KR20150082548A - 항-notch3 항체 및 항체-약물 접합체 - Google Patents

항-notch3 항체 및 항체-약물 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20150082548A
KR20150082548A KR1020157015019A KR20157015019A KR20150082548A KR 20150082548 A KR20150082548 A KR 20150082548A KR 1020157015019 A KR1020157015019 A KR 1020157015019A KR 20157015019 A KR20157015019 A KR 20157015019A KR 20150082548 A KR20150082548 A KR 20150082548A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
notch3
seq
ser
val
Prior art date
Application number
KR1020157015019A
Other languages
English (en)
Inventor
케네쓰 지. 겔레스
이지에 가오
푸자 사프라
리오드밀라 게나디에브나 치스티아코바
빈-빙 스티븐 주
Original Assignee
화이자 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 화이자 인코포레이티드 filed Critical 화이자 인코포레이티드
Publication of KR20150082548A publication Critical patent/KR20150082548A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K47/48438—
    • A61K47/48561—
    • A61K47/48569—
    • A61K47/48715—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

본 발명은 항-Notch3 항체, 항-Notch3 항체-약물 접합체 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

항-NOTCH3 항체 및 항체-약물 접합체 {ANTI-NOTCH3 ANTIBODIES AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATES}
관련 출원
본원은 2012년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 61/723,772 및 2013년 10월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 61/889,744를 우선권 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 출원되었고, .txt 포맷의 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 상기 .txt 파일은 2013년 10월 11일에 생성된 "PC071980A_Sequence_Listing.txt" 파일명의 61 KB 크기를 갖는 서열 목록을 포함한다. 상기 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항-Notch3 항체 및 항-Notch3 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암의 치료를 위한 상기 항체 및 항체-약물 접합체의 사용 방법에 관한 것이다.
Notch 신호전달은 세포외 수용체 및 리간드 상호작용에 의해 유발된다. Notch 수용체는 리간드-유도된 단백질분해에 의해 유발된 신호전달 캐스케이드를 통해 다세포 유기체에서 정상 세포 증식, 분화 및 사멸을 제어한다. 부위 S1에서의 푸린-유사 프로테아제 절단 후에, 성숙 Notch 이종이량체는 세포 막 내로 전위되고, 여기서 이는 3개의 Lin12/Notch 반복체 (LNR-A, B, C) 및 이종이량체화 (HD) 도메인으로 이루어진 막근접 음성 조절 영역 (NRR)에 의해 자가-억제 상태로 유지된다. HD 도메인은 부위 S1에서의 절단 후에 N-말단 (HD1) 및 C-말단 (HD2) 절반체로 나누어진다. 불확실한 메카니즘을 통해, 세포외 EGF-반복 영역에 대한 델타/서레이트/Lag-2 (Delta/Serrate/Lag-2; DSL) 패밀리의 리간드의 결합은 상기 억제를 완화하고, 2개의 추가적인 절단 이벤트를 유도한다. 먼저, ADAM-유형 메탈로프로테이나제는 HD-2 도메인의 C-말단 영역 부근의 부위 S2에서의 절단을 매개하고, 이로써 세포 표면으로부터 세포외 도메인 (ECD)이 방출되고, 이어서 이는 리간드-발현 세포 내로의 트랜스-엔도시토시스를 겪는다. 다음으로, 감마-세크레타제는 막횡단 도메인 내의 부위 S3에서의 절단을 매개하고, 이는 막으로부터 Notch의 세포내 도메인 (Notch-ICD)을 방출시켜, 그가 핵 내로 전위되고 표적 유전자의 전사를 활성화시키도록 한다 (Bray, S., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2006, volume 7, 678-689).
자가-억제된 입체형태의 인간 Notch2-NRR 도메인의 X선 결정 구조는 메탈로프로테아제 S2 부위가 매립된 NRR 내의 LNR 반복체와 이종이량체화 도메인 사이의 광범위한 상호작용을 밝혀냈으며, 이는 리간드에 의한 활성화 동안 상기 부위를 노출시키기 위해 실질적 입체형태적 이동이 필요하다는 것을 시사한다 (Gordon, W.R., et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, volume 14, 295-300). 연구는 NRR 내의 상호작용의 안정화가 리간드-유도된 Notch 활성화를 방지할 수 있음을 시사한다. Notch 자가-억제된 입체형태에 대한 구조 정보의 이용가능성은 치료제, 특히 Notch 신호전달을 표적화하는 항체의 개발을 위한 새로운 기회를 제공하였다 (Li, K., et al., Journal of Biological Chemistry, 2008, volume 283, 8046-8054; Aste-Amezaga, M, et al., PLOS ONE, 2010, volume 5, e9094; Wu, Y., et al., Nature, 2010, volume 464, 1052-1057;).
포유동물 세포에는, 4종의 공지된 Notch 수용체가 존재한다. Notch-1, -2, -3 및 -4는 배아 및 성체 조직에서 광범위하게 중복되는 발현 패턴을 가지며, 조혈 줄기 세포 분화, T 세포 발생, 장 샘 세포 분화 및 혈관 발생 동안 대체불가능한 역할을 수행한다. Notch3은 혈관 평활근 세포 (vSMC), 다양한 흉선세포 하위집단 및 발달 신경계에서 주로 발현된다. 뮤린 Notch3의 표적화 결실은, 그의 제한된 조직 분포와 일치하게 Notch1 및 Notch2 결실과 같은 배아 치사성을 유발하지 않는다. 대신에, Notch3-부재 마우스는 생존가능하지만, vSMC 의 성숙 및 분화에서의 결손을 갖는다 (Domenga, V., et al., Genes and Development, 2004, volume 18, 2730-2735).
Notch 활성화는 많은 정황에서 종양원성이고; 모든 4개의 Notch 상동체의 구성적으로 활성인 세포내 형태는 시험관내 및 트랜스제닉 마우스 모델에서 종양유전자로서의 기능을 한다. 최근 연구는 Notch3이 종종 다양한 인간 고형 종양에서 증폭 및 과다발현된다는 것을 지적하며, 인간 암에서의 발달 신호전달 경로, 예컨대 Notch3의 과다발현은 이들이 종양발생의 핵심 매개인자로서 관련된다는 것을 시사한다. 몇몇 전략이 치료 목적을 위한 암에서의 Notch 신호전달 차단을 위한 개발 중에 있지만; 암의 치료를 위한 보다 강력하고 효과적인 항-Notch 표적화 요법에 대한 요구가 관련 기술분야에 여전히 존재한다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 고친화도 항체의 특이성 및 표적화를, 치료제, 예컨대 세포독성제, 생물학적 반응 조절제, 효소, 아폽토시스-유도제 및 방사성동위원소의 세포독성과 조합한다. 항체로부터의 치료제의 방출은 리소솜으로의 항체-약물 접합체의 트래픽킹 및 국재화를 필요로 할 수 있고, Notch3-ECD 및 Notch3-ICD 둘 다는 리소솜 분해를 겪게 되어 Notch3에 결합된 항체가 리소솜으로 트래픽킹될 것으로 예상된다 (Jia L, et al., International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2009, volume 41, 2594-2598). 본 발명은 암의 치료에서의 진단 및 치료 용도에 있어서 충족되지 않는 임상 요구를 충족시키는 신규 항-Notch3 항체 및 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 항-Notch3 항체 및 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 본 발명은 또한 암의 치료를 위한 상기 항-Notch3 항체 및 항체-약물 접합체의 사용 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 세포 내로 내재화되거나, (b) Notch3 신호전달을 억제하지 않거나, 또는 (c) Notch3 신호전달을 활성화시키지 않는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) Notch3 NRR의 LNR-C 및 HD-1 도메인에 결합하거나, (b) Notch3 NRR을 자가-억제 입체형태로 유지하지 않거나, 또는 (c) S2-절단을 억제하지 않는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 15 또는 16을 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 19 또는 20을 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 23을 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 27을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 29를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (f) 서열 31을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 13과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 서열 25와 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 13의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 서열 25의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 33의 중쇄 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 서열 35의 경쇄 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 37의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 39 또는 40을 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 43 또는 44를 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 47을 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 51을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 53을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (f) 서열 55를 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 37과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 서열 49와 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 37의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 서열 49의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 57의 중쇄 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 서열 59의 경쇄 아미노산 서열을 갖는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 Notch3에 대한 특이적 결합을 위해 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합된 세포독성제를 갖는 항체-약물 접합체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 화학식: Ab-(L-D)p의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며, 상기 식에서 Ab는 Notch3에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이고; p는 1 내지 약 12의 정수이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 화학식: Ab-(L-D)p의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며, 상기 식에서 Ab는 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이고; p는 1 내지 약 12의 정수이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 L이 vc, mc, me 및 MalPeg6C2로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 D가 (a) 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), (b) 6780 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), (c) 0131 (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염), (d) 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염), 및 (e) 8261 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 L-D가
하기 화학식을 갖는 vc0101:
Figure pct00001
및 하기 화학식을 갖는 vc6780:
Figure pct00002
으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Ab가 (a) 서열 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 Ab가 (a) 서열 15를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 19를 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 23을 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 27을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 29를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (f) 서열 31을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Ab가 (a) 서열 37의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 Ab가 (a) 서열 39를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 43을 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 47을 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 51을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 53을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (f) 서열 55를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 Ab가 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따르면서, (a) 서열 61로 제시된 바와 같은, 위치 L443에서의 1개의 아미노산 치환, 및 (b) 서열 65로 제시된 바와 같은, 위치 L443 및 K392에서의 2개의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 조작된 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (Cy) 폴리펩티드를 포함하는 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 Ab가 카바트의 EU 인덱스에 따르면서, 서열 63으로 제시된 바와 같은, 위치 κK183에서의 1개의 아미노산 치환을 갖는 조작된 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (CK) 폴리펩티드를 포함하는 것인 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 임의의 항체-약물 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 갖는 제약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Notch3 발현과 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 임의의 항체-약물 접합체 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 Notch3 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 고형 종양 암인 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 고형 종양 암, 예를 들어 비제한적으로 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 두경부암, 방광암, 간암, 피부암 및 육종을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈액 암, 예를 들어 비제한적으로 T-세포 악성종양, T-세포 백혈병, T-세포 림프종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, B-세포 악성종양, 골수성 악성종양, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병인 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 임의의 항체-약물 접합체 또는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암이 고형 종양 암인 요법에 사용하기 위해 제공된다. 본 발명은 또한 고형 종양 암이 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 두경부암, 방광암, 간암, 피부암 및 육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 것인 요법에 사용하기 위해 제공된다. 본 발명은 또한 암이 혈액 암, 예를 들어 비제한적으로 T-세포 악성종양, T-세포 백혈병, T-세포 림프종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, B-세포 악성종양, 골수성 악성종양, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병인 요법에 사용하기 위해 제공된다. 본 발명은 또한 요법을 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 임의의 항체-약물 접합체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 Notch3 발현 암의 치료를 위한, 본 발명의 임의의 항체-약물 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 Notch3 항체 또는 그의 항체-결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 언급된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 Notch3 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 L을 D에 연결시키고; L-D를 본 발명의 배양물로부터 회수한 항체에 접합시키고; 항체-약물 접합체를 정제하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체-약물 접합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 Notch3에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 갖는 항체-약물 접합체를 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 대상체로부터의 생물학적 샘플이 Notch3을 발현하는지의 여부를 결정함으로써, 암을 앓는 대상체가 본 발명의 임의의 항체-약물 접합체에 반응할지의 여부를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을 본 발명의 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 샘플 상에서 Notch3의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; 및 Notch3의 세포 표면 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 Notch3의 수준을 결정하는 방법을 제공한다.
도 1은 Avi 및 His 태그를 갖는 재조합 S1-절단된 이종이량체 Notch3 NRR 단백질 면역원의 개략적 다이어그램을 보여준다.
도 2는 정제된 인간 및 마우스 Notch3 NRR 재조합 단백질의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 3은 r28 및 r75 항체 가변 영역의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (CDR 밑줄표시).
도 4a 내지 4c는 [a] hu28 VH 1.0 및 CDR (카바트 및 코티아(Chothia)), [b] hu28 VL 1.0 및 CDR (카바트 및 코티아), 및 [c] hu28 HC 1.0 및 LC 1.0의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 5a 내지 5c는 [a] hu75 VH 1.9 및 CDR (카바트 및 코티아), [b] hu75 VL 1.3 및 CDR (카바트 및 코티아), 및 [c] hu75 HC 1.9 및 LC 1.3의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 6은 항-Notch3 항체 ch28 및 ch75의 에피토프 맵핑을 위한 재조합 인간 Notch1 NRR 및 Notch3 NRR 도메인 교환 키메라 구축물을 보여준다.
도 7은 D11B8 항체를 사용한 Notch3 양성 및 음성 세포주의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 8a 내지 8e는 [a] 시간 0에서의 MDA-MB-468 유방암 세포에서의 항-Notch3 항체 hu75-알렉사(Alexa) 488의 세포 막 국재화, 및 pHrodoTM 적색 덱스트란을 사용한 산성 소포의 표지, [b] 시간 5에서의 MDA-MB-468 유방암 세포에서의 항-Notch3 항체 hu75-알렉사 488의 세포내 트래픽킹, 및 pHrodoTM 적색 덱스트란과의 공동-국재화 (화살표), [c] 시간 0에서의 MDA-MB-468 유방암 세포에서의 항-Notch3 항체 hu28-딜라이트(DyLight)650의 세포 막 국재화, 및 pHrodoTM 적색 덱스트란을 사용한 산성 소포의 표지 (세포내 반점), [d] 시간 8에서의 MDA-MB-468 유방암 세포에서의 항-Notch3 항체 hu28-딜라이트650의 세포내 트래픽킹, 및 pHrodoTM 적색 덱스트란과의 공동-국재화 (화살표), 및 [e] 시간이 지남에 따른 MDA-MB-468 세포에서의 hu28-딜라이트650 및 pHrodoTM 적색 덱스트란 형광 표지의 중첩 또는 공동-국재화의 정도를 나타내는 피어슨(Pearson) 상관 계수를 보여준다.
