式IおよびIIの化合物は、抗体に抱合されて、抗体薬物複合体(ADC)を形成していてもよい。ADC複合体において、式Iの化合物および式IIの化合物は、それらが抱合されている抗体によって目的の治療標的に送達される治療部分として供される。式Iおよび式IIの化合物および抗体の抱合によって形成されるADCを含む医薬組成物もまた提供される。式Iの化合物および式IIの化合物を用いるADCの調製方法もまた提供される。本開示のADCを投与することを特徴とするそれを必要とする癌の治療方法もまた提供される。本発明のADCを化学療法薬と組み合わせて投与することを特徴とする癌の治療方法もまた提供される。
前記に記載の明細書は、当業者が実施態様を実施できるために十分であると考えられる。前記明細書および実施例は、一定の実施態様を詳細に記載し、本発明者らによって考えられる最良の様式を記載する。しかしながら、いかに詳細な記載がなされていたとしても、本実施態様は多くの方法で実施されてもよく、特許請求の範囲はそのいかなる均等物をも含むものであると理解される。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の組成物またはプロセス工程に限定されるべきではなく、そのようなものは代えることができるものと理解されるべきである。本明細書および特許請求の範囲で用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」には、特に文脈が示していない限り、複数の対象が含まれるものである。用語「a」(または「an」)、ならびに用語「1つまたはそれ以上の」および「少なくとも1つの」は、本明細書で交換可能に用いることができる。
さらに、本明細書で用いられる「および/または」は、一方とともに、もしくは一方を有しない2つの特定の特徴または構成成分の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。よって、本明細書で「Aおよび/またはB」などの用語で用いられる用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)、および「B」(単独)を含むものとされる。同様に、「A、B、および/またはC」などの用語で用いられる用語「および/または」は、下記の態様の各々を包含するものとされる:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);ならびにC(単独)。
他で定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示に関連する当業者によって一般に理解される用語と同一の意味を有する。例えば、 the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で用いられる多くの用語の一般的な辞書の技術の1つを提供する。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系(SI)で認められた形で表示される。数字範囲は、その範囲を定義する数字が含まれる。特に断りがなければ、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシ基の方向に左から右に記載される。本明細書で提供される表題は、様々な態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照しうる。よって、すぐ下で定義される用語は、明細書全体を参照して十分に定義されている。
用語「を含む」とともに態様が本明細書に記載される場合、「からなる」および/または「から必須としてなる」の用語で記載される類似する態様もまた提供されるものと理解される。
用語「阻害する」、「妨害する」、および「抑制する」は、本明細書で交換可能に用いられ、生物学的活性の統計学的な有意な減少(活性の全阻害を含む)を意味する。例えば、「阻害」は、生物学的活性の約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%の減少を意味しうる。
細胞増殖は、細胞分裂の割合、および/または細胞分裂を経験する細胞集団内の細胞のフラクション、および/または最終分化または細胞死による細胞集団からの細胞喪失の割合(例えば、チミジン取り込み)を測定する当業者で認識されている技術を用いて試験することができる。
本明細書で交換可能に用いられる用語「抗体」または「免疫グロブリン」には、全体抗体およびそれらの抗原結合フラグメントもしくは単鎖、ならびにそれらの組み合わせ(例えば、二重特異性抗体)が含まれる。
典型的な抗体には、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも2つの重鎖(H)および2つの軽鎖(L)が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、VHと略称される)および重鎖定常領域(本明細書では、CHと略称される)から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、VLと略称される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FW)と呼ばれるより保存されている領域で散在される相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性領域にさらに細分化することができる。各VHおよびVLは、下記の順番でアミノ末端からカルボキシル末端に編成される3つのCDRおよび4つのFWから構成される:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子(免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞および伝統的な補体系の第1因子(C1q))を含む)への結合を介在することができる。本開示の抗体の例としては、典型的な抗体、scFvs、およびそれらの組み合わせであって、例えば、scFvは、典型的な抗体の重鎖および/または軽鎖のいずれかのN末端に共有結合しているか(例えば、ペプチド結合または化学リンカーにより)、あるいは典型的な抗体の重鎖および/または軽鎖に挿入されている。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはこれらの組み合わせを認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いられるように、用語「抗体」には、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント)、単鎖可変フラグメント(scFv)、ジスルフィドで安定化したscFv、複数特異性抗体(例えば、少なくとも2つのインタクトな抗体および/またはその抗原結合フラグメントから作成された二重特異性抗体)、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む他の改変免疫グロブリン分子(前記抗体が所望の生物学的活性を示す場合に限る)が包含される。
抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとそれぞれ呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそれらのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)のいずれかでありうる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次立体構造を有する。抗体は、そのままであるか、あるいは毒素、放射性同位体などの他の分子に抱合されて、ADCを形成しうる。
用語「抗原結合フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を意味し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を示す。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって達成されうることが当該技術分野で知られている。抗体フラグメントの例としては、下記に限定されないが、抗体フラグメントから形成されるFab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント、直鎖抗体、単鎖抗体、および複数特異性抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」は、単一抗原決定因子またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関連する均一な抗体集団を意味する。これは、典型的に、異なる抗原決定因子に対して異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。
用語「モノクローナル抗体」には、インタクトおよび全長モノクローナル抗体の両方ならびに抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、単鎖可変フラグメント(scFv)、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む他の改変免疫グロブリン分子が包含される。さらに、「モノクローナル抗体」は、以下に限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、および遺伝子組み換え動物(例えば、遺伝子組み換えマウスにおけるヒト抗体発現)による多くのいずれかの方法で作成されたこのような抗体を意味する。
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト(例えば、マウス)配列を含有するように改変されている非ヒト(例えば、マウス)免疫グロブリンに由来する抗体を意味する。典型的に、ヒト化抗体は、CDRに由来する残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター)のCDRに由来する残基によって置き代えられるヒト免疫グロブリンである(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525;Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327;Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536)。ある例において、ヒト免疫グロブリンのFW残基は、所望される特異性、および/または親和性、および/または能力を有する非ヒト種に由来する抗体における対応する残基で置き代えられる。
用語「抗体薬物複合体」(ADC)は、少なくとも1つの式Iの化合物または式IIの化合物に抱合された目的のエピトープに結合する少なくとも1つの抗体を含む複合体を意味する。式Iの化合物および式IIの化合物は、抗体に抱合されて抗体薬物複合体(ADC)を形成し、それにより式Iの化合物および式IIの化合物は、それらが抱合されている抗体によって目的の治療標的に送達される治療部分として供されうる。
ある態様において、ADCには、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の治療部分が含まれる。ある特定の態様において、ADCには、2個、3個、または4個の治療部分が含まれる。ある態様において、全ての治療部分は、同一である。ある態様において、少なくとも1つの治療部分は、残りの部分と異なる。
用語「対象」は、動物(例えば、哺乳類)であって、下記に限定されないが、特定の治療のレシピエントであるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを意味する。典型的に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象について本明細書では交換可能に用いられる。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性を可能にするような形態であり、この組成物が投与される対象に許容されない毒性を有するさらなる成分を含有しない調製物を意味する。このような組成物は無菌でありうる。
「治療する」または「治療」または「治療するため」または「軽減する」または「軽減するため」などの用語は、(1)診断された病状または障害の症状を治癒し、遅延させ、軽減し、および/または進行を止める治療的手段、ならびに(2)標的とする病状または障害の発症を予防し、および/または遅延させる予防的もしくは予防手段の両方を意味する。よって、治療を必要とするものには、障害にすでに罹っているもの;障害に罹りやすいもの;ならびに障害が予防されるべきものが含まれる。ある態様において、対象は、患者が、例えば、特定タイプの癌の総合的、部分的、もしくは一次的な寛解を示す場合、本開示の方法による癌のために継続して「治療される」。
用語「癌」、「腫瘍」、「癌性」、および「悪性」は、制御されていない細胞増殖によって一般に特徴付けられる哺乳類における身体的状態を意味するか、または記載する。癌の例としては、以下に限定されないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫、および白血病を含む癌が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌(例えば、肝癌および肝細胞癌)、膀胱癌、乳癌(ホルモン介在性乳癌を含み、例えば、Innes et al. (2006) Br. J. Cancer 94:1057-1065を参照のこと)、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)、唾液腺癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道腺癌、様々なタイプの頭頚部癌および粘液性起源の癌、例えば、粘膜性卵巣癌、胆管細胞癌(肝臓)、および腎乳頭癌が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「細胞毒性剤」は、広く定義され、細胞の機能を抑制し、もしくは阻害し、および/または細胞(細胞死)の破壊を引き起こし、および/または抗悪性腫瘍/抗増殖性効果を示す物質を意味する。例えば、細胞毒性剤は、腫瘍性腫瘍細胞の発生、成熟、または拡大を直接的もしくは間接的に防ぐ。前記用語にはまた、細胞分裂停止効果のみを引き起こし、細胞毒性効果を生じないような薬剤が含まれる。前記用語には、下記で特定されるような化学療法薬、ならびに他のHER2アンタゴニスト、抗血管形成薬、チロシンキナーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼA阻害剤、サイトカインファミリーのメンバー、放射性同位体、ならびに細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素などの毒素類が含まれる。
用語「化学療法薬」は、天然または合成化学化合物を含む用語「細胞毒性剤」の一部である。化学療法薬の例としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ならびにアルキル化作用を有する他の化合物、例えば、ニトロソ尿素、シスプラチンおよびダカルバジン;代謝拮抗剤、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト;分裂阻害剤、例えば、ビンカアルカロイドおよびポドフィロトキシン誘導体;細胞傷害性抗生物質およびカンプトテシン誘導体が挙げられる。他の化学治療薬は、アミホスチン(ethyol(登録商標))、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標))、リポソーマルドキソルビシン(doxil(登録商標))、ゲムシタビン(gemzar(登録商標))、ダウノルビシン、リポソーマルダウノルビシン(daunoXome(登録商標))、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、5−フルオロウラシル(5−FU)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT−11、10−ヒドロキシ−7−エチル−カンプトテシン(SN38)、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標))、ダカルバジン、フロキシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシルアロマターゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせである。
本開示の方法によれば、本開示の化合物およびADCは、患者に投与されて癌に関する陽性治療寛解を促進しうる。癌治療に関する用語「陽性治療寛解」は、前記疾患に付随する症状における改善を意味する。
例えば、前記疾患における改善は、完全寛解として特徴付けることができる。用語「完全寛解」は、過去の試験結果の正常化を伴い、臨床的に検出可能な疾患の不存在を意味する。あるいは、前記疾患における改善は、部分寛解であるものとして分類することができる。「陽性治療寛解」には、癌の進行および/または期間の減少または阻害、癌の重症度の減少または軽減、および/または本開示の化合物の投与から生じるこれらの1つまたはそれ以上の症状の緩和が包含される。
臨床的な寛解は、PET、磁気共鳴画像法(MRI)スキャン、X放射線画像、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、フローサイトメトリーもしくは蛍光標示式細胞分取器(FACS)解析、組織学的検査、肉眼所見、および血液化学検査などのスクリーニング技術(下記に限定されないが、ELISA、RIA、クロマトグラフィーなどによって検出可能な変化を含む)を用いて評価することができる。これらの陽性治療寛解に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状における改善の有益な効果を受けることができる。
本開示の化合物は、癌、例えば、大腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部扁平細胞癌、および乳癌の治療に有用と知られているか、あるいは用いられているか、または現在使用中である、薬剤または薬剤の組み合わせを含む、癌のための公知の治療と組み合わせて用いることができる。抗癌剤には、悪性腫瘍、例えば、癌の増殖を治療するために用いられる薬物が含まれる。薬物治療は、単独で、または外科手術もしくは放射線療法などの他の治療と組み合わせて用いることができる。いくつかのクラスの薬物は、関連する臓器の性質に応じて、癌治療に用いることができる。例えば、乳癌は、一般にエストロゲン類によって刺激され、これらの性ホルモンを不活性化する薬物で治療することができる。同様に、前立腺癌は、男性ホルモンのアンドロゲンを不活性化する薬物で治療することができる。
本開示の特定の方法における使用のための抗癌剤としては、特に、抗体、代謝拮抗剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管標的薬、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、免疫治療薬、ホルモン療法、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害剤、mTOR阻害剤、化学療法薬、タンパク質キナーゼB阻害剤、フォスファチジルイノシトール 3−キナーゼ(PI3K)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤、RLr9、CD289、酵素阻害剤、抗TRAIL、MEK阻害剤などが挙げられる。
組み合わせ治療が、別の治療薬の投与と組み合わせた本開示の化合物の投与を含む場合、本開示の方法には、別々の製剤または単一医薬製剤、およびいずれかの順序による連続投与を用いた共投与が包含される。ある態様において、本明細書に記載の式Iの化合物、式IIの化合物、および/またはADCは、他の薬物と組み合わせて投与され、前記抗体または抗原結合フラグメント、変異型、またはこれらの誘導体、および治療薬は、連続して、いずれかの順序で、または一緒に(すなわち、同時に、または同一期間内に)投与することができる。
