventes foram removidos in vacuo. O resíduo foi azeotropado três vezes com heptano para fornecer o material desejado.
[0752] Procedimento Geral C: remoção de Boc ou clivagem de terc-butil éster (também refere-se a t-Bu éster) usando ácido clorídrico em dioxano. Para qualquer uma solução de composto contendo Boc ou composto contendo terc-butil éster em dioxano (ou em alguns casos nenhuma solução, ou outro solvente relevante) foi adicionada uma solução de ácido clorídrico em dioxano a 4 M. O progresso da reação foi monitorado por LC-MS (ou HPLC ou TLC). A reação foi concentrada in vacuo e, em alguns casos, azeotropada de uma a quatro vezes com heptanos.
[0753] Procedimento Geral D: acoplamento com O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N, N, N', N'-tetrametilurônio (HATU). A uma solução agitada de amina (1,0 eq.) e ácido (1,0-2,0 eq.) em diclorometano, N,N-dimetilformamida (também referida como DMF), ou uma mistura de ambos, HATU (1,0-2,0 eq.) foi adicionada seguida por trietilamina (2,0-4,0 eq.) ou diisopropiletilamina (2,0-4,0 eq., também referida como a base de Hunig). O progresso da reação foi monitorado por LC-MS (ou HPLC ou TLC); a reação foi geralmente concluída dentro de três horas. Os solventes foram removidos in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa ou sílica gel ou, em alguns casos, foi azeotropado três vezes com heptanos, diluído com uma pequena quantidade de etil acetato antes de ser reduzida para baixo em sílica ou sílica ligada C18 e purificado por cromatografia de fase reversa ou sílica gel.
[0754] Procedimento Geral E: acoplamento com N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]- L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP). A uma mistura de amina de carga (1 eq.) e N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pyrrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP, Pedido de Pat. Eur. (1994), EP624377, 1,0-2,0 eq.) em N,N-dimetilformamida ou dimetilacetamida (também referida como DMA), piridina (0,0-4,0 eq.), diisopropiletilamina (0,0-4,0 eq.), 2,6- dimetilpiridina (0,0-4,0 eq., também referida como 2,6-Luditina) e 1- hidroxibenzotriazol hidrato (0,01-1,1 eq. também referido como HOBT) ou 3H-[1,2,3] triazolo[4,5-b]piridin-3-ol (0,01-1,1 eq., também referido como HOAT ) foi adicionado. Depois de agitar a 40°C-50°C durante 1-48 horas, a mistura de reação foi concentrada in vacuo e azeotropada três vezes com heptano.
O material bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa de acordo com o método especificado para fornecer o material desejado.
[0755] Procedimento geral F: conjugação de anticorpo de HERCEPTIN® comercial com ligante-carga por meio de dissulfitos internos. Anticorpo de HERCEPTIN® comercialmente disponível (Genentech, Inc), foi dialisado em Solução Salina Tamponada de Fosfato de Dulbecco (DPBS, Lonza). O anticorpo dialisado foi reduzido com a adição de x equivalentes de cloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, 5 mM em água destilada) e diluído para 15 mg/mL de concentração de anticorpo final utilizando DPBS, 5 mM de 2,2',2'',2'''-(etano-1,2-diildinitrilo) ácido tetra-acético ( EDTA ), pH 7,0-7,4 (tampão A). A reação foi incubada a 37°C durante 1-2 horas e, em seguida, arrefecida à temperatura ambiente. A conjugação foi realizada por adição de y equivalentes de ligante-carga (5-10 mM em dimetilacetamida (DMA)). DMA foi adicionada para atingir 10-20% (v/v) do componente de solvente orgânico total na mistura de reação final, e tampão A adicionado para atingir 10 mg/mL de concentração final de anticorpo. A reação foi incubada durante 1-2 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação foi, em seguida, trocada de tampão para DPBS (pH 7,4), utilizando GE Healthcare Sephadex G-25 M colunas de troca de tampão de acordo com as instruções do fabricante. O material bruto foi purificado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) utilizando um sistema de GE AKTA Explorer com coluna Superdex GE e PBS (pH 7,4) como eluente.
[0756] Procedimento Geral G: reações de conjugação foram realizadas na parte superior de um dispositivo de ultrafiltração centrífuga, tais como filtros Amicon Ultra 50k Ultracel (parte # UFC805096, GE). Uma solução estoque de 132 mM de L- cisteína foi preparada em PBS contendo 50 mM de EDTA. Esta solução (50 µL) foi adicionada a uma mistura do respectivo anticorpo mutante (5 mg) em 950 µl de PBS contendo 50 mM de EDTA. A concentração de cisteína final na mistura de reação foi de 6,6 mM. Após permitir que a reação descanse à temperatura ambiente (cerca de 23°C) durante 1,5 horas, o tubo de reação foi centrifugado para concentrar o material a aproximadamente 100 µL. A mistura foi diluída para 1 mL com PBS contendo 50 mM de EDTA. Este processo foi repetido 4 vezes a fim de remover todo o redutor de cisteína. O material resultante foi diluído para 1 mL em PBS contendo 50 mM de EDTA e tratado com 16 µL de uma solução de 5 mM de ligante-carga de maleimida (a partir da Tabela 18A em dimetil acetamida (DMA) (cerca de 5 equivalentes). Depois de descansar à temperatura ambiente (cerca de 23°C) durante 1,5 horas, o tubo de reação foi centrifugado para concentrar o material a aproximadamente 100 µL. A mistura foi diluída para 1 mL com PBS. Este processo foi repetido 2 vezes a fim de remover o excesso de reagente de maleimida. Os conjugados de anticorpo foram geralmente purificados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) utilizando um sistema de GE AKTA Explorer com uma coluna de GE Superdex200 e PBS (pH 7,4) como eluente. O carregamento da droga para o local desejado da conjugação foi determinado utilizando uma variedade de métodos, incluindo a espectrometria de massa (MS), HPLC de fase reversa, e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), como foi descrito em qualquer outro lugar. O valor relatado (nas Tabelas 19A e 19B ) é geralmente obtido por LC-MS sob condições de redução.
[0757] Procedimento Geral H: Uma solução de 20 mM de TCEP (geralmente de 50 a 100 equivalentes molares) foi adicionada ao anticorpo (tipicamente de 5 mg) de tal modo que a concentração de anticorpo final foi de 5 mg/mL em PBS contendo 50 mM de EDTA. Após permitir que a reação descanse a 37°C durante 1,5 horas, o anticorpo foi trocado de tampão em PBS contendo 50 mM de EDTA utilizando um dispositivo de concentração de corte de rotação de 50 kD MW (3 x 3 mL de lavagem, 10x de concentração por ciclo). Métodos alternativos, tais como TFF ou diálises também são úteis em circunstâncias particulares. O anticorpo resultante foi re- suspenso em 1 mL de PBS contendo 50 mM de EDTA e tratado com uma solução de DHA a 50 mM preparada fresca (dehidroascorbato) em 1:1 de PBS/EtOH (concentração de DHA final é tipicamente de 1 mM) e deixado descansar a 4°C durante a noite. A mistura de anticorpo/DHA foi trocada de tampão em PBS contendo 50 mM de EDTA, usando um dispositivo de concentração de corte de rotação de 50 kD MW (3 x 3 mL de lavagem, 10x de concentração por ciclo). O anticorpo resultante foi re-suspenso em 1 mL de PBS contendo 50 mM de EDTA e tratado com 10 mM de ligante-carga de maleimida em DMA (tipicamente 5-10 equivalentes). Depois de descansar durante 1,5 horas, o material foi trocado de tampão (como acima) em 1 mL de PBS (3 x 3 mL de lavagens, 10x de concentração por ciclo). A purificação por SEC (como descrita anteriormente) foi realizada conforme necessária para remover qualquer material agregado.
[0758] Procedimento Geral I: A conjugação inicial do ligante-carga foi executada utilizando o método anteriormente descrito (Procedimento geral F). O anticorpo- droga-conjugado resultante foi trocado de tampão para um tampão de borato de 50 mM (pH 9,2) utilizando um dispositivo de ultrafiltração (50 kd de corte MW). A solução resultante foi aquecida a 37°C durante 24 horas (para os ligantes de maleimida-Peg) ou a 45°C durante 48 horas (para os ligantes de maleimida-caproil).
A solução resultante foi arrefecida, trocada de tampão em PBS, e purificada por SEC (como descrita anteriormente) de modo a remover qualquer material agregado.
Análises de LCMS do material indicaram que o anel succinimida abriu completamente (90% ou mais). Note que nos exemplos em que um metil éster está presente na carga, o éster é hidrolisado para o ácido carboxílico sob as condições descritas.
[0759] Procedimento Geral J: Os pentafluorofenil ésteres foram conjugados ao anticorpo mostrado seguindo o procedimento anteriormente descrito em WO2012007896 A1.
[0760] Procedimento Geral K: A conjugação de ligantes amino-alquil foi realizada através de ligação mediada por enzima, como descrito em WO2012059882 A2.
[0761] Procedimento Geral L: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carbóxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamina (preparada na mesma maneira como #136) foi acoplada ao aminoácido relevante ou porção amina utilizando HATU (1,0- 2,0 eq.) na presença de base de Hunig (1,0-5,0 eq.) em uma solução de DMF, diclorometano, ou em alguns casos, uma solução de ambos (ou uma solução de um ou mais solventes). A reação foi monitorada por LC-MS (ou TLC ou HPLC). A reação foi concentrada in vacuo e geralmente purificada por cromatografia de sílica ou por HPLC preparativa. A proteção de Fmoc foi, em seguida, removida como descrita no procedimento geral A seguido por concentração in vacuo e purificado por cromatografia em sílica ou por HPLC preparativa.
[0762] Procedimento Geral M: #151 foi acoplado à amina relevante utilizando HATU (1,0-2,0 eq., ou outro reagente de acoplamento adequado) na presença de base de Hunig (1,0-5,0 eq.) em uma solução de DMF, diclorometano, ou em alguns casos, uma solução de ambos (ou uma solução de um ou mais solventes). A reação foi monitorada por LC-MS (ou TLC ou HPLC). A reação foi concentrada in vácuo.
Desproteção de Boc foi, em seguida, realizada como descrita no procedimento geral B, concentrada in vacuo e purificada por cromatografia sílica ou por HPLC preparativa.
[0763] Procedimento Geral N. Ácido 1-(9H-fluoreno-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16,19,22- heptaoxa-4-azapentacosan-25-óico (ou outro Fmoc-AmPegXC2-COOH adequado) foi acoplado ao pentapeptídeo citotóxico relevante (ou o pentapeptídeo citotóxico contendo um grupo de proteção em uma porção reativa diferente de N-terminal), utilizando HATU (1,0-2,0 eq., ou outro reagente de acoplamento apropriado), na presença de base de Hunig (1,0-5,0 eq. ou outra base apropriada) em uma solução de DMF, diclorometano, ou em alguns casos, uma solução de ambos (ou uma solução de um ou mais solventes). A reação foi monitorada por LC-MS (ou TLC ou HPLC). A reação foi concentrada in vacuo. Desprotecção de Fmoc foi realizada de acordo com o procedimento geral A. Em alguns casos, uma segunda desprotecção foi realizada a fim de remover um grupo de proteção em uma porção reativa no pentapeptídeo citotóxico, utilizando um procedimento geral B (ou outro procedimento relevante conhecido na literatura com base no grupo de proteção). A reação foi concentrada in vacuo e purificada por cromatografia em sílica ou por HPLC preparativa.
[0764] Procedimento Geral O. O Fmoc-AmPegXC2-COOH apropriado está ligado ao pentapeptídeo citotóxico relevante (ou o pentapeptídeo citotóxico contendo um grupo de proteção em uma porção reativa diferente de N-terminal) e desproteção de Fmoc é realizada de acordo com o procedimento geral N. A reação é concentrada in vacuo e, em seguida, purificada por cromatografia em sílica ou HPLC preparativa (ou o material bruto pode ser utilizado como tal). A sequência de PABC apropriada (tal como, mcValCitPABC, ou derivado de) é, em seguida, instalada de acordo com o procedimento geral E. Em alguns casos, se um grupo de proteção está presente na porção de pentapeptídeo citotóxico de desprotecção da molécula é, em seguida, realizado utilizando o procedimento geral A ou procedimento geral B (ou outro procedimento relevante conhecido na literatura com base no grupo de proteção). A reação é concentrada in vacuo e purificada por cromatografia em sílica ou por HPLC preparativa.
[0765] Procedimento Geral P. O procedimento E seguido substituindo mcValCitPABC-PNP, com MalPeg3C2ValCitPABC-PNP (preparado em uma maneira similar a mcValCitPABC-PNP).
[0766] Procedimento Geral Q: O Fmoc-AmPegXC2-COOH adequado está ligado ao pentapeptídeo citotóxico relevante (ou o pentapeptídeo citotóxico contendo um grupo de proteção em uma porção reativa diferente de N-terminal) e desproteção Fmoc é realizada tal como descrita no procedimento geral N. A reação é concentrada in vacuo e, em seguida, purificada por cromatografia de sílica ou por HPLC preparativa (ou o material bruto pode ser utilizado como tal). A uma solução em agitação deste resíduo em DMF a 0°C (ou a uma temperatura ligeiramente mais elevada, em alguns casos), ácido bromoacético (1,0-2,0 eq.) foi adicionado seguido pela base de Hunig (1,0-5,0 eq.) e HATU (1,0-2,0 eq.). A reação foi deixada aquecer à temperatura ambiente e agitar à temperatura ambiente enquanto é monitorada por LC-MS (ou TLC ou HPLC). A reação foi concentrada in vacuo e purificada por HPLC preparativa.
[0767] Procedimento Geral R. O procedimento E seguido substituindo mcValCitPABC-PNP, com N-(6-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}hexanoil)-L- valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (preparada de uma maneira similar a mcValCitPABC-PNP). Desproteção de Fmoc foi, em seguida, realizada (procedimento geral B) seguida por purificação de HPLC preparativa.
[0768] Procedimento Geral S. A uma solução em agitação de 6-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-il)-hexanal (1,0-3,0 eq.) em metanol, o pentapeptídeo citotóxico relevante (1,0 eq.) foi adicionado seguido por ácido fórmico. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 1-40 minutos, seguida pela adição de sódio
(ciano-kappaC)(trihidrido)borato(1-) (3,0-6,0 eq., também referido como cIanborohidreto de sódio). A reação foi monitorada por LC-MS (ou TLC ou HPLC).
Em alguns casos, 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanal adicional (1,0-3,0 eq.) foi adicionado. A reação foi concentrada in vacuo seguida de purificação por HPLC preparativa.
[0769] Procedimento Geral T. 4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1-il)propil]anilinio é preparado como descrito na literatura (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2012, vol 22, #13, 4249-4253), que é, em seguida, acoplado a bis(pentafluorofenil)3,3'-[etano-1,2-diilbis(óxi)]dipropanoato usando HATU em diclorometano, seguido por acoplamento com o pentapeptídeo citotóxico desejado.
O material é, em seguida, purificado por HPLC preparativa.
[0770] Procedimento Geral U. Fmoc-ValCitPABC-PNP é acoplado ao pentapeptídeo citotóxico desejado seguindo o procedimento geral E, e, em seguida, Fmoc é removido seguinte o procedimento geral A. Este resíduo é, em seguida, acoplado ao ácido [2-oxo-2-({4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1-il)propil]fenil}amino) etoxi] acético (que é preparado por acoplamento de 4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin-1- il)propil]anilinio com 1,4-dioxano-2,6-diona seguindo o procedimento geral D). O material é, em seguida, purificado por HPLC preparativa.
[0771] Procedimento Geral V. Bis(pentafluorofenil)3,3'-[etano-1,2- diilbis(óxi)]dipropanoato ou bis (pentafluorofenil)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecano- 1,19-dioato é acoplado para o pentapetídeo citotóxico desejado (ou em alguns casos acoplado ao pentapeptídeo citotóxico desejado contendo um grupo de proteção em uma porção reativa diferente de N-terminal) seguindo o procedimento geral D. Se um grupo de proteção estiver presente, o grupo de proteção é, em seguida, removido (utilizando procedimentos relevantes descritos na literatura). O material é, em seguida, purificado por HPLC preparativa.
[0772] Procedimento Geral W. 4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil 1-(9H- fluoreno-9-il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oato é acoplado ao pentapeptídeo citotóxico desejado seguindo o procedimento geral E. Fmoc é removido seguindo o procedimento geral A. Bis(pentafluorofenil)3,3'-[etano-1,2-diilbis(óxi)]dipropanoato é acoplado a este resíduo seguindo o procedimento geral D. O material é, em seguida, purificado por HPLC preparativa.
[0773] Procedimento Geral X1. N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonIl]-L-alanil-L-alanil- N~1~-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-N~4~-tritil-L-aspartamida é acoplada ao pentapeptídeo citotóxico desejado seguindo o procedimento geral E. Fmoc é removido seguindo o procedimento geral A e o grupo de proteção tritil é removido seguindo o procedimento geral B. Bis(pentafluorofenil) 3,3'-[etano-1,2- diilbis(óxi)]dipropanoato é acoplado a este resíduo seguindo o procedimento geral D.
O material é purificado por HPLC preparativa.
[0774] Procedimento Geral X2. N-{3-[2-(3-etóxi-3-oxopropóxi)etóxi]propanoil}-L- valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida é acoplada ao pentapeptídeo citotóxico desejado seguindo o procedimento geral E.
Etil ester é removido usando hidróxido de lítio em THF e água. NHS éster é, em seguida, formado por resíduo de acoplamento com 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona, utilizando N,N'-diciclohexilcarbodiimida em THF. O material é purificado por HPLC preparativa.
[0775] Procedimento Geral X3. N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-D-valil-N~5~- carbamoil-N-[4-({[(2-carboxipropan-2-il)carbamoil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida está acoplada a #50 seguindo o procedimento geral D em DMSO e acetonitrila. Fmoc é removido seguindo o procedimento geral A, seguido por acoplamento com bis(pentafluorofenil)3,3'-[etano-1,2-diilbis(óxi)]dipropanoato utilizando a base de Hunig em acetonitrila. O material é purificado por HPLC preparativa.
[0776] Procedimento Geral X4. N-[1-(9H-fluoren-9-il)-3,5,12-trioxo-2,7,10- trioxa-4- azadodecan-12-il]-2-metilalanina é acoplada ao #250 seguindo o procedimento geral D em acetonitrila. Fmoc é removido seguindo o procedimento geral A, seguido por acoplamento com bis(pentafluorofenil)3,3'-[etano-1,2-diilbis(óxi)]dipropanoato utilizando a base de Hunig em acetonitrila. O material é purificado por HPLC preparativa.
[0777] Procedimento Geral X5. L-valil-N~~5-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]- L- ornitinamida é acoplada a N~2~-acetil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisina seguindo o procedimento geral D. Este resíduo resultante é acoplado com bis(4- nitrofenil)carbonato com base de Hunig em DMF, seguido por acoplamento com o pentapeptídeo citotóxico desejado seguindo o procedimento geral E. Desproteção de Boc é, em seguida, realizada de acordo com o procedimento geral B em acetonitrila.
Resíduo é purificado por HPLC preparativa.
[0778] Em alguns casos, pequenas alterações às condições de reação foram feitas tais como, mas não limitadas à ordem de reagente e adição de reagentes e ou a quantidade de reagente ou reagente que está indicada pelo símbolo *. Além disso, esses procedimentos gerais são fornecidos apenas como exemplares e são não- limitantes.
[0779] Além dos Procedimentos Gerais acima fornecidos, as referências de dolastatina e auristatina relevantes incluem o seguinte: Petit et al. J. Am. Chem. Soc.
1989, 111, 5463; Petit et al. Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243 e referências aí citadas; Petit et al. J. Nat. Prod. 2011, 74, 962; WO 96/33212; WO 95/09864; EP 0695758; WO 07/8848; WO 01/18032; WO 09/48967; WO 09/48967; WO 09/117531; WO 08/8603; US 7.750.116; US 5.985.837; e US 2005/9751; todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[0780] Análises de MS e Preparação de Amostras
[0781] As amostras foram preparadas para análises de LC-MS, combinando cerca de 20 µL de amostra (cerca de 1 mg/mL de ADC em PBS) com 20 µL de 20 mM de ditiotreitol (DTT). Depois de deixar a mistura descansar à temperatura ambiente durante 5 minutos, as amostras foram analisadas de acordo com o protocolo de O.
[0782] O seguinte cálculo foi realizado a fim de estabelecer a carga total (DAR) do conjugado:
[0783] Carregando = 2*[LC1/(LC1 + LC0)]+2*[HC1/(HC0 + HC1+ HC2 + HC3)] +
[0784] 4* [HC2/(HC0 + HC1 + HC2+ HC3)]+6*[HC3/(HC0 + HC1 + HC2+ HC3)]
[0785] onde as variáveis indicadas são a abundância relativa de: LC0 = cadeia leve descarregada, LC1 = única cadeia leve carregada, HC0 = cadeia pesada descarregada, HC1 = única cadeia pesada carregada, HC2 = cadeia pesada carregada dupla, e HC3 = cadeia pesada carregada tripla.
[0786] Condições de LC-MS utilizadas são o Protocolo F para o tempo de retenção inferior a um minuto e Protocolo H para os experimentos remanescentes, a menos que indicado de outra forma.
[0787] Preparação de N-[(9H-Fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N- [(2R,3S,4S)-1-carbóxi-2-metóxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (# 8) ! " #
[0788] Etapa 1. Sínteses de benzil[(2S,3S)-1-hidróxi-3-metilpentan-2-il] metilcarbamato (#1). A uma solução de N-[(benzilóxi)carbonil]-N-metil-L-isoleucina (52,37 g, 187,5 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (524 mL, 0,35 M) foi adicionadocomplexo de borano-tetrahidrofurano (1 M em tetrahidrofurano, 375 mL, 375 mmol, 2 eq.) lentamente ao longo de 1 hora e a reação foi deixada agitar durante 18 horas à temperatura ambiente. A reação foi arrefecida a 0°C e água (30 mL) foi adicionada ao longo de 30 minutos. A mistura de reação foi diluída com 1 M de solução de carbonato de sódio aquosa (100 mL) e terc-butil metil éter (250 mL). A camada aquosa foi re-extraída com terc-butil metil éter (100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com 1 M de solução de carbonato de sódio aquosa (100 mL), lavadas com salmoura (200 mL), secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, e concentradas in vacuo para fornecer #1 (48,44 g, 97% de rendimento) como um óleo amarelo pálido, o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 7,26-7,41 (m, 5H), [5,06 (quarteto AB, JAB = 12,9 Hz, vAB = 22,8 Hz) e 5,06 (quarteto AB, JAB = 9,0 Hz, vAB = 9,0 Hz), total 2H], [4,65 (t, J = 5,3 Hz) e 4,59 (t, J = 5,4 Hz), 1H total], 3,67-3,80 (m, 1H), 3,51-3,60 (m, 1H), 3,41-3,51 (m, 1H), 2,75 e 2,71 (2 s, 3H total), 1,49-1,64 (br m, 1H), 1,24-1,37 (br m, 1H), 0,90-1,02 (br m, 1H), 0,74-0,87 (m, 6H).
[0789] Etapa 2. Sínteses de benzil metil[(2S, 3S)-3-metil-1-oxopentan-2-il] carbamato (#2). A uma solução de #1 (8,27 g, 31,2 mmol, 1 eq.) em dimetil-sulfóxido (41,35 mL, 0,75 M), foi adicionada trietilamina (8,70 mL, 64,0 mmol, 2,05 eq.) e a mistura foi arrefecida a 0°C. Complexo de piridina de trióxido de enxofre (10,18 g, 63,96 mmol, 2,05 eq.) foi, em seguida, adicionado em pequenas porções, mantendo a temperatura interna abaixo de 8°C. A reação foi deixada atingir a temperatura ambiente e foi agitada durante 18 horas. A reação foi vertida em água (100 mL) e terc-butil metil éter (100 mL). A camada aquosa foi re-extraída com terc-butil metil éter (50 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 mL), secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, concentradas in vacuo e purificadas por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 10% a 60% de etil acetato em heptano) para fornecer #2 (7,14 g, 87%) como um óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 9,61 (s, 1H), 7,26-7,42 (m, 5H), 5,01-5,13 (m, 2H), 4,04- 4,12 (m, 1H), 2,86 e 2,82 (2 s, 3H total), 1,94-2,11 (br m, 1H), 1,26-1,42 (br m, 1H).
[0790] Etapa 3. Sínteses de terc-butil (3R, 4S, 5S)-4-{[(benzilóxi)carbonil] (metil)amino}-3-hidróxi-5-metilheptanoato (#3). Lítio de diisopropilamina foi preparado por adição de n-butillítio (solução de 2,5 M em tetrahidrofurano, 35,9 mL, 89,8 mmol, 1,4 eq.) a uma solução de diisopropilamina (13,8 mL, 96,3 mmol, 1,5 eq.) em tetrahidrofurano (50 mL, 1,3 M) a -78°C. Após 1 hora, terc-butil acetato (15,7 mL, 116 mmol, 1,8 eq.) foi adicionado gota a gota e a mistura de reação foi agitada durante 1,5 horas adicionais, enquanto deixada aquecer lentamente até -20°C. A mistura de reação foi novamente arrefecida até -78°C e uma solução de aldeído #2 (16,9 g, 64,2 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano foi adicionada (10 mL). A mistura de reação foi agitada durante 1,5 horas e, em seguida, resfriada bruscamente pela adição de água (100 mL). Após a extração com dietil éter (2 x 100 mL), as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, concentradas in vacuo e purificadas por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 20% de acetona em heptano) para fornecer #3 (8,4 g, 34%) como um óleo incolor. LC-MS: m/z 402,4 [M + Na +], tempo de retenção = 3,91 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 7,27-7,39 (m, 5H), 5,01- 5,12 (m, 2H), [4,93 (d, J = 7,2 Hz) e 4,98 (br d, J = 7,2 Hz), 1H total], 4,03-4,15 (br m, 1H), 3,68-3,85 (br m, 1H), 2,65 e 2,72 (2 br s, 3H total), 2,28-2,37 (m, 1H), 2,09-2,17 (m, 1H), 1,74-1,90 (br m, 1H), 1,41-1,51 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 0,92-1,01 (m, 1H), 0,77-0,92 (m, 6H).
[0791] Etapa 4. Sínteses de terc-butil (3R, 4S, 5S)-4-{[(benzilóxi)carbonil] (metil) amino}-3-metóxi-5-metilheptanoato (#@2). A uma solução de #3 (8,4 g, 22 mmol, 1 eq.) em 1,2-dicloroetano (25 mL, 0,88 M) foram adicionadas peneiras moleculares (4 Å, 0,7 g) e esponja de Próton (1,8-bis(dimetilamino) naftaleno) (13,4 g, 59,2 mmol, 2,7 eq.), seguidas por trimetiloxônio tetrafluoroborato (9,10 g, 61,6 mmol, 2,8 eq.).
Depois da agitação durante a noite, a mistura de reação foi filtrada através de Celite. O filtrado foi concentrado in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 40% de 1:1 acetona: etil acetato em heptano) para fornecer #@2 (8,7 g, 68%) como um óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 7,28-7,40 (m, 5H), 5,01-5,13 (m, 2H), 3,89-4,08 (br m, 1H), 3,70 3,82 (m, 1H), 3,18 e 3,26 (2 s, 3H total), 2,66 e 2,71 (2 br s, 3H total), 2,44-2,53 (m, 1H, assumido; parcialmente obscuro pelo pico do solvente), 2,17-2,24 (m, 1H), 1,71-1,86 (br m, 1H), 1,39 e 1,39 (2 s, 9H total), 1,31- 1,40 (m, 1H), 0,94-1,08 (m, 1H), 0,76-0,91 (m, 6H).
[0792] Etapa 5. Sínteses de terc-butil (3R, 4S, 5S)-3-metóxi-5-metil-4-(metilamino) heptanoato, sal de cloridrato (#4). A uma solução de #@2 (13,37 g, 33,98 mmol, 1 eq.) em metanol (134 mL, 0,1 M) e ácido clorídrico concentrado (3,1 mL, 37,4 mmol, 1,1 eq.) foram adicionados 10% de paládio sobre carbono (50% úmido) (0,1% em peso; 1,34 g, 3,40 mmol). A mistura foi hidrogenada a 45 psi durante 3 horas, em seguida, purgada com nitrogênio, filtrada através de Celite e concentrada in vacuo para fornecer #4 (9,20 g, 92%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 9,65 (br s, 1H), 8,97 (br s, 1H), 3,98-4,04 (m, 1H), 3,40 (s, 3H), 3,06-3,13 (br m, 1H), 2,82 (br dd, J = 6, 5 Hz, 3H), 2,74-2,80 (m, 1H), 2,68 (dd, metade do padrão de ABX, J = 16,3, 4,2 Hz, 1H), 2,00-2,10 (br m, 1H), 1,73-1,84 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,38-1,45 (m, 1H), 1,13 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,99 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
[0793] Etapa 6. Sínteses de terc-butil (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoato(#5). A uma mistura de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valina (18,53 g, 54,60 mmol, 1,3 eq.) e 2-cloro-4,6-dimetóxi-1,3,5-triazina (CDMT) (9,58 g, 54,6 mmol, 1,3 eq.) em 2- metiltetrahidrofurano (118,00 mL, 0,34 M) foi adicionada N-metilmorfolina (6,52 mL, 59,1 mmol, 1,5 eq.) seguida por #4 (11,80 g, 39,9 mmol, 1 eq.). Após 3 horas, a reação foi resfriada bruscamente com água (50 mL) e agitada durante 15 minutos. A camada aquosa foi separada e re-extraída com 2-metiltetrahidrofurano (50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (50 mL), secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, e concentradas in vacuo para fornecer um óleo incolor, o qual foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 5% a 40% de acetato etil em heptano) para fornecer #5 (26,2 g, 91%) como uma espuma incolor. LC-MS (Protocolo I) m/z 581,3 [M + H+] 604,3 [M + Na+], tempo de retenção = 4,993 minutos; 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6), possivelmente em uma mistura de rotâmeros, sinais característicos principais: δ 7,88 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,71 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,41 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,27-7,34 (m, 2H), 4,13-4,32 (m, 4H), 3,70-3,82 (br m, 1H), 3,24 (s, 3H), 2,92 (br s, 3H), 2,54 (dd, J = 15,7, 2,4 Hz, 1H), 2,17 (dd, J = 15,4, 9,4 Hz, 1H), 1,95-2,07 (m, 1H), 1,70-1,83 (br m, 1H), 1,40 (s, 9H), 0,83-0,94 (m, 9H), 0,69 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
[0794] Etapa 7A. Sínteses de terc-butil (3R, 4S, 5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil-(L- valil)-amino]-heptanoato (#6). A uma solução de #5 (26 g, 42 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (260 mL, 0,16 M) foi adicionada dietilamina (22 mL) ao longo de 30 minutos. A reação foi agitada durante cerca de 6 horas e a suspensão foi, em seguida, filtrada através de Celite e lavada com tetrahidrofurano adicional (25 mL). O filtrado foi concentrado in vacuo para fornecer um óleo amarelo pálido, o qual foi novamente dissolvido em 2-metiltetrahidrofurano (50 mL) e concentrado mais uma vez para assegurar a remoção completa de dietilamina. O óleo bruto de #6 (> 15,25 g) foi levado para a etapa seguinte sem purificação adicional.
[0795] Etapa 7B. Sínteses de ácido (3R, 4S, 5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanóico (#@5). De acordo com o procedimento geral B, a partir de #5 (1,62 g, 2,79 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,3 M) e ácido trifluoroacético (3 mL) foram sintetizados #@5 (1,42 g, 97%) como um sólido que foi usado sem purificação adicional. LC-MS m/z 525,3 [M + H+] 547,3 [M + Na+] tempo de retenção = 0,95 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), sinais característicos: δ 7,89 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,71 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,59 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,41 (dd, J = 7,6, 7,4 Hz, 2H), 7,28-7,34 (m, 2H), 4,14-4,32 (m, 4H), 3,24 (s, 3H), 2,92 (br s, 3H), 2,51 2,57 (m, 1H, assumido; parcialmente obscuro pelo pico do solvente), 2,20 (dd, J = 15,9, 9,5 Hz, 1H), 1,95-2,06 (m, 1H), 1,70-1,83 (br m, 1H),
1.22- 1,36 (br m, 1H), 0,84-0,93 (m, 9H), 0,70 (t, J = 7,3 Hz, 3H).
[0796] Etapa 8. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N- [(3R,4S,5S)-1-tert-butóxi-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#7). A uma mistura de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil]-N-metil-L-valina (19,54 g, 55,29 mmol, 1,3 eq.) e #6 (15,25 g, 42,54 mmol, 1 eq.) em 2-metiltetrahidrofurano (152 mL, 0,28 M) foi adicionada 2-cloro-4,6-dimetóxi-1,3,5-triazina (CDMT) (9,71 g, 55,3 mmol, 1,3 eq.). Depois de 10 minutos, N-metilmorfolina (6,6 mL, 60 mmol, 1,4 eq.) foi adicionada lentamente, mantendo a temperatura interna abaixo de 25°C. A reação foi agitada durante 4 horas e foi, em seguida, resfriada bruscamente pela adição de água (50 mL). Depois da agitação durante 15 minutos, a camada aquosa foi separada e re-extraída com 2-metiltetrahidrofurano (50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (100 mL), em seguida, foram secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, e concentradas in vacuo. A espuma amarela resultante foi purificada por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 5% a 35% de etil acetato em heptano) para fornecer #7 (32 g, 97%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,41 (br dd,
J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,29-7,34 (m, 2H), 4,52-4,69 (br m, 1H), 3,70-3,82 (br m, 1H), 3,22 e 3,25 (2 br s, 3H total), 2,94 e 2,96 (2 br s, 3H total), 2,78 e 2,81 (2 br s, 3H total), 2,11-2,23 (m, 1H), 1,90-2,10 (m, 2H), 1,68-1,83 (br m, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,21- 1,33 (br m, 1H).
[0797] Etapa 9. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N- [(2R,3S,4S)-1-carbóxi-2-metóxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#8). Para #7 (32 g, 46 mmol, 1 eq.) em diclorometano (160 mL, 0,29 M) foi adicionado gota a gota durante 10 minutos de ácido trifluoroacético (17,4 mL, 231 mmol, 5 eq.). Após 6 horas, a mesma quantidade de ácido trifluoroacético foi adicionada e a reação foi continuada durante 18 horas. A mistura de reação foi diluída com tolueno (320 mL) e concentrada in vacuo para fornecer #8 (35,8 g, 97%) como um óleo rosado, o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,90 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,41 (br dd, J = 7,4, 7,0 Hz, 2H), 7,29-7,35 (m, 2H), 4,54-4,68 (br m, 1H), [4,09 (d, J = 11 Hz) e 4,22 (d, J = 10,9 Hz ), 1H total], 3,74-3,84 (br m, 1H), 3,22 e 3,24 (2 br s, 3H total), 2,94 e 2,96 (2 br s, 3H total), 2,78 e 2,80 (2 br s, 3H total), 2,13-2,24 (m, 1H), 1,89-2,10 (br m, 2H), 1,70-1,81 (br m, 1H).
[0798] Preparação de ácido (2R, 3R)-3-[(2S)-1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3- metóxi-2-metilpropanóico (# 11; “Boc-Dap-ácido”)
[0799] Etapa 1. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R, 2S)-1-hidróxi-2-metilbut-3-en-1- il]pirrolidina-1-carboxilato (#9). A uma solução de terc-butil (2S)-2-formilpirrolidina-1- carboxilato (10 g, 50 mmol, 1 eq.) em diclorometano (120 mL, 0,42 M) foi adicionado potássio (2Z)-2-buten-1-iltrifluoroborato (9,76 g, 60,2 mmol, 1,2 eq.) seguido por brometo de tetra-n-butilamônio (3,24 g, 5,02 mmol, 0,1 eq.) e água (60 mL). Após 13 horas, a reação foi diluída com diclorometano (150 mL) e água (150 mL). A camada aquosa foi separada e re-extraída com diclorometano (100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de cloreto de sódio aquoso (5% em peso, 200 mL), lavadas com água (200 mL), e concentradas in vacuo para fornecer #9 (~13 g) como um óleo laranja, o qual foi utilizado sem mais purificação. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,61-5,86 (br m, 1H), 4,97-5,09 (m, 2H), 3,80-3,98 (br m, 2H), 3,45-3,67 (br m, 1H), 3,21- 3,29 (m, 1H), 2,14-2,26 (m, 1H), 1,80-2,04 (m, 3H), 1,65-1,76 (m, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,12 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0800] Etapa 2. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R, 2S)-1-metóxi-2-metilbut-3-en-1-il] pirrolidina-1-carboxilato (#10). Hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 3,38 g, 84,4 mmol, 1,1 eq.) foi combinado com hexano (40 mL), e a mistura foi submetida à agitação mecânica rápida, durante 5 minutos. Os sólidos foram deixados a assentar e o hexano foi removido. Este procedimento foi repetido duas vezes para remover o óleo mineral. N, N-dimetilformamida (59 mL, 1,3 M) foi adicionado e a mistura foi arrefecida a 0°C; metil iodeto (5 mL; 81 mmol, 1,05 eq.) foi, em seguida, adicionado gota a gota, seguido pela adição gota a gota de uma solução de #9 (19,6 g, 76,8 mmol, 1 eq.) em N,N-dimetilformamida ( 59 mL) ao longo de 5 minutos, mantendo a temperatura entre 0°C e 5°C. A reação foi agitada a 0°C durante 2 horas. A reação foi resfriada bruscamente com solução de cloreto de amônio aquoso saturado (150 mL), vertida em solução de cloreto de sódio aquoso (5% em peso, 300 mL), e a mistura foi extraída com etil acetato (3 x 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com 10% de solução de cloreto de sódio aquoso (2 x 300 mL), lavadas com água (200 mL), e novamente concentradas in vacuo. O óleo úmido em água resultante foi reconcentrado a partir de etil acetato (150 mL) e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 2% a 10% de etil acetato em heptano) para fornecer #10 (15,0 g, 73%) como um óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, CDCl3),
presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 5,60-5,83 (m, 1H), 4,91-5,06 (m, 2H), 3,81-3,95 (br m, 1H), 3,43 (s, 3H), 3,36-3,61 (m, 2H), 3,19-3,31 (m, 1H), 2,09-2,21 (m, 1H), 1,86-2,02 (br m, 2H), 1,62-1,85 (br m, 2H), 1,47 e 1,49 (2 s, 9H total), 1,09 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0801] Etapa 3. Sínteses de ácido (2R, 3R)-3-[(2S)-1-(terc-butoxicarbonil) pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanóico (#11). Para #10 (25,0 g, 92,8 mmol, 1 eq.) em terc- butanol (100 mL, 0,93 M) foi adicionada imediatamente água (30,00 mL), seguida por N-metilmorfolina-N-óxido (25,97 g, 192,1 mmol, 2,07 eq.) e tetróxido de ósmio (235,93 mg, 928,04 µmol, 0,01 eq.). Após 12 horas, a mistura foi concentrada in vacuo usando água (20 mL) para remover azeotropicamente terc-butanol residual. O resíduo foi repartido entre etil acetato (500 mL) e água (500 mL) com salmoura (150 mL). A camada aquosa foi re-extraída com etil acetato (250 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de cloreto de sódio aquosa (10% em peso, 200 mL), lavadas com água (150 mL), e concentradas in vacuo para fornecer um óleo castanho pálido úmido em água, que foi reconcentrado a partir de etil acetato (100 mL) para remover qualquer água remanescente. Este diol bruto (34,76 g) foi utilizado sem purificação adicional. Para o diol bruto (34,76 g, 92,8 mmol, 1 eq.) em acetonitrila (347 mL, 0,1 M) e água (174 mL) foi adicionado permanganato de sódio (2,03 g, 5,73 mmol, 0,05 eq.). A mistura foi arrefecida a 0°C e periodato de sódio (51,46 g, 240,6 mmol, 2,1 eq.) foi adicionado em porções ao longo de 30 minutos, mantendo a temperatura interna abaixo de 5°C. A reação foi agitada a 0°C durante 4 horas e foi, em seguida, vertida em uma solução de pentahidrato de tiossulfato de sódio (65,40 g, 263,5 mmol, 2,3 eq.) em água (100 mL). A mistura foi filtrada através de Celite e o filtrado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi repartido entre etil acetato (200 mL) e água (200 mL). A camada aquosa foi re-extraída com etil acetato (250 mL), e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com 10% de uma solução de ácido cítrico aquoso. À medida que o produto desejado era muito solúvel em água, todas as camadas aquosas foram combinadas, tratadas com Celite (100 g) e concentradas in vacuo, para originar uma pasta esbranquiçada. O etil acetato (150 mL) foi adicionado e a mistura foi reconcentrada para remover qualquer água residual; esta operação foi repetida mais uma vez. A pasta foi tratada com etil acetato (150 mL) e colocada in vacuo, a 50°C durante 10 minutos e filtrada (repetida duas vezes). Estes filtrados foram combinados com a camada orgânica anterior (a partir de lavagem com ácido cítrico), concentrados, diluídos com etil acetato (200 mL) e filtrados através de Celite para remover os sólidos. Finalmente, este filtrado foi concentrado para produzir #11 (22,9 g, 69% ao longo de duas etapas) como espuma amarelada/castanho. LCMS (Protocolo I): m/z 310,1 [M + Na+], 232,1 [(M-2-metilprop-1-eno) + H+], 188,1 [(M - Boc) + H+], tempo de retenção = 3,268 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), sinais característicos: δ 3,61-3,85 (br m, 2H), 3,20-3,45 (br m, 4H), 3,03-3,17 (br m, 1H), 1,59-1,93 (br m, 4H), 1,40 (br s, 9H), 1,02-1,18 (br m, 3H).
[0802] Preparação de (2R,3R)-3-Metóxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]- 3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (#19) e (2R,3R)-3- metóxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2- il]propanotioamida, sal de ácido trifluoroacético (#18) - $ % . / ' % ( ) % " * + ,$ 0/ ' % ( ) % $ % 0 112 $ % &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
[0803] Etapa 1. Síntese de N -(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalaninamida (#12). A uma solução de Boc-Phe-OH (30,1 g, 113 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (378 mL, 0,3 M) arrefecida a -10ºC foram adicionados N-metilmorfolina (13,6 mL, 124 mmol, 1,09 eq.), e etil cloroformiato (11,8 mL, 124 mmol, 1,09 eq.). Após 20 minutos, 30% de uma solução de hidróxido de amônio aquoso (45 mL, 350 mmol, 3,1 eq.) foram adicionados. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas antes de ser concentrada in vacuo. O resíduo foi diluído com etil acetato e lavado sequencialmente com 1 N de solução de bissulfato de potássio aquoso, água e salmoura. A camada orgânica foi, em seguida, seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. O sólido branco foi dissolvido (este aquecimento necessário com agitação) em etil acetato (cerca de 400 mL); a solução foi, em seguida, deixada arrefecer à temperatura ambiente antes da adição de hexano (~1000 mL). Depois de alguns minutos, um material branco começou a precipitar a partir da mistura de reação. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com heptano (2 x ~150 ml), e seco sob vácuo durante 18 horas para fornecer #12 (24,50 g, 82%) como um sólido. LC- MS: m/z 263,2 [M-H+], 309,2 [M + HCO2-], tempo de retenção = 1,85 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, rotâmero principal: δ 7,35 (br s, 1H), 7,22-7,30 (m, 5H), 7,00 (br s, 1H), 6,78 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,09 (ddd, J = 10, 9, 4,5 Hz, 1H), 2,95 (dd, J = 13,8, 4,4 Hz, 1H), 2,72 (dd, J = 13,7, 10,1 Hz, 1H), 1,30 (s, 9H).
[0804] Etapa 2. Sínteses de terc-butil-[(2S)-1-amino-3-fenil-1-tioxopropan-2-il] carbamato (#13). A uma solução de #12 (14,060 g, 53,192 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (180 mL, 0,296 M), foi adicionada 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3,2,4- ditiadifosfetano-2,4-ditiona (reagente de Lawesson) (12,70 g, 31,40 mmol, 0,59 eq.) e a reação foi submetida a refluxo durante 90 minutos. A reação foi arrefecida à temperatura ambiente e resfriada bruscamente pela adição de solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada. A mistura foi extraída duas vezes com etil acetato e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas in vacuo. O resíduo foi dissolvido em etil acetato, concentrado in vacuo sobre sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de etil acetato em heptano), fornecendo #13 (11,50 g, 77%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 279,4 [M-H+], 225,2 [(M - 2-metil-prop-1-eno) + H+], 181,2 [(M - Boc) + H+]; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, rotâmero principal: δ 9,60 (br s, 1H), 9,19 (br s, 1H), 7,23-7,32 (m, 5H), 6,82 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,44 (ddd, J = 9,4, 9,1, 4,4 Hz, 1H), 3,00 (dd, J = 13,7, 4,5 Hz, 1H), 2,79 (dd, J = 13,6, 9,9 Hz, 1H), 1,29 (s, 9H).
[0805] Etapa 3. Sínteses de terc-butil-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil] carbamato (#14). A uma mistura de #13 (5,65 g, 20,2 mmol, 1 eq.) em acetona (101 mL, 0,2 M) foi adicionado bromoacetaldeído dietil acetal (8,76 mL, 58,2 mmol, 2,89 eq.) e 2 gotas de ácido clorídrico de 4 M em dioxano. A mistura foi desgaseificada com nitrogênio, por três vezes, antes de ser aquecida ao refluxo. Após 2 horas, a reação foi arrefecida à temperatura ambiente e concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em etil acetato, lavado com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e lavado com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. O óleo laranja bruto resultante foi diluído com etil acetato antes de ser concentrado in vacuo sobre sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 35% de etil acetato em heptano) e, em seguida, por cromatografia de fase reversa (Método A), para fornecer #14 (625 mg, 10%); HPLC (Protocolo E): m/z 304,5 [M + H+], 248,9 [(M - 2-metil-prop-1-eno) + H+], tempo de retenção = 7,416 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, rotâmero principal: δ 7,75 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,75 (br d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,61 (br d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,25-7,30 (m, 5H), 4,99 (ddd, J = 10,5, 8,9, 4,5 Hz, 1H), 3,29-3,36 (m, 1H, assumido; parcialmente obscuro por sinal de água), 2,98 (dd, J = 13,8, 10,6 Hz, 1H), 1,31 (s, 9H).
[0806] Etapa 4. Sínteses de (1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etanamina, sal de cloridrato (#15). De acordo com o procedimento geral C, a partir de #14 (1,010 g, 3,318 mmol, 1 eq.), dioxano (10 mL, 0,33 M) e uma solução de ácido clorídrico em dioxano a 4 M (20 mL, 80 mmol, 20 eq.) foram sintetizados #15 (775 mg, 97%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,95-9,07 (br m, 3H), 7,86 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,18-7,28 (m, 3H), 7,10-7,15 (m, 2H), 4,98-5,07 (m, 1H), 3,49 (dd, J = 13,3, 4,9 Hz, 1H), 3,18 (dd, J = 13,4, 10,2 Hz, 1H).
[0807] Etapa 5. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidina-1-carboxilato (#16). A uma solução de #11 (280 mg, 0,974 mmol, 1 eq.) e #15 (460 mg, 1,44 mmol, 1,48 eq.) em N, N-dimetilformamida (3 mL, 0,32 M) a 0°C foi adicionado cianeto de dietilfosforil (DEPC) (93% de pureza, 212 µL, 1,30 mmol, 1,34 eq.), seguido por trietilamina (367 µL, 2,63 mmol, 2,7 eq.). Após 2 horas a 0°C, a mistura de reação foi aquecida à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura de reação foi, em seguida, diluída com etil acetato: tolueno (2:1, 30 mL) e lavada, sucessivamente, com 1 M de solução de bissulfato de sódio aquosa (35 mL) e 50% de solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (4 x 25 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, concentrada in vacuo, e purificada por cromatografia em sílica gel (12% a 100% de etil acetato em heptano) para fornecer #16 como um óleo âmbar claro (374 mg, 81%). LC-MS: m/z 474,4 [M + H+], 374,4 [(M - 2-metil-prop-1-eno) + H+] Tempo de retenção = 3,63 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), sinais característicos: δ 8,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,21-7,31 (m, 4H), 7,14-7,20 (m, 1H), 5,40 (ddd, J = 11,4, 8,5, 4,0 Hz, 1H), 3,23 (br s, 3H), 2,18 (dq, J = 9,7, 6,7 Hz, 1H), 1,06 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0808] Etapa 6A. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidina-1-carboxilato (# 17). Uma mistura de #16 (350 mg, 0,739 mmol, 1 eq.) e 2,4-bis (4-metoxifenil)-1,3,2,4-
ditiadifosfetano-2,4-ditiona (reagente de Lawesson) (324 mg, 0,776 mmol, 1,05 eq.) em tolueno (6 ml, 0,1 M) foi aquecida a 100oC. Após 10 minutos, a mistura foi arrefecida à temperatura ambiente. O material insolúvel foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 12% a 80% de etil acetato em heptano) e, em seguida, por cromatografia de fase reversa (Método E2) para fornecer #17 (120 mg, 33%); HPLC (Protocolo J): m/z 490,2 [M + H+], tempo de retenção = 10,069 minutos; [ ]20D - 110 (c 0,24, MeOH); 1H RMN (400 MHz, CD3OD), sinais característicos: δ 7,78 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,32-7,37 (m, 2H), 7,24-7,30 (m, 2H), 7,17-7,23 (m, 1H), 6,52-6,61 (br m, 1H), 3,62 (br dd, J = 15, 4 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 2,98-3,09 (br m, 1H), 2,53-2,64 (br m, 1H), 1,60-1,78 (m, 2H), 1,49 (s, 9H), 1,27 (d, J = 6,5 Hz, 3H).
[0809] Etapa 6B. Sínteses de (2R,3R)-3-metóxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanetioamida, sal de ácido trifluoroacético (#18). De acordo com o procedimento geral B, a partir de #17 (198 mg, 0,404 mmol, 1 eq.), diclorometano (6 ml, 0,07 M) e ácido trifluoroacético (2 mL) foram sintetizados #18 (185 mg, 91%), os quais foram usados sem purificação adicional. LC-MS: m/z 390,1 [M + H+], tempo de retenção = 0,57 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,91 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 9,07-9,20 (br m, 1H), 7,86-8,00 (br m, 1H), 7,83 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,27-7,36 (m, 4H), 7,21-7,26 (m, 1H), 6,33 (ddd, J = 11,3, 8,3, 4,4 Hz, 1H), 3,76-3,82 (m, 1H), 3,56 (dd, J = 14,6, 4,3 Hz, 1H), 3,45 (s, 3H), 3,28 (dd, J = 14,6, 11,3 Hz, 1H), 3,02-3,12 (br m, 1H), 2,89-3,00 (br m, 1H), 2,72-2,89 (m, 2H), 1,69-1,83 (br m, 1H), 1,43-1,58 (m, 2H), 1,20-1,33 (m, 1H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0810] Etapa 7. Sínteses de (2R,3R)-3-metóxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (# 19). De acordo com o procedimento geral B, a partir de #16 (607 mg, 1,28 mmol, 1 eq.),
diclorometano (10 mL, 0,13 M) e ácido trifluoroacético (2 mL) foram sintetizados #19 (640 mg, quantitativo), os quais foram usados na etapa seguinte, sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,96-9,07 (br m, 1H), 8,89 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,87-8,00 (br m, 1H), 7,80 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,28-7,34 (m, 4H), 7,20-7,27 (m, 1H), 5,43 (ddd, J = 11,3, 8,6, 4,2 Hz, 1H), 3,42-3,50 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,04-3,14 (br m, 1H), 2,99 (dd, J = 14,2, 11,5 Hz, 1H), 2,92-3,02 (m, 1H), 2,78-2,88 (br m, 1H), 2,34-2,42 (m, 1H), 1,73-1,84 (br m, 1H), 1,55-1,68 (m, 1H), 1,38-1,53 (m, 2H), 1,15 (d, J = 6,9 Hz, 3H).
[0811] Preparação de ácido (2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-N-(2-feniletil)-3-[(2S)- pirrolidin-2-il]propanotioamida, sal de cloridrato (#23) e (2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-N- (2-feniletil)-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de cloridrato (# 24) $ % & % 2 $ % 3 &+ %
[0812] Etapa 1A. Sínteses de terc-butil (2S)-2-{(1R, 2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- [(2-feniletil) amino]propil}-pirrolidina-1-carboxilato (#20). Para #11 (22 g, 77 mmol, 1 eq.) em diclorometano (383 mL, 0,2 M) e N, N-dimetilformamida (30 mL) foram adicionados diisopropiletilamina (26,9 ml, 153 mmol, 2 eq.), 2-feniletilamina (11,6 mL, 91,9 mmol, 1,2 eq.) e HATU (39,0 g, 99,5 mmol, 1,3 eq.). A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (700 mL) e lavado, sequencialmente, com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 200 mL) e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada in vacuo. O material bruto foi retomado em diclorometano e filtrado. O filtrado foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de etil acetato em heptano) para fornecer #20 (24 g, 80%) como um sólido esbranquiçado. LC-MS: m/z 392,2 [M +2 H+], 291,1 [(M - Boc) + H+], tempo de retenção = 0,88 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 7,80-7,89 (br m, 1H), 7,23-7,29 (m, 2H), 7,15-7,23 (m, 3H), 3,72-3,82 e 3,55-3,62 (2 br m, 1H total), 3,45-3,55 (br m, 1H), 3,31-3,44 (br m, 2H), 3,29 (s, 3H), 3,12-3,25 (br m, 1H), 2,98-3,12 (br m, 1H), 2,71 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,09-2,19 (m, 1H), 1,71-1,83 (br m, 2H), 1,60-1,70 (br m, 1H), 1,49-1,60 (br m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,03 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
[0813] Etapa 1B. Sínteses de dipiridínio-1-ilpentatiodifosfonato (#21).
Pentassulfureto fosforoso (4,45 g, 2,19 mL, 20 mmol, 1 eq.) foi adicionado à piridina (56 mL, 0,36 M) a 80°C e a mistura foi aquecida a refluxo (115°C) durante 1 hora. A mistura foi arrefecida à temperatura ambiente e o produto foi recolhido por filtração para fornecer #21 como um sólido amarelo (4,57 g, 60%); pf: 165-167°C (decomposição); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,78-8,84 (m, 4H), 8,22-8,30 (m, 2H), 7,76-7,83 (m, 4H).
[0814] Etapa 2A. Sínteses de terc-butil (2S)-2-{(1R, 2R)-1-metóxi-2-metil-3-[(2- feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidina-1-carboxilato (#22). Uma mistura de #20 (1,200 g, 3,073 mmol, 1 eq.) e #21 (1,40 g, 3,69 mmol, 1,2 eq.) em acetonitrila (15 mL, 0,20 M) foi submetida à radiação de micro-ondas a 100°C durante 30 minutos. A mistura de reação foi, em seguida, arrefecida à temperatura ambiente, diluída com etil acetato (150 mL), e lavada sequencialmente com 0,5 M de uma solução de ácido clorídrico aquoso (100 mL) e salmoura (2 x 50 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio, filtrada, e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 20% a 80% de etil acetato em heptano) para fornecer #22 (670 mg, 54%) como um sólido do tipo cera branco; pf: 107-
109°C; LC-MS: m/z 407,4 [M + H+], 351,3 [(M - 2-metil-prop-1-eno) + H+], 307,3 [(M - Boc) + H+], tempo de retenção = 0,99 minuto; 1H RMN (400 MHz, CD3CN), presume- se ser uma mistura de rotâmeros: δ 8,28 (br s, 1H), 7,19-7,33 (m, 5H), 3,81-4,05 (br m, 2H), 3,60-3,81 (br m, 2H), 3,38-3,51 (br m, 1H), 3,36 (s, 3H), 3,02-3,17 (br m, 1H), 2,89-3,02 (m, 2H), 2,50-2,62 (br m, 1H), 1,71-1,85 (br m, 2H), 1,53-1,66 (br m, 2H), 1,45 (br s, 9H), 1,23 (d, J = 6,7 Hz, 3H).
[0815] Etapa 3. Sínteses de (2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-N-(2-feniletil)-3-[(2S)- pirrolidin-2-il] propanotioamida, sal de cloridrato (#23). De acordo com o procedimento C, a partir de #22 (325 mg, 0,799 mmol, 1 eq.), dioxano (5 mL, 0,2 M) e 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano (4 mL, 16 mmol, 20 eq.) foi sintetizado #23 (274 mg, quantitativo) como uma espuma branca; LC-MS: 308,2 [M + H+], tempo de retenção = 0,55 minuto.
[0816] Etapa 2B. Sínteses de (2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-N-(2-feniletil)-3-[(2S)- pirrolidin-2-il] propanamida, sal de cloridrato (#24). A #20 (7,00 g, 17,9 mmol, 1 eq.) em dioxano (50 mL, 0,36 M) e o metanol (2 mL) foram adicionados 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano (20 mL, 80 mmol, 4,4 eq.). Depois da agitação durante 18 horas, a mistura foi concentrada para fornecer #24 (5,86 g, quantitativo) como uma goma, a qual foi utilizada sem purificação adicional; LC-MS: 292,2 [M + H+], tempo de retenção = 0,47 minuto.
[0817] Preparação de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#26)
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[0818] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#25)
[0819] De acordo com o procedimento geral D, a partir de #8 (480 mg, 0,753 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,07 M), N, N-dimetilformamida (2 mL), a amina #18 (401 mg, 0,941 mmol, 1,25 eq.), HATU (372 mg, 0,979 mmol, 1,3 eq.) e trietilamina (367 µL, 2,64 mmol, 3,5 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano) para fornecer #25 (711 mg, 75%) como um sólido. LC-MS: m/z 1009,7 [M + H+], tempo de retenção = 1,15 minutos; HPLC (Protocolo B): m/z 505,3 [M +2 H+]/2, tempo de retenção = 10,138 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,81 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,89 (br d, J = 7 Hz, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) e 7,83 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], [7,64 (d, J = 3,2 Hz) e 7,69 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,62 (br d, J = 7 Hz, 2H), 7,37-7,44 (m, 2H), 7,28-7,35 (m, 4H), 7,20-7,27 (m, 2H), 7,12-7,18 (m, 1H), 6,27-6,35 e 6,40-6,48 (2 m, 1H total), [1,14 (d, J = 6,4 Hz) e 1,17 (d, J = 6,3 Hz), 3H total].
[0820] Etapa 2. Sínteses de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#26). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #25 (701 mg, 0,694 mmol) em diclorometano (10 mL, 0,07 M) e dietilamina (10 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer um sólido vítreo. Dietil éter e heptano foram adicionados e a mistura foi concentrada in vacuo, produzindo #26 (501 mg, 92%) como um sólido branco. HPLC (Protocolo A): m/z 787,4 [M + H+], tempo de retenção = 7,229 minutos (pureza> 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume- se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,81 (br d, J = 8 Hz.), 1H total], [7,99 (br d, J = 9 Hz) e 8,00 (br d, J = 9 Hz), 1H total], [7,80 (d, J = 3,3 Hz) e 7,83 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], [7,65 (d, J = 3,2 Hz) e 7,69 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,29-7,34 (m, 2H), 7,19-7,28 (m, 2H), 7,13-7,19 (m, 1H), [6,31 (ddd, J = 11, 8, 4,5 Hz) e 6,45 (ddd, J = 11,5, 8, 4,5 Hz), 1H total], [4,57 (dd, J = 8,9, 8,7 Hz) e 4,63 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz), 1H total], 3,16, 3,21, 3,24 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,96 e 3,03 (2 br s, 3H total), [1,14 (d, J = 6,6 Hz) e 1,17 (d, J = 6,4 Hz), 3H total].
[0821] Preparação de N2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#30) 0&.* & % / % % $
[0822] Etapa 1. Sínteses de terc-butil (3R, 4S, 5S)-4-[{N-[(1-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}-ciclopentil)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-
metilheptanoato (#27). A partir de #6 (287 mg, 0,801 mmol, 1 eq.) em diclorometano (4 mL, 0,2 M) foram adicionados ácido 1-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino} ciclopentanocarboxílico (309 mg, 0,879 mmol, 1,1 eq.), diisopropiletilamina (281 µL, 1,60 mmol, 2 eq.) e HATU (376 mg, 0,960 mmol, 1,2 eq.). A mistura foi agitada durante 18 horas e diluída com etil acetato (15 mL). A mistura de reação foi lavada com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 5 mL) e com salmoura (5 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. O material bruto foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 60% de etil acetato em heptano) para fornecer #27 (502 mg, 91%) como uma espuma branca. LC-MS: m/z 692,3 [M + H+], 714,3 [M + Na+], 636,3 [(M - 2-metil-prop-1-eno) + H+], tempo de retenção = 1,13 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), sinais característicos: δ 7,89 (br d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,67-7,75 (m, 2H), 7,60 (br s, 1H), 7,38- 7,44 (m, 2H), 7,30-7,36 (m, 2H), 7,21 (br d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,44-4,59 (m, 2H), 4,17- 4,27 (m, 3H), 3,68-3,78 (br m, 1H), 3,21 (s, 3H), 2,88 (br s, 3H), 2,09-2,20 (m, 2H), 1,39 (s, 9H).
[0823] Etapa 2. Sínteses de ácido (3R, 4S, 5S)-4-[{N-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil] amino}-ciclopentil) carbonil]-L-valil} (metil) amino]-3-metóxi-5- metilheptanóico (#28). A uma solução de #27 (500 mg, 0,723 mmol) em diclorometano (7 mL, 0,1 M) foi adicionado ácido trifluoroacético (3 mL). A mistura de reação tornou-se inicialmente laranja, em seguida, escureceu ao longo do tempo. Depois da agitação durante 18 horas, o solvente foi removido in vacuo para fornecer #28 (460 mg, quantitativo) como um vidro marrom escuro, o qual foi utilizado sem purificação adicional. LC-MS: m/z 636,3 [M + H+].
[0824] Etapa 3. Sínteses de N2-[(1-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}- ciclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#29). De acordo com o procedimento geral D,
a partir de #28 (50 mg, 0,079 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3 mL, 0,03 M), N, N- dimetilformamida (0,5 mL), amina #18 (44 mg, 0,087 mmol, 1,1 eq.), trietilamina (33,0 µL, 0,237 mmol, 3 eq.) e HATU (36 mg, 0,95 mmol, 1,2 eq.) foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano) para fornecer #29 (59 mg, 67%) como um sólido. LC-MS: m/z 1007,5 [M + H+], tempo de retenção = 1,11 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,80 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,89 (br d, J = 7 Hz, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) e 7,82 (d, J = 3,1 Hz), 1H total], 7,68-7,75 (m, 2H), [7,64 ( d, J = 3,2 Hz) e 7,68 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,38-7,44 (m, 2H), 7,27- 7,36 (m, 4H), 7,12-7,25 (m, 4H), [6,30 (ddd, J = 11, 8, 4,5 Hz) e 6,39-6,48 (m), 1H total], [4,50 (br dd, J = 8, 8 Hz) e 4,54-4,59 (m), 1H total], 4,17-4,29 (m, 3H), 2,89 e 2,96 (2 br s, 3H total), [1,13 (d, J = 6,5 Hz) e 1,16 (d, J = 6,4 Hz), 3H total].
[0825] Etapa 4. Sínteses de N2-[(1-aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#30). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #29 (54 mg, 0,054 mmol) em diclorometano (6 mL, 0,9 mM) e dietilamina (4 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer o Exemplo #30 (26 mg, 61%) como um sólido. HPLC (protocolo A): tempo de retenção = 7,233 minutos, m/z 785,4 [M + H+], (pureza > 72%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,82 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 8,19-8,27 (m, 1H), [7,80 (d, J = 3,2 Hz) e 7,83 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], [7,65 (d, J = 3,3 Hz) e 7,69 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,28-7,33 (m, 2H), 7,20-7,27 (m, 2H), 7,14-7,19 (m, 1H), [6,31 (ddd, J = 11, 8, 4,5 Hz) e 6,44 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz), 1H total], [4,53 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,60 (dd, J = 9,
7,5 Hz), 1H total], 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,17 e 3,21 (2 s, 3H total), 2,93 e 3,00 (2 br s, 3H total), [1,14 (d, J = 6,5 Hz) e 1,17 (d, J = 6,5 Hz), 3H total].