도 9는 항-Notch3 hu28 및 hu75로 처리된 HCC2429 및 MDA-MB-468 세포를 사용한 S2-절단 검정의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. M.W. = 분자량.
도 10은 항-Notch3 hu28-vc0101을 사용한 OVCAR3 난소암 세포의 처리가 포스포-히스톤 H3 염색에 의해 확인된 유사분열 세포 내의 미세관 (항-알파-튜불린 항체로 염색됨)을 교란시킨다는 것을 보여준다.
도 11은 2-3마리의 마우스 (M)로부터 수확된 이종이식편으로부터의 Notch3-ECD의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 12는 37622A1 NSCLC 환자 유래 이종이식편 모델에서의 5 mg/kg 용량의 시스플라틴과 비교한 3 mg/kg 용량의 항-Notch3 hu28-vc0101 및 hu75-vc0101의 효능을 보여준다.
도 13a 및 13b는 [a] MDA-MB-468 유방 모델에서의 항-Notch3 hu28-vc0101의 효능, 및 [b] MDA-MB-468 유방 모델에서의 항-Notch3 hu75-vc0101의 효능을 보여준다.
도 14a 및 14b는 [a] MDA-MB-468 유방 모델에서의 항-Notch3 hu28-vc6780의 효능, 및 [b] MDA-MB-468 유방 모델에서의 항-Notch3 hu75-vc6780의 효능을 보여준다.
도 15는 OVCAR3 난소 모델에서의 항-Notch3 hu28-vc0101의 효능을 보여준다.
도 16a 내지 16e는 [a] HCC2429 폐 이종이식편에서 5mg/kg으로 투여된 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체-약물 접합체의 효능; [b 및 c] MDA-MB-468 유방 이종이식편에서 5mg/kg으로 투여된 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체-약물 접합체의 효능; [d 및 e] N87 위 이종이식편에서 5mg/kg으로 투여된 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체-약물 접합체의 효능을 보여준다.
도 17a 및 17b는 [a] 단일 시스테인 돌연변이체 hu28 HC 1.0 L443C 및 hu28 LC 1.0 κK183C 및 [b] 이중 시스테인 돌연변이체 hu28 HC 1.0 L443C/K392C의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
본 발명은 암의 치료를 위한 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 본 발명을 보다 용이하게 이해하기 위해, 특정 용어 및 일반적 기술을 먼저 정의한다.
본 개시내용에서 사용된 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R. § 1.822 (d)(1)에 기재된 바와 같이, 미국 특허상표국으로부터 승인받은 것이다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 전문 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 널리 공지되어 있고, 관련 기술분야에서 통상적으로 사용된다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 통상의 방법에 따라 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 참고문헌 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조한다.
"Notch3" 또는 "Notch-3"은 인간 Notch3 단백질의 천연체, 변이체, 이소형 및 종 상동체를 지칭한다. 천연의 인간 Notch3 단백질은 예를 들어 리더 펩티드, 대형 표피 성장 인자 (EGF)-유사 반복 영역, 3개의 Lin12 반복체, N 말단 이종이량체화 도메인 (HD-1), C 말단 이종이량체화 도메인 (HD-2), 막횡단 (TM) 서열 및 세포내 도메인 (Notch3ICD)으로 이루어진다. 전장 인간 Notch3의 NCBI/진뱅크(GenBank) 등록 번호는 NM_000435.2이다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "Notch3 음성 조절 영역" 또는 "Notch3 NRR"은 3개의 Lin12 도메인 및 3개의 Lin12 도메인들 사이에 위치하는 아미노산 서열 또는 서열들 + Notch3의 HD1 및 HD2 도메인으로 이루어진 Notch3의 임의의 천연 또는 합성 폴리펩티드 영역을 지칭한다. 한 실시양태에서, "Notch3 NRR"은 3개의 Lin12 도메인 및 2개의 이종이량체화 도메인 HD-1 및 HD-2를 포함하며, 여기서 Notch3의 HD-1 및 HD-2 도메인은 공유 결합되어 있고, 아직 푸린-유사 프로테아제에 의해 절단되어 있지 않다 (S1 절단 전임). 또 다른 실시양태에서, "Notch3 NRR"은 3개의 Lin12 도메인 및 2개의 이종이량체화 도메인 HD-1 및 HD-2를 포함하며, 여기서 HD-1 및 HD-2 도메인은 비-공유 결합되어 있다 (S1 절단 후임). 이러한 실시양태의 한 측면에서, HD-2 도메인 내의 S2 부위는 ADAM-유형 메탈로프로테아제에 의해 절단되어 있지 않다. 이러한 실시양태의 또 다른 구체적 측면에서, HD-2 도메인 내의 S2 부위는 ADAM-유형 메탈로프로테아제에 의해 절단되고 있거나, 또는 이미 절단되어 있다. (Gordon, W.R., et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, volume 14, 295-300).
"항체" 또는 "Ab"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 소정의 항원 (예를 들어, 표적 Notch3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 임의의 항원 결합 부분 (예를 들어, "항원-결합 단편") 또는 그의 단일 쇄, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열, 예를 들어 비제한적으로, Fab; Fab'; F(ab')2; Fd 단편; Fv 단편; 단일 도메인 항체 (dAb) 단편; 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 단일 쇄 (scFv) 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타류 항체), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv를 포괄한다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136] 참조). 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하며, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 (HC) 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
어구 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는 항체를 지칭한다 (예를 들어, Notch3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 Notch3 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 함유하지 않음). 그러나, Notch3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 Notch3 분자에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 (VL) 또는 항체 중쇄의 가변 영역 (VH)을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2, CDR3)에 의해 연결되어 있는 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지고, 이는 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다. 대상 가변 영역의 변이체가 바람직한 경우에, 특히 CDR 영역 외부 (즉, 프레임워크 영역 내)에 아미노산 잔기의 치환을 갖는 것이 바람직한 경우에, 대상 가변 영역과 동일한 정규 부류 중 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역과 대상 가변 영역을 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987). 대상 CDR 측면에 위치하는 FR을 선택하는 경우에, 예를 들어 항체를 인간화하거나 최적화시키는 경우에, 동일한 정규 부류 중 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 항체로부터의 FR이 바람직하다.
가변 도메인의 "CDR"은 카바트, 코티아의 정의, 카바트 및 코티아 둘 다의 복합, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인되는 가변 영역 내 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카바트 등에 의해 최초로 정의된 초가변 영역으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 코티아 등에 의해 최초로 기재된 구조적 루프 구조로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883]을 참조한다. CDR을 확인하는 다른 접근법은 카바트와 코티아 사이의 절충안으로서, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 엑셀리스(Accelrys)®)를 이용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 제시되어 있는, 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 엔탈피에 의해 항원 결합에 기여하는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이들이 특정 잔기 또는 잔기의 기 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 더 짧아지거나 더 길어질 수 있을지라도, 적어도 카바트 CDR의 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 접근법의 조합을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 활용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태의 경우에, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 접촉 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "IgG Fc 영역", "Fc 영역", "Fc 도메인" 및 "Fc"는 IgG 분자의 파파인 소화에 의해 수득된 결정화가능한 단편과 상호관련된 IgG 분자의 부분을 지칭한다. Fc 영역은 디술피드 결합에 의해 연결된 IgG 분자의 2개의 중쇄의 C-말단 절반체로 이루어진다. 이는 항원 결합 활성을 갖지 않지만, 보체 및 Fc 수용체, 예를 들어 FcRn 수용체 (하기 참조)에 대한 탄수화물 모이어티 및 결합 부위를 함유한다. Fc 단편은 전체 제2 불변 도메인 CH2 (카바트 넘버링 시스템에 따른, 인간 IgG1의 잔기 231-340) 및 제3 불변 도메인 CH3 (잔기 341-447)을 함유한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "조작된 Fc 폴리펩티드", "조작된 Fc 영역" 및 "조작된 Fc"는 적어도 1개의 돌연변이, 예를 들어 아미노산 치환을 포함하며 접합을 위한 부위가 도입된 Fc 폴리펩티드 또는 그의 부분을 의미한다. 바람직하게는, 돌연변이는 자연 발생 아미노산 잔기 대신에 그 위치에 시스테인을 도입하고, 여기서 돌연변이는 Fc에 대한 모이어티의 접합을 위한 반응성 부위 (예를 들어, 반응성 술프히드릴 기)를 생성한다.
용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 그를 제조하는 방법이 아닌, 예를 들어 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯하여 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 동종이거나 또는 실질적으로 동종인 집단으로 존재한다.
"인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 서열을 최소로 함유하는, 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간 (예컨대, 래트) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다.
"인간 항체 또는 완전 인간 항체"는 인간 항체 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스 또는 인간 세포로부터 유래된 항체를 지칭한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 것인 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 래트 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 지칭하도록 의도된다.
"치료제"는 암 세포 또는 활성화된 면역 세포에 세포독성, 세포증식억제 및/또는 면역조절 효과를 행사하는 작용제이다. 치료제의 예는 세포독성제, 화학요법제, 세포증식억제제 및 면역조절제를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다.
"세포독성 효과"는 표적 세포(들)의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 지칭한다. "세포독성제"는 세포에 대해 세포독성 및/또는 세포증식억제 효과를 갖는 작용제를 지칭한다.
"세포증식억제 효과"는 세포 증식의 억제를 지칭한다. "세포증식억제제"는 세포에 대한 세포증식억제 효과를 가지며 그로 인해 세포의 특정 하위세트의 성장 및/또는 확장을 억제하는 작용제를 지칭한다.
"항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 세포독성제, 세포증식억제 및/또는 치료제에 접합된, Notch3에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편 (항체 유도체 포함)을 지칭한다.
"항-Notch3 항체-약물 접합체" 또는 "항-Notch3 ADC"는 링커 (L)을 통해 약물 (D)에 연결되는, 본원에 기재된 바와 같은 항-Notch3 항체 또는 그의 항원 결합 단편를 지칭한다.
"링커 (L)"는 약물에 대한 항체의 직접 또는 간접 연결을 기재한다. 항체에 대한 링커의 부착은 다양한 방법으로, 예컨대 표면 리신을 통해, 산화된 탄수화물로의 환원적 커플링, 및 쇄간 디술피드 연결의 환원에 의해 유리된 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 히드라존-, 디술피드- 및 펩티드-기반 연결을 비롯한 다양한 항체-약물 접합체 연결 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
약물 (D)는 생물학적 또는 검출가능한 활성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어 치료제, 검출가능한 표지, 결합제 등, 및 생체내에서 활성제로 대사되는 전구약물이다. 용어 약물, 페이로드 및 화합물은 상호교환적으로 사용된다.
"L-D"는 링커 (L)에 연결된 약물 (D)로부터 생성된 링커-약물 모이어티이다.
용어 "에피토프"는 1개 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 집단으로 이루어지고, 특이적 3차원 구조적 특성, 뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 통상적인 면역검정에 의해 결정시, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드의 부분으로서 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내의 불연속 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다. 항원 상의 목적 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 발명에 기재된 기술을 이용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성화는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 해석할 수 있다. 이어서, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체들을 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "결합 친화도 (KD)"는 특정 항원-항체 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. KD는 회합 속도, 또는 "온-속도(ka)"에 대한 "오프-속도 (kd)"로도 불리는 해리 속도의 비이다. 따라서, KD는 kd/ka이며, 몰 농도 (M)로서 표현된다. KD가 작을수록 결합 친화도가 더 강하게 된다. 따라서, 1 μM의 KD는 1 nM의 KD와 비교하여 약한 결합 친화도를 나타낸다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 한가지 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 것, 전형적으로 비아코어(Biacore)® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 이용하는 것에 의한다.
표적 (예를 들어, Notch3 단백질)에 "우선적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합" (본원에서 교환가능하게 사용됨)하는 항체, 항체 접합체 또는 폴리펩티드는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적 세포 또는 물질보다 특정한 세포 또는 물질과 보다 빈번하게, 보다 급속하게, 보다 큰 지속력으로 및/또는 보다 큰 친화도로 반응 또는 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 보다 큰 지속력으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, Notch3 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 이것이 다른 Notch3 에피토프 또는 비-Notch3 에피토프에 결합하는 것보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게 및/또는 보다 큰 지속력으로 상기 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없다고 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다. "EC50"은 결합 능력의 측정이고, 기준선 및 최대 사이의 중간 지점의 반응을 일으키는데 필요한 항체 또는 항체-약물 접합체의 반수 최대 유효 농도로 정의된다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 염"은 분자 또는 거대분자의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다.
용어 "효력"은 생물학적 활성의 측정이고, IC50, 또는 각각 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같은 Notch3-의존성 리포터 유전자 활성 또는 Notch3 양성 세포주의 성장을 50% 억제하는데 필요한, 항원 Notch3에 대한 항체 또는 항체 약물 접합체의 억제 농도로 지정될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적 치료 결과를 달성하는데 (투여량 및 투여 기간 및 수단에 대해) 필요한 양을 지칭한다. 유효량은 적어도 대상체에게 치료 이익을 부여하는데 필요한 활성제의 최소량이며, 독성량 미만이다.