組み合わせ治療は、「相乗」を提供し、「相乗的な」効果を示すことができ、すなわち、その効果は、一緒に用いられる活性成分が、別々にそれらの化合物を用いることから生じる効果の合計よりも高い場合に達成される。相乗的効果は、活性成分が:(1)共製剤化され、投与されるか、あるいは合わせた単位用量製剤で一緒に送達され;(2)別々の製剤として交互に、もしくは並行して送達され;または(3)他の計画によって送達される場合に達成することができる。別の治療で送達される場合、相乗的効果は、化合物が、例えば、別のシリンジで異なる注射によって連続して投与されるか、または送達される場合に達成することができる。一般に、別の治療期間中、各活性成分の有効な用量は、連続して、すなわち、順次投与される一方、組み合わせ治療では、2つまたはそれ以上の活性成分の有効な用量は、一緒に投与される。
本開示(治療剤)の化合物およびADCは、経口、非経口、吸入または局所経路によって患者に投与されてもよい。本明細書で用いられる用語「非経口」としては、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣投与が挙げられる。しかしながら、本明細書の記載に適合する他の方法において、ADCは、本発明の化合物を選択的に標的として、治療薬を有害な細胞集団の部位に直接送達し、それによりその障害のある部位の治療薬への露出を増加させるために用いることができる。
本明細書に記載されるように、本開示の治療剤は、癌のインビボ治療のための医薬的に許容される組成物で投与することができる。典型的に、本開示の化合物は、静脈内投与のための溶液または(生理食塩水、5% デキストロース、または同様の等張溶剤等とともに)静脈内溶液を調製するための再構成用の凍結乾燥された濃縮物として製剤化される。前記医薬組成物には、例えば、水、イオン交換剤、タンパク質、緩衝物質、および塩を含む医薬的に許容される担体が含まれうる。保存添加剤もまた存在しうる。担体は、溶媒または分散媒体でありうる。本明細書に記載の治療方法における使用に適する製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)に記載される。
ある場合において、無菌の注射溶液は、本開示の治療薬を適当な溶媒の必要な量で含ませ、続いて滅菌濾過することによって調製することができる。さらに、前記調製物は、包装され、キットの形態で販売することができる。このような製品は、添付された組成物が疾患または障害に罹っているか、または罹りやすい対象を治療するために有用であることを示す表示または添付文書を有しうる。
非経口製剤は、単回ボーラス投与、点滴または充填ボーラス投与、続いて維持投与が行われうる。これらの組成物は、具体的な固定または変動間隔、例えば、1日1回、または「必要に応じて」に基づいて投与することができる。
前記組成物は、単回用量、複数回用量として、または点滴で設定された期間にわたり投与することができる。投薬計画はまた、適切な所望の反応(例えば、治療または予防応答)を提供するように調整することができる。
例えば、大腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、および乳癌を含む癌の治療のための本開示の組成物の治療上有効な用量は、投与方法、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、他の投与される薬剤、および治療が予防または治療であるかを含む、多くの異なる因子によって変動する。通常、前記患者は、ヒトであるが、非ヒト哺乳類(遺伝子組み換え哺乳類を含む)もまた治療することができる。治療用量は、安全性および有効性を最適化するための当業者に公知の所定の方法を用いて漸増することができる。
投与される本開示の治療薬の量は、過度の実験を要することなく当業者によって容易に決定することができる。投与様式および薬剤の各量に影響を与える因子としては、以下に限定されないが、疾患の重症度、病歴、ならびに治療を受けている個体の年齢、身長、体重、健康、および身体状態が挙げられる。同様に、投与される抗HER2結合分子、例えば、抗体、またはそのフラグメント、変異型、もしくは誘導体の量は、投与様式に依存し、対象がこの薬の単一用量もしくは複数回用量を受けるかどうかに依存する。
本開示はまた、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、メラノーマ、膵臓癌、および前立腺癌を含む癌のタイプの治療薬の製造における本開示の治療薬の使用について提供する。
本開示はまた、癌のタイプを治療するための対象の治療薬の製造における本開示の治療薬の使用について提供する。ある態様において、該薬は、少なくとも1つの他の療法で前もって治療を受けている対象に用いられる。
「前治療された」または「前治療」は、標的とする対象が、本開示の化合物を含む薬剤を受容する前に1つまたはそれ以上の他の療法を受容している(例えば、少なくとも1つの他の抗癌療法で治療されている)ことを意味する。前記対象は、治療前に前治療に対する応答者である必要はない。よって、薬剤を受容する対象は、過去の治療による前治療、または複数の治療を含む1つまたはそれ以上の過去の治療による前治療に応答し、または応答し得なかったものでありうる。
本開示はまた、癌を治療するための対象の治療薬の製造における治療薬の使用であって、前記治療薬が、対象が少なくとも1つの他の療法で治療される前に投与される使用を提供する。
本開示の態様は、本開示の特定の化合物および中間体の製造、ならびに本開示の化合物の使用方法を詳細に記載する下記の非限定的な実施例を参照することによりさらに定義することができる。原料および方法の両方に対する多くの改変は、本開示の範囲から逸脱することなく実施することができることが当業者にとって明らかである。
他に示されていない限り:
(i)特に記載されていなければ、操作が、室温または周囲温度、すなわち、18−25℃の範囲で行われる場合;温度は摂氏温度(℃)で付与され;
(ii)溶液は、無水硫酸ナトリウムもしくは硫酸マグネシウムで乾燥させ;有機溶媒の蒸発は、減圧下(4.5〜30mmHg)にて30℃までの浴温でロータリーエバポレーターを用いて行われ;
(iii)クロマトグラフィーは、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーを意味し;薄層クロマトグラフィー(TLC)は、シリカゲルプレート上で行われ;
(iv)一般に、反応経過は、TLCまたは液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)に従い、反応時間は、例示のみを付与するに過ぎず;
(v)最終生成物は、条件を満たしたプロトン核磁気共鳴(NMR)スペクトルおよび/または質量スペクトルデータを示し;
(vi)収率は、例示のみを付与し、必ずしも精力的なプロセス開発によって得ることができるものではなくてもよく;より多くの物質が必要であれば調製を繰り返し;
(vii)付与される場合、他に記載がなければ、核磁気共鳴(NMR)データは、主要な診断用プロトンのためのデルタ(Δ)値の形であり、内部標準としてテトラメチルシラン(TMS)と比較して100万分の1(ppm)で付与され、d6−DMSO中で300または400MHzで測定され;
(viii)化学記号は、それらの通常の意味を示し;
(ix)溶媒比は、体積:体積(v/v)の用語で付与され;
(x)化合物の精製は、1つまたはそれ以上の下記の方法を用いて行われ:
a)通常のシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー;
b)シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー(Isco Combiflash(登録商標)分離システムを使用):RediSep順相フラッシュカラム、流速、30−40ml/分(ISCO MPLC
c)Gilson semiprep HPLC分離システム:YMC pack ODS−AQカラム、100x20mm、S5μm 12nm、水(0.1% トリフルオロ酢酸)および溶媒としてのアセトニトリル(0.1% トリフルオロ酢酸),20分;ならびに
(xi)下記の略語が用いられる:
Boc t−ブトキシカルボニル;
DCM ジクロロメタン;
DIAD アゾジカルボン酸ジイソプロピル;
DIC N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド;
DCC N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド;
DIEA ジエチルイソプロピルアミン;
DMA N,N−ジメチルアセトアミド;
DMF N,N−ジメチルホルムアミド;
EDCI 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
EtOAc 酢酸エチル;
Et2O ジエチルエーテル;
Fmoc−OSu 9−フルオレニルメチル N−スクシンイミジル カルボネート
MeOH メタノール;
Na2CO3 炭酸ナトリウム;
NaHCO3 炭酸水素ナトリウム;
RT 室温;
TEA トリエチルアミン
TFA トリフルオロ酢酸;
THF テトラヒドロフラン
HATU 1−[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]−1H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリジニウム 3−オキシド ヘキサフルオロホスフェート
DAST 三フッ化ジエチルアミノ硫黄
ACN アセトニトリル
Boc2O 二炭酸ジ−tert−ブチル
メルドラム酸 2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4,6−ジオン
中間体1
MeOH(40mL)および水(40.0mL)中の(2R,4R)−4−メチルピペリジン−2−カルボン酸(2g,13.97mmol)の溶液に、パラホルムアルデヒド(2.52g,27.94mmol)およびPd/C(10%)(0.8g,7.52mmol)を加えた。反応混合液を、水素雰囲気下にて室温で終夜攪拌した。TLCにより、該反応は完了しなかった。さらに1当量のパラホルムアルデヒド(2.52g,27.94mmol)を加え、該反応混合物をさらに24時間攪拌した。TLCにより該反応が完了したことが示され、反応混合物を濾過し、該触媒をMeOHで洗浄した(2×30mL)。濾液を減圧中で濃縮して、粗生成物を白色の固形物として得、これをエーテルで洗浄し(3×30mL)、高真空で終夜乾燥させて、(2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボン酸(1)(1.870g,85%)を白色の固形物として得た。LC-MS: 158 (M+ 1);
1H NMR (400 MHz, D
2O) δ ppm 0.97 (d, J=5.52 Hz, 3 H), 1.54 (br. s, 1 H), 1.71 - 1.87 (m, 3 H), 1.91 - 2.07 (m, 1 H), 2.84 (s, 3 H), 3.13 (td, J=8.41, 3.76 Hz, 1 H), 3.35 (m, 1 H), 3.65 (m, 1 H).
中間体2
Boc
2O(243.0g,1.1mol)を、室温で攪拌しながらアセトン(1L)および水(1L)中の(R)−3−アミノ−4−メチルペンタン酸(市販品として入手可能な)(133.0g,1.0mol)およびNa
2CO
3(212g,2.0mol)の懸濁液に滴下して加えた。反応混合液を終夜攪拌し、該有機溶媒を減圧下で留去した。該残渣を水(1L)で希釈し、EtOAcで洗浄した(500mL×3)。該水層を、2N HCl溶液でpH=3まで酸性にし、生じた混合物をEtOAcで抽出した(800mL×3)。抽出物を合わせて、食塩水で洗浄し(800mL×1)、乾燥させ(Na
2SO
4)、濃縮して、化合物(2)(224.0g,収率97%)を油状物として得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。
中間体3
トリエチルアミン(67g,0.61mol)を、0℃で攪拌しながらCH
2Cl
2(1.4L)中の中間体2(140.0g,0.61mol)およびN,O−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(74.1g,0.76mol)の懸濁液に加えた。該懸濁液を0.5時間攪拌し、EDCI(74g,0.61mol)を0℃で少しずつ加えた。反応混合液を0℃で2時間攪拌し、水(800mL)を加えた。有機層を分離し、5% KHSO
4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(800mL×3)、続いて食塩水(800mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。該残渣を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(EtOAc/ヘキサン=1:5)、化合物(3)(141.0g,収率84%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.26 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 2.60~2.80 (m, 2H), 1.85 (m, 1H), 1.41 (s, 9H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
中間体4
ヨードエタン(250.0g,1.6mol)を、0℃で攪拌しながらDMF(1.1L)中の中間体3(55.0g,0.2mol)の溶液に加えた。続いて、NaH(60%懸濁液,24.0g,0.60mol)を0℃で少しずつ加え、該反応混合物を室温に温め、12時間攪拌した。該反応を水(2L)で慎重にクエンチし、EtOAc(2L)を加えた。有機層を分離し、5% KHSO
4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(800mL×3)、そして食塩水(800mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。該残渣を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(EtOAc/ヘキサン=1:10)、tert−ブチル (R)−エチル(1−(メトキシ(メチル)アミノ)−4−メチル−1−オキソペンタン−3−イル)カルバメート(35.1g,収率58%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.70 (s, 3H), 3.65 (m, 1H), 3.10~3.30 (m, 5H), 2.50~2.95 (m, 2H), 1.90~2.20 (m, 1H), 1.40~1.55 (m, 9H), 1.10 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
中間体5
n−BuLi(106mL,ヘキサン中で2.5N,0.17mol)の溶液を、N
2下にて−78℃で攪拌しながら1時間にわたって、乾燥THF(500mL)中の中間体50(74g,0.24mol)の溶液に滴下して加えた。該懸濁液をさらに30分間攪拌し、続いて、乾燥THF(300mL)中の中間体4(51.0g,0.17mol)の溶液を−78℃で30分かけて滴下して加えた。反応混合液を−78℃で1時間攪拌し、続いて室温に温め、12時間攪拌した。該反応物を20% 塩化アンモニウム水溶液(1L)でクエンチし、該有機溶媒を減圧下で留去した。生じた混合物をEtOAcで抽出した(800mL×3)。有機層を合わせて、5% KHSO
4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(800mL×3)、そして食塩水(800mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(EtOAc/ヘキサン=1:10)、tert−ブチル (R)−(1−(4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−4−メチル−1−オキソペンタン−3−イル)(エチル)カルバメート(58.1g,収率73%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.53 (m, 1H), 4.90 (s, 2H), 4.04 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 1.40 (s, 9H), 0.80~1.20 (m, 21H), 0.14 (s, 6H).
中間体6
LiBH
4(4.8g,0.22mol)を、室温で攪拌しながら0.5時間かけて、メタノール(500mL)中の中間体5(47.1g,0.1mol)の溶液に少しずつ加えた。該懸濁液を2時間攪拌し、該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をEtOAc(800mL)中に溶解させ、得られた溶液を飽和NaHCO
3溶液(500mL×3)および食塩水(500mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質を、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(EtOAc/ヘキサン=1:6)、tert−ブチル((1R,3R)−1−(4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−1−ヒドロキシ−4−メチルペンタン−3−イル)(エチル)カルバメート(13.5g,収率28%)およびその異性体(化合物6’)(21.0g,収率45%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3) d ppm -0.06 - 0.05 (m, 6 H) 0.76 - 0.89 (m, 15 H) 1.12 (t, J=6.97 Hz, 3 H) 1.39 (s, 9 H) 1.55 - 2.05 (m, 3 H) 2.86 - 3.21 (m, 2 H) 3.76 - 3.96 (m, 1 H) 4.73 (d, J=1.13 Hz, 4 H) 7.01 (s, 1 H).
中間体7
塩化アセチル(45.2g,0.58mol)を、0℃で攪拌しながら10分かけて、ピリジン(500mL)中の中間体6(34.0g,72mmol)の溶液に滴下して加えた。反応混合液を室温に温め、12時間攪拌した。該反応を水(200mL)でクエンチし、該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をCH
2Cl
2(800mL)で処理し、生じた混合物を5% KHSO
4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(800mL×3)および食塩水(800mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(EtOAc/ヘキサン=1:10)、(1R,3R)−3−((tert−ブトキシカルボニル)(エチル)アミノ)−1−(4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−4−メチルペンチルアセテート(25.7g,収率69%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.15 (m, 1H), 5.95 (m, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.04 (m, 1H), 3.10 (m, 2H), 2.35 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.00 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.80~1.10 (m, 15H), 0.08 (s, 6H).