[0826] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#34) 4&* &5& % ,
[0827] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-1-tert-butóxi-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#31). A uma solução de #6 (70% puro, 3,13 g, 6,1 mmol, 1 eq.) em diclorometano (40 mL, 0,15 M) foram adicionados N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil]-2-metilalanina (1,99 g, 6,12 mmol, 1 eq.), diisopropiletilamina (2,67 mL, 15,3 mmol, 2,5 eq.) e HATU (2,79 g, 7,35 mmol, 1,2 eq.). A mistura de reação foi agitada durante 18 horas, diluída com etil acetato, lavada com 1 M de solução aquosa de ácido clorídrico e lavada com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo sobre sílica. O material foi, em seguida, purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 45% de etil acetato em heptano) para fornecer #31 (3,65 g, 90%) como um sólido. LC-MS: m/z 665,5 [M + H+], 688,5 [M + Na+], 610,5 [(M - 2-metil-prop-1-eno) + H+]; HPLC (Protocolo C): tempo de retenção = 9,455 (pureza > 94%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), sinais característicos: δ 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,67-7,74 (m, 2H), 7,39-7,48 (m, 3H), 7,31-7,36 (m, 2H), 7,29 (br d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,47-4,60 (br m, 1H), 4,47 (dd, J = 8,6, 8,0 Hz, 1H), 4,18-4,28 (m,
3H), 3,69-3,79 (br m, 1H), 3,21 (s, 3H), 2,88 (br s, 3H), 2,15 (dd, J = 15,5, 9,3 Hz, 1H), 1,91-2,01 (m, 1H), 1,67 1,81 (br m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,36 (br s, 3H), 1,30 (s, 3H), 0,75 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,66-0,73 (br m, 3H).
[0828] Etapa 2. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(2R,3S,4S)-1-carbóxi-2-metóxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#32). De acordo com o procedimento geral B, a partir de #31 (500 mg, 0,751 mmol) em diclorometano (7 mL, 0,1 M) e ácido trifluoroacético (3 mL) foi sintetizado #32 como um vidro (458 mg, quantitativo), que foi utilizado na etapa seguinte, sem purificação adicional. LC-MS: m/z 611,4 [M +2 H+], 632,2 [M + Na+], tempo de retenção = 0,94 minuto.
[0829] Etapa 3. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#33). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #32 (53,0 mg, 0,083 mmol, 1 eq.), diclorometano (4 mL, 0,02 M), N, N-dimetilformamida (1 mL), amina #18 (43,8 mg, 0,0870 mmol, 1 eq.), trietilamina (36 µL, 0,26 mmol, 3 eq.) e HATU (39,5 mg, 0,104 mmol, 1,2 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano) para fornecer #33 (60 mg, 69% para as duas etapas). LC-MS: m/z 981,4 [M + H+], tempo de retenção = 1,090 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume- se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,80 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,86-7,91 (m, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) e 7,82 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,68-7,74 (m, 2H), [7,64 (d, J = 3,2 Hz) e 7,68 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,38-7,44 (m, 2H), 7,20-7,36 (m, 6H), 7,12-7,17 (m, 1H), 6,27-6,34 e 6,40 -6,47 (2 m, 1H total), 3,22 e 3,24 (2 s, 3H total), 3,14 e 3,18 (2 s, 3H total), 2,90 e 2,97 (2 br s, 3H total), 1,37 (br s, 3H ), 1,31 (2 br s, 3H total), [1,13 (d, J = 6,6 Hz) e 1,16 (d, J = 6,5 Hz), 3H total].
[0830] Etapa 4. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- thioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#34). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #33 (55 mg, 0,055 mmol, 1 eq.) em diclorometano (6 mL, 0,009 M) e dietilamina (4 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 5% de metanol em diclorometano) para fornecer #34 (25 mg, 60%) como um sólido. HPLC (Protocolo A): m/z 759,4 [M + H+], tempo de retenção = 7,088 minutos (pureza > 75%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,81 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 8,01-8,08 (m, 1H), [7,80 (d, J = 3,1 Hz) e 7,83 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], [7,65 (d, J = 3,2 Hz) e 7,69 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,29-7,33 (m, 2H), 7,20-7,27 (m, 2H), 7,13- 7,19 (m, 1H), 6,27-6,35 e 6,40-6,48 (2 m, 1H total), [4,49 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,56 (dd, J = 9, 8 Hz), 1H total], 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,17 e 3,21 (2 s, 3H total), 2,92 e 2,99 (2 br s, 3H total), 1,20 e 1,21 (2 s, 3H total), 1,12 e 1,13 (2 s, 3H total), 0,75- 0,81 (m, 3H).
[0831] Preparação de N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4- il}-N-metil-L-valinamida (# 36) A"7
[0832] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N- {(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3- tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#35). A uma mistura de #23 (337 mg, 0,983 mmol, 1 eq.) em diclorometano (8 mL, 0,1 M) e N, N-
dimetilformamida (1 mL) foram adicionados #8 (564 mg, 0,885 mmol, 0,9 eq.), diisopropiletilamina (383 mg, 2,95 mmol, 3 eq.) e HATU (472 mg, 1,18 mmol, 1,2 eq.). Após 2 horas, a mistura foi diluída com diclorometano, lavada sequencialmente com 0,1 M de ácido clorídrico aquoso e com salmoura, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada, e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método G) para fornecer #35 (600 mg, 66%); LC-MS: m/z 926,6 [M + H+], tempo de retenção = 1,16 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume- se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [9,94 (br t, J = 5 Hz) e 10,16-10,23 (br m), 1H total], 7,90 (d, J = 7,2 Hz, 2H), [7,71 (br d, J = 7 Hz) e 8,06 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,60-7,65 (m, 2H), 7,41 (br dd, J = 7, 7 Hz, 2H), 7,15-7,36 (m, 7H), 3,29 (s, 3H), 1,16-1,22 (m, 3H).
[0833] Etapa 2. Sínteses de N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2- {(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1- oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#36). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #35 (465 mg, 0,502 mmol, 1 eq.) em diclorometano (5 mL, 0,1 M) e dietilamina (5 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer #36 (310 mg, 88%) como um sólido. LC-MS: m/z 704,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,74 minuto; HRMS: m/z calculado para C38H66N5O5S: 704,4779, encontrado: 704,477 [M + H+]; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,23-7,30 (m, 4H), 7,15-7,22 (m, 1H), [4,68 (d, J = 8,6 Hz) e 4,74 (d, J = 8,0 Hz), 1H total], 3,39 e 3,40 (2 s, 3H total), 3,12 e 3,22 (2 br s, 3H total), [2,82 (d, J = 6,0 Hz) e 2,84 ( d, J = 6,0 Hz), 1H total], 2,29 e 2,30 (2 s, 3H total), [1,27 (d, J = 6,8 Hz) e 1,29 (d, J = 6,6 Hz), 3H total], [0,84 (t, J = 7,4 Hz) e 0,87 (t, J = 7,4 Hz), 3H total].
[0834] Preparação de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-
metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#41) e N- metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1- oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan- 4-il]-N-metil-L-valinamida (#42) 0 % & % 0 $ % &&&&&&&&&&&&&&&&
[0835] Etapa 1. Sínteses de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(tert- butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenillalaninato (#37). A uma mistura de #11 (2,7 g, 9,4 mmol, 1 eq.) em diclorometano (30 mL, 0,3 M) e N, N- dimetilformamida (3 mL) foram adicionados diisopropiletilamina (3,30 mL, 18,8 mmol, 2 eq.), L-fenilalanina metil éster cloridrato (2,03 g, 9,40 mmol, 1,2 eq.) e HATU (4,79 g, 12,2 mmol, 1,3 eq.). A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (100 mL) e lavado sequencialmente com 1 M de ácido clorídrico (2 x 50 mL) e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada in vacuo. O material bruto foi retomado em diclorometano e filtrado. O filtrado foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de etil acetato em heptano) para fornecer #37 (2,76 g, 65%) como um sólido esbranquiçado. LC-MS: m/z 449,3 [M + H+], 349,2 [(M - Boc) + H+] tempo de retenção = 0,88 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 8,28 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,14-7,29 (m, 5H), 4,50 (ddd, J = 10,9, 8,1, 4,4 Hz, 1H), 3,64 (s, 3H), 3,23 (s, 3H), 2,15-2,24 (m, 1H), 1,56-1,76 (m, 2H), 1,31-1,55 (m, 11H), 1,02 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0836] Etapa 2. Sínteses de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-(tert- butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanotiol}-L-fenilalaninato (#38). Uma mistura de #37 (1,52 g, 3,39 mmol, 1 eq.) e #21 (1,68 g, 4,41 mmol, 1,3 eq.) em acetonitrila (12 mL, 0,28 M) foi submetida à radiação de micro-ondas a 100°C durante 1 hora. A mistura foi repartida entre água e etil acetato. A camada aquosa foi re-extraída com etil acetato. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com 10% de solução de ácido cítrico aquosa e com salmoura, secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas in vacuo. O material foi dissolvido em uma pequena quantidade de etil acetato e concentrado sobre sílica in vacuo. A purificação por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de etil acetato em heptano) forneceu #38 (680 mg, 43%); LC-MS: m/z 465,2 [M + H+], 487,3 [M + Na+], 365,2 [(M - Boc) + H+], tempo de retenção = 0,97 minuto; HPLC (Protocolo B): 465,2 [M + H+], 487,2 [M + Na+], 365,2 [(M - Boc) + H+], tempo de retenção = 7,444 minutos (pureza > 98%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 10,23 (br d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17-7,28 (m, 5H), 5,24 (ddd, J = 11, 7,5, 4,5 Hz, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,28 (s, 3H), 3,21 (dd, J = 14,3, 4,4 Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 14,2, 11,2 Hz, 1H), 2,65-2,74 (m, 1H), 1,54-1,71 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,17 (d, J = 6,4 Hz, 3H).
[0837] Etapa 3. Sínteses de metil-N-{(2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2- il]propanotioil}-L-fenilalaninato, sal de cloridrato (#39). De acordo com o procedimento geral C, a 0°C a partir de #38 (660 mg, 1,42 mmol, 1 eq.), dioxano (10 mL, 0,14 M) e 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano (20 mL, 80 mmol, 60 eq.) foram sintetizados #39 (590 mg) como um sólido esbranquiçado, o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS: m/z 365,2 [M + H+], tempo de retenção = 0,58 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,67 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 9,42-9,54 (br m, 1H), 8,21-8,33 (br m, 1H), 7,20-7,35 (m, 5H ), 5,25 (ddd, J = 11,1, 7,6, 4,4 Hz, 1H), 3,76 (dd, J = 8,9, 3,0 Hz, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,39 (s, 3H), 3,24 (dd, J = 14,2, 4,5 Hz, 1H), 3,13 (dd, J = 14,3, 11,0 Hz, 1H), 2,93-3,09 (m, 3H), 2,85-2,93 (m, 1H), 1,72-1,84 (m, 1H), 1,36-1,60 (m, 3H), 1,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0838] Etapa 4. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida (#40). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #8 (247 mg, 0,387 mmol, 1 eq.), #39 (186 mg, 0,450 mmol, 1,2 eq.), diclorometano (10 mL, 0,04 M), N, N-dimetilformamida (2 mL), HATU (176 mg, 0,464 mmol, 1,2 eq) e trietilamina (189 µL, 1,35 mmol, 3,5 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 25% de acetona em heptano) para fornecer #40 (410 mg, 90% nas 2 etapas) como um sólido esbranquiçado. LC-MS: m/z 984,7 [M + H+], 1006,7 [M + Na+], tempo de retenção = 1,15 minutos; HPLC (protocolo C): tempo de retenção = 9,683 minutos (pureza > 99%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,19 (br d, J = 7 Hz) e 10,49 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60-7,65 (m, 2H), 7,38-7,45 (m, 2H), 7,29-7,35 (m, 2H), 7,14- 7,28 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11, 7, 4 Hz) e 5,35-5,43 (m), 1H total], 3,65 e 3,69 (2 s, 3H total), [1,15 (d, J = 6,5 Hz) e 1,18 (d, J = 6,4 Hz), 3H total].
[0839] Etapa 5A. Sínteses de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético
(#41). A uma solução de #40 (401 mg, 0,407 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (10 mL, 0,03 M) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (24,4 mg, 1,02 mmol, 2,5 eq.) em água (5 mL). Após 4 horas, a reação foi concentrada in vacuo e, em seguida, azeotropada três vezes com heptano. O material bruto foi dissolvido em dimetil sulfóxido (7 mL) e purificado por cromatografia de fase reversa (Método C, 7 injeções de 1 mL). As frações apropriadas foram concentradas (Genevac), antes de serem diluídas com uma pequena quantidade de metanol em diclorometano. A mistura foi concentrada in vacuo a um sólido vítreo. O dietil éter foi, em seguida, adicionado, seguido por heptano, e a mistura foi concentrada in vacuo para fornecer #41 (180 mg, 59%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 748,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,68 minuto; HPLC (protocolo A): 748,4 [M + H+], tempo de retenção = 6,922 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 12,9 e 13,1 (2 v br s, 1H total), [10,12 (br d, J = 8 Hz) e 10,45 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 8,75-8,90 (m, 2H), 8,62-8,73 (br m, 1H), 7,13- 7,29 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11, 7,5, 4 Hz) e 5,40 (ddd, J = 11,5, 8,4 Hz), 1H total], 4,55-4,73 (m, 2H), 3,23 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,16 e 3,18 (2 s, 3H total), 2,97 e 3,01 (2 br s, 3H total), 1,13-1,20 (m, 3H), 0,73-0,81 (m, 3H).
[0840] Etapa 5B. Sínteses de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#42). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #40 (561 mg, 0,570 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,057 M) e dietilamina (10 ml), foi sintetizado #42 (348 mg, 80%) como um sólido branco após cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano). LC-MS: m/z 762,7 [M + H+], tempo de retenção = 0,74 minuto; HPLC (protocolo A): 762,4 [M + H+], tempo de retenção = 7,315 minutos (pureza > 95%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,20 (br d, J = 7,5 Hz) e 10,50 (br d, J = 8 Hz),
1H total], 7,95-8,03 (m, 1H), 7,15-7,29 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11, 7,5, 5 Hz) e 5,39 (ddd, J = 11, 7,5, 4 Hz, 1H total], [4,57 (dd, J = 8,8, 8,7 Hz) e 4,61 (dd, J = 8,7, 8,6 Hz), 1H total], 3,65 e 3,69 (2 s, 3H total), 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,16 e 3,17 (2 s, 3H total), 2,96 e 2,99 (2 br s, 3H total), 2,69-2,79 (m, 1H), 2,62-2,68 (m, 1H), 2,14 e 2,15 (2 br s, 3H total), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) e 1,18 (d, J = 6,5 Hz), 3H total], [0,75 (t, J = 7,4 Hz) e 0,76 (t, J = 7,3 Hz), 3H total].
[0841] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de cloridrato (#44) e 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida, sal de cloridrato (# 45) !* % ,-( +! & ( &.(
[0842] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-
metil-L-valinamida (#43). A uma solução de #32 (321 mg, 0,881 mmol, 1 eq.) em diclorometano (5 mL, 0,1 M) e N, N-dimetilformamida (1 mL) foram adicionados #39 (484 mg, 0,769 mmol, 0,9 eq.), HATU (353 mg, 0,881 mmol, 1 eq.) e diisopropiletilamina (463 µL, 2,64 mmol, 3 eq.). Depois da agitação durante 18 horas, a mistura foi diluída com diclorometano, lavada com água e com salmoura, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada, e concentrada em sílica in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano) para fornecer #43 (574 mg, 68% ao longo de duas etapas) como um sólido branco. LC-MS: m/z 956,6 [M + H+], tempo de retenção = 4,49 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,80 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,64-7,72 (m, 2H), 7,16-7,35 (m, 7H), [5,43 (dd, J = 11, 4,5 Hz) e 5,58 (dd, J = 11,5, 4 Hz), 1H total], 3,72 e 3,75 (2 s, 3H total), 3,34 e 3,35 (2 s, 3H total), 3,26 e 3,29 (2 s, 3H total), 3,05 e 3,11 (2 br s, 3H total), 1,39 e 1,40 (2 s, 3H total), [1,24 (d, J = 6,7 Hz) e 1,29 (d, J = 6,4 Hz), 3H total].
[0843] Etapa 2A. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de cloridrato (#44). A uma solução de #43 (100 mg, 0,105 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (5 mL, 0,02 M) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (10 mg, 0,417 mmol, 3 eq.) em água (3 mL). Após 3 horas, a reação foi concentrada in vacuo e purificada por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer um sal de ácido trifluoroacético, o qual foi dissolvido em metanol, tratado com 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano, e concentrado in vacuo para fornecer #44 (56 mg, 71%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 720,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,67 minuto; HPLC (Protocolo D): tempo de retenção = 8,851 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,17-7,31 (m, 5H), 3,34 e 3,35 (2 s, 3H total), 3,10 e 3,16 (2 br s, 3H total), 1,62 e 1,64 (2 s, 3H total), 1,53 e 1,55 (2 s, 3H total), [1,26 (d, J = 6,5 Hz) e 1,30 (d, J = 6,5 Hz), 3H total], 0,84-0,91 (m, 3H).
[0844] Etapa 2B. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de cloridrato (#45). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #43 (176 mg, 0,184 mmol, 1 eq.), diclorometano (4 mL, 0,05 M) e dietilamina (4 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método C). O sal de ácido trifluoracético resultante foi dissolvido em metanol, tratado com uma solução de ácido clorídrico em dioxano a 4 M, e concentrado in vacuo para fornecer #45 (100 mg, 70%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 734,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,72 minuto; 1H RMN (400 MHz, CD3OD), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,18-7,31 (m, 5H), 5,41-5,47 e 5,55-5,62 (2 m, 1H total), 3,73 e 3,76 (2 s, 3H total), 3,35 e 3,36 (2 s, 3H total), 3,10 e 3,15 (2 br s, 3H total), 1,62 e 1,64 (2 s, 3H total), 1,53 e 1,55 (2 s, 3H total), [1,25 (d, J = 6,6 Hz) e 1,29 (d, J = 6,5 Hz), 3H total], 0,84-0,91 (m, 3H).
[0845] Preparação de N2-[(1-Aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#47)
[0846] Etapa 1. Sínteses de N2-[(1-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}ciclopentil)-carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#46).
A uma solução de #19 (353 mg, 0,944 mmol, 1 eq.) em diclorometano (10 mL, 0,094 M) foram adicionados #28 (600 mg, 0,944 mmol, 0,9 eq.), diisopropiletilamina (498 µL, 2,83 mmol, 3 eq.) e HATU (444 mg, 1,13 mmol, 1,2 eq.). Após agitação durante dois dias, a mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi diluído com etil acetato (60 mL), lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso e com salmoura, seco sobre sulfato de sódio, filtrado, e concentrado in vacuo. O resíduo foi diluído com diclorometano e filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 40% a 100% de etil acetato em heptano) para fornecer #46 (644 mg, 69%) como um sólido branco. LC- MS: m/z 991,8 [M + H+], tempo de retenção = 1,07 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,89 (br d, J = 7,4 Hz, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,79 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,66-7,76 (m, 2H), [7,62 (d, J = 3,3 Hz) e 7,65 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,37-7,44 (m, 2H), 7,11-7,36 (m, 7H), [5,38 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz) e 5,48-5,57 (m), 1H total], 3,13, 3,17, 3,18 e 3,24 (4 s, 6H total), 2,90 e 3,00 (2 br s, 3H total), [1,05 (d, J = 6,6 Hz) e 1,09 (d, J = 6,8 Hz), 3H total].
[0847] Etapa 2. Sínteses de N2-[(1-aminociclopentil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#47).
A uma mistura de #46 (500 mg, 0,504 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (8 mL, 0,06 M) foi adicionada dietilamina (4 mL). Depois da agitação durante 18 horas, a mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer #47
(374 mg, 96%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 769,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,70 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (d, J = 8,4 Hz) e 8,87 (br d, J = 8,6 Hz), 1H total], [8,22 (d, J = 9,4 Hz) e 8,26 (br d, J = 9,4 Hz), 1H total], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,80 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,1 Hz) e 7,66 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,13-7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,1, 8,5, 4,2 Hz) e 5,54 (ddd, J = 11,7, 8,8, 4,1 Hz), 1H total], [4,53 (dd, J = 9,2, 7,6 Hz) e 4,64 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz), 1H total], 3,16, 3,20, 3,21 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,93 e 3,03 (2 br s, 3H total), [1,05 (d, J = 6,8 Hz) e 1,10 (d, J = 6,6 Hz), 3H total], 0,73-0,80 (m, 3H).
[0848] Preparação de N2-[(1-Aminociclopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#51) e 1-amino-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]ciclohexanocarboxamida (#52)
[0849] Etapa 1. Sínteses de ácido (2R,3R)-3-metóxi-2-metil-N-[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético e (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5- metilheptanóico (#48). A uma solução de #16 (1,0 g, 2,11 mmol, 1 eq.) e #5 (1,22 g, 2,11 mmol, 1 eq.) em diclorometano (20 mL, 0,1 M) a 0°C foi adicionado ácido trifluoroacético (6 mL). Após 3 horas, a mistura foi concentrada in vacuo para fornecer a mistura #48 (1,8 g), a qual foi utilizada na etapa seguinte sem purificação adicional; LC-MS (Protocolo K): m/z 374,2 [M + H+], tempo de retenção = 2,093 minutos, 525,2 [M + H+], tempo de retenção = 4,875 minutos.
[0850] Etapa 2. Sínteses de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#49).
A uma solução de #48 (1,8 g, 2,1 mmol, 1 eq.) e dietil cianofosfonato (DEPC) (0,51 g, 3,2 mmol, 1,5 eq.) em 1,2-dimetoxietano (30 mL, 0,07 M) a 0oC foi adicionada trietilamina (1,47 mL, 10,6 mmol, 5 eq.). Depois da agitação à temperatura ambiente durante 2 horas, a mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (10% a 50% de etil acetato em éter de petróleo) para fornecer #49 (0,8 g, 45%). Rf 0,6 (10% de metanol em diclorometano); LC-MS (Protocolo K): m/z 881,3 [M + H+], 903,3 [M + Na+], tempo de retenção = 4,837 minutos.
[0851] Etapa 3. Sínteses de N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#50). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #49 (0,70 g, 0,79 mmol, 1 eq.), diclorometano (15 mL, 0,05 M) e dietilamina (10 mL), foi sintetizado #50 (160 mg, 30%), após purificação por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 5% de metanol em diclorometano). Rf 0,4 (10% de metanol em diclorometano); LC-MS (Protocolo K): m/z 658,3 [M + H+], 680,3 [M + Na+], tempo de retenção = 2,760 minutos.
[0852] Etapa 4A. Sínteses de N2-[(1-aminociclopropil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#51).
A uma solução de #50 (100 mg, 0,15 mmol, 1 eq.), bromotris (dimetilamino) fosfônio hexafluorofosfonato (Brop, 70 mg, 0,18 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (0,08 mL, 0,45 mmol, 3 eq.) em diclorometano (15 mL, 0,01 M), a 0°C foi adicionado ácido 1-aminociclopropanocarboxílico (18 mg, 0,18 mmol, 1,2 eq.). Após 2 horas, a mistura foi resfriada bruscamente com água e extraída duas vezes com etil acetato. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 5% de metanol em diclorometano) para fornecer #51 (45 mg, 34%).
Rf 0,5 (10% de metanol em diclorometano). LC-MS (Protocolo G): m/z 741,44 [M + H+]; 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (br d, J = 8 Hz) e 8,88 (br d, J = 8 Hz), 1H total], [8,16 (br d, J = 9 Hz) e 8,22 (br d, J = 10 Hz), 1H total], [7,77 (d, J = 3,5 Hz) e 7,79 (d, J = 3,5 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,5 Hz) e 7,65 (d, J = 3 Hz), 1H total], 7,10-7,32 (m, 5H), 5,33-5,60 (m, 1H), 3,16, 3,20, 3,21 e 3,26 (4 s, 6H total), 2,93 e 3,02 (2 br s, 3H total), [1,05 (d, J = 6,3 Hz) e 1,10 (d, J = 6,3 Hz), 3H total].
[0853] Etapa 4B. Sínteses de 1-amino-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]ciclohexanecarboxamida (#52). A uma solução de #50 (120 mg, 0,18 mmol, 1 eq.), Brop (84 mg, 0,21 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (0,1 mL, 0,54 mmol, 3 eq.) em diclorometano (15 mL, 0,009 M), a 0°C foi adicionado ácido 1- aminociclohexanocarboxílico (31 mg, 0,21 mmol, 1,2 eq.). Após 2 horas, a mistura foi resfriada bruscamente com água e extraída duas vezes com etil acetato. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 5% de metanol em diclorometano) para fornecer #52 (50 mg, 35%).
Rf 0,6 (10% de metanol em diclorometano). LC-MS (Protocolo K): m/z 783,79 [M + H+]; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (br d, J = 8 Hz) e 8,87 (br d, J = 9 Hz), 1H total], 8,18- 8,28 (m, 1H), [7,77 (d, J = 3,5 Hz) e 7,80 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) e 7,66 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,12-7,31 (m, 5H), 5,35-5,43 e 5,49-5,57 (2 m, 1H total), [4,51 (dd, J = 9, 8 Hz), e 4,61 (dd, J = 9, 7 Hz), 1H total], 3,16, 3,19, 3,21 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,93 e 3,02 (2 br s, 3H total), [1,05 (d, J = 6,8 Hz) e 1,10 (d, J = 6,8 Hz), 3H total].
[0854] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#54)
[0855] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#53). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #32 (2,05 g, 2,83 mmol, 1 eq.) em diclorometano (20 mL, 0,1 M) e N, N-dimetilformamida (3 mL), a amina #19 (2,5 g, 3,4 mmol, 1,2 eq.), HATU (1,29 g, 3,38 mmol, 1,2 eq.) e trietilamina (1,57 mL, 11,3 mmol, 4 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 55% de acetona em heptano), produzindo #53 (2,42 g, 74%) como um sólido. LC-MS: m/z 965,7 [M + H+], 987,6 [M + Na+], tempo de retenção = 1,04 minutos; HPLC (protocolo A): m/z 965,4 [M + H+], tempo de retenção = 11,344 minutos (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,86-7,91 (m, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,79 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,67-7,74 (m, 2H), [7,63 (d, J = 3,2 Hz) e 7,65 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,38-7,44 (m, 2H), 7,30- 7,36 (m, 2H), 7,11-7,30 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,4, 8,4, 4,1 Hz) e 5,52 (ddd, J = 11,7, 8,8, 4,2 Hz), 1H total], [4,49 (dd, J = 8,6, 7,6 Hz) e 4,59 (dd, J = 8,6, 6,8 Hz), 1H total], 3,13, 3,17, 3,18 e 3,24 (4 s, 6H total), 2,90 e 3,00 (2 br s, 3H total), 1,31 e 1,36 (2 br s, 6H total), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) e 1,09 (d, J = 6,7 Hz), 3H total].
[0856] Etapa 2. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#54).
De acordo com o procedimento geral A, a partir de #53 (701 mg, 0,726 mmol) em diclorometano (10 mL, 0,07 M), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano). O resíduo foi diluído com dietil éter e heptano e foi concentrado in vacuo para fornecer #54 (406 mg, 75%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 743,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,70 minuto; HPLC (protocolo A): m/z 743,4 [M + H+], tempo de retenção = 6,903 minutos, (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (br d, J = 8,5 Hz) e 8,86 (br d, J = 8,7 Hz), 1H total], [8,04 (br d, J = 9,3 Hz) e 8,08 (br d, J = 9,3 Hz), 1H total], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,80 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) e 7,66 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,13-7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11, 8,5, 4 Hz) e 5,53 (ddd, J = 12, 9, 4 Hz), 1H total], [4,49 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,60 (dd, J = 9, 7 Hz), 1H total], 3,16, 3,20, 3,21 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,93 e 3,02 (2 br s, 3H total), 1,21 (s, 3H), 1,13 e 1,13 (2 s, 3H total), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) e 1,10 (d, J = 6,7 Hz), 3H total], 0,73-0,80 (m, 3H).
[0857] Preparação de 2-Metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4- il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#56)
[0858] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- {(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2- feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#55). A uma solução de #24 (104 mg, 0,256 mmol, 1 eq.) em diclorometano (10 mL, 0,094 M) foram adicionados #32 (156 mg, 0,256 mmol, 0,9 eq.), diisopropiletilamina (135 µL, 0,768 mmol, 3 eq.) e HATU (120 mg, 0,307 mmol, 1,2 eq.). Depois da agitação durante 18 horas, a mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi diluído com etil acetato (10 mL), lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x mL) e com salmoura, seco sobre sulfato de sódio, filtrado, e concentrado in vacuo.
O resíduo foi diluído com diclorometano e filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de etil acetato em heptano) para fornecer #55 (44 mg, 19%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 884,5 [M +2H+], tempo de retenção = 1,04 minutos.
[0859] Etapa 2. Sínteses de 2-metilalanil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2- {(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1- oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#56). A uma mistura de #55 (44 mg, 0,050 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (1 mL, 0,05 M) foi adicionada dietilamina (0,5 mL). Depois da agitação durante 18 horas, a mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método B) para fornecer #56 (16,2 mg, 49%) como um sólido. LC-MS: m/z 660,8 [M
+ H+], tempo de retenção = 2,23 minutos; HPLC (protocolo A): m/z 660,5 [M + H+], 682,4 [M + Na+], tempo de retenção = 6,865 minutos.
[0860] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#60) $ % &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
[0861] Etapa 1. Sínteses de 1-(1-fenilciclopropil)metanamina #@1. A uma solução de 1-fenilciclopropanocarbonitrila (50 g, 0,34 mol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (500 mL, 0,7 M) a 0°C, foi adicionado hidreto de lítio alumínio (23 g, 0,35 mol, 1,03 eq.). A mistura de reação foi agitada a 0°C durante uma hora e, em seguida, ao refluxo durante uma hora. A mistura de reação foi, em seguida, arrefecida e resfriada bruscamente com água (23 mL) e uma solução de hidróxido de sódio aquosa a 15% (69 mL). A mistura foi filtrada e concentrada in vacuo para fornecer #@1 (36 g, 72%). LC-MS: m/z 148,1 [M + H+], tempo de retenção = 0,86 minuto; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,2-7,4 (m, 5H), 2,78 (s, 2H), 1,19 (br s, 2H), 0,72-0,84 (m, 4H).
[0862] Etapa 2. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R, 2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1-fenilciclo propil)metil]amino}propil]pirrolidina-1-carboxilato (#57). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #11 (2,15 g, 7,48 mmol, 1,1 eq.) em diclorometano (20 mL, 0,3 M) e N, N-dimetilformamida (4 mL), 1-(1-fenilciclopropil)
metanamina #@1 (1,001 g, 6,799 mmol, 1 eq.), HATU (3,10 g, 8,16 mmol, 1,2 eq.) e trietilamina (2,84 mL, 20,4 mmol, 3 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de etil acetato em heptano), produzindo #57 (1,93 g, 68%) como um sólido. HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 417,3 [M + H+], tempo de retenção = 10,575 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 7,75-7,81 (m, 1H), 7,20-7,27 (m, 4H), 7,12-7,19 (m, 1H), 3,33-3,62 e 3,71-3,80 (br multipletos, 4H total), 3,28 (s, 3H), 2,97-3,17 (br m, 2H), 2,14-2,24 (m, 1H), 1,67-1,80 (br m, 2H), 1,45- 1,65 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,00 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,67-0,93 (m, 4H).
[0863] Etapa 3. Sínteses de (2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-N-[(1-fenilciclopropil)-metil]- 3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de cloridrato (#58). De acordo com o procedimento geral C, a partir de #57 (566 mg, 1,36 mmol, 1 eq.) em dioxano (4 mL, 0,3 M) e 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano (4 mL, 16 mmol, 11,7 eq.), foi sintetizado #58 (466 mg, 97%); LC-MS: m/z 318,2 [M + H+], 339,2 [M + Na+], tempo de retenção = 0,56 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,53 (br s, 1H), 8,48 (br s, 1H), 8,11 (br dd, J = 5,7, 5,6 Hz, 1H), 7,23-7,30 (m, 4H), 7,14-7,21 (m, 1H), 3,58 (dd, J = 7,5, 3,9 Hz, 1H), 3,50 (dd, J = 13,7, 6,3 Hz, 1H), 3,34 (s, 3H), 3,21- 3,29 (br m, 1H), 3,18 (dd, J = 13,8, 5,0 Hz, 1H), 3,04-3,13 (br m, 2H), 2,42-2,50 (m, 1H), 1,56-1,89 (m, 4H), 1,04 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,71-0,91 (m, 4H).
[0864] Etapa 4. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1- fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#59). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #32 (550 mg, 0,902 mmol, 1 eq.), #58 (350 mg, 0,992 mmol, 1,1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,08 M) e N, N-dimetilformamida (2 mL), HATU (446 mg, 1,17 mmol, 1,3 eq.) e trietilamina (0,503 mL, 3,61 mmol, 4 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano), produzindo #59 (618 mg, 69%) como um sólido esbranquiçado. LC-MS: m/z 908,7 [M + H+], 930,7 [M + Na+], tempo de retenção = 1,07 minutos; HPLC (Protocolo B a 45°C): m/z 908,5 [M + H+], tempo de retenção = 8,721 minutos (pureza > 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,89 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,30- 7,36 (m, 2H), [4,49 (dd, J = 8,5, 7,8 Hz) e 4,59 (dd, J = 8,7, 6,9 Hz), 1H total], 4,18- 4,26 (m, 3H), 3,93-4,01 (br m, 1H), 3,23 e 3,26 (2 s, 3H total), 3,16 e 3,16 (2 s, 3H total), 2,91 e 3,05 (2 br s, 3H total), 1,36 e 1,37 (2 br s, 3H total), 1,30 e 1,32 (2 br s, 3H total), [1,00 (d, J = 6,7 Hz) e 1,02 (d, J = 6,6 Hz), 3H total], 0,67-0,78 (m, 7H).
[0865] Etapa 5. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidin-1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#60). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #59 (605 mg, 0,666 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,067 M) e dietilamina (10 mL), foi sintetizado #60 (379 mg, 83%); HPLC (Protocolo A a 45°C) m/z 685,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,072 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,03 (br d, J = 9,6 Hz) e 8,07 (br d, J = 9,4 Hz), 1H total], [7,74 (br dd, J = 7, 4 Hz) e 7,99 (br dd, J = 5,9, 5,7 Hz), 1H total], 7,20-7,27 (m, 4H), 7,11-7,17 (m, 1H), [ 4,49 (dd, J = 9, 7 Hz) e 4,58 (dd, J = 9, 7,5 Hz), 1H total], 3,96-4,04 (br m, 1H), 3,24 e 3,27 (2 s, 3H total), 3,18 e 3,19 (2 s, 3H total), 2,93 e 3,07 (2 br s, 3H total), 1,20 e 1,21 (2 s, 3H total), 1,12 e 1,14 (2 s, 3H total), [1,00 (d, J = 6,7 Hz) e 1,03 (d, J = 6,7 Hz), 3H total].
[0866] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#66)
[0867] 4 M de HCl em dioxano
-------------------------- $ %
[0868] Etapa 1. Sínteses de ciclohepta-2,4,6-trien-1-il-acetonitrila (#61). A uma solução de acetonitrila anidra (3,12 mL, 56,2 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (281 mL, 0,2 M) foi adicionado lítio diisopropilamina (1,8 M em heptano/etilbenzeno/tetrahidrofurano, 31,2 mL, 56,2 mmol, 1 eq.) a -78oC. Após 20 minutos a -78°C, tropílio tetrafluoroborato (10 g, 56 mmol, 1 eq.) foi adicionado. Após minutos, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi diluído com etil acetato e lavado com água. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo para fornecer um óleo marrom, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de etil acetato em heptano) para fornecer #61 (1,88 g, 25%) como um óleo amarelo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,69-6,71 (m, 2H), 6,27-6,32 (m, 2H), 5,28-5,33 (m, 2H), 2,61 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 2,26 2,34 (m, 1H).
[0869] Etapa 2. Sínteses de 2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il) etanamina (#62). A uma suspensão de hidreto de lítio alumínio (911 mg, 24,0 mmol, 1,4 eq.) em dietil éter anidro (75 mL, 0,23 M), a 0°C foi adicionada lentamente, gota a gota, durante 15 minutos, uma solução de #61 (2,25 g, 17,2 mmol, 1 eq.) em dietil éter (15 mL). A reação foi aquecida à temperatura ambiente. Após 5 horas, a reação foi arrefecida a 0°C e resfriada bruscamente por adição de água (1 mL), em seguida, filtrada através de uma pequena almofada de Celite e lavada com metanol. O filtrado foi seco sobre sulfato de sódio, filtrado, e concentrado in vacuo para fornecer #62 (1,683 g, 73%) como um óleo dourado. LC-MS: m/z 136,1 [M + H+], tempo de retenção = 0,23 minuto; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,64-6,67 (m, 2H), 6,16-6,21 (m, 2H), 5,16-5,21 (m, 2H), 2,84-2,89 (m, 2H), 1,86-1,92 (m, 2H), 1,62-1,70 (m, 1H).
[0870] Etapa 3. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien- 1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidina-1-carboxilata (#63). A uma solução de #11 (3,57 g, 12,4 mmol, 1 eq.) em diclorometano (100 mL, 0,1 M) e N, N- dimetilformamida (4 mL) foi adicionado HATU (5,36 g, 13,7 mmol, 1,1 eq.). Após 20 minutos, trietilamina (5,20 mL, 37,3 mmol, 3 eq.) foi adicionada, seguida por #62 (1,68 g, 12,4 mmol, 1 eq.), e a mistura foi agitada durante 18 horas. A reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi retomado em etil acetato e lavado com água (50 mL). A camada aquosa foi re-extraída com etil acetato (3 vezes) e as camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas, e concentradas in vacuo para fornecer um óleo marrom, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de acetato etilo em heptano) para fornecer #63 (2,95 g, 59% de rendimento) como um óleo viscoso. LC-MS: m/z 405,4 [M + H+], 427,4 [M + Na+], tempo de retenção = 0,75 minuto; 1H RMN (400 MHz, CDCl3), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 6,63-6,68 (m, 2H), 6,16-6,23 (m, 2H), 5,19 (br dd, J = 9,0, 5,8 Hz, 2H), 3,51-3,63 e 3,71-3,90 (2 br multipletos, 3H total), 3,42 (s, 3H), 3,18-3,29 e 3,34-3,47 (2 br multipletos, 3H total), 2,27-2,45 (br m, 1H), 1,6-2,00 (m, 7H), 1,47 e 1,50 (2 br s, 9H total), 1,16-1,29 (br m, 3H).
[0871] Etapa 4. Sínteses de (2R,3R)-N-[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]-3-metóxi- 2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de cloridrato (#64)
[0872] Intermediário #63 (400 mg, 0,989 mmol, 1 eq.) foi tratado com 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano (10 mL, 40 mmol, 40 eq.). Após 1 hora, a mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi retomado em diclorometano e lavado com 1 M de solução de hidróxido de sódio. A camada aquosa foi re-extraída com diclorometano e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas in vacuo para fornecer #64 (301 mg, quantitativo) como um óleo marrom, que lentamente começou a solidificar em repouso. LC-MS: m/z 305,3 [M + H+], tempo de retenção = 0,54 minuto; HPLC (Protocolo G): tempo de retenção = 4,848 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCl3), sinais característicos: δ 6,64-6,67 (m, 2H), 6,16-6,22 (m, 2H), 6,08-6,14 (br m, 1H), 5,16-5,22 (m, 2H), 3,44 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 6,3, 4,5 Hz, 1H), 2,98-3,04 (m, 1H), 2,94 (ddd, J = 10,5, 7,2, 5,6 Hz, 1H), 2,81 (ddd, J = 10,5, 7,7, 6,7 Hz, 1H), 2,57 (qd, J = 7,1, 4,5 Hz, 1H), 1,90-1,97 (m, 2H), 1,49-1,55 (m, 1H), 1,18 (d, J = 7,1 Hz, 3H).
[0873] Etapa 5. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil, N- [(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi- 2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#65). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #32 (678 mg, 0,937 mmol, 1 eq.) em diclorometano (9,37 mL, 0,1 M), a amina #64 (300 mg, 0,985 mmol, 1,1 eq.), HATU (427 mg, 1,12 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (494 µL, 2,81 mmol, 3 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano), produzindo #65 (546 mg, 65%) como um sólido. LC-MS: m/z 896,7 [M + H+], 918,7 [M + Na+], tempo de retenção = 1,06 minutos.
[0874] Etapa 6. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#66). A uma solução de #65 (540 mg, 0,603 mmol, 1 eq.) em diclorometano (10 mL, 0,06 M) foi adicionada trietilamina (10 mL) e a mistura de reação foi agitada durante 2 horas. A mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel
(Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer #66 (347 mg, 85%) como um sólido incolor. HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 674,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,015 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,03 (br d, J = 9 Hz) e 8,05 (br d, J = 9 Hz), 1H total], [7,77 (br dd, J = 5,5, 5,5 Hz) e 7,98 (br dd, J = 5,5, 5,5 Hz), 1H total], 6,54-6,65 (m, 2H), 6,10-6,19 (m, 2H), 5,11 -5,19 (m, 2H), [4,48 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,54 (dd, J = 9, 7,5 Hz), 1H total], 3,94-4,04 (br m, 1H), 3,26 e 3,29 (2 s, 3H total), 3,17 e 3,19 (2 s, 3H total), 2,93 e 3,06 (2 br s, 3H total), 1,20 e 1,21 (2 s, 3H total), 1,12 e 1,13 (2 s, 3H total), [1,04 (d, J = 6,8 Hz) e 1,07 (d, J = 6,7 Hz), 3H total].
[0875] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#69) e 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi- 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2- metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#70) $ %
2. /
[0876] Etapa 1. Sínteses de metil-N-{(2R,3R)-3-metóxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il] propanoil}-L-fenilalaninato, sal de cloridrato (#67). De acordo com o procedimento geral C, a partir de #37 (2,39 g, 5,33 mmol, 1 eq.), dioxano (10 mL, 0,53 M) e 4 M de uma solução de ácido clorídrico em dioxano (10 mL, 40 mmol, 7,5 eq.), foi sintetizado #67 (2,21 g) como um sólido branco, o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS: m/z 349,2 [M + H+], tempo de retenção = 0,53 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,45-9,58 (br m, 1H), 8,63 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,51-8,62 (br m, 1H), 7,25-7,33 (m, 4H), 7,18-7,25 (m, 1H), 4,50 (ddd, J = 10,8, 8,1, 4,5 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,54 (dd, J = 6,8, 4,5 Hz, 1H), 3,20 (s, 3H), 3,11 (dd, J = 13,8, 4,5 Hz, 1H), 2,99-3,14 (br m, 3H), 2,89 (dd, J = 13,8, 10,9 Hz, 1H), 2,44-2,50 (m, 1H, assumido; parcialmente obscuro pelo pico do solvente), 1,77-1,89 (m, 1H), 1,60-1,73 (m, 2H), 1,46-1,57 (m, 1H), 1,05 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
[0877] Etapa 2. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida (#68). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #32 (353 mg, 0,488 mmol, 1 eq.) em diclorometano (10 mL, 0,04 M), amina #67 (271 mg, 0,588 mmol, 1,3 eq.), HATU (223 mg, 0,586 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (238 µL, 1,71 mmol, 3,5 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 40% de acetona em heptano), fornecendo #68 (404 mg, 88% ao longo de duas etapas) como um sólido.
LC-MS: m/z 940,7 [M + H+], 962,7 [M + Na+], tempo de retenção = 1,04 minutos; HPLC (Protocolo C): tempo de retenção = 9,022 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,25 (br d, J = 8 Hz) e 8,48 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,67-7,75 (m, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,31-7,36 (m, 2H), 7,14-7,24 (m, 5H), 4,43- 4,69 (m, 3H), 4,17-4,26 (m, 3H), 3,91-3,99 (br m, 1H), 3,63 e 3,65 (2 s, 3H total), 3,19 e 3,24 (2 s,
3H total), 3,14 e 3,15 (2 s, 3H total), 2,90 e 2,99 (2 br s, 3H total), 1,36 e 1,37 (2 br s, 3H total), 1,30 e 1,32 (2 s, 3H total), [1,02 (d, J = 6,8 Hz) e 1,06 (d, J = 6,6 Hz), 3H total].
[0878] Etapa 3A. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#69). A uma solução de #68 (143 mg, 0,152 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (5 mL, 0,02 M) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (9,10 mg, 0,378 mmol, 2,5 eq.) em água (3 mL). Após 5 horas, a reação foi concentrada in vacuo, submetida à destilação azeotrópica três vezes com heptano, dissolvida em dimetil sulfóxido (2,2 mL) e purificada por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer #69 (56 mg, 52%). HPLC (Protocolo A a 45°C): 704,4 [M + H+], tempo de retenção = 6,623 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 8,08-8,22 e 8,37-8,49 (2 m, 5H total), 7,12-7,28 (m, 5H), 3,18, 3,20 e 3,24 (3 s, 6H total), 2,95 e 3,04 (2 br s, 3H total), 1,52 e 1,53 (2 s, 3H total), 1,39 e 1,41 (2 s, 3H total), [1,02 (d, J = 6,8 Hz) e 1,05 (d, J = 6,6 Hz), 3H total], 0,74-0,81 (m, 3H).
[0879] Etapa 3B. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#70). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #68 (240 mg, 0,255 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,026 M) e dietilamina (10 ml), foi sintetizado #70 (120 mg, 65%) como um sólido branco/mistura de vidro após cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano). HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 762,7 [M + H+], 740,4 [M + Na+], tempo de retenção = 6,903 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,26 (d, J = 8,1 Hz) e 8,49 (d, J = 8,3 Hz), 1H total], [8,03 (d, J =
9,5 Hz) e 8,07 (d, J = 9,5 Hz), 1H total], 7,14-7,27 (m, 5H), 3,63 e 3,67 (2 s, 3H total), 3,16, 3,18, 3,20 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,92 e 3,01 (2 br s, 3H total), 1,20 e 1,22 (2 s, 3H total), 1,12 e 1,13 (2 s, 3H total), [1,02 (d, J = 6,8 Hz) e 1,06 (d, J = 6,7 Hz), 3H total], 0,74-0,80 (m, 3H).
[0880] Preparação de N2-[(3-Aminooxetan-3-il)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- [(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5- metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#75) $ % &&&&&&&&&&&&&&&& * & 8 ! # 2 . /
[0881] Etapa 1. Sínteses de ácido 3-[(terc-butoxicarbonil)amino]oxetano-3- carboxílico (#71). Para ácido 1-aminooxetano-3-carboxílico (1,00 g, 8,54 mmol, 1 eq.) em dioxano (15 mL, 0,5 M) foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio (1,55 g, 38,7 mmol, 4,5 eq.) em água (15 mL) seguida por di-terc-butil dicarbonato (2,09 g, 9,29 mmol, 1,1 eq.). Um sólido branco formado. A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato e lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo para fornecer #71 (633 mg, 38%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz,
DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros: δ 12,93 (br s, 1H), 7,59 e 7,93 (2 br s, 1H total), 4,71-4,78 (m, 2H), 4,47 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 1,30 e 1,38 (2 s, 9H total).
[0882] Etapa 2. Sínteses de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin- 1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#72). Para #@5 (9,47 g, 18,0 mmol, 1 eq.) e #24 (5,90 g, 18,0 mmol, 1 eq.) em diclorometano (250 mL, 0,072 M) foram adicionados diisopropiletilamina (9,52 ml, 54,2 mmol, 3 eq.) e HATU (8,49 g, 21,7 mmol, 1,2 eq.). A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (300 mL) e lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 100 mL) e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em diclorometano (250 mL) e filtrado. O filtrado foi concentrado in vacuo em sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano) para fornecer #72 (11,61 g, 81%) como um sólido amarelo claro. LC-MS: m/z 797,6 [M + H+], 819,6 [M + Na+], tempo de retenção = 1,06 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 3,26 e 3,28 (2 s, 3H total), 3,18 e 3,20 (2 s, 3H total), 2,95 e 3,10 (2 br s, 3H total), 1,01-1,09 (m, 3H), 0,67-0,78 (m, 3H).
[0883] Etapa 3. Sínteses de N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil- L-valinamida (#73). Para #72 (5,16 g, 6,47 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (10 mL, 0,65 M) foi adicionada dietilamina (10 mL). Após 2 horas, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer #73 (2,414 mg, 65%). LC-MS: m/z 576,5 [M + H+], tempo de retenção = 0,64 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,80-7,88 e 7,99-
8,10 (2 m, 1H total), 7,14-7,31 (m, 5H), 3,17 e 3,18 (2 s, 3H total), 2,87 e 3,03 (2 br s, 3H total), 1,02-1,08 (m, 3H).
[0884] Etapa 4. Sínteses de N2-({3-[(tert-butoxicarbonil)amino]oxetan-3-il}carbonil)- N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2- feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#74). Para #73 (100 mg, 0,174 mmol, 1 eq.) em diclorometano (4 mL, 0,04) e N, N- dimetilformamida (0,5 mL), foi adicionado #71 (45,2 mg, 0,208 mmol, 1,2 eq.), seguido por diisopropiletilamina (92 µL, 0,521 mmol, 3 eq.) e HATU (102 mg, 0,260 mmol, 1,5 eq.). Após 16 horas, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi retomado em etil acetato (6 mL) e lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 2 mL) e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer #74 (140 mg), o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. LC-MS: m/z 774,7 [M + H+], 796,6 [M + Na+], tempo de retenção = 0,91 minuto.
[0885] Etapa 5. Sínteses de N2-[(3-aminooxetan-3-il)carbonil]-N-{(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin- 1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido acético (#75). Para #74 (140 mg, 0,181 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3 mL, 0,06 M) foi adicionado ácido trifluoroacético (1 mL). Após 1 hora, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi retomado em etil acetato (6 mL) e lavado com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (2 mL) e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. Metade do material bruto foi purificada por cromatografia de fase reversa (Método B) para fornecer #75 (16 mg, 26%, ao longo de duas etapas). LC-MS: m/z 674,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,68 minuto; HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 674,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,128 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,80-7,87 e 8,02-8,07 (2 m, 2H total), 7,23-7,30 (m, 2H), 7,14-7,22 (m, 3H), 4,28-4,33 (m, 2H), 3,96-4,04 (br m, 1H), 3,17 e 3,19 (2 s, 3H total), 2,96 e 3,10 (2 br s, 3H total), [1,04 (d, J = 7,0 Hz) e 1,07 (d, J = 6,6 Hz), 3H total].
[0886] Preparação de N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#79) e N,2- dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil- L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#80)
[0887] Etapa 1. Sínteses de metil-N-{(2R, 3R)-3-[(2S)-1- {(3R, 4S, 5S)-4-[{N-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2- il]-3-metóxi-2-metilpropanotioil}-L-fenilalaninato (#76). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #@5 (260 mg, 0,648 mmol, 1 eq.), #39 (340 mg, 0,629 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,065 M), HATU (296 mg, 0,778 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (339 µL, 1,94 mmol, 3 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 40% de acetona em heptano) para fornecer #76 (466 mg, 83% ao longo de duas etapas) como um sólido. LC-MS: m/z 871,5 [M + H+], 893,5 [M + Na+], tempo de retenção = 1,10 minutos; HPLC (protocolo C): tempo de retenção = 9,249 minutos (pureza > 99%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,19 (br d, J = 7,4 Hz) e 10,49 (br d, J = 7,8 Hz), 1H total], 7,89 (br d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,68-7,75 (m, 2H), 7,54-7,60 (m, 1H), 7,41 (br dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,28-7,36 ( m, 2H), 7,15-7,28 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 10,9, 7,3, 4,4 Hz) e 5,34-5,43 (m), 1H total], 3,65 e 3,69 (2 s, 3H total), 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,17 (br s, 3H), 2,93 e 2,98 (2 br s, 3H total), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) e 1,18 (d, J = 6,6 Hz), 3H total].
[0888] Etapa 2. Sínteses de metil N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3- metóxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanotioil}-L- fenilalaninato (#77). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #76 (460 mg, 0,528 mmol, 1 eq.) tetrahidrofurano (8 mL, 0,07 M) e dietilamina (8 ml), foi sintetizado #77 (399 mg), o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional; LC-MS m/z 649,5 [M + H+], tempo de retenção = 0,73 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais de produtos característicos: δ [10,20 (d, J = 7,4 Hz) e 10,49 (d, J = 7,4 Hz), 1H total], 7,15 -7,28 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 10,9, 7,2, 4,5 Hz) e 5,34-5,42 (m), 1H total], 3,65 e 3,68 (2 s, 3H total), 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,15 e 3,15 (2 s, 3H total), 2,83 e 2,88 (2 br s, 3H total), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) e 1,18 (d, J = 6,6 Hz), 3H total].
[0889] Etapa 3. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida (#78). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #77 (399 mg, 0,52 mmol, 1 eq.), N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N ,2-dimetilalanina (213 mg, 0,628 mmol, 1,2 eq.), diclorometano (5 mL, 0,1 M), HATU (239 mg, 0,628 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (282 µL, 1,62 mmol, 3,1 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em gel sílica (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano), fornecendo #78 (231 mg, 46% ao longo de duas etapas). LC-MS: m/z 970,7 [M + H+], 992,6 [M + Na+], tempo de retenção = 1,11 minutos; HPLC (Protocolo C): tempo de retenção = 9,260 minutos; 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,19 (d, J = 7,4 Hz) e 10,47 (d, J = 7,8 Hz), 1H total], 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,61-7,67 (m, 2H), 7,41 (br dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,14-7,36 (m, 8H), [5,20 (ddd, J = 11, 7, 5 Hz) e 5,38 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz), 1H total], [4,41(dd, J = 8,6, 8,4 Hz) e 4,46 (dd, J = 8,2, 8,2 Hz), 1H total], 3,65 e 3,68 (2 s, 3H total), 3,23 e 3,24 (2 s, 3H total), 3,13 (br s, 3H), 2,88 e 2,93 (2 br s, 3H total), 2,84 e 2,85 (2 s, 3H total), 1,31 e 1,32 (2 s, 3H total), [1,15 (d, J = 6,6 Hz) e 1,18 (d, J = 6,4 Hz), 3H total].
[0890] Etapa 4A. Sínteses de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#79). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #78 (223 mg, 0,230 mmol, 1 eq.), diclorometano (6 ml, 0,04 M) e dietilamina (6 mL), foi sintetizado #79 (146 mg, 85%) como um sólido branco após cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 5% de metanol em heptano, em seguida, 0% a 10% de metanol em diclorometano). HPLC (Protocolo A a 45°C): 749,4 [M + H+], tempo de retenção = 7,315 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,20 (d, J = 7,6 Hz) e 10,50 (d, J = 8,0 Hz), 1H total], 7,79- 7,88 (m, 1H), 7,15-7,29 (m, 5H), [5,20 (ddd, J = 11, 7, 4 Hz) e 5,38 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz), 1H total], [ 4,50 (dd, J = 8,8, 8,6 Hz) e 4,56 (dd, J = 9, 8 Hz), 1H total], 3,65 e 3,69 (2 s, 3H total), 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,16 (br s, 3H), 2,93 e 2,97 (2 br s, 3H total), 2,10 e 2,11 (2 s, 3H total).
[0891] Etapa 4B. Sínteses de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletill]amino}-1-metóxi-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-
metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#80). A uma solução de #78 (170 mg, 0,175 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (3 mL, 0,04 M) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (12,6 mg, 0,525 mmol, 3 eq.) em água (1,5 mL) . Depois da agitação durante a noite, o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi azeotropado três vezes com heptano. O resíduo foi, em seguida, diluído com dimetil sulfóxido (2,2 mL) e purificado por cromatografia de fase reversa (Método C), para fornecer #80 (74 mg, 58%) como um sólido. LC-MS: m/z 734,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,69 minuto; HPLC (Protocolo A a 45°C): 734,4 [M + H+], tempo de retenção = 6,903 minutos (pureza > 96%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 12,9 e 13,1 (2 v br s, 1H total), [10,12 (d, J = 7,4 Hz) e 10,46 (d, J = 7,8 Hz), 1H total], 8,77-8,89 (br m, 2H), [8,47 (d, J = 8,6 Hz) e 8,51 (d, J = 8,6 Hz), 1H total], 7,21-7,29 ( m, 4H), 7,14-7,21 (m, 1H), [5,16-5,23 (m) e 5,38 (ddd, J = 11,3, 8,2, 3,9 Hz), 1H total], [4,51 (dd, J = 9,0, 9,0 Hz) e 4,57 (dd, J = 9,4, 8,6 Hz), 1H total], 3,24 e 3,24 (2 s, 3H total), 3,18 e 3,19 (2 s, 3H total), 2,96 e 3,00 (2 br s, 3H total), 1,51 e 1,53 (2 s, 3H total), 1,40 e 1,42 (2 s, 3H total), 1,14-1,19 (m, 3H), 0,74-0,81 (m, 3H).
[0892] Preparação de N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#84) ! /
[0893] Etapa 1. Sínteses de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#81). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #@5 (620 mg, 1,18 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,1 M), amina #18 (604 mg, 1,42 mmol, 1,2 eq.), diisopropiletilamina (618 µL, 3,54 mmol, 3 eq.) e HATU (539 mg, 1,42 mmol, 1,2 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano) para fornecer #81 (737 mg, 58%). HPLC (Protocolo C): tempo de retenção = 9,235 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,81 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,89 (d, J = 7,6 Hz, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) e 7,83 (d, J = 3,1 Hz), 1H total], 7,70-7,75 (m, 2H), [7,64 (d, J = 3,1 Hz) e 7,68 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,55-7,60 (m, 1H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,13- 7,35 (m, 7H), [6,31 (ddd, J = 11, 8, 4,5 Hz) e 6,40-6,48 (m), 1H total], 3,23 e 3,24 (2 s, 3H total), 3,17 e 3,22 (2 s, 3H total), 2,94 e 3,01 (2 br s, 3H total), [1,14 (d, J = 6,4 Hz) e 1,17 (d, J = 6,2 Hz), 3H total].
[0894] Etapa 2. Sínteses de N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#82). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #81 (733 mg, 0,818 mmol, 1 eq.) em diclorometano (7 mL, 0,1 M) e dietilamina (7 mL), foi sintetizado #82 (670 mg), que foi utilizado na próxima etapa sem purificação adicional. LC-MS: m/z 674,5 [M + H+], tempo de retenção = 1,29 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais de produtos característicos: δ [10,55 (br d, J = 8 Hz) e 10,84 (br d, J = 8 Hz), 1H total], [7,64 (d, J = 3,1 Hz) e 7,69 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,13-7,33 (m, 5H), 6,27-6,35 e 6,38-6,47 (2 m, 1H total), 3,23 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,15 e 3,19 (2 s, 3H total), 2,84 e 2,91 (2 br s, 3H total).
[0895] Etapa 3. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#83). De acorco com o procedimento geral D, a partir de #82 (670 mg, <0,818 mmol, 1 eq.), diclorometano (5 mL, 0,16 M), N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetilalanina (304 mg, 0,896 mmol, 1,1 eq.), HATU (372 mg, 0,978 mmol, 1,2 eq.) e diisopropiletilamina (440 µL, 2,53 mmol, 3,1 eq.), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por meio de cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0% a 30% de acetona em heptano) para fornecer #83 (556 mg, 69% ao longo de duas etapas). LC-MS: m/z 994,7 [M + H+], tempo de retenção = 0,69 minuto; HPLC (protocolo C): tempo de retenção = 9,333 minutos (pureza > 98%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,53 (br d, J = 8 Hz) e 10,80 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,86-7,91 (m, 2H), [7,80 (d, J = 3,3 Hz) e 7,82 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], [7,64 (d, J = 3,2 Hz) e 7,68 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,62-7,66 (m, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,28- 7,36 (m, 5H), 7,19-7,26 (m, 2H), 7,12-7,17 (m, 1H), [6,31 (ddd, J = 11, 8, 4,5 Hz) e 6,44 (ddd, J = 11, 8,5, 4,5 Hz), 1H total], [4,42 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,48 (dd, J = 8, 8 Hz), 1H total], 3,22 e 3,24 (2 s, 3H total), 3,13 e 3,17 (2 s, 3H total), 2,89 e 2,97 (2 br s, 3H total), 2,84 e 2,85 (2 s, 3H total), [1,13 (d, J = 6,4 Hz) e 1,16 (d, J = 6,4 Hz), 3H total].
[0896] Etapa 4. Sínteses de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#84). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #83 (552 mg, 0,555 mmol, 1 eq.) em diclorometano (10 mL, 0,05 M) e dietilamina (10 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, o qual foi diluído com metanol, concentrado in vacuo sobre sílica, e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer #84 (406 mg, 95%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 772,8 [M + H+], tempo de retenção = 1,35 minutos; HPLC (protocolo A): 774,4 [M + H+], tempo de retenção = 7,390 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume- se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [10,54 (br d, J = 8 Hz) e 10,81 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 7,78-7,84 (m, 2H), [7,65 (d, J = 3,1 Hz) e 7,69 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,29-7,34 (m, 2H), 7,20-7,28 (m, 2H), 7,14-7,19 (m, 1H), 6,27-6,35 e 6,40-6,48 (2 m, 1H total), [4,51 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,57 (dd, J = 9, 8 Hz), 1H total], 3,24 e 3,25 (2 s, 3H total), 3,16 e 3,21 (2 s, 3H total), 2,94 e 3,00 (2 br s, 3H total), 2,09 e 2,10 (2 s, 3H total), 1,08 e 1,09 (2 s, 3H total), 0,73-0,80 (m, 3H).
[0897] N,2-Dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#88) 9, % :
[0898] Etapa 1. Sínteses de N2-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#85).
A uma mistura de #@5 (5,48 g, 10,4 mmol, 1 eq.) e #19 (3,90 g, 10,4 mmol, 1 eq.) em diclorometano (50 mL, 0,2 M) foi adicionada diisopropiletilamina (5,51 mL, 31,3 mmol, 3 eq.) seguida por HATU (4,91 g, 12,5 mmol, 1,2 eq.). Depois da agitação durante a noite, a mistura de reação foi concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (100 mL) e lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 30 mL) e com salmoura (30 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em diclorometano e filtrado; o filtrado foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente; 0% a 50% de acetona em heptano) para fornecer #85 (7,20 g, 78%) como um sólido. LC-MS: m/z 880,6 [M + H+], tempo de retenção = 1,07 minutos.
[0899] Etapa 2. Sínteses de N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#86). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #85 (5,00 g, 5,68 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (10 mL, 0,56 M) e dietilamina (3 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer #86 (2,952 g, 79%) como um sólido. LC-MS: m/z 658,5 [M + H+], 680,5 [M + Na+] tempo de retenção = 0,66 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (d, J = 8,4 Hz) e 8,90 (br d, J = 8,8 Hz), 1H total], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,80 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) e 7,66 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,12-7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,2, 8,4, 4,2 Hz) e 5,54 (ddd, J = 11,9, 8,9, 4,0 Hz), 1H total], 3,15, 3,19, 3,20 e 3,26 (4 s, 6H total), 2,86 e 2,98 (2 br s, 3H total), [1,06 (d, J = 6,6 Hz) e 1,11 (d, J = 6,6 Hz), 3H total].
[0900] Etapa 3. Sínteses de N-(tert-butoxicarbonil)-N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)- 3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#87).
A uma mistura de #86 (80,3 mg, 0,122 mmol, 1 eq.) em diclorometano (4 mL, 0,03 M) foi adicionada N-(terc-butoxicarbonil)-N,2-dimetilalanina (29,1 mg, 0,134 mmol, 1,1 eq.) seguida por diisopropiletilamina (64 µL, 0,365 mmol, 3 eq.) e HATU (71,7 mg, 0,183 mmol, 1,5 eq.). Após agitação durante a noite, a mistura de reação foi concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (6 mL) e lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 2 mL) e com salmoura. O solvente orgânico foi seco sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrado in vacuo. O resíduo foi retomado em diclorometano e filtrado; o filtrado foi concentrado in vacuo em sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano) para fornecer #87 (58 mg, 50%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 857,7 [M + H+], 879,7 [M + Na+], tempo de retenção = 0,99 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (br d, J = 8 Hz) e 8,87 (br d, J = 9 Hz), 1H total], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,80 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,2 Hz) e 7,66 (d, J = 3,2 Hz), 1H total], 7,13-7,31 (m, 5H), [6,95 (br d, J = 8 Hz) e 7,06 (br d, J = 8 Hz), 1H total], 5,35-5,42 e 5,51-5,58 (2 m, 1H total), 3,15, 3,19, 3,20 e 3,26 (4 s, 6H total), 2,94 e 3,03 (2 br s, 3H total), 2,83 e 2,84 (2 s, 3H total), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) e 1,11 (d, J = 6,7 Hz), 3H total].
[0901] Etapa 4. Sínteses de N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#88).
A uma mistura de #87 (58 mg, 0,068 mmol, 1 eq.) em diclorometano (8 mL) foi adicionado ácido trifluoroacético (2 mL). Depois da agitação durante a noite, a mistura de reação foi concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (10 mL), lavado com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada, seco sobre sulfato de sódio, filtrado, e concentrado in vacuo para fornecer #88 (52 mg, quantitativo). LC-MS 757,6 [M + H+], tempo de retenção = 0,69 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,64 (br d, J = 8,6 Hz) e 8,87 (br d, J = 8,6 Hz), 1H total], 7,80-7,85 (m, 1H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,80 (d, J = 3,1 Hz), 1H total], [7,63 (d, J = 3,1 Hz) e 7,66 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,20-7,31 (m, 4H), 7,13-7,19 (m, 1H), [5,39 (ddd, J = 11, 8,5, 4 Hz) e
5,49-5,56 (m), 1H total], [4,51 (dd, J = 9, 8 Hz) e 4,61 (dd, J = 9, 8 Hz), 1H total], 3,16, 3,20, 3,21 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,94 e 3,03 (2 br s, 3H total), 2,10 e 2,10 (2 s, 3H total), 1,16 (br s, 3H), 1,04-1,12 (m, 6H), 0,72-0,80 (m, 3H).