본 발명의 항체의 생물활성과 관련하여 본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "중화하다"는, 예를 들어 생물학적 활성을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌, 억제되고 있는 대상의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항, 금지, 방지, 저지, 저속화, 교란, 제거, 중지, 감소 또는 역전시키는 항체의 능력을 의미한다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다" 또는 "경쟁한다"는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 상기 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합이 제2 항체 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교시 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 상황도 가능하지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체는 제1 항체가 그의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도, 보다 큰 정도, 또는 보다 적은 정도의 여부와 상관없이 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우에, 상기 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 다가 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태 변화 또는 공통적인 에피토프 또는 그의 단편에 대한 결합)과는 상관없이, 통상의 기술자는 본원에 제공되는 교시에 기반하여 본원에 개시된 방법에 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되며 유용할 수 있음을 인지할 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다음을 포함할 수 있다: 오직 변이체에 대한 코딩 서열만, 변이체에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 기능적 폴리펩티드, 또는 신호 또는 분비 서열 또는 프로단백질 서열; 항체에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 항체에 대한 코딩 서열의 인트론 또는 비-코딩 서열 5' 및/또는 3'. 용어 "항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 변이체에 대한 추가의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 특이적 숙주 세포/발현 시스템에 대해 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 원하는 단백질의 아미노산 서열로부터 용이하게 수득될 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (진아트 아게(GENEART AG: 독일 레겐스부르크) 참조).
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 도입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 자연적, 우연적 또는 계획적인 돌연변이로 인해 반드시 본래 모 세포와 (형태학적으로 또는 게놈 DNA 상보성에서) 완전하게 동일할 필요는 없을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 관련 기술분야에 공지되어 있는, 자연적으로-회합된 프로모터 또는 이종 프로모터 영역을 비롯한, 항체 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터내 진핵 프로모터 시스템일 것이나, 원핵 숙주에 대한 제어 서열 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적절한 숙주 세포주 내로 도입되면, 숙주 세포는 뉴클레오티드 서열을 발현하는데 적합한, 및 원하는 경우, 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 증식된다. 바람직한 진핵 세포주는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 또는 인간 배아 신장 세포주를 포함한다. 가장 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포주이다.
항체
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예컨대 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 상기 기술들의 조합 또는 관련 기술분야에 용이하게 공지되어 있는 다른 기술을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) 및 Fellouse, F.A., et al., J. MoI. Biol., 373(4):924-40 (2007)] 참조).
본 발명의 한 실시양태는 서열 13과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열, 및 서열 25와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 Notch3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 서열 37과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열, 및 서열 49와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일한 Notch3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Notch3에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 13과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열, 및 서열 25와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합과 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Notch3에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 37과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 아미노산 서열, 및 서열 49와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합과 경쟁한다.
항체에 대한 약물의 접합
약물은 항체에 대한 접합 지점과 반응성인 기를 갖거나, 또는 이를 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 약물은 (예컨대, 항체의 엡실론-아미노 기 리신 또는 N-말단에서의) 알킬화, 산화된 탄수화물의 환원적 아민화, 히드록실 기와 카르복실 기 사이의 에스테르교환, 아미노 기 또는 카르복실 기에서의 아미드화, 및 티올에의 접합에 의해 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 분자 당 접합되는 약물의 개수, p는 평균 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8; 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 실시양태에서, p는 평균 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 실시양태에서, p는 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 일부 실시양태에서, p는 평균 약 1 내지 약 12, 약 1 내지 약 11, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 9, 약 1 내지 약 8; 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2의 범위이다. 일부 실시양태에서, p는 약 2 내지 약 12, 약 2 내지 약 11, 약 2 내지 약 10, 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4 또는 약 2 내지 약 3의 범위이다. 접합을 위해 이용될 수 있는 화학의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modifications of Proteins)]을 참조한다.
링커
링커는 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하기 위해 약물 및 항체를 연결하는데 사용될 수 있는 이관능성 화합물이다. 이러한 접합체는, 예를 들어 종양 연관 항원에 대해 지시되는 면역접합체의 형성에 유용하다. 이러한 접합체는 세포독성 약물의 종양 세포로의 선택적 전달을 허용한다.
적합한 링커는 예를 들어 절단성 링커 및 비-절단성 링커를 포함한다. 절단성 링커는 전형적으로 세포내 조건 하에 절단되기 쉽다. 적합한 절단성 링커는 예를 들어, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소솜 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단성 펩티드 링커를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 디펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린 (val-cit), 페닐알라닌-리신 (phe-lys) 링커, 또는 말레이미도카프로닉-발린-시투룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (vc) 링커일 수 있다. 또 다른 링커는 술포숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 (smcc)아다. 술포-smcc 접합은, 술프히드릴 (티올, -SH)과 반응하지만 그의 술포-NHS 에스테르는 (리신 및 단백질 또는 펩티드 N-말단에서 발견되는) 1급 아민에 대해 반응성인 말레이미드기를 통해 이루어진다. 또 다른 링커는 말레이미도카프로일 (mc)이다. 다른 적합한 링커는 특정 pH 또는 pH 범위에서 가수분해 가능한 링커, 예컨대 히드라존 링커를 포함한다. 추가의 적합한 절단성 링커는 디술피드 링커를 포함한다. 링커, 예를 들어 mc 링커 등은 약물이 방출되도록 하기 위해 항체가 세포내에서 분해되어야 하는 정도로 항체에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 링커는 말레이미도카프로닉-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (vc) 및 말레이미도카프로일 (mc), me 및 MalPeg6C2를 포함한다.
조작된 Fc 폴리펩티드
본원에 참조로 포함되는 국제 공개 번호 WO/2013/093809에 기재된 바와 같이, 특정 잔기가 아마 항체의 중쇄의 CH2 또는 CH3 도메인의 표면 상에, 또는 경쇄의 불변 도메인 상에 존재하거나, 또는 달리 접근가능하게는, 예를 들어 시스테인으로의 자연 발생 야생형 아미노산의 치환에 적합하고, 따라서 다양한 작용제에 대한 접합이 가능한 부위를 조작하는데 유용하다는 것이 이전에 보고된 바 있다.
아미노산 변형은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있고, 많은 이러한 방법은 널리 공지되어 있고 통상의 기술자에게 일상적이다. 예를 들어, 비제한적으로, 아미노산 치환, 결실 및 삽입은 임의의 널리 공지된 PCR-기반 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 아미노산 치환은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; 및 Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488] 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 Fc 폴리펩티드가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 항체 또는 그의 단편은 조작된 잔기 (즉, 야생형 비변형된 Fc와 비교하여 아미노산 치환된)에서 매우 다양한 모이어티를 접합시키는데 사용될 수 있는 조작된 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 카파 경쇄 불변 폴리펩티드가 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 항체 또는 그의 단편은 조작된 아미노산 잔기에서 매우 다양한 모이어티를 접합시키는데 사용될 수 있는, 아미노산 돌연변이를 포함하는 조작된 CL 영역 또는 그의 단편을 포함한다.
Fc 폴리펩티드에서의, 예를 들어 시스테인 잔기의 단일 치환이 통상적으로 IgG 항체 분자의 동종이량체 특성으로 인해, 생성된 IgG 항체에서의 2개의 상응하는 잔기의 디스플레이를 유발한다는 점에 주목해야 한다. 따라서, 생성된 본 발명의 조작된 IgG 항체는 약물 또는 화합물에 대한 접합의 목적을 위해 적어도 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 반응성 기를 디스플레이할 수 있다. 한 실시양태에서, 치환 중 1개 이상은 시스테인 잔기로 이루어지며, 생성된 조작된 항체는 약물 또는 화합물에 대한 접합의 목적을 위해 적어도 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 티올 기를 디스플레이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 Fc 폴리펩티드는 항체의 중쇄의, 위치 443 및 392로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함하며, 여기서 불변 영역의 넘버링 시스템은 상기 문헌 [Kabat et al.]에 기재된 바와 같은 EU 인덱스의 넘버링 시스템이다.
일부 실시양태에서, 조작된 Fc 폴리펩티드는 서열 61로 제공된 바와 같은 1개의 아미노산 치환 (L443C)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 Fc 폴리펩티드는 서열 65로 제공된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (L443C/K392C)을 포함한다.
조작된 Cκ 폴리펩티드
본 발명의 항-Notch3 항체는, 모, 천연 또는 야생형 항체의 항체 경쇄의 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산 (천연 및 비-천연/합성 아미노산 포함)으로 치환된 것인, 조작된 항체 경쇄 불변 영역 (LC) 또는 그의 단편을 포괄할 수 있으며, 여기서 경쇄 불변 영역의 넘버링 시스템은 문헌 [Kabat et al.]에 기재된 바와 같은 카바트 넘버링 시스템 (1991, NIH 공개 91- 3242, 국립 기술 정보 서비스, 버지니아주 스프링필드, 이하 "카바트")의 것이다.
다른 실시양태에서, 많은 항체의 이량체 특성 때문에 (예를 들어, IgG는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 Fc 폴리펩티드를 포함함), 본 발명의 항체는 적어도 1개의 조작된 Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 적어도 1개의 조작된 경쇄 불변 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있으며, 이로써 적어도 2개의 부위-특이적 접합 부위를 제공한다 - Fc 폴리펩티드에서의 1개 및 CL 폴리펩티드에서의 또 다른 것.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 Cκ 폴리펩티드는 항체의 경쇄의 위치 183에서 적어도 1개의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 Cκ 폴리펩티드는 서열 63으로 제공된 바와 같은 1개의 아미노산 치환 (κK183C)을 포함한다.
암을 위한 요법
암, 예를 들어 비제한적으로 종양, 전이 또는 탈제어된 세포 성장을 특징으로 하는 다른 질환 또는 장애는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체-약물 접합체 (ADC)의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.
예시적인 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 항체-약물 접합체는 Notch3이 참조 대상체 또는 표준물 (예를 들어, 비-암성 또는 정상 조직)과 비교하여 발현 또는 과다발현되는 암을 치료하는데 유용하다. 본원에 기재된 방법에 따른 Notch3-발현 암의 치료 또는 예방은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항체-약물 접합체를 투여함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성제에 접합된 항-Notch3 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 투여될 것이다. 일부 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항-Notch3 항체-약물 접합체는 (i) Notch3 발현 암 세포에 결합하고, (ii) 예를 들어 Notch3 발현 암 세포의 증식을 억제하거나 Notch3 발현 암 세포를 사멸시키기 위해 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 행사할 것이다.
다른 실시양태에서, 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체는 또 다른 치료제와 공동-투여되거나, 또는 또 다른 치료제와 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체는 화학요법제 (표준 관리 화학요법제 포함)와 공동-투여되거나, 또는 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 다른 치료제는, 치료될 구체적 질환에 대한 표준 관리이거나 치료될 구체적 질환에 대한 구제 요법의 일부인 작용제일 것이다. 항암제 및 화학치료 요법은 예를 들어 항암 항체, 예를 들어 항-CD52 항체 (예를 들어, 알렘투주맙(Alemtuzumab)), 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙(Rituximab)), 및 항-CD40 항체 (예를 들어, SGN40); 화학치료 요법, 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손); CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 및 프레드니손); RCVP (리툭시맙+CVP); RCHOP (리툭시맙+CHOP); RICE (리툭시맙+이포사미드, 카르보플라틴, 에토포시드); RDHAP, (리툭시맙+덱사메타손, 시타라빈, 시스플라틴); RESHAP (리툭시맙+에토포시드, 메틸프레드니솔론, 시타라빈, 시스플라틴); 겜시타빈; 아스파라기나제가 포함되거나 포함되지 않은, 빈크리스틴, 프레드니손 및 안트라시클린과의 조합 치료; 다우노루비신, 빈크리스틴, 프레드니손, 및 아스파라기나제와의 조합 치료; 테니포시드 및 Ara-C (시타라빈)와의 조합 치료; 메토트렉세이트 및 류코보린과의 조합 치료; 블레오마이신, 독소루비신, 에토포시드, 메클로레타민, 프레드니손, 빈블라스틴 및 빈크리스틴과의 조합 치료; 소분자 억제제; 및 프로테오솜 억제제, 예를 들어 보르테조밉을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암의 치료 방법은 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체를 방사선 치료 및 임의로 또 다른 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체는 항암제 (예를 들어, 화학요법제) 및/또는 방사선 요법과 공동으로 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 화학요법제 또는 방사선 요법은 본 발명의 화합물의 투여의 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 1일, 1주, 1개월, 수개월 (예를 들어, 3개월 이하) 이전 또는 이후에 투여된다.
일반적으로, 항-Notch3 항체 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체의 투여를 위한 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg, 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 대략 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg 및 약 25 mg/kg의 투여량이 사용될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 증상의 원하는 억제가 나타날 때까지 또는 예를 들어 종양 성장/진행 또는 암 세포의 전이를 억제 또는 지연시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 항-Notch3 항체 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체를 초기 용량 약 2 mg/kg으로 투여한 후에, 매주 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하거나 격주로 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 예시적인 투여 요법은 증가하는 용량 (예를 들어, 1 mg/kg의 초기 용량 및 매주 또는 보다 긴 기간마다 하나 이상의 보다 높은 용량으로의 점진적 증가)의 투여를 포함한다. 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 매주 1 내지 4회 투여하는 것이 고려된다. 다른 실시양태에서, 1개월에 1회, 또는 2개월마다 또는 3개월마다 1회 투여, 뿐만 아니라 매주, 격주 및 3주마다의 투여가 고려된다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 모니터링될 수 있다. 투여 요법 (사용된 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체의 적절한 투여량은 사용된 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체 (또는 그의 조성물), 치료될 증상의 유형 및 중증도, 작용제가 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 작용제에 대한 반응, 투여된 작용제에 대한 환자의 클리어런스율, 및 담당의의 재량에 따라 달라질 것이다. 임상의는 목적 결과 및 그 이상을 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체를 투여할 수 있다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 걸쳐 달라질 수 있지만, 또한 일정하게 유지될 수 있다. 일반적으로, 반감기와 같은 실험적인 고려사항이 투여량을 결정하는데 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로 증상의 치료 및/또는 저해 및/또는 개선 및/또는 지연, 예를 들어 종양 성장 억제 또는 지연에 기초하지만 반드시 그렇지는 않다. 대안적으로, 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체에 대한 투여량은 항-Notch3 항체 또는 그의 항-Notch3 항체-약물 접합체의 하나 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 항-Notch3 항체 또는 Notch3 길항제의 증분 투여량을 제공받는다. 효능을 평가하기 위해, 질환의 인디케이터를 추적할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료 또는 예방인지의 여부, 및 통상의 기술자에게 공지된 다른 인자들에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 간격을 둔 일련의 투여일 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 초과의 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체가 제공될 수 있다. 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종의 상이한 또는 그 초과의 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체가 제공될 수 있다. 일반적으로, 이들 항-Notch3 항체 또는 항-Notch3 항체-약물 접합체는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 항-Notch3 항체 중 1개 이상이 사용될 수 있다: Notch3 상의 1개의 에피토프에 지시된 제1 항-Notch3 항체, 및 Notch3 상의 상이한 에피토프에 지시된 제2 항-Notch3 항체.