中間体8
THF(200mL)中のフッ化テトラブチルアンモニウム(65.3g,0.25mol)の溶液を、0℃で攪拌しながらTHF(300mL)中の中間体7(25.7g,50mmol)の溶液に滴下して加えた。反応混合液を室温にし、4時間攪拌した。水(800mL)を加え、該有機溶媒を減圧下で留去した。該残渣をCH
2Cl
2(800mL)で処理し、生じた混合物を5% KHSO
4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(800mL×3)および食塩水(800mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(EtOAc/ヘキサン=1:4)、(1R,3R)−3−((tert−ブトキシカルボニル)(エチル)アミノ)−1−(4−(ヒドロキシメチル)チアゾール−2−イル)−4−メチルペンチル アセテート(19.5g,収率98%)を油状物として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.26 (m, 1H), 5.95 (m, 1H), 4.83 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.56 (s, 9H), 1.10~1.30 (m, 3H), 0.80~1.05 (m, 6H).
中間体9
デス・マーチン試薬(32.7g,75mmol)をジクロロメタン(300mL)中の中間体8(20.0g,50mmol)の溶液に加え、該反応混合物を室温で12時間攪拌した。該混合物を水酸化ナトリウム溶液(1N,300mL×3)、チオ硫酸ナトリウム溶液(1N,300mL×3)、飽和NaHCO
3(300mL×3)溶液、続いて食塩水(300mL×1)でそれぞれ洗浄した。有機層を乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮して、対応するアルデヒド化合物を得た。この粗アルデヒド化合物をtert−ブチルアルコール(500mL)中に溶解させ、水(300mL)中の亜塩素酸ナトリウム(80%,36.4g,320mmol)およびリン酸二水素ナトリウム一水和物(105g,0.77mol)の溶液を、室温で1時間かけて滴下して加えた。反応混合液を3時間攪拌し、塩酸溶液(0.1N,500mL)で希釈した。生じた混合物をEtOAcで抽出し(500mL×1)、該有機層を合わせて、5% KHSO
4溶液(500mL×3)および食塩水(500mL×1)で洗浄し、Na
2SO
4で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。該残渣を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して(CH
2Cl
2/MeOH=100:5)、2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((tert−ブトキシカルボニル)(エチル)アミノ)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸(15.4g,収率58%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3): δ 9.90 (br s, 1H), 8.27 (s, 1H), 5.96 (m, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.15 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
中間体10
DCM(60mL)中の中間体9(6.5g,15.68mmol)の溶液に、0℃でTFA(30mL)を滴下して加えた。該混合物を0℃で1時間攪拌した。該溶媒を減圧中で蒸発させて、粗2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−(エチルアミノ)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸を得た。粗生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した(7.2グラム)。LC-MS : 315 (M + 1),
中間体11
アセトン(300mL)および水(150mL)の混合液中の中間体10(5g,11.67mmol)および炭酸水素ナトリウム(9.80g,116.71mmol)の溶液に、(9H−フルオレン−9−イル)メチル(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)カルボネート(3.94g,11.67mmol)を加えた。該混合物を室温で終夜攪拌した。LC/MSにより、該反応が完了したことが示された。該混合物を塩酸で(pH2)まで酸性にし、アセトンを減圧中で蒸発させた。該生成物をDCMで抽出した(3×300mL)。有機抽出物を合わせて、0.1% HCl溶液(200mL)、食塩水(200mL)で洗浄し、Na
2SO
4で乾燥させ、減圧中で蒸発させた。該残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して(シリカゲル,MeOH/DCM,MeOH 0%〜5%)、2−((1R,3R)−3−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)−1−アセトキシ−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸(3.53g,54.6%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 537.2 (M+1);
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 (d, J=6.78 Hz, 3 H), 0.92 - 1.05 (m, 5 H), 1.14 (d, J=3.01 Hz, 1 H), 1.73 (dt, J=10.23, 6.43 Hz, 1 H), 1.92 - 2.05 (m, 1 H), 2.12 - 2.27 (m, 4 H), 2.28 - 2.44 (m, 1 H), 2.90 - 3.33 (m, 2 H), 3.98 (t, J=9.29 Hz, 1 H), 4.12 - 4.32 (m, 1 H), 4.47 - 4.82 (m, 2 H), 5.95 (dd, J=10.92, 2.89 Hz, 1 H), 7.29 - 7.45 (m, 4 H), 7.55 - 7.69 (m, 2 H), 7.72 - 7.81 (m, 2 H), 8.22 - 8.29 (m, 1 H).
中間体12
DMAP(106g,0.86mol)を、ジクロロメタン(1.5L)中のBoc−L−4−ニトロ−フェニルアラニン(1800g,0.58mol)およびメルドラム酸(92g,0.64mol)の溶液に加えた。生じた溶液をN
2雰囲気下で−5℃に冷却し、ジクロロメタン(1L)中のDCC(240g,1.16mol)を1時間かけて加えた。該混合物を0〜5℃で終夜攪拌した。続いて、沈殿したN,N’−ジシクロヘキシルウレアを濾過により除去し、該濾液を5% HCl溶液(1L×3)、そして食塩水(1L×1)で洗浄し、MgSO
4で乾燥させた。MgSO
4を濾過により除去し、有機層を乾燥するまで濃縮した。該残渣をEtOAc/ヘキサン(1:1,500mL)でトリチュレートし、乾燥させて、tert−ブチル (S)−(1−(2,2−ジメチル−4,6−ジオキソ−1,3−ジオキサン−5−イル)−3−(4−ニトロフェニル)−1−オキソプロパン−2−イル)カルバメート(130.0g,収率51%)を黄色の固形物として得た
中間体13
AcOH(400mL)を、N
2下にて−5℃でジクロロメタン(1.5L)中の中間体12(130.0g,0.298mol)の溶液に加えた。固形物NaBH
4(22.7g,0.597mol)を2時間かけて少しずつ加えた(ガス発生と発熱)。−5℃でさらに3時間攪拌し、TLCにより、該反応が完了したことが示された。該混合物を食塩水(1L)でクエンチした。有機層を分離し、水(1L×2)、飽和NaHCO
3水溶液(1L×3)、続いて食塩水(1L×3)で順次洗浄し、MgSO
4で乾燥させた。濾液を乾燥するまで濃縮し、tert−ブチル (R)−(1−(2,2−ジメチル−4,6−ジオキソ−1,3−ジオキサン−5−イル)−3−(4−ニトロフェニル)プロパン−2−イル)カルバメート(70.3g,収率55%)を黄色の固形物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.18 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.41 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.58 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 2.97 (d, J=6.6 Hz, 2H), 2.27 (m ,2H), 1.80 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.35 (s, 9H).
中間体14
K
2CO
3(35g,0.25mol)およびMeI(36g,0.25mol)を、アセトン(400mL)およびDMF(400mL)中の中間体13(70.3g,0.167mol)の溶液に加えた。該混合物を室温で終夜攪拌した。TLCにより出発物質が使い果たされたことが示された。水(2L)を加え、該混合物をさらに1時間攪拌した。沈殿した固形物を濾過により回収し、水で洗浄し、乾燥させて、tert−ブチル (S)−(1−(4−ニトロフェニル)−3−(2,2,5−トリメチル−4,6−ジオキソ−1,3−ジオキサン−5−イル)プロパン−2−イル)カルバメート(34.5g,収率47%)を淡黄色の固形物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.17 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.34 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.22 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 2.85 (m, 2H), 2.22 (m ,2H), 1.73 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.31 (s, 9H).
中間体15
中間体14(34.5g,79.1mmol)をトルエン(500mL)中に溶解させた。該溶液を40時間加熱還流させた。TLCにより、該反応の完了が示された。溶媒を留去して、tert−ブチル (5R)−3−メチル−5−(4−ニトロベンジル)−2−オキソピロリジン−1−カルボキシレート(30g)を得て、さらに精製することなく次の工程に使用した。
中間体16
K
2CO
3(22g,0.16mol)を、MeOH(300mL)中の中間体15(30g,79mmol)の溶液に加えた。該混合物を室温で3時間攪拌した。TLCにより、完全な変換が示された。該溶媒を留去し、残渣をジクロロメタン(500mL)中に溶解させ、食塩水で洗浄し(500mL×3)、MgSO
4で乾燥させた。MgSO
4を濾過により留去し、有機層を乾燥するまで濃縮した。該残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン=1:10)でさらに精製し、メチル (4R)−4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−2−メチル−5−(4−ニトロフェニル)ペンタノエート(23.5g,2ステップで81%の収率)を1:1のジアステレオマー混合物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.13 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.34 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.43 (m, 1H), 3.85 (m,1H), 3.65 (s ,3H), 2.85 (m, 2H), 2.65 (m ,1H), 1.85 (m, 1H), 1.50 (m, 1H), 1.30 (s, 9H), 1.15 (t, J=6.6 Hz, 3H).
中間体17
50gの化合物(16)を、Chiralpak ID 21×250mm,5μカラム(移動相A 90% 二酸化炭素および移動相B イソプロパノール 10%を60ml/分の流速で使用)上でSFC(超臨界流体クロマトグラフィー)を用いるキラルクロマトグラフィーにかけた。40℃で分離を行い、270nMで検出した。基準の分離を行い、2つのフラクションを単離した。ピークBは、所望のメチル (2S,4R)−4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−2−メチル−5−(4−ニトロフェニル)ペンタノエートであり、固形物27.4g(55%)として得た。>99:1のジアステレオマー過剰量(Chiralpak IAカラム 4.6×250mm,5μ、ヘキサン中で10%の1:1のメタノール:イソプロパノール(0.1% ジエチルアミン改質剤を含有))。LC/MS (2分, 酸_CV10.olp法 367 (M + 1), 1.16分.
1H NMR (400 MHz, メタノール-d
4) d ppm 8.16 (d, J=8.53 Hz, 2 H) 7.46 (d, J=8.53 Hz, 2 H) 3.79 - 3.93 (m, 1 H) 3.68 (s, 3 H) 2.90 - 2.99 (m, 1H) 2.71 - 2.81 (m, 1 H) 2.47 - 2.59 (m, 1 H) 1.81 - 1.95 (m, 1 H) 1.55 - 1.66 (m, 1 H) 1.32 (s, 9 H) 1.21 - 1.25 (m, 2 H) 1.16 (d, J=7.03 Hz, 3 H)
中間体18
6N HCl水溶液中の中間体17の溶液(8.0mL,263.30mmol)をマイクロ波にて130℃で30分間加熱した。反応混合液を凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−アミノ−2−メチル−5−(4−ニトロフェニル)ペンタン酸を固形物として得た。該生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した(3.2g)。LC-MS : 253 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, D
2O) δ ppm 1.12 (d, J=7.28 Hz, 3 H), 1.62 - 1.76 (m, 1 H), 1.90 - 2.02 (m, 1 H), 2.56 - 2.68 (m, 1 H), 3.02 - 3.11 (m, 2 H), 3.58 - 3.69 (m, 1 H), 7.47 (d, J=8.53 Hz, 2 H), 8.18 (d, J=8.78 Hz, 2 H).
中間体19
アセトン(30mL)および水(15mL)の混合液中の中間体18(0.43g,1.49mmol)およびNaHCO
3(1.251g,14.89mmol)の溶液に、(9H−フルオレン−9−イル)メチル 2,5−ジオキソピロリジン−1−イル カルボネート(0.502g,1.49mmol)を加えた。該混合物を室温で終夜攪拌した。LC/MSにより、該反応の完了が示された。該混合物を塩酸でpH2まで酸性にし、アセトンを減圧中で蒸発させた。該生成物をDCMで抽出した(3×60mL)。有機抽出物を合わせて、1N HCl溶液(40mL)、食塩水(40mL)で洗浄し、Na
2SO
4で乾燥させ、減圧中で蒸発させた。該残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して(EtOAc DCM中で0%〜100%)、(2S,4R)−4−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−2−メチル−5−(4−ニトロフェニル)ペンタン酸(0.630g,89%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 475.5 (M+H);
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.81 - 1.06 (m, 1 H), 1.08 - 1.28 (m, 2 H), 1.33 - 1.75 (m, 1 H), 1.77 - 2.11 (m, 1 H), 2.36 - 2.69 (m, 2 H), 2.76 - 3.18 (m, 1 H), 3.43 - 4.08 (m, 1 H), 4.09 - 4.19 (m, 1 H), 4.21 - 4.53 (m, 2 H), 4.54 - 4.80 (m, 1 H), 7.18 - 7.58 (m, 8 H), 7.66 - 7.82 (m, 2 H), 7.95 - 8.17 (m, 2 H), 8.67 (br. s., 1 H.
中間体20
DIEA(0.419mL,2.40mmol)を、DCM(4.5mL)中の中間体19(0.380g,0.80mmol)の溶液に加え、該混合物を室温で5分間攪拌し、続いて2−クロロトリチル クロリド樹脂(0.4mmol/gの荷重,0.5g,0.80mmol)を該混合物に加えた。該混合物を室温で終夜攪拌し、得られた樹脂をDMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、次いでDCM(3×6mL)で洗浄し、続いてDIEA(0.419mL,2.40mmol)およびMeOH/DCM(1:1,5mL)で室温にて30分間処理した。得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、そしてDCM(3×6mL)で洗浄し、高真空中で終夜乾燥させた。少量の化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析した。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 475 (M + 1).
中間体21
樹脂中間体20(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 253 (M + H).
中間体22
中間体21の樹脂(0.5g,1.88mmol)に、室温でDMF(5mL)中の中間体11(1.108g,2.07mmol)、HATU(1.428g,3.76mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.500mL,3.76mmol)、およびDIEA(0.656mL,3.76mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、およびDCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 771 (M + H).
中間体23
中間体22の樹脂(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 549 (M + 1).