[0902] Preparação de N2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#95)
[0903] Etapa 1. Sínteses de ácido 3-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}-2,2- dimetilpropanóico (#93). Ao ácido 3-amino-2-,2-dimetilpropanóico, sal de cloridrato (250 mg, 1,63 mmol, 1 eq.) em diclorometano (4 mL, a 0,4 M) foi adicionada diisopropiletilamina (859 µL, mmol 4,88, 3 eq.) seguida por (9H-fluoreno-9-ilmetóxi) carbonil cloreto (473 mg, 1,79 mmol, 1,1 eq.). A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (3 mL) e lavado com 1 M de solução ácido clorídrico aquosa (2 x 1 mL) e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e purificada por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 100% de etil acetato em heptano) para fornecer #93 (250 mg, 45%) como um óleo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,22 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,72 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,38-7,44 (m, 2H), 7,27- 7,35 (m, 3H), 4,18-4,30 (m, 3H), 3,16 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 1,05 (s, 6H).
[0904] Etapa 2. Sínteses de N2-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}-2,2- dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-
3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida (#94). Para #86 (100 mg, 0,152 mmol, 1 eq.) em diclorometano (4 mL, 0,038 M) e N, N-dimetilformamida (0,5 mL), foi adicionado #93 (51,6 mg, 0,152 mmol, 1 eq.) seguido pela diisopropiletilamina (80,0 µL, 0,457 mmol, 3 eq.) e HATU (89,8 mg, 0,229 mmol, 1,5 eq.). A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (6 mL) e lavado com 1 M de solução de ácido clorídrico aquoso (2 x 2 mL) e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo.
O resíduo foi retomado em diclorometano (250 mL) e filtrado; o filtrado foi concentrado in vacuo em sílica e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano) para fornecer #94 (90 mg, 60%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 979,8 [M + H+], 1002,7 [M + Na+], tempo de retenção = 1,15 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais de produtos característicos: δ [8,64 (br d, J = 8,6 Hz) e 8,86 (br d, J = 8,6 Hz), 1H total], 7,86-7,91 (m, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) e 7,79 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,67-7,73 (m, 2H), [7,63 (d, J = 3,3 Hz) e 7,65 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 6,87-6,95 (m, 1H), [5,39 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz) e 5,52 (ddd, J = 11,5, 9, 4 Hz), 1H total], [4,44 (dd, J = 8,4, 8,4 Hz) e 4,55 (dd, J = 8,4, 8,4 Hz), 1H total], 3,16, 3,20, 3,21 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,96 e 3,06 (2 br s, 3H total), 0,69-0,77 (m, 3H).
[0905] Etapa 3. Sínteses de N2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#95). Para #94 (86 mg, 0,088 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (2 mL, 0,04 M) foi adicionada dietilamina (10 mL). Depois da agitação durante a noite, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer #95 (55 mg, 72%). LC-MS: m/z 757,5 [M + H+], tempo de retenção = 0,74 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [8,66 (br d, J = 8 Hz) e 8,92 (br d, J = 9 Hz), 1H total], [7,91 (br d, J = 8 Hz) e 7,97 (br d, J = 9 Hz), 1H total], [7,78 (d, J = 3,3 Hz) e 7,81 (d, J = 3,1 Hz), 1H total], 7,65-7,74 (br m, 3H), [7,63 (d, J = 3,3 Hz) e 7,67 (d, J = 3,3 Hz), 1H total], 7,12-7,31 (m, 5H), [5,35-5,42 (m) e 5,45-5,52 (m), 1H total], [4,44 (dd, J = 9, 9 Hz) e 4,55 (dd, J = 9, 9 Hz), 1H total], 3,17, 3,20, 3,22 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,96 e 3,05 (2 br s, 3H total), 1,25 e 1,25 (2 s, 3H total), 1,14 e 1,15 (2 s, 3H total), [1,06 (d, J = 6,6 Hz) e 1,10 (d, J = 6,4 Hz), 3H total], 0,72- 0,80 (m, 3H).
[0906] Preparação de N2-(3-Amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- [(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5- metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#97)
[0907] Etapa 1. Sínteses de N2-(3-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}-2,2- dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- 3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L- valinamida (#96). Para #73 (100 mg, 0,174 mmol, 1 eq.) em diclorometano (4 mL, 0,04 M) e N, N-dimetilformamida (0,5 mL), foi adicionado #93 (59,1 mg, 0,174 mmol, 1 eq.), seguido por diisopropiletilamina (92 µL, 0,52 mmol, 3 eq.) e HATU (102 mg, 0,260 mmol, 1,5 eq.). A reação foi agitada durante 18 horas e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em etil acetato (6 mL) e lavado com solução 1 M de ácido clorídrico aquoso (2 x 2 mL) e com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo. A purificação por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano) forneceu #96 (102 mg, 65%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 896,7 [M + H+], 918,8 [M + Na+], tempo de retenção = 1,14 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais de produtos característicos: δ 7,88 (d, J = 7,4 Hz, 2H), [7,83 (br dd, J = 6, 5 Hz) e 8,03 (br dd, J = 6, 5 Hz), 1H total], 7,67-7,73 (m, 2H), 7,36-7,48 (m, 3H), 7,22-7,35 (m, 4H), 7,13-7,21 (m, 3H), 6,86-6,96 (m, 1H), [4,44 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz) e 4,50 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz), 1H total], 3,18, 3,19, 3,26 e 3,29 (4 s, 6H total), 2,96 e 3,11 (2 br s, 3H total), 0,70-0,77 (m, 3H).
[0908] Etapa 2. Sínteses de N2-(3-amino-2,2-dimetilpropanoil)-N-{(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin- 1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#97). Para #96 (98 mg, 0,11 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (2 mL, 0,04 M) foi adicionada dietilamina (0,5 mL). Depois agitação durante a noite, a reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer #97 (58 mg, 68%). LC-MS: m/z 674,4 [M + H+], 696,4 [M + Na+], tempo de retenção = 0,74 minuto; HPLC (protocolo A): 674,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,072 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [7,92 (br d, J = 8 Hz) e 7,97 (br d, J = 8 Hz), 1H total], [7,86 (br dd, J = 6, 5 Hz) e 8,07 (br dd, J = 6, 5 Hz), 1H total], 7,64- 7,74 (br m, 3H), 7,15-7,29 (m, 5H), [4,44 (dd, J = 9, 9 Hz) e 4,50 (dd, J = 9, 9 Hz), 1H total], 3,26 e 3,29 (2 s, 3H total), 3,18 e 3,20 (2 s, 3H total), 2,96 e 3,10 (2 br s, 3H total), 1,24 e 1,25 (2 s, 3H total), 1,14 e 1,16 (2 s, 3H total), 1,02-1,07 (m, 3H), 0,73- 0,80 (m, 3H).
[0909] Preparação de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (# 98)
[0910] A uma mistura de 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (65,1 mg, 0,284 mmol, 1,1 eq.) e #86 (170 mg, 0,258 mmol, 1 eq.) em diclorometano (5 mL, 0,03 M), foi adicionado HATU (0,108 mg, 0,284 mmol, 1,1 eq.) seguido por diisopropiletilamina (139 µL, 0,800 mmol, 3,1 eq.). Depois da agitação durante a noite, a mistura de reação foi arrefecida a 0°C, diclorometano (3 mL) foi adicionado, seguido pela adição lenta de ácido trifluoroacético (2 mL). A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 5 minutos, deixada aquecer à temperatura ambiente e, em seguida, agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos antes de ser concentrada in vacuo. O resíduo foi azeotropado duas vezes com heptano, diluído com uma pequena quantidade de diclorometano e metanol, antes de ser concentrado in vacuo sobre sílica. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) e, em seguida, por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer #98 (128 mg, 56%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 769,4 [M + H+], tempo de retenção = 1,28 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C) m/z 769,4 [M + H+], tempo de retenção = 7,146 minutos (pureza > 98%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 9,03-9,15 (br m, 1H), 8,77-8,86 (br m, 1H), 8,69- 8,76 (m, 1H ), [8,66 (d, J = 8,2 Hz) e 8,92 (d, J = 8,6 Hz), 1H total], [7,78 (d, J = 3,1 Hz) e 7,80 (d, J = 3,5 Hz), 1H total ], [7,63 (d, J = 3,1 Hz) e 7,67 (d, J = 3,1 Hz), 1H total], 7,12-7,31 (m, 5H), [5,38 (ddd, J = 11, 8, 4 Hz) e 5,47 (ddd, J = 11, 9, 4 Hz), 1H total], [4,46 (dd, J = 9,4, 9,0 Hz) e 4,55 (dd, J = 9,0, 8,6 Hz), 1H total], 3,17, 3,20, 3,22 e 3,25 (4 s, 6H total), 2,98 e 3,04 (2 br s, 3H total), [1,06 (d, J = 7,0 Hz) e 1,09 (d, J = 6,6 Hz), 3H total], 0,73-0,80 (m, 3H).
[0911] Preparação de metil amino (biciclo [4.2.0] octa-1 ,3,5-trien-7-il) acetato, sal de cloridrato (# 102) &&&&&&&&&&&&&&&& 0#2 . / &&&&&&&&&&&&&&&&
2. /
[0912] Etapa 1. Sínteses de etil (acetilamino)(biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il) cianoacetato (#99). Sódio (464 mg, 20,2 mmol, 1,2 eq.) foi deixado reagir com etanol absoluto (40 mL, 0,42 M); à mistura resultante foi adicionado etil 2-(acetilamino)-2- cianoacetato (3,44 g, 20,2 mmol, 1,2 eq.). Depois de 20 minutos a 60°C, 7- bromobiciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trieno (3,092 g, 16,89 mmol, 1 eq.) foi adicionado e a mistura de reação foi aquecida a refluxo durante a noite, em seguida, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi diluído com água e extraódo com etil acetato. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada in vacuo para fornecer um óleo escuro, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0 % a 50% de etil acetato em heptano) para fornecer #99 (4,38 g) como uma goma amarela. LC - MS: m/z 273,2 [ M + H+], tempo de retenção = 2,36 minutos.
[0913] Etapa 2. Sínteses de ácido (acetilamino)(biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7- il)acético (#100). A uma mistura de #99 (4,38 mg, < 16,1 mmol, 1 eq.) em metanol
(30 mL, 0,53 M) foi adicionada 1 N de uma solução aquosa de hidróxido de sódio (38 mL, 38 mmol, 2,4 eq.). A mistura de reação foi aquecida a refluxo durante a noite, em seguida, concentrada in vacuo, diluída com água (40 mL), e acidificada com 1 N de uma solução aquosa de ácido clorídrico (40 mL). A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas in vacuo. O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica gel (solvente A: diclorometano; Solvente B: 20% de metanol em diclorometano contendo 0,02 % de ácido trifluoroacético; Gradiente: 0 % a 40% de B), em seguida, por cromatografia de fluido supercrítico (Coluna: Chiralpak AD-H, 250 x 21 mm, Eluente: 85:15 de dióxido de carbono/metanol; Taxa de fluxo: 65 g/min, Detecção: 210 nm; Instrumento: sistema SFC preparativo Berger minigram). O segundo pico de eluição foi isolado para fornecer #100 (600 mg, 17% ao longo de duas etapas) como um enantiômero único (tempo de retenção = 3,37 minutos, pureza > 99 %). LC-MS: m/z 220,3 [M + H+], tempo de retenção = 2,10 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,14-7,24 (m, 2H), 7,03-7,09 (m, 2H), 4,59 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,87 (ddd, J = 8,5, 5,3, 2,4 Hz, 1H), 3,35 (dd, J = 14,5, 5,4 Hz, 1H, assumido; parcialmente obscuro pelo pico do solvente), 3,10 (dd, J = 14,4, 2,4 Hz, 1H), 2,00 (s, 3H). Rotação óptica: [ ]D25 +70,9° (c 0,67, metanol).
[0914] Etapa 3. Sínteses de amino de ácido (biciclo [4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il) acético, sal de cloridrato (#101). Uma mistura de #100 (200 mg, 0,912 mmol, 1 eq.) e 6 N de ácido clorídrico aquoso (12,3 mL, 73,8 mmol, 81 eq.) foi aquecida a refluxo durante a noite. A mistura de reação foi concentrada in vacuo para fornecer o enantiômero simples #101 (195 mg) como um sólido amarelo, o qual foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional.
[0915] Etapa 4. Sínteses de metil amino (biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il) acetato, sal de cloridrato (#102). A uma mistura de #101 (195 mg, < 0,913 mmol, 1 eq.) em metanol (20 mL, 0,04 M) foi adicionado cloreto de tionil (0,666 mL, 9,13 mmol, 10 eq.). Depois de duas horas ao refluxo, a mistura de reação foi concentrada in vacuo para fornecer o enantiômero simples #102 (175 mg, 84% ao longo de duas etapas) como um sólido de cor clara. LC-MS: m/z 192,3 [ M + H+], tempo de retenção = 0,80 minuto; GC-MS: m/z 192 [ M + H+], tempo de retenção = 3,206 minutos; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,24-7,33 (m, 2H), 7,11-7,18 (m, 2H), 4,40 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 3,99-4,05 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,46 (dd, J = 14,8, 5,4 Hz, 1H), 3,23 (dd, J = 14,8, 2,5 Hz, 1H).
[0916] Preparação de ácido (2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2- il]propanóico, sal de cloridrato (#103) $ % % 4 $ %
[0917] A uma mistura de #11 (4,09 g, 14,2 mmol, 1 eq.) em ciclopentil metil éter (10 mL, 0,14 M) foram adicionados 4 N de uma solução de cloreto de hidrogênio em dioxano (37 mL, 100 mmol, 7 eq.). Depois de três horas, a mistura de reação foi concentrada in vacuo e azeotropada três vezes com heptano para fornecer #103 (1000 mg, 31%) como uma goma, a qual foi utilizada na etapa seguinte sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,92-10,06 (br s, 1H), 8,66- 8,80 (br s, 1H), 3,89 (dd, J = 5,2, 4,9 Hz, 1H), 3,43-3,53 (m, 1H), 3,39 (s, 3H ), 3,06- 3,17 (m, 2H), 2,66 (qd, J = 7,1, 4,6 Hz, 1H), 1,71-2,03 (m, 4H ), 1,11 (d, J = 7,1 Hz, 3H).
[0918] Preparação de 2-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1- (biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il)-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#107) e 2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-
{[biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il(carbóxi)metil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#108)
[0919] Etapa 1. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-1-oxo-1-(pentafluorofenóxi)heptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#104). Para #32 (4,00 g, 6,56 mmol, 1 eq.) em diclorometano (20 mL, 0,33 M) e piridina (1,06 mL, 13,1 mmol, 2 eq.) foi adicionado gota a gota, pentafluorofenil trifluoroacetato (2,25 mL, 13,1 mmol, 2 eq.). A mistura de reação foi agitada durante uma hora.
[0920] A um segundo frasco contendo #32 (360 mg, 0,59 mmol) em diclorometano (0,6 mL, 1 M) e piridina (0,095 mL, 1,2 mmol, 2 eq.) foi adicionado gota a gota, pentafluorofenil trifluoroacetato (0,203 mL, 1,18 mmol). Esta mistura de reação foi agitada durante 15 minutos.
[0921] As duas misturas de reação foram combinadas, lavadas duas vezes com 1 N de ácido clorídrico aquoso, seco sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado in vacuo. O óleo amarelo resultante foi dissolvido em etil acetato, pré-adsorvido em sílica gel e purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0 % a 40 % de etil acetato em heptano) para fornecer #104 (4,6 g, 83%) como uma espuma branca contendo algumas impurezas. LC-MS: m/z 798,3 [ M + Na+], tempo de retenção = 1,23 minutos.
[0922] Etapa 2. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carbóxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#105). A uma mistura de #104 (2,00 g, < 2,58 mmol, 1 eq.) em diclorometano (6 mL, 0,4 M) foi adicionada uma solução de #103 (483 mg, 2,16 mmol, 1 eq.) em diclorometano (2 mL) seguido por diisopropiletilamina (1,35 mL, 7,73 mmol, 3 eq.). A mistura de reação foi agitada durante 16 horas, em seguida, adsorvida em sílica e purificada por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0 % a 20 % de metanol em diclorometano) para fornecer #105 (1,67 g, 83%) como uma espuma branca. As frações contendo o produto desejado com impurezas (0,571 g) foram recolhidas separadamente.
[0923] A reação e purificação acima foram repetidas de forma similar usando #104 (2,60 g, < 3,35 mmol, 1 eq.), #103 (750 mg, 3,35 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL, 0,3 M) e diisopropiletilamina (1,35 mL, 7,73 mmol, 2,3 eq.) para fornecer #105 (2,4 g, 92%) como uma espuma acastanhada. As frações que contêm o produto impuro (1,7 g) foram combinadas com as frações impuras anteriores e purificadas como descritas acima para fornecer #105 adicional (1,30 g, rendimento quantitativo para as duas reações ao longo de duas etapas). LC-MS: m/z 779,3 [M + H+], 802,3 [M + Na+], tempo de retenção = 1,05 minutos.
[0924] Etapa 3. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1-(biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il)-2-metóxi-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#106). A uma mistura de #105 (225 mg, 0,289 mmol, 1 eq.) em diclorometano (15 mL, 0,02 M) e N, N-dimetilformamida (1 mL) foi adicionado HATU (136 mg, 0,347 mmol, 1,2 eq.). Depois de cinco minutos, uma solução de amina #102 (72,4 mg, 0,318 mmol, 1 eq.) e diisopropilamina (203 µL,
1,16 mmol, 3 eq.) em diclorometano (5 mL) foi adicionada. Após 24 horas, a mistura de reação foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio, filtrada, concentrada in vacuo sobre silica gel e purificada por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 50% de acetona em heptano) para fornecer o enantiômero simples #106 (210 mg, 76%) como um óleo claro. LC - MS: m/z 953,1 [M + H+], tempo de retenção = 3,99 minutos; 1H RMN (400 MHz, CDCl3), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,57-7,64 (m, 2H), 7,40 (dd, J = 7,5, 7,4 Hz, 2H), 7,28-7,34 (m, 2H), 4,82-4,88 (m, 1H), 3,95-4,01 (m, 1H), 3,76 e 3,82 (2 s, 3H total), 3,30, 3,31, 3,34 e 3,35 (4 s, 6H total), [1,20 (d, J = 7,0 Hz) e 1,20 (d, J = 7,0 Hz), 3H total].
[0925] Etapa 4A. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[1- (biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il)-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#107). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #106 (25 mg, 0,026 mmol, 1 eq.) em diclorometano (10 mL, 0,003 M) e dietilamina (4 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer o enantiômero simples #107 (16 mg, 73%) como um sólido. LC-MS: m/z 730,8 [M + H+], tempo de retenção = 2,13 minutos; HPLC (Protocolo N): tempo de retenção = 9,889 minutos.
[0926] Etapa 4B. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-il(carbóxi)metil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#108). O único enantiómero #108 (94,5 mg, 57%) foi sintetizado a partir de #106 (190 mg, 0,200 mmol), de acordo com um procedimento similar ao descrito para a síntese de #41 a partir de #40. LC-MS: m/z 716,8 [M + H+], tempo de retenção = 2,06 minutos; HPLC (Protocolo N): tempo de retenção = 9,137 minutos.
[0927] Preparação de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1- hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#112) / $ % !0 $! 1#0" % &/( /( )'( ' (
[0928] Etapa 1. Sínteses de terc-butil (2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1- fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidina-1-carboxilato (#109). A uma solução de #11 (2,00 g, 6,96 mmol, 1 eq.) em diclorometano ( 21 mL, 0,3 M ) e N, N-dimetilformamida (3 mL) foi adicionado HATU (3,270 mg, 8,35 mmol, 1,2 eq.).
Depois de dois minutos, a amina (1R, 2S)-(+)-norefedrina (1,07 mg, 6,96 mmol, 1 eq.) e trietilamina (1,94 mL, 13,9 mmol, 2 eq.) foram adicionadas. Depois de duas horas, a mistura de reação foi diluída com etil acetato (100 mL), lavada com 1 M de uma solução aquosa de ácido clorídrico e com salmoura, seca sobre sulfato de sódio, filtrada, concentrada in vacuo, e purificada por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 60% de etil acetato em heptano) para fornecer #109 (2,18 g, 74%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 321,3 [(M-Boc) + H+], tempo de retenção = 3,14 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,64 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,24-7,33 (m, 4H), 7,15-7,21 (m,
1H), 5,35 (br d, J = 5 Hz, 1H), 4,45 (br dd, J = 5, 5 Hz, 1H), 3,91-4,00 (m, 1H), 3,30- 3,39 (m, 1H), 3,26 (s, 3H), 2,94-3,07 (m, 1H), 2,04-2,14 (m, 1H), 1,46-1,78 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 0,97-1,04 (m, 6H).
[0929] Etapa 2. Sínteses de (2R,3R)-N-[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]-3- metóxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida, sal de ácido trifluoroacético (#110).
De acordo com o procedimento geral C, a 0°C a partir de #109 (414 mg, 0,984 mmol, 1 eq.), dioxano (5 mL, 0,2 M) e 4 M de uma solução de cloreto de hidrogênio em dioxano (15 mL, 60 mmol, 60 eq.) foi sintetizado o composto bruto desejado, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método C) para fornecer #110 (120 mg, 34%) como um líquido viscoso. LC-MS: m/z 321,1 [M + H+], tempo de retenção = 0,55 minuto; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), sinais característicos: δ 7,90 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,28-7,36 (m, 4H), 7,20-7,27 (m, 1H), 4,46 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 3,48 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,92-3,16 (m, 3H), 2,24-2,35 (m, 1H), 1,49-1,88 (m, 4H), 1,09 (d, J = 6,6 Hz, 3H ), 1,01 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[0930] Etapa 3. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#111). De acordo com o procedimento geral D, a partir de #32 (140 mg, 0,230 mmol, 1 eq.), #110 (110 mg, 0,253 mmol, 1,1 eq.), diclorometano (3 mL, 0,08 M), N, N-dimetilformamida (0,5 mL), HATU (96,2 mg, 0,253 mmol, 1,1 eq.) e trietilamina (96 µL, 0,69 mmol, 3 eq.) foi sintetizado o produto bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 40 % de acetona em heptano) para fornecer #111 (220 mg, 95%). LC-MS: m/z 912,4 [M + H+], 935,4 [M + Na+], tempo de retenção = 2,15 minutos; HPLC (Protocolo B ): m/z 912,5 [M + H+], 934,5 [M + Na+], tempo de retenção = 10,138 minutos (pureza > 94%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume-se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ 7,89 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,66-7,75 (m, 2H), 7,41 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 2H), 7,12-7,20
(m, 1H), [5,33 (d, J = 4,7 Hz) e 5,38 (d, J = 4,7 Hz), 1H total], 3,15, 3,18, 3,22 e 3,23 (4 s, 6H total), 1,30, 1,33, 1,36 e 1,39 (4 s, 6H total), 0,95-1,06 (m, 6H).
[0931] Etapa 4. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#112). Acordo com o procedimento geral A, a partir de #111 (210 mg, 0,230 mmol) em diclorometano (5 mL, 0,05 M) e dietilamina (5 mL), foi sintetizado o material bruto desejado, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 10% de metanol em diclorometano) para fornecer uma mistura de um óleo e sólido. Dietil éter e heptano foram adicionados e a mistura foi concentrada in vacuo, fornecendo #112 (81 mg, 51%) como um sólido branco. LC-MS: m/z 690,4 [M + H+], tempo de retenção = 1,10 minutos; HPLC (protocolo A): m/z 690,5 [M + H+], 712,4 [M + Na+], tempo de retenção = 7,229 minutos (pureza > 90%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), presume- se ser uma mistura de rotâmeros, sinais característicos: δ [7,62 (br d, J = 8 Hz), 7,88 (br d, J = 8 Hz), 8,07 (br d, J = 9 Hz) e 8,11 (br d, J = 9 Hz), 2H total], 7,15-7,34 (m, 5H), [5,34 (d, J = 4 Hz) e 5,41 (d, J = 5 Hz), 1H total], 3,18, 3,21, 3,23 e 3,25 ( 4 s, 6H total), 2,93 e 3,08 (2 br s, 3H total , 1,15, 1,18, 1,21 e 1,25 (4 s, 6H total).
[0932] Preparação de N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (115).
HATU, Hunig's base A"7 HN Et2NH O CH2Cl2 ,% O H H CH2Cl2
N OH N N Fmoc N O Fmoc N
O O NH O O O O 62% O 67%
NH O O
O dimer acid#5
O #113 #67 0; 4&< &+ , %& & =$ / % >&4 & %% O 1. N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-N,2-dimethylalanine H2N N HATU, Hunig's base, CH2Cl2 O
N H A"7
2. LiOH, THF, water ,% N N
O O HN N
O O O O NH 64% O
O O NH
O O #114 O #115
OH
[0933] Etapa 1. Sínteses de metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2- il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato (#113). A uma mistura de agitação de ácido dímero #5 (12,1 g, 23,0 mM e #67 (11,5 g, 23,0 mM) em 75 mL de diclorometano sob nitrogênio, HATU (10,8 g, 27,6 mM) foi adicionado seguido pela base de Hunig (12,1 mL, 69,0 mM). A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 15 horas. A reação foi concentrada até um volume menor, retomada com etil acetato e lavada com 1 N de HCl, duas vezes. A camada orgânica foi, em seguida, lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio, filtrada, concentrada in vacuo. O resíduo foi, em seguida, purificado por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 70% de acetona em heptanos), fornecendo #113 (12,3 g, 62%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q ): m/z 855,3 [M + H+], 877,2 [M + Na+], tempo de retenção = 2,32 minutos; HPLC (Protocolo R): /z 855,5 [M + H+], tempo de retenção = 9,596 minutos (pureza > 97 %) .
[0934] Etapa 2. Sínteses de metil N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3- metóxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L- fenilalaninato (#114). De acordo com o procedimento geral A, a partir de #113 (12 g, 14 mmol, 1 eq.), diclorometano (60 mL, 0,24 M) e dietilamina (40 mL, 390 mM) foi sintetizado #114 (5,9 g, 67%) sólido amarelo branco/ligeiro, após a purificação por cromatografia em sílica gel (Gradiente: 0% a 25% de metanol em diclorometano).
LC-MS (Protocal Q): m/z 633,0 [M + H+], tempo de retenção = 1,19 minutos. HPLC (Protocolo A ) :/z 633,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,142 minutos (pureza > 98%).
[0935] Etapa 3. Sínteses de sal de ácido N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletill]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida-trifluoroacético (#115). A uma mistura de agitação de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2- dimetilalanina (167 mg, 0,493 mM), #114 (260 mg, 0,411 mM), e HATU (188 mg, 0,493 mM) em 10 mL de diclorometano, a base de Hunig (0,14 mL, 0,82 mM) foi adicionada. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 1 hora e 20 minutos. A reação foi reduzida para baixo. THF (9 mL) foi adicionado ao material bruto e para esta mistura de agitação hidróxido de lítio (49,2 mg, 2,06 mM) dissolvido em 3 mL de água foi adicionado. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 4 horas. A reação foi concentrada para baixo seguida por purificação por cromatografia C18 de fase reversa de média pressão (Gradiente: 5% a 45% de água em acetonitrila com 0,02% de TFA em cada fase) #115 (218 mg, 64%) sólido branco.
LC-MS (Protocolo Q): m/z 718,7 [M + H+], 740,6 [M + Na+], tempo de retenção = 1,21 minutos. HPLC (Protocolo A a 45°C ): m/z 718,4 [M + H+], tempo de retenção = 6,903 minutos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ 8,81-8,95 (m), 8,44-8,50 (m), 8,42 (d), 8,15 (d), 7,14-7,28 (m), 4,71-4,78 (m), 4,57-4,66 (m), 4,49-4,56 (m), 4,41-4,48 (m), 3,94-4,05 (m), 3,72-3,79 (m), 3,39-3,60 (m), 2,95-3,33 (m), 2,78-2,89 (m), 2,69 (s), 2,43-2,50 (m), 2,08-2,42 (m), 1,60-1,92 (m), 1,20-1,57 (m), 0,84-1,11 (m), 0,74- 0,83 (m).
[0936] Preparação de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3 oxopropil]pirrolidin- 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético
(#117) e 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2- feniletill]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#118)
O
H TFA, CH2Cl2 N N
N
NH 00 A"7 O O O O 89% O #114, HATU, H ,% N N .CF3CO2H O
NH OH Hunig's base N #117 O
N N CH2Cl2 O O O O Boc O O Boc 74% NH O O 0; ( 3 #116 O 1. LiOH O THF, water H " * ? , N N
N
2. TFA, CH2Cl2 NH
O O O O
NH # 2 .74% (2 steps) / .CF3CO2H O O #118
OH
[0937] Etapa 1. Sínteses de 1-(tert-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4- {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida (#116). A uma solução agitada de #114 (1,02 g, 1,61 mmol, 1,0 eq.) e 1- (terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (443 mg, 1,93 mmol, 1,2 eq.) em 12 mL de diclorometano, HATU (735 mg, 1,93 mmol, 1,2 eq.) foi adicionado seguido pela base de Hunig (1,12 mL, 6,45 mmol, 4,0 eq.). A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 2 horas. A reação foi reduzida para baixo, diluída com etil acetato antes de ser lavada com 0,5 N de HCl e salmoura. Orgânicos onde, em seguida, secos sobre sulfato de sódio, reduzidos até um pequeno volume, e em seguida, reduzidos em sílica. A cromatografia sobre sílica foi, em seguida, realizada (Gradiente: 0%-45% de acetona em heptanos) fornecendo #116 (1,02 g, 74%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 844,3 [M + H+], 867,2 [M + Na+], tempo de retenção = 2,15 minutos.
[0938] Etapa 2A. Sínteses de 2-metil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}- 2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#117). A uma solução agitada de #116 (450 mg, 0,533 mmol, 1,0 eq.) em 7 mL de diclorometano a 0°C, TFA (3 ml, 40 mmol, 70 eq.) foi adicionado. A reação foi deixada agitar a 0°C durante 5 minutos e, em seguida, deixada aquecer à temperatura ambiente enquanto se agitava durante 20 minutos. A reação foi reduzida para baixo, diluída com diclorometano e uma pequena quantidade de metanol, antes de ser reduzida para baixo sobre sílica. A cromatografia sobre sílica foi, em seguida, realizada (Gradiente: 0%-20% de metanol em etil acetato) fornecendo #117 (396 mg, 89%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q ): m/z 744,5 [M + H+], 767,2 [M + Na+], tempo de retenção = 1,40 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 744,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,149 minutos (pureza > 91%). 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ 8,73-9,14 (m), 8,66 (br d), 8,50 (d), 8,22 (d), 7,12- 7,25 (m), 4,67-4,74 (m), 4,41 -4,63 (m), 3,93-4,00 (m), 3,73 (dd), 3,63 (d), 3,46-3,57 (m), 3,38-3,45 (m), 3,26-3,23 (m), 3,22-3,25 (m), 3,06-3,22 (m), 2,99-3,05 (m), 2,93- 2,97 (m), 2,80-2,89 (m), 2,75-2,78 (m), 2,64-2,67 (m), 2,46-2,50 (m), 2,27-2,43 (m), 2,00-2,26 (m), 1,85-1,99 (m), 1,70-1,83 (m), 1,52-1,69 (m), 1,33-1,51 (m), 1,18-1,31 (m), 0,98 -1,07 (m), 0,93-0,97 (m), 0,82-0,92 (m), 0,71-0,78 (m).
[0939] Etapa 2B. Sínteses de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletill]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (# 118). A uma solução agitada de #116 (435 mg, 0,515 mmol), em 4 mL de THF sob nitrogênio, LiOH (24,7 mg, 1,03 mmol, 2,0 eq.) dissolvido em 2 mL de água foi adicionado. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente até a saponificação indicada de LC-MS de metil éster. A reação foi concentrada in vacuo e, em seguida, colocada sob vácuo. A reação foi diluída com diclorometano e colocada sob nitrogênio. A esta mistura de agitação, TFA (3 mL, 40,5 mmol, 80 eq.) foi adicionado.
A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 30 minutos. A reação foi, em seguida, reduzida para baixo. O resíduo foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 5% a 60% de acetonitrila em água com 0,02% de TFA em cada fase) #118 (396 mg, 89%) como um sólido branco. LC- MS (Protocolo Q): m/z 730,2 [M + H+], tempo de retenção = 1,18 minutos; HPLC (Protocolo A a 45°C): m/z 730,5 [M + H+], tempo de retenção = 7,088 minutos (pureza > 98%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ 9,04-9,13 (m), 8,75-8,87 (m), 8,70 (d), 8,38 (d), 8,11 (d), 7,10-7,24 (m), 4,66 - 4,74 (m), 4,48-4,64 (m), 4,37-4,47 (m), 3,91-3,99 (m), 3,77 (m), 3,47-3,56 (m), 3,33-3,47 (m), 3,08-3,30 (m), 2,93-3,07 (m), 2,75-2,86 (m), 2,63-2,69 (m), 2,45-2,50 (m), 2,28-2,44 (m), 2,03-2,27 (m), 1,88-2,02 (m), 1,68-1,86 (m), 1,55-1,67 (m), 1,30-1,47 (m), 1,17-1,29 (m), 0,98-1,05 (m), 0,93- 0,97 (m), 0,83-0,92 (m), 0,71-0,79 (m).
[0940] Preparação de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-tert- butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#123). 0; $ %
1. 4M HCl in dioxane, dioxane & , (&+ % %
2. Fmoc-OSu N % tert-butyl L-phenylalaninate, hydrochloride salt diethylamine 10% Na2CO3 (aq) ;* &3@, 0 2 HATU, Hunig's base Fmoc CH2Cl2 DME 4 3 . 9/ CH2Cl2, DMF A"7 ,% N N1 O Boc Fmoc NH 79% O O quant. O quant. (2 steps) O
OH OH O
O O #11 #119 #120 9, % ; . / % HN #32, HATU, Hunig's base O diethylamine O H CH2Cl2 H CH2Cl2, DMF Fmoc N N N N N N H2N N
O H
O O O O O O NH O 99% O O O 62% NH NH
O O O O O #123 #122
O O #121
[0941] Etapa 1. Sínteses de ácido (2R, 3R)-3-{(2S)-1-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil]-2-il}-pirrolidin-2-il}-3-metóxi-2-metilpropanóico (#119). A uma solução agitada de #11 (2,4 g, 8,4 mmol, 1,0 eq.) em 10 mL de dioxano sob nitrogênio, 4M de HCl em dioxano (20 mL, 80 mM, 10 eq.) foram adicionados. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 3 horas antes de ser concentrada in vacuo e colocada sob alto vácuo. O material bruto foi, em seguida, dissolvido com 30 mL de 10% de Na2CO3. Esta solução foi, em seguida, adicionada a uma solução agitada de
1-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil]óxi}pirrolidina-2,5-diona (2,96 g, 8,77 mmol, 1,05 eq.) em 30 ml de DME. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente até que a TLC (20% de metanol/40% de etil acetato/40% de heptanos) indicou o consumo do material de partida desprotegido Boc. A reação foi concentrada in vacuo para um volume menor, lavada duas vezes com éter, acidificada para pH 2 com HCl concentrado e, em seguida, extraída três vezes com uma solução de 90% de diclorometano a 10% de metanol. Os orgânicos foram lavados com bicarbonato de sódio saturado e salmoura antes de serem secos sobre sulfato de sódio, filtrados, e concentrados in vacuo até um sólido castanho #119 (3,4 g, quant.). LC-MS (Protocolo Q): m/z 410,0 [M + H+], tempo de retenção = 1,81 minutos.
[0942] Etapa 2. Sínteses de terc-butil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]pirrolidin-2-il}-3-metóxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato (#120). A uma solução agitada de terc-butil L-fenilalaninato, sal de cloridrato (1,67 g, 6,5 mmol, 1,0 eq.) e #119 (5,9 g, 6,5 mmol, 1,0 eq.) em 50 mL de diclorometano e 5 mL de DMF, HATU (2,9 g, 7,9 mmol, 1,2 eq.) foi adicionado seguido pela base de Hunig (5,6 mL, 32 mmol, 5,0 eq.). A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 45 minutos. A reação foi reduzida para baixo, diluída com etil acetato, lavada com 0,5 N de HCl e salmoura antes de ser concentrada até a sílica. A cromatografia de sílica foi, em seguida, realizada (Gradiente: 0%-25% de acetona em heptano) fornecendo #120 (3,14 g, 79%) como um sólido amarelo branco. LC- MS (Protocolo Q ): m/z 613,1 [M + H+] tempo de retenção = 2,37 minutos.
[0943] Etapa 3. Sínteses de terc-butil N-{(2R, 3R)-3-metóxi-2-metil-3-[(2S)- pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato (#121). A uma solução agitada de #120 (2,87 g, 4,68 mmol, 1,00 eq.) em 20 mL de diclorometano, dietilamina (10 mL, 95 mM, 20,5 eq.) foi adicionada. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 2 horas. Outra (10 mL, 95 mmol, 20,5 eq.) de dietilamina foi adicionada e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante mais 3 horas. A reação foi concentrada in vacuo e colocada sob alto vácuo produzindo #121 (1,8 g, quant.) mistura sólida de óleo branco amarelo. LC-MS (Protocolo Q): m/z 391,1 [M + H+] tempo de retenção = 1,05 minutos.
[0944] Etapa 4. Sínteses de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-tert-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}- 1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil- L-valinamida (#122). A uma solução agitada de #121 (0,55 g, 1,0 mmol, 1,0 eq.) em mL de diclorometano e 1 mL de DMF, #32 (0,62 g, 1,0 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado seguido por HATU (0,42 g, 1,1 mmol, 1,1 eq.) e base de Hunig (0,72 mL, 4,1 mmol, 4,0 eq.). A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante aproximadamente 21 horas. A reação foi reduzida para baixo, diluída com etil acetato, e em seguida lavada com 0,5 N de HCl e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e concentrada para um volume menor antes de ser concentrada até sílica. A cromatografia de sílica foi, em seguida, realizada (Gradiente: 0%-40% de acetona em heptano) produzindo #122 (0,62 g, 62%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 982,3 [M + H+] tempo de retenção = 2,44 minutos.
[0945] Etapa 5. Sínteses de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)- 1-tert-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#123). A uma mistura agitada de #122 (600 mg, 0,611 mmol, 1,00 eq.) em 15 mL de diclorometano, dietilamina (5 mL, 50 mmol, 80 eq.) foi adicionada. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 3 horas. A reação foi concentrada in vacuo e a mistura foi purificada por cromatografia de sílica (Gradiente: 0% a 40% de metanol em diclorometano) produzindo #123 (0,46 g, 99%) como um sólido. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 760,3 [M + H+] tempo de retenção = 0,83 minuto. 1H RMN (400 MHz, CD3OD), δ 7,14-7,30 (m), 4,70-4,78 (m), 4,56-4,64 (m), 4,05-4,19 (m), 3,87
(dd), 3,79-3,84 (m), 3,72-3,77 (m), 3,62-3,70 (m), 3,46-3,56 (m), 3,37-3,45 (m), 3,33- 3,36 (m), 3,16-3,24 (m), 3,09-3,11 (m), 2,98 -3,05 (m), 2,95 (d), 2,91 (d), 2,87 (d), 2,83 (d), 2,73 – 2,79 (m), 2,40-2,51 (m), 2,29-2,39 (m), 2,16-2,28 (m), 2,04-2,15 (m), 2,01 (s), 1,73-1,96 (m), 1,50-1,68 (m), 1,47-1,49 (m), 1,46 (s), 1,43 (s), 1,38 (s), 1,35 (d), 1,23-1,32 (m), 1,17-1,22 (m), 1,15 (d), 1,04-1,11 (m), 0,94-1,03 (m), 0,82-0,91 (m).
[0946] Preparação de N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-amino-2,2- dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3- metóxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato de metil (#126).
[0947] Etapa 1. Síntese de ácido 3-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}-2,2- dimetilpropanoico (#124). Uma solução de cloridrato de ácido 3-amino-2,2- dimetilpropanoico (1.0 g, 6.5 mmol, 1.0eq.) em 10 mL de 10% de Na2CO3 foi adicionada a uma solução de 1-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]óxi}pirrolidina-2,5- diona (2.3 g, 6.5 mmol, 1.0 eq.) em 10 mL de DME. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente durante a noite. Reação foi concentrada para um volume menor e em seguida lavada duas vezes com éter. A camada aquosa foi acidificada para pH <2 coM de HCl concentrado e em seguida extraída três vezes com uma solução de 10% de metanol 90% de diclorometano. The organics foram combinados antes sendo lavada com 1M de HCl e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada in vacuo produzindo #124 (2.2 g, 98%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 362.0 [M+Na+] tempo de retenção = 0.89 minutos.
[0948] Etapa 2. Síntese de N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-{[(9H-fluoren- 9-ilmetóxi)carbonil]amino}-2,2-dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi-5- metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metóxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato de metil (#125). A uma solução agitada de #114 (200 mg, 0.316 mmol, 1.00 eq.) em 2 mL de diclorometano, #124 (107 mg, 0.316 mmol, 1.00 eq.) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.167 mL, 0.948 mmol, 3.00 eq.) e HATU (149 mg, 0.379 mmol, 1.20 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. A reação foi concentrada para um volume menor, tomada em 10 mL de acetato de etil, e lavada duas vezes com 5 mL de 1M de HCl, e uma vez com 5 mL de salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. Orgânicos foram concentrados in vacuo e o material bruto foi tomado em diclorometano. O precipitado foi filtrado. A camada orgânica foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-50% de acetona em heptano) produzindo #125 (235 mg, 78%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 954.2 [M+H+] tempo de retenção = 2.28 minutos.
[0949] Etapa 3. Síntese de N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-(3-amino-2,2- dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3- metóxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato metil (#126). A uma solução agitada de #125 (235 mg, 0.246 mmol, 1.00 eq.) em 2 mL de THF, (1 mL, 10 mM, 40.6 eq.) de dietilmina foi adicionada. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 3 horas. Reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de metanol em acetato de etil) produzindo #126 (101 mg, 56%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 732.2 [M+H+] tempo de retenção = 1.32 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.51 (dd), 8.28 (d), 7.15-
7.29 (m), 5.77 (s), 4.55-4.77 (m), 4.44-4.54 (m), 3.94-4.10 (m), 3.73-3.79 (m), 3.66
(d), 3.49-3.60 (m), 3.40-3.48 (m), 3.10-3.36 (m), 3.00-3.09 (m), 2.83-2.98 (m), 2.57-
2.77 (m), 2.19- 2.46 (m), 1.87- 2.14 (m), 1.61- 1.86 (m), 1.36-1.55 (m), 1.23-1.36 (m),
1.12-1.22 (m), 0.97-1.11 (m), 0.82-0.96 (m), 0.73-0.81 (m).
[0950] Preparação de N,2-dimetillanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1- terc-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#130).
[0951] Etapa 1. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(3R,4S,5S)-1-terc-butóxi-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#127). A um frasco de fundo redondo contendo #6 (4.7 g, 7.9 mmol, 1.0 eq.) e N- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanine (3.2 g, 9.4 mmol, 1.2 eq.) e uma barra de agitação sob nitrogênio, 50 mL de diclorometano foi adicionado seguido por HATU (3.6 g, 9.4 mmol, 1.2 eq.) e Base de Hunig (5.5 mL, 32 mmol, 4.0 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. Reação foi reduzida para um volume menor, tomada em acetato de etil, antes sendo lavada com 1 N de HCl, e salmoura. Orgânicos foram em seguida secos sobre sulfato de sódio, filtrados e em seguida reduzidos sobre sílica. Resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de acetona em heptano) produzindo #127 (4.2 g, 78%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 680.2 [M+H+] tempo de retenção = 2.52 minutos.
[0952] Etapa 2. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(2R,3S,4S)-1-carbóxi-2-metóxi-4-metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida, (#128). A uma solução agitada de #127 (4.2 g, 6.1 mmol, 1.0 eq.) em 21 mL de diclorometano sob nitrogênio, (7 mL, 90 mmol, 10 eq.) de TFA foi adicionada. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~4 horas. Reação foi concentrada in vacuo, azeotropada uma vez com heptano, e em seguida colocada sob alto vácuo rendendo #128 como um sólido amarelo levemente esbranquiçado (3.8 g, quant.). LC-MS (Protocolo Q): m/z 624.2 [M+H+] tempo de retenção = 2.01 minutos.
[0953] Etapa 3. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}- 1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil- L-valinamida (#129). A uma solução agitada de #128 (1.67 g, 3.1 mmol, 1.0 eq.) em de diclorometano e 2 mL de DMF, #121 (2.4 g, 3.1 mmol, 1.0 eq.) foi adicionado seguido por HATU (1.29 g, 3.39 mmol, 1.1 eq.) e em seguida Base de Hunig (2.2 mL, 12.3 mmol, 4.0 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~2 horas. Reação foi reduzida, diluída com acetato de etil antes sendo lavada com 0.5 N de HCl e salmoura. Orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio e em seguida reduzidos sobre sílica. Resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-50% de acetona em heptanos) produzindo #129 (1.9 g, 62%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 996.3 [M+H+] tempo de retenção =2.53 minutos.
[0954] Etapa 4. Síntese de N,2-dimetillanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(2S)-1-terc-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#130). A uma solução agitada de #129 (823 mg, 0.826 mmol, 1.00 eq.) em 15 mL de diclorometano, dietilmina (4 mL, 40 mmol, 50 eq.) foi adicionada. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~14 ½ horas. A reação foi concentrada in vacuo e azeotropada uma vez com heptanos. Resíduo foi diluído com diclorometano e uma pequena quantidade de metanol antes sendo reduzido sobre sílica. Resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-20% de metanol em acetato de etil) produzindo #130 (518 mg, 81%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 774.3 [M+H+] tempo de retenção =1.48 minutos. HPLC (Protocola A at 25 °C): m/z 774.5 [M+H+], tempo de retenção = 7.733 minutos (pureza > 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.36 (d). 8.14(d), 7.81 (t), 7.14-
7.25 (m), 7.01-7.07 (m), 4.87-4.94 (m), 4.78-4.85 (m,), 4.67-4.76 (m), 4.46-4.65 (m),
4.29-4.40 (m), 3.93-4.03 (m), 3.70- 3.81(m), 3.49- 3.60 (m), 3.38-3.47 (m), 3.29- 3.36 (m), 3.15-3.28 (m), 2.98-3.13 (m), 2.94 (br s), 2.74-2.89 (m), 2.64-2.69 (m), 2.18-2.45 (m), 2.02-2.14 (m), 1.90-2.01 (m), 1.62-1.87 (m), 1.40-1.55 (m), 1.37 (d), 1.20-1.33 (m), 1.16(d), 1.01-1.10(m), 0.90-0.98 (m), 0.82 -0.89 (m), 0.69-0.79 (m).
[0955] Preparação de 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#131).
[0956]
[0957] Etapa 1. Síntese de 2-metil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#131). A uma solução agitada de #114 (164 mg, 0.259 mmol, 1.0 eq.) e 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-D-prolina (71.3 mg, 0.311 mmol, 1.2 eq.) em 4 mL de diclorometano, HATU (118 mg, 0.311 mmol, 1.2 eq.) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.180 mL, 1.04 mmol, 4 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~30 minutos. Reação foi reduzida. Reação foi tomada em
3.5 mL de diclorometano e colocada sob nitrogênio. A esta solução agitada, TFA
(1.5 mL, 20 mmol, 76 eq.) foi adicionado. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~1 hora. Reação foi reduzida e colocada sob alto vácuo. Purificação por (Método J*) fornece #131 (119 mg, 54%) como um sólido branco. HPLC (Protocola A at 45 °C): m/z 744.5 [M+H+], tempo de retenção = 7.342 minutos (pureza > 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 9.08-9.18 (m), 8.79-8.89 (m), 8.76 (t), 8.54 (d), 8.29 (d), 7.14-7.31 (m), 4.70-4.79 (m), 4.57- 4.66 (m), 4.45-4.55 (m),
3.96- 4.04 (m), 3.74- 3.80, 3.66 (d), 3.48-3.61 (m), 3.40-3.48 (m), 3.09- 3.34 (m),
3.00-3.09 (m), 2.95-3.00 (m), 2.83- 2.93 (m), 2.36- 2.53 (m), 2.21-2.35 (m), 2.10-2.19 (m), 1.99-2.10 (m), 1.61-1.09 (m), 1.36-1.53(m), 1.21-1.35 (m), 1.02- 1.10 (m), 0.94-
1.0 (m), 0.86- 0.93 (m), 0.73- 0.82 (m).
[0958] Preparação de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)- 1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#134).
[0959] Etapa 1. Síntese de N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#132). A um frasco contendo #@5 (1.14 g, 2.17 mmol, 1.0 eq.), 10 mL de diclorometano foi adicionado seguido por Base de Hunig (1.15 mL, 6.52 mmol, 3.0 eq.), HATU (1.02 g, 2.61 mmol, 1.2 eq.), e #110 (0.776 g, 2.17 mmol, 1.0 eq.).
Reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 30 minutos e em seguida concentrada in vacuo. Material bruto foi tomado em 50 mL de acetato de etil, lavado duas vezes com 25 mL de 1 M de HCl, e uma vez com 25 mL de salmoura.
Orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio e decantados. Orgânicos foram concentrados in vacuo, tomados em 30 mL de diclorometano, e o precipitado resultante foi filtrado. Orgânicos foram concentrados in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-50% de acetona em heptanos) produzindo #132 (1.33 g, 81%) como um sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 849.2 [M+Na+] tempo de retenção =2.19 minutos.
[0960] Etapa 2. Síntese de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi- 1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#133). A uma solução agitada de #132 (1.33 g, 1.60 mmol, 1.0 eq) em 10 mL de THF dietilmina (5 mL, 50 mM, 31.3 eq) foi adicionada. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 4 horas.
Reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de metanol em acetato de etil) produzindo #133 (418 mg, 43%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 605.2 [M+H+] tempo de retenção =1.48 minutos.
[0961] Etapa 3. Síntese de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#134). HATU (151 mg, 0.398 mmol, 1.2 eq), #133 (201 mg, 0.332 mmol, 1.0 eq.) e 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (91.3 mg, 0.398 mM, 1.2 eq.) foram combinados em um frasco de fundo redondo contendo uma barra de agitação sob nitrogênio. 5 mL de diclorometano foi adicionado seguido por Base de
Hunig (0.231 mL, 1.33 mmol, 4.0 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~15 horas. Reação foi em seguida concentrada in vacuo e colocada sob alto vácuo. 4 mL de dioxano foi em seguida adicionado ao resíduo seguido por 4M de HCl em dioxano (4 mL, 20 mmol, 50 eq.). Reação foi em seguida permitida agitar à temperatura ambiente por 1 hora. Reação foi em seguida concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 5% a 90% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) #134 (237 mg, 86%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 716.3 [M+H+], tempo de retenção = 1.16 minutos; HPLC (Protocola A at 45 °C): /z 716.5 [M+H+], tempo de retenção = 6.930 minutos (pureza > 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 9.12-9.21(m), 8.79-8.90 (m), 8.70-8.78 (m), 7.95 (d), 7.64 (d), 7.25-7.36 (m), 7.16- 7.23 (m), 4.74- 4.80 (m), 4.61- 4.69 (m), 4.41- 4.59 (m), 3.91- 4.06 (m),
3.78 (dd), 3.54- 3.64 (m), 3.45- 3.51 (m), 3.17- 3.36 (m), 3.02- 3.15 (m), 3.00 (br s),
2.40-2.48 (m), 2.24- 2.35 (m), 1.91- 2.21 (m),. 1.68- 1.90 (m), 1.61-1.68 (m), 1.48-
1.59 (m), 1.22- 1.35 (m), 0.97- 1.09 (m), 0.84- 0.97 (m), 0.74-0.83 (m).
[0962] Preparação de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- benzil-2-(metilmino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2- metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#140), N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-2- amino-1-benzil-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi- 1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#141), N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-oxo-2- (propylamino)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#142), N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-(dietilmino)-2- oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1- metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#143), e
N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-(terc-butylamino)-2-
oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-
metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#144).
[0963] Etapa 1. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N-
[(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-1-oxo-1-(pentafluorofenóxi)heptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida (#135). 3,3,3-trifluoropropanoato de pentafluorofenila (2.44 mL, 13.4 mmol, 2.0 eq.) foi adicionado a uma solução de #128 (4.18 g, 6.70 mmol, 1.0 eq.) em
50 mL de diclorometano seguido por piridina (1.61 mL, 20.1 mmol, 3.0 eq.). Reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas.
Reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-70% de acetona em heptanos) produzindo #135 (5.2 g, 98%) como uma espuma branca.
LC- MS (Protocolo Q1): m/z 812.1 [M+Na+] tempo de retenção =1.24 minutos.
[0964] Etapa 2. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carbóxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida(#136). A uma solução agitada de 4M de HCl em dioxano (10 mL, 25 mmol, 3.7 eq.) em 10 mL de dioxano #11 (2.31 g, 8.05 mmol, 1.2 eq.) foi adicionado. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 6 horas. A reação foi concentrada in vacuo produzindo uma goma amarela. Uma solução de #135 (5.3 g, 6.7 mmol, 1.0 eq.) em 30 mL de diclorometano foi adicionada ao resíduo anterior seguido por Base de Hunig (3.5 mL, 20 mmol, 3 eq.).
A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 4 horas. A reação foi diluída com diclorometano antes sendo lavada com a 1% Solução aquosa de HCl e em seguida salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, concentrada in vacuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 20%-50% de acetato de etil em heptanos seguido por 93% de acetato de etil 6.6% de metanol e 0.4% de ácido acético) produzindo #136 (4.87 g, 92%) como um sólido esbranquiçado. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 793.3 [M+H+] tempo de retenção =1.07 minutos.
[0965] Etapa 3. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- (pentafluorofenóxi)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#137). 3,3,3-trifluoropropanoato de pentafluorofenila (1.3 mL, 7.1 mmol, 2.0 eq.) foi adicionado a uma solução de #136 (2.8 g, 3.5 mmol, 1.0 eq.) em 30 mL de diclorometano seguido pela adição de piridina (0.85 mL, 10.6 mM). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi concentrada in vacuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-70% de acetona em heptano) produzindo #137 (3.1 g, 92%) como um pó branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 959.2 [M+H+] tempo de retenção =1.28 minutos.
[0966] Etapa 4. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil- 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida(#138). A uma solução agitada de #137 (493 mg, 0.514 mmol, 1.0 eq.) em 4 mL de DMF, L-fenilalanina (84.9 mg, 0.514 mmol, 1.0 eq) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.27 mL, 1.54 mmol, 3.0 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. Reação foi concentrada in vacuo e resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-100% de acetato de etil em heptano) produzindo #138 (200 mg, 41%) como uma espuma branca. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 940.3 [M+H+] tempo de retenção =1.08 minutos.
[0967] Etapa 5. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N,2-dimetillanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1-oxo-1- (pentafluorofenóxi)-3-fenilpropan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan- 4-il]-N-metil-L-valinamida (#139). A uma solução agitada de #138 (200 mg, 0.213 mmol, 1.0 eq.) em 5 mL de diclorometano, 3,3,3-trifluoropropanoato de pentafluorofenila (126 mg, 0.426 mM, 2.0 eq.) foi adicionado seguido por piridina (0.051 mL, 0.64 mmol, 3.0 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. Reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-100% de acetato de etil em heptanos) produzindo #139 (174 mg, 74%) como um óleo amarelo. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1128 [M+Na+] tempo de retenção =1.23 minutos.
[0968] Etapa 6A. Síntese de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- 1-benzil-2-(metilmino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2- metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#140). To a stirred solution de #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) em 1mL de THF metilmina (1M em THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10 eq.) foi adicionada, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi reduzida, e diluída com dmso, e submetida à purificação (Método J*). As frações foram coletadas e concentradas in vacuo para dar #140 (4.0 mg, 30%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 731.2 [M+H+], tempo de retenção = 0.70 minutos. 1H NMR (400 MHz, metanol-d4), 7.30-7.41 (m), 4.71-4.78 (m), 4.58-4.69 (m), 4.04-4.15 (m), 3.86-3.98 (m), 3.73-3.78 (m), 3.61-3.70 (m), 3.50-3.58 (m), 3.32-
3.47 (m), 3.23-3.26 (m), 3.17-3.22 (m), 3.07-3.15 (m), 2.95-2.98 (m), 2.76-2.91 (m),
2.68-2.75 (m), 2.63-2.66 (m), 2.43-2.51 (m), 2.22-2.28 (m), 1.99-2.11 (m), 1.74-1.96 (m), 1.21-1.31 (m), 1.17-1.20 (m), 0.92-1.10 (m), 0.79-0.89 (m).
[0969] Etapa 6B. Síntese de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- 2-amino-1-benzil-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2- metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#141). Seguindo o mesmo procedimento que #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.), solução de amônia (7M em metanol, 0.026 mL, 0.18 mmol, 10eq.) e purificação (Método J*), #141 (3.0 mg, 20%) foi obtida como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 717.2 [M+H+], tempo de retenção = 0.79 minutos. 1 H NMR (400 MHz, metanol-d4), 7.22-7.30 (m), 7.14-7.21 (m), 4.57-4.4.80 (m), 4.02-
4.17 (m), 3.92-3.98 (m), 3.84-3.91 (m), 3.32-3.74 (m), 3.17-3.27 (m), 3.06-3.14 (m),
2.77-3.05 (m), 2.65 (s), 2.43-2.51 (m), 2.21-2.26 (m), 1.98-2.13 (m), 1.70-1.94 (m),
1.32-1.69 (m), 1.16-1.31 (m), 0.89-1.13 (m), 0.80-0.88 (m).
[0970] Etapa 6C. Síntese de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- 1-benzil-2-oxo-2-(propylamino)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}- 2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#142). Seguindo o mesmo procedimento que #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) n-propilamina (1M em THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10. eq) e purificação (Método J*), #142 (3.0 mg, 20%) foi obtida como um sólido branco. LC- MS (Protocolo Q): m/z 759.2 [M+H+], tempo de retenção = 0.74 minutos. 1H NMR (400 MHz, metanol-d4), 7.15-7.29 (m), 4.71-4.79 (m), 4.52-4.68 (m), 4.04-4.17 (m),
3.87-3.99 (m), 3.73-3.99 (m), 3.73-3.79 (m), 3.50-3.70 (m), 3.34-3.49 (m), 3.06-3.23 (m), 2.79-2.99 (m), 2.44-2.50 (m), 2.28-2.43 (m), 2.22-2.27 (m), 1.75-2.10 (m), 1.34-
1.61 (m), 1.16-1.29 (m), 0.92-1.10 (m), 0.77-0.89 (m).
[0971] Etapa 6D. Síntese de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- 1-benzil-2-(dietilmino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2- metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#143). Seguindo o mesmo procedimento que #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0 eq.) dietilmina (1M em THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10 eq.) e purificação (Método J*), #143 (4.0 mg, 30%) foi obtida como um sólido branco. LC- MS (Protocolo Q): m/z 773.3 [M+H+], tempo de retenção = 0.77 minutos. 1H NMR (400 MHz, metanol-d4), 7.16-7.33 (m), 5.10-5.17 (m), 4.96-5.07 (m), 4.68-4.75 (m),
4.60-4.65 (m), 3.61-4.23 (m), 3.35-3.67 (m), 3.16-3.26 (m), 2.99-3.15 (m), 2.78-2.94 (m), 2.30-2.52 (m), 2.19-2.28 (m), 1.73-2.13 (m), 1.83-1.45 (m), 1.19-1.31 (m), 0.92-
1.18 (m), 0.80-0.89 (m).
[0972] Etapa 6E. Síntese de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- 1-benzil-2-(terc-butylamino)-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético #144. Seguindo o mesmo procedimento que #140 usando #139 (20 mg, 0.018 mmol, 1.0eq.) terc-butilmina (1M em THF, 0.18 mL, 0.18 mmol, 10 eq.) e purificação (Método J*), #144 (3.4 mg, 24%) foi obtida como um sólido branco. LC- MS (Protocolo Q1): m/z 773.3 [M+H+], tempo de retenção = 0.74 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.21 (d), 8.03-7.98 (m), 7.92 (d), 7.81-7.62 (m), 7.46-7.16 (m), 4.83-4.69 (m), 4.68-4.56 (m), 4.21-4.07 (m), 3.92-3.86 (m), 3.83-3.80 (m), 3.74-
3.65 (m), 3.60-3.48 (m), 3.47-3.36 (m), 3.28-3.13 (m), 3.11-3.01 (m), 2.96-2.82 (m),
2.69-2.62 (m), 2.54-2.43 (m), 2.38-2.12 (m), 2.00-1.76 (m), 1.69-1.161 (m), 1.60-1.53 (m), 1.52-0.98 (m), 0.94-0.86 (m).
[0973] Preparação de N,2-dimetillanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#145).
[0974] Etapa 1. Síntese de N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1R,2S)-2-hidróxi-1-metil-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1- il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#145). A uma solução agitada de #137 (300 mg, 0.313 mmol, 1.0 eq.) em 3 mL de DMF, (1S,2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol (54.8 mg, 0.344 mmol, 1.1 eq.) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.164 mL, 0.939 mmol, 3.0 eq). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. 20% de solução de piperidina em DMF (1 mL, 2.2 mmol, 7.0 eq.) foi em seguida adicionada e a reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 2 horas. Purificação (Método J*) seguido por concentração de tubos de teste apropriados produzidos #145 (190 mg, 74%) como um pó branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 704.3 [M+H+], tempo de retenção = 0.67 minutos. 1H NMR (400 MHz, CD3OD), δ 7.97 (d), 7.73 (d), 7.37-7.41 (m), 7.27-7.36 (m), 7.19-7.25 (m), 4.70- 4.75 (m), 4.58-4.63 (m), 4.49-4.54 (m), 4.14-
4.30 (m), 4.04-4.11 (m), 3.87 (dd), 3.63-3.77 (m), 3.51-3.58 (m), 3.46-3.49 (m), 3.38-
3.43 (m), 3.25-3.37 (m), 3.15- 3.23 (m), 3.11- 3.14 (m), 3.01- 3.02 (m), 2.59-2.64 (m),
2.52-2.55 (m), 2.44-2.52 (m), 2.41-2.43 (m), 2.07-2.26 (m), 1.73-2.0 (m), 1.65- 1.73 (m), 1.59- 1.65 (m), 1.51-1.59 (m), 1.32- 1.46 (m), 1.23- 1.26 (m), 1.08-1.21 (m),
0.94- 1.07 (m), 0.83-0.92 (m).
[0975] Preparação de 3-metil-D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi- 1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#146), 3-metil-L-isovalil-N- {(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2- metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida (#147), L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2- metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#148), e D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)- 2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida (#149).
[0976] Etapa 1A. Síntese de 3-metil-D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-
2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#146). Uma solução de #114 (225 mg, 0.356 mmol, 1.0 eq.) em 2 mL de diclorometano foi adicionada a uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-3-metil-D-isovalina (126 mg,
0.356 mmol, 1.0eq.) em 4 mL de diclorometano. Base de Hunig (0.188 mL, 1.07 mmol, 3.0 eq.) foi adicionado seguido por HATU (167 mg, 0.427 mmol, 1.2 eq). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 12 horas. A reação foi concentrada in vacuo e em seguida tomada em acetato de etil antes sendo lavada duas vezes com 1M de HCl e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. O solvente orgânico foi removido em um genevac. THF (4 mL) foi adicionada seguido por dietilmina (2 mL, 19 mmol, 53.4 eq.). A reação foi permitida agitar por ~12 horas. Reação foi concentrada usando um genevac seguido por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de metanol em acetato de etil) produzindo #146 (183 mg, 69%) como um sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 746.4 [M+H+] tempo de retenção =1.37 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6), δ 8.55 (d), 8.26- 8.36 (m), 7.88-8.03 (m), 7.81 (d), 7.41-7.53 (m), 7.13-7.30 (m),
7.01 (s), 4.71-4.79 (m), 4.44-4.70 (m), 3.96-4.04 (m), 3.70-3.80 (m), 3.62-3.69 (m),
3.40-3.61 (m), 2.76-3.35 (m), 2.67-2.71 (m), 2.56-2.58 (m), 2.06-2.46 (m), 1.61-1.90 (m), 1.14-1.54 (m), 0.72-1.12 (m).