본 발명의 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체는 선택된 투여 방식, 및 제약상 허용되는 희석제 또는 부형제, 예컨대 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 담체 등에 적절하도록 제제화된 투여용 제약 조성물의 형태일 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18th ed., 1995]은 진료의에게 일반적으로 공지되어 있는 제제화 기술의 개요를 제공한다.
이들 제약 조성물은 암을 치료하고자 하는 일반적인 목적을 달성하기 위한, 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 및 관절내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 투여 방식을 지칭하도록 본원에서 정의되는 비경구 투여이다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재하는 경우에 공동 치료의 종류, 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 특성에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 범위 내의 조성물은, 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 항-Notch3 항체-약물 접합체가 암을 치료하기 위한 목적 의학적 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 환자별로 개별 필요량은 달라질 수 있지만, 모든 성분의 유효량에 대해 최적인 범위를 결정하는 것은 통상의 기술을 갖는 임상의의 능력 내에 있다.
진단
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 시험관내에서 또는 생체내에서 생물학적 샘플 내의 Notch3을 검출하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 조직 내의, 또는 조직으로부터 유래된 세포 내의 Notch3의 수준을 결정하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 조직은 질환 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직은 종양 또는 그의 생검일 수 있다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 조직 또는 생검 내의 Notch3의 수준은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 면역검정으로 결정될 수 있다. 조직 또는 그의 생검은 환자로부터 절제될 수 있고, 동결되거나 고정될 수 있다. 동일한 방법을 이용하여 Notch3 단백질의 다른 특성, 예컨대 그의 세포 표면 수준, 또는 그의 세포 국소화를 결정할 수 있다.
상기-기재된 방법을 이용하여 암을 앓는 것으로 밝혀졌거나 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체에서 암을 진단할 수 있고, 여기서 상기 환자에서 측정된 Notch3의 수준이 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교된다. 이어서, 상기 방법을 이용하여 종양이 Notch3을 발현하는지의 여부를 결정할 수 있고, 이는 종양이 본 발명의 항체-약물 접합체를 사용한 치료에 반응할 것임을 시사할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 종양은 Notch3이 발현되는, 고형 종양 암, 예를 들어 비제한적으로, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 두경부암, 방광암, 간암, 피부암 및 육종 또는 혈액 암, 예를 들어 비제한적으로, T-세포 악성종양, T-세포 백혈병, T-세포 림프종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, B-세포 악성종양, 골수성 악성종양, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병, 및 아직 Notch3이 우세하게 발현되는 것으로 결정되지 않은 다른 암이다.
본 발명의 한 실시양태는 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터 채취된 샘플을 항-Notch3 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 샘플에서 Notch3의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; Notch3의 세포 표면 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계; 및 본 발명의 항체-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 Notch3의 수준을 결정하는 것을 포함하는, Notch3 발현 암을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 임의로, 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터 샘플을 채취하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터 채취한 샘플을 계내 혼성화 (ISH)에 적용하는 단계; 샘플 내의 Notch3 mRNA의 수준을 결정하는 단계; Notch3 mRNA의 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계; 및 본 발명의 항체-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 Notch3의 수준을 결정하는 것을 포함하는, Notch3 발현 암을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 임의로, 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터 샘플을 채취하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 연구 또는 진단 용도에서의 사용을 위해 추가로 표지된 모노클로날 항체, 인간화 항체 및 그의 에피토프-결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표지는 방사성표지, 형광단, 발색단, 영상화제 또는 금속 이온이다.
표지된 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편을 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, 대상체의 신체 내에서의 표지의 분포를 측정 또는 모니터링하는 진단 방법이 또한 제공된다.
키트
본 발명은 또한, 예를 들어 기재된 세포독성 접합체, 및 특정 세포 유형의 사멸을 위한 세포독성 접합체의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트를 포함한다. 지침서는 세포독성 접합체를 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 사용하기 위한 지시를 포함할 수 있다. 전형적으로, 키트에는 세포독성 접합체를 함유하는 구획이 있을 것이다. 세포독성 접합체는 동결건조된 형태, 액체 형태, 또는 키트 내에 포함되도록 개조될 수 있는 다른 형태일 수 있다. 키트는 또한 키트 내의 지침서에 기재된 방법을 실행하는데 필요한 추가적인 요소, 예컨대 동결건조된 분말을 재구성하기 위한 멸균 용액, 환자에게 투여하기 전에 세포독성 접합체와 조합하기 위한 추가의 작용제, 및 접합체를 환자에게 투여하는 것을 보조하는 도구를 함유할 수 있다.
상기 또는 하기 실시예에 인용된 모든 공개 및 특허 문헌은 각각을 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기재될 것이나; 본 발명이 이러한 실시예에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적 측면의 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되는 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
재조합 Notch3 단백질 면역원의 생성
N-말단에 신호 펩티드 및 C-말단에 Avi 및 His6 태그를 갖는 인간 Notch3 NRR 영역을 코딩하는 cDNA 구축물을 발현 벡터 pSMED2 내로 클로닝하였다. 이들 구축물을 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 조건화 배지 중에 분비된 단백질을 SDS-PAGE상에서 분석하였다. S1 절단 부위에서의 프로세싱 후, Notch3 NRR 도메인의 N-말단 ~26 kDa (LNR-A, B, C 및 HD1) 및 C-말단 ~12 kDa (HD2 및 Avi_His 태그) 절반체는 비-공유 상호작용을 통해 회합되어 유지됨으로써 도 1에 나타낸 바와 같은 이종이량체 복합체를 형성한다. Notch3 NRR의 S1 프로세싱은 CHO 세포로부터 제조된 샘플에서 약 50% 이하인 것으로 결정되었다. S1 절단 부위에서의 프로세싱을 강화하기 위해, Notch3 NRR 발현 구축물을 CHO-PACE 세포 (Harrison et al., Semin Hematol. 1998 Apr;35(2 Suppl 2):4-10) 내로 형질감염시키고, Notch3 NRR의 최고 발현 및 완전한 프로세싱을 나타내는 안정한 세포주를 선택하였다. 일련의 조건화 배지들에 대하여 이들 세포주의 배양 규모를 확대하고, 그로부터 Notch3 NRR 단백질을 정제하였다.
정제된 인간 및 마우스 Notch3 NRR_Avi_His 태그 단백질 (이하 "Notch3 NRR 재조합 단백질")의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 도 2에 제공된다. 소문자는 Avi_His 태그를 나타낸다. SDS-PAGE 분석은 정제된 단백질의 > 90%가 예측된 Notch3 NRR N-말단 및 C-말단 펩티드 크기로 정확하게 절단되었음을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 2
래트 항-Notch3 항체의 생성 및 클로닝
A. 면역화 및 하이브리도마 생성
프로인트 완전 아주반트 중에 각각 20 μg의 인간 (서열 1) 및 마우스 (서열 3) Notch3 재조합 단백질을 함유하는 혼합물을 피하 주사함으로써 스프라그-돌리 래트를 면역화하였다. 2주 간격으로 12주 동안 면역화를 반복하였다. 1차 주사 후 0, 35, 49, 및 63일째에 수집된 혈청 샘플들을 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 순환 항-Notch3 항체 역가 활성에 대해 시험하였다. 최적의 역가에 도달하였을 때, 단백질 혼합물의 최종 용량을 최적의 항체 역가를 갖는 래트에 정맥내로 (꼬리 정맥) 주사하고, 4일 후 비장세포 수집을 위하여 래트를 희생시켰다. PEG 1500을 사용하여, 래트로부터의 전체 비장세포 (2 x 108)를 마우스 골수종 세포주 P3X63.Ag8.653 (2.5 x 107)과 융합시켰다. 융합된 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (0.2 mL/웰), HAT 선택 (5 x10-4 M 하이포크산틴, 1.6 x 10-5 M 티미딘, 4 x 10-4 M 아미노프테린, 및 20% 열 불활성화 FCS를 함유하는 RPMI 1640)에 적용하였다.
융합 14일 후, 하이브리도마 상청액을 수확하고, Notch3 결합 활성의 존재에 대해 시험하였다. 2개의 모 래트 클론 28 및 75 (각각 이하 r28 및 r75)는 ELISA에 의해 인간 Notch3 NRR 재조합 단백질에 대한 결합 활성을 나타내었고, 0.1-1nM 항체 농도에서 1 이상의 O.D. 450nM 값으로 세포-기반 ELISA에 의해 인간 전장 Notch3을 안정하게 과다발현하는 U-2 OS 세포의 세포 표면에 대한 결합 활성을 나타내었다. 또한, r28은 (r75는 제외) ELISA에 의해 마우스 Notch3 NRR 재조합 단백질에 대한 결합 활성을 나타내었고, 0.1-1nM 항체 농도에서 1 이상의 O.D. 450nM 값으로 세포-기반 ELISA에 의해 마우스 전장 Notch3을 안정하게 과다발현하는 U-2 OS 세포의 세포 표면에 대한 결합 활성을 나타내었다.
B. 항-Notch3 항체의 클로닝 및 서열분석
r28 및 r75 가변 영역을 추가의 분석을 위해 서브클로닝하였다. 서브클론으로부터의 RNA를 추출하고, RT-PCR 클로닝을 통해 발현된 항체로부터의 가변 영역 DNA 서열을 수득하였다. 퀴아젠(QIAGEN) RNAeasy 미니 키트를 사용한 전체 RNA 단리를 위해, 1 내지 5백만개의 서브클로닝된 하이브리도마 세포를 균질화하였다. 이어서, 수퍼스크립트(SuperScript) III RT 키트 (인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 생성시켰다. 후속으로, 항-Notch3 IgG의 가변 영역에 대한 이중 가닥 cDNA를 생성시키고, 하기 기재된 바와 같이 래트 IgG 중쇄 (IgG1, 2a, 2b) 및 경쇄 (카파 또는 람다) 불변 영역으로부터의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 순환 조건: 95℃에서 1분 동안 1순환; 95℃에서 1분 동안, 63℃에서 1분 동안 및 72℃에서 1분 동안 25순환. 생성된 RT-PCR 생성물을 TOPO-블런트(Blunt) 클로닝 벡터 (인비트로젠) 내로 클로닝하고, 통상적인 방법에 의해 서열분석하였다. r28 및 r75 가변 영역의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 도 3에 제공된다. CDR은 밑줄표시되어 있다.
실시예 3
키메라 항-Notch3 항체의 생성 및 특성화
r28 및 r75로부터의 가변 영역 cDNA를, 래트 가변 중쇄 (VH)가 인간 IgG1 (hIgG1)과 인프레임 융합되고 래트 가변 경쇄 (VL)가 인간 카파와 융합된 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 래트-인간 키메라 항체 28 및 75 (각각 이하 ch28 및 ch75)를 HEK293 세포에서의 일시적 형질감염에 의해 이들 구축물로부터 생성하고, 추가로 분석하였다.
ch28 및 ch75를 재조합 단백질 ELISA에서 결합 활성에 대해 시험하였다. 정제된 인간 또는 마우스 Notch3 NRR 재조합 단백질을 1μg/ml의 농도로, Mg/Ca를 함유하는 PBS 100 μl 중에서 코스타 하이-바운드(CoStar hi-bound) 96-웰 ELISA 플레이트 상에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS-Mg/Ca로 세척하고, PBS-Mg/Ca 중 1% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 차단 용액을 플레이트로부터 경사분리하고, 차단 용액 중 항체의 1:3 연속 희석을 플레이트에 적용하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS-Mg/Can으로 다시 세척한 다음, 차단 완충제 중에 희석된 (1:20,000) HRP (양고추냉이 퍼옥시다제) -접합된 이차 항체를 적용하였다. 시험된 일차 항체가 래트 IgG인 경우, 이차 항체는 염소 항-래트 IgG Fc (베틸 바이오테크(Bethyl Biotech))였으며; 일차 항체가 인간 IgG인 경우, 이차 항체는 염소 항-인간 IgG Fc (서던 바이오테크(Southern Biotech))였다.
이차 항체와 함께 1시간 인큐베이션한 후, 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 다시 세척하고, TMB 기질 용액을 첨가하였다. 10분 동안 발색 반응이 일어나게 한 후, 중지 용액인 0.18M H2SO4를 첨가하였다. O.D. 450 nM에서의 흡광도를 측정하고, 데이터를 플롯팅하여, 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 및 그래프패드-프리즘(Graphpad-Prism) 소프트웨어로 분석하였다. ch28 및 ch75는 1nM 이하의 EC50을 가지면서 인간 Notch3 NRR 재조합 단백질에 강한 결합 활성을 나타내었으며, ch28 (ch75는 제외)은 또한 1nM 이하의 EC50으로 마우스 Notch3 NRR 재조합에 대한 강한 결합 활성을 나타내었다. ch28 및 ch75를 하기 기재된 바와 같은 추가의 세포 기반 ELISA를 위해 선택하였다.