中間体24
DCM(120mL)中の(2S,3S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルペンタン酸(Fmoc−イソロイシン)(7g,19.81mmol)およびピリジン(1.602mL,19.81mmol)の溶液に、カニューレにより10分かけてDCM(20mL)中のDAST(3.11mL,23.77mmol)の溶液を加えた。反応混合液を室温で1時間攪拌し、DCM(80mL)で希釈し、氷冷水で洗浄し(2×200mL)、該有機層をMgSO
4で乾燥させ、濾過し、減圧中で蒸発させて、(9H−フルオレン−9−イル)メチル (2S,3S)−1−フルオロ−3−メチル−1−オキソペンタン−2−イルカルバメート(6.65g,94%)を白色の固形物として得た。エステル化試験を行って、無水MeOH(0.3mL)およびDIEA(0.030mL)中にFmoc−Ile−F(5mg)を溶解させ、室温で15分間反応させることにより定量的な酸フッ化物の形成を確認した。続いて、該混合物を減圧中で蒸発させ、LC/MSにより解析し、1%以下のFmoc−Ile−OHの存在が示された。
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) d ppm 0.83 - 1.12 (m, 6 H) 1.18 - 1.37 (m, 1 H) 1.42 - 1.59 (m, 1 H) 2.01 (br. s., 1 H) 4.26 (t, J=6.78 Hz, 1 H) 4.44 - 4.63 (m, 3 H) 5.20 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 7.31 - 7.39 (m, 2 H) 7.40 - 7.47 (m, 2 H) 7.61 (d, J=7.28 Hz, 2 H) 7.80 (d, J=7.53 Hz, 2 H)
中間体25
中間体23の樹脂(0.5g,0.80mmol)に、室温でDCM(5mL)中の中間体24(0.569g,1.60mmol)、DMAP(4.89mg,0.04mmol)、およびDIEA(0.419mL,2.40mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で終夜攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、高真空中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析した。LC/MSにより該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 884 (M + H).
中間体26
中間体25の樹脂(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 662 (M + 1).
中間体27
樹脂中間体26(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の中間体1(0.252g,1.60mmol)、HATU(0.608g,1.60mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.320mL,2.40mmol)、およびDIEA(0.419mL,2.40mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、そしてDCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 801 (M + 1).
中間体28
樹脂中間体27に、DMF(5mL)中の塩化スズ(II)二水和物(1.805g,8.00mmol)、および酢酸ナトリウム(0.197g,2.40mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で4時間攪拌した。生じた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、およびDCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 771 (M + H).
化合物1
樹脂中間体28(0.1g,0.16mmol)に、室温でDCM(1mL)、水(0.200mL)およびTFA(1mL)を加えた。該混合物を室温で20分間攪拌し、続いて濾過し、該樹脂を水/TFAで洗浄し(1:1,3×2 mL)、該濾液を減圧中で蒸発させた。該残渣を逆相HPLCにより精製して(ACN/H
2O 0.1% TFA(14分でACN 5%〜50%))。純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−アミノフェニル)−2−メチルペンタン酸(0.050g,35.3%)を固形物として得た。LC/MS : 771.8 [M+1];
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) d ppm 7.8 (s, 1 H) , 7.30 (d, J=8.53 Hz, 2 H), 7.08 - 7.18 (m, 2 H), 5.66 (d, J=13.05 Hz, 1 H), 4.57 (d, J=8.53 Hz, 1 H), 4.29 (ddd, J=9.98, 6.71, 2.89 Hz, 1 H), 3.90 (br. s., 1 H), 3.73 (d, J=6.27 Hz, 1 H), 3.24 - 3.33 (m, 1 H), 2.84 (d, J=7.28 Hz, 2 H), 2.68 (br. s., 3 H), 2.40 - 2.53 (m, 2 H), 2.20 - 2.36 (m, 1 H), 2.03 - 2.12 (m, 4 H), 1.75 - 2.00 (m, 7 H), 1.64 (ddd, J=14.12, 10.23, 4.02 Hz, 2 H), 1.42 - 1.57 (m, 2 H), 1.30 (t, J=7.15 Hz, 3 H), 1.01 - 1.17 (m, 7 H), 0.88 - 0.98 (m, 7 H), 0.84 (t, J=7.40 Hz, 3 H), 0.77 d, J=6.53 Hz, 3 H).
中間体29
MeOH(4.0mL)および水(4.0mL)中の2−エチルピペリジン−2−カルボン酸(320mg,1.65mmol)の溶液に、パラホルムアルデヒド(372mg,4.13mmol)およびPd/C(10%)(88mg,0.83mmol)を加えた。1当量の炭酸ナトリウム(175mg,1.65mmol)を加え、該反応混合物を水素雰囲気下にて室温で終夜攪拌した。LC/MSにより出発物質の完全な変換が示された。反応混合液を珪藻土に通して濾過した。該濾過ケーキをMeOHで洗浄した(2×30mL)。濾液を減圧中で濃縮して粗生成物を得た。該粗固形物をメタノール(50mL)中に懸濁し、得られた懸濁液を濾過し、該濾液を濃縮して、2−エチル−1−メチルピペリジン−2−カルボン酸(202mg,71.4%)を固形物として得た。LC/MS: 172 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 3.58 (td, J=12.80, 3.51 Hz, 1 H), 3.09 - 3.20 (m, 1 H), 2.81 (s, 3 H), 2.17 - 2.29 (m, 1 H), 1.54 - 1.84 (m, 7 H), 0.98 (t, J=7.40 Hz, 3 H).
中間体30
樹脂中間体26(0.2g,0.32mmol)に、DMF(5mL)中の中間体29(0.082g,0.48mmol)、HATU(0.243g,0.64mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.127mL,0.96mmol)およびDIPEA(0.168mL,0.96mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×4mL)、MeOH(3×4mL)、およびDCM(3×4mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 815 (M + H).
中間体31
樹脂中間体30に、DMF(5mL)中の塩化スズ(II)二水和物(0.544g,2.41mmol)および酢酸ナトリウム(0.059g,0.72mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で4時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、そしてDCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 785 (M + H).
化合物2
樹脂中間体31に、室温でDCM(2mL)およびTFA(0.493mL,6.40mmol)を加えた。該混合物を室温で20分間攪拌した。該樹脂をDCM/TFA(1:1,3×2mL)で洗浄し、該濾液を減圧中で蒸発させた。該残渣を逆相HPLCにより精製した(ACN/H
2O 0.1% ギ酸,ACN 10%〜50%,14分)。該純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−N−エチル−2−(2−エチル−1−メチルピペリジン−2−カルボキサミド)−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−アミノフェニル)−2−メチルペンタン酸(0.057g,20.31%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 785 (M + H).;
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 7.98 (s, 1 H), 6.87 (m, J=8.28 Hz, 2 H), 6.54 (m, J=8.03 Hz, 2 H), 5.63 - 5.73 (m, 1 H), 4.60 - 4.71 (m, 3H), 4.17 (br. s., 2 H), 3.76 (dd, J=14.93, 7.15 Hz, 1 H), 2.69 (d, J=6.53 Hz, 2 H), 2.42 (br. s., 1 H), 2.36 (s, 3 H), 2.29 (br. s., 2 H), 2.03 - 2.12 (m, 3 H), 1.88 (d, J=9.79 Hz, 3 H), 1.79 (br. s., 2 H), 1.49 - 1.64 (m, 5 H), 1.43 (br. s., 2 H), 1.23-1.35 (m, 4 H), 1.11 (d, J=7.78 Hz, 1 H), 1.06 (d, J=7.03 Hz, 4 H), 0.93 (d, J=15.81 Hz, 3 H), 0.94 (d, J=15.56 Hz, 3 H), 0.70 - 0.87 (m, 9 H).
中間体32
ACN(20mL)中の1−(tert−ブトキシカルボニル)−2−メチルピペリジン−2−カルボン酸(1g,4.11mmol)および炭酸カリウム(0.852g,6.17mmol)の懸濁液に、臭化ベンジル(0.733mL,6.17mmol)を滴下して加えた。生じた反応混合物を室温で終夜攪拌した。LC/MSにより、所望生成物の生成が示された。反応混合物を水(2mL)で希釈し、酢酸エチルで抽出した(2×30mL)。抽出物を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製して(シリカゲル,ヘキサン/酢酸エチル,80/20溶離液)、2−ベンジル 1−(tert−ブチル) 2−メチルピペリジン−1,2−ジカルボキシレート(1.27g,92%)を油状物として得た。LC-MS: 356 (M+ Na);
1H NMR (400 MHz, CD
2Cl
2) δ ppm 7.33 - 7.45 (m, 5 H), 5.13 - 5.27 (m, 2 H), 3.91 - 4.09 (m, 1 H) ,2.83 - 3.09 (m, 1 H), 2.10 -2.32 (m, 1 H), 1.56 - 1.72 (m, 1 H), 1.30 - 1.51 (m, 12 H), 1.09 (qd, J=12.42, 4.64 Hz, 1 H), 0.90 - 0.98 (m, 3 H).
中間体33
DCM(10mL)中の中間体32(1.2g,3.60mmol)の溶液に、TFA(4.16mL,53.99mmol)を滴下して加えた。生じた反応混合物を室温で2時間攪拌した。LC/MSによりBocの完全な脱保護が示された。溶媒を減圧下で留去した。粗製物質を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で塩基性にし、該水層を酢酸エチルで抽出した(2×50mL)。抽出物を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで濃縮して、ベンジル 2−メチルピペリジン−2−カルボキシレート(810mg)を油状物として得た。該粗生成物を精製することなく次の工程に使用した。LC/MS: 234 (M + 1).
中間体34
DCM(25mL)中の中間体33(1.45g,6.22mmol)およびDIEA(2.388mL,13.67mmol)の溶液に、0℃でクロロギ酸ベンジル(0.875mL,6.22mmol)を滴下して加えた。生じた溶液を室温で2時間攪拌した。反応混合液を30mLのDCMで希釈し、4mLの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、5分間攪拌した。有機層を分離し、水層をDCMで抽出した(2×30mL)。有機抽出物を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製して(シリカゲル,ヘキサン/酢酸エチル,90/10)、ジベンジル 2−メチルピペリジン−1,2−ジカルボキシレート(1.32g,58%)を油状物として得た。LC-MS: 268 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, メタノール-d
4) δ ppm 7.21 - 7.42 (m, 10 H), 5.04 - 5.18 (m, 2 H), 5.00 (br. s., 2 H), 4.91 (br. s., 1 H), 3.88 (d, J=12.80 Hz, 1 H), 3.17 (t, J=9.54 Hz, 1 H), 1.83 - 1.97 (m, 1 H), 1.55 - 1.78 (m, 4 H), 1.51 (s, 3 H).
中間体35
中間体34を、2種類のエナンチオマーのSFCキラルカラム分割(Chiralpak AD,二酸化炭素/メタノール 90%−10%)にかけて、所望生成物ジベンジル (R)−2−メチルピペリジン−1,2−ジカルボキシレートを単離した,LC-MS: 368 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 7.19 - 7.44 (m, 10 H), 5.04 - 5.15 (m, 2 H), 5.00 (br. s., 2 H), 3.88 (d, J=13.05 Hz, 1 H), 3.17 (t, J=9.54 Hz, 1 H), 1.84 - 1.97 (m, 1 H), 1.55 - 1.78 (m, 5 H), 1.51 (s, 3 H); % ee :> 98 : 旋光度: [α]
D: +2 (メタノール)
中間体36
メタノール(10mL)中の中間体35(600mg,1.63mmol)の溶液に、パラホルムアルデヒド(49.0mg,1.63mmol)およびパラジウム炭素(174mg,1.63mmol)を加えた。反応混合液を水素雰囲気下にて室温で終夜攪拌した。LC/MSにより、出発物質の消費が示された。反応混合液を濾過し、該触媒をMeOHで洗浄した(2×30mL)。濾液を減圧中で濃縮して、粗生成物を白色の固形物として得、これをエーテルで洗浄し(3×30mL)、高真空中で終夜乾燥させて、1,2−ジメチルピペリジン−2−カルボン酸(230mg,90%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 158 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ ppm 3.03 - 3.18 (m, 1 H), 2.76 (br. s., 3 H), 2.01 (br. s., 1 H), 1.83 (br. s., 2 H), 1.72 - 1.81 (m, 1 H), 1.62 - 1.71 (m, 2 H), 1.48 (s, 3 H).; 旋光度 : α
D +24 (メタノール).
中間体37
中間体樹脂26(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の中間体36(0.189g,1.20mmol)、HATU(0.608g,1.60mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.318mL,2.40mmol)およびDIEA(0.419mL,2.40mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、およびDCM(3×6mL)で洗浄し、乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 801 (M + 1).
中間体38
樹脂中間体37(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の塩化スズ(II)二水和物(1.384g,6.13mmol)および酢酸ナトリウム(0.151g,1.84mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で4時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、およびDCM(3×6mL)で洗浄し、真空中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 771 (M + H).
化合物3
樹脂中間体38(0.15g,0.24mmol)に、室温でDCM(5mL)、およびTFA(0.370mL,4.80mmol)を加えた。該混合物を室温で10分間攪拌し、続いて濾過し、DCMで洗浄した(2×50mL)。該濾液を減圧中で蒸発させた。該残渣を逆相HPLCにより精製した(ACN/H
2O 0.1% ギ酸,14分でACN 10%〜50%)。純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((R)−1,2−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−アミノフェニル)−2−メチルペンタン酸(0.037g,17.86%)を固形物として得た。LC/MS: 771 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 7.97 (s, 1 H), 6.87 (d, J=8.03 Hz, 2 H), 6.53 (d J=8.03 Hz, 2 H), 5.67 (d, J=12.80 Hz, 1 H), 4.59 (d, J=8.28 Hz, 1 H), 4.17 (br. s., 2 H), 3.72 (d, J=7.28 Hz, 1 H), 2.69 (d, J=6.27 Hz, 3 H), 2.42 (br. s., 2 H), 2.28 (br. s., 2 H), 2.17 (s, 3 H), 2.07 (s, 3 H),1.74 - 1.94 (m, 3 H), 1.45 - 1.62 (m, 4 H), 1.36 (br. s., 3 H), 1.27 (t, J=7.03 Hz, 3 H), 1.10 (s, 3 H), 1.06 (d, J=7.03 Hz, 4 H), 0.95 (d, J=6.53 Hz, 3 H), 0.90 (d, J=6.78 Hz, 4 H), 0.83 (t, J=7.40 Hz, 4 H), 0.74 (d, J=6.27 Hz, 3 H).