[0977] Etapa 1B. Síntese de 3-metil-L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}- 2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#147). Uma solução de #114 (224 mg, 0.354 mmol, 1.0 eq.) em 2 mL de diclorometano foi adicionada a uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-3-metil-L-isovalina (125 mg,
0.354 mmol, 1.0 eq.) em 4 mL de diclorometano. Base de Hunig (0.187 mL, 1.06 mmol, 3.0 eq.) foi adicionado seguido por HATU (167 mg, 0.425 mmol, 1.2 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 12 horas. A reação foi concentrada in vacuo e em seguida tomada em acetato de etil antes sendo lavada duas vezes com 1M de HCl e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. O solvente orgânico foi removido em um genevac. THF (4 mL) foi adicionada seguido dietilmina (2 mL, 19 mmol, 53.7 eq.). A reação foi permitida agitar por ~12 horas. Reação foi concentrada usando um genevac seguido por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de metanol em acetato de etil) produzindo #147 (216 mg, 82%) como um sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 746.6 [M+H+] tempo de retenção =1.29 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6), δ 8.56 (m), 8.31-8.39 (m), 8.50 (d), 8.30 (br d), 7.87-8.01 (m), 7.80 (d), 7.40-7.53 (m), 7.14-7.30 (m), 4.45-4.78 (m), 3.94-4.04 (m), 3.70-3.79 (m), 3.61-3.69 (m), 3.42-
3.59 (m), 2.97-3.37 (m), 2.80-2.92 (m), 2.32-2.49 (m), 2.05-2.30 (m), 1.61-1.89 (m),
1.37-1.56 (m), 1.14-1.135 (m), 0.70-1.11 (m).
[0978] Etapa 1C. Síntese de L-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi- 1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#148). Uma solução de #114 (447 mg, 0.707 mmol, 1.0 eq.) em 2 mL de diclorometano foi adicionada a uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-isovalina (240 mg, 0.707 mmol,
1.0eq.) em 4 mL de diclorometano. Base de Hunig (0.373 mL, 2.12 mmol, 3.0 eq.) foi adicionado seguido por HATU (332 mg, 0.425 mmol, 1.2 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 12 horas. A reação foi concentrada in vacuo e em seguida tomada em acetato de etil antes sendo lavada duas vezes com 1M de HCl e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. O solvente orgânico foi removido em um genevac. THF (4 mL) foi adicionado seguido por dietilmina (2 mL, 19 mmol, 26.9 eq.). A reação foi permitida agitar por ~12 horas. Reação foi concentrada usando um genevac seguido por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de metanol em acetato de etil) produzindo #148 (182 mg, 35%) como um sólido. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 732.3 [M+H+] tempo de retenção =0.71 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.56 (d),
8.46-8.52 (m), 8.30 (d), 8.02-8.15 (m), 7.98 (d), 7.80 (d), 7.40-7.53 (m), 7.15-7.30 (m), 4.70-4.80 (m), 4.44-4.69 (m), 3.96-4.05 (m), 3.70-3.79 (m), 3.62-3.69 (m), 3.41-
3.59 (m), 2.99-3.35 (m), 2.31-2.95 (m), 2.67-2.71 (m), 2.55-2.59 (m), 2.32-2.48 (m),
2.20-2.31 (m), 1.97-2.19 (m), 1.61-1.88 (m), 1.37-1.56 (m), 1.20-1.34 (m), 1.14-1.19 (m), 1.02-1.11 (m), 0.97-1.01 (m), 0.86-0.96 (m), 0.71-0.83 (m).
[0979] Etapa 1D. Síntese de D-isovalil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- benzil-2-metóxi-2-oxoetil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi- 1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#149). Uma solução de #114 (447 mg, 0.707 mmol, 1.0 eq.) em 2 mL de diclorometano foi adicionada a uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-D-isovalina (240 mg, 0.707 mmol, 1.0 eq.) em 4 mL de diclorometano. Base de Hunig (0.373 mL, 2.12 mmol, 3 eq.) foi adicionado seguido por HATU (332 mg, 0.425 mmol, 1.2 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 12 horas. A reação foi concentrada in vacuo e em seguida tomada em acetato de etil antes sendo lavada duas vezes com 1M de HCl e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. O solvente orgânico foi removido em um genevac. THF (4 mL) foi adicionado seguido por dietilmina (2 mL, 19 mmol, 26.9 eq.). A reação foi permitida agitar por ~12 horas. Reação foi concentrada usando um genevac seguido por cromatografia de sílica (Gradiente: 0%-30% de metanol em acetato de etil) produzindo #149 (154 mg, 30%) como um sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 732.0 [M+H+] tempo de retenção =1.24 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.55 (d),
8.38-8.46 (m), 8.29 (d), 8.03-8.14 (m), 7.97 (d), 7.81 (d), 7.40-7.53 (m), 7.14-7.28 (m), 7.02 (s), 4.71-4.79 (m), 4.43-4.69 (m), 3.96-4.05 (m), 3.71-3.80 (m), 3.62-3.70 (m), 3.49-3.60 (m), 3.40-3.48 (m), 3.15-3.34 (m), 3.10-3.14 (m), 3.01-3.09 (m), 2.94-
3.00 (m), 2.83-2.93 (m), 2.65-2.71 (m), 2.55-2.59 (m), 2.32-2.48 (m), 2.04-2.31 (m),
1.61-1.89 (m), 1.37-1.52 (m), 1.21-1.35 (m), 1.15-1.20 (m), 1.02-1.10 (m), 0.75-1.01 (m).
[0980] Preparação de 1,2-dimetil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#151).
[0981] Etapa 1. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolina (#150). Um frasco parr contendo 2- metil-L-prolina (1.0 g, 7.7 mmol, 1.0 eq.), 40 mL de metanol, Formaldeído 37 % em peso em água (2.1 mL, 77 mmol, 10 eq.), e 10 % em peso de paládio sobre carbono (313 mg, 2.94 mmol, 0.38 eq.) foi colocado em um agitador parr e e permitido agitar sob 40 psi de hidrogênio por ~12 horas. Hidrogênio foi removido e a reação foi filtrada através de uma almofada de celite que foi lavada com uma solução de 50% de metanol 50% diclorometano. Resíduo foi concentrada in vacuo rendendo #150 (1.1 g, 100%) como um sólido colorido preto claro esbranquiçado. LC-MS (Protocolo Q): m/z 144.0 [M+H+] tempo de retenção =0.17 minutos.
[0982] Etapa 2. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2- metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#151). A uma mistura agitada de #114 (125 mg, 0.198 mmol, 1.0 eq), #150 (37 mg, 0.26 mmol, 1.3 eq.), e HATU (98 mg, 0.26 mmol, 1.3 eq.) em 5 mL de diclorometano, Base de Hunig (0.14 mL, 0.80 mmol, 4.1 eq.) foi adicionada. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 1 hora. Reação foi concentrada in vacuo. THF (6 mL) foi adicionada ao material bruto. A esta mistura de agitação LiOH (14 mg, 0.59 mmol, 3.0 eq) dissolvido em 2 mL de água foi adicionado. Reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 90 minutos. Reação foi concentrada in vacuo e resíduo foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 5% a 40% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) #151 (147 mg, 69%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 744.3 [M+H+], tempo de retenção = 1.19 minutos; HPLC (Protocola A at 45 °C): m/z 744.4 [M+H+], tempo de retenção = 6.631 minutos (pureza > 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 9.57-9.71 (m),
8.75 (d), 8.42 (d), 8.15 (d), 7.14-7.29 (m), 4.70-4.79 (m), 4.40-4.68 (m), 3.95-4.03 (m), 3.73-3.80 (m), 3.37-3.61 (m), 2.97-3.31 (m), 2.79-2.88 (m), 2.66-2.76 (m), 2.54-
2.58 (m), 2.31-2.43 (m), 1.94-2.29 (m), 1.57-1.91 (m), 1.21-1.52 (m), 0.85-1.10 (m),
0.74-0.82 (m)
[0983] Preparação de 1,2-dimetil-D-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#153).
[0984] Etapa 1. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolina (#152). A um frasco parr contendo 2-metil-D-prolina (432 mg, 3.34 mmol, 1.0 eq.), Formaldeído 37 % em peso em água (1.0 mL, 37 mM, 11 eq.), 3.5 mL de metanol e 1 mL de água, 10 % em peso de paládio sobre carbono (108 mg, 0.304 mmol, 0.304 eq.) foi adicionada. O frasco foi colocado em um agitador parr e permitido agitar sob 30 psi de hidrogênio por ~48 horas. Hidrogênio foi removido e reação foi lavada através de uma almofada de celite, que foi subsequentemente lavada com metanol. Os orgânicos foram concentrados in vacuo e em seguida azeotropados com tolueno fornecendo #152 (517 mg, 100%) como um sólido. 1H NMR (400 MHz, metanol-d4): δ [3.61-3.56 (m, 1H), 3.07-2.96 (m, 1H), 2.68 (br s, 3H), 2.34-2.22 (m, 1H), 2.01-1.88 (m, 1H), 1.87-
1.73 (m, 1H), 1.40 (br s, 3H)].
[0985] Etapa 2. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2- metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida (#153). A uma mistura agitada de #114 (240 mg, 0.379 mmol, 1.0 eq.), #152 (71 mg, 0.49 mmol, 1.3 eq.), e HATU (188 mg, 0.49 mmol, 1.3 eq.) em 10 mL de diclorometano, Base de Hunig (0.27 mL, 4.1 mM, 4.1 eq.) foi adicionada. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 1 hora. Reação foi concentrada in vacuo. THF (6 mL) foi adicionada ao material bruto. A esta mistura de agitação LiOH (36 mg, 1.5 mmol, 4 eq.) dissolvido em 2 mL de água foi adicionada. Reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 1 hora. Reação foi concentrada in vacuo e resíduo foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 5% a 40% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) #153 (220 mg, 78%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q): m/z 744.8 [M+H+], tempo de retenção = 1.16 minutos; HPLC (Protocola A at 45 °C): /z 744.4 [M+H+], tempo de retenção = 6.713 minutos (pureza > 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 9.72-9.85 (m), 8.65 (t),
8.41 (d), 8.14 (d), 7.14-7.28 (m), 4.69-4.79 (m), 4.38-4.53 (m), 3.95-4.04 (m), 3.73-
3.79 (m), 3.37-3.62 (m), 3.13-3.33 (m), 2.95-3.10 (m), 2.79-2.89 (m), 2.67-2.75 (m),
2.00-2.46 (m), 1.61-1.90 (m), 1.22-1.54 (m), 1.02-1.09 (m), 0.95-1.01 (m), 0.85-0.94 (m), 0.75-0.83 (m)
[0986] Preparação de N~2~-[2,2-dimetil-3-(metilmino)propanoil]-N-{(1S,2R)-2- metóxi-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#154).
[0987] Etapa 1. Síntese de N~2~-[2,2-dimetil-3-(metilmino)propanoil]-N-{(1S,2R)-2- metóxi-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#154). A um frasco contendo #50 (100 mg,
0.152 mmol, 1.0 eq.) e 1 mL de diclorometano, ácido 2,2-dimetil-3- (metilmino)propanoico (36 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.080 mL, 0.456 mmol, 3.0 eq.) e HATU (66 mg, 0.17 mmol, 1.1 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi concentrada in vacuo e em seguida tomada em acetato de etil antes sendo lavada duas vezes com 1M de HCl e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. A reação foi concentrada in vacuo. Dioxano (1 ml) foi adicionado seguido por 4M de HCl em dioxano (1.0 mL, 4.0 mmol, 26 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. A reação foi concentrada in vacuo. O material bruto foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 10% a 100% de acetonitrila em água com
0.02% de TFA em cada fase) rendendo #154 (55.8 mg, 41%) como um sólido. LC- MS (Protocolo Q): m/z 771.8 [M+H+]. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.70 (d), 8.45 (d), 7.90-8.15 (m), 7.82 (d), 7.75 (d), 7.55 (dd), 7.40 (dd), 6.90-7.10 (m), 5.10-5.30 (m), 4.45-4.55 (b), 4.30-4.45 (m), 4.20-4.30 (m), 3.75-3.90 (m), 3.50-3.60 (m), 3.15-
3.40 (m), 3.05-3.15 (m), 2.85-3.05 (m), 2.60-2.85 (m), 2.25-2.40 (m), 1.80-2.25 (m),
1.70-1.80 (m), 1.20-1.60 (m), 0.80-1.10 (m), 0.05-0.80 (m).
[0988] Preparação de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-dimetil-3- (metilmino)propanoil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3- metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#155).
[0989] Etapa 1. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[{N-[2,2-dimetil-3- (metilmino)propanoil]-L-valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3- metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#155).
A um frasco contendo #114 (96.2 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) e 1 mL de diclorometano, ácido 2,2-dimetil-3-(metilmino)propanoico (36.1 mg, 0.152 mmol, 1.0 eq.) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.080 mL, 0.456 mmol, 3.0 eq.) e HATU (66 mg, 0.17 mmol, 1.1 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi concentrada in vacuo e em seguida tomada em acetato de etil antes sendo lavada duas vezes com 1M de HCl e uma vez com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e decantada. A reação foi concentrada in vacuo. Dioxano (1 ml) foi adicionado seguido por 4M de HCl em dioxano (1.0 mL, 4.0 mmol, 26 eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por ~12 horas. A reação foi concentrada in vacuo. O material bruto foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 10% a 100% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) rendendo #155 (22.2 mg, 17%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.55 (d), 8.22 (d), 8.15-8.35 (m), 7.90-8.05 (m) 7.10-7.25 (m)
4.70-4.80 (m), 4.55-4.65 (m), 4.45-4.52 (m), 3.93-4.00 (m), 3.72-3.78 (m), 3.60-3.70 (m), 3.50-3.60 (m), 3.40-3.50 (m), 2.80-3.30 (m), 2.45-2.60 (m), 2.00-2.45 (m), 1.60-
1.80 (m), 1.35-1.50 (m), 1.10-1.35 (m).
[0990] Preparação de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil- 4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#158) e N- {(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2- metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L- fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#159)
[0991] Etapa 1. (Síntese de ácido (2S)-1-(terc-butoxicarbonil)-2-metilpiperidina-2- carboxílico (#156) e ácido (2R)-1-(terc-butoxicarbonil)-2-metilpiperidina-2-carboxílico (#157). Ácido 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metilpiperidina-2-carboxílico (500 mg, 2.06 mmol, 1 eq.) foi separado por cromatografia de fluido supercrítico (Coluna: Chiralcel OJ-H, 250 x 21 mm; Eluente: 90:10 dióxido de carbono/etanol; Taxa de Fluxo: 65 g/min; para dar os enanciômeros correspondentes. O primeiro pico de eluição (tempo de retenção = 1.57 minutos) foi isolado para dar #156 como uma goma (140 mg, 28%) (estereoquímica arbitrariamente atribuída como o enanciômero S). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.83-3.90 (m, 1H), 2.93-3.01 (m, 1H), 1.87-1.97 (m, 1H),
1.67-1.77 (m, 3H), 1.48-1.66 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.44 (s, 9H). Rotação óptica: [ ]D25 -21.7° (c 0.40, clorofórmio). O segundo pico de eluição (tempo de retenção =
2.22 minutos) foi isolado para dar #157 como um óleo (255 mg, 51%) (estereoquímica arbitrariamente atribuída como o enanciômero R). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.83-3.90 (m, 1H), 2.93-3.01 (m, 1H), 1.87-1.97 (m, 1H), 1.67-1.77 (m, 3H), 1.48-1.66 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.44 (s, 9H). Rotação óptica: [ ]D25 +30.2°(clorofórmio).
[0992] Etapa 2A. Síntese de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi- 5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#158). A uma solução de #156 (8.3 mg, 0.034 mmol, 1 eq.) em diclorometano (0.3 mL) e N,N-dimetilformamida (0.05 mL), foi adicionada N,N- diisopropiletilmina (0.018 mL, 0.102 mmol, 3 eq.), seguido por HATU (16.1 mg, 0.041 mmol, 1.2 eq.). A reação foi agitada por 15 minutos e #114 (23.4 mg, 0.037 mmol,
1.1 eq.) foi adicionada e agitada à temperatura ambiente por 18 horas. A reação foi diluída com diclorometano (2.5 mL) e 10 % de ácido cítrico (1.5 mL) foi adicionada.
As camadas foram separadas usando um cartucho separador de fase e a camada aquosa extraída com diclorometano (2 X 2.5 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram concentradas in vacuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (4 mL) e ácido trifluoroacético (0.5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, em seguida concentrada in vacuo. Purificação por cromatografia de fase reversa (método M*) rendeu #158 (10.6 mg, 49%). HPLC (Protocolo T): m/z 758.4 [M+H+], tempo de retenção = 2.53 minutos (pureza >99%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.74-8.90 (m), 8.49-8.55(m), 8.24 (d), 8.08-8.12 (m), 7.94-8.01 (m), 7.14-7.26 (m), 4.71-4.77 (m), 4.57-4.68 (m), 4.44-4.55(m), 3.94-
4.0 (m), 3.73-3.78 (m), 3.40-3.72 (m), 3.16-3.32 (m), 2.98-3.16 (m), 2.82-2.92 (m),
2.47-2.56 (m), 2.38-2.44 (m), 2.20-2.37 (m), 2.08-2.19 (m) 1.74-1.88 (m), 1.61-1.73 (m), 1.52-1.59 (m), 1.22-1.52 (m), 1.05 (dd), 0.94-1.00 (m), 0.85-0.93 (m), 0.74-0.79 (m).
[0993] Etapa 2B. Síntese de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi- 5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L- valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#159). A uma solução de #157 (7.8 mg, 0.032 mmol, 1 eq.) em diclorometano (0.3 mL) e N,N-dimetilformamida (0.05 mL), foi adicionada N,N-
diisopropiletilmina (0.017 mL, 0.096 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (14.9 mg, 0.038 mmol, 1.2 eq.). A reação foi agitada por 15 minutos e #114 (22.1 mg, 0.035 mmol,
1.1 eq.) foi adicionada e agitada à temperatura ambiente por 3 horas e em seguida concentrada in vacuo. Purificação do resíduo por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 80% de acetona em heptano) rendeu um sólido branco que foi dissolvido em dioxano (0.2 mL) e 4N de HCl em dioxano (0.2 mL) foi adicionada. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e mais 4N de HCl em dioxano (0.1 mL) foi adicionado. A reação foi agitada por 2 horas à temperatura ambiente, concentrada in vacuo. Purificação por cromatografia de fase reversa (Método M*) rendeu #159 (6.6 mg, 33 %). HPLC (Protocolo T): m/z 758.4 [M+H+], tempo de retenção = 2.46 minutos (pureza = 89%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.86-8.95 (m), 8.75-8.84(m), 8.48-8.54 (m), 8.33-8.45 (m), 8.22-8.27 (m), 8.17-8.19 (m), 7.99-
8.12 (m), 7.83-7.91 (m), 7.13-7.29 (m), 7.04-7.08 (m), 4.69-4.76 (m), 4.55-4.66 (m),
4.45-4.53 (m), 3.96-4.01 (m), 3.41-3.78 (m), 3.28-3.33 (m), 3.24-3.27 (m), 3.16-3.23 (m), 3.11-3.15 (m), 3.02-3.10 (m), 2.93-3.02 (m), 2.91-2.93 (m), 2.84-2.91 (m), 2.76-
2.82 (m), 2.69-2.71(m), 2.60-2.63 (m), 2.53-2.55 (m), 2.47-2.53 (m), 2.40-2.46 (m),
2.30-2.38 (m), 2.20-2.30 (m), 2.06-2.17 (m), 1.75-1.87 (m), 1.52-1.74 (m), 1.35-1.51 (m), 1.14-1.34 (m), 1.01-1.08 (m), 0.92-1.0 (m), 0.85-0.94 (m), 0.74-0.82 (m).
[0994] Preparação de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil- 4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2- metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#162) e N-{(2R,3R)-3- metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2- il]carbonil}-L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético. (#163).
[0995] Etapa 1A. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2S)-1-(terc- butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5- metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil (#160). A uma solução de #156 (106 mg, 0.436 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3 mL) e N,N-dimetilformamida (0.5 mL) foi adicionada diisopropiletilmina (0.228 mL,
1.31 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (205 mg, 0.523 mmol, 1.2 eq.). A reação foi agitada por 15 minutos e #114 (276 mg, 0.436 mmol, 1 eq.) foi adicionada e agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi diluída com diclorometano (10 mL) e lavada com 10% de ácido cítrico (3 X 5 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e o filtrado concentrado in vacuo. Purificação do resíduo por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 to 80% de acetona em heptano) rendeu #160 (145 mg, 39%). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 858.8 [M+H+], tempo de retenção =
1.12 minutos.
[0996] Etapa 1B. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(2R)-1-(terc- butoxicarbonil)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5- metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil (#161). A uma solução de #157 (109 mg, 0.448 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3 mL) e N,N-dimetilformamida (0.5 mL), foi adicionada diisopropiletilmina (0.234 mL,
1.34 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (205 mg, 0.538 mmol, 1.2 eq.). A reação agitada por 15 minutos e #114 (284 mg, 0.448 mmol, 1 eq.) foi adicionada. Após agitação à temperatura ambiente por 2 horas, a mistura foi diluída com diclorometano (10 mL), lavada com 10 % de ácido cítrico (3 X 5 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo. Purificação do resíduo por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 100% de acetona em heptano) rendeu #161 (185 mg, 48%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 858.3 [M+H+], tempo de retenção = 2.25 minutos.
[0997] Etapa 2A. Síntese de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi- 5-metil-4-[metil(N-{[(2S)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L- valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#162). A uma solução de #160 (145 mg, 0.169 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (1.25 mL) foi adicionada hidróxido de lítio (8 mg, 0.338 mmol, 2 eq.) dissolvido em água (0.75 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e evaporado até secura in vacuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (2.5 mL) e ácido trifluoroacético (1 mL) foi adicionado. A reação foi agitada por 30 minutos, concentrada in vacuo e purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 0% a 100% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) para render o composto do título #162 (145 mg, quantitativa) como um sólido branco. HPLC (Protocolo U): m/z 744.5 [M+H+], tempo de retenção =
7.121 minutos (pureza = 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6). δ 8.76-8.96 (m), 8.52-
8.58 (m), 8.38-8.43 (m), 8.11- 8.16 (m), 7.27-7.30 (m), 7.12-7.27 (m), 7.01-7.05 (m),
4.71-4.79 (m), 4.48-4.67 (m), 4.39-4.47 (m), 3.79-4.22 (m), 3.71-3.78 (m), 3.38-3.57 (m), 3.22-3.30 (m), 3.14-3.23 (m), 3.07-3.13 (m), 2.96-3.06 (m), 2.76-2.87 (m), 2.66-
2.68 (m), 2.47-2.57 (m), 2.42-2.44 (m), 2.06-2.40 (m), 1.73-1.89 (m), 1.51-1.72 (m),
1.36-1.49 (m), 1.20-1.35 (m), 1.00-1.09 (m), 0.95-0.99 (m), 0.83-0.94 (m), 0.73-0.80 (m).
[0998] Etapa 2B. Síntese de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi- 5-metil-4-[metil(N-{[(2R)-2-metilpiperidin-2-il]carbonil}-L- valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#163). Composto #161 (185 mg, 0.216 mmol, 1 eq.) foi convertido para o composto do título em bruto #163, usando o procedimento descrito for a preparação de #162. O material bruto foi purificado por cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 0% a 85% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) para render #163 (127 mg, 68%) como um sólido branco. HPLC (Protocol U): m/z 744.5 [M+H+], tempo de retenção = 7.077 minutos (pureza = 98%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6). δ 8.79-8.99 (m), 8.36-8.49 (m), 8.12-8.17 (m),
7.31-7.34 (m), 7.11-7.27 (m), 7.05-7.09 (m), 4.71-4.77 (m), 4.54-4.68 (m), 4.40-4.53 (m), 3.88-4.39 (m), 3.71-3.77 (m), 3.39-3.58 (m), 3.22-3.32 (m), 3.10-3.22 (m), 3.04-
3.09 (m), 2.92-3.03 (m), 2.77-2.88 (m), 2.68-2.71 (m), 2.47-2.57 (m), 2.43-2.45 (m),
2.30-2.42 (m), 2.03-2.29 (m), 1.74-1.88 (m), 1.52-1.73 (m), 1.37-1.51 (m), 1.17-1.37 (m), 1.00-1.07 (m), 0.95-0.99 (m), 0.84-0.93 (m), 0.73-0.81 (m).
[0999] Preparação de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3- fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#172) e N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3- il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2- metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#173).
[01000] Etapa 1. Síntese de (3R)-1-benzil-3-fluoropirrolidina-3-carboxilato de metil (#164) e (3S)-1-benzil-3-fluoropirrolidina-3-carboxilato de metil (#165). (1-benzil-3- fluoropirrolidina-3-carboxilato de metil conhecido (3900 mg, 16.4 mmol, 1 eq.) foi separado por cromatografia de fluido supercrítico (Coluna: Chiralpak IC, 250 x 21 mm; Eluente: 95:5 dióxido de carbono/propanol; Taxa de Fluxo: 65 g/min; para dar os enanciômeros correspondentes. O primeiro pico de eluição (tempo de retenção =
3.37 minutos) foi isolado para render #164 (1720 mg, 36%) como um único enanciômero (estereoquímica arbitrariamente atribuída como Enanciômero R). 1H NMR (400 MHz, TMS-CDCl3; δ 7.17–7.30 (m, 5H), 3.74 (s, 3H), 3.65 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.86–3.03 (m, 3H), 2.61 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 2.34–2.46 (m, 1H), 2.13-2.26 (m, 1H). Rotação óptica: [ ]D25 +24.7° (clorofórmio). O segundo pico de eluição (tempo de retenção = 3.91 minutos) foi isolado para render #165 (1600 mg, 33%) como um único enanciômero (estereoquímica arbitrariamente atribuída como Enanciômero S). 1H NMR (400 MHz, CDCl3; (CH3)4Si), δ 7.17–7.30 (m, 5H), 3.74 (s, 3H), 3.65 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.86–3.03 (m, 3H), 2.61 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 2.34–2.46 (m, 1H), 2.13-2.26 (m, 1H). Rotação óptica: [ ]D25-23.3° (clorofórmio).
[01001] Etapa 2A. Síntese de 3-metil (3R)-3-fluoropirrolidina-1,3-dicarboxilato de 1- terc-butil (#166). A uma solução contendo #164 (355mg, 1.50 mmol, 1 eq.) e carbonato de di-terc-butil (400mg, 1.8 mmol, 1.2 eq.) em metanol (15.5 mL) foi adicionado 10% de Pd/C (70 mg). A reação foi hdrogenada a 45 psi em um agitador parr por 22 horas, filtrada sobre celite, e o filtrado concentrado in vacuo e purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 30% de acetato de etil em heptano) para render #166 como um óleo claro. (272 mg, 74%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ
3.87 (s, 3H), 3.85-3.66 (m, 3H), 3.56 (m, 1H), 2.53-2.28 (m, 2H), 1.51 (s, 9H).
[01002] Etapa 2B. Síntese de 3-metil (3S)-3-fluoropirrolidina-1,3-dicarboxilato de 1- terc-butil (#167). Composto #165 (362mg, 1.53 mmol, 1 eq.) foi convertido para #167 em 63% de rendimento usando o método descrito acima para #164. 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 3.87 (s, 3H), 3.85-3.66 (m, 3H), 3.56 (m, 1H), 2.53-2.28 (m, 2H), 1.51 (s, 9H).
[01003] Etapa 3A. Síntese de ácido (3R)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidina-3- carboxílico (#168). A uma solução de #166 (272mg, 1.10 mmol, 1 eq.) dissolvido em metanol (2.96 mL) foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de sódio (2.5 M,
0.88 mL) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 3.5 horas. A reação foi arrefecida com 10% de ácido cítrico aquoso (5 mL), acetato de etil (100 mL) foi adicionada, e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com 10% de ácido cítrico, água, e salmoura, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo para render #168 como um sólido branco. (253mg, 99%). 1H NMR (400 MHz,
CDCl3), δ 3.96-3.69 (m, 3H), 3.59 (m, 1H), 2.59-2.33 (m, 2H), 1.51 (s, 9H). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 232.1 [M-H+], tempo de retenção = 0.67 minutos. Tempo de retenção de HPLC quiral: 3.39 min (pureza = 99%). (Coluna: Chiralpak AD-H, 4.6mm x 25cm, fase móvel 5-60% CO2/Metanol, Taxa de Fluxo 3.0 mL/min); Rotação óptica: [ ]D25 4.8 (c= 0.52, MeOH)
[01004] Etapa 3B. Síntese de ácido (3S)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidina-3- carboxílico (#169). A uma solução de #167 (238 mg, 0.963 mmol, 1 eq.) dissolvido em metanol (2.6 mL) foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de sódio (2.5 M, 0.88 mL) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi em seguida resfriada bruscamente com 10% de ácido cítrico aquoso (5 mL) e acetato de etil (100 mL) foi adicionada, e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com 10% de ácido cítrico, água, e salmoura, em seguida seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo para render #169 como um sólido branco (221 mg, 99%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 3.96-3.69 (m, 3H), 3.59 (m, 1H), 2.59-2.33 (m, 2H), 1.51 (s, 9H). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 232.1 [M-H+], tempo de retenção = 0.67 minutos. Tempo de retenção de HPLC quiral: 3.95 min (pureza = 98%) (Coluna: Chiralpak AD-H, 4.6mm x 25cm, fase móvel 5-60% CO2/Metanol, Taxa de Fluxo 3.0 mL/min); Rotação óptica: [ ]D25 -3.6 (c= 0.55, MeOH)
[01005] Etapa 4A. Síntese de (3R)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidina-3- carboxilato de lítio (#170). A uma solução de #168 (50 mg, 0.21 mmol, 1 eq.) em metanol (0.2 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (9.2 mg, 0.38 mmol, 1.8 eq.) dissolvido em água (0.1 mL). Depois, tetrahidrofurano (0.3 mL) foi adicionado e a reação foi agitada a 45 °C por 18 horas. A reação foi concentrada in vacuo e o material foi azeotropado (3X) com tolueno (2 mL) para obter #170 (51mg, 100%) como um sólido branco que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.
[01006] Etapa 4B. Síntese de (3S)-1-(terc-butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidina-3- carboxilato de lítio (#171). A uma solução de #169 (75 mg, 0.32 mmol, 1 eq.) em metanol (0.3 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (13.8 mg, 0.572 mmol, 1.8 eq.) em água (0.4 mL). Depois, tetrahidrofurano (0.45 mL) foi adicionada e a reação foi agitada a 45 °C por 18 horas. A reação foi concentrada in vacuo e o material foi azeotropado (3X) com tolueno (4 mL) para obter #171 (77 mg, 100%) como um sólido branco, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.
[01007] Etapa 5A. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3- fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#172). A uma suspensão de #168 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) e #114 (100 mg,
0.158 mmol, 1.0 eq.) em N,N-dimetilformamida (0.8 mL) e diclorometano (3.6 mL) foi adicionada N,N-diisopropiletilmina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1.0 eq.) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas. A reação foi diluída com acetato de etil e foi lavada sucessivamente com água, 10% de ácido cítrico aquoso (W/V), e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada in vacuo para dar 220 mg (164% de teoria) de um intermediário bruto. Auma porção deste intermediário bruto (50 mg, 23%) foi dissolvido em diclorometano (1.5 mL) e ácido trifluroacético (0.4 mL) foi adicionado.
A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e evaporado até secura in vacuo. Purificação por cromatografia de fase reversa (Método M*) rendeu #172 (15.8 mg, 51%) LC-MS (Protocolo Q): m/z 748.9 [M+H+] tempo de retenção = 1.29 minutos. 1H NMR (DMSO-d6)2, 2 9.16-9.43 (m), 8.48-8.53 (m), 8.40-8.44 (m), 8.34-
8.39 (m), 8.22-8.30 (m), 8.09-8.16 (m), 7.87-7.91 (m), 7.77-7.83 (m), 7.12-7.24 (m),
4.56-4.72 (m), 4.41-4.54 (m), 3.92-4.00 (m), 3.70-3.75 (m), 3.39-3.66 (m), 3.20-3.25 (m), 3.12-3.20 (m), 2.97-3.11 (m), 2.94 (br s), 2.75-2.89 (m), 2.63- 2.69 (m), 2.47-
2.54 (m), 2.29- 2.45 (m), 2.15- 2.27 (m), 2.02-2.15 (m), 1.57-1.87 (m), 1.33- 1.51 (m),
1.19-1.30 (m),1.02 (dd), 0.82-0.97 (m), 0.70-0.79 (m).
[01008] Etapa 5B. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3- fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil, sal de ácido trifluoroacético (#173). A uma suspensão de #169 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1eq.) e #114 (100.0 mg,
0.158 mmol, 1 eq.) em N,N-dimetilformamida (0.8 mL) e diclorometano (3.6 mL) foi adicionada N,N-diisopropiletilmina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) foi adicionada, seguido por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1 eq.). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 14 horas, diluída com acetato de etil, e lavada sucessivamente com água, 10% de ácido cítrico aquoso (W/V), e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada in vacuo para dar 180 mg (134% de teoria) de um intermediário bruto. A uma porção deste intermediário bruto (50 mg, 27%) foi dissolvido em diclorometano (1.5 mL) e ácido trifluroacético (0.4 mL) foi adicionada e a mistura agitada à temperatura ambiente por 2 horas e evaporado até secura in vacuo. Purificação por cromatografia de fase reversa (Método M*) rendeu #173 (17.6 mg, 45%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 748.9 [M+H+] tempo de retenção =1.29 minutos. 1H NMR (DMSO-d6)22 9.35-9.50 (m), 9.22-9.34 (m), 8.47-8.52 (m), 8.39-
8.45 (m), 8.30-8.37 (m), 8.22-8.24 (m), 8.09-8.13 (m), 7.80-7.85 (m), 7.67-7.72 (m),
7.09-7.24 (m), 6.97-6.98 (m), 4.65-4.72 (m), 4.55-4.64 (m), 4.41-4.50 (m), 3.92-3.99 (m), 3.42-3.75 (m), 3.32-3.39 (m), 3.25-3.31(m), 3.21-3.24 (m), 3.11-3.20 (m), 3.06-
3.11 (M), 2.97-3.05 (m), 2.95 (br s), 2.83-2.88 (m), 2.76-2.82 (m), 2.65-2.70 (m),
2.44-2.54 (m), 2.15-2.42 (m), 2.02-2.14 (m), 1.57-1.84 (m), 1.33-1.48 (m), 1.19-1.30 (m), 1.02 (dd), 0.92-0.97(m), 0.82-0.91 (m), 0.70-0.77 (m).
[01009] Preparação de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-
metilpiperidina-2-carboxamida, sal de cloridrato (#178) e (2R)-N-[(2S)-1- {[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi- 2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3- metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2-carboxamida, sal de cloridrato (#180).
[01010] Etapa 1. Síntese de (3R,4S,5S)-4-[{N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoato de pentafluorofenila (#174). A uma solução de #@5 (19.43 g, 37.03 mmol, 1 eq.) em diclorometano (100 mL) e piridina (5.86 g, 74.1 mmol, 2 eq.) foi adicionado trifluoroacetato de pentafluorofenila (20.7 g,
74.1 mmol, 2 eq.) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 52% de acetato de etil em heptano) para render #174 (23.58 g, 92%) como um óleo amarelo. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 691.2 [M+H+], tempo de retenção = 1.23 minutos.
[01011] Etapa 2. Síntese de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta- 2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-metil-L-valinamida (#175).
A uma solução de #174 (706 mg, 1.02 mmol, 1 eq.) e #64 (311mg, 1.02 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3 mL) foi adicionada N,N-diisopropiletilmina (400 mg, 3.07 mmol,
3 eq.). Após 18 horas de agitação à temperatura ambiente, a reação foi concentrada in vacuo e purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 100% de acetato de etil em heptano) para render #175 (560 mg, 68%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 611.8 [M+H+], tempo de retenção = 1.15 minutos.
[01012] Etapa 3. Síntese de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta- 2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#176). De acordo com o procedimento geral A, de #175 (560 mg, 0.690 mmol, 1 eq.) em diclorometano (9 mL), e N,N-dietilmina (6.0 mL), foi sintetizado o composto desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 50% de metanol em diclorometano) para render #176 (351 mg, 87%) como um óleo amarelo. LC-MS (Protocolo Q1): m/z
589.5 [M+H+], tempo de retenção = 0.72 minutos.
[01013] Etapa 4A. Síntese de (2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2- metilpiperidina-1-carboxilato de terc-butil (#177). De acordo com o procedimento geral D, de #176 (100 mg, 0.170 mmol, 1 eq.), #156 (53.8 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.), diclorometano (4.5 mL), HATU (84.9 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.) e N,N- diisopropiletilmina (0.123 mL, 0.697 mmol, 4.1 eq.), foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 100% de acetato de etil em heptano) para render #177 (145 mg, assumir rendimento quantitativo) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 814.7 [M+H+], tempo de retenção = 1.14 minutos.
[01014] Etapa 4B. Síntese de (2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2- metilpiperidina-1-carboxilato de terc-butil (#179). De acordo com o procedimento geral D, de #176 (100 mg, 0.170 mmol, 1 eq.), #157 (53.8 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.), diclorometano (4.5 mL), HATU (84.9 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.) e N,N- diisopropiletilmina (0.123 mL, 0.697 mmol, 4.1 eq.), foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 100% de acetato de etil em heptano) para render #179 (155 mg, assumir rendimento quantitativo) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 814.7 [M+H+], tempo de retenção = 1.14 minutos.
[01015] Etapa 5A. Síntese de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2- metilpiperidina-2-carboxamida, sal de cloridrato (#178). De acordo com o procedimento geral C, de #177 (143 mg, 0.176 mmol, 1 eq.) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (2.0 mL) foi sintetizado o material desejado como uma goma (145 mg). Uma porção deste resíduo bruto (25 mg) foi azeotropada com uma mistura de metanol/acetonitrila para render #178 (20 mg, 89% de rendimento) como um sólido branco. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.96-9.07 (m), 8.79-8.96 (m),
8.58 (d), 8.02- 8.08 (m), 7.77-7.83 (m), 7.25-7.31 (m), 7.19-7.24 (m), 6.56-6.67 (m),
6.12-6.21(m), 5.13-5.22 (m), 4.72-4.81 (m), 4.63-4.70 (m), 4.50-4.59 (m), 4.07-4.16 (m), 3.98-4.05 (m), 3.80-3.86 (m), 3.55-3.76 (m), 3.46-3.54 (m), 3.38 -3.44 (m), 3.26-
3.35 (m), 3.18-3.24 (m), 3.05-3.18 (m), 2.98-3.04 (m), 2.40-2.55 (m), 2.27-2.35 (m),
2.08-2.27 (m), 1.74-1.98 (m), 1.50-1.74 (m), 1.20-1.46 (m), 0.73-1.16 (m). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 714.6 [M+H+], tempo de retenção = 0.76 minutos. HPLC (Protocol U): m/z 714.5 [M+H+] tempo de retenção = 7.124 minutos (pureza =91%).
[01016] Etapa 5B. Síntese de (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2- metilpiperidina-2-carboxamida, sal de cloridrato (#180). De acordo com o procedimento geral C, de #179 (162 mg, 0.199 mmol, 1 eq.) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (2.0 mL) foi sintetizado o material desejado como uma goma (155 mg). Uma porção desta goma (25 mg) foi azeotropada com a 1/1 misturae de metanol/acetonitrila para render #180 (20 mg, 83%) como um sólido. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 9.02-9.13 (m), 8.83-8.93 (m), 8.39-8.46 (m), 8.00-8.06 (m), 7.78 (t), 7.24-7.30 (m), 7.16-7.21 (m), 6.54-6.65 (m), 6.09-6.19 (m), 5.11-5.18 (m), 4.69-4.78 (m), 4.59-4.68 (m), 4.46-4.56 (m), 4.08-4.13 (m), 3.95-4.03 (m), 3.77-
3.85 (m), 3.54-3.73 (m), 3.43-3.53 (m), 3.37-3.42 (m), 3.24-3.33 (m), 3.16-3.22 (m),
3.03- 3.15 (m), 2.99-3.02 (m), 2.89-2.98 (m), 2.65-2.76 (m), 2.41-2.54 (m), 2.15-2.39 (m), 2.07-2.15 (m), 1.51-1.94 (m), 1.49 (d), 1.38 (t), 1.20-1.32 (m), 1.02-1.09 (m),
0.84-0.97 (m), 0.73-0.81 (m). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 714.6 [M+H+], tempo de retenção =0.76 HPLC (Protocol U): m/z 714.4 [M+H+], tempo de retenção = 7.409 minutos (pureza =90%).
[01017] Preparação de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido fórmico (#182) e N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N~2~- {[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#184) e N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6- trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#186).
[01018] Etapa 1A. Síntese de 1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#181). De acordo com o procedimento geral D, de #176 (100 mg, 0.170 mmol, 1 eq.), (S)-1-(terc-butoxicarbonil)-2-metil-L-prolina (50.7 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.), diclorometano (4.3 mL), HATU (84.9 mg, 0.221 mmol, 1.3 eq.) e N,N- diisopropiletilmina (0.123 mL, 0.697 mmol, 4.1 eq.), foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0 a 100% de acetato de etil em heptano) para render #181 (142 mg, assumir rendimento quantitativo). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 800.6 [M+H+], tempo de retenção = 1.11 minutos.
[01019] Etapa 1B. Síntese de (3R)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-3- fluoropirrolidina-1-carboxilato de terc-butil (#183). A uma solução de #170 (18.2 mg,
0.076 mmol, 1 eq.) em diclorometano (1.8 mL) e N,N-dimetilformamida (0.3 mL) foi adicionada N,N-diisopropiletilmina (0.040 mL, 0.228 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (29.2 mg, 0.076 mmol, 1 eq.). Após agitação por 10 minutos à temperatura ambiente, #176 (45 mg, 0.076 mmol, 1 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas e aHATU adicional (29 mg, 0.076 mmol, 1 eq.) foi adicionado.
Após 8 horas a reação foi concentrada in vacuo para proporcionar #183 (61.0 mg, quantitativa) que foi tomado na próxima etapa sem purificação adicional. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 826.6 [M+Na+], tempo de retenção = 1.05 minutos.
[01020] Etapa 1C. Síntese de (3S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-3- fluorociclopentanecarboxilato de terc-butil (#185). A uma solução de #171 (24 mg,
0.1 mmol, 1 eq.) em diclorometano (2.35 mL) e N,N-dimetilformamida (0.33 mL) foi adicionada N,N- diisopropiletilmina (0.053 mL, 0.300 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (38.4 mg, 0.100 mmol, 1 eq.). Após agitação à temperatura ambiente por 10 minutos, #176 (58.9 mg, 0.1 mmol, 1 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas e quantidade adicional de HATU (38.4 mg, 0.100 mmol, 1 eq.) e N,N-dimetilformamida (0.2 mL) foi adicionada e agitada por um adicional de 9 horas. A reação foi concentrada in vacuo para dar #185 (80 mg, quantitativa), que foi tomado na próxima etapa sem purificação adicional. LC-MS (Protocolo Q1): m/z
804.6 [M+H+], tempo de retenção = 1.05 minutos.
[01021] Etapa 2A. Síntese de 2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido fórmico (#182).
De acordo com o procedimento geral C, de #181 (136 mg, 0.170 mmol, 1 eq.) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (2 mL) foi sintetizado o material desejado como uma goma (142 mg). Uma porção deste resíduo bruto (20 mg, 14%) foi azeotropada com a 1/1 mistura de metanol/acetonitrila e em seguida purificada por cromatografia de fase reversa (Método O) para obter #182 (10 mg, 57% em duas etapas) como um sólido. HPLC (Protocol U): m/z 700.4 [M+H+], tempo de retenção =
7.106 minutos (pureza > 90%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.25-8.39 (m), 8.20-
8.25 (m), 7.96-7.99 (m), 7.74-7.77 (m), 6.55-6.63 (m), 6.10-6.18 (m), 5.11- 5.18 (m),
4.66-4.72 (m), 4.51-4.61 (m), 4.46-4.50 (m), 3.96-4.01 (m), 3.37-3.86 (m), 3.20-3.36 (m), 3.11-3.19 (m), 3.03-3.11 (m), 2.98-3.03 (m), 2.90-2.96 (m), 2.77-2.79 (m), 2.65-
2.73 (m), 2.57-2.63 (m), 2.47-2.56 (m), 2.36-2.46 (m), 2.26-2.32 (m), 2.14-2.25 (m),
2.03-2.10 (m), 1.92-2.03 (m), 1.72-1.92 (m), 1.64-1.72 (m), 1.60-1.64 (m), 1.50-1.59 (m), 1.39-1.48 (m), 1.23-1.32 (m), 1.18-1.22 (m), 1.12-1.14 (m), 1.01-1.09 (m), 0.83-
1.00 (m), 0.74-0.83 (m), 0.70- 0.74 (m).
[01022] Etapa 2B. Síntese de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta- 2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida sal de ácido trifluoroacético (#184). De acordo com o procedimento geral C, de #183 (61.1 mg, 0.076 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.3 mL), e a 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (0.9 mL) foi sintetizado o material desejado bruto (140 mg).
Uma porção do material bruto (98 mg, 69 %) foi purificada por cromatografia de fase reversa (Método M*) para dar #184 (7.6 mg, 20% em duas etapas). HPLC (Protocolo T): m/z 704.5 [M+H+], tempo de retenção = 2.50 minutos (pureza = 84%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.67-8.71 (m), 8.44-8.48 (m), 8.27-8.33 (m), 8.22-8.27 (m),
7.97-8.03 (m), 7.84-7.89 (m), 7.74-7.81 (m), 7.43-7.48 (m), 7.23-7.29 (m), 7.17-7.21 (m), 6.55-6.66 (m), 6.10-6.19 (m), 5.10-5.19 (m), 4.66-4.75 (m), 4.51-4.63 (m), 3.96-
4.04 (m), 3.78-3.85 (m), 3.65-3.73 (m), 3.46-3.62 (m), 3.37-3.45 (m), 3.24-3.37 (m),
3.21-3.24 (m), 3.13-3.21 (m), 3.02-3.13 (m), 2.95-3.00 (m), 2.80-2.82 (m), 2.66-2.71 (m), 2.47-2.57 (m), 2.24-2.46 (m), 2.09-2.24 (m), 1.95-2.05 (m), 1.49-1.93 (m), 1.22-
1.34 (m), 1.02-1.09 (m), 0.83-1.01 (m), 0.74-0.82 (m).
[01023] Etapa 2C. Síntese de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta- 2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#186). De acordo com o procedimento geral C, de #185
(80.3 mg, 0.1mmol, 1 eq.), diclorometano (0.4 mL), e a 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (1.2 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, em cuja uma porção (94 mg, 53%) foi purificada por cromatografia de fase reversa (Método M*) para dar #186 (11.8 mg, 32% em duas etapas). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ
8.85-9.07 (m), 8.29-8.41(m), 7.99-8.04 (m), 7.76-7.84 (m), 6.56-6.68 (m), 6.12-6.21 (m), 5.12-5.21 (m), 4.87-4.99 (m), 4.69-4.79 (m), 4.49-4.67 (m), 3.98-4.06 (m), 3.80-
3.87 (m), 3.64-3.76 (m), 3.55-3.64 (m), 3.47-3.54 (m), 3.39-3.46 (m), 3.26-3.39 (m),
3.22-3.25 (m), 3.18- 3.22 (m), 3.06-3.14 (m), 2.98-3.01 (m), 2.55- 2.57 (m), 2.42-2.49 (m), 2.11-2.38 (m), 2.09 (s), 1.78-1.97 (m), 1.72-1.77 (m), 1.51-1.71 (m), 1.24-1.36 (m), 1.07 (dd), 0.83-1.03 (m), 0.75- 0.82 (m). HPLC (Protocolo T): m/z 704.5 [M+H+], tempo de retenção = 2.48 minutos (pureza = 100%).
[01024] Preparação de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- 5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2- carboxamida, sal de formiato (#188) e (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)- 2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2-carboxamida, sal de formiato (#190) e N~2~-{[(3R)- 3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#192) e N~2~- {[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#194).
[01025] Etapa 1A. Síntese de (2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidina-1-carboxilato de terc-butil (#187). De acordo com o procedimento geral D, de #86 (280 mg, 0.4 mmol, 1 eq.), #156 (100 mg, 0.4 mmol, 1 eq.), diclorometano (5mL), HATU (182 mg, 0.48 mmol, 1.2 eq.) e N,N-diisopropiletilmina (100 mg, 0.8 mmol, 2 eq.) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0.01 a 0.05% de metanol em diclorometano) para render #187 (220 mg, 62%) como um sólido branco. HPLC (Protocol V): m/z 883.57 [M+H+], tempo de retenção = 3.23 minutos (pureza = 95%).
[01026] Etapa 1B. Síntese de (2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpiperidina-1-carboxilato de terc-butil (#189). De acordo com o procedimento geral D, de #86 (400 mg, 0.6 mmol, 1 eq.), #157 (146 mg, 0.6 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL), HATU (259 mg, 0.72 mmol, 1.2 eq.) e N,N-diisopropiletilmina (158 mg, 1.2 mmol, 2 eq.) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 0.01 to 0.05% de metanol em diclorometano) para render #189 (220 mg, 37%) como um sólido branco.
HPLC (Protocol W): m/z 883.7 [M+H+], tempo de retenção = 4.12 minutos (pureza = 95%).
[01027] Etapa 1C. Síntese de (3R)-3-fluoro-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)- 2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]carbamoil}pirrolidina-1-carboxilato de terc-butil (#191). De acordo com o procedimento geral D, de #86 (300 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), #168 (106 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL), HATU (194 mg, 0.54 mmol, 1.2 eq.) e diisopropiletilmina (117 mg, 0.9 mmol, 2 eq.) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método P) para render #191 (159 mg, 40%) como um sólido branco. HPLC (Protocol X): m/z 873.4 [M+H+], tempo de retenção = 3.32 minutos (pureza = 99%).
[01028] Etapa 1D. Síntese de (3S)-3-fluoro-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)- 2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]carbamoil}pirrolidina-1-carboxilato de terc-butil (#193). De acordo com o procedimento geral D, de #86 (300 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), #169 (106 mg, 0.45 mmol, 1 eq.), diclorometano (10 mL), HATU (194 mg, 0.54 mmol, 1.2 eq.) e diisopropiletilmina (117 mg, 0.9 mmol, 2 eq.) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método P) para render #193 (149 mg, 37%) como um sólido branco. HPLC (Protocol X): m/z 873.4 [M+H+], tempo de retenção = 3.34 minutos (pureza = 98%).
[01029] Etapa 2A. Síntese de (2S)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2-carboxamida, sal de ácido fórmico (#188). De acordo com o procedimento geral C, de #187 (20 mg, 0.023 mmol, 1 eq.),
diclorometano (0.1 mL), acetonitrila (0.1 mL) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (0.26 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método N*) para obter #188 (11.6 mg, 61%,); HPLC (Protocolo T): m/z 783.8[M+H+], tempo de retenção = 2.53 minutos (pureza= 96%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.82-8.87 (m), 8.60-8.63 (m), 8.26-8.29 (m), 7.84-
7.90 (m), 7.75-7.81 (m), 7.60-7.67 (m), 7.21-7.31 (m), 7.14-7.19 (m), 5.49-5.55 (m),
5.37-5.42 (m), 4.69-4.75 (m), 4.59-4.65 (m), 4.50-4.56 (m), 3.95-4.01 (m), 3.77-3.82 (m), 3.54-3.61 (m), 3.47-3.53 (m), 3.24-3.45 (m), 3.14-3.23 (m), 3.03-3.08 (m), 2.96-
3.03 (m), 2.78-2.80 (m), 2.64-2.73 (m), 2.60-2.62 (m), 2.47-2.56 (m), 2.31-2.45 (m),
2.13-2.28 (m), 2.00-2.07 (m), 1.92-1.99 (m), 1.71-1.86 (m), 1.58-1.70 (m), 1.50-1.56 (m), 1.38-1.49 (m), 1.15-1.36 (m), 1.08-1.14 (m), 1.03-1.07 (m), 0.90-1.02 (m), 0.83-
0.90 (m), 0.73-0.80 (m), 0.70-0.73 (m).
[01030] Etapa 2B. Síntese de (2R)-N-[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]-2-metilpiperidina-2-carboxamida, sal de ácido fórmico. (#190). De acordo com o procedimento geral C, de #189 (20 mg, 0.022 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 mL), acetonitrila (0.1 mL) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (0.26 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método N*) para obter #190 (13.2 mg, 73%,) HPLC (Protocolo T): m/z 783.7[M+H+], tempo de retenção = 2.5 minutos (pureza= 100%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 8.83-8.86 (m), 8.60-8.62 (m), 8.24-8.27 (m), 7.83-
7.89 (m), 7.78-7.80 (m), 7.75-7.77 (m), 7.64-7.66 (m), 7.60-7.63 (m), 7.20-7.31 (m),
7.13-7.19 (m), 5.49- 5.55 (m), 5.36-5.42 (m), 4.65-4.74 (m), 4.60-4.65 (m), 4.50-4.56 (m), 3.95-4.01 (m), 3.76-3.81 (m), 3.53-3.62 (m), 3.47-3.52 (m), 3.22-3.45 (m), 3.14-
3.21 (m), 2.97-3.05 (m), 2.93-2.96 (m), 2.79-2.86 (m), 2.76-2.78 (m), 2.65-2.68 (m),
2.48-2.56 (m), 2.37-2.43 (m), 2.29-2.35 (m), 2.17-2.27 (m), 2.04-2.11 (m), 1.93-2.00
(m), 1.70-1.85 (m), 1.53-1.69 (m), 1.36-1.48 (m), 1.28-1.36 (m), 1.13-1.26 (m), 1.08-
1.12 (m), 0.98-1.07 (m), 0.91-0.97 (m), 0.84-0.91 (m), 0.73-0.78 (m).
[01031] Etapa 2C. Síntese de N~2~-{[(3R)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#192). De acordo com o procedimento geral C, de #191 (10 mg, 0.011 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 mL), acetonitrila (0.1 mL) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (0.13 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para obter #192 (5.1mg, 60 %) HPLC (Protocolo T): m/z 773.5[M+H+ ], tempo de retenção = 2.43 minutos (pureza = 100%).1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 29 2 .32-9.44 (m), 9.17-9.21 (m), 8.91 (d), 8.63-8.69 (m), 8.38-8.43 (m), 8.22-8.27 (m),
7.80 (dd), 7.66 (dd), 7.14-7.33 (m), 5.49-5.57 (m), 5.37-5.45 (m), 4.10-4.78 (m), 3.97-
4.06 (m), 3.77-3.83 (m), 3.33-3.65 (m), 3.15-3.29 (m), 2.95-3.09 (m), 2.82-2.83 (m),
2.67-2.71 (m), 2.55-2.57 (m), 2.32-2.54 (m), 2.10-2.31 (m), 2.09 (s), 1.72-1.90(m),
1.57-1.72 (m). 1.38-1.50 (m), 1.15-1.38 (m), 1.09 (dd), 0.85-1.0 (m), 0.75-0.83 (m).
[01032] Etapa 2D. Síntese de N~2~-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#194). De acordo com o procedimento geral C, de #193 (10 mg, 0.011 mmol, 1 eq.), diclorometano (0.1 mL), acetonitrila (0.1 mL) e 4M de solução de ácido clorídrico em dioxano (0.13 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para obter #194 (9 mg, 93%) HPLC (Protocolo T): m/z 773.8 [M+H+], tempo de retenção = 2.42 minutos (pureza = 100%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)  9.39-9.52 (m), 9.21-9.35 (m), 8.90 (d), 8.63-8.69 (m), 8.42-8.48 (m), 8.29 -8.34 (m), 7.80 (dd), 7.66 (dd), 7.22-7.33 (m), 7.13-7.21 (m), 5.47-5.57 (m), 5.36-5.44 (m),
4.43-4.93 (m), 3.97-4.05 (m), 3.64-3.83 (m), 3.32-3.61 (m), 3.15-3.29 (m), 3.06-3.09 (m), 2.95-3.05 (m), 2.89-2.95 (m), 2.82-2.84 (m), 2.67-2.72 (m), 2.54-2.56 (m), 2.48-
2.53 (m), 2.28-2.48 (m), 2.11-2.28 (m), 2.09 (s), 1.57-1.72 (m), 1.38-1.47 (m), 1.15-
1.37 (m), 1.09 (dd), 0.85-0.99 (m), 0.78 (t).
[01033] Preparação de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(2S)-3-(4-aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de formiato (#200) e 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3- (4-aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de formiato (#201).
[01034] Etapa 1. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-terc-butóxi-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#195). De acordo com o procedimento geral D, de #6 (7.75 g, 21.6 mmol, 1 eq.), #152 (3.88 g, 21.6 mmol, 1 eq.), diclorometano (100 mL), HATU (9.8 g, 25.9 mmol, 1.2 eq.), e diisopropiletilmina (11.1 g, 86.4 mmol, 4 eq.) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 20 a 55% de acetato de etil em éter de petróleo) para render #195 (11.1 g, rendimento quantitativo) como um óleo amarelo.
[01035] Etapa 2. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(2R,3S,4S)-1-carbóxi-2-metóxi-4- metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#196). De acordo com o procedimento geral B, de #195 (11.1 g, 21.6 mmol, 1 eq.), diclorometano (100 mL) e ácido trifluoroacético (40 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, para obter #196 (10.1 g, rendimento quantitativo) que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. LC-MS (Protocolo Z): m/z 428.5 [M+H+], tempo de retenção = 0.9 minutos.
[01036] Etapa 3. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-1- oxo-1-(pentafluorofenóxi)heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#197). A uma solução fria (0 °C) de #196 (4.0 g, 9.4 mmol, 1 eq.) em diclorometano (40 mL) foi adicionada gota a gota piridina (2.95 g, 37.6 mmol, 4eq.) seguido por uma solução de trifluoroacetato de pentafluorofenila (3.9 g, 13.6 mmol, 1.4 eq.) em diclorometano (5 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma hora, e o solvente foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 1 a 10% de metanol em diclorometano) para render composto #197 (4.5 g, 81.2% (em três etapas) como um sólido branco.
[01037] Etapa 4. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2- carbóxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#198). A uma solução fria (0 °C) de #197 (4.0 g, 7.4 mmol, 1 eq.) em diclorometano (25 mL) foi adicionada gota a gota diisopropiletilmina (3.4 g, 26.3 mmol, 3.5 eq.) seguido por uma solução #103 (2.3 g,
7.6 mmol, 1.02 eq.) em diclorometano (15 mL). Após a adição, a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 1 a 10% de metanol em diclorometano) seguido por uma segunda purificação por cromatografia de fase reversa (Método Q) para dar #198 (1.57 g, 57.5%) como um sólido branco HPLC (Protocol X): m/z 597.49 [M+H+] tempo de retenção = 8.879 minutos (pureza = 98%).
Tempo de retenção de HPLC quiral: 3.328 min (pureza = 98%) Coluna: Coluna: Chiralcel OJ-H, 250 x 4.6 mm, 5 m; Fase móvel: metanol (0.05% de dietilmina) em CO2 de 5% a 40% durante 15 minutos; Taxa de Fluxo: 2.35 mL/minuto.
[01038] Etapa 5. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-(pentafluorofenóxi)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#199). A uma solução de #198 (280 mg, 0.394 mmol, 1 eq.) em diclorometano (2 mL) foi adicionada piridina (75 mg, 0.94 mmol, 2.4 eq.) seguido por uma solução de trifluoroacetato de pentafluorofenila (268 mg, 0.94 mmol, 2.4 eq.) em diclorometano (1.5 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente for 2.5 horas, e o solvente foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 1 a 10% de metanol em diclorometano) para render composto #199 (279 mg, 39%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 763.5 [M+H+], tempo de retenção = 0.93 minutos.
[01039] Etapa 6A. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2- il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#200). A uma mistura de #199 (25 mg,
0.033 mmol, 1 eq) e #215 ((7.7 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) em diclorometano (1.5 mL), N,N-diisopropiletilmina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada por 5 minutos e N,N-dimetilformamida (0.5 mL) foi adicionada. Após agitação por 2 ½ horas, N,N-diisopropiletilmina adicional (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) foi adicionada. Após 3 ½ horas, mais N,N-dimetilformamida (0.75 mL) foi adicionada e a mistura agitada por 18 horas. N,N-diisopropiletilmina adicional (15.1 mg, 1.15 mmol, 3.6 eq.) e N,N-dimetilformamida (0.25 mL) foram adicionados e reação agitada à temperatura ambiente for 48 horas. A mistura de reação foi concentrada in vacuo e o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para dar #200 (12.9 mg, 48 %). HPLC (Protocolo T): m/z HPLC (Protocolo T): m/z
407.7, carga dupla [2+], tempo de retenção = 1.69 minutos (pureza = 100 %). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 29 2 .72-9.82 (m), 28.61-8.67 (m), 8.42-8.48 (m), 8.19-8.24 (m), 7.25-7.27 (m), 7.12-7.14 (m), 6.94-7.01 (m), 6.88- 6.94 (m), 6.78- 6.84 (m), 6.67-
6.74 (m), 6.57-6.64 (m), 4.69-4.77 (m), 4.60-4.68 (m), 4.53-4.60 (m), 4.46-4.53 (m),
4.37-4.45 (m), 3.97-4.05 (m), 3.76-3.81 (m), 3.62-3.67 (m), 3.53-3.62 (m), 3.44-3.52 (m), 3.32-3.38 (m), 3.27-3.32 (m), 3.22-3.27 (m), 3.15-3.22 (m), 3.06-3.14 (m), 2.97-
3.01 (m), 2.92-2.96 (m), 2.74-2.83 (m), 2.61-2.74 (m), 2.57-2.61 (m), 2.48-2.56 (m),
2.37-2.46 (m), 2.25-2.36 (m), 2.00-2.20 (m), 1.67-1.91 (m), 1.47-1.60 (m), 1.37-1.47 (m), 1.24-1.35 (m), 1.03-1.10 (m), 0.95-1.00 (m), 0.88-0.94 (m), 0.76-0.83 (m).
[01040] Etapa 6B. Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- 3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#201). A uma mistura de #199 (25 mg, 0.033 mmol, 1eq) e 4-amino-L-fenilalaninato (8.8 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) em diclorometano de metil o comercialmente disponível (1.5 mL), N,N-diisopropiletilmina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada por 5 minutos e N,N-dimetilformamida (0.5 mL) foi adicionada. Após 4 horas, N,N-diisopropiletilmina adicional (37.75 mg, 2.88 mmol, 8.25 eq.) foi adicionada e a mistura agitada por 50 minutos. N,N- dimetilformamida adicional (0.75 mL) foi adicionada e a reação foi agitada por 66 horas, concentrada in vacuo e o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para dar #201 (14.3 mg, 56 %); HPLC (Protocolo T): m/z
387.2, carga dupla [2+], tempo de retenção = 1.50 minutos (pureza= 100%).; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 29.68-9.84 (m), 8.57-8.66 (m), 8.46-8.51 (m), 8.23-8.29
(m), 7.18-7.28 (m), 7.11-7.16 (m), 7.03-7.08 (m), 6.97-7.02 (m), 4.67-4.75 (m), 4.58-
4.66 (m), 4.34-4.57 (m), 3.95-4.03 (m), 3.85-3.90 (m), 3.73-3.81 (m), 3.66-3.72 (m),
3.57-3.66 (m), 3.50-3.57 (m), 3.42-3.49 (m), 3.32-3.38 (m), 3.14-3.30 (m), 2.95-3.11 (m), 2.84-2.94 (m), 2.78-2.81 (m), 2.63-2.74 (m), 2.46-2.57 (m), 2.34-2.45 (m), 2.19-
2.34 (m), 1.97-2.19 (m), 1.67-1.90 (m), 1.45-1.62 (m), 1.34-1.41 (m), 1.21-1.34 (m),
1.01-1.10 (m), 0.82-0.99 (m), 0.72-0.81 (m).
[01041] Preparação de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2- il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida, sal de formiato. (#207) e 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil- 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida sal de formiato (#208) e 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#209)
[01042] Etapa 1. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-terc-butóxi-3-metóxi- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#202). De acordo com o procedimento geral D, de #6 (4.3 g, 12 mmol, 1 eq.), #150 (2.15 g, 12 mmol, 1 eq.), diclorometano (50 mL), HATU (5.46 g, 14 mmol, 1.2 eq.), e diisopropiletilmina (8.17 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 20 a 55% de acetato de etil em éter de petróleo) para render #202 (5.2 g, 89 %) como um óleo amarelo.\
[01043] Etapa 2. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(2R,3S,4S)-1-carbóxi-2-metóxi-4- metilhexan-3-il]-N-metil-L-valinamida (#203). De acordo com o procedimento geral B, de #202 (5.2 g, 10.77 mmol, 1 eq.), diclorometano (45 mL), e ácido trifluoroacético (20 mL) foi sintetizado o material desejado bruto, para obter #203 (7 g, rendimento quantitativo) que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.