실시예 4
인간화
r28 및 r75를 추가의 발전을 위해 인간화되도록 선택하였다. 인간화를 인간 수용자 프레임워크 (중쇄에 대해 DP-54 및 경쇄에 대해 DPK9) 상의 CDR 그라프팅에 의해 수행한 후, 인간 수용자 프레임워크에서의 선택된 복귀 돌연변이로 모 래트 항체의 완전 활성을 회복시켰다. 표 1은 다양한 변이체에 대한 인간 수용자 프레임워크에서의 선택된 복귀 돌연변이를 보여준다.
표 1: 인간화 항-Notch3 항체 변이체에 대해 선택된 복귀 돌연변이.
Figure pct00003
선택된 복귀 돌연변이를 갖는, 인간 수용자 프레임워크, DP-54 및 DPK9 상에 r28 및 r75의 그라프팅된 CDR 공여자 서열을 함유하는 cDNA를 진위즈(Genewiz)에 의해 합성하였다. 합성된 cDNA 생성물을 서브클로닝하고, 각각 포유동물 발현 벡터 pSMED2 및 pSMEN3에서 중쇄의 경우 인간 IgG1 중쇄 불변 영역과, 경쇄의 경우 인간 카파와 인프레임 융합시켰다.
인간화 r28 변이체 VH1.0/VL1.0 (이하 hu28)은 ch28의 항원 결합 에피토프 및 친화도를 완전히 유지하였고, ch28에서 관찰된 강력한 신호전달 억제 활성이 결핍되었다. hu28의 VH 및 VL 영역의 CDR은 각각 r28의 VH 및 VL 영역의 CDR과 동일하다. 인간화 r75 변이체 VH1.9/VL1.3 (이하 hu75)은 ch75의 항원 결합 에피토프 및 친화도, 및 ch75에서 관찰된 강력한 신호전달 억제 활성을 완전히 유지하였다. hu75의 VH 영역의 CDR2 및 CDR3은 각각 r75의 VH 영역의 CDR2 및 CDR3과 동일하다. hu75의 VH 영역의 CDR1은 1개의 복귀 돌연변이 V34M을 함유한다. hu75의 VL 영역의 CDR은 r28의 VL 영역의 CDR과 동일하다. 도 4a-4c는 확인된 CDR을 갖는 hu28의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 (카바트 및 코티아)을 제공하고, 도 5a-5c는 확인된 CDR을 갖는 hu75의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 (카바트 및 코티아)을 제공한다.
r28 및 hu28, 및 r75 및 hu75에 대한 인간 수용자 프레임워크의 VH 및 VL 영역의 정렬을 표 2에 나타내었다. 카바트 CDR은 밑줄표시되어 있다. 래트 및 인간화 서열 사이의 프레임워크의 잔기의 차이는 소문자로 나타내었다. r28 및 hu28 가변 영역에 대한 인간 수용자 프레임워크 사이의 상동성은 VH의 경우 73% 및 VL의 경우 76%였다. r75 및 hu75 가변 영역에 대한 인간 수용자 프레임워크 사이의 상동성은 VH의 경우 46% 및 VL의 경우 64%였다. 카바트 CDR은 밑줄표시되어 있다.
표 2: 항-Notch3 항체에 대한 인간 수용자 프레임워크의 정렬.
Figure pct00004
실시예 5
hu28 및 hu75의 특성화
A. 세포-기반 ELISA
인간화 hu28 및 hu75 및 래트-인간 키메라, ch28 및 ch75, 항-Notch3 항체를 세포-기반 ELISA로 세포 표면 Notch3 결합에 대해 스크리닝하였다. 세포 표면 상에 인간 또는 마우스 전장 Notch3 단백질을 안정하게 과다발현하는 U-2 OS 세포 (각각 이하 U2OS/hNotch3 및 U2OS/mNotch3)를 ELISA 검정 전날에 96웰 플레이트 (백색 불투명, BD/VWR)에서 50,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. ELISA 당일에, 웰로부터 배양 배지를 제거하고, 연속 희석된 (차단 완충제 중에 1:3) 항체 용액을 플레이트에 적용하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 PBS-Mg/Ca로 세척하였다. 이어서, HRP-접합된 이차 항체를 적용하고, 재조합 단백질 ELISA에 대해 상기 기재된 바와 같이 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Mg/Ca로 세척한 후, 피코-케미루미네센트(Pico-Chemiluminescent) 발색 키트 (서멀 사이언티픽(Thermal Scientific))를 이용하여 발색시키고, 제조업체의 지침에 따라 화학발광 측정을 수행하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드-프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터 플롯팅 및 분석을 수행하였다. EC50 (nM) 값을 세포 표면 Notch3 결합 ELISA로부터 계산하고, 표 3에 제공하였다.
데이터는, hu28이 세포 표면 U2OS/hNotch3 세포 상에 발현된 전장 인간 Notch3에 대한 결합에 있어서 ch28과 유사하다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 hu28이 U2OS/mNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 마우스 Notch3에 대한 ch28의 교차-반응성을 완전히 유지했음을 보여준다. 데이터는 또한 hu75가 U2OS/hNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3에 대한 결합에 있어서 ch75와 유사하다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 hu75가 인간 Notch3에 대한 ch75의 특이성을 완전히 유지했음을 보여주며; U2OS/mNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 마우스 Notch3에 대해 어떠한 교차-반응성도 관찰되지 않았다. N/B는 비-결합을 나타낸다.
표 3. 항-Notch3 항체에 대한 세포 표면 Notch3 결합 ELISA의 EC50 (nM) 값.
Figure pct00005
B. 경쟁 ELISA
경쟁 ELISA를 세포 표면 발현된 전장 인간 Notch3에 대하여 hu28 및 ch28, 및 hu75 및 ch75에 대해 수행하였다. 96 웰 세포 배양 플레이트를 U2OS/hNotch3 세포 (세포 배양 플레이트, 코스타)로 시딩하였다. 0.8 nM의 ch28 (비오티닐화) 또는 ch75 (비오티닐화) 항체의 존재하에, 연속 희석된 (차단 완충제 중에 1:3) 항체 용액을 플레이트에 적용하였다. 2시간 동안의 인큐베이션 후, 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 세척하고, 차단 완충제 중에 1:5000 희석된 HRP-접합 스트렙타비딘 (서던 바이오테크)을 적용하였다. 스트렙타비딘과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 세척한 다음, TMB 용액으로 10분 동안 발색시켰다. 0.18M H2SO4를 첨가함으로써 발색 반응을 중지시킨 후, 450 nM에서의 흡광도를 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드-프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터 플롯팅 및 분석을 수행하였다.
표 4는 U2OS/hNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3에 대한 결합에 대한 경쟁 ELISA로부터의 EC50 (nM) 값을 나타낸다. 데이터는 hu28이 비표지된 r28과 유사한 EC50 값을 갖는다는 것을 나타내며, 이는 hu28이 U2OS/hNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3에 대한 결합에 대하여 비표지된 ch28 뿐만 아니라 비오티닐화 ch28과 경쟁한다는 것을 입증한다. 데이터는 hu28이 ch28과 동일하거나 고도로 유사한, U2OS/hNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3 상의 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
데이터는 또한, hu75가 비표지된 ch75와 유사한 EC50 값을 갖는다는 것을 나타내며, 이는 hu75가 U2OS/hNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3에 대한 결합에 대하여 비표지된 ch75 뿐만 아니라 비오티닐화 ch75와 경쟁한다는 것을 입증한다. 데이터는 hu75가 ch75와 동일하거나 고도로 유사한, U2OS/hNotch3 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3 상의 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다.
표 4. 항-Notch3 항체의 경쟁 ELISA에 대한 EC50 (nM) 값.
Figure pct00006
C. 다른 인간 Notch 상동체에 대한 결합의 특이성
Notch 수용체 패밀리의 다른 구성원들은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, Notch1 또는 Notch2 결핍은 마우스 모델에서 배아 사멸로 이어진다. 대조적으로, Notch4 결핍은 마우스 모델에서 어떠한 검출가능한 표현형도 일으키지 않는다. Notch3 NRR 영역의 가장 가까운 상동체는 Notch1 및 Notch2 (~50% 상동성)이며, Notch4는 더 먼 상동체 (~30% 상동성)이다. Notch 패밀리의 다른 구성원, 특히 Notch1 및 Notch2에 대한 항-Notch3 항체의 교차-반응성은 환자에서 바람직하지 않은 효과로 이어질 수 있다. 따라서, 다른 Notch 패밀리 구성원에 대한 r28 및 hu28과 r75 및 hu75의 잠재적 교차-반응성을 평가하였다.
인간 IgG1 Fc 단편과 융합된 인간 Notch1 및 Notch2 NRR 영역을 코딩하는 발현 구축물을 CHO-PACE 세포 내로 안정하게 도입하였다. NRR-Fc 융합체를 발현하는 이들 세포로부터의 조건화 배지를 수집하였다. 단백질 A 친화도에 의해 인간 Notch2 NRR-Fc, 및 인간 Notch1 NRR-Fc를 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 정제된 조제물을 1 mM CaCl2를 함유하는 TBS 내로 투석하였으며, 분석용 SEC에서 순도가 >99%인 것으로 분석되었다.
표 5에 나타낸 바와 같이, r28 및 hu28과 r75 및 hu75는 모두 인간 Notch2 NRR-Fc 융합 단백질에 대한 검출가능한 결합이 결핍되었다. 추가로, hu28 및 hu75는 또한 전장 인간 Notch1 NRR-Fc에 대한 검출가능한 결합이 결핍되었다. 이는 hu28 및 hu75가 Notch1 또는 Notch2와 교차-반응하지 않는다는 것을 보여준다. N/B는 비-결합을 나타낸다.
표 5. Notch2 NRR-Fc 및 Notch1 NRR-Fc에 대한 항-Notch3 항체의 결합.
Figure pct00007
D. 인간 Notch3 NRR에 대한 결합 친화도
표면 플라즈몬 공명 (비아코어® T100, 비아코어 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해, 항-Notch3 NRR 상호작용의 동역학적 상수를 결정하였다. CM5 칩의 유동 세포를 10μl/분의 10mM 글리신, pH 5.0 중 항-인간 IgG-Fc (비아코어®)의 대략 10,000 반응 단위 (RU)로 600초 동안 고정하였다. 10μg/ml의 항-Notch3 항체 ch28 및 hu28, 및 ch75 및 hu75를 1mM CaCl2를 함유하는 TBS 중에 희석하고, 10μl/분으로 포획하였다. 1mM CaCl2를 함유하는 TBS 중에서, 100μl/분의 4가지 농도의 인간 Notch3 NRR 재조합 단백질 (3.7-100 nM) 및 제로 농도 (전개 완충제)의 회합을 3분 동안 기록하였다. 복합체의 해리를 10분 동안 측정하였다. 10μl/분으로 60초 동안, 3mM EGTA를 함유하는 3M MgCl2를 주사함으로써 칩의 표면을 재생시켰다. 참조 및 완충제 신호를 차감한 후 수득된 곡선을, 비아코어® T100 평가 소프트웨어 (비아코어®)를 사용하여 1:1 랑뮈르(Langmuir) 결합 모델에 핏팅하였다.
Ka, Kd 및 KD를 표 6에 나타내었다. 동역학적 분석은 ch28 및 hu28에 대해 유사한 ka (온) 및 kd (오프) 속도를 보여준다. 또한, ch75보다 hu75에 대하여 더 높은 ka (온) 및 더 낮은 kd (오프) 속도가 관찰되었으며, 이는 hu75에 대한 더 낮은 KD 값을 유발한다.
표 6. 항-Notch3 항체의 동역학적 분석.
Figure pct00008
D. 열 안정성
단백질 또는 단백질 도메인의 열 안정성과 단백질 또는 단백질 도메인의 전반적 안정성 사이에는 양성 상관관계가 존재한다. 단백질 또는 단백질 도메인의 더 높은 융점은 종종 개선된 제조성 및 더 긴 보관 수명을 제공한다. 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용하여 각각 hu28 및 hu75 대 ch28 및 ch75의 열 안정성을 평가하였다. 단백질 샘플들을 250 μl 부피 중 0.3 mg/ml로 PBS에 희석하였다. 참조 샘플로는 상응하는 제제화 완충제 블랭크를 사용하였다. 8℃로 설정된 마이크로칼 서모박 샘플 탈기 및 온도조절장치(MicroCal ThermoVac Sample Degassing and Thermostat) (마이크로칼, 인크.(Microcal, Inc.), 매사추세츠주 노스햄프턴)를 이용하여 샘플 둘 다를 철저하게 탈기하였다. 마이크로칼 VP-DSC 모세관 세포 미세열량계 (마이크로칼, 인크., 매사추세츠주 노스햄프턴)의 적절한 셀에 샘플들을 분배하였다. 샘플들을 15℃에서 4분 동안 평형화한 다음, 시간 당 100℃의 속도로 100℃까지 스캐닝하였다. 20초의 여과 기간을 선택하였다. 미가공 데이터를 기준선 보정하고, 단백질 농도를 정규화하였다. 데이터를 오리진(Origin) 소프트웨어 (오리진랩 코포레이션(OriginLab Corporation), 매사추세츠주 노스햄프턴)를 이용하여 적절한 추이 수로 MN2-스테이트(State) 모델에 피팅하였다.
하기 표 7에 나타낸 바와 같이, hu28 및 hu75는 둘 다 각각 ch28 및 ch75와 비교하여 그의 Fab 영역에서 더 높은 융점을 나타냄으로써 (모두 77℃ 초과) 보다 높은 열안정성을 가졌다.
표 7. 항-Notch3 항체의 열 안정성 (DSC) 분석.