中間体39
トリエチルアミン(40g,0.4mol)を、0℃で攪拌しながらDCM(500mL)中のBoc−L−フェニルアラニン(90g,0.34mol)およびN,O−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(36.5g,0.37mol)の懸濁液に加えた。該懸濁液を10分間攪拌し、EDCI(HCl塩,72g,0.37mol)を加えた。該懸濁液を0℃でさらに3時間攪拌した。該混合物を飽和NaHCO
3水溶液(1L)でクエンチした。該層を分離し、該水層をDCMで再抽出した(500mL×3)。有機層を合わせて、水(1L×3)、5% KHSO
4水溶液(1L×3)、飽和NaHCO
3水溶液(1L×3)、および食塩水(1L×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:1)、(S)−tert−ブチル 1−(メトキシ(メチル)アミノ)−1−オキソ−3−フェニルプロパン−2−イルカルバメート(85.1g,収率81%)を白色の固形物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3): δ 7.15~7.26 (m, 5H), 5.25 (bs, 1H), 4.95 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 2.83~3.07 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
中間体40
乾燥THF(500mL)中の中間体39(97.1g,0.315mol)の溶液を、−10℃で攪拌しながら、乾燥THF(200mL)中のLiAlH
4(12.0g,0.316mol)の懸濁液に1時間かけて滴下して加えた。該懸濁液を0℃でさらに3時間攪拌し、続いて−10℃で水(12mL)、15% NaOH水溶液(12mL)、および水(12mL×3)でクエンチした。0.5時間攪拌し、該混合物を濾過し、該濾液を乾燥するまで濃縮して、(S)−tert−ブチル 1−オキソ−3−フェニルプロパン−2−イルカルバメート(45.2g,粗生成物)、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3): δ 9.65 (s, 1H), 7.17~7.33 (m, 5H), 4.80 (m, 1H), 2.80~3.15 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).
中間体41
酢酸エチル(400mL)中のトリフェニルホスフィン(173.7g,0.66mol)およびエチル 2−ブロモ−プロピオネート(100g,0.55mol)の溶液を、終夜加熱還流した。冷却し、該混合物を濾過した。該ケーキを酢酸エチルで洗浄し、乾燥させて、ホスホニウム塩を得た。ホスホニウム塩をDCM(400mL)中に溶解させた。モレキュラ・シーブス(4A,50g)を加え、続いて室温で攪拌しながらトリエチルアミン(111g,1.1mol)を滴下して加えた。該混合物をさらに1時間攪拌し、続いて濾過した。濾液を水(300mL×3)、5% KHSO
4水溶液(300mL×3)、そして食塩水(300mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:10)、エチル(トリフェニルホスホラニリデン)プロピオネート(105g,収率52%)を固形物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34~8.10 (m, 15H), 4.02 (q, J=7.2 Hz, 2H), 1.68 (m, 3H), 1.01 (t, J=7.2 Hz, 3H).
中間体42
DCM(500mL)中の中間体40(52g,0.21mol)および中間体41(76g,0.21mol)の溶液を、室温で14時間攪拌した。該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:10)、(S)−エチル 4−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メチル−5−フェニルペンタ−2−エノエート(45.3g,収率64%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.17~7.32 (m, 5H), 6.53 (dd, J=1.2 and 9 Hz, 1H), 4.63 (m, 2H), 4.18 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.76~2.95 (m, 2H), 1.72 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.28 (t, J=7.2 Hz, 3H).
中間体43
中間体42(45g,0.135mol)を10% Pd/C(10g)を含有するMeOH(600mL)中に溶解させた。反応混合液を水素雰囲気下にて室温で16時間攪拌した。反応混合液を珪藻土に通して濾過し、該濾液を減圧下で濃縮した。該残渣をアセトン(200mL)中に溶解させ、NaOH水溶液(2M,135mL)を0℃で加えた。該混合物を室温で10時間攪拌した。反応混合液をHCl水溶液(2M,135mL)に注ぎ入れ、DCMで抽出した(300mL×3)。有機抽出物を合わせて、乾燥させ(MgSO
4)、濾過し、そして減圧下で濃縮して、(R)−4−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メチル−5−フェニルペンタン酸を得て(41.0g,〜100%収率)、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。LC/MSによりその構造を確認した。
中間体44
中間体43(28g,0.091mol)を無水THF(200mL)中に溶解させ、−40℃に冷却した。この溶液に、トリエチルアミン(10.1g,0.099mol)を加え、続いてクロロギ酸エチル(11g,0.10mol)を15分かけて滴下して加えた。反応混合液を−40℃でさらに1時間攪拌し、続いて濾過して、沈殿した物質を取り除いた。濾液を0℃に冷却し、水(20mL)中の水素化ホウ素ナトリウム(7.5g,0.197mol)を含有する懸濁液で30分にわたり処理した。反応混合液を0℃で30分間攪拌し、室温でさらに30分間攪拌した。該混合物をEtOAc(500mL)で希釈し、食塩水(500mL)で洗浄した。水層をEtOAcで抽出した(200mL×3)。有機抽出物を合わせて、飽和NaHCO
3水溶液(500mL×2)、そして食塩水(500mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO
4)、濾過し、減圧下で濃縮して、油状残渣を供した。該残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=10:1)、tert−ブチル (2R,4S)−5−ヒドロキシ−4−メチル−1−フェニルペンタン−2−イルカルバメート(17.5g,収率65%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.15~7.29 (m, 5H), 4.60 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.45 (d, J=5.7 Hz, 2H), 2.71~2.11 (m, 4H), 1.78 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.25 (m, 1H).
中間体45
デス・マーチンペルヨージナン(39g,89.4mmol)を、DCM(300mL)中の中間体44(17.5g,59.7mmol)の溶液に加え、該懸濁液を室温で15時間攪拌した。該混合物をNaOH溶液(1N,300mL×3)、および食塩水(300mL×3)で洗浄し、乾燥させ(MgSO
4)、濾過し、減圧下で濃縮した。該残渣を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:6)、tert−ブチル (3S,5R)−5−ベンジル−3−メチル−2−オキソピロリジン−1−カルボキシレート(9.1g,収率53%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.16~7.35 (m, 5H), 4.30 (m, 1H), 3.15 (dd, J=3.3 および 13.2 Hz, 1H), 2.73 (dd, J=9.6 and 13.2 Hz), 2.42 (m, 1H), 2.00~2.10 (m, 2H), 1.58 (s, 9H), 1.15 (d, J=6.9 Hz, 3H).
中間体46
中間体45(9.0g,31.1mmol)およびHCl溶液(4N,150mL)を4時間加熱還流した。冷却し、該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をアセトン(100mL)および水(100mL)中に溶解させた。該溶液のpHを2M NaOH溶液で8.5に調整し、アセトン(20mL)中のFmoc−OSu(12g,35mmol)の溶液を滴下して加え、この溶液のpHを、この工程中に2M NaOH溶液で8〜9に保った。該懸濁液を4時間攪拌し、続いて2M HCl溶液でpH3まで酸性にし、EtOAcで抽出した(200mL×3)。有機層を合わせて、水(100mL×3)、5% KHSO
4水溶液(100mL×3)、そして食塩水(100mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:1)、(2S,4R)−4−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)−2−メチル−5−フェニルペンタン酸(5.3g,収率40%)を得た。LC-MS : 430 [M+1];
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ ppm 7.78 - 7.83 (m, 2 H), 7.59 - 7.65 (m, 2 H), 7.37 - 7.43 (m, 2 H), 7.28 - 7.35 (m, 2 H), 7.14 - 7.26 (m, 5 H),6.94 - 7.01 (m, 1 H), 4.28 - 4.36 (m, 1 H), 4.21 - 4.27 (m, 1 H), 4.10 - 4.16 (m, 1 H), 3.84 - 3.93 (m, 1 H), 2.68 - 2.82 (m, 2 H), 2.48 - 2.60 (m, 1 H), 1.86- 1.95 (m, 1 H), 1.42 - 1.51 (m, 1 H), 1.17 (d, J=7.03 Hz, 3 H), 1.09 - 1.14 (m, 1 H).
中間体47
クロロギ酸エチル(12.6mL,0.13mol)を、−20℃で無水THF(200mL)中のI−Me−Boc−L−Val−OH(27.3g,0.12mol)およびトリエチルアミン(14.7mL,0.13mol)の溶液に15分かけて滴下して加え、得られた白色懸濁液をさらに30分間攪拌した。ジアゾメタン溶液(0.36mol,60gのN−ニトロソ−N−メチルウレアから調製し、エーテル(500mL)中の水酸化カリウムで乾燥させ、続いてカニューレにより該反応混合物に入れた。該混合物を室温にし、さらに5時間攪拌し、続いて酢酸溶液(10%,250mL)で慎重にクエンチした。該層を分離し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム(300mL×3)および食塩水(300mL×3)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、約200mLまで濃縮した。該残渣をTHF(900mL)および水(100mL)中に溶解させた。該溶液を40℃に加熱し、酢酸銀(500mg)を加えた。該懸濁液を5時間攪拌し、続いて約300mLに濃縮した。該残渣をEtOAcで抽出した(500mL×3)。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム(300mL×3)および食塩水(300mL)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、濃縮して、(R)−3−(tert−ブトキシカルボニル(メチル)アミノ)−4−メチルペンタン酸(23.8g,収率81%)を得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 10.08 (bs, 1H), 4.00 (m, 1H), 2.75 (m, 3H), 2.55 (m, 2H), 1.43 (s, 9h), 0.85~0.84 (m, 6H).
中間体48
トリエチルアミン(34.3mL,0.244mol)を、0℃で攪拌しながらCH
2Cl
2(300mL)中の中間体47(60g,0.244mol)およびN,O−ジメチルヒドロアミン塩酸塩(23.9g,0.244mol)の懸濁液に加えた。該懸濁液をこの温度で0.5時間攪拌し、続いてEDCI(46.9g,0.244mol)を0℃で少しずつ加えた。反応混合液を0℃でさらに2時間攪拌し、次いで水(300mL)でクエンチした。有機層を分離し、5% KHSO
4溶液(300mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(300mL×3)、そして食塩水(300mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。該残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによりさらに精製し(EtOAc/ヘキサン=1:3)、tert−ブチル (R)−(1−(メトキシ(メチル)アミノ)−4−メチル−1−オキソペンタン−3−イル)(メチル)カルバメート(52g,収率74%)を油状物として得た。
中間体49
tert−ブチル ニトリル(0.61molのNaNO
2および110mLのtert−ブチル アルコールから調製)を、0℃でACN(500mL)中のCuBr
2(260g,1.16mol)およびエチル 2−アミノチアゾール−4−カルボキシレート(100g,0.58mol)の懸濁液に1時間かけて滴下して加えた。該混合物を室温で12時間攪拌し、続いてEtOAc(800mL)および水(800mL)でクエンチした。該混合物を濾過し、該濾液を水層および有機層に分割した。該水層をEtOAcで抽出した(800mL×2)。有機抽出物を合わせて、5% KHSO
4溶液(300mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(300mL×3)、そして食塩水(300mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮して、エチル 2−ブロモチアゾール−4−カルボキシレート(79.4g,収率58%)を得て、さらに精製することなく次の工程に使用した。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.45 (s, 1H), 4.20 (q, J=7.2 Hz, 2H), 1.25 (t, J=7.2 Hz, 3H).
中間体50
NaBH
4(16.5g,0.43mol)を、50℃で攪拌しながらエタノール(500mL)中の中間体49(68g,0.288mol)の溶液に0.5時間かけて少しずつ加えた。該懸濁液を5時間加熱還流し、NaBH
4(8.25g,0.22mol)の別のバッチを少しずつ加えた。該混合物をさらに12時間加熱還流した。これを室温に冷まし、該溶媒を減圧下で留去し、残渣をDCM(500mL)中に溶解させ、飽和NaHCO
3溶液(300mL×3)、続いて食塩水(300mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮して、該アルコール化合物を得た。該アルコール化合物をDMF(300mL)中に溶解させ、イミダゾール(28.3g,0.416mol)を加えた。THF(100mL)中のTBS−Cl(62.4g,0.416mol)の溶液を、室温でこの溶液に滴下して加えた。該混合物を12時間攪拌し、次いで水(800mL)でクエンチし、EtOAcで抽出した(800mL×2)。有機抽出物を合わせて、5% KHSO
4水溶液(300mL×3)、飽和NaHCO
3水溶液(300mL×3)、そして食塩水(300mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。該残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:30)、2−ブロモ−4−((tert−ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)チアゾール(42.0g,2ステップで47%収率)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.15 (t, J=1.5 Hz, 1H), 4.84 (d, J=1.5 Hz, 2H), 0.94 9s, 9H), 0.12 (s, 6H).
中間体51
n−BuLi(77mL,ヘキサン中で2.5N,0.19mol)の溶液を、N
2にて−78℃で攪拌しながら、乾燥THF(500mL)中の中間体50(53.9g,0.175mol)の溶液を1時間かけて滴下して加えた。該懸濁液をこの温度で30分間攪拌した。続いて、乾燥THF(200mL)中の中間体48(50.4g,0.175mol)の溶液を−78℃で30分かけて滴下して加えた。反応混合液をこの温度で1時間攪拌し、続いて室温に温め、12時間攪拌した。該混合物を20% 塩化アンモニウム溶液(1L)でクエンチし、該有機溶媒を減圧下で留去した。生じた混合物をEtOAcで抽出した(500mL×3)。有機層を合わせて、5% KHSO
4溶液(500mL×3)、飽和NaHCO
3溶液(500mL×3)、そして食塩水(500mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:10)、(R)−tert−ブチル 1−(4−((tert−ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−4−メチル−1−オキソペンタン−3−イル(メチル)カルバメート(38.1g,収率48%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.55 (m, 1H), 4.91 (s, 2H), 4.27 (m, 1H), 3.20~3.60 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.03 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.97 (s, 9H), 0.88 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.15 (s, 6H).