[01044] Etapa 3. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-5-metil-1- oxo-1-(pentafluorofenóxi)heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#204). A uma solução fria (0 °C) de #203 (7.0 g, 10.77 mmol, 1 eq.) em diclorometano (15 mL) foi adicionada gota a gota piridina (3.41 g 43.08 mmol, 4eq.) seguido por uma solução de trifluoroacetato de pentafluorofenila (6.03 g, 21.54 mmol, 2 eq.) em diclorometano (7 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma hora, e o solvente foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 1 a 10% de metanol em diclorometano) para render composto #204 (8 g, 82% em duas etapas) como um sólido amarelo.
[01045] Etapa 4. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2- carbóxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (#205). A uma solução fria (0 °C) de #204 (8.0 g, 10.77 mmol, 1 eq.) em diclorometano (25 mL) foi adicionada gota a gota diisopropiletilmina(5.6 g, 43.08 mmol, 4 eq.) seguido por uma solução de #103 (3.22 g, 10.77 mmol, 1 eq.) em diclorometano (15 mL). Após a adição, a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 1 a 10% de metanol em diclorometano) para dar #205 (2.2 g, 33 %) como um sólido amarelo HPLC (Protocol X): m/z 597.42 [M+H+], tempo de retenção = 8.729 minutos (pureza > 97%), Tempo de retenção de HPLC quiral: 2.87 min (pureza = 89%) Coluna: Chiralcel OD-3, 150 x 4.6 mm, 3 m; Fase móvel: etanol (0.05% dietilmina) em CO2 de 5% a 40% over 12 minutos; Taxa de Fluxo: 2.5 mL/minuto.
[01046] Etapa 5. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-(pentafluorofenóxi)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#206). A uma solução de #198 (0.28 g, 0.47 mmol, 1 eq.) em diclorometano (2 mL) foi adicionada piridina (75 mg, 0.94 mmol, 2 eq.) seguido por uma solução de trifluoroacetato de pentafluorofenila (268 mg, 0.94 mmol, 2 eq.) em diclorometano (1.5 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente for 2.5 horas, e o solvente foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel (Gradiente: 1 a 10% de metanol em diclorometano) para render composto #206 (348 mg, 97%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 763.5 [M+H+], tempo de retenção = 0.9 minutos.
[01047] Etapa 6A. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propan-2- il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida, sal de ácido trifluoroacético. (#207). O composto do título foi preparado de #206 (25 mg, 0.033 mmol, 1eq.) e #215 (7.7 mg, 0.033 mmol, 1 eq) usando o método descrito acima para preparação de #200. O produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para dar #207 (11.7 mg, 44%). HPLC (Protocolo T): m/z 407.6, carga dupla [2+], tempo de retenção = 1.59 minutos (pureza = 100%). 1H NMR (DMSO-d6) 29.57-9.69 (m), 28.68-8.76 (m), 8.42-8.47 (m),
8.23-8.29 (m), 8.18-8.23 (m), 7.24-7.27 (m), 6.95-7.01 (m), 6.89-6.94 (m), 6.80-6.86 (m), 6.70-6.78 (m), 6.60-6.67 (m), 4.69-4.77 (m), 4.60-4.68 (m), 4.46-4.60 (m), 4.34-
4.46 (m), 3.95-4.03 (m), 3.87-3.91 (m), 3.79-3.85 (m), 3.74-3.79 (m), 3.60-3.66 (m),
3.49-3.60 (m), 3.41-3.49 (m), 3.12-3.35 (m), 3.04-3.12 (m), 2.89-3.04 (m), 2.68-2.83 (m), 2.61-2.67 (m), 2.45-2.55 (m), 2.34-2.44 (m), 2.08-2.33 (m), 2.05-2.08 (m), 1.92-
2.05 (m), 1.75-1.91 (m), 1.65-1.75 (m), 1.59-1.64 (m), 1.34-1.58 (m), 1.20-1.31 (m),
1.01-1.09 (m), 0.94-0.99 (m), 0.84-0.93 (m), 0.80-0.83 (m), 0.72-0.80 (m).
[01048] Etapa 6B. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(2S)-3-(4-aminofenil)-1-metóxi-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#208). A uma mistura de #206 (25.0 mg, 0.033 mmol, 1 eq.), e o 4-amino-L-fenilalaninato de metil comercialmente disponível (8.8 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) em diclorometano (1.5 mL),N,N-diisopropiletilmina (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada por 5 minutos e N,N-dimetilformamida (0.5 mL) foi adicionada. Após 2 ½ horas, N,N-diisopropiletilmina adicional (30.2 mg, 2.31 mmol, 7 eq.) foi adicionada. Após agitação por 3 1/2 horas, N,N-dimetilformamida adicional (0.75 mL) foi adicionada e A reação foi agitada por 66 horas, concentrada in vacuo e o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método
M*) para dar #208 (13 mg, 51 %); HPLC (Protocolo T): m/z 387.2, carga dupla [2+], tempo de retenção = 1.58 minutos (pureza= 100%).; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 29.54-9.69 (m), 8.68-8.75 (m), 8.46-8.50 (m), 8.33-8.37 (m), 8.22-8.31 (m), 8.09-8.14 (m), 7.17-7.27 (m), 7.07-7.16 (m), 6.99-7.05 (m), 6.92-6.99 (m), 4.69-4.75 (m), 4.60-
4.68 (m), 4.42-4.59 (m), 4.34-4.42 (m), 3.95-4.03 (m), 3.85-3.90 (m), 3.74-3.80 (m),
3.65-3.72 (m), 3.62-3.65 (m), 3.42-3.62 (m), 3.31-3.36 (m), 3.24-3.30 (m), 3.11-3.24 (m), 3.03-3.11 (m), 2.96-3.03 (m), 2.81-2.92 (m), 2.65-2.76 (m), 2.43-2.55 (m), 2.34-
2.43 (m), 2.06-2.33 (m), 1.93-2.05 (m), 1.75-1.89 (m), 1.66-1.74 (m), 1.58-1.65 (m),
1.47-1.57 (m), 1.34-1.43 (m), 1.20-1.32 (m), 1.10-1.14 (m), 1.00-1.09 (m), 0.83-0.99 (m), 0.72-0.81 (m).
[01049] Etapa 6C. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (#209). O composto do título foi preparado de #206 (25.0 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) e cloridrato de metil-L-fenilalaninato (7.1 mg, 0.033 mmol, 1 eq.) usando o método descrito acima para preparação de #200. O produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para dar #209 (10.3 mg, 41%). HPLC (Protocolo T): m/z 758.7 [M+H+], tempo de retenção = 1.787 minutos (pureza= 100%).1H NMR (DMSO-d6) 29.57-9.70 (m), 8.70-8.75 (m), 8.50-8.56 (m), 8.32-8.42 (m), 8.24-8.26 (m), 8.10-8.15 (m), 7.14-7.27 (m), 7.12-7.13 (m), 6.98-7.00 (m), 4.69-
4.77 (m), 4.55-4.67 (m), 4.43-4.53 (m), 3.94-4.02 (m), 3.73-3.78 (m), 3.62-3.68 (m),
3.48-3.60 (m), 3.39-3.48 (m), 3.23-3.33 (m), 3.13-3.22 (m), 3.08-3.13 (m), 3.02-3.08 (m), 2.96-3.01 (m), 2.81-2.94 (m), 2.76-2.80 (m), 2.66-2.75 (m), 2.62-2.66 (m), 2.46-
2.55 (m), 2.31-2.45 (m), 2.09-2.29 (m), 2.05-2.09 (m), 1.93-2.04 (m), 1.74-1.88 (m),
1.65-1.74 (m), 1.59-1.65 (m), 1.36-1.52 (m), 1.21-1.35 (m), 1.01-1.08 (m), 0.94-1.00 (m), 0.83-0.94 (m), 0.73-0.81 (m).
[01050] Preparação de (2S)-2-amino-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)propanoato de metil
[01051] Etapa 1. Síntese de 6-(bromometil)quinolina (#210). Uma solução de 6- metilquinolina (5 g, 35 mmol, 1 eq.), N-Bromossuccinimida (8.1 g, 45.5 mmol, 1.3 eq.) e peróxido de benzila (840 mg, 3.5mmol, 0.1 eq.) em tetracloreto de carbono (100 mL) foi agitada a refluxo por 3 horas e em seguida esfriada para a temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi dissolvido em tetrahidrofurano (100 mL) e filtrado. O filtrado foi diretamente usado na próxima etapa sem purificação adicional
[01052] Etapa 2. Síntese de 6-{[(2S,5R)-3,6-dimetóxi-5-(propan-2-il)-2,5- dihidropirazin-2-il]metil}quinolina (#211). A uma solução fria (-70 °C) de (2R)-3,6- dimetóxi-2-(propan-2-il)-2,5-dihidropirazina (25.8 g, 140 mmol, 2 eq.) em tetrahidrofurano (200 mL) foi adicionada gota a gota n-butillítio (2.5 M, 64.4 mL, 161 mmol. 2.3eq.) e em seguida agitada por 30 minutos. Uma solução de #210 (15.4 g, 70 mmol, 1 eq.) em tetrahidrofurano (150 mL) foi adicionada gota a gota a -65°C e em seguida a solução foi agitada por 2 horas nesta temperatura. A reação foi arrefecida por cloreto de amônio aquoso saturado (100 mL) e extraída com acetato de etil (100 mL). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de sílica (Gradiente: 10 a
16% de acetato de etil em éter de petróleo) para render #211 (7.3g, 32%, em duas etapas) como um sólido amarelo. LC-MS (Protocolo Z): m/z 326.2[M+H+], tempo de retenção = 0.88 minutos.
[01053] Etapa 3. Síntese de (2S)-2-amino-3-(quinolin-6-il)propanoato de metil(#212).
A uma solução de #211 (7.3 g, 22.5 mmol, 1 eq.) em água (25 mL) e acetonitrila (80 mL) foi adicionado ácido trifluoroacético (9 mL) a 0 °C e a solução foi agitada a 10°C durante a noite. A camada orgânica foi removida in vacuo e a camada aquosa restante foi basificada para pH 9 com carbonato de sódio, que foi diretamente usado para a próxima etapa.
[01054] Etapa 4. Síntese de (2S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-(quinolin-6- il)propanoato de metil (#213). A uma solução #212 (5.2 g, 22.5 mmol, 1 eq.) e trietilmina (9.1 g, 90 mmol, 4eq.) em solvente misturado de metanol (30 mL) e água (50 mL) foi adicionado dicarbonato de di-terc-butil (17.5 g, 78.75 mmol, 3.5 eq.) a 0 °C e em seguida a solução foi agitada a 10 °C durante a noite. A mistura de reação foi filtrada e a torta do filtro foi lavada com metanol (20 mL X 2). O filtrado foi extraído com acetato de etil (50 mL X 2) e a fase orgânica foi concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de sílica (Gradiente: 25 a 50% de acetato de etil em éter de petróleo) para render #213 (5.5 g, 74% em duas etapas) como um óleo amarelo. LC-MS (Protocolo Z): m/z 331.2[M+H+], tempo de retenção =
0.76 minutos.
[01055] Etapa 5. Síntese de (2S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-(1,2,3,4- tetrahidroquinolin-6-il)propanoato de metil (#214) Uma suspensão de #213 (1.5 g,
4.55 mmol, 1 eq.) e paládio sobre carbono (150 mg) em etanol (20 mL) foi agitada a 50 °C sob 30 psi de hidrogênio durante a noite. A mistura de reação foi filtrada através de uma almofada de celite e o filtrado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de sílica (Gradiente: 40% de acetato de etil em éter de petróleo) para render #214 (1.2 g, 80%) como um óleo. 1H NMR (400
MHz, CDCl3): δ 6.70 (d, 2H), 6.40 (m, 1H), 4.95 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 3.77 (s, 3H),
3.28 (m, 2H), 2.97 (m, 2H), 2.71 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.26 (s, 9H), HPLC (Protocolo Y): m/z 357.0 [M+Na+] tempo de retenção = 5.304 minutos (pureza >98%). Tempo de retenção de HPLC quiral: 4.64 min (pureza = 98%)(Coluna: Chiralcel OJ-H, 150 x
4.6 mm, 5 m; Fase móvel: etanol (0.05% de dietilmina) em CO2 de 5% a 40% over minutos; Taxa de Fluxo: 2.5 mL/minuto.
[01056] Etapa 6. Síntese de (2S)-2-amino-3-(1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6- il)propanoato de metil (#215). A uma solução de #214 (750 mg, 2.25 mmol, 1 eq.) em diclorometano (20 mL) foi adicionado gota a gota ácido trifluoracético (2 mL) a 0 °C e em seguida a solução foi agitada a 20 °C durante a noite. A mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi dissolvido em água (20 mL). A solução foi basificada com carbonato de sódio e extraída com acetato de etil/tetrahidrofurano (30 mL X 3). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada in vacuo para render #215 (450 mg, 85%) como um óleo amarelo. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.70 (d, 2H), 6.40 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.67 (m, 1H), 3.30 (m, 2H), 2.96 (m, 1H),
2.75 (m, 3H), 1.96 (m, 2H), 1.50 (br, 2H), 1.26 (br, 1H)., HPLC (Protocolo Y): m/z
235.14 [M+H+] tempo de retenção = 4.35 minutos (pureza > 96%). Tempo de retenção de HPLC quiral: 5.71 min (pureza = 98%). (Coluna: Chiralcel OJ-H, 150 x
4.6 mm, 5 m; Fase móvel: etanol (0.05% de dietilmina) em CO2 de 5% a 40% over 15 minutos; Taxa de Fluxo: 2.5 mL/minuto.
[01057] Preparação de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3- fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#217) e N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L- valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}- L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#219).
[01058] Etapa 1A. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-1-(terc- butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5- metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil (#216). A uma solução de #168 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) e #114 (100 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3.6 mL) e N,N-dimetilformamida (0.8 mL), foi adicionada diisopropiletilmina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 18 horas, diluída com acetato de etil (25 mL), lavada com água (1X), 10% de ácido cítrico (1X) e salmoura (1X). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada, e o filtrado concentrado in vacuo para dar #216 bruto (220 mg, 164% de teoria) que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. HPLC (Protocolo Q): m/z 848.6 [M+H+], tempo de retenção = 2.10 minutos.
[01059] Etapa 1B. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-1-(terc- butoxicarbonil)-3-fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5- metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalaninato de metil (#218). A uma solução de #169 (36.9 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) e #114 (100 mg, 0.158 mmol, 1 eq.) em diclorometano (3.6 mL) e N,N-dimetilformamida (0.8 mL), foi adicionada diisopropiletilmina (0.083 mL, 0.474 mmol, 3 eq.) seguido por HATU (60.7 mg, 0.158 mmol, 1eq.). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 18 horas, diluída com acetato de etil (25 mL), lavada com água (1 X), 10% de ácido cítrico (1X) e salmoura (1X). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio,
filtrada, e o filtrado concentrado in vacuo para proporcionar #218 brut (180 mg, 134% de teoria) que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. HPLC (Protocolo Q): m/z 848.6 [M+H+], tempo de retenção = 2.10 minutos.
[01060] Etapa 2A. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3R)-3- fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#217). A uma solução de crude #216 (134 mg) em tetrahidrofurano (4 mL) foi adicionada hidróxido de lítio (1M, 0.5 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas e concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (2 mL) e ácido trifluoroacético (2 mL) foi adicionada. A reação foi agitada por 4 horas e concentrada in vacuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para obter #217 (60 mg, 86% em duas etapas) como uma goma. LC-MS (Protocolo Q): m/z 734.93 [M+H+], tempo de retenção = 1.19 minutos. 1 H NMR (DMSO-d6) 212.62-12.83 (m), 9.30-9.43 (m), 9.17-9.28 (m), 8.34-8.41 (m),
8.22-8.31 (m), 8.08-8.15 (m), 7.87-7.93 (m), 7.76-7.81 (m), 7.11-7.23 (m), 4.93-4.99 (m), 4.81-4.88 (m), 4.55-4.71 (m), 4.48-4.54 (m), 4.37-4.45 (m), 3.92-3.99 (m), 3.69-
3.75 (m), 3.31-3.65 (m), 3.25-3.30 (m), 3.20-3.24 (m), 3.12-3.19 (m), 3.08-3.10 (m),
2.97-3.07 (m), 2.92-2.97 (m), 2.75-2.84 (m), 2.64-2.70 (m), 2.43-2.57 (m), 2.28-2.43 (m), 2.15-2.26 (m), 2.02-2.15 (m), 1.56-1.87 (m), 1.31-1.48 (m), 1.05-1.30 (m), 0.97-
1.06 (m), 0.82-0.97 (m), 0.71-0.79 (m).
[01061] Etapa 2B. Síntese de N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(N-{[(3S)-3- fluoropirrolidin-3-il]carbonil}-L-valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin- 2-il]-3-metóxi-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina, sal de ácido trifluoroacético (#219). A uma solução de #218 bruto (100 mg) em tetrahidrofurano (4 mL) foi adicionada 1.0 M hidróxido de lítio em água (0.5 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas e em seguida concentrada in vacuo. O material bruto foi dissolvido em diclorometano (2 mL) e ácido trifluoroacético (2 mL) foi adicionado. A reação foi agitada por 4 horas e em seguida concentrada in vacuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (Método M*) para obter #219 como uma goma (60 mg, 91% em duas etapas). LC-MS (Protocolo Q): m/z 734.97 [M+H+], tempo de retenção = 1.14 minutos. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 12.62-12.85 (m), 9.32-9.43 (m), 9.13-9.26 (m), 8.39-8.46 (m), 8.30-8.39 (m), 8.25-8.29 (m), 8.08-
8.13 (m), 7.79-7.85 (m), 7.67-7.72 (m), 7.10-7.23 (m), 4.94-5.01 (m), 4.83-4.89 (m),
4.64-4.73 (m), 4.56-4.63 (m), 4.44-4.50 (m), 4.37-4.44 (m), 3.92-3.99 (m), 3.60-3.74 (m), 3.24-3.55 (m), 3.11-3.24 (m), 3.07-3.10 (m), 3.02-3.06 (m), 2.98-3.02 (m), 2.93-
2.97 (m), 2.75-2.85 (m), 2.68-2.69 (m), 2.63-2.67 (m), 2.45-2.55 (m), 2.26 -2.44 (m),
2.15-2.25 (m), 2.03-2.14 (m), 1.55-1.87 (m), 1.31-1.47 (m), 1.15-1.31 (m), 0.98-1.05 (m), 0.91-0.98 (m), 0.82-0.91 (m), 0.71-0.78 (m).
[01062] Preparação de 2-metillanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-benzil-4- metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]-5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12- triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L- valinamida (#257).
[01063] Etapa 1. Síntese de [(2S)-1-({2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etil}amino)-1-oxo- 3-fenilpropan-2-il]carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetil (#253). Seguindo o procedimento geral D usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-fenilalanina (500 mg, 1.29 mmol, 1.0 eq), terc-butil (2-aminoetil)carbamato (207 mg, 1.29 mmol, 1.0 eq.), HATU (620 mg, 1.55 mmol, 1.2 eq.) e Base de Hunig (0.452 mL, 2.58 mmol, 2.0 eq) em 6 mL de DMF #253 foi proporcionado como um sólido branco (620 mg, 91%) seguindo concentração do solvente e re-cristalização usando acetato de etil. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 552.3 [M+Na+], tempo de retenção = 1.01 minutos.
[01064] Etapa 2. Síntese de N-alpha-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N-[2-({6- [(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]hexanoil}amino)etil]-L-fenilalaninamida (#254).
Proteção Boc foi removida usando procedimento geral C usando #251 (88 mg, 0.17 mmol, 1.0 eq.) e 4M de HCl (2.0 mL, 8.0 mmol, 48 eq.) seguido por concentração in vacuo. Reação de acoplamento foi em seguida realizada seguindo o procedimento geral D usando resíduo bruto, ácido 6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4- il]hexanoico (35.6 mg, 0.166 mmol, 1.0 eq.), HATU (73.2 mg, 0.18 mmol, 1.1 eq.), e Base de Hunig (0.087 mL, 0.50 mmol, 3.0 eq.) em 2 mL de DMF seguido por purificação (Método J) rendendo #254 (35 mg, 34%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 626.3 [M+H+], tempo de retenção = 0.86 minutos.
[01065] Etapa 3. Síntese de N-[2-({6-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4- il]hexanoil}amino)etil]-L-fenilalaninamida (#255). Seguindo o procedimento geral A usando #254 (35 mg, 0.056 mmol, 1.0 eq.), piperidina (0.10 mL, 1.0 mmol, 20 eq.) em 0.5 mL de DMF seguido por purificação usando cromatografia de sílica (0-30% de metanol em diclorometano) fornece #253 (19 mg, 84%). LC-MS (Protocolo Q1): m/z 404.2 [M+H+], tempo de retenção = 0.48 minutos.
[01066] Etapa 4. Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metillanil-N- {(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7-benzil-4-metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2- oxoimidazolidin-4-il]-5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12-triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida (#256). Seguindo o procedimento geral D usando #105 (36.6 mg, 0.047 mmol, 1.0 eq.), #255 (19 mg,
0.047 mmol, 1.0 eq.), HATU (22.4 mg, 0.056 mmol, 1.2 eq.) e Base de Hunig (0.025 mL, 0.141 mmol) em 1.5 mL de DMF seguindo por purificação (Método J) rendeu #256 (15 mg, 27%) como um sólido branco. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1164.8 [M+H+], tempo de retenção = 0.99 minutos.
[01067] Etapa 5. Síntese de 2-metillanil-N-{(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S)-7- benzil-4-metil-18-[(4S,5R)-5-metil-2-oxoimidazolidin-4-il]-5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12- triazaoctadecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L- valinamida (#257). Seguindo o procedimento geral A usando #256 (5mg, 0.004 mmol, 1.0 eq.) e piperidina (0.02 mL, 0.2 mmol, 50 eq.) em 0.7 mL de DMF seguido por purificação (Método J) rendeu #257 (2 mg, 50%) como um vidro incolor. LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1164.8 [M+H+], tempo de retenção = 0.99 minutos. 1H NMR (400
MHz, DMSO-d6), δ 8.44-8.52 (m), 8.06-8.20 (m), 7.96-8.01 (m), 7.69-7.83 (m), 7.20-
7.28 (m), 7.11-7.19 (m), 3.38-3.83 (m), 3.19-3.26 (m), 3.03-3.12 (m), 2.98 (s), 2.91 (s), 2.75 (s), 2.65-2.70 (m), 2.01-2.36 (m), 1.65-1.87 (m), 1.39-1.57 (m), 1.13-1.37 (m), 1.04-1.08 (m), 0.74-1.01 (m).
[01068] Preparação de N-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-yl)pentanoil]-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (mv#115).
[01069] Etapa 1. Preparação de N-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-yl)pentanoil]- N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (mv#115). A uma solução agitada de ácido 5-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-il)pentanoico (12 mg, 0.061 mM) em 0.4 mL de diclorometano, e
0.1 mL de DMF, HATU (23.2 mg, 0.061 mM) foi adicionado seguido por Base de Hunig (0.033 mL, 0.188 mM). A reação foi permitida agitar por 5 minutos antes #115 (39 mg, 0.047 mM) foi adicionada como uma solução em 0.4 mL de diclorometano, e
0.1 mL de DMF. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 3 horas e minutos antes sendo resfriada bruscamente através da adição de água contendo uma pequena quantidade de TFA. Reação foi em seguida reduzida. Material bruto foi dissolvido com DMSO e purificado por cromatografia de fase reversa (Método J).
As frações apropriadas foram concentradas em seguida (Genevac). Material foi em seguida purificado adicionalmente por cromatografia de fase reversa (Método K) com as frações apropriadas sendo concentradas (Genevac). Material foi em seguida transferido para um frasco pequeno usando diclorometano e metanol antes sendo reduzido (Genevac) para render mv#115 (1.4 mg, 3.3%) mitura de óleo /sólido. HPLC (Protocola A a 45 °C): m/z 897.5 [M+H+], tempo de retenção = 9.149 minutos (pureza > 97%).
[01070] Preparação de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (mc#115)
[01071] Etapa 1. Síntese de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil chloride (#248). A uma solução agitada de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-yl)hexanoic acid (3.15 g, 14.9 mM) em 15 mL de diclorometano, oxalyl chloride (1.61 mL, 17.9 mM) foi adicionado seguido por one drop de DMF. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por três horas. A reação foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em a one to one solution de heptano e diclorometano e em seguida concentrada in vacuo. This process foi repeated two more times produzindo a solid
#248 (3.43 g, 100%).. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [7.02 (s, 2H), 3.43 (m, 2H),
2.53 (m, 1H), CH2.18 (m, 1H), 1.54 (m, 4H), 1.26 (m, 2H).]
[01072] Etapa 2. Síntese de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N,2- dimetillanine (#249). A uma solução agitada de #248 (600 mg, 2.61 mM) em 10 mL de diclorometano, N,2-dimetillanine (306 mg, 2.61 mM) foi adicionado seguido por trietilmina (1.09 mL, 7.84 mM). A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por três horas. Diclorometano foi adicionada à reação e a camada orgânica foi lavada três vezes com água e duas vezes com salmoura. A camada orgânica foi separada e em seguida seca sobre sulfato de sódio antes sendo concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de sílica (0-30% de metanol em diclorometano) sobre sílica que foi previamente neutralizada com trietilmina rendendo um sólido branco #249 (127 mg, 16%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 309.0 [M-H-], tempo de retenção = 0.96 minutos.
[01073] Etapa 3. Síntese de N-{(2R,3R)-3-metóxi-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-5- metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoil}pirrolidin-2-il]-2-metilpropanoil}-L-fenilalanina (#250). A uma solução agitada de #113 (2.10 g, 2.46 mM) em 10 mL de THF, hidróxido de lítio (228 mg, 5.16 mM) foi adicionado seguido por 3 mL de água. A reação foi permitida agitar à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi acidificada através da adição de 1 M de HCl e em seguida concentrada in vacuo. O sólido branco resultante foi tomado em 20 mL de acetonitrila e 5 mL de água. A camada aquosa removida e a camada orgânica foi lavada uma vez com água. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo.
Acetato de etil (20 mL) foi em seguida adicionado e o sólido bruto foi permitido agitar por 30 minutos, antes sendo filtrada para render um sólido branco #250 (1.42 g, 94%). LC-MS (Protocolo Q): m/z 619.5 [M+H+], tempo de retenção = 1.10 minutos. HPLC (Protocola A at 45 °C) m/z 619.4 [M+H+], tempo de retenção = 6.732 minutos.
[01074] Etapa 4. Síntese de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N,2-
dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (mc#115). A uma solução agitada de #249 (382 mg, 1.23 mM) em mL de diclorometano, HATU (482 mg, 1.23 mM) foi adicionado seguido por trietilmina (0.52 mL, 1.23 mM). A reação foi permitida agitar por 1 hora à temperatura ambiente seguido pela adição de #250 (762 mg, 1.23 mM). A reação foi permitida agitar por 3 horas. Reação foi concentrada in vacuo. Reverse phase purificação (MétodoL) seguido por liofilização rendeu um sólido branco mc#120 (124 mg, 11%). HPLC (Protocola A at 45 °C;) m/z 911.5 [M+H+], tempo de retenção = 9.676 minutos.
[01075] Preparação de N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-yl)butanoil]-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (mb#115).
[01076] Etapa 1. Síntese de N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-yl)butanoil]-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (mb#115). Uma solução agitada de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)butanoico (1.2 equivalentes), HATU (1.2 equivalentes), e Base de Hunig (3 equivalentes) em DMF e diclorometano é permitido agitar por 30 minutos.
Composto #115 (1 equivalente) é em seguida adicionado como uma solução em diclorometano e DMF. Reação é monitorada por LC-MS. Reação é concentrada e purificação é completada por pressão em meio Isco cromatografia de fase reversa (Gradiente: 5%-100% água em acetonitrila).
[01077] Preparação de N-[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)heptanoil]-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (me#115).
[01078] Etapa 1. Síntese de N-[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)heptanoil]-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (me#115). Uma solução agitada de ácido 7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)heptanoico (1.2 equivalentes), HATU (1.2 equivalentes), e Base de Hunig (3 equivalentes) em DMF e diclorometano é permitida agitar por 30 minutos.
Composto #115 (1 equivalente) é em seguida adicionado como uma solução em diclorometano e DMF. Reação é monitorada por LC-MS. Reação é concentrada e purificação é completada por pressão em meio Isco cromatografia de fase reversa (Gradiente: 5%-100% água em acetonitrila).
[01079] Preparação de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil- N~5~-carbamoil-N-(4-{(8S,11S,12R)-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-8-isopropil- 4,5,5,10-tetrametil-11-[(1S)-1-metilpropil]-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il}fenil)-L-ornitinamida (mcValCitPABC#115).
[01080] Etapa 1. Síntese de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L- valil-N~5~-carbamoil-N-(4-{(8S,11S,12R)-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-8-isopropil- 4,5,5,10-tetrametil-11-[(1S)-1-metilpropil]-3,6,9-trioxo-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il}fenil)-L-ornitinamida (mcValCitPABC#115). Uma solução de mcCValCitPABC (Linker # D, 1 equivalente) e #115 (1 equivalente) em DMF é preparada. Base de Hunig (4 equivalentes), 2,6-Luditina (4 equivalentes), e HOAT (0.2 equivalentes) é adicionada. Reação é monitorada por LC-MS. Reação é concentrada e purificação é completada por pressão em meio Isco cromatografia de fase reversa (Gradiente: 5%-100% água em acetonitrila).
[01081] Preparação de N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxahenicosan-1-oil)-N,2- dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N- metil-L-valinamida (AmPeg6C2#115).
[01082] Etapa 1. Síntese de N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxahenicosan-1-oil)- N,2-dimetillanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1- metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-
metil-L-valinamida (AmPeg6C2#115). Uma solução de ácido 1-(9H-fluoren-9-il)-3- oxo-2,7,10,13,16,19,22-heptaoxa-4-azapentacosan-25-oico (1 equivalente), HATU (1 equivalente), e Base de Hunig (3 equivalentes) é permitido agitar por 30 minutos.
Composto #115 é adicionado como uma solução em DMF. Reação é monitorada por LC-MS. Quando reação de acoplamento está próxima de terminar, piperidina (5 equivalentes) é adicionada. Desproteção de Fmoc é monitorada por LC-MS. Reação é concentrada e purificação é completada por pressão em meio Isco cromatografia de fase reversa (Gradiente: 5%-100% água em acetonitrila).
[01083] Preparação de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- ({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicil}amino)fenil]-1- metóxi-1-oxopropan-2-il}amino)-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mcGly#201.
[01084] Etapa1: Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H pirrol-1-il)hexanoil]glicil}amino)-L-fenilalaninato de metil (#251): A uma solução de metil 4-amino-N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalaninato (4.1 g, 15.3 mmol, 1eq.) em N,N-dimetilformamida seco (70 mL) foi adicionada N,N'-Diciclohexilcarbodiimida (2.9 g, 15.3 mmol, 1eq.) a 0 oC. A mistura foi agitada a 0 oC por 30 minutos. Uma solução de ácido 2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)acético (3 g, 10.2 mmol, 0.66 eq.) em N,N-dimetilformamida seco (20 mL) foi adicionada a 0 oC. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 dias. A mistura foi filtrada. O filtrado foi vertido em água com gelo (200 mL) e extraído com EtOAc (200 mLX3). O extrato foi lavado com salmoura (200 mL), seco sobre Na2SO4 e concentrado in vacuo para render #251 (1.8 g, 32.3% de rendimento) como um sólido amarelo claro. HPLC (Protocolo Q2) [M+Na+] 567.3, tempo de retenção = 1.02 min
[01085] Etapa 2: Síntese de 4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicil}amino)-L-fenilalaninato de metil (#252): A uma solução de #251 (800 mg, 1.47 mmol, 1 eq.) em diclorometano (16 mL) foi adicionada TFA (4.8 mL) a 0 oC.
A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em água e filtrado. O filtrado foi liofilizado para render #252 (800 mg, 97.5%) como um sólido branco. HPLC (Protocolo Q3) [M+H+]
445.4, tempo de retenção = 0.90 min.
[01086] Etapa 3: Síntese de 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- ({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicil}amino)fenil]-1- metóxi-1-oxopropan-2-il}amino)-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (mcGly#201). A uma solução de #198 (94 mg, 0.13mmol, 1 eq.) e #252 (60.3 mg, 0.18 mmol, 1.4 eq.) em N,N- dimetilformamida (2 mL) foi adicionada HATU (64.2 mg, 0.13 mmol, 1 eq.) seguido por N,N- diisopropiletilmina (66 mg, 0.52 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi neutralizada com ácido cítrico aq. e concentrada para dar produto bruto, que foi purificado por cromatografia de sílica gel (eluído com MeOH/DCM de 1% a 7%), em seguida purificado novamente por TLC preparativa (Metanol:diclorometano: =1:10) para dar mcGly#201 (25 mg, 16.2%) como um sólido branco: ESI-MS: m/z 1023.59 [M+H+], HPLC (ProtocolEB) tempo de retenção = 4.0 minutos (Pureza = 96%). 1H NMR (DMSO-d6) 29.88 (d, 1H), 8.48 (d,
0.5H), 8.24 (d, 0.5H), 8.11 (m, 1H), 7.82 (m, 1H), 7.47 (d, 2H), 7.15 (m, 2H), 7.01 (s, 2H), 4.67 (m, 3H), 3.96 (m, 4H), 3.65 (m, 4H), 3.40 (m, 4H), 3.27 (m, 7H), 3.16 (m, 5H), 2.24 (m, 8H), 1.50 (m, 11H), 1.19 (m, 21H).
[01087] Preparação de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)- 1-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}- 1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil- L-valinamida (MalC6Am#151)
[01088] Etapa 1. Síntese de 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(2S)-1-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2- il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida (MalC6Am#151). Seguindo o procedimento geral D usando #151 (20 mg, 0.023 mmol, 1.0 eq.), 1-(6-aminohexil)-1H-pirrol-2,5-diona (7.0 mg,
0.030 mmol, 1.3 eq.), HATU (11.4 mg, 0.030 mmol, 1.3 eq.), e Base de Hunig (0.016 mL, 0.092 mmol, 1.3 eq.) em 2 mL de diclorometano, e 0.2 mL de DMF seguido por purificação usando cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 5% a 80% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) rendeu MalC6Am#151 (18.4 mg, 86%) como uma mistura clara de óleo / sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 922.3 [M+H+], tempo de retenção = 1.43 minutos; HPLC (Protocola A at 45 °C): m/z 922.4 [M+H+], tempo de retenção = 7.203 minutos.
[01089] Preparação de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N- (4-{(6S,9R,10R)-6-benzil-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(1,2-dimetil-L-prolil-L- valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-9-metil-3,8-dioxo-2,11- dioxa-4,7-diazadodec-1-il}fenil)-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (mcValCitPABC#246)
[01090] Etapa 1. Síntese de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L- valil-N-(4-{(6S,9R,10R)-6-benzil-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(1,2-dimetil-L-prolil-L- valil)(metil)amino]-3-metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-9-metil-3,8-dioxo-2,11- dioxa-4,7-diazadodec-1-il}fenil)-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (mcValCitPABC#246). Seguindo o procedimento geral E usando #246 (29.2 mg,
0.035 mmol, 1.0 eq.), mcValCitPABC-PNP (28.8 mg, 0.039 mmol, 1.1 eq.), 2,6- Luditina (0.016 mL, 0.14 mmol, 4.0 eq.), Base de Hunig (0.025 mL, 0.14 mmol, 4.0 rq.), e HOAT (4.8 mg, 0.035 mmol, 1.0 eq.) em 2.0 mL de DMA seguido por purificação usando cromatografia C18 de fase reversa de pressão média (Gradiente: 5% a 50% de acetonitrila em água com 0.02% de TFA em cada fase) rendeu mcValCitPABC#246 (21 mg, 45%) como uma mistura clara de óleo / sólido. LC-MS (Protocolo Q): m/z 1327.9 [M+H+], tempo de retenção = 1.36 minutos.
[01091] Estudos de HERCEPTIN® in vitro e in vivo
[01092] Deve ser notado que para os seguintes estudos HERCEPTIN® na ausência de agentes citotóxicos conjugados não mostra nenhuma potência significativa in vitro ou eficácia in vivo em concentrações de anticorpo equivalentes.
[01093] Procedimento de Ensaio Celular In Vitro
[01094] Células de expressão alvo (BT474 (câncer de mama), N87 (câncer gástrico), HCC1954 (câncer de mama), MDA-MB-361-DYT2 (câncer de mama)) ou não expressão (MDA-MB-468) foram cultivadas em placas de cultura celular de 96 poços por 24 horas antes de tratamento. Céluls foram tratadas com conjugados de droga de anticorpo serialmente diluídos 3 vezes ou compostos livres (i.e., nenhum anticorpo conjugado a droga) em duplicata a 10 concentrações. Viabilidade celular foi determinada por Ensaio CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation MTS (Promega, Madison WI) 96 horas após tratamento. Viabilidade cellular relative foi determinada como percentual de controle não tratado. Valores IC50 foram calculados usando um modelo logístico de quatro parâmetros #203 com XLfit v4.2 (IDBS, Guildford, Surry, UK). Resultados são mostrados nas Tabelas 20, 21A e 21B.
[01095] Modelo de Xenoenxerto de Tumor In vivo MDAMB-361 DYT2
[01096] Estudos de eficácia In vivo de conjugados de droga-anticorpo foram realizados com a linhagem celular Her2+ MDAMB-361 DYT2. Para estudos de eficácia, 10 milhões de células tumorais em 50% de matrigel foram implantadas subcutaneamente em camundongos nus irradiados de 6-8 semanas de idade.
Quando os tamanhos de tumor alcançado entre 250-350 mm3 de drogas ou veículo foram administrados através de injeção de bolus na veia da cauda. Os camundongos foram injetados com 1 mg/kg de conjugados de droga anticorpo tratados quatro vezes a cada quatro dias (Q4dx4). O volume do tumor é medido duas vezes por semana durante os primeiros 50 dias e uma vez por semana depois disso por um dispositivo Caliper e calculado com a seguinte fórmula: volume do tumor = (comprimento x largura2)/2 Os resultados foram comparados entre os estudos, normalizando a regressão do tumor do camundongos tratados com a droga dividindo o volume do tumor pelo volume do tumor tratado com veículo (T/C).
[01097] Seis compostos foram testados nos três estudos de xenoenxerto MDA-MB- 361-DYT2 diferentes para determinar a sua atividade antitumoral. Os resultados de um estudo representativo, com quatro dos compostos demonstra regressão significativa do tumor dos camundongos tratados com veículo durante o período de observação de 50 dias (Figura 1). Para comparar os resultados dos compostos nos três estudos, a atividade antitumoral foi normalizada dividindo o volume do tumor tratado com a droga pelo volume do tumor tratado com veículo (T/C). Um esquema de seis valores T/C (Figura 2) demonstra que cada um dos seis compostos causa a regressão completa (ou quase completa) do tumor durante o período de observação que foi até 107 dias, para um dos estudos.
[01098] Os resultados dos testes de H(C)-#D54, H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF e H(K)-MCC-DM1 nos estudos de xenoenxerto MDA-MB-361-DYT2 são mostrados na Figura 4. Esquema de volume tumoral no grupo de tratamento sobre o grupo de controle (T/C) permite a comparação entre os conjugados (Figura 5C). Estes resultados demonstram que H(C)-#D54 exibe eficácia equivalente a conjugados HERCEPTIN® com H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF e é superior a H(K)-MCC-DM1 neste modelo.
[01099] Modelo de Xenoenxerto de Tumor N87 In vivo (HERCEPTIN ®)
[01100] Estudos de eficácia in vivo de conjugados anticorpo-droga foram realizados com modelos de xenoenxerto expressando alvo usando as linhagens de células N87. Para o estudo de eficácia, 7,5 milhões de células tumorais em 50 % de matrigel são implantadas subcutaneamente em camundongos nus 6-8 semanas de idade, até que os tamanhos dos tumores atingem entre 250 e 350 mm3. Dosagem é feita através de injeção de bolus na veia da cauda. Dependendo da resposta do tumor ao tratamento, os animais são injetados com 1-10 mg/kg de conjugados de fámaco anticorpo tratados quatro vezes a cada quatro dias. Todos os animais experimentais são monitorados para mudanças de peso corporal por semana. O volume tumoral é medido duas vezes por semana durante os primeiros 50 dias e uma vez por semana depois disso por um dispositivo Caliper e calculado com a seguinte fórmula: volume tumoral = (comprimento x largura2)/2. Animais são humanamente sacrificados antes de seus volumes tumorais atingirem 2500 mm3. O tamanho do tumor é observado diminuindo após a primeira semana de tratamento. Os animais podem ser monitorizados continuamente para o recrescimento do tumor após o tratamento ser interrompido.
[01101] Os resultados dos testes de H(C)-#D54, H(C)-vcMMAE, H(C)-mcMMAF e H(K)-MCC-DM1 no modelo de seleção in vivo de xenoenxerto de camundongo N87 são apresentados nas Figuras 3 e 5. Estes resultados demonstram que H(C)-#D54 é superior / semelhante ao conjugado H(C)-vcMMAE e é mais potente do que conjugados H(C)-mcMMAF e H (K)-MCC-DM1 neste modelo.
[01102] Farmacocinéticas e Toxicocinéticas
[01103] Farmacocinéticas de camundongo e toxicocinéticas de ratos foram determinadas a partir de estudos de farmacocinética de camundongo de dose única e toxicologia de rato (ver Tabelas 22 e 23). Farmacocinéticas de camundongo e toxicocinéticas de rato foram determinadas estudos de farmacocinética de camundongo de dose única e toxicologia de rato. Farmacocinéticas de camundongo foram determinadas a partir de amostras coletadas de camundongos nus que foram administrados com uma única dose de 3 mg/kg. As amostras foram coletadas em até 336h. Toxicocinéticas de rato foram determinadas em ratos (Sprague-Dawley (Crl: CD (SD))), que foram administrados com uma única administração de H(C)-vc- MMAE ou H(C)-#D54, em doses de 3, 10, e 30 mg/kg, ou administrados com H(C)- mc-DAMM ou H(C)-mc-MMAF a 10, 30, e 100 mg/kg. As amostras foram coletadas em até 336 horas. As concentrações circulantes de anticorpo total e ADC foram medidas utilizando os ensaios de ELISA. A área sob a curva (AUC) foi calculada para o anticorpo total e ADC para cada ADC. Razões ADC para AUC de anticorpos também foi calculado.
[01104] Exposição de anticorpo total H(C)-#D54 e ADC foi maior do que a observada para o H(C)-vc-MMAE em camundongos a 3 mg/kg e em todas as doses testadas em ratos. A razão ADC para AUC Ab para H(C)-#D54 também foi maior do que a observada para o H(C) -vc-MMAE. Estes resultados sugerem que o H(C)- #D54 tem maior exposição e que o ADC e / ou carga de ligante são potencialmente mais estáveis do que o H(C)-vc-MMAE.
[01105] Toxicidade
[01106] A toxicidade independente de alvo de #D54 e carga de ligante comparadoras (mcValCitPABC-MMAD e mcValCitPABC-MMAE) conjugadas com um anticorpo monoclonal reativo não reticulado (IgG1) foram avaliadas em um estudo de toxicidade de rato de dose única com um período de observação de duas semanas. As doses dos conjugados de anticorpo - droga (ADCs) foram 0, 3, 10 e 30 mg/kg com um n é 5 machos / grupo e a carga de ligante foi semelhante entre os conjugados (3,8, 3.2 e 4, respectivamente). Estes estudos incluíram pelo menos observações diárias clínicas, peso corporal semanal, patologia clínica (finais de vida) e necropsia (dia 15-17) com o exame microscópico de 9 ou mais tecidos e quaisquer lesões macroscópicas.
[01107] A mortalidade com as mudanças de peso corporal relacionado e sinais de morbidade, foram observadas com a dose de 30 mg/kg para todos os conjugados e na dose de 10 mg/kg para o conjugado MMAD. Não houve observações clínicas ou alterações de peso corporal nos grupos de sobreviventes.
[01108] Os órgãos alvo dos conjugados identificados por exame microscópico dos grupos de doses sobreviventes foram como se segue. O conjugado a 10 mg/kg, tinha detritos no lúmen do epidídimo (5/5, mínimo a leve), inflamação na base do coração (1/5 ratos, mínimo), e aumento da mitose na córnea (1/5 ratos, mínimo).
Não houve achados histológicos para o conjugado a 3 m/kg. Para o conjugado de MMAD no grupo da dose de sobrevivência a 3 mg/kg, houve mudanças em e relacionadas com a medula óssea e nos testículos e epidídimos. Para o conjugado MMAE a 10 mg/kg, houve alterações na medula óssea, rim, fígado e epidídimo. No grupo de dose a 3 mg/kg para este conjugado, houve alterações renais e aumento da mitose no fígado. Assim, em estudos de projeto semelhante e nos grupos de sobreviventes, o conjugado não teve os resultados de medula óssea observados com os conjugados de comparação e também não tinha os resultados hepáticos ou renais visto com um dos comparadores.
[01109] Em resumo, a dose máxima tolerada (DMT) do conjugado e do conjugado MMAE foi de 10 mg/kg e a DMT do conjugado MMAD foi de 3 mg/kg. A não foram observados efeitos adversos (NOAEL) do conjugado foi de 3 mg/kg enquanto que NOAEL dos conjugados de carga de ligante comparadores foi inferior a 3 mg/kg.
Este estudo demonstra a forma como o perfil de toxicidade para #D54 se compara a determinados compostos descritos na técnica.
[01110] Estudos de Anti-IL-13R 2 ADC In Vitro e In Vivo
[01111] Anticorpos Anti-IL-13R 2 e ADCs
[01112] O anticorpo humanizado hu08 liga-se especificamente ao receptor IL- 13R 2. O aminoácido e as sequências de nucleotídeos para hu08 são mostrados na Tabela 3. CDRs Kabat estão sublinhadas.
[01113] Tabela 3. Sequências de aminoácidos e de nucleotídeos de hu08 anticorpos humanizados.
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA
NO 9 sequência de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSR aminoácido de NGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYA região variável DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA de cadeia VYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSS pesada hu08 (CDRs sublinhadas).
sequência de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTA aminoácido de VAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFS região variável GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAP de cadeia leve WTFGGGTKVEIK hu08 (CDRs sublinhadas).
11 sequência de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSR aminoácido de NGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYA cadeia pesada DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA hu08 (CDRs VYYCARQGTTALATRFFDVWGQGTLVTVSSA sublinhadas). STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSCSPGK
12 sequência de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTA aminoácido de VAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFS cadeia leve GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAP hu08 (CDRs WTFGGGTKVEIK sublinhadas). TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
13 Sequência de GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGG nucleotídeo de ACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACT cadeia pesas GTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAG hu08 TAGGAATGGCATGTCTTGGGTGAGGCAGGC
CCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCA CCGTTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTA TGCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTCACCAT CTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTA CCTCCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGG ATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACAAG GGACTACGGCACTAGCTACGAGGTTCTTCG ATGTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACC GTGTCCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG
14 Sequência de GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCT nucleotídeo de CTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACC de cadeia leve ATCACCTGTAAGGCCAGTCAGGATGTAGGT hu08 ACTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAGCCT
GGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTCG GCATCCTACCGGTCCACTGGCGTGCCTTCC AGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAT TTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCT GAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAC CATTATAGTGCTCCGTGGACGTTTGGCGGC GGAACAAAGGTGGAGATCAAGACTGTGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG ATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTG TTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGA GCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
[01114] Anticorpo anti-IL-13R 2 humanizado hu08 foi conjugado com várias combinações de carga de ligante da presente invenção, como proporcionado na Tabela 4. Os conjugados de droga de anticorpo foram preparados de acordo com os métodos da presente invenção.
[01115] Tabela 4 anti-IL-13R 2 ADCs.
Carga de Ligante ADC # Nomenclatura ADC Correspondente IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- hu08-vc-0101 (C)_mcValCitPABC-#54 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#115 hu08-mc-3377 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-0#118 hu08-mc-0131 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_MalPeg6C2- hu08-Malpeg-6121 #117 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- hu08-Malpeg-0131 (C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#117 hu08-mc-6121 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- hu08-vc-3906 (C)_mcValCitPABC-#226 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- hu08-vc-6780 (C)_mcValCitPABC-#112 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#69 hu08-mc-8261 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_mc-#226 hu08-mc-3906 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-(C)_MalPeg6C2- hu08-MalPeg-8261 #69 huIgG8.84-mcValCitPABC-#54 huIgG8.84-vc0101 huIgG8.84-mc-#115 huIgG8.84-mc3377
[01116] Ensaio de CItotoxidade In Vitro com anti-IL-13R 2 ADCs
[01117] Linhagens celulares expressando o antígeno IL-13R 2 e uma linhagem celular de controle negativo, foram cultivadas com concentrações aumentadas de ADCs anti-IL-13R 2 compreendendo o anticorpo hu08 conjugado a várias cargas de ligante da presente invenção. Após quarto dias, viabilidade de cada cultura foi avaliada. Valores IC50 foram calculados por regressão não linear logística e são apresentados como ng Ab/mL.
[01118] Os dados demonstram que o anticorpo anti-IL-13R 2 hu08v1.0/1.0 conjugado a seis cargas de auristatina diferentes é eficaz contra ambas as Linhagens celulares positivas IL-13R 2 testadas (PC3MM2), tendo um IC50 variando de 1.1 a 4.9 ng Ab/mL ou 7.3-32.7 pM (Tabela 5). Todos ADCs foram não ativos contra a Linhagem celular negativa IL-13R 2, H460, e os ADCs de controle de ligação de não-IL-13R 2, huIgG8.84-vc0101 e huIgG8.84-mc3377, foram não ativos contra quaisquer das linhagens celulares testadas.
Tabela 5. Valores IC50 (ng Ab/mL) de ADCs anti-IL-13R 2 humanizados.
IC50 (ng Ab/mL)
ADC DAR PC3MM2 A375 H460 hu08-vc0101 3.2 2.5 3.8 >400000 hu08-mc3377 4.3 1.2 2.2 >400000 hu08-mc-0131 3.2 1.3 2.1 >400000 hu08-Malpeg-6121 3.3 3.5 3.4 >400000 hu08-Malpeg-0131 2.9 2.9 4.9 >400000 hu08-mc-6121 3.3 1.1 2.4 >400000 hu08-vc-3906 3 1.5 2.9 >400000 hu08 vc-6780 4 1.2 2.2 >400000 huIgG8.84-vc0101 3.7 >400000 >400000 >400000 huIgG8.84-mc3377 4.3 >400000 >400000 >400000
[01119] Modelos de Xenoenxerto Subcutâneo In Vivo com ADCs anti-IL13R 2
[01120] O anticorpo humanizado hu08 especificamente se liga ao receptor IL- 13R 2. ADCs hu08 com onze combinações de carga de ligante diferentes foram testadas em um modelo de xenoenxerto in vivo. Camundongos fêmeas, atímicos (nus) foram injetados subcutaneamente com PC3MM2. Camundongos com tumores faseados, aproximadamente 0.1 a 0.3 g (n = 8 a 10 camundongos/grupo de tratamento), foram administrados intravenosamente q4d x 4 com salina normal (veículo), hu08v1.0/1.0 ADCs com cargas de ligante vc-0101, vc-6780, vc-3906, mc- 8261, mc-0131, mc-6121, mc-3377, MalPeg-8261, MalPeg-0131, MalPeg-6121, ou MalPeg-3906, e um Ab de não ligação (huIgG8.84) conjugado com vc-0101 ou mc- 3377, a uma dose de 2 ou 3 mg Ab/kg. Os ADCs foram doseados com base em um teor de Ab. Tumores foram medidos pelo menos uma vez por semana e seu tamanho é calculado como mm3 = 0.5 x (largura do tumor2) x (comprimento do tumor).
[01121] Os resultados de eficácia in vivo listados na Tabela 6 mostram uma faixa de atividade antitumoral com os vários ADCs testados. A ordem relativa de potência é hu08-vc-0101 > hu08-vc-6780 > hu08-mc-0131 > hu08-mc-6121 > hu08-mc-3906 > hu08-MalPeg-0131 >hu08-MalPeg-6121 > hu08-MalPeg-3906 > > hu08-mc-8261.
No nível de dose 3 mg/kg, ambos hu08-vc-0101 e hu08-mc-3377 demonstraram atividade antitumoral, ao passo que o Ab de não ligação (huIgG8.84) conjugado com vc-0101 ou mc-3377 não teve nenhuma atividade e foi similar ao controle veículo.
Tabela 6. Eficácia de ADCs anti-IL-13R 2 em xenoenxertos PC3MM2.
Dose Xenoenxerto PC3MM2, volume tumoral (mm3 +/- SEM) ADC (mg/kg) Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Dia Q4dx4 -1 3 8 16 20 30 42 52 638 1149 1707 Veículo 0 ± ± ± GT GT GT GT GT 27 82 133 hu08- 642 1036 1176 MalPeg- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT 3906 36 60 51 hu08-mc- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT 8261 51 121 158
637 1004 778 hu08-mc- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT 0131 44 73 83 hu08- 638 947 1000
MalPeg- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT
6121 36 85 126 hu08- 649 1085 1040
MalPeg- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT
0131 39 54 88
646 899 557 243 201 113 207 532 hu08-vc- 2 ± ± ± ± ± ± ± ± 0101 36 54 49 28 20 17 49 151
641 850 652 279 217 230 hu08-vc- 2 ± ± ± ± ± ± GT GT 6780 28 100 54 55 45 133
636 909 821 hu08-mc- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT 6121 37 63 93
637 875 806 hu08-mc- GT 2 ± ± ± GT GT GT GT 3906 26 48 70 hu08- 645 991 1220
MalPeg- 2 ± ± ± GT GT GT GT GT
8261 34 71 115 hu08- 3 ± ± ± ± ± ± GT GT vc0101 18 45 14 6 110 230 337 385 41 0 78 346 616 902 hu08- 3 ± ± ± ± ± ± ± ± mc3377 21 36 12 0 36 147 243 364 365 581 1017 huIgG8.8 3 ± ± ± GT GT GT GT GT 4-vc0101 22 47 168 328 459 295 544 huIgG8.8 10 ± ± ± ± GT GT GT GT 4-mc3377 27 63 121 258
[01122] GT= grupo terminado devido ao tamanho de tumor grande
[01123] Estudos ADC Anti-Notch in Vitro e inVivo
[01124] Anticorpo Anti-Notch e ADCs
[01125] Anticorpos humanizados, hu28 e hu75, e anticorpos quiméricos de rato- humano, ch28 e ch75, especificamente se ligam ao receptor Notch. As sequências de aminoácido e nucleotídeo para hu28 e hu75 são providas na Tabela 7. CDRs Kabat são sublinhados.
[01126] Tabela 7. Sequências de aminoácido e nucleotídeo de anticorpo anti-Notch humanizados.
SEQ DESCRIÇÃO SEQUÊNCIAS ID NO.
Sequência de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYGMT aminoácido de WVRQAPGKGLEWVAYISSGSNYIYYAEAVKGRFTISR região variável DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGPFVLDAWG de cadeia QGTLVTVSS pesada hu28 (CDRs sublinhadas).
16 Sequência de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYGMT aminoácido de WVRQAPGKGLEWVAYISSGSNYIYYAEAVKGRFTISR cadeia pesada DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGPFVLDAWG hu28 (CDRs QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL sublinhadas). VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS Região LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK Constante IgG1 SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR Humana TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG
17 Sequência de GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGG nucleotídeo de TCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA cadeia pesada GCCTCTGGATTCACTTTCAGGGACTATGGAATGAC hu28 CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG
TGGGTGGCCTATATTAGTAGTGGTAGCAATTACATC TATTATGCAGAAGCGGTGAAGGGCCGATTCACCAT CTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGT GTATTACTGTGCGAGACGAGGCCCGTTTGTTTTGG ATGCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCG CCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGT CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGG TACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA
18 Sequência de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSINRYLHWYQ aminoácido de QKPGKAPKLLIYNANGLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLT região variável ISSLQPEDFATYYCLQHNTWPDTFGGGTKVEIK de cadeia leve hu28 (CDRs sublinhadas).
19 hu28 Sequência DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSINRYLHWYQ de aminoácido QKPGKAPKLLIYNANGLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLT de cadeia leve ISSLQPEDFATYYCLQHNTWPDTFGGGTKVEIKRTVA (CDRs APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW sublinhadas). KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD Região YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Constante Kappa Humana
Sequência de GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTC nucleotídeo de TGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCA cadeia leve AAGCAAGTCAGAGTATTAACAGGTACTTACACTGGT hu28 ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTG
ATCTATAATGCAAACGGTTTGCAAACGGGGGTCCC ATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATT TCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATT TTGCAACTTACTACTGTTTGCAGCATAATACGTGGC CGGACACGTTTGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGAT CAAACGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCT TCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACC GCCTCTGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCC CCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAAC GCTCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCTGTGAC CGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGT CCTCTACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAG AAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCA GGGCCTGTCCTCTCCTGTGACCAAGTCCTTCAACC
GGGGCGAGTGC 21 Sequência de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYAFTDYWMT aminoácido de WVRQAPGKGLEWVAEISPNSGGTNFNEKFKGRFTIS região variável VDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEIRYNWFA de cadeia YWGQGTLVTVSS pesada hu75 (CDRs sublinhadas).
22 Sequência de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYAFTDYWMT aminoácido de WVRQAPGKGLEWVAEISPNSGGTNFNEKFKGRFTIS cadeia pesada VDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEIRYNWFA hu75 (CDRs YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA sublinhadas). LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS Região GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK Constante IgG1 VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Humana MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPG
23 Sequência de GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGG nucleotídeo de TCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA cadeia pesada GCCTCTGGTTATGCATTCACTGACTACTGGATGAC hu75 CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG
TGGGTGGCCGAAATTTCTCCTAACAGTGGTGGTAC TAACTTCAATGAAAAGTTCAAGGGCCGATTCACCAT CTCCGTTGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGT GTATTACTGTGCGAGAGGGGAAATCCGTTACAATT GGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCA GGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCC CAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
24 Sequência de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNIAWYQ aminoácido de QKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTI região variável SSLQPEDFATYYCQRLYNSPFTFGGGTKVEIK de cadeia leve hu75 (CDRs sublinhadas).
Sequência de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNIAWYQ aminoácido de QKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTI cadeia leve SSLQPEDFATYYCQRLYNSPFTFGGGTKVEIKRTVAA hu75 (CDRs PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK sublinhadas). VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY Região EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Constante Kappa Humana
26 Sequência de GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTC nucleotídeo de TGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCA cadeia leve AGGCCAGTCAGAATGTGGGTAATAATATAGCCTGG hu75 TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCT
GATCTATTATGCATCTAACCGGTACACTGGGGTCC CATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATATGGGACAGAT TTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGAT TTTGCAACTTACTACTGTCAGCGTCTTTACAATTCT CCATTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGA TCAAACGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATC TTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCAC CGCCTCTGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAA CGCTCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCTGTGA CCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTG TCCTCTACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGA GAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCAC CAGGGCCTGTCCTCTCCTGTGACCAAGTCCTTCAA CCGGGGCGAGTGC
[01127] Anticorpos anti-Notch humanizados, hu28 e hu75, e anticorpos anti-Notch quiméricos de rato-humano, ch28 e ch75, foram conjugados a várias combinações de cargas de ligante da presente invenção, como provido na Tabela 8. Os conjugados de droga de anticorpo foram preparados de acordo com os métodos da presente invenção.
Tabela 8. ADCs.
Anti-Notch
Nomenclatura ADC Carga de ligante de ADC # Correspondente
Notch-28-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC- hu28-vc0101 #54
Notch-28-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC- hu28-vc6780 #112
Notch-75-v1913-hG1-(C)_mcValCitPABC- hu75-vc0101 #54
Notch-75-v1913-hG1-(C)_mcValCitPABC- hu75-vc6780 #112
Notch-28-cG1-(C)_mcValCitPABC-#54 ch28-vc0101
Notch-28-cG1-(C)_mcValCitPABC-#112 ch28-vc6780
Notch-28-cG1-(C)_mc-#54 ch28-mc0101
Notch-28-cG1-(C)_mc-0#118 ch28-mc0131
Notch-28-cG1-(C)_mc-#115 ch28-mc3377
Notch-28-cG1-(C)_mc-#69 ch28-mc8261 ch28-MalPeg6C2- Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-0#118 0131 ch28-MalPeg6C2- Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69 8261
Notch-28-cG1-(C)_me-0#118 ch28-me0131
Notch-28-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118 ch28-m(H2O)c-0131
Notch-75-cG1-(C)_mcValCitPABC-#54 ch75-vc0101
Notch-75-cG1-(C)_mcValCitPABC-#112 ch75-vc6780
Notch-75-cG1-(C)_mc-0#118 ch75-mc0131
Notch-75-cG1-(C)_mc-#115 ch75-mc3377
Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-0#118 ch75-MalPegC2-0131 ch75-MalPeg6C2- Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69 8261 Notch-75-cG1-(C)_me-0#118 ch75-me0131 Notch-75-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118 ch75-m(H2O)c-0131 huNeg8.8-(C)_mcValCitPABC-#54 huNeg8.8-vc0101 huNeg8.8-(C)_mcValCitPABC-#112 huNeg8.8-vc6780 huNeg8.8-(C)_mc-0#118 huNeg8.8-mc0131 huNeg8.8-(C)_mc-#115 huNeg8.8-mc3377 huNeg8.8-(C)_me-0#118 huNeg8.8-me0131 huNeg8.8- huNeg8.8-(C)_MalPeg6C2-#69 MalPeg6C2-8261 ch2H6-(C)_mc-#69 ch2H6-mc8261
[01128] Ensaios de Citotoxidade In Vitro com ADCs Anti-Notch
[01129] Os efeitos de ADCs anti-Notch foram avaliadas em 1) linhagens celulares que expressam endogenamente a proteína Notch: HCC2429 (câncer do pulmão), OVCAR3 (câncer do ovário) e MDA-MB-468 (câncer da mama), 2) linhagens celulares construídas para que sobreexpressam a proteína Notch: MDA-MB- 468/hNotch e U2OS/hNotch, e 3) uma linhagem celular de controle negativo (SW900), utilizando um indicador de viabilidade celular MTS (Promega, Madison, WI). Estas linhagens celulares foram cultivadas com concentrações crescentes de ADCs anti-Notch compreendendo anticorpos humanizados anti-Notch, e hu28 hu75, e anticorpos quiméricos anti-Notch de rato-humano, ch28 e ch75, conjugados com várias combinações de carga de ligante da presente invenção. Como um controle de especificidade para o anti-Notch-ADCs, ADCs de controle não alvo (huNeg8.8-ADCs ou ch2H6-ADCs) também foram testados nas mesmas linhagens celulares. Após quatro dias, a viabilidade de cada cultura foi avaliada. Os valores de IC50 foram calculados por regressão não linear logística e apresentados como ng Ab/ml. A razão de droga / anticorpo (DAR) também é fornecida.
[01130] A Tabela 9 mostra valores IC50 (ng Ab/mL) dos tratamentos com ADC anti- Notch humanizados. Linhagens celulares HCC2429 e MDA-MB-468/hNotch tinham duas repetições individuais. Os dados demonstram que os ADCs anti-Notch humanizados com várias cargas de ligantes eram ativos e morte celular induzida no Notch que expressa e sobre-expressa as linhagens celulares de câncer HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA-MB-468/hNotch, U2OS/hNotch, mas não na expressão de Notch que falta SW900 da linhagem celular de controle negativo sem.
Os ADCs de controle não alvos ou que faltam potência (LP) e, portanto, valores IC50 não foram gerados, como indicado, ou foram minimamente ativos nas mais altas doses testadas. ADCs anti-Notch com valores IC50 iguais ou maiores do que os valores IC50 para controle em ADCs foram considerados como falta potência in vitro e indiciados como LP.
Tabela 9. Valores IC50 (ng Ab/mL) de ADCs anti-Notch humanizados.
IC50 (ng Ab/mL) ± S.E.M.
DA ADC MDA-MB- R OVCA MDA- U2OS/ SW9 HCC2429 468/ R3 MB-468 hNotch 00 hNotch 294 hu28-vc0101 3.9 473 306 6545 3.2 3 1330 LP 0 329 hu75-vc0101 3.8 611 515 7001 37 36 523 LP 5 huNeg8.8- 1841 239 2337
3.7 3770 LP 5122 LP LP vc0101 7 78 9 hu28-vc6780 3.9 148 205 17 LP 1.3 3 LP LP hu75-vc6780 4.2 214 630 254 LP 26 25 LP LP huNeg8.8-
4.2 LP LP 9238 LP LP LP LP LP vc6780
[01131] Tabela 10 mostram valores IC50 (ng Ab/mL) dos tratamentos ADC anti-Notch quimérico de rato-humano. Para experimentos com 1 a 4 repetições individuais, IC50 médio foram calculados jutamente com erro padrão da média (S.E.M.). Os dados demonstram que os ADC anti-Notch quimérico de rato-humano com várias cargas de ligante foram ativos e induziram morte celular nas linhagens celulares de câncer que expressam ou sobre-expressam Notch HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA- MB-468/hNotch, U2OS/hNotch. Os ADCs de controle não alvo também faltam potência (LP) e portanto valores IC50 não foram gerados como indicado, ou foram minimamente ativos nas doses mais altas testadas. ADCs anti-Notch tendo valores IC50 iguais a ou maiores do que valores IC50 for ADCs de controle foram considerados com falta de potência em vitro e indicados como LP.