Figure pct00009
실시예 6
도메인 교환 키메라 구축물
실시예 3에 기재된 바와 같이, hu28 및 hu75 둘 다는 Notch1 단백질과의 교차-반응성이 결핍되었다. Notch1 및 Notch3 NRR에 대한 도메인 교환 키메라 구축물을 항-Notch3 ch28 및 ch75 항체의 에피토프 맵핑을 위해 제조하였다. 인간 Notch1-Notch3 (이하 Notch 1-3) NRR 영역 도메인 교환 키메라를 코딩하며 C-말단 Fc 융합 (인간 IgG1 Fc 단편)을 갖는 발현 구축물을 CHO-PACE 내로 개별적으로 형질감염시키고, 각각의 키메라를 발현하는 안정한 풀을 확립하였다. 각각의 안정한 풀로부터의 조건화 배지를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 적용한 후, 키메라 융합 단백질의 정제를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 정제된 조제물을 1mM CaCl2를 함유하는 TBS 내로 투석하고, 분석용 SEC 상에서 분석하였다. 도 6은 재조합 NRR 키메라 단백질이 인간 Fc (나타내지 않음)에 융합된 다양한 Notch1 (회색으로 나타냄) 및 Notch3 (흑색으로 나타냄) 도메인으로 이루어진다는 것을 보여준다.
Notch 1-3 NRR 도메인 교환 키메라에 대한 ch28 및 ch75의 상대적 결합 능력을 실시예 3 및 5에 기재된 바와 같이 ELISA로 시험하였다. Notch 1-3 NRR 도메인 교환 키메라를 1ug/ml로 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 0.9mM Mg2 + 및 Ca2 +를 함유하는 PBS 중 1% BSA로 차단하였다. 이어서, ch28 및 ch75를 차단 완충제 중에 희석된 5ug/ml로 차단된 플레이트에 적용하였다. 인큐베이션 1시간 후에, 플레이트를 0.9mM Mg2 + 및 Ca2 +를 함유하는 PBS로 세척한 다음, HRP와 접합된 이차 염소 항-인간 Fc 항체를 적용하고, 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 다시 세척한 후, 플레이트를 TMB로 발색시키고, 발색 반응을 0.18M H2SO4를 첨가함으로써 중지시켰다. O.D. 450nM을 플레이트 판독기 상에서 판독하고, 상대적 결합 능력을 O.D. 값으로 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, Notch3 NRR의 도메인에 대한 ch28 및 ch75의 에피토프 결합 프로파일은 구별되었다. 보다 구체적으로, Notch3 NRR에 대한 ch28의 결합은 LNR-C 및 HD-1 도메인에 보다 의존적이었던 반면, ch75는 LNR-A, 및 HD-1 및 HD-2 도메인 둘 다에 보다 의존적이었다. ch28 및 ch75에 대해 관찰된 결합 프로파일은 항체의 신호전달 억제 활성과 일치하였다. 특히, ch28은 단지, Notch3 신호전달의 활성화를 억제하는데 요구되는 자가-억제 입체형태로 Notch3 NRR 영역을 유지하지 않는 Notch3 NRR 이종이량체의 N-말단 (HD-1)과 상호작용하였다. 대조적으로, ch75는 자가-억제 입체형태로 Notch3 NRR 영역을 유지하는 Notch3 NRR 이종이량체의 HD-1 및 HD-2 도메인 둘 다와 상호작용하였으며, 이로써 Notch3 신호전달의 활성화를 억제하였다.
실시예 7
Notch3 발현 암 세포주의 확인
Notch3의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 암 세포주의 패널에서 결정함으로써, 항-Notch3 항체 및 항-Notch3 항체-약물 접합체의 추가의 분석 및 시험을 위한 Notch3 양성 세포를 확인하였다. 패널은 HCC2429 폐암 세포주, OVCAR3 난소암 세포주, MDA-MB-468 유방암 세포주, N87 위암 세포주와 함께, U-2 OS 및 MDA-MB-468 세포를 포함하는, 인간 Notch3을 과다발현하도록 조작된 세포주 (각각 이하 U2OS/hNotch3 및 MDAMB468/hNotch3으로 지칭됨)를 포함하였다. Notch3을 표준 웨스턴 블롯 절차를 이용하여 토끼 모노클로날 항-Notch3 항체 D11B8 (셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies)) 또는 마우스 모노클로날 1G5 (압노바(Abnova))로 검출하였다.
D11B8 항-Notch3 항체는 인간 Notch3 단백질의 C-말단 꼬리 내의 Glu2312 주위의 에피토프에 결합하고, 비절단된 전장 Notch3 (~270 kDa), 및 Notch3 단백질 단편을 함유하는 절단된 C-말단 도메인 (~80-90 kDa) 둘 다를 인식한다. 도 7에 나타낸 바와 같이, ~80-90 kDa 분자량에서의 Notch3 밴드는 TMIC (막횡단 및 세포내 도메인) 및/또는 NEXT (Notch 세포외 말단절단) 단백질분해 단편을 나타낸다. 1G5 항체는 Notch3 세포외 도메인 (ECD)의 아미노산 47-156 내의 에피토프에 결합하고, 비절단된 전장 (~270kDa) 및 절단된 N-말단 단편 (~210 kDa) 둘 다를 인식한다 (데이터는 나타내지 않음).
도 7에 나타낸 바와 같이, Notch3-ECD (데이터는 나타내지 않음) 및 Notch3 단백질 단편을 함유하는 절단된 C-말단 도메인 둘 다가 HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, N87, MDAMB468/hNotch3 및 U2OS/hNotch3에서 검출되었다. 또한, Notch3은 SW900 폐암 세포주에서 검출되지 않았고, 따라서 Notch3 음성 대조군 세포주를 나타낸다.
실시예 8
항-Notch3 항체의 내재화 및 트래픽킹
항-Notch3 항체-약물 접합체는 일련의 세포독성제에 접합된 펩티드 절단성 말레이미도카프로닉-발린-시트루린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (vc) 링커 또는 비-절단성 티오에테르-기재 말레이미도카프로일 (mc) 링커로 이루어진다. 항체로부터의 페이로드의 방출은, 항체의 완전한 이화작용을 위해 vc-유형 링커 또는 후기 리소솜을 절단하여 mc-연결된 페이로드가 방출되도록 하는 단백질분해 효소, 예컨대 카텝신 B를 보유하는 리소솜에 대한 항체-약물 접합체의 트래픽킹 및 국재화를 필요로 한다. 리소솜 소포에 대한 항-Notch3 항체의 내재화 및 세포내 트래픽킹을 간접 및 직접 면역형광 현미경검사-기반 검정에 의해 모니터링하였다. 항-Notch3 항체의 세포내 트래픽킹을 직접적으로 가시화하기 위해, 이들을 형광 염료에 접합시키고, 산성 소포, 예컨대 리소솜을 염색하기 위해 pHrodoTM 적색 덱스트란 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))의 존재 하에 살아있는 세포와 함께 인큐베이션하였다. 살아있는 세포 영상화를 수행하여 형광-표지된 항체와 리소솜 및 다른 산성 소포의 공동-국재화를 확인하였다. 또한, 간접 면역형광 현미경검사-기반 검정을 세포 상에서 수행하여 항-Notch3 항체 및 리소솜-연관 단백질인 LAMP1의 공동-국재화를 확인하였다.
A. 내재화 및 리소솜 트래픽킹
HCC2429 또는 MDA-MB-468 세포를 커버 #1.5 보로실리케이트 멸균 슬라이드 (써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.))를 갖는 Lab Tec II 4 챔버형 커버글라스에서 배양하였다. 제1일에, 산성 소포, 예컨대 리소솜을 염색하기 위해 pHrodoTM 적색 덱스트란 (라이프 테크놀로지스)을 10 μg/ml 농도로 배지에 첨가하고, 16시간 동안 인큐베이션하였다. 제2일에, 세포를 HBSS++ (깁코 라이프 테크놀로지스(Gibco Life Technologies))로 2회 세척하였다. 항-Notch3 항체 hu75를 알렉사 플루오르 488 (이하 "hu75-알렉사488") (라이프 테크놀로지스 단백질 표지 키트)에 접합시키고, hu28을 제조업체의 지침에 따라 딜라이트650 말레이미드 시약 (이하 "hu28-딜라이트650") (써모 사이언티픽)에 직접적으로 접합시켰다. Hu75-알렉사488 또는 hu28-딜라이트650 표지된 항체를 습윤 얼음 상에서 2% 소 혈청 알부민 (BSA)/HBSS++ 중 5 μg/ml 농도로 25분 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 빙냉 HBSS++로 2회 세척하고, 2% BSA/HBSS++에 넣고, 엑셀론 이볼브(eXcelon Evolve) 512 카메라 (광도측정) 및 온도, 습도 및 5% CO2 제어를 위한 XL S 시리즈 챔버 (자이스(Zeiss))가 장착된 스피닝 디스크 CSU-X1M 5000 현미경 (요코가와(Yokogawa)) 상에서 영상화하였다 (5분에서 12-18시간). 영상을 5분마다 캡쳐하고, Zen CZI 파일 포맷 (자이스)을 이용하여 조합하였다. 피어슨 상관 계수를 hu28-딜라이트650 및 pHrodoTM 적색 덱스트란 사이의 공동국재화의 정도를 결정하기 위해 볼로시티(Volocity) v6.3 소프트웨어 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 이용하여 계산하였다.
살아있는 세포 영상화를 위해 세포가 준비되면, 평가될 수 있는 가장 이른 시점은 영상 획득을 위한 기기 셋팅의 셋업 및 최적화 때문에 10분이었다. 세포를 가습된, 37℃, 5% CO2 챔버에 두고 대략 10분 후, 도 8a에 나타낸 바와 같이 hu75-알렉사488이 세포 표면에서, 뿐만 아니라 세포 내부의 몇몇 반점-유사 구조로 관찰될 수 있었다. 이 결과는 항-Notch3 항체 hu75가 세포 막에서 Notch3 수용체에 결합시에 신속하게 내재화를 겪었음을 나타낸다. 초기 시점에 (10분 내지 약 65분), 세포내 항-Notch3 항체 hu75-알렉사488, 및 pHrodoTM 적색 덱스트란으로 염색된 산성 소포는 공동-국재화되지 않은 개별 반점으로 나타났다. 약 70분 및 그 이후의 시점으로부터, 도 8b에 화살표로 나타낸 바와 같이, 항-Notch3 항체 hu75 및 pHrodoTM 적색 덱스트란-표지된 소포는 동일한 개별 반점-유사 구조로 공동-국재화되었다. 이 데이터는, 도 8b에 나타난 바와 같이, 항-Notch3 항체 hu75가 Notch3 발현 HCC2429 (데이터는 나타내지 않음) 및 MDA-MB-468 세포에서 내재화되고 산성 소포, 예컨대 리소솜에 트래픽킹되었음을 시사한다.
세포를 가습된, 37℃, 5% CO2 챔버에 두고 약 10분 후, 도 8c에 나타낸 바와 같이 hu28-딜라이트650이 세포 표면에서 관찰될 수 있었다. 도 8d에 화살표로 나타낸 바와 같이, 세포내 항-Notch3 항체 hu28-딜라이트650 및 pHrodoTM 적색 덱스트란-염색된 산성 소포가 개별 반점으로서 나타났고, 시간이 지나면서 점차 공동-국재화되었다. 피어슨 상관 계수 (PCC)를 계산하여, 시간이 지남에 따른 MDA-MB-468 세포에서의 hu28-딜라이트650 및 pHrodoTM 적색 덱스트란 형광 표지 사이의 중첩 또는 공동-국재화의 정도를 결정하였다. PCC 수가 높을수록, hu28-딜라이트650 및 pHrodoTM 적색 덱스트란 형광 표지 사이의 공동-국재화의 정도도 더 크다. 도 8e는 약 360분까지 공동-국재화가 꾸준히 증가하고, hu28-딜라이트650 및 pHrodoTM 적색 덱스트란 사이의 최대 공동국재화가 약 420분에 발생한 후, 정체기가 이어진다는 것을 보여준다. 데이터는 항-Notch3 항체 hu28-딜라이트650이 Notch3 발현 MDA-MB-468 세포에서 내재화되고 산성 소포, 예컨대 리소솜에 트래픽킹되었음을 시사한다
B. 리소솜-연관 막 단백질 1 (LAMP1)과의 공동-국재화
HCC2429 또는 MDA-MB-468 세포를 커버 #1.5 보로실리케이트 멸균 슬라이드 (써모 피셔 사이언티픽 인크.)를 갖는 Lab Tec II 4 챔버형 커버글라스에서 배양하였다. 결합 및 내재화 검정을 위해, 세포를 HBSS++로 2회 세척하고, 비접합된 항-Notch3 항체, hu75 및 hu28을 얼음 상에서 25분 동안 2% 소 혈청 알부민 (BSA)/HBSS++ 중 농도 10 μg/ml로 세포에 첨가하였다. 시간 0분에서의 시각적 막 결합을 위해, 대조 세포를 빙냉 HBSS++로 세척하고, 이어서 10분 동안 PBS 중 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시켰다. 항체 내재화를 위해, 세포를 빙냉 HBSS++로 2회 세척하고, 이어서 사전-가온된 완전 성장 배지를 세포에 첨가하고, 가습된 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내부에 넣었다. 앞서와 같이 5분에서 18시간까지의 다중 시점에 세포를 인큐베이터에서 꺼내고, 세척하고, 고정시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고, PBS 중 0.3%트리톤 X-100으로 10분 동안 투과시켰다. 세포를 PBS로 3회, 매번 5분 동안 세척하고, 이어서 3% BSA/PBS 중에서 1시간 동안 차단하였다. 항-LAMP-1 마우스 모노클로날 항체 (H4A3, 압캠(Abcam))를 2% BSA/PBS 중 1:100으로 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회, 각각 5분 동안 세척하고, 이어서 이차 염소 항-인간 알렉사 플루오르 488 및 염소 항-마우스 알렉사 플루오르 555 (라이프 테크놀로지스)를 암실에서 45분 동안 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 자이스 LSM510 공초점 현미경 또는 CSU-X1M 5000 (요코가와) 스피닝 디스크 공초점 현미경 상에서 영상화하였다.