中間体52
NaBH
4(4.7g,125mmol)を、室温で攪拌しながらメタノール(200mL)中の中間体51(38.0g,83.3mmol)の溶液に0.5時間かけて少しずつ加えた。該懸濁液を2時間攪拌し、NaBH
4(1.5g,40mmol)の別のバッチを加え、該混合物をさらに2時間攪拌した。該溶媒を減圧下で留去し、残渣をEtOAc(200mL)中に溶解させ、飽和NaHCO
3水溶液(200mL×3)、そして食塩水(200mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィーによりさらに精製し(EtOAc/ヘキサン=1:6)、tert−ブチル (1R,3R)−1−(4−((tert−ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−1−ヒドロキシ−4−メチルペンタン−3−イル(メチル)カルバメート(16.2g,収率42%)およびtert−ブチル ((1S,3R)−1−(4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−1−ヒドロキシ−4−メチルペンタン−3−イル)(メチル)カルバメート(異性体,17.3g,収率45%)を得た。
tert−ブチル (1R,3R)−1−(4−((tert−ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−1− ヒドロキシ−4−メチルペンタン−3−イル(メチル)カルバメート(1R,3R−異性体):
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.11 (s, 1H), 4.98 (bs, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.68 (dt, J=11.7 Hz, 1H), 3.95 (dt, J=3.3 および 12 Hz, 1H), 2.75 (s, 3H), 1.70 ~1.95 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 0.95 (s, 9H), 0.85~0.95 (m, 6H), 0.15 (s, 6H).
tert−ブチル ((1S,3R)−1−(4−(((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−1−ヒドロキシ−4−メチルペンタン−3−イル)(メチル)カルバメート(1S,3R−異性体):
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.07 (s, 1H), 5.01 (m, 1H), 4.81 (s, 2H), 4.81 (bs, 1H), 3.86 (dt, J=3.3 および 10.5 Hz, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.25 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.43 (s, 9H), 1.00 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.96 (s, 9H), 0.84 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.15 (s, 6H).
中間体53
塩化アセチル(22.5mL,0.316mol)を、0℃で攪拌しながらピリジン(140mL)中の中間体52(19.7g,43mmol)の溶液に1時間かけて滴下して加えた。反応混合液を室温に温め、12時間攪拌した。該混合物を水(200mL)でクエンチし、該有機溶媒を減圧下で留去した。該残渣をDCM(500mL)中に溶解させ、5% KHSO
4水溶液(200mL×3)、飽和NaHCO
3水溶液(200mL×3)、および食塩水(200mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:10)、(1R,3R)−3−(tert−ブトキシカルボニル(メチル)アミノ)−1−(4−((tert−ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)チアゾール−2−イル)−4−メチルペンチルアセテート(18.5g,収率86%)を油状物として得た。LC/MSによりその構造を確認した。
中間体54
THF(100mL)中のフッ化テトラブチルアンモニウム(45.7g,175mmol)の溶液を、0℃で攪拌しながらTHF(100mL)中の中間体53(17.5g,35mmol)の溶液に滴下して加えた。反応混合液を室温に温め、12時間攪拌した。該混合物を水(100mL)でクエンチし、該有機溶媒を減圧下で留去した。該残渣をCH
2Cl
2(500mL)中に溶解させ、5% KHSO
4水溶液(200mL×3)、飽和NaHCO
3水溶液(200mL×3)、そして食塩水(200mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,EtOAc/ヘキサン=1:4)、(1R,3R)−3−(tert−ブトキシカルボニル(メチル)アミノ)−1−(4−(ヒドロキシメチル)チアゾール−2−イル)−4−メチルペンチルアセテート(9.3g,収率69%)を油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.15 (d, J=3 Hz, 1H), 5.81~5.86 (m, 1H), 4.74 (d, J=3Hz, 2H), 4.11 (m, 1H), 2.70 および 2.63 (s, 3H), 2.31 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.05 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.47 (s, 9H), 0.98 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.86 (d, J=6.6 Hz, 3H).
中間体55
デス・マーチンペルヨージナン(14.9g,34.2mmol)を、ジクロロメタン(250mL)中の中間体54(8.8g,22.8mmol)の溶液に加えた。反応混合液を室温に温め、12時間攪拌し、続いて水酸化ナトリウム水溶液(1N,200mL×3)、チオ硫酸ナトリウム水溶液(1N,200mL×3)、飽和NaHCO
3水溶液(200mL×3)、食塩水(200mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮して、アルデヒドを得た。この粗アルデヒド化合物を、tert−ブチル アルコール(250mL)、ならびに水(150mL)中の亜塩素酸ナトリウム(80%,11.6g,102mmol)およびリン酸二水素ナトリウム一水和物(33.6g,244mmol)の溶液に室温で1時間かけて滴下して加えた。反応混合液をさらに16時間攪拌し、続いて塩酸(0.1N,100mL)で希釈し、EtOAcで抽出した(200mL×3)。有機層を合わせて、5% KHSO
4水溶液(200mL×3)、そして食塩水(200mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮して、2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−(tert−ブトキシカルボニル(メチル)アミノ)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸(7.5g,収率82%)を得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。
1H NMR (300 MHz, CDCl
3): δ 8.26 (s, 1H), 5.87~6.01 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 2.72 および 2.65 (s, 3H), 2.35 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.18 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.00 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J=6.6 Hz, 3H).
中間体56
TFA(30mL)を、ジクロロメタン(80mL)中の中間体55(7.4g,18.5mmol)の溶液に加えた。該混合物を12時間攪拌し、該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をアセトン(100mL)および水(100mL)中に溶解させた。該溶液のpHを2M NaOH水溶液で8.5に調整し、アセトン(50mL)中のFmoc−OSu(6.2g,18.5mmol)の溶液を滴下して加え、この溶液のpHをこの工程の間、2M NaOH水溶液で8〜9に保った。該懸濁液を4時間攪拌し、2M HCl水溶液でpH3に酸性にし、EtOAcで抽出した(200mL×3)。有機層を合わせて、水(100mL×3)、5% KHSO
4水溶液(100mL×3)、そして食塩水(100mL×1)で洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(シリカゲル,MeOH/CH
2Cl
2=1:40)、2−((1R,3R)−3−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)−1−アセトキシ−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸を得た(5.1g,収率53%)。LC-MS : 523 [M+1];
1H NMR (400 MHz, CDCl
3) d ppm 0.56 (br. s., 1 H) 0.67 - 0.82 (m, 2 H) 0.83 - 0.96 (m, 2 H) 1.64 (dt, J=10.36, 6.57 Hz, 1 H) 1.88 (s, 1 H) 2.07 (s, 2 H) 2.09 - 2.17 (m, 1 H) 2.19 - 2.33 (m, 1 H) 2.52 - 2.67 (m, 3 H) 3.86 - 4.01 (m, 1 H) 4.08 (s, 1 H) 4.12 - 4.21 (m, 1 H) 4.29 - 4.40 (m, 1 H) 4.68 (dd, J=10.61, 5.56 Hz, 1 H) 5.85 (dd, J=10.86, 3.28 Hz, 1 H) 7.19 - 7.27 (m, 2 H) 7.27 - 7.35 (m, 2 H) 7.42 - 7.58 (m, 2 H) 7.61 - 7.71 (m, 2 H) 8.11 - 8.19 (m, 1 H)
中間体57
DIEA(0.419mL,2.40mmol)を、DCM(1.5mL)中の中間体46(0.344g,0.80mmol)の溶液に加え、該混合物を室温で5分間攪拌し、続いて2−クロロトリチル クロリド樹脂(0.5g,0.80mmol)を該混合物に加えた。該混合物を室温で4時間攪拌し、得られた樹脂をDMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、そしてDCM(3×6mL)で洗浄し、続いてMeOH/DCM(1:1,5mL)中のDIEA(0.419mL,2.40mmol)で室温にて30分間処理した。得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、そしてDCM(3×6mL)で洗浄し、高真空中で終夜乾燥させた。少量の化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析した。該乾燥させた樹脂を次の工程に使用した。LC/MS: 430 (M + 1).
中間体58
樹脂中間体57(0.5g,0.80mmol)に、DMF(5mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 208 (M + 1).
中間体59
樹脂中間体58(0.4g,0.64mmol)に、DMF(4mL)中の中間体56(0.351g,0.67mmol)、HATU(0.487g,1.28mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.256mL,1.92mmol)、およびDIEA(0.335mL,1.92mmol)の溶液を加えた。。該混合物を室温で2時間攪拌した。生じた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 712 (M + 1).
中間体60
樹脂中間体59(0.4g,0.64mmol)に、DMF(4mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を、室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 491 (M + H).
中間体61
樹脂中間体60(0.4g,0.64mmol)に、室温でDCM(4mL)中の中間体24(0.341g,0.96mmol)、DMAP(3.91mg,0.03mmol)、およびDIEA(0.335mL,1.92mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で1時間攪拌した。得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、高真空中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。LC/MS: 825 (M + 1).
中間体62
樹脂中間体61(0.4g,0.64mmol)に、DMF(4mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×6mL)、MeOH(3×6mL)、DCM(3×6mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 603 (M + 1).
中間体63
H
2O/EtOH(720mL,5/1)中の4,4−ジメチルシクロヘキサノン(30g,0.238mol)、ヒドロキシルアミン塩酸塩(32.8g,0.476mol)、および酢酸ナトリウム(39.0g,0.476mol)の溶液を、加熱還流した。該反応をTLCによりモニターし、反応完了後、室温に冷ました。これをジクロロメタン(500mL)で希釈した。有機層を分離し、食塩水(100mL)で洗浄し、Na
2SO
4で乾燥させた。溶媒を減圧下で留去し、4,4−ジメチルシクロヘキサノン オキシムを無色の固形物として得て、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
中間体64
キシレン(1000mL)中の五塩化リン(120g,0.576mol)の攪拌スラリーに、キシレン(400mL)中の中間体63(27.2g,0.192mol)の溶液を20分かけて加えた。反応混合液を、添加中、水浴を用いて30〜36℃に保った。次いで、これを80℃に加熱し、1.5時間攪拌した。該均一の反応混合物を室温に冷まし、飽和炭酸ナトリウム水溶液(2000mL)に注ぎ入れた。該混合物を終夜静置し、該沈殿物を収集した。3,3−ジクロロ−5,5−ジメチルアゼパン−2−オン(28.4g)を褐色の固形物として得、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 6.51 (bs, 1H), 3.39-3.44 (m, 1H), 3.16-3.21 (m, 1H), 1.41-1.51 (m, 2H), 1.17 (s, 2H), 0.99 (s, 6H).
中間体65
中間体64(25.8,0.123モル)を氷酢酸(1300mL)中に溶解させ、室温でPd/C(13g,10%)上にて水素の40atm下で2時間攪拌した。触媒を濾過して除去し、該濾液を減圧濃縮した。DCM(200mL)および飽和NaHCO
3水溶液(200mL)を、該残渣に加え、該混合物を10分間攪拌した。有機層を分離し、Na
2SO
4で乾燥させ、減圧濃縮して、3−クロロ−5,5−ジメチルアゼパン−2−オン(19.1g)を得て、さらに精製することなく次の工程で使用した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 6.19 (brs, 1H), 4.75 (d, J = 11 Hz, 1H), 3.30-3.36 (m, 1H), 3.11-3.17 (m, 1H), 1.91-2.09 (m, 2H), 1.39-1.59 (m, 2H), 1.14 (s, 3H), 1.04 (s, 3H).
中間体66
中間体65(16.1g,0.092mol)およびBa(OH)
2(35.1g,0.11mol)を入れたフラスコに、水(400mL)を加えた。この混合物を110℃で2時間攪拌した。次いで、これを室温に冷まし、THF(400mL)中の塩化CBZ(20.6g,0.121mol)の溶液を加えた。該混合物を室温で終夜攪拌し、続いて1N HClを用いてpH3に調整した。該粗生成物を酢酸エチルで抽出した(2×200mL)。抽出物を合わせて、食塩水(100mL)で洗浄し、Na
2SO
4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。該残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、1−((ベンジルオキシ)カルボニル)−4,4−ジメチルピペリジン−2−カルボン酸を粘稠性油状物として得た(7g)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.33-7.38 (m, 5H), 5.16-5.19 (m, 2H), 4.78-4.88 (m, 1H), 3.95-3.99 (m, 1H), 3.23-3.27 (m, 1H), 2.07 (s, 2H), 1.64-1.71 (m, 1H), 1.37-1.40 (m, 2H), 0.97 (s, 3H), 0.93 (s, 3H).