Tabela 10. Valores IC50 (ng Ab/mL) de ADC anti-Notch quimérico de rato- humano (nd= não determinado).
IC50 (ng Ab/mL) ± S.E.M.
U2OS MDA-MB- ADC DAR OVCA MDA-MB- / HCC2429 468/ R3 468 hNotc hNotch h 12147±480 ch28-mc8261 3.7 LP nd nd nd
6.4 ch2H6-mc8261 4.1 LP nd LP nd nd ch28-MalPeg6C2-
4.3 LP nd 83±35.5 nd nd 8261 ch75-MalPeg6C2-
3.8 LP nd 4255±2375 nd nd 8261 huNeg8.8-
4.1 LP nd LP nd nd MalPeg6C2-8261 ch28-mc0131 3.4 251±77.5 6±1.0 35±18.5 nd 3±0.5 671±406. 8202±2773 ch75-mc0131 3.3 289 nd 19 5 .0 huNeg8.8-mc0131 3.9 Nd LP LP nd LP 3±1.1 ch28-me0131 3.9 30 8±2.0 24±14.0 nd 5 ch75-me0131 3.5 Nd nd 259 nd nd huNeg8.8-me0131 3.7 Nd LP LP nd LP ch28-mc3377 3.7 LP 14±5.5 27±11.3 nd 3±0.5 ch75-mc3377 3.7 Nd nd 560 nd nd huNeg8.8-mc3377 3.6 Nd LP LP nd LP ch28-MalPeg6C2- 3±0.8
4.1 LP 10±2.0 10±1.0 nd 0131 5 3230±111 5443±2630 95±18 ch28-vc0101 3.8 635 4±0.5
6.5 .9 .2 2112±826 4064±1793 ch75-vc0101 2.7 LP 24±4.0 LP .0 .9 4523±2789 huNeg8.8-vc0101 3.7 15341 LP 8833 LP .5 90±48. 4407±2128 ch28-vc6780 4.1 324±78.9 3±0.5 LP 5 .2 1004±177 6873±4230 ch75-vc6780 2.8 922 21±3.5 LP .0 .0 huNeg8.8-vc6780 4.1 LP LP LP LP LP
[01132] Modelos de Xenoenxerto de Tumor Humano In vivo com ADCs anti-Notch
[01133] Anticorpos anti-Notch humanizados, hu28 e hu75, e anticorpos anti-Notch quiméricos de rato-humano, ch28 e ch75, foram conjugados a várias combinações de cargas de ligante e testados em modelos de xenoenxerto de câncer de pulmão de células não pequenas 37622A1 (NSCLC), câncer de pulmão HCC2429, câncer de mama MDA-MB-468 e câncer gástrico N87. Para cada modelo descrito abaixo a primeira dose foi dada no Dia 0. Os tumores foram medidos pelo menos uma vez por semana e seu volume foi calculado com a fórmula: volume tumoral (mm3) = 0.5 x (largura do tumor2) (comprimento do tumor). Volumes tumorais médios (± S.E.M.) for cada grupo de tratamento foram calculados tendo um máximo de 10 animais e a mínimo de 6 animais para serem incluídos.
A. Xenoenxertos NSCLC 37622A1
[01134] Os efeitos de ADCs anti-Notch foram examinados em camundongos imunodeficientes no crescimento in vivo de xenoenxertos de tumor humano que foram estabelecidos de fragmentos de tumores NSCLC 37622A1 recentemente dessecados obtidos de acordo com procedimentos de consenso apropriados (Asterand). Os xenoenxertos derivados de pacientes com NSCLC 37622A1 foram subcutaneamente passados in vivo como fragmentos de animal para animal em camundongos nus (Nu/Nu) fêmeas. Quando os tumores alcançaram um volume de 150 a 300 mm3, eles foram faseados para assegurar uniformidade do tamanho todo tumor entre os vários grupos de tratamento. O modelo NSCLC 37622A1 foi doseado intravenosamente quatro vezes a cada quatro dias (Q4dx4) com veículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados, ADCs huNeg-8.8 de controle e cisplatina nas doses providas na Tabela 11.
[01135] Cisplatina é um agente anticâncer a base de platina usado no tratamento de câncer e considerado uma terapia de cuidado padrão. Cisplatina reticula DNA desse modo induzindo apoptose e inibição do crescimento celular. Os dados demonstram que ADCs anti-Notch hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 e hu75-vc6780 inibiram crescimento de xenoenxertos NSCLC37622A1. Adicionalmente, os dados mostram que ADCs anti-Notch inibiram crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg8.8 de controle. Além do mais, os dados mostram que ADCs anti-Notch inibiram crescimento do tumor mais potencialmente do que cisplatina indicando uma potência maior do que uma droga quimioterapêutica de cuidados padrão a base de platina.
Tabela 11. Eficácia de ADCs anti-Notch em Xenoenxertos NSCLC 37622A1.
Xenoenxertos NSCLC 37622A1, volume do tumor (mm3 ± SEM) huNeg- huNeg- hu28- hu28- hu75- hu75- Cispla PBS 8.8- 8.8- vc0101 vc6780 vc0101 vc6780 tina vc0101 vc6780 Dose 0 3 10 3 10 3 10 5 mg/kg DIA -1 187 186 182 185 183 184 182 185 ±10 ±13 ±16 ±17 ±17 ±18 ±17 ±11 DIA 4 227 202 176 200 205 225 226 226 ±19 ±16 ±13 ±16 ±23 ±17 ±26 ±15 DIA 7 279 202 176 227 195 274 265 280 ±24 ±15 ±19 ±16 ±22 ±18 ±28 ±29
DIA 371 130 122 175 147 309 246 301 11 ±42 ±11 ±10 ±20 ±23 ±26 ±30 ±34
DIA 419 119 95 156 118 303 277 345 14 ±49 ±11 ±7 ±19 ±18 ±26 ±41 ±47
DIA 516 71 65 112 93 298 219 309 18 ±63 ±6 ±6 ±16 ±14 ±28 ±31 ±37
DIA 562 55 56 122 98 320 218 373 21 ±65 ±6 ±6 ±27 ±20 ±41 ±42 ±50
DIA 610 49 51 137 93 315 264 401 ±78 ±6 ±6 ±33 ±24 ±52 ±52 ±58
DIA 624 41 51 161 99 358 246 446 28 ±94 ±7 ±8 ±53 ±26 ±61 ±51 ±64
DIA 817 42 72 175 165 398 332 482 32 ±99 ±13 ±15 ±52 ±45 ±64 ±77 ±62
DIA 900 42 92 271 229 487 384 587 ±104 ±11 ±21 ±79 ±59 ±79 ±94 ±80
DIA 960 62 120 319 294 569 431 591 39 ±117 ±26 ±31 ±103 ±78 ±102 ±114 ±83
DIA 931 75 151 357 318 590 495 612 42 ±108 ±34 ±37 ±113 ±71 ±101 ±128 ±92
DIA 1037 92 172 431 412 743 610 723 46 102 ±44 ±47 ±137 ±106 ±133 ±165 ±119
DIA 1119 120 248 519 521 810 718 853 49 ±120 ±63 ±62 ±135 ±132 ±121 ±202 ±139
DIA 1345 144 339 678 629 989 848 970 53 ±158 ±67 ±93 ±195 ±162 ±146 ±251 ±193
DIA 1485 126 376 818 808 1149 776 1215 56 ±185 ±51 ±100 ±251 ±196 ±191 ±184 ±231
DIA 1691 180 503 710 917 1287 964 1428 60 ±220 ±85 ±138 ±162 ±209 ±194 ±232 ±273
DIA 1736 223 604 824 917 1503 1097 - 63 ±193 ±111 ±160 ±191 ±147 ±227 ±254 DIA 296 888 938 1116 1600 1167 - - 67 ±152 ±272 ±202 ±173 ±251 ±260 DIA 312 773 953 1181 1352 - - - 70 ±162 ±235 ±209 ±203 ±305 DIA 331 881 - - - - - - 74 ±160 ±264 DIA 422 1029 - - - - - - 77 ±210 ±325
DIA 510 - - - - - - - 81 ±248 DIA 622 - - - - - - - 84 ±322 B. Xenoenxertos de pulmão HCC2429
[01136] Experimentos in vivo similares foram realizados com a linhagem celular de câncer de pulmão HCC2429 como descrito acima. Para gerar xenoenxertos, camundongos nus (Nu/Nu) fêmeas foram implantados subcutaneamente com
3.5x106 de células HCC2429 em 50% de Matrigel (BD Biosciences). Quando os tumores alcançaram um volume de 200 a 400 mm3, os tumores foram faseados para assegurar uniformidade da massa do tumor entre os vários grupos de tratamento. O modelo de xenoenxerto HCC2429 foi doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados e ADCs huNeg-8.8 de controle nas doses providas nas Tabelas 12 e 13. Os dados demonstram que ADCs anti-Notch hu28- vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 e hu75-vc6780 inibiu crescimento de xenoenxertos de pulmão HCC2429 em uma maneira dependente de dose.
Adicionalmente, os dados mostram que ADCs anti-Notch inibiram crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg-8.8 de controle nas doses de 1 e 3 mg/kg para ADCs anti-Notch com cargas de ligante vc0101 e nas doses de 3 e 10 mg/kgs para ADCs anti-Notch com cargas de ligante vc6780. Adicionalmente, os dados demonstram que uma dose de 3mg/kg de hu28-vc0101 foi foi mais potente do que uma dose de 10 mg/kg de hu28-vc6780.
Tabela 12. Eficácia de ADCs anti-Notch-vc0101 em Xenoenxertos de Pulmão HCC2429.
Xenoenxertos de pulmão HCC2429, volume do tumor (mm3 +/- SEM)
PBS hu28-vc0101 hu75-vc0101 huNeg-8.8-vc0101
Dose 0 3 1 0.3 3 1 0.3 3 1 0.3 mg/kg
DIA -1 245 245 246 246 245 246 247 244 245 246
±24 ±23 ±26 ±30 ±28 ±23 ±29 ±30 ±33 ±27
DIA 1 529 548 532 528 498 548 524 482 519 514
±52 ±52 ±36 ±50 ±39 ±37 ±66 ±59 ±72 ±50
DIA 3 742 606 757 733 498 753 713 695 756 724
±73 ±78 ±68 ±78 ±44 ±93 ±74 ±91 ±97 ±73
DIA 6 120
1205 723 1095 1112 469 1096 1078 1075 1144 7
±120 ±101 ±119 ±132 ±70 ±146 ±74 ±132 ±100 ±10
0
DIA 8 168
1720 696 1324 1617 407 1428 1499 1404 1598 3
±181 ±100 ±173 ±172 ±71 ±200 ±115 ±183 ±133 ±16
5
DIA 10 216
2312 620 1606 2027 370 1611 1830 1735 1974 3
±197 ±90 ±250 ±233 ±81 ±189 ±120 ±253 ±185 ±26
0
DIA 13 258
3235 543 1717 2642 273 1803 2408 2162 2676 9
±120 ±92 ±223 ±297 ±69 ±208 ±226 ±376 ±346 ±28
7
DIA 15 512 1865 298 1871 - - - - - - ±111 ±263 ±88 ±232
DIA 17 442 2228 250 1948 - - - - - - ±114 ±333 ±77 ±228
DIA 20 428 177 - - - - - - - - ±144 ±44
DIA 23 405 160 - - - - - - - - ±149 ±35
DIA 27 422 174 - - - - - - - - ±164 ±51
DIA 30 394 196 - - - - - - - - ±182 ±72
DIA 34 505 295 - - - - - - - - ±236 ±121
DIA 37 606 433 - - - - - - - - ±283 ±179
DIA 41 750 606 - - - - - - - - ±361 ±259
DIA 45 872 836 - - - - - - - - ±415 ±359
DIA 49 558 732 - - - - - - - - ±303 ±350
DIA 52 571 - - - - - - - - - ±310
DIA 56 704 - - - - - - - - - ±399
Tabela 13. Eficácia de ADCs anti-Notch-vc6780 em Xenoenxertos de Pulmão HCC2429.
Xenoenxertos de pulmão HCC2429, volume do tumor (mm3 ± SEM) PBS hu28-vc6780 hu75-vc6780 huNeg-8.8-vc6780 Dose 0 10 3 1 10 3 1 10 3 1 mg/kg DIA -1 245 244 245 245 244 246 245 244 244 245 ±28 ±22 ±24 ±27 ±19 ±30 ±16 ±22 ±26 ±20 DIA 1 398 369 379 400 407 403 418 429 427 402 ±50 ±31 ±45 ±66 ±43 ±51 ±34 ±56 ±49 ±53 DIA 3 701 318 493 579 339 526 629 619 689 655 ±102 ±31 ±65 ±113 ±36 ±74 ±65 ±62 ±83 ±97 DIA 5 808 837 949 228 609 826 251 615 916 965 ±10 ±11 ±140 ±28 ±82 ±191 ±33 ±98 ±97 ±114 1 7 DIA 7 107 109 1345 172 638 1023 225 615 1164 2 1380 9 ±200 ±22 ±86 ±259 ±24 ±115 ±131 ±15 ±136 ±17 4 2 DIA 10 145 172 2045 143 784 1439 198 717 1705 2 2082 2 ±356 ±22 ±115 ±398 ±24 ±129 ±184 ±21 ±192 ±36 0 3
DIA 12 167 158
134 883 1442 166 807 2029 3 2701 6 - ±20 ±132 ±487 ±22 ±130 ±270 ±29 ±228 ±33
0 7
DIA 14 180
115 895 150 831 2294 9 - - - - ±16 ±175 ±22 ±145 ±287 ±31
4
DIA 17 127 1105 158 1017 - - - - - - ±18 ±253 ±32 ±178
DIA 20 149 1219 164 1297 - - - - - - ±27 ±311 ±48 ±231
DIA 24 206 1618 261 1813 - - - - - - ±60 ±468 ±89 ±343
DIA 27 290 316 1970 - - - - - - - ±100 ±135 ±462
DIA 31 378 438 - - - - - - - - ±150 ±201
DIA 34 551 423 - - - - - - - - ±244 ±177
DIA 38 718 504 - - - - - - - - ±332 ±203
DIA 42 1011 655 - - - - - - - - ±504 ±266
DIA 46 793 - - - - - - - - - ±320
DIA 49 901 - - - - - - - - - ±351 DIA 53 1228 - - - - - - - - - ±472
[01137] O modelo de xenoenxerto HCC2429 foi também doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo PBS, ADC anti-Notch quimérico de rato-humano e ADCs huNeg-
8.8 de controle, a uma dose de 5mg/kg como provido na Figure 8A. Os dados demonstram que ADCs anti-Notch com ligantes não cliváveis (mc) e cliváveis (vc) e várias combinações de carga inibiram crescimento de xenoenxertos de pulmão HCC2429. Adicionalmente, os dados mostram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano inibiu crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg-
8.8 de controle. Adicionalmente, os dados demonstram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano com cargas de ligante vc0101 foi mais potente do que os outros ADCs anti-Notch testados.
C. Xenoenxertos de mama MDA-MB-468
[01138] Experimentos in vivo similares foram realizados com a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-468 como descrito acima. Células MDA-MB-468 são classificadas como um subtipo tipo basal de câncer de mama triplo-negativo (TNBC) uma vez que elas faltam expressão do receptor de estrigênio, receptor de progesterona e receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) (Lehmann, BD, et al, J Clin Invest. 2011;121(7):2750–2767). Para gerar xenoenxertos, camundongos fêmeas SCID Hairless Outbred (SHO) foram ortopicamente implantados com 10x106 de células MDA-MB-468 contendo 50% de Matrigel (BD Biosciences) em a camada de gordura mamária. Quando os tumores alcançaram um volume de 250 a 450 mm3, os tumores foram faseados para assegurar uniformidade da massa do tumor entre os vários grupos de tratamento. O modelo de mama MDA-MB-468 foi doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo
PBS, ADCs anti-Notch humanizados e ADCs huNeg-8.8 de controle nas doses providas nas Tabelas 14 e 15. Os dados demonstram que ADCs anti-Notch hu28- vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 e hu75-vc6780 inibiram crescimento de xenoenxertos de mama MDA-MB-468 em uma maneira dependente de dose.
Adicionalmente, os dados mostram que ADCs anti-Notch inibiram crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg-8.8 de controle nas doses de 1 e 3 mg/kg for ADCs com cargas de ligante vc0101 e 1, 3 e 10 mg/kg doses para ADC com cargas de ligante vc6780. Adicionalmente, os dados demonstram que uma dose de 1 mg/kg de ADCs anti-Notch com cargas de ligante vc0101 foi mais potente do que uma dose de 3 mg/kg de ADCs anti-Notch com cargas de ligante vc6780.
Tabela 14. Eficácia de anti-Notch-vc0101 ADCs em Xenoenxertos de Mama MDA-MB-468.
Xenoenxertos de Mama MDA-MB-468, Volume do Tumor (mm3 ± SEM) PBS hu28-vc0101 hu75-vc0101 huNeg-8.8-vc0101 Dose 0 3 1 0.3 3 1 0.3 3 1 0.3 mg/kg DIA 0 343 347 348 336 347 347 348 334 346 344 ±12 ±15 ±22 ±19 ±20 ±22 ±21 ±23 ±16 ±19 DIA 4 441 359 439 403 444 410 439 424 447 442 ±24 ±24 ±21 ±28 ±28 ±32 ±31 ±29 ±32 ±19 DIA 7 469 326 415 395 338 383 435 411 449 438 ±32 ±27 ±25 ±38 ±20 ±33 ±27 ±26 ±20 ±23 DIA 11 495 227 372 412 277 373 504 439 538 496 ±28 ±27 ±34 ±42 ±22 ±33 ±38 ±36 ±23 ±37
DIA 14 581 147 314 488 181 350 507 445 592 560
±35 ±20 ±27 ±45 ±19 ±40 ±30 ±29 ±47 ±36
DIA 18 639 77 261 497 90 296 587 479 619 578
±43 ±10 ±33 ±55 ±12 ±33 ±44 ±42 ±42 ±36
DIA 21 638 16 219 509 60 260 590 481 676 627
±46 ±8 ±41 ±60 ±9 ±49 ±55 ±34 ±46 ±30
DIA 26 707 0 253 590 16 267 652 548 793 671
±41 ±0 ±61 ±66 ±10 ±59 ±64 ±41 ±54 ±56
DIA 29 749 0 238 8 261 675 819 669 - - ±59 ±0 ±64 ±8 ±62 ±63 ±73 ±37
DIA 32 812 0 266 7 264 738 913 758 - - ±80 ±0 ±67 ±7 ±67 ±70 ±72 ±44
DIA 35 891 0 271 0 326 821 1023 848 - - ±79 ±0 ±73 ±0 ±86 ±69 ±96 ±58
DIA 39 892 0 310 0 324 864 884 - - - ±84 ±0 ±88 ±0 ±81 ±74 ±64
DIA 42 100 1037 0 349 0 381 997 - - - 2 ±104 ±0 ±95 ±0 ±94 ±84 ±55
DIA 47 114 1173 0 394 0 442 - - - - 5 ±134 ±0 ±123 ±0 ±69 ±78
DIA 50 112 0 377 0 484 - - - - - 0 ±0 ±118 ±0 ±89 ±67
DIA 53 122 0 414 0 452 9 - - - - - ±0 ±127 ±0 ±78 ±10 0 DIA 56 131 0 470 0 535 4 - - - - - ±0 ±128 ±0 ±93 ±12 0 DIA 60 0 532 0 603 - - - - - - ±0 ±140 ±0 ±98 DIA 63 0 509 0 - - - - - - - ±0 ±117 ±0 DIA 67 0 611 0 - - - - - - - ±0 ±148 ±0 DIA 70 0 0 - - - - - - - - ±0 ±0 Tabela 15. Eficácia de ADCs anti-Notch-vc6780 em Xenoenxertos de Mama MDA-MB-468.
Xenoenxertos de mama MDA-MB-468, volume do tumor (mm3 ± SEM) PBS hu28-vc6780 hu75-vc6780 huNeg-8.8-vc6780 Dose 0 10 3 1 10 3 1 10 3 1 mg/kg DIA 0 342 335 342 342 343 344 340 339 341 346 ±9 ±9 ±18 ±16 ±10 ±11 ±14 ±18 ±12 ±16 DIA 4 466 395 394 462 418 406 423 432 457 466
±20 ±19 ±33 ±22 ±15 ±22 ±27 ±45 ±23 ±29
DIA 7 481 350 399 452 370 378 434 449 529 528
±17 ±19 ±24 ±30 ±18 ±21 ±29 ±45 ±24 ±25
DIA 611 248 380 512 302 403 471 504 599 621
11 ±44 ±26 ±25 ±35 ±21 ±21 ±39 ±38 ±23 ±43
DIA 610 154 401 507 228 370 470 503 622 639
14 ±19 ±23 ±30 ±38 ±19 ±28 ±44 ±64 ±31 ±48
DIA 707 65 438 538 112 339 536 437 697 713
19 ±34 ±17 ±39 ±47 ±23 ±19 ±49 ±54 ±36 ±48
DIA 25 414 551 52 360 552 415
22 - ±16 ±41 ±48 ±21 ±17 ±44 ±54 - -
DIA 26 491 575 63 381 597 421
25 - ±19 ±37 ±55 ±25 ±23 ±48 ±76 - -
DIA 15 497 654 64 443 660 451
28 - ±15 ±68 ±74 ±26 ±33 ±53 ±84 - -
DIA 0 524 653 71 437 634 456
32 ±0 ±69 ±82 ±31 ±28 ±74 ±94
DIA 0 734 85 495 742 541
35 - ±0 - ±89 ±38 ±33 ±80 ±108 - -
DIA 0 761 125 535 794 563
40 - ±0 - ±99 ±44 ±41 ±87 ±109 - -
DIA 0 816 134 619 878 581
43 - ±0 - ±122 ±42 ±47 ±78 ±120 - -
DIA 0 859 143 636 868 617
46 - ±0 - ±126 ±42 ±38 ±99 ±116 - -
DIA 0 948 159 723 996 733
49 - ±0 - ±178 ±44 ±71 ±109 ±129 - -
DIA 0 1008 201 795 758 53 - ±0 - ±192 ±63 ±67 - ±163 - - DIA 0 211 819 56 - ±0 - - ±63 ±77 - - - - DIA 0 240 976 60 - ±0 - - ±63 ±115 - - - - DIA 0 201 63 - ±0 - - ±57 - - - - -
[01139] O modelo de mama MDA-MB-468 foi também doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo PBS, ADC anti-Notch quimérico de rato-humano e ADCs huNeg-
8.8 de controle, a uma dose de 5mg/kg como provido na Figures 8B e 8C. Os dados demonstram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano com ligantes não cliváveis (mc) e cliváveis (vc) e várias combinações de carga inibiram crescimento de xenoenxertos de mama MDA-MB-468. Adicionalmente, os dados mostram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano inibiu crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg-8.8 de controle. Adicionalmente, os dados demonstram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano com cargas de ligante vc0101 foi mais potente do que outro ADC anti-Notch quimérico de rato-humano testado.
D. N87 Xenoenxertos Gástricos
[01140] Experimentos in vivo similares foram realizados com a linhagem celular de câncer gástrico N87 como descrito acima. Para gerar xenoenxertos, camundongos nus (Nu/Nu) fêmeas foram implantados subcutaneamente com 7.5 x106 de células N87 em 50% de Matrigel (BD Biosciences). Quando os tumores alcançaram um volume de 250 a 450 mm3, os tumores foram faseados para assegurar uniformidade da massa do tumor entre os vários grupos de tratamento. O modelo gástrico N87 foi doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo PBS, ADCs anti-Notch humanizados,
ADCs huNeg-8.8 de controle e cisplatina nas doses providas nas Tabelas 16 e 17.
Os dados demonstram que ADCs anti-Notch hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75- vc0101 e hu75-vc6780 inibiram crescimento de xenoenxertos gástricos N87 em uma maneira dependente de dose. Adicionalmente, os dados mostram que ADCs anti- Notch inibiram crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg-8.8 de controle nas doses 1, 3, 5 mg/kg para ADCs com cargas de ligante vc0101 e doses 3 e 10 mg/kg para ADCs com cargas de ligante vc6780. Adicionalmente, os dados demonstram que ADCs com cargas de ligante vc0101 foram em general mais potentes do que terapia de cuidado padrão de cisplatina e ADCs com cargas de ligante vc6780.
Tabela 16. Eficácia de ADCs anti-Notch-vc0101 em xenoenxertos gástricos N87.
N87 Xenoenxertos Gástricos, volume do tumor (mm3 ± SEM) huNeg-8.8- Cisplat PBS hu28-vc0101 hu75-vc0101 vc0101 ina Dose 0 1 3 5 1 3 5 1 3 5 5 mg/kg DIA 0 32 327 321 326 321 321 324 320 327 324 1 328 ±11 ±21 ±13 ±8 ±9 ±19 ±11 ±18 ±11 ±1 ±20 6 DIA 4 42 526 369 339 344 392 362 315 437 478 3 414 ±19 ±18 ±11 ±14 ±15 ±35 ±15 ±34 ±19 ±3 ±27 2
DIA 7 51
706 429 302 272 417 303 246 584 625 2 520
±27 ±43 ±10 ±7 ±25 ±21 ±12 ±54 ±34 ±3 ±26
4
DIA 50
11 854 304 182 152 331 174 156 702 716 1 501
±36 ±30 ±14 ±13 ±21 ±14 ±10 ±60 ±53 ±3 ±29
8
DIA 54
14 887 282 191 155 305 172 151 822 823 9 637
±45 ±25 ±5 ±13 ±17 ±10 ±7 ±65 ±42 ±3 ±31
7
DIA 49 104 18 263 161 138 267 151 128 823 789 1 - 5 ±24 ±7 ±11 ±17 ±10 ±6 ±73 ±33 ±5 ±68 1
DIA 41 107 21 227 123 110 218 130 115 857 785 3 2 - ±23 ±15 ±9 ±23 ±5 ±7 ±78 ±35 ±5 ±76 0
DIA 130 34 895 26 3 205 108 69 185 92 82 825 3 - ±12 ±14 ±32 ±16 ±16 ±24 ±14 ±10 ±62 ±6 6 0 3
DIA 127 41 957 29 6 180 99 50 211 104 75 879 1 ±12 ±13 ±30 ±14 ±13 ±37 ±16 ±12 ±72 ±8 - 6 9 9
DIA 148 41 988 33 0 211 106 43 251 91 73 966 1 ±18 ±18 ±43 ±17 ±14 ±53 ±18 ±12 ±98 ±8 - 0 3 9
DIA 48 884 36 215 122 52 272 86 85 1023 1 - ±14 - ±42 ±22 ±16 ±59 ±18 ±9 ±106 ±8 3 6
DIA 53 937 39 - 261 128 45 304 59 72 1142 5 ±16 ±54 ±23 ±14 ±72 ±16 ±13 ±121 ±1 - 7 28
DIA 100 59
42 - 283 149 34 314 81 74 8 1240 6
±52 ±25 ±15 ±73 ±22 ±13 ±17 ±143 ±1 -
9 19
DIA 106 62
47 262 105 25 334 80 36 1 1380 1 - - ±64 ±19 ±14 ±95 ±25 ±8 ±21 ±153 ±1
0 37
DIA 75 53 302 104 29 393 86 69 7 - - - - ±75 ±30 ±16 ±115 ±24 ±13 ±1 89 DIA 69 62 415 116 33 463 106 50 0 - - - - ±111 ±47 ±18 ±155 ±35 ±15 ±1 22 DIA 85 70 521 139 58 658 148 76 2 - - - - ±135 ±54 ±30 ±241 ±54 ±22 ±1 50 Tabela 17. Eficácia de ADCs anti-Notch-vc6780 em xenoenxertos gástricos N87.
N87 Xenoenxertos gástricos, volume do tumor (mm3 ± SEM) huNeg8.8- PBS hu28-vc6780 hu75-vc6780 vc6780 Dose 0 10 3 1 10 3 1 10 3 mg/kg DIA 0 345 350 349 348 349 351 359 356 344 ±14 ±14 ±10 ±13 ±8 ±20 ±16 ±20 ±14 DIA 4 600 434 552 560 468 545 552 581 537 ±16 ±24 ±24 ±26 ±18 ±37 ±40 ±60 ±36 DIA 8 675 379 545 592 351 511 568 605 670 ±20 ±12 ±37 ±44 ±24 ±31 ±62 ±67 ±45
DIA 763 315 511 617 316 544 591 636 706
11 ±54 ±18 ±25 ±48 ±25 ±43 ±63 ±79 ±38
DIA 886 292 564 782 269 558 666 775 917
14 ±72 ±24 ±29 ±60 ±27 ±36 ±77 ±117 ±36
DIA 997 199 479 797 224 494 642 665 958
18 ±93 ±18 ±29 ±88 ±26 ±41 ±90 ±112 ±57
DIA 1041 194 499 839 192 534 710 637 1002
21 ±107 ±20 ±34 ±93 ±19 ±41 ±117 ±119 ±59
DIA 1151 181 588 878 227 628 748 647 1075
±144 ±21 ±40 ±105 ±32 ±58 ±138 ±134 ±82
DIA 1200 204 672 904 244 645 763 674 1148
28 ±155 ±16 ±48 ±123 ±35 ±57 ±145 ±146 ±77
DIA 1481 196 786 1043 267 730 991 733 1290
33 ±206 ±27 ±65 ±152 ±52 ±66 ±239 ±195 ±128
DIA 189 827 1108 300 850 817 1265
36 - ±37 ±69 ±185 ±64 ±74 - ±222 ±111
DIA 228 847 1204 323 881 880 1429
39 - ±44 ±77 ±209 ±69 ±88 - ±247 ±121
DIA 257 959 350 1020 797
42 - ±60 ±81 - ±78 ±99 - ±244 -
DIA 253 1018 380 1097 874
46 - ±59 ±94 - ±78 ±129 - ±267 -
DIA 253 1111 415 1162
50 - ±67 ±95 - ±77 ±134 - - -
DIA 298 1279 504 1331
56 - ±85 ±108 - ±111 ±187 - - -
DIA 345 1368 581 63 - ±93 ±133 - ±121 - - - - DIA 376 1483 726 70 - ±117 ±154 - ±163 - - - - DIA 388 797 77 - ±123 - - ±184 - - - -
[01141] O modelo gástrico N87 foi também doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo PBS, ADC anti-Notch quimérico de rato-humano e ADCs huNeg-8.8 de controle, a uma dose de 5mg/kg como provido na Figure 8D. Os dados demonstram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano com ligantes não cliváveis (mc) e cliváveis (vc) e várias combinações de carga inibiram crescimento de xenoenxertos gástricos N87. Adicionalmente, os dados mostram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano inibiu crescimento do tumor mais potencialmente do que ADCs huNeg-
8.8 de controle. Adicionalmente, os dados demonstram que ADC anti-Notch quimérico de rato-humano com cargas de ligante vc0101 foi mais potente do que os outros ADCs anti-Notch testados.
[01142] O modelo gástrico N87 foi também doseado intravenosamente Q4dx4 com veículo PBS e ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano ch28-mc0131, ch75- mc0131, ch28-m(H2O)c-0131 e ch75-m(H2O)c-0131 a uma dose de 5mg/kg como provido na Figure 8D. Os dados demonstram que ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano com cargas de ligante mc0131 and m(H2O)c-0131 inibiram crescimento de xenoenxertos gástricos N87. Adicionalmente, os dados mostram que ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano com cargas de ligante m(H2O)c-0131 foram mais potentes do que os ADCs anti-Notch quiméricos de rato-humano com cargas de ligante mc0131.
[01143] Tabela 18A - Compostos selecionados (peptídeos citotóxicos com ligantes) da invenção
Quantidade Método de Método de Ligante-Carga # em mg preparação purificação (Rendimento)
Procedimento mcValCitPABC-#34 Método D 4,7 (12%) geral E
Procedimento MalPeg3C2-#41 Método C 36 (28%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#42 Método C 125 (88%) geral D
Procedimento mc-#44 Método C 5,9 (25%) geral D
Procedimento MalPeg3C2-#44 Método C 10 (28%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#44 Método C 1,8 (6%) geral D
Procedimento MalValCitPABC-#44 Método F 4 (10%) geral E
Procedimento mc-#45 Método C 12,8 (53 %) geral D
Procedimento MalPeg3C2-#45 Método C 7,5 (28%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#45 Método E1* 13,6 (45%) geral D
Procedimento Método C & mcValCitPABC-#45 5,8 (15%) geral E Método E1
Procedimento mcValCitPABC-#54 Método D 33 (36%) geral E
Procedimento mc-#69 Método C 30,2 (24%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#69 Método C 3,6 (13%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#69 Método I 51 (9%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#70 Método D 6,9 (12%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#75 Método H 5,3 (14%) geral E
Procedimento mc-#79 Método E 5,6 (19%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#79 Método D 5,5 (10%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#92 Método E 9,5 (26%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#112 Método C 11,8 (21%) geral E
Procedimento mv-#115 Método J 1,4 (3,3%) geral D mc-#115 - Método L 124 (11%)
Procedimento mb-#115 - - geral D
Procedimento me-#115 - - geral D
Procedimento mcValCitPABC-#115 Método K 4,9 (12%) geral E
Procedimento mc-#51 Método E1 5,5 (42 %) geral D
Procedimento mc-#47 Método E1 8,4 (46%) geral D
Procedimento mc-#54 Método E1 12,9 (65%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#47 Método E1 3,3 (20%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#26 Método E1 2,3 (20%) geral E
Procedimento mc-#26 Método E1 5,4 (10%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#42 Método E1 10,8 (38%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#36 Método E1 12,6 (32%) geral E
Procedimento mc-#42 Método E1 7,1 (83%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#54 Método J 44 (67%) geral N
Procedimento MalPeg3C2-#54 Método J 19 (69%) geral D
Procedimento mcValCitPABCAmPeg6C2-#54 Método J 12 (42%) geral O
Procedimento mcValCitPABCAmPeg3C2-#54 Método J 12,4 (30%) geral O
Procedimento MalPeg3C2-#47 Método J* 19 (62%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#47 Método J 50 (77%) geral N
Procedimento mcValCitPABCAmPeg3C2-#47 Método J 6,4 (18%) geral O
Procedimento mcValCitPABCAmPeg6C2-#47 Método J 18 (50%) geral O
Procedimento MalPeg3C2-#42 Método J 22 (70%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#42 Método J 53 (75%) geral N
Procedimento mcValCitPABCAmPeg6C2-#42 Método J 15,4 (43%) geral O
Procedimento mcValCitPABCAmPeg3C2-#42 Método J* 12 (26%) geral O
Procedimento MalPeg3C2-#26 Método J* 13,8 (51%) geral D
Procedimento mc-#41 Método J* 9,6 (38%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#26 Método J 59 (87%) geral N
Procedimento mcValCitPABCAmPeg3C2-#26 Método J 23,4 (45%) geral O
Procedimento MalPeg3C2ValCitPABC-#26 Método J 16 (42%) geral P
Procedimento mcValCitPABCAmPeg6C2-#26 Método J 15 (38%) geral O
Procedimento mc-#36 Método J* 26 (80%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#54 Método J 27 (67%) geral D
Procedimento MalPeg3C2ValCitPABC-#47 Método J 17 (49%) geral P
Procedimento MalPeg3C2-#36 Método J* 9,2 (33%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#47 Método J* 24 (78%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#26 Método J* 29 (75%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#36 Método J 18 (58%) geral D
Procedimento mcValCitPABCAmPeg3C2-#36 Método J 16 (51%) geral O
Procedimento AmPeg6C2-#36 Método J 51 (78%) geral N
Procedimento mcValCitPABC-#60 Método J 1,9 (4,3%) geral E
Procedimento mcValCitPABCAmPeg6C2-#36 Método J 11,6 (35%) geral O
Procedimento mcValCitPABCAmPeg3C2-#41 Método J 5,7 (26%) geral O
Procedimento MalPeg6C2-#60 Método J 24 (75%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#60 Método J 31 (80%) geral N
Procedimento MalPeg3C2-#60 Método J 17,3 (58%) geral D
Método J com Procedimento MalPeg6C2-#41 AcOH como 11 (28%) geral D modificador
Procedimento AmPeg6C2-#66 Método J 5 (10%) geral N
Procedimento mcValCitPABCAmPeg6C2-#60 Método J 12 (34%) geral O
Procedimento mc-#70 Método J* 11,2 (46%) geral D
Procedimento 2AcAmPeg6C2-#66 Método J 8 (60%) geral Q
Método J com Procedimento mc-#66 AcOH como 8,2 (32%) geral D modificador
Procedimento mcValCitPABC-#88 Método J 7,9 (45%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#88 Método J 7,5 (39%) geral E
Procedimento mc-#92 Método F 15 (66%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#44 Método F 1,6 (4%) geral E
Procedimento Método H sem mc-#108 8,8 (37%) geral D modificador
Procedimento mcValCitPABC-#108 Método F 6,1 (14%) geral E
Procedimento NHSCOPeg2C2ValCitPABC-#66 Método F* 6,8 (32%) geral X2
Procedimento mcValCitPABC-#98 Método J* 4,8 (11%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#95 Método J* 13 (28%) geral E
Procedimento MalPeg3C2-#69 Método K 12,8 (35%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#69 Método J* 71 (69%) geral N
Procedimento mcValCitPABC-#84 Método J* 4,9 (11%) geral E
Procedimento AmCapValCitPABC-#54 Método K* 97 (53%) geral R
Procedimento mcValCitPABC-#226 Método J* 7,1 (16%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#117 Método J* 15,8 (36%) geral E
Procedimento MalPeg6C2-#98 Método I* 7,4 (22%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#118 Método J* 11,7 (29%) geral E
Procedimento mcValCitPABC-#80 Método J* 3,8 (12%) geral E
Procedimento MalPeg6C2-#118 Método J* 11 (4,5%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#230 Método H 2,8 (8%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#232 Método J* 13,6 (29%) geral E
Procedimento mc-#117 Método J* 9,5 (40%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#117 Método K* 2,3 (8%) geral D
Procedimento mv-#69 Método J* 22 (49%) geral D
Procedimento mb-#69 Método J* 12 (28%) geral D
Procedimento AmPeg6C2-#234 Método J* 16 (52%) geral N
Procedimento AmPeg6C2-#235 Método J* 16,5 (70%) geral N
Procedimento mc-#118 Método J* 41 (38%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#123 Método J* 85 (40%) geral D
Procedimento cromatografia de mc-#226 290 (40%) geral D sílica
Procedimento me-#118 Método J* 16,2 (42%) geral D
Procedimento mc-#131 Método J* 16,3 (51%) geral D
Procedimento mb-#118 Método J* 7,9 (23%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#134 Método J* 17 (33%) geral E
Procedimento mc-#145 Método K 6 (20%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#126 Método J* 16,4 (26%) geral D
Procedimento mc-#126 Método K* 16,3 (32%) geral D
Procedimento mv-#118 Método J* 11,7 (34%) geral D
Procedimento mc-#172 Método J* 10 (56%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#226 Método K* 15 (10%) geral D
Procedimento MalPeg6C2-#145 Método K 1,8 (3,7%) geral D
Procedimento Método H* sem mc-#162 1,2 (3,1%) geral D modificador
Procedimento mc-#163 Método K* 9,9 (26%) geral D
Procedimento mcValCitPABC-#231 Método J* 0,2 (4%) geral E
Procedimento cromatografia de MalPeg6C2-#238 240 (77%) geral D sílica
Cromatografia Procedimento MalPeg6C2-#239 C18 de pressão 104 (39%) geral D média
Procedimento cromatografia de mc-#123 345 (quant,) geral D sílica
Procedimento MalC6-#54 Método J* 16,3 (30%) geral S
Procedimento mc-#231 Método J* 10 (60%) geral D
Procedimento MalC6-#118 Método J* 5,3 (10%) geral S
Procedimento cromatografia de mcValCitPABC-#123 179 (60%) geral E sílica
Procedimento mc-#237 Método J* 12,6 (47%) geral D
Procedimento mc-#158 Método J* 7,1 (28%) geral D
Procedimento MalC6Am-#151 Método J* 18,4 (86%) geral D
Método J* AcOH Procedimento PFPCOPeg2C2 ValCitPABC-#54 como 70 (68%) geral X3 modificador cromatografia Procedimento mcValCitPABC-#154 C18 de pressão 10 (19%) geral E média
Procedimento MalC6Am-#153 Método K* 18,7 (47%) geral D
Procedimento PFPCOPeg2C2AmPeg2C2-#69 Método R* 40 (64%) geral X4 cromatografia Procedimento mcValCitPABC-#246 C18 de pressão 21 (45%) geral E média
Procedimento PFPCOPeg2C2AlaAlaAsnPABC-#54 Método R* 16,8 (54%) geral X1
Procedimento PFPCOPeg2C2-#54 Método R* 4,1 (56%) geral V
PFPCOPeg2C2AmPeg2C2PABC- Procedimento Método R* 1,1 (39%) #54 geral W
Procedimento AmPeg6C2-#115 Método J* 100 (48%) geral N
Procedimento PFPCOPeg5C2-#115 Método J* 29 (26%) geral V cromatografia de mcGly-#201 - 25 (16,2%) sílica
Procedimento AzCOC2Ph4AmCOPeg2C2-#54 Método R* 3,5 (52%) geral T
AzCOC2Ph4AmPeg1C1ValCitPABC- Procedimento Método R* 93 (43%) #54 geral U
AzCOC2Ph4AmPeg1C1ValCitPABC- Procedimento Método R* 1,7 (42%) #30 geral U
Procedimento AzCOC2Ph4AmCOPeg2C2-#69 Método R* 88 (62%) geral T
Procedimento AzCOC2Ph4AmCOPeg2C2-#115 Método R* 75 (82%) geral T
Procedimento AcLysValCitPABC-#54 Método J* 86 (40%) geral X5
Tabela 18B - Compostos selecionados (peptídeos citotóxicos com ligantes) da invenção Espectro de massa: LC- MS ou HPLC m/z ligante com carga # observado e Nome IUPAC tempo de retenção em minutos: ESI-
MS N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- (Protocolo M) [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2- : 1380,6 mcValCitPABC-#34 fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- [M+Na+], tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- (12,899 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2- minutos) il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N5-carbamoil-L-ornitinamida
LC-MS:
1031,7 N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
[M+H+], pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-N-
1054,8 metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-
[M+Na+] (0,88 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- MalPeg3C2-#41 minutos); feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-
HPLC tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-
(Protocolo D) metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
: 10,559 valinamida minutos
LC-MS:
1178,2 N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
[M+H+], 21-oxo-3,6,9,12,15,18-
1197,4 hexaoxahenicosan-21-il]-N-metil-L-valil-
[M+Na+] (3,50 N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- MalPeg6C2-#42 minutos); [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-
HPLC oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-
(Protocolo Q) tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
: 25,235 oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida minutos
LC-MS: 913,7 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- [M+H+] (0,85 il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- minutos); {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- HRMS: Calc: mc-#44 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- 913,5103 tioxopropil]pirrolidiN-1-il}-3-metóxi-5- [M+H+], metil-1-oxoheptaN-4-il]-N-metil-L- Obsd: valinamida 913,5103,
LC-MS:
1003,8
[M+H+](0,82 N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
minutos); pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-2-
HPLC metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-
(Protocolo A) [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- MalPeg3C2-#44 : 1003,5 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-
[M+H+], tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-
1026,4 metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
[M+Na+] valinamida
(9,095 minutos)
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)- 21-oxo-3,6,9,12,15,18- LC-MS: hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N- 1135,8 [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- MalPeg6C2-#44 [M+H+] (0,83 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2- minutos) metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil- L-valinamida LC-MS: 1318,9 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- [M+H+] (0,89 il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- minutos); 11-[(2S)-butaN-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
HPLC [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- (Protocolo A) MalValCitPABC-#44 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- : 1319,6 tioxopropil]pirrolidiN-1-il}-2-oxoetil)- [M+H+] , 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propaN-2- 1342,6 il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- [M+Na+] il]fenil}-N5-carbamoil-L-ornitinamida (9,132 minutos)
LC-MS: 927,7 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- [M+H+] (0,92 il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3- minutos); metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- HRMS: Calc: mc-#45 {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropaN-2- 927,5260 il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidiN-1- [M+H+] , il}-5-metil-1-oxoheptaN-4-il]-N-metil-L- Obsd: valinamida 927,5259,
N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-2- LC-MS: metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 1017,8 MalPeg3C2-#45 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1- [M+H+] (0,90 metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2- minutos); metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-
1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
LC-MS:
1149,9
[M+H+] (0,90 N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
minutos); 21-oxo-3,6,9,12,15,18-
HPLC hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N-
(Protocolo A [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- MalPeg6C2-#45 at 45 oC) 1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- : 1150,5 fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- [M+H+], tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- 1171,5[M+Na oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida + ] (9,788 minutos)
LC-MS: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
1332,8 il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
[M+H+] (1,86 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
minutos); [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-
HPLC oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- mcValCitPABC-#45 (Protocolo A tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-
at 45 oC) 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-
: 1333,6 il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-
[M+H+] (9,737 il]fenil}-N5-carbamoil-L-ornitinamida minutos)
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
(Protocolo A [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-
at 45 oC) 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- mcValCitPABC-#54 : 1342,6 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-
[M+H+] (9,114 oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-
minutos), (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
triazatetradec-1-il]fenil}-N5-carbamoil-L-
ornitinamida
LC-MS: 897,7 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- [M+H+], 919,7 il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- (0,81 {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- minutos); feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- HPLC oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- mc-#69 (Protocolo A 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida at 45 oC) : 897,5 [M+H+] (9,058 minutos) N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
HPLC 21-oxo-3,6,9,12,15,18- (Protocolo A hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N- at 45 oC) [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- MalPeg6C2-#69 : 1120,6 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2- [M+H+], metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- 1142,5 (9,076 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- minutos) valinamida N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
HPLC pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-N- (ProtocolM) : metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- 1326,6 mcValCitPABC-#69 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- [M+Na+] feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- (11,962 oxopropil]pirrolidiN-1-il}-3-metóxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptaN-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
HPLC 11-[(2S)-butaN-2-il]-12-(2-{(2S)-2- (Protocolo A [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1- at 45 oC) mcValCitPABC-#70 oxo-3-fenilpropaN-2-il]amino}-2-metil-3- : 1317,6 oxopropil]pirrolidiN-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- [M+H+] (9,282 trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propaN-2-il)-2,13- minutos) dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N5- carbamoil-L-ornitinamida LC-MS: 1273,9 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- [M+H+] (0,82 il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-{4- minutos); [({[3-({(2S)-1-[{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-
HPLC [(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- mcValCitPABC-#75 (Protocolo A 3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]- at 45 5-metil-1-oxoheptan-4-il}(metil)amino]-3- o C): 1273,6 metil-1-oxobutan-2-il}carbamoil)oxetan-3- [M+H+], il]carbamoil}oxi)metil]fenil}-L-ornitinamida (8,814 minutos)
HPLC N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- (Protocolo A il)hexanoil]-N,2-dimetilalanil-N- at 45 oC) [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- : 941,5 mc-#79 1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- [M+H+], 963,4 fenilpropaN-2-il]amino}-2-metil-3- [M+Na+] tioxopropil]pirrolidiN-1-il}-5-metil-1- (10,444 oxoheptaN-4-il]-N-metil-L-valinamida minutos)
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
(Protocolo A) [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-
: 1346,6 oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- mcValCitPABC-#79 [M+H+], tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-
(9,807 4,5,5,10-tetrametil-3,6,9-trioxo-8-
minutos) (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
triazatetradec-1-il]fenil}-N5-carbamoil-L-
ornitinamida
LC-MS: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- 1282,6 il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- [M+H+] (0,79 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- minutos); [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-
HPLC mcValCitPABC-#92 (quinolin-6-ilamino)propil]pirrolidin-1-il}-2- (Protocolo A oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- at 45 (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- o C): 1282,6 triazatetradec-1-il]fenil}-N5-carbamoil-L- + [M+H ] (7,953 ornitinamida minutos) N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- (Protocolo M) 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- : 1288,6 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- [M+H+] , mcValCitPABC-#112 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- 1310,6 oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- [M+Na+] trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13- (11,757 dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N5- minutos) carbamoil-L-ornitinamida HPLC N-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- (Protocolo A il)pentanoil]-N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)- at 45 °C): 4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- mv-#115 m/z 897,5 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+], oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- (9,149 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- minutos) valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)- (Protocolo A 4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- at 45 °C;) m/z mc-#115 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- 911,5 [M+H+], oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- (9,676 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- minutos) valinamida N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)butanoil]-N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)- 4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- mb-#115 - feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida N-[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)heptanoil]-N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)- 4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- me-#115 - feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)- 1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- (Protocolo M): [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- m/z 1317,7 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- mcValCitPABC-#115 [M+H+] oxopropil]pirro
(12,261 lidin-1-il}-2-oxoetil)-4,5,5,10-tetrametil-
minutos) 3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-
4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-
carbamoil-L-ornitinamida
N~2~-[(1-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
HPLC pirrol-1-
(Protocolo M): il)hexanoil]amino}ciclopropil)carbonil]-N- m/z 934,5 [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- mc-#51 [M+H+] 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-
(11,94 (1,3-tiazol-2-il)etil]
minutos) amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N~2~-[(1-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
HPLC pirrol-1-
(Protocolo M): il)hexanoil]amino}ciclopentil)carbonil]-N- m/z 962,5 [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- mc-#47 [M+H+] 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-
(13,014 (1,3-tiazol-2-il)etil]
minutos) amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- HPLC il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3- (Protocolo M): metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- mc-#54 m/z 936,5 metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-
[M+H+] (9,22 2-il)etil]amino}propil]pirroli minutos) din-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-
L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-
HPLC ({[(1-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-
(Protocolo M): {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- m/z 1368,6 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il mcValCitPABC-#47 [M+H+] )etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
(13,157 oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-
minutos) oxobutan-2-
il]carbamoil}ciclopentil)carbamoil]oxi}meti l)fenil]-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
HPLC [(5S,8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-
(Protocolo M): (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- m/z 1386,6 {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}- mcValCitPABC-#26 [M+H+] 3-t
(16,21 hioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-4,10-
minutos) dimetil-3,6,9-trioxo-5,8-di(propan-2-il)-
2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-
il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)- (Protocolo 3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- A*): m/z mc-#26 metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- 980,5 [M+H+] il)etil]amino}-3-tioxopropil]py (10,628 rrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- minutos) metil-L-valinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
HPLC [(5S,8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (Protocolo (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1- A*): m/z metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2- mcValCitPABC-#42 1361,7 metil-3- [M+H+] tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-4,10- (9,831 dimetil-3,6,9-trioxo-5,8-di(propan-2-il)- minutos) 2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
HPLC [(5S,8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (Protocolo {2-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- A*): m/z [(2-feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin- mcValCitPABC-#36 1324,6 1-y [M+Na+23] l]-2-oxoetil}-4,10-dimetil-3,6,9-trioxo-5,8- (9,987 di(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- minutos) triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil- L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)- (Protocolo 3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- A*): m/z mc-#42 {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2- 955,5 [M+H+] il]amino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1- (10,679 il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- minutos) valinamida N-(21-amino-4,7,10,13,16,19- LC-MS hexaoxahenicosan-1-oil)-2-metilalanil-N- (Protocolo H): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- AmPeg6C2-#54 m/z 1078,7 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- [M+H+] (2,56 (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- minutos) 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-2- LC-MS metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- (Protocolo H): {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- MalPeg3C2-#54 m/z 1026,6 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- [M+H+] (3,54 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- minutos) metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(30S,33S,34R)-
33-[(2S)-butan-2-il]-34-(2-{(2S)-2- LC-MS [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino} m/z 1677,9 6C2-#54 propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-27,27,32- [M+H+] (3,48 trimetil-3,25,28,31-tetraoxo-30-(propan- minutos) 2-il)-2,7,10,13,16,19,22,35-octaoxa-
4,26,29,32-tetraazahexatriacont-1-
il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(21S,24S,25R)-
24-[(2S)-butan-2-il]-25-(2-{(2S)-2- LC-MS [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino} m/z 1545,8 3C2-#54 propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-18,18,23- [M+H+] (3,48 trimetil-3,16,19,22-tetraoxo-21-(propan- minutos) 2-il)-2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-
tetraazaheptacos-1-il]fenil}-N~5~-
carbamoil-L-ornitinamida
N~2~-[(1-{[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-
dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]amino}ciclop (Protocolo entil)carbonil]-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- Q1): m/z MalPeg3C2-#47 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- 1052,7 3-{[(1S)-2-ph [M+H+] (0,88 enil-1-(1,3-tiazol-2- minutos) il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-
1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
1-amino-N-(1-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-
metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- LC-MS metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- (Protocolo H): 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- AmPeg6C2-#47 m/z 1104,88 metil-1-oxoheptan-4-il](metil)ami [M+H+] (2,65 no}-3-metil-1-oxobutan-2- minutos) il]carbamoil}ciclopentil)-3,6,9,12,15,18-
hexaoxahenicosan-21-amida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-(4- {16-[(1-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- LC-MS 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- m/z 1571,8 3C2-#47 1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- [M+H+] (3,56 oxobutan-2- minutos) il]carbamoil}ciclopentil)amino]-3,16- dioxo-2,7,10,13-tetraoxa-4-azahexadec- 1-il}fenil)-L-ornithin amida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-(4- {25-[(1-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-
HPLC 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- m/z 1703,8 6C2-#47 1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- [M+H+] (3,57 oxobutan-2- minutos) il]carbamoil}ciclopentil)amino]-3,25- dioxo-2,7,10,13,16,19,22-heptaoxa-4- azapentacos-1-il}fenil)- L-ornitinamida
N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-N- LC-MS metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- (Protocolo H): {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1- MalPeg3C2-#42 m/z 1045,7 metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]a [M+H+] (3,92 mino}-2-metil-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}- minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
LC-MS hexaoxahenicosan-1-oil)-N-metil-L-valil-
(Protocolo H): N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-
AmPeg6C2-#42 m/z 1097,7 [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1- [M+H+] (2,80 oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-
minutos) tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
[(27S,30S,33S,34R)-33-[(2S)-butan-2-il]-
34-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)- LC-MS 1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg 2-metil- m/z 1696,8 6C2-#42 3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- [M+H+] (3,73 26,32-dimetil-3,25,28,31-tetraoxo-27,30- minutos) di(propan-2-il)-2,7,10,13,16,19,22,35-
octaoxa-4,26,29,32-tetraazahexatriacont-
1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornithi namida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4- [(18S,21S,24S,25R)-24-[(2S)-butan-2-il]- LC-MS 25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)- (Protocolo H): 1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}- mcValCitPABCAmPeg m/z 1564,8 2-metil- 3C2-#42 [M+H+] (3,70 3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- minutos) 17,23-dimetil-3,16,19,22-tetraoxo-18,21- di(propan-2-il)-2,7,10,13,26-pentaoxa- 4,17,20,23-tetraazaheptacos-1-il]fenil}- N~5~-carbamoil-L-ornitinamida N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-N- LC-MS metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- (Protocolo H): {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- MalPeg3C2-#26 m/z 1070,6 {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il [M+H+] (3,94 )etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-il}-5- minutos) metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)- (Protocolo A): 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- m/z 941,5 mc-#41 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-meth (9,883 oxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- minutos) valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
hexaoxahenicosan-1-oil)-N-metil-L-valil- LC-MS N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- (Protocolo H): [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2- AmPeg6C2-#26 m/z 1122,6 fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- [M+H+] (2,76 tioxopropil]pyr minutos) rolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-
metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
[(18S,21S,24S,25R)-24-[(2S)-butan-2-il]-
LC-MS 25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-
(Protocolo H): 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- mcValCitPABCAmPeg m/z 1588,0 il)etil]amino}-3 3C2-#26 [M+H+] (3,74 -tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-
minutos) 17,23-dimetil-3,16,19,22-tetraoxo-18,21-
di(propan-2-il)-2,7,10,13,26-pentaoxa-
4,17,20,23-tetraazaheptacos-1-il]fenil}-
N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-L-
valil-N-{4-[(5S,8S,11S,12R)-11-[(2S)- LC-MS butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- (Protocolo H): MalPeg3C2ValCitPAB metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1, m/z 1476,8 C-#26 3-tiazol-2-il)etil]amino}-3- [M+H+] (3,81 tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-4,10- minutos) dimetil-3,6,9-trioxo-5,8-di(propan-2-il)-
2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-
il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
[(27S,30S,33S,34R)-33-[(2S)-butan-2-il]-
34-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- LC-MS 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg il)etil]amino}-3 m/z 1721,9 6C2-#26 -tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- [M+H+] (3,75 26,32-dimetil-3,25,28,31-tetraoxo-27,30- minutos) di(propan-2-il)-2,7,10,13,16,19,22,35-
octaoxa-4,26,29,32-tetraazahexatriacont-
1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornithin amida
LC-MS N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- (Protocolo il)hexanoil]-N-metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)- Q1): m/z 3-metóxi-1-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2- mc-#36 897,7 [M+H+] metil-3-[(2-feniletil)amino]-3-
(1,00 tioxopropil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-
minutos) oxoheptan-4-il}-N-metil-L-valinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18-
LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N-
(Protocolo H): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-
MalPeg6C2-#54 m/z 1158,7 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- [M+H+] (3,55 (1,3-th minutos) iazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-
5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-L-
valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(1-{[(2S)-1-
LC-MS {[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-
(Protocolo H): [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 MalPeg3C2ValCitPAB m/z 1458,7 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- C-#47 [M+H+] (3,56 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-
minutos) 1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-
oxobutan-2-
il]carbamoil}ciclopentil)carbamoil]oxi}meti l)fenil]-L-ornitinamida
N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- LC-MS pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-N- (Protocolo H): metil-L-valil-N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- MalPeg3C2-#36 m/z 987,7 [(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-[(2-
[M+H+] (3,97 feniletil)amino]-3-tioxoprop minutos) il}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-
N-metil-L-valinamida
1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-
(1-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-
LC-MS {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-
(Protocolo H): 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-
MalPeg6C2-#47 m/z 1184,7 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- [M+H+] (3,67 1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-
minutos) oxobutan-2-il]carbamoil}ciclopentil)-
3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosan-21-
amida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18-
LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-N-metil-L-valil-
(Protocolo H): N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-
MalPeg6C2-#26 m/z 1202,7 [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-
[M+H+] (3,93 fenil-1-(1,3-tiazo minutos) l-2-il)etil]amino}-3-tioxopropil]pirrolidin-1-
il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18- LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-N-metil-L-valil- (Protocolo H): N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2- MalPeg6C2-#36 m/z 1118,8 {(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-[(2- [M-H] (3,96 feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1- minutos) il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-
valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
[(18S,21S,24S,25R)-24-[(2S)-butan-2-il]-
LC-MS 25-{2-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-
(Protocolo H): 3-[(2-feniletil)amino]-3- mcValCitPABCAmPeg m/z 1506,8 tioxopropil}pirrolidin-1 3C2-#36 [M+H+] (3,76 -il]-2-oxoetil}-17,23-dimetil-3,16,19,22-
minutos) tetraoxo-18,21-di(propan-2-il)-
2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-
tetraazaheptacos-1-il]fenil}-N~5~-
carbamoil-L-ornitinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
LC-MS hexaoxahenicosan-1-oil)-N-metil-L-valil-
(Protocolo H): N-{(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-[(2S)-2-
AmPeg6C2-#36 m/z 1039,7 {(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-[(2-
[M+H+] (2,68 feniletil)amino]-3-tioxopropil}pirrolidin-1-
minutos) il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-L-
valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- (Protocolo M): [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1- m/z 1307,6 mcValCitPABC-#60 fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrol [M+H+] idin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- (12,696 trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- minutos) triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil- L-ornitinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4- [(27S,30S,33S,34R)-33-[(2S)-butan-2-il]- LC-MS 34-{2-[(2S)-2-{(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- (Protocolo H): 3-[(2-feniletil)amino]-3- mcValCitPABCAmPeg m/z 1638,0 tioxopropil}pirrolidin-1 6C2-#36 [M+H+] (3,77 -il]-2-oxoetil}-26,32-dimetil-3,25,28,31- minutos) tetraoxo-27,30-di(propan-2-il)- 2,7,10,13,16,19,22,35-octaoxa- 4,26,29,32-tetraazahexatriacont-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-
[(18S,21S,24S,25R)-24-[(2S)-butan-2-il]- LC-MS 25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- (Protocolo H): carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2- mcValCitPABCAmPeg m/z 1550,9 metil-3-tioxoprop 3C2-#41 [M+H+] (3,53 il]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-17,23-dimetil-
minutos) 3,16,19,22-tetraoxo-18,21-di(propan-2-
il)-2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-
tetraazaheptacos-1-il]fenil}-N~5~-
carbamoil-L-ornitinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18- LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N- (Protocolo H): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- MalPeg6C2-#60 m/z 1101,8 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1- [M+H+] (3,66 fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidi minutos) n-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-
L-valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
LC-MS hexaoxahenicosan-1-oil)-2-metilalanil-N-
(Protocolo H): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-
AmPeg6C2-#60 m/z 1021,7 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1-
[M+H+] (2,57 fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidi minutos) n-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-
L-valinamida
N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-2- LC-MS metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- (Protocolo H): {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- MalPeg3C2-#60 m/z 969,7 3-{[(1- [M+H+] (3,65 fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirrolidi minutos) n-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-
L-valinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18-
LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-N-metil-L-valil-
(Protocolo H): N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-
MalPeg6C2-#41 m/z 1163,0 {[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-
[M-H] (3,70 metóxi-2-metil-3 minutos) -tioxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-
metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
LC-MS hexaoxahenicosan-1-oil)-2-metilalanil-N-
(Protocolo [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- Q1): m/z (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1- AmPeg6C2-#66 1009,8 metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-
[M+H+] (0,72 3-
minutos) metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-
L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(30S,33S,34R)- 33-[(2S)-butan-2-il]-34-(2-{(2S)-2- LC-MS [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1- (Protocolo H): mcValCitPABCAmPeg fenilciclopropil)metil]amino}propil]pirro m/z 1621,0 6C2-#60 lidin-1-il}-2-oxoetil)-27,27,32-trimetil- [M+H+] (3,55 3,25,28,31-tetraoxo-30-(propan-2-il)- minutos) 2,7,10,13,16,19,22,35-octaoxa- 4,26,29,32-tetraazahexatriacont-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3- (Protocolo M): metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- m/z 911,5 mc-#70 {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2- [M+H+] il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrol (11,847 idin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- minutos) metil-L-valinamida N-(24-bromo-23-oxo-4,7,10,13,16,19- LC-MS hexaoxa-22-azatetracosan-1-oil)-2- (Protocolo metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- Q1): m/z [(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6-trien-1- 2AcAmPeg6C2-#66 1129,8 il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] (0,85 oxopropil]pirrol minutos) idin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida
LC-MS N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- (Protocolo il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- Q1): m/z {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6- mc-#66 867,7 [M+H+] trien-1-il)etil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-
(0,90 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-
minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
LC-MS 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
(Protocolo [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-
Q1): m/z 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- mcValCitPABC-#88 1355,9 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-
[M+H+] (0,87 oxoetil)-4,5,5,10-tetrametil-3,6,9-trioxo-8-
minutos) (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-
L-ornitinamida
N-{6-[(bromoacetil)amino]hexanoil}-L-
valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan- LC-MS 2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2- (Protocolo (ciclohepta-2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1- Q1): m/z mcValCitPABC-#88 metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}- 1314,9 2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- [M+H+] (0,91 (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- minutos) triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-
L-ornitinamida
LC-MS N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- (Protocolo il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3- Q1): m/z metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- mc-#92 876,7 [M+H+] metil-3-oxo-3-(quinolin-6-
(0,75 ilamino)propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
minutos) oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
(Protocolo A): [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- m/z 1318,6 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- mcValCitPABC-#44 [M+H+] tioxopropil]pi
(9,174 rrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-
minutos) 3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-
4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-
carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-
(Protocolo A): {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)-(7S)- m/z 909,5 biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7- mc-#108 [M+H+] il(carboxi)metil]amino}-1-metóxi-2-metil-
(9,063 3-oxoprop minutos) il]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- HPLC 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)-(7S)- (Protocolo M): biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7- m/z 1315,7 il(carboxi)metil]amino}-1-metóxi-2-metil- mcValCitPABC-#108 [M+H+] 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-11- (11,89 [(2S)-butan-2-il]-5,5,10-trimetil-3,6,9- minutos) trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil- L-ornitinamida N-[3-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3- oxopropoxi}etoxi)propanoil]-L-valil-N-{4-
HPLC [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2- (Protocolo M): {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-2,4,6- NHSCOPeg2C2ValCit m/z 683,3 trien-1-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3- PABC-#66 [M+H+2] oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- (10,03 trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13- minutos) dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}- N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-{4- HPLC [({[(2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi- (Protocolo M): 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- m/z 1368,6 oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol mcValCitPABC-#98 [M+H+] -2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- (12,504 metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3- minutos) metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2- metilpirrolidin-1-il]carbonil}oxi)metil]fenil}- L-ornitinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(9S,12S,13R)- 12-[(2S)-butan-2-il]-13-(2-{(2S)-2- LC-MS [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- (Protocolo Q): 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- mcValCitPABC-#95 m/z 1356,5 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- [M+H+] (1,79 oxoetil)-6,6,11-trimetil-3,7,10-trioxo-9- minutos) (propan-2-il)-2,14-dioxa-4,8,11- triazapentadec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida N-[3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-
HPLC pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoil]-2- (Protocolo M): metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- m/z 987,5 MalPeg3C2-#69 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- [M+H+] feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- (10,702 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
hexaoxahenicosan-1-oil)-2-metilalanil-N- LC-MS [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- (Protocolo H): 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2- AmPeg6C2-#69 m/z 1040,1 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- [M+H+] (2,12 5- minutos) metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
LC-MS 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-
(Protocolo Q): [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-{[(1S)-2-
mcValCitPABC-#84 m/z 1371,4 fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}-3-tio [M+H+] (1,89 xopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-4,5,5,10-
minutos) tetrametil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-
2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-
il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-(6-aminohexanoil)-L-valil-N-{4-
[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-
LC-MS {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-
(Protocolo H): 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- AmCapValCitPABC- m/z 1262,3 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- #54 [M+H+] (2,35 oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-
minutos) (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-
L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- LC-MS [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1- (Protocolo Q): oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- mcValCitPABC-#226 m/z 1330,9 oxo [M+H+] (1,77 propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-4,5,5,10- minutos) tetrametil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-
2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-
il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-{4-
LC-MS [({[(2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi-
(Protocolo Q): 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-
mcValCitPABC-#117 m/z 1342,6 metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2- [M+H+] (1,80 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
minutos) oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1-
oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpirrolidin-
1-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-ornitinamida
1-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)- 21-oxo-3,6,9,12,15,18-
HPLC hexaoxahenicosan-21-il]-2-metil-L-prolil- (Protocolo M): N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- m/z 1185,6 MalPeg6C2-#98 [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- [M+H+] 2-fenil-1-(1,3 (11,985 -tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-{4- LC-MS [({[(2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- (Protocolo Q): [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- mcValCitPABC-#118 m/z 1328,6 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopro [M+H+] (1,68 pil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- minutos) oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- oxobutan-2-il]carbamoil}-2-metilpirrolidin- 1-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- HPLC 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- (Protocolo M): [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- m/z 1353,6 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- mcValCitPABC-#80 [M+Na+] tioxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-
(12,751 4,5,5,10-tetrametil-3,6,9-trioxo-8-
minutos) (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-
L-ornitinamida
1-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18-
LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-2-metil-L-prolil-
(Protocolo Q): N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-
MalPeg6C2-#118 m/z 1145,6 {[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1- [M+H+] (1,66 metóxi-2-metil-
minutos) 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-
metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)- 21-oxo-3,6,9,12,15,18-
HPLC hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N- (Protocolo M): [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)- m/z 1146,6 MalPeg6C2-#230 carboxi(1-fenilciclopropil)metil]amino}-1- [M+H+] metóxi-2- (12,071 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-{4- [({[(2R)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-metóxi- LC-MS 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3- (Protocolo Q): oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol mcValCitPABC-#232 m/z 1367,3 -2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- [M+H+] (1,81 metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3- minutos) metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2- metilpirrolidin-1-il]carbonil}oxi)metil]fenil}- L-ornitinamida 1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)hexanoil]-2-metil-L-prolil-N- (Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- mc-#117 m/z 937,4 1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- [M+H+] (1,91 fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3- minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
1-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)- 21-oxo-3,6,9,12,15,18-
HPLC hexaoxahenicosan-21-il]-2-metil-L-prolil- (Protocolo M): N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- m/z 1161,6 MalPeg6C2-#117 [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1- [M+H+] oxo-3-fenilpropan (12,115 -2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- minutos) 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida N-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)pentanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- (Protocolo Q): 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- mv-#69 m/z 883,3 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] (1,57 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
HPLC il)butanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- (Protocolo M): {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- m/z 869,5 mb-#69 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5 (10,874 -metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- minutos) valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
hexaoxahenicosan-1-oil)-2-metilalanil-N- LC-MS {(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S,12S)- (Protocolo 7-benzil-14-[3-cloro-4-(propan-2- Q1): m/z iloxi)fenil]-4-metil-12-[4-(8- AmPeg6C2-#234 1514,3 metilimidazo[1,2-a]piridin [M+H+] (0,76 -2-il)benzil]-5,8,14-trioxo-2,9-dioxa-6,13-
minutos) diazatetradecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3-
metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-N-metil-
L-valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19-
LC-MS hexaoxahenicosan-1-oil)-2-metilalanil-N-
(Protocolo [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)- Q1): m/z 1-{[4-(5-fluoro-1,3-benzotiazol-2-il)-2- AmPeg6C2-#235 1280,2 metilfenil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2-
[M+H+] (0,87 il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-
minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-
1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
LC-MS il)hexanoil]-2-metil-L-prolil-N-
(Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-
mc-#118 m/z 923,3 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-
[M+H+] (1,73 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-
minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)- LC-MS 21-oxo-3,6,9,12,15,18- (Protocolo hexaoxahenicosan-21-il]-2-metilalanil-N- Q1): m/z [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)- MalPeg6C2-#123 1175,3 1-terc-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2- [M+H+] (0,99 il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-
minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-
1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
LC-MS il)hexanoil]-N,2-dimetilalanil-N-
(Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-
mc-#226 m/z 925,7 1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- [M+H+] (1,85 fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-
minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
1-[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
LC-MS il)heptanoil]-2-metil-L-prolil-N-
(Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-
me-#118 m/z 937,7 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2- [M+H+] (1,80 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-
minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)hexanoil]-2-metil-D-prolil-N- (Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)- mc-#131 m/z 937,3 1-metóxi-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-
[M+H+] (1,88 fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-
minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
1-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)butanoil]-2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)- (Protocolo Q): 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- mb-#118 m/z 895,3 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] (1,63 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N~5~-carbamoil-N-{4-
[({[(2S)-2-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- LC-MS [(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1- (Protocolo Q): fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil mcValCitPABC-#134 m/z 1314,3 -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- [M+H+] (1,67 metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3- minutos) metil-1-oxobutan-2-il]carbamoil}-2-
metilpirrolidin-1-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-
L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)hexanoil]-N,2-dimetilalanil-N- (Protocolo [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- Q1): m/z mc-#145 {[(1S,2R)-1-hidróxi-1-fenilpropan-2- 897,34 il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] (0,90 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-
HPLC 4-[{N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-
(Protocolo M): 1-il)-24,24-dimetil-21,25-dioxo- m/z 1169,6 3,6,9,12,15,18-hexaoxa-22- MalPeg6C2-#126 [M+Na+] azapentacosan-25-il]-L-
(12,583 valil}(metil)amino]-3-metóxi-5-
minutos) metilheptanoil}pirrolidin-2-il]-3-metóxi-2-
metilpropanoil}-L-fenilalaninato
HPLC metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-
(Protocolo M): {[N-(3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- m/z 925,5 pirrol-1-il)hexanoil]amino}-2,2- mc-#126 [M+H+] dimetilpropanoil)-L-valil](metil)amino}-3-
(12,994 metóxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-
minutos) metoxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato
1-[5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)pentanoil]-2-metil-L-prolil-N- (Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- mv-#118 m/z 909,2 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-
[M+H+] (1,68 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-
minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
LC-MS metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-
(Protocolo {[N-({(3S)-1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- Q1): m/z pirrol-1-il)hexanoil]-3-fluoropirrolidin-3- mc-#172 941,3 [M+H+] il}carbonil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi-
(0,96 5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-3-metóxi-
minutos) 2-metilpropanoil]-L-fenilalaninato
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18- LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-N,2- (Protocolo Q): dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- MalPeg6C2-#226 m/z 1147,3 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(2S)-1- [M+H+] (1,76 metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2- minutos) metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)- LC-MS 21-oxo-3,6,9,12,15,18- (Protocolo hexaoxahenicosan-21-il]-N,2- Q1): m/z dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- MalPeg6C2-#145 1141,3 [(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidróxi-1- [M+Na+] fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi
(0,87 -2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-
minutos) metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-
L-valinamida
N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N- LC-MS ({(2S)-1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- (Protocolo Q): pirrol-1-il)hexanoil]-2-metilpiperidin-2- mc-#162 m/z 937,3 il}carbonil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi- [M+H+] (1,50 5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}- minutos) 3-metóxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalanina
HPLC N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-{[N-
(Protocolo A): ({(2R)-1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- m/z 937,5 pirrol-1-il)hexanoil]-2-metilpiperidin-2- mc-#163 [M+H+] il}carbonil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi-
(7,855minuto 5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il}-
s) 3-metóxi-2-metilpropanoil]-L-fenilalanina
(N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-
12-(2-{(2S)-2-[(3R,4R,7S)-7-benzil-15-{2- LC-MS [(3,5-dimetil-1H-pirrol-2-il- (Protocolo kappaN)metilideno]-2H-pirrol-5-il- Q1): m/z kappaN}-4-metil-5,8,13-trioxo-2-oxa- mcValCitPABC-#231 1640,4 6,9,12-triazapentadecan-3-il]pirrolidin-1- [M+Na+23] il}-2-oxoetil)-11-[(2S)-butan-2-il]-5,5,10- (0,94 trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13- minutos) dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-
N~5~-
carbamoil-L-ornitinamidato)(difluoro)boro
N-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18- LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-N,2- (Protocolo dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- Q1): m/z MalPeg6C2-#238 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- 1173,3 3-{[(2S)-1-oxo-3-fenil-1-(prop-2-en-1- [M+H+] (0,96 iloxi)propan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1- minutos) il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
1-[1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-
21-oxo-3,6,9,12,15,18- LC-MS hexaoxahenicosan-21-il]-2-metil-L-prolil- (Protocolo Q): N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- MalPeg6C2-#239 m/z 1201,3 {[(2S)-1-terc-butóxi-1-oxo-3-fenilpropan- [M+H+] (2,02 2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3- minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-
1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- (Protocolo {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butóxi-1- Q1): m/z mc-#123 oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2- 953,3 [M+H+] metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 (1,04 -il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- minutos) metil-L-valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
LC-MS il)hexil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-
(Protocolo Q): metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-
MalC6-#54 m/z 922,3 metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- [M+H+] (1,50 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin minutos) -1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
{N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1- LC-MS {(2S)-2-[(3R,4R,7S)-7-benzil-15-{2-[(3,5- (Protocolo dimetil-1H-pirrol-2-il-kappaN)metilideno]- Q1): m/z mc-#231 2H-pirrol-5-il-kappaN}-4-metil-5,8,13- 1213,3 trioxo-2-oxa-6,9,12-triazapentadecan-3- [M+H+] (0,98 il]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- minutos) oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamidato}(difluoro)boro
1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)hexil]-2-metil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1- (Protocolo {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- Q1): m/z MalC6-#118 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- 909,3 [M+H+] oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5 (0,76 -metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- minutos) valinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- LC-MS 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- (Protocolo [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butóxi-1-oxo-3- Q1): m/z mcValCitPABC-#123 fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3 1358,3 -oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- [M+H+] (0,97 trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13- minutos) dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-
N~5~-carbamoil-L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- LC-MS il)hexanoil]-N,2-dimetilalanil-N- (Protocolo [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)- Q1): m/z mc-#237 3-(1H-indol-3-il)-1-metóxi-1-oxopropan-2- 964,4 [M+H+] il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- (0,96 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida metil N-[(2R,3R)-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-
HPLC {[N-({(2S)-1-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- (Protocolo M): pirrol-1-il)hexanoil]-2-metilpiperidin-2- m/z 951,4 mc-#158 il}carbonil)-L-valil](metil)amino}-3-metóxi- [M+H+] 5-metilheptanoil]pirrolidin (12,839 -2-il}-3-metóxi-2-metilpropanoil]-L- minutos) fenilalaninato 1,2-dimetil-L-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)- LC-MS 2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[6-(2,5-dioxo-2,5- (Protocolo Q): dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]amino}-1-oxo- MalC6Am-#151 m/z 922,3 3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2- [M+H+] (1,43 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il minutos) }-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida
N-(3-{2-[3-oxo-3-
(pentafluorofenoxi)propoxi]etoxi}propanoi l)-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- LC-MS butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- (Protocolo Q): PFPCOPeg2C2ValCitP metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- m/z 1502,8 ABC-#54 (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- [M+H+] (1,98 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- minutos) 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-
L-ornitinamida
N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-
il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(9S,12S,13R)-
LC-MS 12-[(2S)-butan-2-il]-13-(2-{(2S)-2-
(Protocolo [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- Q1): m/z 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- mcValCitPABC-#154 1370,2 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-
[M+H+] (0,93 oxoetil)-4,6,6,11-tetrametil-3,7,10-trioxo-
minutos) 9-(propan-2-il)-2,14-dioxa-4,8,11-
triazapentadec-1-il]fenil}-N~5~-
carbamoil-L-ornitinamida
1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1- HPLC {(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-{[6-(2,5- (Protocolo A): dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- m/z 922,5 il)hexil]amino}-1-oxo-3-fenilpropan-2- MalC6Am-#153 [M+H+] il]amino}-1-metóxi-2-metil-3- (7,352 oxopropil]pirrolidin-1-il minutos) }-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- metil-L-valinamida N-[11,20-dioxo-20-(pentafluorofenoxi)-
HPLC 4,7,14,17-tetraoxa-10-azaicosan-1-oil]-2- (Protocolo metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- BB): m/z PFPCOPeg2C2AmPeg [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- 1217,6 2C2-#69 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- [M+H+] oxopropil]pyr (12,936 rolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- minutos) oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{(6S,9R,10R)-6- LC-MS benzil-10-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(1,2- (Protocolo Q): dimetil-L-prolil-L-valil)(metil)amino]-3- mcValCitPABC-#246 m/z 1327,9 metóxi-5-metilheptanoil}pirrolidin-2 [M+H+] (1,36 -il]-9-metil-3,8-dioxo-2,11-dioxa-4,7- minutos) diazadodec-1-il}fenil)-N~5~-carbamoil-L- ornitinamida
N-(3-{2-[3-oxo-3- (pentafluorofenoxi)propoxi]etoxi}propanoi HPLC l)-L-alanil-L-alanil-N~1~-{4- (Protocolo [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2- PFPCOPeg2C2AlaAla AB): m/z {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- AsnPABC-#54 1503,6 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- [M+H+] (8,06 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- minutos) oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-L-aspartamida 2-metil-N-(3-{2-[3-oxo-3-
HPLC (pentafluorofenoxi)propoxi]etoxi}propanoi (Protocolo l)alanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- AB): m/z PFPCOPeg2C2-#54 [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 1098,4 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- [M+H+] (8,44 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida N-{[(4-{[11,20-dioxo-20- HPLC (pentafluorofenoxi)-4,7,14,17-tetraoxa- (Protocolo 10-azaicosan-1- AB): m/z oil]amino}benzil)oxi]carbonil}-2- PFPCOPeg2C2AmPeg 1428,2 metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 2C2PABC-#54 [M+Na+] {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- (10,32 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- minutos) il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N-(21-amino-4,7,10,13,16,19- HPLC hexaoxahenicosan-1-oil)-N,2- (Protocolo A): dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- AmPeg6C2-#115 m/z 1053,5 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- [M+H+] (7,35 feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil- 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida N,2-dimetil-N-[19-oxo-19- (pentafluorofenoxi)-4,7,10,13,16- LC-MS pentaoxanonadecan-1-oil]alanil-N- (Protocolo Q): [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)- PFPCOPeg5C2-#115 m/z 1205,1 1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2- [M+H+] (1,99 metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- minutos) 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida 1,2-dimetil-D-prolil-N-[(3R,4S,5S)-1-
HPLC {(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(2S)-3-[4-({N-[6-(2,5- (Protocolo dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- EB): (4,0 il)hexanoil]glycil}amino)fenil]-1-metóxi-1- mcGly-#201 minutos) : oxopropan-2-il}amino)-1-metóxi-2-metil- ESI-MS m/z 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- 1023,59 metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- [M+H+] valinamida
2-metil-N-(3-{2-[3-oxo-3-({4-[3-oxo-3-(2-
HPLC oxoazetidin-1- (Protocolo il)propil]fenil}amino)propoxi]etoxi}propan FB): m/z AzCOC2Ph4AmCOPe oil)alanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)- 1132,4 g2C2-#54 2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- [M+H+] {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- (10,18 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida N-{[2-oxo-2-({4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin- 1-il)propil]fenil}amino)etoxi]acetil}-L-valil-
HPLC N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- (Protocolo 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- FB): m/z AzCOC2Ph4AmPeg1C 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- 1465,8 1ValCitPABC-#54 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- [M+H+] oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (10,97 (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- minutos) triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil- L-ornitinamida
N-{[2-oxo-2-({4-[3-oxo-3-(2-oxoazetidin- 1-il)propil]fenil}amino)etoxi]acetil}-L-valil- HPLC N~5~-carbamoil-N-[4-({[(1-{[(2S)-1- (Protocolo {[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- FB): m/z [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- AzCOC2Ph4AmPeg1C 1491,8 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- 1ValCitPABC-#30 [M+H+] il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- (10,56 1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metil-1- minutos) oxobutan-2- il]carbamoil}ciclopentil)carbamoil]oxi}meti l)fenil]-L-ornitinamida 2-metil-N-(3-{2-[3-oxo-3-({4-[3-oxo-3-(2-
HPLC oxoazetidin-1- (Protocolo il)propil]fenil}amino)propoxi]etoxi}propan AB): m/z AzCOC2Ph4AmCOPe oil)alanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- 1065,3 g2C2-#69 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- [M+H+] feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- (12,02 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida N,2-dimetil-N-(3-{2-[3-oxo-3-({4-[3-oxo-3-
HPLC (2-oxoazetidin-1- (Protocolo il)propil]fenil}amino)propoxi]etoxi}propan AA): m/z AzCOC2Ph4AmCOPe oil)alanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- 1078,6 g2C2-#115 [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- [M+H+] feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3- (12,02 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil- minutos) 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida
N~2~-acetil-L-lysil-L-valil-N-{4-
[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2- LC-MS {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo- (Protocolo Q): 3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-
m/z 1319,3 il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- AcLysValCitPABC-#54 [M+H+2] oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-
(1,34 (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-
minutos) triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-
L-ornitinamida, sal de ácido trifluoroacético
Tabela 19A – Conjugados selecionados da invenção
Peso molecula Quantidade de r de 2,2',2"-ácido Método de ligante/ ADC-Ligante-Carga # fosfanotriiltripropanóic Preparação de o /Ligante-Carga ou massa TCEP/ PL (x/y) ou carga teórico
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#41 2,3/7,5 1031 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#42 2,3/7,5 1177 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#44 2,3/7,5 913 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#44 2,2/7 1003 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#44 2,0/7 1135 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#44 2,5/7,5 1319 o geral F
Procediment H-(C)_Mal-PEG3C2-#45 2,3/7,5 1017 o geral F
Procediment H-(C)_Mal-PEG6C2-#45 2,05/10 1149 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#45 2,5/10 1342 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#54 2,2/7,5 897 o geral F
Procediment H-(C)_Mal-PEG6C2-#69 2,1/7,5 1119 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#69 2,5/7,5 1303 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#70 2,0/7 1317 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#79 2,0/7 941 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#79 2,3/7,5 1345 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#115 2,2/6,5 911 o geral F
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#51 NA 934,21 o geral G
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#47 NA 962,27 o geral G
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#54 NA 936,2 o geral G
H-A114C- Procediment 50/10 1367,72 (C114)_mcValCitPABC-#47 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1341,68 (C114)_mcValCitPABC-#54 o geral H
H-A114C- Procediment 50/10 1385,8 (C114)_mcValCitPABC-#26 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#26 50/10 980,35 o geral H
H-A114C- Procediment 50/10 1302,69 (C114)_mcValCitPABC-#36 o geral H
H-A114C- Procediment 100/7 1360,73 (C114)_mcValCitPABC-#42 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#42 50/10 955,27 o geral H
Procediment H-(C)-mcValCitPABC-#54 2,5/10 1342 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- 2,5/9 1544 o geral F #54
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 2,6/10 1677 o geral F #54
Procediment H-(C)_mc-#47 1,9/10 962,27 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#54 1,9/10 1026 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#54 2,07/10 936,2 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- 2,3/7,5 1569,96 o geral F #47
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#47 2,3/7,5 1052 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- 2,5/7,5 1562,87 o geral F #42
Procediment H-(C)_mc-#41 2,5/10 941,24 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- 2,5/10 1589,04 o geral F #26
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 2,4/7 1701,9 o geral F #47
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#42 2,3/7 1044,58 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 2,5/7,5 1719,9 o geral F #26
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 2,3/7,5 1696,1 o geral F #42
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#54 2,3/7,5 1158,5 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#47 2,3/7,5 1184,5 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#26 2,3/7,5 1202,6 o geral F
Procediment H-(C)-MalPeg6C2-#42 2,3/7,5 1177 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#36 2,3/7,5 896 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#60 3,0/7 1284,61 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#26 2,5/10 1070,42 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- 3,0/10 1505,93 o geral F #36
H-A114C- Procediment (C114)_mcValCitPABCAmPeg3C 50/10 1505,93 o geral H 2-#36
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 50/10 1158,5 #54 o geral H
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#60 2,3/7,5 969,23 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#60 2,3/7,5 1101,4 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#41 2,3/7,5 1163,5 o geral F
Procediment H-(C)-mc-#69 2,2/7,5 897 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg3C2-#36 2,15/10 987,31 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 2,25/10 1636 o geral F #36
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#36 2,15/10 1119,5 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- 2,5/10 1549,94 o geral F #41
Procediment H-(C)-MalPeg3C2-#41 2,3/7,5 1031 o geral F
H- Procediment (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 2,5/10 1620 o geral F #60
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#66 50/7 866,5 o geral H
H-L398C+L443C- Procediment (C398+C443)_mcValCitPABC- 50/7 1341,68 o geral H #54
H-K392C+L443C- Procediment (C392+C443)_mcValCitPABC- 100/10 1341 o geral H #54
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- Procediment 100/10 1341 #54 o geral H
H-L398C+V422C- Procediment (C398+C422)_mcValCitPABC- 50/7 1341,68 o geral H #54
Procediment H-(C)-mc-#44 2,3/7,5 913 o geral F
Procediment H-(C)-Mal-PEG3C2-#45 2,3/7,5 1017 o geral F
Procediment H-(C)_2AcAmPeg6C2-#66 2,4/10 1049,6 o geral F
Procediment H-(C)-Mal-PEG6C2-#45 2,05/10 1149 o geral F
Procediment H-(C)-mc-#79 2,0/7 941 o geral F
Procediment H-(C)-MalPeg3C2-#44 2,2/7 1003 o geral F
Procediment H-(C)-mcValCitPABC-#70 2,0/7 1317 o geral F
Procediment H-(C)-MalPeg6C2-#44 2,0/7 1135 o geral F
H-A114C- Procediment 100/8,25 1302 (C114)_mcValCitPABC-#69 o geral H
Procediment H-(C)-mcValCitPABC-#79 2,3/7,5 1345 o geral F
H-A114C- Procediment 100/7,5 1346 (C114)_mcValCitPABC-#79 o geral H
Procediment H-(C)-mcValCitPABC-#44 2,5/7,5 1319 o geral F
H-A114C- Procediment 100/7,5 1355 (C114)_mcValCitPABC-#88 o geral H
Procediment H-(C)-mcValCitPABC-#69 2,5/7,5 1303 o geral F
H-(C)_2AcAmCapValCitPABC- Procediment 2,2/10 1313,49 #66 o geral F
H-A114C- Procediment 100/7,5 1331,7 (C114)_mcValCitPABC-#45 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1357 (C114)_mcValCitPABC-#34 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#45 100/10 926 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#70 100/10 911,15 o geral H
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#112 2,3/7,5 1288 o geral F
Procediment H-(C)-Mal-PEG6C2-#69 2,1/7,5 1119 o geral F
H-Q347C- Procediment 100/10 1302 (C347)_mcValCitPABC-#69 o geral H
H-Y373C- Procediment 100/10 1302 (C373)_mcValCitPABC-#69 o geral H
H-E388C- Procediment 100/10 1302 (C388)_mcValCitPABC-#69 o geral H
H-N421C- Procediment 100/10 1302 (C421)_mcValCitPABC-#69 o geral H
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- Procediment 100/10 1302 #69 o geral H
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- Procediment 100/10 1346 #79 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1354 (C114)_mcValCitPABC-#95 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1367 (C114)_mcValCitPABC-#98 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg3C2- Procediment 100/10 987,2 #69 o geral H
Procediment H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#42 NA 1080 o geral K
Procediment H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#54 NA 1061 o geral K
Procediment H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#47 NA 1087 o geral K
Procediment H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#36 NA 1022 o geral K
Procediment H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#26 NA 1105 o geral K
Procediment H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#66 NA 992 o geral K
H-L443C-(C443)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-Q347C-(C347)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-E388C-(C388)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-N421C-(C421)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-E380C-(C380)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-L398C+L443C- Procediment 100/10 1119 (C398+C443)_MalPeg6C2-#69 o geral H
H-K392C+L443C- Procediment 100/10 1119 (C392+C443)_MalPeg6C2-#69 o geral H
H-kA111C-(kC111)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-kK183C-(kC183)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-kK207C-(kC207)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #69 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1314,59 (C114)_mcValCitPABC-#108 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1371 (C114)_mcValCitPABC-#84 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1330 (C114)_mcValCitPABC-#226 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#108 100/10 909,12 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1342 (C114)_mcValCitPABC-#117 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1316 (C114)_mcValCitPABC-#115 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1184 #98 o geral H
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,2/7 1341,68 (C)_mcValCitPABC-#54 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,3/7 897,12 (C)_mc-#69 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,3/8 1119 (C)_MalPeg6C2-#69 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,5/8 1302 (C)_mcValCitPABC-#69 o geral F
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/15 1145 0#118 o geral H
H-A114C- Procediment 100/15 1328 (C114)_mcValCitPABC-0#118 o geral H
H-A114C- Procediment 100/15 1332 (C114)_mcValCitPABC-#80 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#117 100/15 937 o geral H
H-A114C- Procediment 100/15 1366 (C114)_mcValCitPABC-#232 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/15 1145 #230 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/15 1159 #117 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#115 100/10 911 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mv-#115 100/10 897 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mb-#69 100/15 869 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mv-#69 100/15 883 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-0#118 100/15 923 o geral H
Procediment H-(C)_mc-#117 2,0/6,5 937 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#117 2,05/6,5 1159 o geral F
Procediment H-(C)_mc-0#118 2,1/7 923 o geral F
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-0#118 2,2/7,5 1145 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,35/7 923 (C)_mc-0#118 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 3,0/10 925 (C)_mc-#226 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 3,0/10 937 (C)_mc-#117 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 3,0/10 1159 (C)_MalPeg6C2-#117 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 3,0/10 1145 (C)_MalPeg6C2-0#118 o geral F
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1147 #226 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#172 100/15 940,53 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mb-0#118 100/15 895 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_me-0#118 100/15 937 o geral H
H-A114C- Procediment 100/15 1314 (C114)_mcValCitPABC-#134 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#131 100/15 937 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/15 1147 #126 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/15 1174 #123 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#126 100/15 925 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mv-0#118 100/15 909 o geral H
Procediment H-(C)_MalPeg6C2-#226 2,4/7 1147 o geral F
Procediment H-(C)_mc-#226 2,4/7 925 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 3,0/10 1147 (C)_MalPeg6C2-#226 o geral F
Procediment Notch-28-cG1-(C)_mc-0#118 2,5/7 923 o geral F
Procediment Notch-28-cG1-(C)_mc-#115 2,35/7 911 o geral F
Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2- Procediment 2,35/7 1145 0#118 o geral F
Procediment Notch-28-cG1-(C)_me-0#118 2,4/7 937 o geral F
Procediment Notch-75-cG1-(C)_mc-0#118 2,5/7 923 o geral F
IL13Ra2-19F9-cG1- Procediment 2,5/8 1341,68 (C)_mcValCitPABC-#54 o geral F
IL13Ra2-19F9-cG1- Procediment 2,5/7 1288 (C)_mcValCitPABC-#112 o geral F
Notch-28-cG1- Procediment 2,3/7 1288 (C)_mcValCitPABC-#112 o geral F
Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2- Procediment 2,4/7 1119 #69 o geral F
Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2- Procediment 2,4/7 1119 #69 o geral F
Procediment H-(C)_m(H2O)c-0#118 2,35/7 941 o geral I
Procediment H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118 2,35/7 1163 o geral I
Procediment H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-#69 2,1/7 1137 o geral I
Procediment H-(C)_m(H2O)c-#69 2,4/7 915 o geral I
Procediment H-(C)_me-0#118 2,2/7 937 o geral F
Procediment H-(C)_mv-0#118 2,2/7 909 o geral F
Procediment H-(C)_mb-0#118 2,1/7 895 o geral F
Procediment H-A114C-(C114)_MalC6-#54 100/5 922,22 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#231 100/5 1213 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_MalC6-0#118 100/5 909,18 o geral H
Procediment H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-#115 2,4/7 1151 o geral I
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#158 100/10 951 o geral H
H-A114C- Procediment 100/10 1617 (C114)_mcValCitPABC-#231 o geral H
Procediment H-(C)_m(H2O)c-#115 2,4/7 929 o geral I
Procediment Notch-75-cG1-(C)_mc-#115 3,0/7,0 911,15 o geral F
Procediment Notch-75-cG1-(C)_me-0#118 3,0/7,0 937 o geral F
Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2- Procediment 3,0/7,0 1144 0#118 o geral F
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#237 100/10 963 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#145 100/10 897 o geral H
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- Procediment 100/10 1119 #145 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mc-#162 100/10 937 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_MalC6Am-#151 100/10 905 o geral H
Notch-28-cG1-(C)_m(H2O)c- Procediment 2,2/7 941 0#118 o geral I
Notch-75-cG1-(C)_m(H2O)c- Procediment 2,2/7 941 0#118 o geral I
H- Procediment (kK188)_COPeg2C2ValCitPABC- - 1318 o geral J #54
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,3/7 1163 (C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,3/7 1151 (C)_Mal(H2O)Peg6C2-#115 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,35/7 911 (C)_mc-#115 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,8/7 941 (C)_m(H2O)c-0#118 o geral F
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-0#118 2,2/7 1328 o geral F
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment 2,35/7 929 (C)_m(H2O)c-#115 o geral F
H-A114C- Procediment 100/5 1369 (C114)_mcValCitPABC-#154 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_MalC6Am-#153 100/10 921 o geral H
IL13Ra2-AB08-v1010-
Q347C+kK183C-hG1- Procediment 100/10 1341,68 (C347+kC183)_mcValCitPABC- o geral H
#54
IL13Ra2-AB08-v1010-Q347C- Procediment 100/10 1341,68 hG1-(C347)_mcValCitPABC-#54 o geral H
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment (kK188)_COPeg2C2AmPeg2C2- - 1032 o geral J #69
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- Procediment (kK188)_COPeg2C2ValCitPABC- - 1318 o geral J #54
IL13Ra2-AB08-v1010-L443C- Procediment 100/10 1341,68 hG1-(C443)_mcValCitPABC-#54 o geral H
IL13Ra2-AB08-v1010-
K392C+L443C-hG1- Procediment 100/10 1341,68 (C392+C443)_mcValCitPABC- o geral H
#54
IL13Ra2-AB08-v1010-
L443C+kK183C-hG1- Procediment 100/10 1341,68 (C443+kC183)_mcValCitPABC- o geral H
#54
Procediment H-(C)_mcValCitPABC-#98 2,2/7 1367 o geral F
H-A114C- Procediment 100/10 1327 (C114)_mcValCitPABC-#246 o geral H
H-H435A-(C)_mcValCitPABC- Procediment 2,2/8 1341,7 #54 o geral F
H-M428L+N434S- Procediment 2,2/8 1316 (C)_mcValCitPABC-#70 o geral F
H-M428L+N434S- Procediment 2,2/8 1341,7 (C)_mcValCitPABC-#54 o geral F
H-E388C+N421C- Procediment (C388+C421)_mcValCitPABC- 100/10 1341 o geral H #54
H-Q347C+K392C- Procediment (C347+C392)_mcValCitPABC- 100/10 1341 o geral H #54
H-L443C+kK183C- Procediment (C443+kC183)_mcValCitPABC- 100/10 1341 o geral H #54
H-Q347C+kK183C- Procediment (C347+kC183)_mcValCitPABC- 100/10 1341 o geral H #54
H-Q347C- Procediment 100/10 1341 (C347)_mcValCitPABC-#54 o geral H
H-K392C+L443C- Procediment 100/10 911 (C392+C443)_mc-#115 o geral H
H-E388C+N421C- Procediment 100/10 911 (C388+C421)_mc-#115 o geral H
H-Q347C+K392C- Procediment 100/10 911 (C347+C392)_mc-#115 o geral H
H-L443C+kK183C- Procediment 100/10 911 (C443+kC183)_mc-#115 o geral H
H-Q347C+kK183C- Procediment 100/10 911 (C347+kC183)_mc-#115 o geral H
Procediment H-Q347C-(C347)_mc-#115 100/10 911 o geral H
H-kK183C- Procediment 100/10 1341 (kC183)_mcValCitPABC-#54 o geral H
H-E388C- Procediment 100/10 1341 (C388)_mcValCitPABC-#54 o geral H
Procediment H-kK183C-(kC183)_mc-#115 100/10 911 o geral H
Procediment H-E388C-(C388)_mc-#115 100/10 911 o geral H
Procediment H-L443C-(C443)_mc-#115 100/10 911 o geral H
H-N421C- Procediment 100/10 1341 (C421)_mcValCitPABC-#54 o geral H
Procediment H-N421C-(C421)_mc-#115 100/10 911 o geral H
Procediment H-A114C-(C114)_mcGly-#201 100/10 1023 o geral G
[01144] Tabela 19B - Conjugados selecionados da invenção
Espectro de massa: Carega ou tempo de retenção HPLC-SEC e Droga por de massa HPLC para a ADC-Ligante-Carga # razão de porção de cadeia pesada (HC) anticorpo (até 6 de diferença com de (DAR) massa teórico)
SEC (Protocolo O): 7,317
H-(C)_MalPeg3C2-#41 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,3
HC massa = 1032
SEC (Protocolo O): 7,177
H-(C)_MalPeg6C2-#42 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,9
HC massa = 1180
SEC (Protocolo O): 7,195
H-(C)_mc-#44 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,4 HC massa = 915
SEC (Protocolo O): 7,247
H-(C)_MalPeg3C2-#44 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,4
HC massa = 1005
SEC (Protocolo O): 7,237
H-(C)_MalPeg6C2-#44 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,4
HC massa = 1135
SEC (Protocolo O): 7,351
H-(C)_mcValCitPABC-#44 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,2
HC massa = 1321
SEC (Protocolo O): 7,364 H-(C)_Mal-PEG3C2-#45 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,3
HC massa = 1017
SEC (Protocolo O): 7,419
H-(C)_Mal-PEG6C2-#45 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,9
HC massa = 1154
SEC (Protocolo O): 7,159
H-(C)_mcValCitPABC-#45 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,1
HC massa = 1343
SEC (Protocolo O): 7,192
H-(C)_mc-#54 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,5
HC massa = 899
SEC (Protocolo O): 7,350
H-(C)_Mal-PEG6C2-#69 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,4
HC massa = 1122
SEC (Protocolo O): 7,254
H-(C)_mcValCitPABC-#69 minutos; HPLC (Protocolo P): 4,5
HC massa = 1305
SEC (Protocolo O): 7,466
H-(C)_mcValCitPABC-#70 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,7
HC massa = 1318
SEC (Protocolo O): 7,478
H-(C)_mc-#79 minutos; HPLC (Protocolo P): 4
HC massa = 946
SEC (Protocolo O): 7,635
H-(C)_mcValCitPABC-#79 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,7
HC massa = 1349
SEC (Protocolo O): 7,510
H-(C)_mc-#115 minutos; HPLC (Protocolo P): 3,54
HC massa = 912
H-A114C-(C114)_mc-#51 - 2,4
H-A114C-(C114)_mc-#47 - 2,3
H-A114C-(C114)_mc-#54 - 2,3
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #47
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,9 #54
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #26
H-A114C-(C114)_mc-#26 - 1,9
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #36
SEC (Protocolo P): 7,681 H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- minutos; HPLC (Protocolo O): 1,95 #42 HC massa = 1378
H-A114C-(C114)_mc-#42 - 2
SEC (Protocolo P): 7,159
H-(C)-mcValCitPABC-#54 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,1
HC massa = 1343
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 4,6 #54
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - 4,5 #54
H-(C)_mc-#47 - 4,2
SEC (Protocolo P): 7,179 H-(C)_MalPeg3C2-#54 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,7
HC massa = 1028
H-(C)_mc-#54 - 4
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 3,7 #47
H-(C)_MalPeg3C2-#47 - 4,3
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 4,3 #42
H-(C)_mc-#41 - 3,1
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 3 #26
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - 4,2 #47
SEC (Protocolo P): 7,142
H-(C)_MalPeg3C2-#42 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,3
HC massa = 1050
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- 4,2 #26
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - 4,1 #42
SEC (Protocolo P): 7,254
H-(C)_MalPeg6C2-#54 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,4
HC massa = 1161
SEC (Protocolo P): 7,303
H-(C)_MalPeg6C2-#47 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,4
HC massa = 1182
H-(C)_MalPeg6C2-#26 - 4,1
SEC (Protocolo P): 7,177
H-(C)-MalPeg6C2-#42 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,9
HC massa = 1180
H-(C)_mc-#36 - 4,2
H-(C)_mcValCitPABC-#60 - 3,8
H-(C)_MalPeg3C2-#26 - 3,8
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 3,5 #36
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 1,9
#36
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2-#54 - 2
H-(C)_MalPeg3C2-#60 - 4,2
H-(C)_MalPeg6C2-#60 - 4,1
H-(C)_MalPeg6C2-#41 - 4
SEC (Protocolo P): 7,192
H-(C)-mc-#69 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,5
HC massa = 899
H-(C)_MalPeg3C2-#36 - 5,2
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - 4,2 #36
H-(C)_MalPeg6C2-#36 - 5
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - 4,4 #41
SEC (Protocolo P): 7,317 H-(C)-MalPeg3C2-#41 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,3
HC massa = 1032
H-(C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - 4,1 #60
H-A114C-(C114)_mc-#66 - 1,8
H-L398C+L443C- - 3,8 (C398+C443)_mcValCitPABC-#54
H-K392C+L443C- - 3,8 (C392+C443)_mcValCitPABC-#54
SEC (Protocolo P): 8,827 H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- minutos; HPLC (Protocolo O): 2 #54 HC massa = 1344
H-L398C+V422C- - 3,4 (C398+C422)_mcValCitPABC-#54
SEC (Protocolo P): 7,195
H-(C)-mc-#44 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,4
HC massa = 915
SEC (Protocolo P): 7,364 H-(C)-Mal-PEG3C2-#45 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,3
HC massa = 1017
H-(C)_2AcAmPeg6C2-#66 - 4
SEC (Protocolo P): 7,419
H-(C)-Mal-PEG6C2-#45 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,9
HC massa = 1154
SEC (Protocolo P): 7,478 H-(C)-mc-#79 minutos; HPLC (Protocolo O): 4
HC massa = 946
SEC (Protocolo P): 7,247
H-(C)-MalPeg3C2-#44 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,4
HC massa = 1005
SEC (Protocolo P): 7,466
H-(C)-mcValCitPABC-#70 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,7
HC massa = 1318
SEC (Protocolo P): 7,237
H-(C)-MalPeg6C2-#44 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,4
HC massa = 1135
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #69
SEC (Protocolo P): 7,635
H-(C)-mcValCitPABC-#79 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,7
HC massa = 1349
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,84 #79
SEC (Protocolo P): 7,351
H-(C)-mcValCitPABC-#44 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,2
HC massa = 1321
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- 1,93 #88
SEC (Protocolo P): 7,254
H-(C)-mcValCitPABC-#69 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,5
HC massa = 1305
H-(C)_2AcAmCapValCitPABC-#66 - 3,3
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,92 #45
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #34
H-A114C-(C114)_mc-#45 - 1,95
H-A114C-(C114)_mc-#70 - 2
SEC (Protocolo P): 7,083
H-(C)_mcValCitPABC-#112 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,4
HC massa = 1291
SEC (Protocolo P): 7,350
H-(C)-Mal-PEG6C2-#69 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,4
HC massa = 1122
H-Q347C-(C347)_mcValCitPABC- - 2 #69
H-Y373C-(C373)_mcValCitPABC- - 1,6 #69
H-E388C-(C388)_mcValCitPABC- - 2 #69
H-N421C-(C421)_mcValCitPABC- - 1,95 #69
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- - 2 #69
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- - 2 #79
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #95
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #98
H-A114C-(C114)_MalPeg3C2-#69 - 2
H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#42 - 3,2
H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#54 - 3,04
H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#47 - 3,16
H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#36 - 3,36
H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#26 - 3,4
H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#66 - 2,8
SEC (Protocolo P): 7,012
H-L443C-(C443)_MalPeg6C2-#69 minutos; HPLC (Protocolo O): 2
HC massa = 1120
H-Q347C-(C347)_MalPeg6C2-#69 - 1,9
H-E388C-(C388)_MalPeg6C2-#69 - 1,8
H-N421C-(C421)_MalPeg6C2-#69 - 1,8
H-E380C-(C380)_MalPeg6C2-#69 - 1,8
H-L398C+L443C- - 3,9 (C398+C443)_MalPeg6C2-#69
H-K392C+L443C- - 3,5 (C392+C443)_MalPeg6C2-#69
H-kA111C-(kC111)_MalPeg6C2- - 3,7 #69
H-kK183C-(kC183)_MalPeg6C2- - 2,1 #69
H-kK207C-(kC207)_MalPeg6C2- - 2,3 #69
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 2 #108
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,9 #84
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,8 #226
H-A114C-(C114)_mc-#108 - 1,9
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,8 #117
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,9 #115
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2-#98 - 1,9
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,9 (C)_mcValCitPABC-#54
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,5 (C)_mc-#69
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,5 (C)_MalPeg6C2-#69
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 4,4 (C)_mcValCitPABC-#69
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 1,9 0#118
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,8 0#118
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,8 #80
H-A114C-(C114)_mc-#117 - 1,9
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,8 #232
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 1,9 #230
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 1,9 #117
H-A114C-(C114)_mc-#115 - 2
H-A114C-(C114)_mv-#115 - 2
H-A114C-(C114)_mb-#69 - 2
H-A114C-(C114)_mv-#69 - 2
H-A114C-(C114)_mc-0#118 - 2
SEC (Protocolo P): 7,797
H-(C)_mc-#117 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,5
HC massa = 937
SEC (Protocolo P): 8,005
H-(C)_MalPeg6C2-#117 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,56 HC massa = 1163
H-(C)_mc-0#118 - 4,1
SEC (Protocolo P): NA; HPLC
H-(C)_MalPeg6C2-0#118 (Protocolo O): HC massa = 3,9
1148
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 4 (C)_mc-0#118
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 4,6 (C)_mc-#226
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,3 (C)_mc-#117
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,3 (C)_MalPeg6C2-#117
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 2,9 (C)_MalPeg6C2-0#118
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 1,9 #226
H-A114C-(C114)_mc-#172 - 1,9
H-A114C-(C114)_mb-0#118 - 1,9
H-A114C-(C114)_me-0#118 - 2
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,9 #134
H-A114C-(C114)_mc-#131 - 2
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 1,9 #126
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 1,7 #123
H-A114C-(C114)_mc-#126 - 2
H-A114C-(C114)_mv-0#118 - 2
SEC (Protocolo P): 7,501
H-(C)_MalPeg6C2-#226 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,5
HC massa = 1150
SEC (Protocolo P): 7,418
H-(C)_mc-#226 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,5
HC massa = 927
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 4,2 (C)_MalPeg6C2-#226
Notch-28-cG1-(C)_mc-0#118 - 4,6
SEC (Protocolo P): 7,015 Notch-28-cG1-(C)_mc-#115 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,7
HC massa = 911
Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2- - 4,1 0#118
SEC (Protocolo P): 7,182
Notch-28-cG1-(C)_me-0#118 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,9
HC massa = 937
Notch-75-cG1-(C)_mc-0#118 - 3,3
IL13Ra2-19F9-cG1- - 4,1 (C)_mcValCitPABC-#54
IL13Ra2-19F9-cG1- - 4,2 (C)_mcValCitPABC-#112
Notch-28-cG1-(C)_mcValCitPABC- - 4,1 #112
Notch-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69 - 4,3
Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69 - 3,8
SEC (Protocolo P): 7,010
H-(C)_m(H2O)c-0#118 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,1
HC massa = 942
SEC (Protocolo P): 6,964
H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118 minutos; HPLC (Protocolo O): 4
HC massa = 1166
H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-#69 - 2,8
H-(C)_m(H2O)c-#69 - 3,6
H-(C)_me-0#118 - 4,4
H-(C)_mv-0#118 - 4,4
SEC (Protocolo P): 7,032 H-(C)_mb-0#118 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,1
HC massa = 896
H-A114C-(C114)_MalC6-#54 - 1,9
H-A114C-(C114)_mc-#231 - 1,7
H-A114C-(C114)_MalC6-0#118 - 2
SEC (Protocolo P): 6,936
H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-#115 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,1
HC massa = 1152
H-A114C-(C114)_mc-#158 - 2
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,7 #231
SEC (Protocolo P): 6,928
H-(C)_m(H2O)c-#115 minutos; HPLC (Protocolo O): 3,7
HC massa = 930
Notch-75-cG1-(C)_mc-#115 - 3,7
Notch-75-cG1-(C)_me-0#118 - 3,5
Notch-75-cG1-(C)_MalPeg6C2- - 3,8 0#118
H-A114C-(C114)_mc-#237 - 2
H-A114C-(C114)_mc-#145 - 2
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- - 2 #145
H-A114C-(C114)_mc-#162 - 1,9
H-A114C-(C114)_MalC6Am-#151 - 1,9
Notch-28-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118 - 3,7
Notch-75-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118 - 3
H-
(kK188)_COPeg2C2ValCitPABC- - 2
#54
SEC (Protocolo P): 7,766 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- minutos; HPLC (Protocolo O): 3,5 (C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118 HC massa = 1164
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,9 (C)_Mal(H2O)Peg6C2-#115
SEC (Protocolo P): 7,813 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- minutos; HPLC (Protocolo O): 4,3 (C)_mc-#115 HC massa = 911
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- - 3,3 (C)_m(H2O)c-0#118
H-(C)_mcValCitPABC-0#118 - 4,5
SEC (Protocolo P): 7,783 IL13Ra2-AB08-v1010-hG1- minutos; HPLC (Protocolo O): 3,8 (C)_m(H2O)c-#115 HC massa = 930
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,9 #154
H-A114C-(C114)_MalC6Am-#153 - 2
IL13Ra2-AB08-v1010-
Q347C+kK183C-hG1- - 4,3 (C347+kC183)_mcValCitPABC-
#54
IL13Ra2-AB08-v1010-Q347C-hG1- - 2,1 (C347)_mcValCitPABC-#54
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-
(kK188)_COPeg2C2AmPeg2C2- - 2
#69
IL13Ra2-AB08-v1010-hG1-
(kK188)_COPeg2C2ValCitPABC- - 1,9
#54
IL13Ra2-AB08-v1010-L443C-hG1- - 2,1 (C443)_mcValCitPABC-#54
IL13Ra2-AB08-v1010-
K392C+L443C-hG1- - 3,7 (C392+C443)_mcValCitPABC-#54
IL13Ra2-AB08-v1010-
L443C+kK183C-hG1- - 4 (C443+kC183)_mcValCitPABC-
#54
SEC (Protocolo P): 7,232
H-(C)_mcValCitPABC-#98 minutos; HPLC (Protocolo O): 4,2
HC massa = 1371
H-A114C-(C114)_mcValCitPABC- - 1,9 #246
H-H435A-(C)_mcValCitPABC-#54 - 4
H-M428L+N434S- - 4,2 (C)_mcValCitPABC-#70
H-M428L+N434S- - 4 (C)_mcValCitPABC-#54
H-E388C+N421C- - 3,6 (C388+C421)_mcValCitPABC-#54
H-Q347C+K392C- - 3,9 (C347+C392)_mcValCitPABC-#54
H-L443C+kK183C-
(C443+kC183)_mcValCitPABC- - 3,7
#54
H-Q347C+kK183C- SEC (Protocolo P): 8,278
(C347+kC183)_mcValCitPABC- minutos; HPLC (Protocolo O): 3,7
#54 HC massa = 1339
H-Q347C-(C347)_mcValCitPABC- - 1,9 #54
H-K392C+L443C- - 4 (C392+C443)_mc-#115
H-E388C+N421C- - 3,8 (C388+C421)_mc-#115
H-Q347C+K392C- - 4 (C347+C392)_mc-#115
H-L443C+kK183C- - 3,8 (C443+kC183)_mc-#115
H-Q347C+kK183C- - 3,8 (C347+kC183)_mc-#115
H-Q347C-(C347)_mc-#115 - 2
H-kK183C- - 1,9 (kC183)_mcValCitPABC-#54
H-E388C-(C388)_mcValCitPABC- - 2 #54
H-kK183C-(kC183)_mc-#115 - 1,8
SEC (Protocolo P): 7,364 H-E388C-(C388)_mc-#115 minutos; HPLC (Protocolo O): 2
HC massa = 914
H-L443C-(C443)_mc-#115 - 2
H-N421C-(C421)_mcValCitPABC- - 2 #54
H-N421C-(C421)_mc-#115 - 2
H-A114C-(C114)_mcGly-#201 - 1,9
Tabela 20 – Valores de IC50 para compostos selecionados (peptídeos citotóxicos) da invenção
MDA-MB- BT474 N87GMEAN 361-DYT2 Exemplo # GMEAN IC50 (nM) GMEAN IC50 (nM) IC50 (nM)
#26 0,368 0,543 1,045
#30 0,682 6,709 1,853
#34 0,211 1,95 1,119
#36 0,499 1,205 1,111
#41 29,666 33,21 51,784
#42 0,125 0,327 0,195