항-Notch3 항체와 함께 얼음 상에서 인큐베이션한 다음 즉시 고정시킨 대조 세포에서, hu28 및 hu75 둘 다는 Notch3 발현 세포의 세포 표면에 국재화되었고, 세포 내부의 염색은 관찰되지 않았다. 대조 세포에서, 리소솜을 항-LAMP1 항체로 염색하였고, 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75와 공동-국재화되지 않은 세포 내부의 개별 반점-유사 구조로 나타났다. 37℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75는 항-LAMP1 항체와 공동-국재화된 세포 내부의 반점-유사 구조로 관찰되었다. 37℃에서 인큐베이션한 후, 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75의 세포 막 염색이 감소되었고, 결국 검출불가능하게 되었다. 이 데이터는 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75가 얼음 상에서 세포와의 인큐베이션 후에 세포 표면에 결합하였고, 이어서 37℃에서 온도-의존성 내재화를 겪었다는 것을 시사하였다. 내재화되면, 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75는 LAMP1 단백질과 공동-국재화되며, 이는 이들이 리소솜에 특이적으로 트래픽킹되었음을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 9
세포-기반 검정에서의 Notch3 신호전달에 대한 항-Notch3 항체의 효과.
Notch3 신호전달은 리간드-유도된 단백질분해에 의해 개시된다. 부위 S1에서의 푸린-유사 프로테아제 절단 후의 성숙 Notch3 이종이량체는 막근접 음성 조절 영역 (NRR)에 의해 자가-억제 상태로 유지된다. 리간드, 예컨대 DLL4 또는 재기드1의 Notch3-ECD에 대한 결합은, 각각 ADAM-유형 메탈로프로테이나제 및 감마-세크레타제에 의해 촉매화되는 부위 S2 및 S3에서의 두 연속적 추가 절단을 유도한다. 후자의 절단은 Notch3의 세포내 도메인 (NICD3)을 방출하여, 그것이 핵으로 전위되고 CSL 단백질에 대한 컨센서스 DNA 결합 부위 모티프를 함유하는 표적 유전자의 전사를 활성시키게 한다.
Notch3 신호전달을 억제하는 항-Notch3 키메라 항체, ch28-huIgG1 및 ch75-huIgG1, 및 인간화 항체, hu28 및 hu75의 능력을 Notch3-의존성 리포터 유전자 공동-배양 검정으로 시험하였다. 항-Notch3 항체를 Notch3 리포터 세포와 함께 예비-인큐베이션한 다음, DLL4-HEK293 세포와 공동-배양함으로써 Notch3 신호전달을 활성화하거나, 또는 대조군으로서 모 HEK293 세포와 공동-배양하였다.
A. Notch3 리포터 유전자 공동-배양 검정을 위한 세포주 구축
Notch3 리포터 세포주를 생성하기 위해, U-2 OS 인간 골육종 세포주 (ATCC, 버지니아주 마나사스)에서 3회 일련의 순차적이고 안정한 형질감염을 수행하였다. 1차 형질감염은 pCMV6-엔트리(Entry)-Myc-플래그(Flag) 백본 (오리젠(Origene)) 기반의 전장 인간 Notch3의 발현용 벡터를 사용하였고, Notch3 삽입물의 정확한 DNA 서열이 확인되었다. 트랜스IT-LT1 형질감염 시약 (마이러스(Mirus), 위스콘신주 매디슨)을 사용한 형질감염 후, G418에서 U-2 OS 세포를 선택하고, 클론주를 단리하였다. 2차로, 히그로마이신 B + G418에서 선택된 CSL 인핸서 서열 (CGTGGGAAAAT)의 8개 탠덤 카피를 함유하는 pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro] 벡터 (프로메가((Promega)), 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 안정한 Notch3-발현 U-2 OS 클론을 재-형질감염시키고, 클론주를 단리하였다. 8xCSL 반딧불이-루시퍼라제 리포터 구축물은 활성화된 Notch 신호전달에 대해 반응성이다 (예를 들어, 문헌 [Jeffries et al., Mol. Cell. Biol. 22(11):3927-3941, 2002] 참조). 3차로, 인간 Notch3 8xCSL 반딧불이-루시페라제 U-2 OS 세포를, 퓨로마이신, 히그로마이신 B 및 G418에서 선택된 시그날 렌티 레닐라(Cignal Lenti Renilla) 대조군 (luc) (퀴아젠, 캘리포니아주) 렌티바이러스 입자로 형질도입시키고, 클론주를 단리하였다. 시그날 렌티 레닐라 대조군 (luc) 벡터는 CMV 프로모터로부터 구성적으로 발현되는 레닐라-루시퍼라제 유전자를 코딩하며, 내부 대조군으로서 기능하였다. 삼중으로 안정하게 형질감염된 U-2 OS 세포주 (이후 "Notch3 리포터 세포"로 칭함)를 10% FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 (깁코(Gibco)), 0.25 mg/ml G418 술페이트, 0.3 mg/ml 히그로마이신 B 및 0.001 mg/ml 퓨로마이신을 함유하는 맥코이(McCoy) 5A 배지 (깁코, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 중에서 유지하였다.
리간드-발현 세포를 생성하기 위하여, HEK293 세포 (ATCC)를 인간 DLL4 발현용 벡터로 형질감염시켰다. 벡터는 pCMV6-AC-HA-His 백본 (오리젠, 매릴랜드주 로크빌) 기반의 것이며, DLL4 삽입물의 정확한 DNA 서열이 확인되었다. 형질감염 후, HEK293 세포를 0.5 mg/ml G418 중에서 선택하고, 클론주를 단리하고, 증량시키고, DLL4 발현에 대하여 분석하였다. U-2 OS 세포에서 높은 DLL4 발현 및 높은 Notch3 리포터 활성 유도를 갖는 클론을 사용하여 항-Notch3 항체의 억제 효과를 평가하였다.
반딧불이-루시퍼라제로부터의 발광 판독치를 내부 대조군 레닐라-루시퍼라제 판독치로 나누어 신호를 정규화하였다 (이후 "F/R 비"로 칭함). Notch3 신호전달의 배수-유도를 계산하기 위해, DLL4-HEK293 공동-배양 리포터 검정으로부터 생성된 F/R 비를 모 HEK293 공동-배양으로부터의 F/R 비로 나누고, 상대적 루시퍼라제 단위 (RLU) 또는 활성으로 칭하였다.
B. 리포터 유전자 공동-배양 검정
인간 Notch3 리포터 세포를 트립신처리하고, 50% 완전 맥코이 5A 배지 (맥코이 5A, 10% FBS 및 페니실린, 스트렙토마이신 함유, 인비트로젠) 및 50%의 완전 MEM 배지 (MEM, 10% FBS 및 페니실린, 스트렙토마이신 함유, 인비트로젠)로 이루어진 검정 배지의 배양 플레이트로부터 수확하고, 카운팅하였다. 연속 희석된 (완전 맥코이 5A 배지 중에 1:3) 항체 용액 또는 하이브리도마 배양 상청액의 존재하에, 96웰 배양 블레이트 (백색 불투명, BD/VWR)에서 45μl/웰의 총 부피로 10,000개 세포/웰이 되도록, 동일 배지를 사용하여 적절한 세포 희석물을 제조하였다. 세포 및 항체 희석물의 혼합물을 멸균 후드 내의 플레이트 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 30,000/45μl의 인간 DLL4-HEK293 세포를 각 웰에 첨가하였다. hDLL4-HEK293 세포의 첨가 후, 인큐베이터 내에서 20시간 동안 플레이트를 추가로 인큐베이션하고, 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시퍼라제 검정 시스템 (프로메가)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 반딧불이 루시퍼라제 및 내부 대조군 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터를 플롯팅 및 분석하였다.
인간 Notch3 리포터 공동-배양 검정에서의 ch75-huIgG1 및 hu75의 적정은 용량-의존성 방식으로 Notch3 신호전달의 강력한 억제를 보여주었다. 표 8은 인간 Notch3 리포터 세포에서의 Notch3 의존성 신호전달에 대한 ch75-huIgG1 및 hu75 항체의 억제 활성을 보여준다. ch75-huIgG1 및 hu75는 인간 Notch3 의존성 신호전달 리포터 검정에서 유사한 중화 활성을 보여주었다. 따라서, hu75는 ch75-huIgG1의 억제 활성을 완전히 유지하였다. ch28-huIgG1 및 hu28 둘 다는 대조군 ch2H6-huIgG1 및 huNeg8.8 항체와 유사한 수준으로 Notch3 신호전달을 약하게 억제하였다. 이는 ch28-huIgG1 및 hu28의 억제 활성이 비-특이적이었음을 나타낸다. 또한, 데이터는 항-Notch3 항체 ch28-huIgG1 및 hu28이 Notch3 신호전달을 억제하지 않으며, 따라서 ch75-huIgG1 및 hu75와 기능적으로 구분된다는 것을 보여준다.
표 8. 인간화 및 키메라 항체의 용량-의존성 억제 활성.
Figure pct00010
ch75-huIgG1 및 hu75 변이체의 IC50 (nM) 값을 Notch3 리포터 유전자 공동-배양 검정의 Notch3-의존성 신호전달의 억제로부터 계산하였다. 표 9에 제공된 바와 같이, 2 또는 3회의 독립적 실험으로부터의 IC50 (nM) 데이터를 평균내었다. hu75 및 ch75-huIgG1 둘 다는 낮은 IC50 값을 가졌으며, 이는 이들이 Notch3 신호전달의 강력한 억제제임을 나타낸다.
표 9. hu75 및 ch75-hIgG1의 억제 활성에 대한 IC50 값 (nM).
Figure pct00011
C. 메탈로프로테아제에 의한 부위 2 절단에 대한 항-Notch3 항체의 효과
항-Notch3 항체 hu75 (hu28은 제외)의 Notch3의 NRR 도메인에 대한 결합이 S2-절단의 감소를 동반하는 것을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 토끼 모노클로날 항-Notch3 항체 D11B8 (셀 시그널링 테크놀로지스)은 S1 및 S2 단백질분해적 절단 사건의 생성물인 Notch3 C-말단 단편을 인식한다. NRR 도메인 교환 실험에 의해 입증된 바와 같이, 항-Notch3 항체 hu75는, 부위 1 (S1)에서 푸린-절단에 의해 분리된 NRR의 2개의 비-공유적으로 연결된 영역에 위치한 LNR-A, HD-1 및 HD-2 도메인에 동시에 결합하였다. 항-Notch3 항체 hu28은, S1-부위에 대해 N-말단인 NRR 도메인의 선형, 공유적으로 연결된 영역에 위치한 LNR-C 및 HD1 도메인에 결합하였다. 억제 항체는 자가-억제 입체형태로 NRR 도메인을 안정화하여 S2-절단을 감소시킴으로써 S2-절단된 Notch3의 검출을 감소시킬 것으로 예상되는 반면, 비-억제 항체는 S2-절단에 대한 효과를 갖지 않을 것으로 예상된다.
Notch3 수용체의 부위 2 (S2)-절단을, C-말단 도메인에서 Glu2312 주위의 에피토프를 인식하는 D11B8 (셀 시그널링 테크놀로지스) 항체를 사용한 단백질의 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. HCC2429 및 MDA-MB-468 유방암 세포를 사용하여 S2-절단에 대한 억제 항-Notch3 항체 hu75 및 비-억제 항-Notch3 항체 hu28의 효과를 검사하였다. 검정을 위해, 1-2.5X106개의 세포를 완전 성장 배지에 플레이팅하였다. Hu75, hu28 및 huNeg8.8 대조 항체를 5μg/ml의 농도로 첨가하였다. 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 완충제에서 직접적으로 용해시켰다. 추출물을 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 (바이오-라드(Bio-Rad) 기준 겔) 상에서 변성 SDS-PAGE에 의해 분해하고, iBlot 겔 전달 시스템 (인비트로젠)을 이용하여 니트로셀룰로스 종이로 전달하였다. Notch3을 표준 웨스턴 블롯 절차를 이용하여 D11B8 항체, 및 로딩 대조군으로서 항-GAPDH (시그마(Sigma))로 검출하였다.
도 9는 S2-절단 검정의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 24시간 동안의 비처리 및 대조군 huNeg8.8-처리된 HCC2429 및 MDA-MB-468 세포에서, S1- 및 S2-절단된 C-말단 Notch3 단백질 단편 둘 다가 예상대로 D11B8 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출될 수 있었다. 또한, 억제 항-Notch3 항체 hu75로 처리된 세포에서, S1-절단된 Notch3 C-말단 단편이 검출되었지만, S2-절단된 단편은 검출되지 않았고, 이는 메탈로프로테아제 절단이 hu75에 의해 차단되었음을 나타낸다. 또한, 비-억제 항-Notch3 항체 hu28로 처리된 세포에서, S1- 및 S2-절단된 Notch3 C-말단 단편 둘 다가 검출되었으며, 이는 hu28이 수용체의 단백질분해를 억제하지 않았음을 나타낸다. 따라서, hu28은 실시예 5에서 입증된 바와 같이 높은 친화도로 Notch3-NRR에 결합하고, 세포 표면 상에 발현된 전장 Notch3에 대한 높은 결합 활성을 가졌지만, Notch3 신호전달을 억제하지 않았으며, 이는 이것이 hu75를 비롯한 억제 항-Notch3-NRR 항체와 기능적으로 구분된다는 것을 나타낸다.
실시예 10
화합물의 합성
화합물 0101, 6780, 0131, 3377 및 8261을, 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 번호 WO/2013/072813에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
A. 화합물 0101 (반응식 중 #54)에 대한 실험
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#54)의 제조
Figure pct00012
단계 1. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#53)의 합성. 일반적 절차 D (하기)에 따라, 디클로로메탄 (20 mL, 0.1 M) 및 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 중 #32 (2.05 g, 2.83 mmol, 1 당량), 아민 #19 (2.5 g, 3.4 mmol, 1.2 당량), HATU (1.29 g, 3.38 mmol, 1.2 당량)
Figure pct00013
및 트리에틸아민 (1.57 mL, 11.3 mmol, 4 당량)으로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 헵탄 중 0% → 55% 아세톤)에 의해 정제하여, #53 (2.42 g, 74%)을 고체로서 수득하였다.