中間体67
2種類のエナンチオマーを、移動相A 90% 二酸化炭素/移動相B 10% エタノールを用いてchiralpak ICにより分割した(210nmで検出)。(R)−1−((ベンジルオキシ)カルボニル)−4,4−ジメチルピペリジン−2−カルボン酸:LC-MS : 292 [M+1];
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) d ppm 0.93 (s, 3 H) 0.98 (s, 3 H) 1.40 (d, J=11.80 Hz, 2 H) 1.68 (dd, J=14.05, 7.28 Hz, 1 H) 1.99 - 2.18 (m, 1 H) 3.27 (m, J=12.30 Hz, 1 H) 3.97 (m, J=12.80 Hz, 1 H) 4.69 - 4.95 (m, 1 H) 5.11 - 5.25 (m, 2 H) 7.28 - 7.44 (m, 5 H) 9.63 (br. s, 1 H)
中間体68
MeOH(20mL)および水(20.00mL)中の中間体67(1.14g,3.91mmol)の溶液に、パラホルムアルデヒド(0.705g,7.83mmol)およびPd/C(10%)(0.4g,3.76mmol)を加えた。反応混合液を水素雰囲気下にて室温で終夜攪拌した。TLCから、該反応は完了していなかった。さらにパラホルムアルデヒド(0.705g,7.83mmol)を加え、該反応混合物を水素雰囲気下にて室温で終夜攪拌した。TLCにより、該反応が完了したことが示された。反応混合液を濾過し、該触媒をMeOHで洗浄した(2×20mL)。濾液を減圧中で濃縮して、粗生成物を白色の固形物として得て、これをエーテルで洗浄し(3×20mL)、高真空中で終夜乾燥させて、(R)−1,4,4−トリメチルピペリジン−2−カルボン酸(0.671g,100%)を白色の固形物として得た。LC-MS: 172 [M+1];
1H NMR (400 MHz, D
2O) d ppm 0.96 (s, 3 H) 1.01 (s, 3 H) 1.49 - 1.63 (m, 3 H) 1.83 (dt, J=14.56, 2.64 Hz, 1 H) 2.79 (s, 3 H) 3.08 - 3.18 (m, 1 H) 3.27 - 3.34 (m, 1 H) 3.54 (dd, J=12.80, 3.26 Hz, 1 H).
中間体69
樹脂中間体62(0.1g,0.16mmol)に、DMF(1mL)中の中間体68(0.055g,0.32mmol)、HATU(0.122g,0.32mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.064mL,0.48mmol)、およびDIEA(0.056mL,0.32mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×2mL)、MeOH(3×2mL)、そしてDCM(3×2mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS : 756 (M+1).
化合物4
樹脂中間体69(0.1g,0.13mmol)に、DCM(1mL)およびTFA(1mL)を加えた。該混合物を室温で20分間攪拌し、続いて濾過し、該樹脂をDCM/TFAで洗浄し(1:1,3×2mL)、該濾液を減圧中で蒸発させた。該残渣を逆相HPLCにより精製した(ACN/H
2O 0.1% TFA ACN 5%〜75%,14分)。該純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−N,3−ジメチル−2−((R)−1,4,4−トリメチルピペリジン−2−カルボキサミド)ペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−2−メチル−5−フェニルペンタン酸(30mg,収率30%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 756.5 [M+1];
1H NMR (400 MHz, メタノール-d
4) d ppm 0.75 (dd, J=6.53, 2.01 Hz, 3 H), 0.85 (td, J=7.34, 3.64 Hz, 4 H), 0.90 - 0.99 (m, 11 H), 1.01 - 1.16 (m, 9 H), 1.45 - 1.66 (m, 6 H), 1.67 - 1.85 (m, 4 H), 1.86 - 1.97 (m, 1 H), 2.03 - 2.06 (m, 3 H), 2.16 - 2.34 (m, 2 H), 2.39 - 2.51 (m, 1 H), 2.66 (d, J=1.25 Hz, 3 H), 2.75 - 2.85 (m, 2 H), 3.02 (d, J=1.25 Hz, 3 H), 3.16 (br. s., 1 H), 3.79 - 3.93 (m, 1 H), 4.29 (br. s., 2 H), 4.57 - 4.66 (m, 1 H), 5.55 - 5.70 (m, 1 H), 7.01 - 7.18 (m, 5 H), 7.98 (d, J=1.25 Hz, 1 H).
中間体70
樹脂中間体62(0.1g,0.16mmol)に、DMF(1mL)中の中間体1(0.050g,0.32mmol)、HATU(0.122g,0.32mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.064mL,0.48mmol)、およびDIEA(0.056mL,0.32mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×2mL)、MeOH(3×2mL)、そしてDCM(3×2mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 742 (M+1).
化合物5
樹脂中間体70(0.1g,0.16mmol)に、DCM(1mL)およびTFA(1mL)を加えた。該混合物を室温で20分間攪拌し、続いて濾過し、該樹脂をDCM/TFA(1:1,3×2mL)で洗浄し、該濾液を減圧中で蒸発させた。該残渣を逆相HPLCにより精製した(ACN/H
2O 0.1% TFA,ACN 5%〜50% 14分)。純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N,3−ジメチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−2−メチル−5−フェニルペンタン酸(0.040g,29.2%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 742 (M+1);
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 0.71 - 0.78 (m, 3 H), 0.80 - 0.87 (m, 3 H), 0.93 (dd, J=9.91, 6.65 Hz, 6 H), 1.07 (d, J=7.03 Hz, 6 H) ,1.42 - 1.65 (m, 3 H), 1.74 - 1.85 (m, 3 H), 1.86 - 1.98 (m, 3 H), 2.05 (s, 4 H), 2.16 - 2.35 (m, 2 H), 2.38 - 2.51 (m, 1 H), 2.59 - 2.72 (m, 3 H), 2.77 - 2.83 (m, 2 H), 3.02 (s, 3 H), 3.84 - 3.94 (m, 1 H), 4.20 - 4.35 (m, 2 H), 4.56 - 4.65 (m, 1 H), 5.57 - 5.67 (m, 1 H), 7.03 - 7.09 (m, 1 H), 7.13 (s, 4 H), 7.91 - 8.02 (m, 2 H).
中間体71
DCM(24mL)中のエチル 2−((1R,3R)−3−((2S,3S)−2−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−N,3−ジメチルペンタンアミド)−1−ヒドロキシ−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキシレート(Patterson A. et al J. Org. Chem. 2008, 73, 4362に記載されるとおり調製)(1.2g,2.40mmol)の溶液に、同等体積のTFA(24.00mL)を、1時間攪拌しながら加えた。続いて、該溶液を濃縮し、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO
3(水溶液)で1回洗浄した。水性フラクションをEtOAcで2回逆抽出し、有機フラクションを合わせて、Na
2SO
4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、Boc脱保護遊離アミンを得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。CH
2Cl
2(24mL)中のこのアミン化合物に、HOBT(0.368g,2.40mmol)および中間体1(0.3969g,2.52mmol)を加えた。続いて、該混合物を、塩を入れた氷水浴内で攪拌しながら冷却し、PS−カルボジイミド(1.23mmol/g)(2.598g,2.88mmol)を加えた。該浴を室温に温め、14時間攪拌し続けた。次いで、該混合物を濾過し、該樹脂をDCMで洗浄し、該濾液を濃縮した。該粗混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO
3水溶液で1回洗浄した。水性フラクションをEtOAcで2回逆抽出し、有機フラクションを合わせて、Na
2SO
4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、4−メチルMep−結合中間体を得て、これをさらに精製することなく使用した。ジオキサン(24mL)で希釈した該粗中間体に、脱気した水(24mL)中のLiOH(0.230g,9.60mmol)の溶液を加えた。5時間攪拌し、該溶液を濃縮した。該残渣を、順相フラッシュクロマトグラフィーを用いることによりシリカゲルカラムにより精製した(DCM/DCM:MeOH:NH
4OH(90:10:1〜70:30:1で溶出)(0〜100%のグラジエントとしてDCM:MeOH:NH
4OH)。該純粋なフラクションを濃縮し、最終的に高真空下で乾燥させて、2−((1R,3R)−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N,3−ジメチルペンタンアミド)−1−ヒドロキシ−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸(1.003g,82%)をアモルファス固形物として得た。LC/MS: 509 [M+1].
中間体72
ピリジン(19.47mL)中の中間体71(1.0026g,1.96mmol)の溶液を、氷水浴内で冷却し、無水酢酸(0.927mL,9.82mmol)を攪拌しながら加えた。該浴を室温に温め、24時間攪拌し続けた。次いで、該溶液を氷水浴内で冷却し、脱気した水/ジオキサン(40mL)中の1:1(v/v)溶液を加えた。該浴を室温に温め、22時間攪拌し続けた。該残渣を蒸発により濃縮し、残渣を逆相クロマトグラフィーにより精製し(ACN/H
2O(0.1% TFA)を使用,ACN 5%〜50%,14分)、純粋なフラクションを凍結乾燥させて、2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N,3−ジメチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボン酸(0.945g,72.2%)を無色の固形物として得た。LC-MS : 551 [M+1];
1H NMR (400 MHz, メタノール-d
4) δ ppm 0.85 (d, J=6.53 Hz, 3 H), 0.88 - 0.98 (m, 4 H), 0.98 - 1.08 (m, 6 H), 1.10 - 1.28 (m, 4 H), 1.59 (ddd, J=13.49, 7.47, 2.89 Hz, 1 H), 1.70 (d, J=14.05 Hz, 1 H), 1.81 - 2.12 (m, 5 H), 2.12 - 2.25 (m, 3 H), 2.32 (d, J=7.78 Hz, 2 H), 2.72 - 2.93 (m, 4 H), 3.07 - 3.18 (m, 4 H), 4.02 (d, J=10.54 Hz, 1 H), 4.10 - 4.39 (m, 1 H), 4.65 - 4.76 (m, 1 H), 5.64 - 5.80 (m, 1 H), 8.30 - 8.39 (m, 1 H), 8.66 (d, J=7.28 Hz, 1 H).
中間体73
中間体72(100mg,0.18mmol)を、0℃でDCM(5mL)中の2,3,4,5,6−ペンタンフルオロフェノール(49.32mg,0.27mmol)およびDIC(41.34μl,0.27mmol)の溶液に加えた。該溶液を室温にし、4時間攪拌し、続いて該溶媒を減圧下で留去した。EtOAc(4mL)を該混合物に加え、得られた懸濁液を吸入濾過して、濾液中の所望の活性化した酸を得た。該EtOAcを減圧下で留去し、続いて乾燥DMF(1.3mL)を加え、次いで中間体18(52.2mg,0.18mmol)およびDIEA(0.213mL)を加えた。該混合物を終夜攪拌し、続いてDMFを高真空下で留去した。該残渣を逆相クロマトグラフィーにより精製し(ACN/H
2O(10mM 酢酸アンモニウムを含有),ACN 10%〜80%,20分)、純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N,3−ジメチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−2−メチル−5−(4−ニトロフェニル)ペンタン酸(85mg,59.3%)を無色の固形物として得た。LC/MS : 787 [M+1]
化合物6
25mLの丸底フラスコに、攪拌バー、中間体73(84.5mg,0.11mmol)およびMeOH(5mL)を入れ、Pd−C10%(50mg,0.47mmol)を窒素下で加えた。該混合物を、室温で水素バルーンを用いて1時間水素化した。該粗LC/MSにより、出発物質の生成物への完全な変換が示された。反応混合液を珪藻土パッドに通して濾過し、フィルター上にてMeOHで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、最終的に高真空下で乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N,3−ジメチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−アミノフェニル)−2−メチルペンタン酸(79mg,97%)を固形物として得た。LC-MS : 757 [M+1];
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ ppm 8.10 (s, 1 H) 6.99 (d, J=8.28 Hz, 2 H) 6.65 (d, J=8.28 Hz, 2 H) 5.66 - 5.78 (m, 1 H) 4.71 - 4.80 (m, 1H) 4.24 - 4.43 (m, 2 H) 3.13 (s, 3 H) 2.77 - 2.83 (m, 2 H) 2.61 - 2.71 (m, 1 H) 2.49 - 2.56 (m, 1 H) 2.44 (s, 3 H) 2.27 - 2.40 (m, 2 H) 2.17 (s, 3 H) 1.86 - 2.04 (m, 4 H) 1.74 - 1.83 (m, 1 H) 1.53 - 1.69 (m, 3 H) 1.31 (br. s., 3H) 1.17 (d, J=7.03 Hz, 4H) 0.98 - 1.07 (m, 8 H) 0.93 (d, J=7.53 Hz, 6H) 0.83 - 0.87 (m, 3 H).
中間体74
樹脂中間体28(0.2g,0.32mmol)に、DMF(4mL)中の(S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸(0.300g,0.64mmol)、HATU(0.243g,0.64mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.128mL,0.96mmol)、およびDIEA(0.168mL,0.96mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×2mL)、MeOH(3×2mL)、およびDCM(3×2mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体74を次の工程に使用した。LC/MS: 1221 (M + 1).
中間体75
樹脂中間体74(0.2g,0.32mmol)に、DMF(2mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×3mL)、MeOH(3×3mL)、DCM(3×3mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体75を次の反応工程に使用した。LC/MS: 999 (M + H).
中間体76
樹脂中間体75(0.2g,0.32mmol)に、室温でDMF(2mL)中の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(0.148g,0.48mmol)の溶液、続いてN−メチルモルホリン(0.106mL,0.96mmol)を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×3mL)、DCM(3×3mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体76を次の工程に使用した。LC/MS: 1192 (M + 1).
化合物7
樹脂中間体76(0.2g,0.32mmol)に、室温でDCM(1mL)、およびTFA(1mL)を加えた。該混合物を室温で20分間攪拌し、濾過した。該樹脂をDCM/TFA(1:1,3×2mL)で洗浄し、濾液を合わせて、減圧中で蒸発させた。該残渣を逆相HPLCにより精製した(ACN/水 0.1%TFA,ACN 5%〜75%,14分)。純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−((S)−6−アミノ−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)フェニル)−2−メチルペンタン酸(0.095g,22.48%)を白色の固形物として得た。LC-MS: 1092 [M+1];
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ ppm 7.99 (s, 1 H), 7.34 (d , J =8.53 Hz, 2 H), 7.10 (d , J=8.53 Hz, 2 H), 6.66 (s, 2 H), 5.64 (d, J=10.79 Hz, 1 H), 4.50 - 4.61 (m, 1 H), 4.21 - 4.35 (m, 2 H), 3.92 (d, J=9.29 Hz, 1 H), 3.69 (br. s., 1 H), 3.37 (t, J=7.15 Hz, 2 H), 3.15-3.35 ( m, 4H), 3.04 (dt, J=3.58, 1.85 Hz, 1 H), 2.84 (t, J=7.65 Hz, 2 H), 2.76 (d, J=7.03 Hz, 2 H), 2.62 (br. s., 2 H), 2.38 - 2.52 (m, 2 H), 2.25 (t, J=11.54 Hz, 1 H), 2.16 (t, J=7.40 Hz, 2 H), 2.04 - 2.11 (m, 4 H), 1.70 - 2.00 (m, 7 H) 1.42 - 1.69 (m, 11 H), 1.34 - 1.40 (m, 1 H), 1.27 (t, J=6.78 Hz, 3 H), 1.16 - 1.24 (m, 2 H), 1.01 - 1.14 (m, 7 H), 0.90 (d, J=6.78 Hz, 3 H), 0.94 (d, J=6.53 Hz, 3 H), 0.84 (t, J=7.40 Hz, 3 H), 0.79 (d, J=6.53 Hz, 3 H).