#44 7,119 14,61 >16,401
#45 0,15 0,385 0,415
#47 <0,244 <0,256 0,317
#51 <0,599 3,658 -
#54 <0,133 <0,221 0,206
#56 0,316 1,256 0,766
#60 0,524 1,245 0,957
#66 0,244 0,463 0,334
#69 80,191 65,979 40,988
#70 0,179 0,327 0,225
#75 >100,000 >100,000 >100,000
#79 0,079 0,137 0,129
#80 20,346 28,204 32,846
#84 0,246 0,426 0,686
#115 31,493 50,302 19,870
#117 0,096 0,103 0,118
#118 100,000 100,000 100,000
#123 0,125 0,089 0,129
#126 0,315 0,375 0,454
#130 0,050 0,076 0,039
#131 0,072 0,185 0,081
#134 0,108 0,115 0,134
#140 - - -
#141 3,367 3,018 -
#142 0,279 0,259 -
#143 - - -
#144 0,172 0,182 0,174
#145 0,185 0,167 0,229
#146 0,435 0,195 0,387
#147 0,456 0,144 0,421
#148 0,429 0,219 0,502
#149 0,417 0,250 0,428
#151 84,867 61,953 84,599
#153 98,160 47,274 91,350
#154 0,193 0,572 0,198
#155 0,323 0,875 0,318
#158 0,082 0,115 0,100
#159 0,070 0,075 0,074
#162 31,448 21,610 27,824
#163 100,000 72,703 99,433
#172 0,057 0,144 0,086
#173 0,088 0,099 0,067
#178 0,968 1,262 0,911
#180 0,159 0,117 0,113
#182 0,153 0,148 0,122
#184 2,478 5,098 3,427
#186 - - -
#188 0,250 0,283 0,404
#190 0,134 0,066 0,095
#192 0,262 0,360 0,408
#194 0,134 0,212 0,198
#200 0,048 0,029 0,017
#201 0,144 0,150 0,121
#207 0,219 0,626 0,260
#208 0,418 0,379 0,336
#209 0,067 0,067 0,058
#217 - - -
#219 - - -
#220 35,163 100,000 100,000
#221 32,402 87,857 65,401
#222 0,158 0,352 0,272
#223 7,589 13,026 10,863
#224 0,383 1,563 0,998
#225 3,449 10,524 7,575
#226 0,118 0,478 0,106
#227 11,008 18,975 12,899
#228 0,105 0,090 0,078
#229 18,372 16,566 10,218
#230 100,000 89,133 70,236
#231 3,706 15,127 22,855
#232 0,071 0,194 0,095
#233 1,074 8,413 5,042
#234 0,684 0,756 2,004
#235 0,852 1,320 1,278
#236 0,020 0,023 0,010
#237 0,162 0,217 0,278
#238 0,139 0,077 0,084
#239 - - -
#240 11,710 19,930 23,480
#241 0,364 0,388 0,494
#242 32,330 41,329 34,529
#243 1,252 1,301 1,284
#244 73,123 100,000 100,000
#245 11,793 33,037 31,856
#246 3,159 10,828 5,430
#247 1,007 2,061 1,334
#257 - - -
Tabela 21A - IC50 values for selected conjugados da invenção
BT474 HCC1954 N87
IC50 de IC50 de IC50 de
IC50 Anticor IC50 Anticor IC50 Anticorp ADC-Ligante-Carga # (nM) po (nM) po (nM) o
(ng/mL) (ng/mL) (ng/mL)
H-(C)_MalPeg3C2-#41 0,725 25,592 0,465 16,617 4,02 175,448
>14,09 >6681,1 H-(C)_MalPeg6C2-#42 0,502 19,855 0,604 24,783 0 50
121,41 493,07 >841,3 >29495, H-(C)_mc-#44 3,553 14,464 4 7 60 311
114,84 225,59 >440,8 >26346, H-(C)_MalPeg3C2-#44 2,603 5,113 7 4 81 532
4873,85 H-(C)_MalPeg6C2-#44 1,318 58,155 1,466 64,663 98,174 1
H-(C)_mcValCitPABC- 0,188 6,717 0,155 5,329 0,781 28,146 #44
103,76 >740,0 >27967, H-(C)_Mal-PEG3C2-#45 2,886 1,513 52,791 2 01 742
111,43 9072,13 H-(C)_Mal-PEG6C2-#45 1,274 49,903 1,423 54,715 4 1
H-(C)_mcValCitPABC- 0,258 9,997 0,204 7,988 0,417 16,737 #45
H-(C)_mc-#54 0,436 19,821 0,992 45,072 2,45 138,026
5147,5 2427,63 H-(C)_Mal-PEG6C2-#69 1,938 0,356 12,995 5,743 4 9
H-(C)_mcValCitPABC- 0,18 7,17 0,073 2,878 <0,185 <8,946 #69
H-(C)_mcValCitPABC- 0,133 4,522 0,078 2,61 0,249 8,722 #70
H-(C)_mc-#79 0,483 18,097 0,654 24,543 7,576 297,254
H-(C)_mcValCitPABC- 0,152 6,634 0,127 5,682 0,469 21,134 #79
H-(C)_mc-#115 0,272 - 0,109 - 0,841 -
H-A114C-(C114)_mc- 41,768 - - 17,297 - #51
H-A114C-(C114)_mc- 3,269 - - 8,216 - #47
H-A114C-(C114)_mc- 4,294 - - 7,195 - #54
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,493 - 0,31 - 0,696 -
#47
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,174 - 0,17 - 0,189 -
#54
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 2,548 - 28,2 - 4,314 -
#26
H-A114C-(C114)_mc- >1000, >980,0 >60,648 - - - #26 00 26
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 2,007 - 26,18 - 13,579 -
#36
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,283 0,16 - 0,524 -
#42
H-A114C-(C114)_mc- 0,81 - 1,54 - 44,164 - #42
H-(C)-mcValCitPABC- 0,292 - 0,27 - 0,345 - #54
H-
(C)_mcValCitPABCAmP 15,134 - 14,33 - 41,016 -
eg3C2-#54
H-
(C)_mcValCitPABCAmP 1,898 - 1,4 - 11,71 -
eg6C2-#54
H-(C)_mc-#47 4,429 - 3,52 - 20,007 -
>41,71 H-(C)_MalPeg3C2-#54 2,181 - 1,54 - - 1
H-(C)_mc-#54 3,565 - 6,28 - 48,566 -
H- >1000, >543,8 (C)_mcValCitPABCAmP 5,228 - - - 00 52 eg3C2-#47
H-(C)_MalPeg3C2-#47 1,467 - 1,29 - 16,856 -
H- >1000, (C)_mcValCitPABCAmP 1,587 - 4,95 - - 000 eg3C2-#42
H-(C)_mc-#41 0,506 - 0,68 - 7,543 -
H- >1000, >1000, (C)_mcValCitPABCAmP 11,211 - - - 00 000 eg3C2-#26
H-
(C)_mcValCitPABCAmP 0,935 - 2,46 - 14,283 -
eg6C2-#47
H-(C)_MalPeg3C2-#42 0,517 - 0,51 - 5,479 -
H- >1000, >1000, (C)_mcValCitPABCAmP 10,992 - - - 00 000 eg6C2-#26
H-
(C)_mcValCitPABCAmP 1,819 - 1,97 - 75,643 -
eg6C2-#42
>56,92 H-(C)_MalPeg6C2-#54 2,108 - 1,02 - - 8
H-(C)_MalPeg6C2-#47 1,637 - 1,42 - 31,762 -
>817,8 H-(C)_MalPeg6C2-#26 6,385 - 9,55 - - 59
H-(C)-MalPeg6C2-#42 0,518 - 0,55 - >7,993 -
>1000,0 >1000, >1000, H-(C)_mc-#36 - - - 00 00 000
H-(C)_mcValCitPABC- 0,835 - 6,45 - 14,917 - #60
>1000, H-(C)_MalPeg3C2-#26 11,506 - 9,43 - - 000
H- >1000,0 >1000, >1000, (C)_mcValCitPABCAmP - - - 00 00 000 eg3C2-#36
H-A114C- >1000,0 >1000, >325,7 (C114)_mcValCitPABCA - - - 00 00 14 mPeg3C2-#36
H-A114C- 133,42 1,228 - 2,01 - - (C114)_MalPeg6C2-#54 6
>1000,0 >1000, >1000, H-(C)_MalPeg3C2-#60 - - - 00 00 000
>1000,0 >1000, >1000, H-(C)_MalPeg6C2-#60 - - - 00 00 000
H-(C)_MalPeg6C2-#41 1,166 - 0,36 - 5,882 -
H-(C)-mc-#69 0,427 - 0,47 - 3,05 -
>1000, >1000, H-(C)_MalPeg3C2-#36 720,826 - - - 00 000
H- >1000,0 >1000, >1000, (C)_mcValCitPABCAmP - - - 00 00 000 eg6C2-#36
>1000, H-(C)_MalPeg6C2-#36 878,903 - 159,1 - - 000
H-
(C)_mcValCitPABCAmP 2,363 - 2,28 - 18,728 -
eg3C2-#41
H-(C)-MalPeg3C2-#41 0,725 - 0,54 - 4,004 -
H- >1000, 392,90 (C)_mcValCitPABCAmP 979,982 - - - 00 5 eg6C2-#60
H-A114C-(C114)_mc- >1000, >1000, 17,235 - - - #66 00 000
H-L398C+L443C-
(C398+C443)_mcValCit 0,249 - 0,27 - 0,678 -
PABC-#54
H-K392C+L443C-
(C392+C443)_mcValCit <0,195 - 0,42 - <0,254 - PABC-#54
H-L443C-
(C443)_mcValCitPABC- <0,130 - 0,32 - <0,267 -
#54
H-L398C+V422C-
(C398+C422)_mcValCit 0,387 - 0,27 - 0,504 -
PABC-#54
>507,2 >878,4 H-(C)-mc-#44 3,553 - - - 3 89
>834,7 H-(C)-Mal-PEG3C2-#45 2,886 - 68,41 - - 17
H-(C)_2AcAmPeg6C2- >1000, >1000, 703,419 - - - #66 00 000
>268,0 H-(C)-Mal-PEG6C2-#45 1,274 - 2,74 - - 47
H-(C)-mc-#79 0,483 - 0,65 - 7,576 -
>440,8 H-(C)-MalPeg3C2-#44 2,603 - 5,11 - - 81
H-(C)-mcValCitPABC- 0,188 - 0,09 - <0,179 - #70
H-(C)-MalPeg6C2-#44 1,318 - 1,47 - 98,174 -
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,174 - 0,06 - 0,207 -
#69
H-(C)-mcValCitPABC- 0,152 - 0,15 - 0,469 - #79
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,124 - 0,12 - 0,386 -
#79
H-(C)-mcValCitPABC- 0,252 - 0,18 - 0,732 - #44
H-A114C- >1000, (C114)_mcValCitPABC- 8,127 - - 62,825 - 00 #88
H-(C)-mcValCitPABC- 0,133 - 0,1 - 0,249 - #69
H-
(C)_2AcAmCapValCitPA 0,436 - 0,99 - 2,45 -
BC-#66
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,217 - 0,2 - 0,496 -
#45
H-A114C- >1000, (C114)_mcValCitPABC- 3,724 - - 18,422 - 00 #34
H-A114C-(C114)_mc- >1000, 148,85 6,431 - - - #45 00 2
H-A114C-(C114)_mc- 0,349 - 0,62 - 7,208 - #70
H-(C)_mcValCitPABC- 0,226 - 0,24 - 0,469 - #112
H-(C)-Mal-PEG6C2-#69 0,453 - 0,54 - 1,8 -
H-Q347C-
(C347)_mcValCitPABC- 0,368 - 0,06 - 0,22 -
#69
H-Y373C-
(C373)_mcValCitPABC- 0,359 - 0,06 - 0,295 -
#69
H-E388C-
(C388)_mcValCitPABC- 0,427 - 0,06 - 0,314 -
#69
H-N421C-
(C421)_mcValCitPABC- 0,434 - 0,09 - 0,244 -
#69
H-L443C-
(C443)_mcValCitPABC- 0,239 - 0,05 - 0,272 -
#69
H-L443C-
(C443)_mcValCitPABC- 0,3 - 0,15 - 0,412 -
#79
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,381 - 0,36 - 0,852 -
#95
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,171 - 0,24 - 0,258 -
#98
H-A114C- 0,221 - 0,58 - 1,589 - (C114)_MalPeg3C2-#69
H-N297Q- 0,466 - 0,36 - 5,42 - (Q)_AmPeg6C2-#42
H-N297Q- 0,557 - 0,37 - 6,899 - (Q)_AmPeg6C2-#54
H-N297Q- 0,346 - 0,43 - 4,337 - (Q)_AmPeg6C2-#47
H-N297Q- >1000, 284,26 3,003 - - - (Q)_AmPeg6C2-#36 00 7
H-N297Q- 0,991 - 1,07 - 35,331 - (Q)_AmPeg6C2-#26
H-N297Q- >1000, >1000, 13,812 - - - (Q)_AmPeg6C2-#66 00 000
H-L443C- 0,251 - 0,25 - 1,989 - (C443)_MalPeg6C2-#69
H-Q347C- 0,267 - 0,3 - 0,887 - (C347)_MalPeg6C2-#69
H-E388C- 0,382 - 0,46 - 3,035 - (C388)_MalPeg6C2-#69
H-N421C- 0,35 - 0,45 - 1,329 - (C421)_MalPeg6C2-#69
H-E380C- 0,482 - 0,49 - 5,588 - (C380)_MalPeg6C2-#69
H-L398C+L443C-
(C398+C443)_MalPeg6 0,226 - 0,3 - 1,346 -
C2-#69
H-K392C+L443C-
(C392+C443)_MalPeg6 0,268 - 0,31 - 1,63 -
C2-#69
H-kA111C-
(kC111)_MalPeg6C2- 0,297 - 0,34 - 1,635 -
#69
H-kK183C-
(kC183)_MalPeg6C2- 0,257 - 0,5 - 2,23 -
#69
H-kK207C-
(kC207)_MalPeg6C2- 0,252 - 0,41 - 1,744 -
#69
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,212 - 0,12 - 0,777 -
#108
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,627 - 12,2 - 1,733 -
#84
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,2 - 0,1 - 0,239 -
#226
H-A114C-(C114)_mc- >1000,0 >1000, 113,88 - - - #108 00 00 9
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,242 - 0,17 - 0,239 -
#117
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,202 - 0,2 - 0,211 -
#115
H-A114C- 0,576 - 0,47 - 1,46 - (C114)_MalPeg6C2-#98
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 0,257 - 0,17 - 0,505 -
0#118
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,251 - 0,24 - 0,398 -
0#118
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,341 - 0,31 - 0,887 -
#80
H-A114C-(C114)_mc- 0,197 - 0,14 - 0,465 - #117
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,376 - 1,31 - 1,367 -
#232
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 0,504 - 0,85 - 3,179 -
#230
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 0,335 - 0,21 - 0,792 -
#117
H-A114C-(C114)_mc- 0,243 - 0,23 - 0,45 - #115
H-A114C-(C114)_mv- 0,21 - 0,15 - 0,65 - #115
H-A114C-(C114)_mb- 0,256 - 0,43 - 2,137 - #69
H-A114C-(C114)_mv- 0,215 - 0,27 - 1,043 - #69
H-A114C-(C114)_mc- 0,151 - 0,1 - 0,342 - 0#118
H-(C)_mc-#117 0,162 - 0,06 - 0,314 -
H-(C)_MalPeg6C2-#117 0,283 - 0,07 - 0,515 -
H-(C)_mc-0#118 0,18 - <0,10 - 0,303 -
H-(C)_MalPeg6C2- 0,269 - 0,15 - 0,499 - 0#118
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 0,28 - 0,22 - 0,685 -
#226
H-A114C-(C114)_mc- 0,296 - 0,41 - 0,694 - #172
H-A114C-(C114)_mb- 0,318 - 0,33 - 0,709 - 0#118
H-A114C-(C114)_me- 0,256 - 0,33 - 0,64 - 0#118
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,301 - 0,34 - 0,501 -
#134
H-A114C-(C114)_mc- 0,357 - 0,76 - 1,614 - #131
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 0,284 - 0,36 - 1,377 -
#126
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 0,362 - 0,34 - 1,867 -
#123
H-A114C-(C114)_mc- 0,319 - 0,49 - 3,294 - #126
H-A114C-(C114)_mv- 0,209 - 0,25 - 0,719 - 0#118
H-(C)_MalPeg6C2-#226 0,575 - 0,22 - 1,126 -
H-(C)_mc-#226 0,359 - 0,18 - 0,69 -
H-(C)_m(H2O)c-0#118 0,26 - 0,11 - 0,448 -
H-
(C)_Mal(H2O)Peg6C2- 0,482 - 0,19 - 0,9 -
0#118
H-
(C)_Mal(H2O)Peg6C2- 0,832 - 0,51 - 5,769 -
#69
H-(C)_m(H2O)c-#69 0,418 - 0,28 - 1,529 -
H-(C)_me-0#118 0,186 - 0,11 - 0,218 -
H-(C)_mv-0#118 0,201 - 0,14 - 0,265 -
H-(C)_mb-0#118 0,222 - 0,13 - 0,267 -
H-A114C- 0,662 - 5,11 - 8,003 - (C114)_MalC6-#54
H-A114C-(C114)_mc- >1000,0 >1000, - - >1000 - #231 00 00
H-A114C- 0,976 - 113 - 15,407 - (C114)_MalC6-0#118
H-
(C)_Mal(H2O)Peg6C2- 1,06 - 0,28 - 3,439 -
#115
H-A114C-(C114)_mc- 0,247 - 0,35 - 0,739 - #158
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 1,178 - 24,41 - 13,447 -
#231
H-(C)_m(H2O)c-#115 0,393 - 0,17 - 0,498 -
H-A114C-(C114)_mc- 0,97 - 0,68 - 27,907 - #237
H-A114C-(C114)_mc- 643,39 4,681 - 585,59 - - #145 1
H-A114C-
(C114)_MalPeg6C2- 12,856 - 190,59 - 89,125 -
#145
H-A114C-(C114)_mc- 0,377 - 0,15 - 1,144 - #162
H-A114C- 0,42 - 0,1 - 0,694 - (C114)_MalC6Am-#151
H-
(kK188)_COPeg2C2Val - - -
CitPABC-#54
H-(C)_mcValCitPABC- 0,227 - 0,14 - 0,182 - 0#118
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,323 - 0,32 - 0,363 -
#154
H-A114C- 0,377 - 0,27 - 0,34 - (C114)_MalC6Am-#153
H-(C)_mcValCitPABC- 0,211 - 0,14 - 0,162 - #98
H-A114C-
(C114)_mcValCitPABC- 0,357 - 0,65 - 3,197 -
#246
H-H435A- 0,358 - 0,17 - 0,237 - (C)_mcValCitPABC-#54
H-M428L+N434S- 0,322 - 0,1 - 0,114 - (C)_mcValCitPABC-#70
H-M428L+N434S- 0,354 - - 0,217 - (C)_mcValCitPABC-#54
H-E388C+N421C-
(C388+C421)_mcValCit 1,38 - 0,99 - 0,855 -
PABC-#54
H-Q347C+K392C-
(C347+C392)_mcValCit 0,276 - 0,29 - 0,147 -
PABC-#54
H-L443C+kK183C-
(C443+kC183)_mcValCit <0,129 - 0,37 - <0,111 - PABC-#54
H-Q347C+kK183C-
(C347+kC183)_mcValCit 0,146 - 0,25 - 0,08 -
PABC-#54
H-Q347C-
(C347)_mcValCitPABC- 0,153 - 0,33 - 0,111 -
#54
H-K392C+L443C- 0,323 - 0,1 - 0,304 - (C392+C443)_mc-#115
H-E388C+N421C- 1,251 - 0,42 - 0,997 - (C388+C421)_mc-#115
H-Q347C+K392C- 0,342 - 0,1 - 0,219 - (C347+C392)_mc-#115
H-L443C+kK183C- 0,319 - 0,1 - 0,268 - (C443+kC183)_mc-#115
H-Q347C+kK183C- 0,347 - 0,1 - 0,403 - (C347+kC183)_mc-#115
H-Q347C-(C347)_mc- 0,272 - 0,18 - 0,278 - #115
H-kK183C-
(kC183)_mcValCitPABC 0,287 - 0,34 - 0,194 -
-#54
H-E388C-
(C388)_mcValCitPABC- 0,098 - 0,38 - 0,084 -
#54
H-kK183C-(kC183)_mc- 0,28 - 0,27 - 0,269 - #115
H-E388C-(C388)_mc- 0,302 - 0,15 - 0,301 - #115
H-L443C-(C443)_mc- 0,222 - 0,1 - 0,259 - #115
H-N421C-
(C421)_mcValCitPABC- <0,051 - 0,42 - <0,051 -
#54
H-N421C-(C421)_mc- 0,312 - 0,23 - 0,306 - #115
H-A114C- 0,321 - - - (C114)_mcGly-#201
Tabela 21B – Valores IC50 para conjugados selecionados da invenção
DYT2 MDA-MB-468
IC50 de IC50 de IC50 IC50 ADC-Ligante-Carga # Anticorpo Anticorpo (nM) (nM) (ng/mL) (ng/mL)
>17528,58 >35714,28 H-(C)_MalPeg3C2-#41 >69,685 - 1 6
>25857,97 H-(C)_MalPeg6C2-#42 33,396 5455,61 >629,281 1
>1000,00 >34090,90 >1000,00 >34090,90 H-(C)_mc-#44 0 9 0 9
>1000,00 >44117,64 >1000,00 >44117,64 H-(C)_MalPeg3C2-#44 0 7 0 7
>1000,00 >44117,64 >1000,00 >44117,64 H-(C)_MalPeg6C2-#44 0 7 0 7
>1000,00 >35714,28 H-(C)_mcValCitPABC-#44 0,203 7,246 0 6
>1000,00 >34883,72 >1000,00 >34883,72 H-(C)_Mal-PEG3C2-#45 0 1 0 1
>1000,00 >38461,53 >1000,00 >38461,53 H-(C)_Mal-PEG6C2-#45 0 8 0 8
H-(C)_mcValCitPABC-#45 0,371 14,304 613,294 24435,914
>1000,00 >45454,54 >1000,00 >45454,54 H-(C)_mc-#54 0 5 0 5
>29849,27 >1000,00 >35714,28 H-(C)_Mal-PEG6C2-#69 >467,163 9 0 6
H-(C)_mcValCitPABC-#69 0,156 7,54 547,953 21860,354
>1000,00 >33333,33 H-(C)_mcValCitPABC-#70 0,098 3,332 0 3
>1000,00 >37500,00 H-(C)_mc-#79 978,508 36694,065 0 0
H-(C)_mcValCitPABC-#79 0,212 9,528 351,392 15383,462
H-(C)_mc-#115 0,21 - - -
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#51 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#47 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#54 - - 0 0
H-A114C- 383,667 - 445,014 - (C114)_mcValCitPABC-#47
H-A114C- 0,372 - 362,213 - (C114)_mcValCitPABC-#54
H-A114C- >1000,00 - >930,555 - (C114)_mcValCitPABC-#26 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#26 - - 0 0
H-A114C- >1000,00 >927,422 - - (C114)_mcValCitPABC-#36 0
H-A114C- 0,436 - 530,596 - (C114)_mcValCitPABC-#42
H-A114C-(C114)_mc-#42 >727,245 - 567,735 -
H-(C)-mcValCitPABC-#54 0,275 - 471,905 -
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - - 0 0 #54
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - - 0 0 #54
>1000,00 >1000,00 H-(C)_mc-#47 - - 0 0
>1651,00 >1651,00 H-(C)_MalPeg3C2-#54 - - 7 7
>1000,00 >1000,00 H-(C)_mc-#54 - - 0 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - - 0 0 #47
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg3C2-#47 - - 0 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - - 0 0 #42
>1000,00 >1000,00 H-(C)_mc-#41 - - 0 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - - 0 0 #26
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - - 0 0 #47
H-(C)_MalPeg3C2-#42 9,675 - 358,435 -
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - - 0 0 #26
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - - 0 0 #42
>1731,54 >1731,54 H-(C)_MalPeg6C2-#54 - - 4 4
>1651,00 >1651,00 H-(C)_MalPeg6C2-#47 - - 7 7
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg6C2-#26 - - 0 0
H-(C)-MalPeg6C2-#42 5,705 - >642,029 -
>1000,00 >1000,00 H-(C)_mc-#36 - - 0 0
H-(C)_mcValCitPABC-#60 >699,241 - >544,495 -
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg3C2-#26 - - 0 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - - 0 0 #36
H-A114C- >1000,00 >1000,00 (C114)_mcValCitPABCAmPeg3C - - 0 0 2-#36
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- >1000,00 >1000,00 - - #54 0 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg3C2-#60 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg6C2-#60 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg6C2-#41 - - 0 0
H-(C)-mc-#69 >71,831 - >899,249 -
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg3C2-#36 - - 0 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - - 0 0 #36
>1000,00 >1000,00 H-(C)_MalPeg6C2-#36 - - 0 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg3C2- - - 0 0 #41
>1000,00 H-(C)-MalPeg3C2-#41 >69,685 - - 0
H- >1000,00 >1000,00 (C)_mcValCitPABCAmPeg6C2- - - 0 0 #60
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#66 - - 0 0
H-L398C+L443C-
(C398+C443)_mcValCitPABC- 0,463 - 801,354 -
#54
H-K392C+L443C-
(C392+C443)_mcValCitPABC- <0,171 - 565,01 -
#54
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- 0,371 - 500,958 - #54
H-L398C+V422C-
(C398+C422)_mcValCitPABC- 0,48 - 610,884 -
#54
>1000,00 >1000,00 H-(C)-mc-#44 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)-Mal-PEG3C2-#45 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)_2AcAmPeg6C2-#66 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)-Mal-PEG6C2-#45 - - 0 0
>1000,00 H-(C)-mc-#79 - 978,508 - 0
>1000,00 >1000,00 H-(C)-MalPeg3C2-#44 - - 0 0
H-(C)-mcValCitPABC-#70 0,116 - 547,953 -
>1000,00 >1000,00 H-(C)-MalPeg6C2-#44 - - 0 0
H-A114C- >1000,00 0,083 - - (C114)_mcValCitPABC-#69 0
H-(C)-mcValCitPABC-#79 0,212 - 351,392 -
H-A114C- 0,199 - 472,593 - (C114)_mcValCitPABC-#79
>1000,00 H-(C)-mcValCitPABC-#44 0,248 - - 0
H-A114C- >1000,00 >1000,00 - - (C114)_mcValCitPABC-#88 0 0
>1000,00 H-(C)-mcValCitPABC-#69 0,098 - - 0
H-(C)_2AcAmCapValCitPABC- >1000,00 >1000,00 - - #66 0 0
H-A114C- 2,37 - >968,025 - (C114)_mcValCitPABC-#45
H-A114C- >1000,00 >1000,00 - - (C114)_mcValCitPABC-#34 0 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#45 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#70 - - 0 0
H-(C)_mcValCitPABC-#112 0,185 - >563,999 -
H-(C)-Mal-PEG6C2-#69 0,963 - 748,275 -
H-Q347C- >1000,00 0,094 - - (C347)_mcValCitPABC-#69 0
H-Y373C- >1000,00 0,156 - - (C373)_mcValCitPABC-#69 0
H-E388C- >1000,00 0,117 - - (C388)_mcValCitPABC-#69 0
H-N421C- >1000,00 0,162 - - (C421)_mcValCitPABC-#69 0
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- >1000,00 0,1 - - #69 0
H-L443C-(C443)_mcValCitPABC- 0,303 - 370,53 - #79
H-A114C- >1000,00 61,8 - - (C114)_mcValCitPABC-#95 0
H-A114C- 0,218 - 609,904 - (C114)_mcValCitPABC-#98
H-A114C-(C114)_MalPeg3C2- >1000,00 >1000,00 - - #69 0 0
>1000,00 >1000,00 H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#42 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#54 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#47 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#36 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#26 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-N297Q-(Q)_AmPeg6C2-#66 - - 0 0
H-L443C-(C443)_MalPeg6C2- >1000,00 - 758,157 - #69 0
H-Q347C-(C347)_MalPeg6C2- 1,752 - 832,08 - #69
H-E388C-(C388)_MalPeg6C2- 6,883 - >973,529 - #69
H-N421C-(C421)_MalPeg6C2- 1,027 - 472,466 - #69
H-E380C-(C380)_MalPeg6C2- >65,641 - 873,254 - #69
H-L398C+L443C- 0,827 - 846,418 - (C398+C443)_MalPeg6C2-#69
H-K392C+L443C- >32,438 - 804,407 - (C392+C443)_MalPeg6C2-#69
H-kA111C-(kC111)_MalPeg6C2- 0,423 - 740,791 - #69
H-kK183C-(kC183)_MalPeg6C2- >1000,00 - 749,154 - #69 0
H-kK207C-(kC207)_MalPeg6C2- >138,618 - 586,857 - #69
H-A114C- >1000,00 - 873,831 - (C114)_mcValCitPABC-#108 0
H-A114C- >1000,00 976,796 - - (C114)_mcValCitPABC-#84 0
H-A114C- 0,101 - 385,851 - (C114)_mcValCitPABC-#226
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#108 - - 0 0
H-A114C- 0,107 - 469,882 - (C114)_mcValCitPABC-#117
H-A114C- 0,142 - 989,147 - (C114)_mcValCitPABC-#115
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- >1000,00 355,331 - - #98 0
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- 0,126 - >865,455 - 0#118
H-A114C- >1000,00 0,215 - - (C114)_mcValCitPABC-0#118 0
H-A114C- >1000,00 0,432 - - (C114)_mcValCitPABC-#80 0
H-A114C-(C114)_mc-#117 0,107 - >414,892 -
H-A114C- 38,422 - 959,259 - (C114)_mcValCitPABC-#232
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- >1000,00 >1000,00 - - #230 0 0
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- >1000,00 0,179 - - #117 0
H-A114C-(C114)_mc-#115 0,238 - >699,755 -
H-A114C-(C114)_mv-#115 0,322 - >668,891 -
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mb-#69 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mv-#69 - - 0 0
H-A114C-(C114)_mc-0#118 0,098 - 432,816 -
H-(C)_mc-#117 <0,093 - 194,684 -
H-(C)_MalPeg6C2-#117 <0,080 - 361,061 -
H-(C)_mc-0#118 <0,073 - 541,542 -
H-(C)_MalPeg6C2-0#118 0,074 - 465,455 -
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- 0,513 - 574,794 - #226
H-A114C-(C114)_mc-#172 1,48 - 500,864 -
H-A114C-(C114)_mb-0#118 0,208 - 506,604 -
H-A114C-(C114)_me-0#118 0,236 - 903,571 -
H-A114C- 1,434 - 648,066 - (C114)_mcValCitPABC-#134
>1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#131 - 480,901 - 0
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- 54,268 - 656,645 - #126
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- >1000,00 - 543,693 - #123 0
>1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#126 - 749,49 - 0
H-A114C-(C114)_mv-0#118 0,147 - 490,276 -
H-(C)_MalPeg6C2-#226 0,206 - 582,309 -
H-(C)_mc-#226 0,219 - 477,622 -
H-(C)_m(H2O)c-0#118 0,071 - 306,626 -
H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-0#118 <0,059 - 441,766 -
H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-#69 0,203 - 459,502 -
H-(C)_m(H2O)c-#69 0,315 - 740,334 -
H-(C)_me-0#118 <0,061 - 455,314 -
H-(C)_mv-0#118 0,084 - 531,617 -
H-(C)_mb-0#118 0,076 - 584,327 -
H-A114C-(C114)_MalC6-#54 52,056 - 65,721 -
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#231 - - 0 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_MalC6-0#118 - - 0 0
H-(C)_Mal(H2O)Peg6C2-#115 0,095 - 698,101 -
H-A114C-(C114)_mc-#158 0,164 - 329,554 -
H-A114C- >1000,00 >1000,00 - - (C114)_mcValCitPABC-#231 0 0
H-(C)_m(H2O)c-#115 <0,069 - 534,743 -
>1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#237 - 646,464 - 0
>1000,00 >1000,00 H-A114C-(C114)_mc-#145 - - 0 0
H-A114C-(C114)_MalPeg6C2- >1000,00 >1000,00 - - #145 0 0
H-A114C-(C114)_mc-#162 0,201 - 676,764 -
H-A114C-(C114)_MalC6Am-#151 0,469 - 75,696 -
H-
(kK188)_COPeg2C2ValCitPABC- - - - -
#54
>1000,00 H-(C)_mcValCitPABC-0#118 0,081 - - 0
H-A114C- 1,708 - 566,056 - (C114)_mcValCitPABC-#154
H-A114C-(C114)_MalC6Am-#153 0,114 - 69,259 -
H-(C)_mcValCitPABC-#98 0,23 - 270,019 -
H-A114C- >1000,00 >1000,00 - - (C114)_mcValCitPABC-#246 0 0
H-H435A-(C)_mcValCitPABC- 0,208 - 339,77 - #54
H-M428L+N434S- 0,069 - 380,393 - (C)_mcValCitPABC-#70
H-M428L+N434S- 0,178 - - - (C)_mcValCitPABC-#54
H-E388C+N421C-
(C388+C421)_mcValCitPABC- 1,033 - 826,243 -
#54
H-Q347C+K392C-
(C347+C392)_mcValCitPABC- 0,103 - 390,7 -
#54
H-L443C+kK183C-
(C443+kC183)_mcValCitPABC- <0,103 - 395,707 -
#54
H-Q347C+kK183C-
(C347+kC183)_mcValCitPABC- <0,051 - 384,028 -
#54
H-Q347C- 2,89 - 393,412 - (C347)_mcValCitPABC-#54
H-K392C+L443C- 0,07 - 542,081 - (C392+C443)_mc-#115
H-E388C+N421C- >1000,00 0,227 - - (C388+C421)_mc-#115 0
H-Q347C+K392C- 0,068 - 934,867 - (C347+C392)_mc-#115 H-L443C+kK183C- 0,071 - 757,604 - (C443+kC183)_mc-#115 H-Q347C+kK183C- 0,073 - 741,434 - (C347+kC183)_mc-#115 H-Q347C-(C347)_mc-#115 0,098 - 888,128 - H-kK183C- 1,329 - 160,012 - (kC183)_mcValCitPABC-#54 H-E388C- 0,658 - 287,88 - (C388)_mcValCitPABC-#54 H-kK183C-(kC183)_mc-#115 0,179 - 775,698 - H-E388C-(C388)_mc-#115 0,124 - 958,96 - H-L443C-(C443)_mc-#115 0,108 - 451,857 - H-N421C- 0,601 - 263,107 - (C421)_mcValCitPABC-#54 H-N421C-(C421)_mc-#115 0,108 - 668,857 - H-A114C-(C114)_mcGly-#201 0,073 - - - Tabela 22 – Valores farmacocinéticos selecionados emn ratos para conjugados da invenção e valores farmacocinéticos selecionados em ratos compreendendo MMAD, MMAE ou MMAF. AUCs foram calculados a um 0-last de 0- 336 h exceto onde notado.
AUC (0-last) (µg*Horas/mL) ADC/Ab ADC Dose ADC Ab Ratio
H(C)-#D54 10 132001 164001 80 30 378002 417001 91 10 14140 20840 68 H(C)-#A69 30 44040 63480 69 100 146000 212000 69 10 13300 15780 84 H(C)-MalPEG6C2- 30 56180 60280 93
MMAD 100 134400 146800 92 10 7650 14500 53 H(C)-mc-MMAD 30 20700 43800 47 100 58000 121000 48 3 10803 29503 37 H(C)-vc-MMAE 10 39303 106003 37 30 134003 184003 - 10 10700 24500 44 H(C)-mc-MMAF 30 32000 71500 45 100 83600 176000 48 3 3800 5200 73 H(K)-MCC-DM1 10 12800 16200 79 30 39100 49600 79 1 representa um 0-last de 0-312 horas 2 representa um 0-last de 0-168 horas 3 representa um 0-last de 0-96 horas
Tabela 23 – Valores farmacocinéticos selecionados em camundongos para conjugados da invenção e para conjugados compreendendo MMAD, MMAE ou MMAF. AUCs foram calculados em um 0-last de 0-336 h exceto onde notado.
AUC (0-last) (µg*Horas/mL) ADC/Ab ADC Dose ADC Ab Ratio H(C)-#D44 3 10701 27201 39 H(C)-#D70 3 2240 4890 46 H(C)-#D69 3 2490 4770 52 H(C)-#A69 3 3594 5722 63 H(C)-MalPEG6C2- 3 2641 5415 49
MMAD H(C)-mc-MMAD 3 3580 4970 72 H(C)-vc-MMAE 3 1600 3290 49 H(C)-mc-MMAF 3 3080 4800 64 1 representa um 0-last de 0-168 horas
Tabela 24 – Dados mostrando estabilidade de conjugados preparados utilizando ligantes à base de succinimida de anel fechado versus de anel aberto
Herceptina ADC Estabilidade GSH Camundongo Camundongo
(6d) ADC AUC PK
(% de carga (ug*h/mL) ADC/Ab remanescente no dia 6)
mc-#118 anel 65% 2160 55%
fechado anel 87% 3490 65%
aberto
MalPeg6C2-#118 anel 82% 2010 70%
fechado anel 100% 3000 77%
aberto mc-#8261 anel 51% 3590 52%
fechado anel 96% 4470 73%
aberto
MalPeg6C2- anel 61% 2950 72%
#8261 fechado anel 104% - -
aberto mc-#115 anel - 1930 58%
fechado anel - 2330 68%
aberto
Tabela 25A – Cargas selecionadas e seus métodos de síntese
Preparada da mesma Quantidade Método de Exemplo maneira ou em mg purificação Método de (Rendimento)
preparação
10,5 mg #220 exemplo #107 Método M (43%)
15,2 mg #221 exemplo #107 Método M (76%)
Procedimento #222 Método J* 14 mg (39%) geral L
Procedimento 16,6 mg #223 Método J* geral L (42%)
Procedimento 18,8 mg #224 Método J* geral L (68%)
Procedimento 17,3 mg #225 Método J* geral L (64%)
cromatografia 354 mg #226 exemplo #146 de sílica (78%)
Procedimento 19,4 mg #227 Método J* geral L (77%)
#228 exemplo #131 Método E1* 30 mg (51%)
#229 exemplo #151 Método J* 16 mg (61%)
Procedimento #230 Método J* 69 mg (42%) geral L
Procedimento #231 Método J* 4,2 mg (44%) geral L*
113 mg #232 exemplo #98 Método J* (50%)
cromatografia #233 exemplo #146 88 mg (82%) de sílica
Procedimento #234 Método J* 8,5 mg (78%) geral L
Procedimento #235 Método J* 27 mg (77%) geral L*
#236 exemplo #131 achiral 3,7 mg (14%)
cromatografia 38,6 mg #237 exemplo #145 de sílica (93%)
cromatografia 419 mg #238 exemplo #145 de sílica (81%)
cromatografia 315 mg #239 exemplo #130 de sílica (48%)
#240 exemplo #142 Método E1* 6 mg (20%)
#241 exemplo #142 Método E1* 6 mg (20%)
#242 exemplo #145 Método J* 8 mg (10%)
#243 exemplo #145 Método J* 12 mg (22%)
#244 exemplo #145 Método J* 9,6 mg (20%)
Procedimento medium #245 38 mg (55%) geral M pressue C18 medium #246 exemplo #130 78 mg (80%) pressue C18
10,5 mg #247 exemplo #178 Método M* (57%)
Tabela 25B – Cargas selecionadas e seu nome IUPAC e dados de caracterização
Espectro de massa: LC-MS ou HPLC observado m/z e tempo de retenção em Exemplo Nome IUPAC 1 minutos: H RMN (400 MHz, DMSO- d6) salvo indicação em contrário
2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-
1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-
{[(2R,4S)-4-carboxi-1-
fenilpentan-2-il]amino}-1- HPLC (Protocolo CB): m/z 746,51 #220 metóxi-2-metil-3- [M+H+] (1,57 minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-
metóxi-5-metil-1- oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-
1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-
(biciclo[1.1.1]pent-1-
ilamino)-1-metóxi-2-metil-3- HPLC (Protocolo DB): m/z 622,42 #221 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- [M+H+] (1,57 minutos)
metóxi-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
LC-MS (Protocolo H): m/z 744,9
[M+H+] (2,19 minutos), 1H RMN (400
2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- MHz, CDCl3) δ 7,16-7,22 (m), 6,99-7,08 3-metóxi-1-{(2S)-2- (m), 6,42-6,51 (m), 6,10-6,17 (m), 4,87- [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(1R)- 4,96 (m), 4,65-4,79 (m), 4,27-4,36 (m), 2-metóxi-2-oxo-1-(1- 4,04-4,27 (m), 3,95-4,02 (m), 3,87-3,93 fenilciclopropil)etil]amino}- (m), 3,64-3,84 (m), 3,44-3,57 (m), 3,22- #222 2-metil-3- 3,42 (m), 3,08-3,17 (m), 2,98-3,07 (m), oxopropil]pirrolidin-1-il}-5- 2,90-2,93 (m), 2,85-2,89 (m), 2,53-2,57 metil-1-oxoheptan-4-il]-N- (m), 2,35-2,51 (m), 2,19-2,27 (m), 2,02- meth 2,16 (m), 1,93-2,00 (m), 1,77-1,90 (m), il-L-valinamida 1,57-1,70 (m), 1,35-1,52 (m), 1,26-1,33
(m), 1,19-1,25 (m), 1,11-1,16 (m), 1,03-
1,11 (m), 0,83-1,02 (m), 0,79-0,88 (m).
LC-MS (Protocolo H): m/z 744,4
[M+H+] (2,17 minutos), 1H RMN (400
MHz, CD3OD) δ 8,19-8,24 (m), 7,87- 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- 7,92 (m), 7,20-7,38 (m), 4,71-5,04 (m), 3-metóxi-1-{(2S)-2- 4,61-4,71 (m), 4,47-4,52 (m), 4,38-4,44 [(1R,2R)-1-metóxi-3-{[(1S)- (m), 4,05-4,13 (m), 3,99-4,04 (m), 3,90- 2-metóxi-2-oxo-1-(1- 3,98 (m), 3,64-3,73 (m), 3,52-3,60 (m), fenilciclopropil)etil]amino}- 3,46-3,52 (m), 3,37-3,46 (m), 3,35-3,37 #223 2-metil-3- (m), 3,29-3,35 (m), 3,24-3,28 (m), 3,15- oxopropil]pirrolidin-1-il}-5- 3,19 (m), 3,08-3,14 (m), 3,01-3,06 (m), metil-1-oxoheptan-4-il]-N- 2,84-2,87 (m), 2,43-2,63 (m), 1,96-2,20 meth (m), 1,68-1,95 (m), 1,60-1,66 (m), 1,52- il-L-valinamida 1,57 (m), 1,33-1,44 (m), 1,27-1,32 (m),
1,23-1,27 (m), 1,12-1,17 (m), 1,04-1,10
(m), 0,96-1,03 (m), 0,90-0,96 (m), 0,82-
0,90 (m).
LC-MS (Protocolo H): m/z 730,8 [M+H+] (2,15 minutos), 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,09-7,18 (m), 6,95- 7,08 (m), 4,88-4,93 (m), 4,75-4,85 (m), 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- 4,72-4,74 (m), 4,62-4,70 (m), 4,50-4,59 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1R)- (m), 4,09-4,16 (m), 3,96-4,06 (m), 3,82- 1-[(7R)-biciclo[4.2.0]octa- 3,90 (m), 3,67-3,76 (m), 3,58-3,67 (m), 1,3,5-trien-7-il]-2-metóxi-2- 3,58-3,67 (m), 3,45-3,54 (m), 3,33-3,44 #224 oxoetil}amino)-1-metóxi-2- (m), 3,33-3,44 (m), 3,28-3,33 (m), 3,10- metil-3-oxopropil]pirrolidin- 3,27 (m), 3,00-3,10 (m), 2,93-3,00 (m), 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-o 2,75-2,78 (m), 2,56-2,65 (m), 2,36-2,45 xoheptan-4-il]-N-metil-L- (m), 2,17-2,35 (m), 1,94-2,16 (m), 1,67- valinamida 1,94 (m), 1,48-1,67 (m), 1,27-1,33 (m), 1,23-1,27 (m), 1,17-1,26 (m), 1,08-1,17 (m), 0,98-1,07 (m), 0,86-0,98 (m), 0,77- 0,84 (m).
2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)- 1-[(7S)-biciclo[4.2.0]octa- 1,3,5-trien-7-il]-2-metóxi-2- LC-MS (Protocolo H): m/z 730,9 #225 oxoetil}amino)-1-metóxi-2- [M+H+] (2,19 minutos) metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-o xoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida
LC-MS (Protocolo Q): m/z 732,4 N,2-dimetilalanil-N- [M+H+] (1,24 minutos), 1H RMN δ [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 8,47-8,53 (m), 8,24-8,29 (m), 7,81-7,91 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- (m), 7,14-7,27 (m), 4,54-4,75 (m), 4,44- 3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- 4,54 (m), 3,94-4,02 (m), 3,72-3,78 (m), #226 fenilpropan-2-il]amino}-2- 3,61-3,69 (m), 3,28-3,36 (m), 3,14-3,28 metil-3-oxopropil]pirrolidin- (m), 2,99-3,08 (m), 2,81-2,97 (m), 2,29- 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4- 2,57 (m), 2,16-2,29 (m), 1,91-2,16 (m), il]-N-metil-L-valinamida 1,60-1,87 (m), 1,35-1,53 (m), 0,99-1,33 (m), 0,80-0,99 (m), 0,71-0,80 (m).
2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-({(1S)- 1-[(7R)-biciclo[4.2.0]octa- 1,3,5-trien-7-il]-2-metóxi-2- LC-MS (Protocolo Q): m/z 730,4 #227 oxoetil}amino)-1-metóxi-2- [M+H+] (1,29 minutos) metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-o xoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida
N,N,2-trimetilalanil-N-
[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-
{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-
3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- HPLC (Protocolo A*): m/z 746,5 [M+H+] #228 fenilpropan-2-il]amino}-2- (7,103 minutos) metil-3-oxopropil]pirrolidin-
1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-
il]-N-metil
-L-valinamida
N,N,2-trimetilalanil-N-
[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-
[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-
2-feniletil]amino}-1-metóxi- LC-MS (Protocolo Q1): m/z 732,3 #229 2-metil-3- [M+H+] (0,70 minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-
metóxi-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-
1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(R)-
carboxi(1-
fenilciclopropil)metil]amino}- HPLC (Protocolo G): m/z 730,4 [M+H+] #230 1-metóxi-2-metil-3- (1,25 minutos) oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-
metóxi-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valinamida
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 1020,6
[M+H+] (0,83 minutos), 1H RMN (400
MHz, CD3OD) δ 8,19-8,23 (m), 7,99- difluoro{2-metilalanil-N- 8,07 (m), 7,93-7,98 (m), 7,41-7,45 (m), [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- 7,23-7,31 (m), 7,17-7,22 (m), 7,00-7,04 [(3R,4R,7S)-7-benzil-15-{2- (m), 6,32-6,37 (m), 6,20-6,24 (m), 4,72- [(3,5-dimetil-1H-pirrol-2-il- 4,93 (m), 4,61-4,69 (m), 4,05-4,17 (m), kappaN)metilideno]-2H- 3,88-3,93 (m), 3,72-3,81 (m), 3,63-3,70 #231 pirrol-5-il-kappaN}-4-metil- (m), 3,56-3,62 (m), 3,48-3,56 (m), 3,25- 5,8,13-trioxo-2-oxa-6,9,12- 3,44 (m), 3,16-3,25 (m), 3,09-3,14 (m), triazapentadecan 2,98-3,09 (m), 2,81-2,90 (m), 2,54-2,67 -3-il]pirrolidin-1-il}-3-metóxi- (m), 2,39-2,53 (m), 2,09-2,32 (m), 1,75- 5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N- 1,97 (m), 1,60-1,69 (m), 1,52-1,59 (m), metil-L-valinamidato}boro 1,32-1,44 (m), 1,28-1,32 (m), 1,16-1,21
(m), 0,98-1,09 (m), 0,86-0,98 (m), 0,79-
0,90 (m).
LC-MS (Protocolo Q): m/z 769,3
[M+H+] (1,34 minutos), 1H RMN δ
9,04-9,17 (m), 8,88-8,94 (m), 8,70- 8,86
(m), 8,62-8,67 (m), 7,79-7,84 (m), 7,76- 2-metil-D-prolil-N- 7,79 (m), 7,65-7,69 (m), 7,61-7,64 (m), [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 7,20-7,31 (m), 7,12-7,20 (m), 5,44-5,52 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- (m), 5,34-5,46 (m), 4,70-4,78 (m), 4,56- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- #232 4,67 (m), 4,47-4,54 (m), 3,94-4,04 (m), fenil-1-(1,3-tiazol-2- 3,76-3,83 (m), 3,52-3,61 (m), 3,36-3,52 il)etil]amino}propil]pirrolidin- (m), 3,28-3,35 (m), 3,10-3,27 (m), 2,93- 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4- 3,08 (m), 2,77-2,80 (m), 2,64-2,70 (m), il]-N-metil-L-valinamida 2,35-2,54 (m), 2,09-2,34 (m), 1,96-2,09
(m), 1,54-1,88 (m), 1,38-1,52 (m), 1,18-
1,36 (m), 1,03-1,13 (m), 0,81-1,01 (m),
0,68-0,81 (m).
LC-MS (Protocolo Q): m/z 732,2
[M+H+] (1,28 minutos), 1H RMN δ metil N-{(2R,3R)-3-[(2S)-1- 8,48- 8,53 (m), 8,22-8,28 (m), 7,80-7,92 {(3R,4S,5S)-4-[{N-[(3- (m), 7,14-7,28 (m), 4,74-4,79 (m), 4,54- aminooxetan-3-il)carbonil]- 4,72 (m), 4,43-4,52 (m), 4,24-4,35 (m), L-valil}(metil)amino]-3- 4,07-4,12 (m), 3,94-4,02 (m), 3,72- #233 metóxi-5- 3,78 (m), 3,61-3,69 (m), 3,48-3,58 (m), metilheptanoil}pirrolidin-2- 3,40-3,48 (m), 3,11-3,35 (m), 2,98-3,11 il]-3-metóxi-2- (m), 2,75-2,97 (m), 2,64-2,69 (m), 2,30- metilpropanoil}-L- 2,55 (m), 2,17-2,28 (m), 2,03-2,14 (m), fenilalaninato 1,92-2,02 (m), 1,59-1,87 (m), 1,35-1,54
(m), 1,21-1,33 (m), 1,112-1,20 (m),
1,00-1,09 (m), 0, 70-0,98 (m).
LC-MS (Protocolo H): m/z 589,9
[M+H+2] (2,29 minutos), 1H RMN (400
2-metilalanil-N-{(3R,4S,5S)- MHz, CD3OD) δ 8,55-8,61 (m), 8,40- 1-[(2S)-2-{(3R,4R,7S,12S)- 8,45 (m), 8,34-8,39 (m), 8,23-8,28 (m), 7-benzil-14-[3-cloro-4- 8,14-8,19 (m), 7,84-7,95 (m), 7,79-7,84 (propan-2-iloxi)fenil]-4- (m), 7,71-7,77 (m), 7,61-7,68 (m), 7,46- metil-12-[4-(8- 7,52 (m), 7,34-7,40 (m), 7,09-7,27 (m), metilimidazo[1,2-a]piridin-2- 7,03-7,09 (m), 4,77-4,90 (m), 4,58-4,77 #234 il)benzil]-5,8,14-trioxo-2,9- (m), 4,43-4,55 (m), 4,17-4,33 (m), 4,07- dioxa-6,13-diazatetr 4,16 (m), 4,00-4,07 (m), 3,79-3,85 (m), adecan-3-il}pirrolidin-1-il]-3- 3,58-3,70 (m), 3,44-3,52 (m), 3,12-3,40 metóxi-5-metil-1- (m), 2,80-3,12 (m), 2,64-2,71 (m), 2,62- oxoheptan-4-il}-N-metil-L- 2,64 (m), 2,38-2,47 (m), 2,00-2,33 (m), valinamida 1,66-2,00 (m), 1,46-1,63 (m), 1,29-1,44
(m), 1,07-1,16 (m), 0,91-1,07 (m), 0,79-
0,87 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 944,3 [M+H+] (0,84 minutos), 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,54-8,59 (m), 8,29- 8,33 (m), 7,87-8,02 (m), 7,80-7,87 (m), 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)- 7,68-7,74 (m), 7,62-7,67 (m), 7,20-7,38 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)- (m), 4,98-5,06 (m), 4,84-4,97 (m), 4,66- 1-{[4-(5-fluoro-1,3- 4,79 (m), 4,61-4,66 (m), 4,13-4,19 (m), benzotiazol-2-il)-2- 3,98-4,04 (m), 3,91-3,96 (m), 3,79-3,85 metilfenil]amino}-1-oxo-3- (m), 3,64-3,73 (m), 3,38-3,56 (m), 3,34- #235 fenilpropan-2-il]amino}-1- 3,38 (m), 3,28-3,34 (m), 3,17-3,27 (m), metóxi-2-metil-3- 3,12-3,16 (m), 3,03-3,11 (m), 2,99-3,03 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3 (m), 2,86-2,87 (m), 2,80-2,82 (m), 2,69- -metóxi-5-metil-1- 2,71 (m), 2,31-2,54 (m), 2,27-2,31 (m), oxoheptan-4-il]-N-metil-L- 2,06-2,27 (m), 1,88-2,00 (m), 1,74-1,88 valinamida (m), 1,64-1,74 (m), 1,59-1,64 (m), 1,50- 1,59 (m), 1,27-1,48 (m), 1,19-1,26 (m), 1,11-1,16 (m), 1,06-1,11 (m), 0,96-1,05 (m), 0,86-0,94 (m), 0,77-0,83 (m).
1,2-dimetil-D-prolil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- LC-MS (Protocolo Q1): m/z 758,3 #236 fenilpropan-2-il]amino}-2- [M+H+] (0,74 minutos) metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4- il]-N-metil -L-valinamida
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 771,2
[M+H+] (0,67 minutos), 1H RMN (400
MHz, CD3OD) δ 7,95-7,96 (m), 7,48- N,2-dimetilalanil-N- 7,55 (m), 7,45-7,48 (m), 7,26-7,31 (m), [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- 6,94-7,18 (m), 5,45-5,49 (m), 5,19-5,22 [(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H- (m), 5,11-5,17 (m), 4,97-5,00 (m), 4,78- indol-3-il)-1-metóxi-1- 4,87 (m), 4,68-4,77 (m), 4,59-4,64 (m), oxopropan-2-il]amino}-1- 4,27-4,34 (m), 3,99-4,16 (m), 3,84-3,92 #237 metóxi-2-metil-3- (m), 3,78-3,82 (m), 3,62-3,78 (m), 3,49- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- 3,59 (m), 3,41-3,49 (m), 3,20-3,41 (m), metóxi-5-metil-1- 2,99-3,20 (m), 2,95-2,98 (m), 2,82-2,86 oxoheptan-4-il]-N-metil-L- (m), 2,77-2,79 (m), 2,62-2,68 (m), 2,28- valinamida 2,49 (m), 2,19-2,27 (m), 1,98-2,16 (m),
1,56-1,91 (m), 1,31-1,49 (m), 1,19-1,30
(m), 1,15-1,19 (m), 1,06-1,13 (m), 0,88-
1,03 (m), 0,79-0,87 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 758,84 [M+H+] (0,71 minutos), 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,15-7,32 (m), 5,86- N,2-dimetilalanil-N- 6,00 (m), 5,28-5,40 (m), 5,17-5,27 (m), [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 4,97-5,04 (m), 4,69-4,91 (m), 4,57-4,69 {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- (m), 4,05-4,21 (m), 3,91-3,96 (m), 3,79- 2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1- 3,88 (m), 3,71-3,78 (m), 3,62-3,70 (m), #238 oxo-3-fenil-1-(prop-2-en-1- 3,25-3,56 (m), 3,15-3,24 (m), 3,08-3,14 iloxi)propan-2- (m), 2,90-3,02 (m), 2,79-2,87 (m), 2,42- il]amino}propil]pirrolidin-1- 2,52 (m), 2,20-2,38 (m), 2,12-2,20 (m), il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]- 2,03-2,12 (m), 2,00-2,03 (m), 1,71- N-metil-L-valinamida 2,1,96 (m), 1,33-1,70 (m), 1,23-1,32 (m), 1,17-1,23 (m), 1,12-1,17 (m), 1,05- 1,10 (m), 0,94-1,05 (m), 0,82-0,89 (m).
LC-MS (Protocolo Q): m/z 786,6 [M+H+] (1,46 minutos), 1H RMN δ 2-metil-L-prolil-N- 8,35-8,42 (m), 8,21- 8,31 (m), 8,14-8,20 [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- (m), 7,15-7,29 (m), 4,66-4,76 (m), 4,53- [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-terc- 4,65 (m), 4,46-4,53 (m), 4,32-4,42 (m), butóxi-1-oxo-3-fenilpropan- 4,07-4,15 (m), 3,96-4,04 (m), 3,76-3,82 #239 2-il]amino}-1-metóxi-2- (m), 3,41-3,61 (m), 3,30-3,38 (m), 3,16- metil-3-oxopropil]pirrolidin- 3,30 (m), 3,08-3,15 (m) 2,99-3,08 (m), 1-il}-3-metóxi-5-metil-1- 2,92-2,96 (m), 2,78-2,90 (m), 2,63-2,78 oxoheptan-4-il]-N-metil (m), 2,37-2,58 (m), 2,18-2,36 (m), 2,03- -L-valinamida 2,13 (m), 1,89-2,01 (m), 1,64-1,88 (m), 1,35-1,62 (m), 1,31-1,35 (m), 1,17-1,31 (m), 1,03-1,14 (m), 0,70-1,01 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 798,2 N,2-dimetilalanil-N- [M+H+] (0,66 minutos), 1H RMN (400 [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- MHz, CD3OD) δ 8,43-8,49 (m), 7,50- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 7,53 (m), 7,42-7,48 (m), 7,06-7,20 (m), 2-metil-3-oxo-3-({(2S)-1- 4,21-4,83 (m), 3,95-4,13 (m), 3,76-3,88 oxo-3-fenil-1-[(1H-1,2,3- (m), 3,53-3,67 (m), 3,16-3,47 (m), 3,08- #240 triazol-4- 3,15 (m) 3,00-3,16 (m), 2,77-2,90 (m), ilmetil)amino]propan-2- 2,70-2,73 (m), 2,62-2,69 (m), 2,45-2,58 il}amino)propil]pirrolidin-1- (m), 2,34-2,41 (m), 2,21-2,29 (m), 2,12- il}-5-metil- 2,21 (m), 1,55-2,09 (m), 1,39-1,54 (m), 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- 1,16-1,36 (m), 1,04-1,14 (m), 0,85-0,99 valinamida (m), 0,73-0,80 (m), 0,00-0,02 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 755,1 [M+H+] (0,69 minutos), 1H RMN (400 N,2-dimetilalanil-N- MHz, CD3OD) δ 8,36-8,67 (m), 7,26- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 7,50 (m), 7,10-7,26 (m), 5,13-5,17 (m), {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 4,95-4,99 (m), 4,67-4,84 (m), 4,61-4,66 2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1- (m), 4,50-4,60 (m), 3,77-4,12 (m), 3,69- #241 oxo-3-fenil-1-(prop-2-yn-1- 3,75 (m), 3,56-3,66 (m), 3,44-3,54 (m), ilamino)propan-2- 3,19-3,44 (m) 3,12-3,19 (m), 3,03-3,12 il]amino}propil]pirrolidin-1- (m), 2,74-2,94 (m), 2,37-2,60 (m), 2,14- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]- 2,36 (m), 1,60-2,13 (m), 1,47-1,59 (m), N-metil-L-valinamida 1,19-1,40 (m), 1,11-1,16 (m), 0,88-1,11 (m), 0,75-0,84 (m), 0,02-0,06 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 722,95
[M+H+] (0,52 minutos) 1H RMN (400
MHz, CD3OD) δ 8,78-8,86 (m), 8,71- N,2-dimetilalanil-N- 8,73 (m), 7,96-8,00 (m), 7,34-7,40 (m), [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- 4,74-4,91 (m), 4,67-4,71 (m), 4,55-4,63 [(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H- (m), 4,13-4,22 (m), 4,04-4,10 (m), 3,97- imidazol-4-il)-1-metóxi-1- 4,01 (m), 3,84-3,92 (m), 3,66-3,82 (m), oxopropan-2-il]amino}-1- #242 3,42-3,64 (m), 3,26-3,42 (m) 3,11-3,21 metóxi-2-metil-3- (m), 2,90-2,92 (m), 2,83-2,84 (m), 2,59- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- 2,64 (m), 2,48-2,56 (m), 2,32-2,41 (m), metóxi-5-metil-1- 2,09-2,24 (m), 1,99-2,08 (m), 1,68-1,95 oxoheptan-4-il] (m), 1,59-1,66 (m), 1,51-1,58 (m), 1,35- -N-metil-L-valinamida 1,45 (m), 1,22-1,26 (m), 1,17-1,21 (m),
0,95-1,12 (m), 0,83-0,89 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 748,2
[M+H+] (0,52 minutos) 1H RMN (400
MHz, CD3OD), δ 8,91-8,99 (m), 8,42-
8,46 (m), 8,15-8,20 (m), 7,92-8,01 (m), N,2-dimetilalanil-N- 7,00-7,10 (m), 6,64-6,74 (m), 5,22-5,26 [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- (m), 5,06-5,09 (m), 4,79-4,95 (m), 4,65- [(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4- 4,79 (m), 4,59-4,65 (m), 4,12-4,21 (m), hidroxifenil)-1-metóxi-1- 4,05-4,12 (m), 3,91-3,99 (m), 3,84-3,90 oxopropan-2-il]amino}-1- #243 (m), 3,67-3,79 (m), 3,60-3,66 (m), 3,39- metóxi-2-metil-3- 3,57 (m), 3,34-3,39 (m) 3,29-3,34 (m), oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- 3,12-3,27 (m), 2,98-3,00 (m), 2,78-2,88 metóxi-5-metil-1- (m), 2,61-2,65 (m), 2,55-2,57 (m), 2,46- oxoheptan-4-il]- 2,53 (m), 2,10-2,36 (m), 1,68-1,96 (m), N-metil-L-valinamida 1,61-1,68 (m), 1,55-1,60 (m), 1,35-1,53
(m), 1,19-1,24 (m), 1,14-1,18 (m), 1,08-
1,13 (m), 0,98-1,08 (m), 0,84-0,92 (m).
LC-MS (Protocolo Q1): m/z 718,4
[M+H+] (0,66 minutos) 1H RMN (400
MHz, CD3OD), δ 7,87-7,92 (m), 7,71-
7,76 (m),7,46-7,53 (m), 7,40-7,46 (m), N,2-dimetilalanil-N- 7,19-7,33 (m), 4,81-4,96 (m), 4,68-4,77 [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- (m), 4,60-4,65 (m), 4,47-4,53 (m), 4,01- [(1R,2R)-3-{[(1R)-1-carboxi- 4,17 (m), 3,94-3,98 (m), 3,81-3,86 (m), 2-feniletil]amino}-1-metóxi- 3,68-3,76 (m), 3,56-3,64 (m), 3,40-3,50 #244 2-metil-3- (m), 3,36-3,40 (m) 3,26-3,35 (m), 3,23- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- 3,26 (m), 3,16-3,22 (m), 3,12-3,16 (m), metóxi-5-metil-1- 2,94-3,06 (m), 2,91-2,93 (m), 2,86-2,88 oxoheptan-4-il]-N-metil-L- (m), 2,41-2,66 (m), 2,32-2,41 (m), 1,97- valinamida 2,23 (m), 1,85-1,97 (m), 1,71-1,85 (m),
1,62-1,68 (m), 1,50-1,61 (m), 1,37-1,46
(m), 0,98-1,14 (m), 0,85-0,92 (m).
LC-MS (Protocolo Q): m/z 835,0 [M+Na+] (0,87 minutos) 1H RMN δ 9,58-9,69 (m), 8,84-9,16 (m), 8,69-8,77 1,2-dimetil-L-prolil-N- (m), 8,54-8,60 (m), 8,44-8,50 (m), 8,32- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1- 8,42 (m), 8,25-8,30 (m), 7,13-7,31 (m), {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 7,00-7,01 (m), 4,97-5,06 (m), 4,88-4,97 2-metil-3-oxo-3-{[(2S)-1- (m), 4,57-4,75 (m), 4,45-4,57 (m), 3,84- #245 oxo-3-fenil-1-(piperazin-1- 4,45 (m), 3,62-3,84 (m), 3,40-3,62 (m), il)propan-2- 3,13-3,33 (m), 2,77-3,10 (m), 2,67-2,75 il]amino}propil]pirrolidin-1- (m), 2,47-2,57 (m), 2,38-2,45 (m), 1,92- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il] 2,35 (m), 1,58-1,88 (m), 1,37-1,55 (m), -N-metil-L-valinamida 1,22-1,32 (m), 0,97-1,06 (m), 0,84-0,97 (m), 0,73-0,81 (m).
LC-MS (Protocolo Q): m/z 366,2[M+H+2] (0,91 minutos) 1H RMN δ 1,2-dimetil-L-prolil-N- 9,56-9,65 (m), 8,70-8,76 (m), 8,05-8,09 [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- (m), 7,77-7,92 (m), 7,14-7,30 (m), 4,60- [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-amino- 4,72 (m), 4,46-4,57 (m), 3,61-4,39 (m), 3-fenilpropan-2-il]amino}-1- 3,41-3,61 (m), 3,11-3,33 (m), 2,97-3,09 #246 metóxi-2-metil-3- (m), 2,79-2,94 (m), 2,63-2,74 (m), 2,38- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- 2,56 (m), 2,13-2,37 (m), 1,93-2,13 (m), metóxi-5-metil-1- 1,45-1,89 (m), 1,21-1,32 (m), 1,09-1,14 oxoheptan-4-il]-N-metil-L- (m), 1,03-1,08 (m), 0,84-095 (m), 0,73- valinamida 0,80 (m).
2-metil-D-prolil-N-
[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-
[(1R,2R)-3-{[2-(ciclohepta-
2,4,6-trien-1-il)etil]amino}-1-
metóxi-2-metil-3- HPLC (Protocolo DB): m/z 700,51 #247 oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- [M+H+] (2,56 minutos)
metóxi-5-metil-1-
oxoheptan-4-il]-N-metil-L-
valin amida

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula I:
I ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ; R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R3A e R3B são algum dos seguintes: (i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; ou (ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A e R4B são algum dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12 R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil; R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil; R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril; R13 é C1-C10 heterociclil; e X é O.
2. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIa: IIa ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência,
1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
Y O
Z Z
Y 1 R é , ou ; Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-; -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno- (C3-C8 heterociclo)- ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
H
N
O R10 N O
O Zé , , , O
O
O
H
N
O NH2 ou -NH2;
G é halogênio, -OH, -SH ou –S-C1-C6 alquil; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R3A e R3B são algum dos seguintes: (i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil ou halogênio; ou (ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A e R4B são algum dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12 R5 é , , , , , , , , , , , ,
, , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil; R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil;
R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril; R13 é C1-C10 heterociclil; e R7 é independentemente selecionado para cada ocorrência do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3; R10 é hidrogênio, -Cl-Cl0alquil, -C3-C8carbociclil, -aril, -Cl-C10heteroalquil, -C3- C8heterociclo, -Cl-Cl0alquileno-aril, -arileno-Cl-Cl0alquil, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8carbociclo), -(C3-C8 carbociclo)-Cl-Cl0alquil, -Cl-Cl0alquileno-(C3-C8heterociclo), e - (C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquil, em que aril em R10 compreendendo aril é opcionalmente substituído por [R7]h; h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e X é O.
3. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIIa: IIIa ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ; R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil;
R3A e R3B são algum dos seguintes: (i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou (ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A e R4B são algum dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R5 é
O R11 R11 O , O R11 , , O R11 ,
S 11 N N R R11 R11 H
O O N O O N R11 O , H , , , , N R11
H
S
N or NH-R11 , opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2,
-NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
Y
Z 11 R é , ou ; Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, C3-C8 carbociclo-, -arileno-, - C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl-Cl0alquileno- (C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-; Zé ou -NH2; G é halogênio, -OH, -SH ou –S-C1-C6alkyl R7 é independentemente selecionado para cada ocorrência do grupo que consiste em F, Cl, I, Br, NO2, CN e CF3; h é 1, 2, 3, 4 ou 5; e
X é O.
4. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIb: IIb ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ;
Y O
Z Z
Y R1 é , ou ; Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno- (C3-C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
Z é , , ,
O
H
L N
O
H
N
H
L N O O O , NH2 ou -NHL; L é um anticorpo; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R3A e R3B são algum dos seguintes: (i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou (ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A e R4B são algum dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12 R5 é , , , ,
, , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio,
-N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil; R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil; R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril; R13 é C1-C10 heterociclil; e X é O.
5. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIIb: IIIb ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ; R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R3A e R3B são algum dos seguintes:
(i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou (ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A e R4B são algum dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R5 é
O R11 R11 O , O R11 , , O R11 ,
S 11 N N R R11 R11 H
O O N O O N R 11 O , H , , , , N R11
H
S
N or NH-R11 , opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
R11 é , ou ; Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno- (C3-C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-; Z é , , ,
O
H
L N
O
H
N
H
L N O O O , NH2 ou -NHL; L é um anticorpo; X é O.
6. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIc: R3B' R3A' H O H L Z' R1' N N N N D N R5 R2' O O X
O O 1-20
IIc ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência,
O
O O O
H
N
Y N N
H H
O
O
NH
Y R1’ é ou O NH2 ; Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3- C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno-(C3- C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
O
H O
N N Z’ é O , O , ,
O
H
N
O
H
N
H
N O O O , NH2 , ou –NH-; L é um anticorpo; D é –C(R4A’)(R4B’)- ou é ausente; R2’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, ou é ausente se está presente; R3A’ e R3B’ são algum dos seguintes:
(i) R3A’ é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B’ é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil, ou R3B’ é C2-C4 alquileno e forma anel de 5-7 membros como indicado por ; ou (ii) R3A’ e R3B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A’ e R4B’ são algum dos seguintes: (i) R4A’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A’ e R4B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12 R5 é , , , , , , , , , , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil; R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil; R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril; R13 é C1-C10 heterociclil; e X é O.
7. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIIc:
H O H
N N N W N R5' R11'Z' L
O O O X 1-20 IIIc ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, Wé 1-2 R3A
N R1 , O , R3A
N R1 1-2 ou O ; R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R3A e R3B são algum dos seguintes: (i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou (ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A e R4B são algum dos seguintes: (i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
(ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
R5 é opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R',
-OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2,
-NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
O
O O O
H
N
Y N N
H H
O
O
NH
Y R11’ é ou O NH2 ; Y é -C2-C20 alquileno-, -C2-C20 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -arileno-, -C3-C8heterociclo-, -Cl-C10alquileno-arileno-, -arileno-Cl-Cl0alquileno-, -Cl- Cl0alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3-C8carbociclo)-Cl-C10alquileno-, -Cl-Cl0alquileno- (C3-C8heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-Cl-Cl0alquileno-;
O
H O
N N Z’ é O , O , ,
O
H
N
O
H
N
H
N O O O , NH2 , ou –NH-; L é um anticorpo; X é O.
8. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IId: R3B' R3A' H O H L [linker] N N N N D N R5 R2' O X
O O O 1-20 IId ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência,
L é um anticorpo; [ligante] é um ligante divalente; D é –C(R4A’)(R4B’)- ou é ausente; R2’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, ou é ausente se está presente; R3A’ e R3B’ são algum dos seguintes: (i) R3A’ é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e R3B’ é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil, ou R3B’ é C2-C4 alquileno e forma anel de 5-7 membros como indicado por ; ou (ii) R3A’ e R3B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno; R4A’ e R4B’ são algum dos seguintes: (i) R4A’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e R4B’ é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou (ii) R4A’ e R4B’, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
O R12
N R12 R5 é , , , , , , , ,
, , , , , , C1-C10 heterociclil, C3-C8 carbociclil e C6-C14 aril opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em -C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’ -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído, ou dois R’ podem, juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil;
O
O O R12 R6 N O R12 R6
O ou R5 é , R13 , ou
O R12
N
H R13 opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -C1-C8 alquil-N(R’)2, -C1-C8 alquil-C(O)R’, -C1-C8 alquil-C(O)OR’, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' e arileno-R’, em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C8 alquil, C1-C8heterociclil, C1-C10alquileno-C3-C8heterociclil e aril, ou dois R’ podem,
juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados, formar um C1-C10 heterociclil; R6 é hidrogênio, -C1-C8 alquil, -C2-C8 alquenil, -C2-C8 alquinil ou -C1-C8 haloalquil; R12 é hidrogênio, C1-C4 alquil, C1-C10 heterociclil ou C6-C14 aril; R13 é C1-C10 heterociclil; e X é O.
9. Composto CARACTERIZADO por ser de fórmula IIId:
H O H
N N N W N R5' [linker] L
O O O X 1-20 IIId ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que, independentemente para cada ocorrência, 1-2 R3A
N R1 W é , O , R3A
N R1 1-2 ou O ; R1 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R2 é hidrogênio, C1-C8 alquil ou C1-C8 haloalquil; R3A e R3B são algum dos seguintes: (i) R3A é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, aralquil ou halogênio; e
R3B é C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil, halogênio ou aralquil; ou
(ii) R3A e R3B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
R4A e R4B são algum dos seguintes:
(i) R4A é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; e
R4B é hidrogênio, C1-C8 alquil, C1-C8 haloalquil, C3-C8 carbociclil, C1-C10 heterociclil, aril, heteroaralquil ou aralquil; ou
(ii) R4A e R4B, tomados juntos, são C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno;
R5 é opcionalmente substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos independentemente selecionados do grupo que consiste em C1-C8 alquil, -O-(C1-C8 alquil), -C(O)R',
-OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R',
-S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2,
-NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR', em que cada R' é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C8 alquil e aril insubstituído;
[ligante] é um ligante divalente;
L é um anticorpo; X é O.
10. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO por W ser
11. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO por W ser .
12. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de R2 ser hidrogênio ou C1-C8 alquil.
13. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de R3A ser C1-C8 alquil, preferencialmente metil.
14. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-5, 7 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de R3A e R3B, tomados juntos, serem C2-C8 alquileno ou C1-C8 heteroalquileno.
15. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, 4, 6 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de R5 ser , , ou
16. Composto, sal ou solvato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo ser selecionado de trastuzumab, oregovomab, edrecolomab, cetuximab, um anticorpo humanizado monoclonal para o receptor de vitronectina ( v 3); alemtuzumab; um anticorpo anti- HLA-DR humanizado para o tratamento de linfoma de non-Hodgkin; 131I Lym-1; um anticorpo anti-HLA-Dr10 de murino para o tratamento de linfoma de non-Hodgkin; um mAb anti-CD2 humanizado para o tratamento de doença de Hodgkin ou linfoma de non-Hodgkin; labetuzumab; bevacizumab; ibritumomab tiuxetan; ofatumumab; panitumumab; rituximab; tositumomab; ipilimumab; gemtuzumab; um anticorpo anti- IL13; e um anticorpo anti-Notch.
17. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, CARACTERIZADO por ser selecionado de:
N N
O S O
H O S H H
H N N N N N NH N N NH H2N N
N N H2N
O O O O O , H2N O O O O O , O O O O O
S N ,
O
H
O H N N H N H2 N N O H
H N
N N O O O N N H2 N N O H2N N
O O
O O O NH O O O O O
O , , ,
O
H N
N N O H2N H N
O O N O
O O N O H H2N O H N
NH O
O O O O N N NH H2N N
O O O O
OH O O O
O , , ,
O
H
O H N N H N H2N N O H
N N H N HN N O O O H2N N N
O O N
O O O S N O O O
O O O S N
NH
O , N , ,
O
O H H N H
N O
H N N H N H2N N N NH O S N N N O H2N N
O O O O H O O
O O O N N O O O O O
O , , ,
O
O H
H N N
N N
N N NH O H H2N O O O
H N O O O O
N N O O H2N N OH NH
O O NH O
O O O O OH O O , , ,
O O
H H
N N N N O H N H2N N H N NH H2N N N
O O O O O O N
O O O O O
O O O O O O
NH NH
O O O
OH , , ,
O O
H H O
N N N N H
HN N N N N
N N
O O O H O O O N
O O O H O O O
O O OH
NH NH
O O NH
O O
O , , ,
O
H
N N O
HN N H O
N N H
O O O HN N N N
O O HN N
H O O O
N O O O O O
O N O
H NH O O NH2 NH
O
HN , , ,
O O
H O H
N N O H N N
HN N H N HN N
N N N
O O O O HN N H O O O
O H O O O
O O O OH
N N NH
O O , , ,
O H H H
H N O O
N N H N H N
N N N N N H2N O O H2N N H2N N
O O O O O O O O O , O O O O O , O O O O O ,
O
O H
H N N
O H N N N
H N N N
N O O O
N N O O O O O O H2N N O H
O O H OH N
O O O O O N O OH
O , , ,
NH O
S O H
O H O H N N
H N H N N
HN N N N N N O
N HN
N O O O
O O O O O
O O O O O O O , , O
N H O ,
NH O NH O
H H NH
N N N H O
N
N N N N
O O O O O O N
O OH O O O
O O OH
N O ,
N
O H O O H O , O
N
H O ,
O F H O
HN F H HN O
N N N N H H
N N N N N
O O O N N
O O O O H
O O O O O O O
O
N N O H O , O H O , ,
O O
H H H H
N N N F H O H
N N N N N N
N N HN N N
H H N
O O O O O O O O O O
O O O O O , , ,
F H O H N N
N O H O H
HN N N H H N
N N N S N N S
N N N
O N N
O O O O H H O
O O O O O O O O O , , ,
O N H
F H H N N
HN N N S F H O H O O
N N
N HN N N S
O N N N
O O O O HN
O O O O O N
O , ,
O
O
O
O
N H O , O NH2 H
O O N O O O NH2
HN N
N N N
N HN N HN N
O N N
O O O
O O O
O O O
O O
N
O H O , O
N H O , O
N H O ,
H O
F H O H N
N O N N
HN N N F H H N
N HN N N N
N O O O
O O O O O O
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18. Composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, CARACTERIZADO por ser selecionado de:
e
19. Ligante de carga ou um conjugado droga-anticorpo CARACTERIZADO por compreender um radical de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 ou 18.
20. Conjugado droga-anticorpo CARACTERIZADO por compreender um radical de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1-3.
21. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo CARACTERIZADO por ser selecionado de:
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N O O e .
22. Conjugado droga-anticorpo CARACTERIZADO por compreender um radical de um composto, conforme definido na reivindicação 21.
23. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
24. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
25. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
26. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
27. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
28. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
29. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
30. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser de fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
31. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-29, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, e excipiente farmaceuticamente aceitável.
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