中間体77
樹脂中間体28に、DMF(38mL)中の(S)−2−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)−5−ウレイドペンタン酸(3.88g,9.76mmol)、HATU(3.71g,9.76mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(2.59mL,19.52mmol)およびDIEA(3.41mL,19.52mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×100mL)、MeOH(3×100mL)、およびDCM(3×100mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体77を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 1150 (M + 1).
中間体78
樹脂中間体77に、DMF(35mL)中の20% ピペリジンの溶液を加えた。該混合物を室温で6分間攪拌した。生じた樹脂を濾過し、DMF(3×100mL)、MeOH(3×100mL)、およびDCM(3×100mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより分析し、弱いシグナルが示された。生じた樹脂中間体78を次の工程反応に使用した。LC/MS: 928 (M + 1).
中間体79
樹脂中間体78に、DMF(20mL)中の(S)−2−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸(1.529g,4.50mmol)、HATU(1.713g,4.50mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(1.294mL,9.76mmol)、およびDIPEA(1.705mL,9.76mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×75mL)、MeOH(3×75mL)、およびDCM(3×75mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体79を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 1250 (M + 1).
中間体80
樹脂中間体79に、DMF(20mL)中の20% ピペリジンの溶液を加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×75mL)、MeOH(3×75mL)、およびDCM(3×75mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体80を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 1028 (M + 1).
中間体81
樹脂中間体80に、室温でDMF(18mL)中の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(1.157g,3.75mmol)の溶液、続いて4−メチルモルホリン(1.032mL,9.38mmol)を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×75mL)、MeOH(3×75mL)、およびDCM(3×75mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の樹脂を、TFAを加えることにより切り出し、LC/MSにより分析し、所望生成物の形成が示された。樹脂中間体81を次の工程に使用した。LC/MS: 1220 (M + 1).
化合物8
化合物81からの樹脂に、DCM(40mL)中のTFA(2.89mL,37.54mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で5分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、さらに50mL DCMで洗浄した。抽出物を合わせて、濃縮した。粗製物質を逆相HPLCにより精製した(C18カラム,0.1% TFA/水/0.1 TFA アセトニトリル,0−40%,30分の方法)。純粋なフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)フェニル)−2−メチルペンタン酸(0.620g,12.38%)を白色の固形物として得た。LC-MS: 1220 (M + 1);
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 8.03 (s, 1 H), 7.30 - 7.44 (m, 2 H), 7.07 (d, J=8.53 Hz, 2 H), 6.69 (s, 2 H), 5.53 - 5.68 (m, 1 H), 4.52 -4.63 (m, 1 H), 4.19 - 4.40 (m, 3 H), 4.01 - 4.12 (m, 2 H), 3.89 - 3.99 (m, 1 H), 3.56 - 3.74 (m, 1 H), 3.33 - 3.43 (m, 2 H), 3.23 - 3.32 (m, 1 H), 2.96 - 3.13(m, 4 H), 2.83 - 2.95 (m, 1 H), 2.66 - 2.83 (m, 3 H), 2.57 (br. s., 3 H), 2.40 - 2.52 (m, 2 H), 2.14 - 2.24 (m, 3 H), 2.02 - 2.11 (m, 4 H), 1.87 - 2.00 (m, 5 H), 1.72 - 1.87 (m, 4 H), 1.42 - 1.68 (m, 10 H), 1.16 - 1.28 (m, 5H), 1.09 (d, J=7.03 Hz, 6 H,) 0.76 - 0.96 (m, 16 H).
中間体82
樹脂中間体38(0.35g,0.56mmol)に、DMF(5mL)中の(S)−2−((((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)−6−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸(0.525g,1.12mmol)、HATU(0.426g,1.12mmol)、2,4,6−トリメチルピリジン(0.223mL,1.68mmol)およびDIPEA(0.293mL,1.68mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で2時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×5mL)、MeOH(3×5mL)、およびDCM(3×5mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体82を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 1221 (M + 1).
中間体83
樹脂中間体82に、DMF(4mL)中の20% ピペリジンを加えた。該混合物を室温で6分間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×5mL)、MeOH(3×5mL)、DCM(3×5mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体83を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 999 (M + 1).
中間体84
樹脂中間体83に、室温でDCM(4mL)中の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(0.259g,0.84mmol)の溶液、続いて4−メチルモルホリン(0.185mL,1.68mmol)を加えた。該混合物を室温で6時間攪拌し、得られた樹脂を濾過し、DMF(3×5mL)、MeOH(3×5mL)、DCM(3×5mL)で洗浄し、減圧中で乾燥させた。少量の該化合物を樹脂から切り出し、LC/MSにより解析し、該反応の完了が示された。生じた樹脂中間体84を次の工程の反応に使用した。LC/MS: 1192 (M + 1).
中間体85
樹脂中間体84(0.35g,0.56mmol)に、DCM(5mL)中のTFA(0.216mL,2.80mmol)を加えた。該混合物を室温で10分間攪拌した。該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をDMSO中に溶解させ、逆相HPLCにより精製した(0.1 TFA/水/アセトニトリル,20−80%,14分)。純粋な生成物を含有するフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−(1,2−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−((S)−6−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)フェニル)−2−メチルペンタン酸(0.123g,18.42%)を白色の固形物として得た。LC/MS: 1192 (M + 1).
化合物9
中間体85(95mg,0.08mmol)に、DCM(1mL)中のTFA(0.123mL,1.59mmol)の溶液を加えた。該混合物を室温で1時間攪拌した。該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をDMSO中に溶解させ、逆相HPLCにより精製した(0.1 TFA/水/アセトニトリル,10−70%,10分)。純粋な生成物を含有するフラクションを凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((R)−1,2−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−((S)−6−アミノ−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)フェニル)−2−メチルペンタン酸(53.0mg,50.4%)を白色の固形物として得た。LC-MS : 1092 (M + 1).;
1H NMR (400 MHz, CD
3OD) δ ppm 7.97 (s, 1 H), 7.36 (d, J=8.28 Hz, 2 H), 7.11 (d, J=8.28 Hz, 2 H), 6.65 (s, 2 H), 5.63 (d, J=11.29 Hz, 1 H), 4.34 (dd, J=8.28, 5.77 Hz, 1 H), 4.26 (br. s., 1 H),3.75-3.60 (m, 1 H), 3.32 - 3.46 (m, 4 H), 3.30-3.25 (m, 1 H), 2.71 - 2.90 (m, 5 H), 2.49 - 2.62 (m, 3 H), 2.27 (t, J=12.05 Hz, 1 H), 2.17 (t, J=7.40 Hz, 3 H) 2.00 - 2.12 (m, 5 H), 1.84 - 1.96 (m, 3 H), 1.72 - 1.84 (m, 4 H), 1.58 - 1.69 (m, 5 H), 1.47 - 1.56 (m, 4 H), 1.36 - 1.44 (m, 5 H), 1.14 - 1.30 (m, 6 H), 1.01 - 1.10 (m, 4 H), 0.93 (dd, J=13.93, 6.65 Hz, 7 H), 0.74 - 0.86 (m, 7 H).
中間体86
樹脂中間体75(0.20g,0.16mmol)に、室温でDCM中の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル−3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)プロパノエート(85mg,0.32mmol)の溶液、続いてDIEA(0.056mL,0.32mmol)を加えた。該混合物を室温で4時間攪拌し、得られた樹脂をDMF(3×3mL)、DCM(3×3mL)、およびMeOH(3×3mL)で洗浄し、減圧下で乾燥させた。少量の化合物をTFA/DCM(1:2)で該樹脂から切り出した。該溶媒を蒸発させ、該粗生成物をLC/MSにより解析した。LC/MSにより、該カップリング反応の完了が示された。LC/MS: 1050.37 (M+1).
化合物10
樹脂中間体86(0.20g,0.16mmol)に、室温でTFA/DCM(1:2,3mL)を加えた。該混合物を室温で10分間攪拌し、濾過した。該樹脂をDCM(3×3mL)で洗浄し、全ての濾液を合わせて、減圧下で蒸発させて、粗生成物を得た。該粗生成物を逆相HPLCにより精製した(H
2OおよびCH
3CN(0.1% TFAを含有),CH
3CN 5%〜40%,12CVの長さ)。収集したフラクションを合わせて、凍結乾燥させて、(2S,4R)−4−(2−((1R,3R)−1−アセトキシ−3−((2S,3S)−2−((2R,4R)−1,4−ジメチルピペリジン−2−カルボキサミド)−N−エチル−3−メチルペンタンアミド)−4−メチルペンチル)チアゾール−4−カルボキサミド)−5−(4−((S)−6−アミノ−2−(3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)プロパンアミド)ヘキサンアミド)フェニル)−2−メチルペンタン酸を白色の粉末(70mg,35%)として得た。LC/MS: 1050.37 (M+1);
1H NMR (400 MHz, メタノール-d
4) δ 7.99 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.65 (s, 2H), 5.64 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.28 (td, J = 11.3, 10.0, 6.1 Hz, 2H), 3.92 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 3.69 (q, J = 6.8 Hz, 3H), 3.31 - 3.23 (m, 1H), 3.18 (s, 1H), 2.83 (t, J = 7.7 Hz, 3H), 2.76 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.50 - 2.40 (m, 4H), 2.25 (t, J = 12.8 Hz, 1H), 2.06 (s, 4H), 2.00 - 1.69 (m, 8H), 1.69 - 1.52 (m, 6H), 1.53 - 1.31 (m, 4H), 1.28 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.08 (d, J = 7.1 Hz, 7H), 0.92 (dd, J = 13.7, 6.7 Hz, 7H), 0.83 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 0.78 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
抱合の一般的な説明
抗体を含有するADCは、標準的な方法、例えば、以下に限定されないが、アルデヒド/シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸不安定性結合、シス−アコニチル結合、ヒドラゾン結合、Hamblett, Clin. Cancer Res. 2004, 10, 7063-7070;Doronina et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7), 778-784、およびFrancisco et al., Blood, 2003, 102, 1458-1465によって記載される方法に類似する方法、および下記の非限定的な例の適当な改変によって調製されてもよい。抗体は、pH7.2でPBS中の40モル当量のTCEPおよび1mMのEDTAを37℃で3時間使用する還元条件下で処理することにより、チオール反応性種、例えば、システイン、グルタチオン、金属類を除去し、抗体中の鎖間ジスルフィド結合を減らす。この工程に続いて、10,000MWCO透析カセット(Thermo Scientific)を用いて、4℃でPBS、pH7.2、1mM EDTAで2回透析を行う。ジスルフィド結合は、PBS、pH7.2、1mM EDTA中に25℃で、抗体に対してデヒドロアスコルビン酸で4時間酸化させることによって再形成させる。その後、20モル当量の式IIの化合物は、PBS、pH7.2、1mM EDTA、10v/v% DMSO(ジメチルスルホキシド)(Thermo Scientific)で25℃にて1時間インキュベートすることによって、抗体の反応性チオール基を介して抱合させる。前記複合体は濾過により精製する。抱合反応は、4モル当量のN−アセチルシステイン(Sigma−Aldrich)を加えてクエンチする。該抗体薬物複合体は、5mM NaPO4中にてpH6で20K MWCOカセットを用いて4℃で終夜透析し、続いて5mL セラミックスヒドロキシアパタイト(CHT)タイプIIカートリッジ(Biorad)を用いて精製する。前記複合体を10mM NaPO4、pH6および0〜2M NaCl直線グラジエントを用いてカートリッジから溶出し、濃縮し、20mM ヒスチジン−HCl、pH6.0中の透析を用いて緩衝液交換により製剤化することができる。
インビトロ増殖アッセイ
American Type Tissue Collection(ATCC)(P.O. Box 1549, Manassa, VA 20108 (USA))から取得したヒト癌細胞株集団(DU145、NCI−N87、およびMDA−MB−361)を用いて、本発明のツブリシン化合物の相対的な細胞毒性を決定した。前記細胞は、80μlの体積中に組織培養処理した96ウェルプレートの1ウェルあたり2,000〜5,000個の密度で培地中にプレーティングし、終夜接着させた。5X濃度の各試験化合物は、培地中の試験試料を希釈することによって調製した。20マイクロリットルの各試験試料を細胞に2回もしくは3回加え、最終用量曲線を段階的な1:4の連続希釈系で4μg/mlから61pg/mlまでの範囲とした。処理した細胞は、37℃/5% CO
2で72〜144時間培養した。CellTiter−Glo発光生存アッセイ(Promega)を用いて、相対的な細胞毒性を決定した。簡単に説明すると、100μlのCellTiter−Glo試薬を各ウェルに加え、軽く振盪させながら室温で10分間インキュベートさせ、続いて各試料の560nMでの吸光度をPerkin Elmer EnVisionルミノメーターを用いて読み取った。細胞生存率を下記の式によって算出した:(処理した試料の平均発光/コントロール(未処理)試料の平均発光)X100。IC
50値は、GraphPad Prismソフトウェアによるロジスティック非線形回帰分析を用いて決定した。全ての化合物を全ての細胞株に対してアッセイしなかった。表Iは、アッセイのデータを提供する。
表I
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