Figure pct00014
단계 2. 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#54)의 합성
일반적 절차 A (하기)에 따라, 디클로로메탄 (10 mL, 0.07 M) 중 #53 (701 mg, 0.726 mmol)으로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 디클로로메탄 중 0% → 10% 메탄올)에 의해 정제하였다. 잔류물을 디에틸 에테르 및 헵탄으로 희석하고, 진공 하에 농축시켜 #54 (406 mg, 75%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00015
B. 화합물 6780 (반응식 중 #112)에 대한 실험
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#112)의 제조
Figure pct00016
단계 1. tert-부틸 (2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-카르복실레이트 (#109)의 합성. 디클로로메탄 (21 mL, 0.3 M) 및 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 중 #11 (2.00 g, 6.96 mmol, 1 당량)의 용액에 HATU (3270 mg, 8.35 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 2분 후, 아민 (1R,2S)-(+)-노르에페드린 (1.07 mg, 6.96 mmol, 1 당량) 및 트리에틸아민 (1.94 mL, 13.9 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL)로 희석하고, 염산의 1 M 수용액 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 헵탄 중 0% → 60% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 #109 (2.18 g, 74%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00017
단계 2. (2R,3R)-N-[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]-3-메톡시-2-메틸-3-[(2S)-피롤리딘-2-일]프로판아미드, 트리플루오로아세트산 염 (#110)의 합성. 일반적 절차 C (하기)에 따라, 0℃에서 #109 (414 mg, 0.984 mmol, 1 당량), 디옥산 (5 mL, 0.2 M), 및 디옥산 중 염화수소의 4 M 용액 (15 mL, 60 mmol, 60 당량)으로부터 조 목적 화합물을 합성하고, 이를 역상 크로마토그래피 (방법 C)에 의해 정제하여 #110 (120 mg, 34%)을 점성 액체로서 수득하였다.
Figure pct00018
단계 3. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#111)의 합성. 일반적 절차 D (하기)에 따라, #32 (140 mg, 0.230 mmol, 1 당량),
Figure pct00019
#110 (110 mg, 0.253 mmol, 1.1 당량), 디클로로메탄 (3 mL, 0.08 M), N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL), HATU (96.2 mg, 0.253 mmol, 1.1 당량) 및 트리에틸아민 (96 μL, 0.69 mmol, 3 당량)으로부터 조 목적 생성물을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 헵탄 중 0% → 40% 아세톤)에 의해 정제하여 #111 (220 mg, 95%)을 수득하였다.
Figure pct00020
단계 4. 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#112)의 합성. 일반적 절차 A (하기)에 따라, 디클로로메탄 (5 mL, 0.05 M) 및 디에틸아민 (5 mL) 중 #111 (210 mg, 0.230 mmol)로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 디클로로메탄 중 0% → 10% 메탄올)에 의해 정제하여 오일 및 고체의 혼합물을 수득하였다. 디에틸 에테르 및 헵탄을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 농축시켜 #112 (81 mg, 51%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00021
C, 일반적 절차
일반적 절차 A: 디에틸아민 또는 피페리딘을 사용한 fmoc 제거. 디클로로메탄 또는 N,N-디메틸포름아미드 (또한 DMF로도 지칭됨) 중 Fmoc-함유 화합물의 용액에 동등 부피의 디에틸아민 또는 피페리딘을 첨가하였다. 반응 진행을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 일부 경우에는 잔류물을 헵탄과 1 내지 4회 공비혼합하였다. 잔류물을 통상적으로 디클로로메탄 및 소량의 메탄올로 희석한 후, 실리카 상에 농축시키고, 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 메탄올 (또는 다른 적절한 용매 혼합물)로 용리하여 정제함으로써 목적 물질을 수득하였다 (또는 조 물질을 그대로 사용함).
일반적 절차 C: 디옥산 중 염산을 사용한 Boc 제거 또는 tert-부틸 에스테르 (또한 t-Bu 에스테르로도 지칭됨) 절단. 디옥산 (또는 일부 경우에는 용액 없이, 또는 다른 적절한 용매) 중 Boc-함유 화합물 또는 tert-부틸 에스테르-함유 화합물의 용액에 디옥산 중 염산의 4M 용액을 첨가하였다. 반응 진행을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 일부 경우에는 헵탄과 1 내지 4회 공비혼합하였다.
일반적 절차 D: O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU)와의 커플링. 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드 (또한 DMF로도 지칭됨) 또는 둘 다의 혼합물 중 아민 (1.0 당량) 및 산 (1.0-2.0 당량)의 교반 용액에 HATU (1.0-2.0 당량)를 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (2.0-4.0 당량) 또는 디이소프로필에틸아민 (2.0-4.0 당량, 또한 휘니그 염기로도 지칭됨)을 첨가하였다. 반응 진행을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였고; 반응은 통상적으로 3시간 이내에 완결되었다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 또는 역상 크로마토그래피에 의해 정제하거나, 또는 일부 경우에는 헵탄과 3회 공비혼합하고, 소량의 에틸 아세테이트로 희석한 후, 실리카 또는 C18 결합된 실리카 상에 농축시키고, 실리카 겔 또는 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
D. 다른 화합물
본 발명에 사용된 추가의 화합물은 국제 공개 번호 WO/2013/072813에 기재되어 있고, 하기에 나타내었다.
본원에 사용된, 화합물 0131 또는 2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염 (#118)은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00022
본원에 사용된, 화합물 3377 또는 N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염 (#115)은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00023
본원에 사용된, 화합물 8261 또는 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#69)는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00024
실시예 11
항-Notch3 항체-약물 접합체 (ADC)의 제조
화학적 화합물에 대한 결합을 위한 반응성 부위를 갖는 링커의 섹션을 사용하면서 항체에 대한 반응성 부위를 갖는 링커 단위의 또 다른 섹션을 도입하여 본 발명의 ADC를 제조하였다. 한 측면에서, 링커 단위는 항체 단위, 예컨대 항체 상에 존재하는 친핵성 기와 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 유용한 친핵성 기는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 단위 상의 친전자성 기에 대해 반응성이고, 링커 단위에 대한 공유 결합을 형성한다. 링커 상의 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커 단위는 항체 단위 상에 존재하는 친전자성 기와 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커 단위에 대한 부착에 편리한 부위를 제공한다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 링커 단위의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 단위 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된, "MalC-"로도 공지된 "mc-"는
Figure pct00025
를 지칭한다.
본원에 사용된, "mcValCitPABC-" 또는 "MalCValCitPABC-"로도 공지된 "vc-"는
Figure pct00026
를 지칭한다.
본원에 사용된 "me-"는
Figure pct00027
를 지칭한다.
본원에 사용된, "MalPeg6C2-"는 하기 나타낸 "MalPegXC2-" (여기서 X=6)를 지칭한다:
Figure pct00028
본 발명의 ADC를, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 사용한 항체의 부분적 환원 후에 환원된 시스테인 잔기와 목적 말레이미드 말단 링커-페이로드의 반응을 통해 제조하였다. 구체적으로, 37℃에서 2시간 동안 100 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충제), pH 7.0 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 중 약 2.3 - 3.0배 몰 과량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 첨가함으로써 항체를 부분적으로 환원시켰다. 이어서, 목적 링커-페이로드를 약 7-8의 링커-페이로드/항체 몰비로 반응 혼합물에 첨가하고, 15% v/v의 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재 하에 25℃에서 추가로 1시간 동안 반응시켰다. 1시간의 인큐베이션 기간 후, 3배 과량의 N-에틸말레이미드를 첨가하여 미반응 티올을 캡핑하고, 15분 동안 반응되도록 한 후, 6배 과량의 L-Cys를 첨가하여 임의의 미반응 링커-페이로드를 켄칭하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 밤새 포스페이트 완충 염수 (PBS), pH 7.4 중에서 투석시키고, SEC (AKTA 익스플로러(AKTA explorer), 수퍼덱스(Superdex) 200)를 통해 정제하였다. 정제된 ADC를 37℃에서 24-72시간 동안 100mM 보레이트, pH 9.2 완충제 중에서 인큐베이션하여 숙신이미드 고리의 가수분해를 추가로 달성하였다. 개환을 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 모니터링하였고, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해 정제하였다. ADC를 SEC (순도에 대해), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여, 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도를 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
vc0101 (시스테인 잔기를 통한 항체 X에 대한 접합을 보여준다)
Figure pct00029
vc6780 (시스테인 잔기를 통한 항체 X에 대한 접합을 보여준다)
Figure pct00030
표 10에 제공된 바와 같이, 인간화 항-Notch 항체, hu28 및 hu75, 및 래트-인간 키메라 항-Notch 항체, ch28 및 ch75를 다양한 링커-페이로드 조합에 접합시켰다. ADC 및 그의 성분을 본 발명의 방법에 따라, 및 국제 공개 번호 WO/2013/072813에 따라 제조하였다.
표 10. 항-Notch3 ADC 명명법.
Figure pct00031
실시예 12
항-Notch3 항체 및 ADC의 결합 활성 및 특이성
A. 세포-기반 ELISA
비접합된 항-Notch3 항체, 항-Notch3 ADC 및 음성 대조군 항체 (huNeg8.8)를 세포-기반 ELISA에서 Notch3 발현 세포주에 대한 세포 표면 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 과다발현 Notch3 세포주, U2OS/hNotch3 및 내인성 Notch3 발현 세포주, HCC2429 및 MDA-MB-468을 ELISA 검정 전날에 96 웰 플레이트 (백색 불투명, BD/VWR)에 각각 50,000, 200,000 및 100,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. ELISA 당일에, 배양 배지를 웰로부터 제거하고, 연속 희석된 (염화칼슘 및 염화마그네슘 (Ca/Mg) 및 1% BSA를 함유하는 DPBS 중 1:3) 항체 및 ADC 용액을 플레이트에 적용하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, Ca/Mg 및 1% BSA를 함유하는 DPBS로 세척하였다. 이어서, HRP-접합된 이차 항체를 적용하고, 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 Ca/Mg 및 1% BSA를 함유하는 DPBS로 세척한 후, 피코-케미루미네센트 발색 키트 (서멀 사이언티픽)를 이용하여 발색시키고, 제조업체의 지침에 따라 화학발광 측정을 수행하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드-프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터 플롯팅 및 분석을 수행하였다.
표 11은 비접합된 항-Notch3 항체, hu28 및 hu75, 및 항-Notch3 ADC, hu28- vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 및 hu75-vc6780에 대한 세포 표면 Notch3 결합 ELISA로부터의 2 내지 4회 독립적 실험에 대해 계산된 EC50 (nM) 값 및 표준 편차 (SD)를 보여준다. 데이터는 hu28-ADC 및 hu75-ADC가 U2OS/hNotch3, HCC2429 및 MDA-MB-468 세포의 세포 표면 상에 발현된 전장 인간 Notch3에 대한 결합에 있어서, 각각 비접합된 항체 hu28 및 hu75와 유사하다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 hu28 및 hu75 항체에 대한 다양한 링커-페이로드의 접합이 결합 특성에 영향을 미치거나 이를 변경하지 않는다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 hu28, 및 hu28-vc0101 및 hu28-vc6780 둘 다가 hu75 및 hu75-vc0101 및 hu75-vc6780보다 세포 표면 Notch3에 대해 더 높은 결합 능력을 갖는다는 것 (보다 낮은 EC50 값에 의해 입증됨)을 보여준다. 음성 대조군, 비접합된 huNeg8.8 항체는 시험된 임의의 세포주에 결합하지 않았다. 결합 결핍 (LB) 대조 항체의 경우, EC50 값은 나타낸 바와 같이 생성되지 않았다. (SD = 표준 편차)
표 11. 비접합된 항-Notch3 항체 및 항-Notch3 ADC에 대한 EC50 (nM) 값. (SD = 표준 편차)
Figure pct00032
B. 유동 세포측정법
비접합된 항-Notch3 항체, hu28 및 hu75를 유동 세포측정법에 의해 Notch3 발현 세포주에 대한 세포 표면 결합 활성에 대해 검사하였다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 표준 절차에 따라 수행하였다. 세포를 염화칼슘 및 염화마그네슘을 함유하는 HBSS (본원에서 HBSS++로 칭함) 중에서 헹구고, EDTA 없이 트립신을 사용하여 수확하고, FBS를 함유하는 배지로 중화하였다. 세포를 3% HICS (열-불활성화 소 혈청)를 함유하는 HBSS++ 중에서 4 μg/mL 항-Notch3 항체, hu28 및 hu75와 함께 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 차가운 HBSS++, 3% HICS 완충제로 3회 세척하였다. 세포를 암실에서 알로피코시아닌-접합된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 이차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 펜실베니아주 웨스트 그로브) 중에 10 μg/mL로 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 차가운 HBSS++/3% HICS 완충제로 1회 세척하였다. 세포를 HBSS++/3% HICS, 25mM HEPES, 1 mM MgCl2 및 25 μg/ml DNaseI 중에 재현탁시켰다. 비생존 세포를 배제시키기 위해 7-AAD (7-아미노-악티노마이신 D)를 첨가하였다. 살아있는 세포를 BD FACSC칼리버 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세) 상에서 분석하였다. 채널 FL-4로부터의 평균 형광 강도 (MFI)를 플루우조 유동 세포측정법 분석 소프트웨어 (오리건주 앳슈랜드)로 계산하였다.
표 12는 FACS 분석에 의한 Notch3 발현 세포주의 패널에 대한 비접합된 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75의 결합 활성을 보여준다. U-2 OS 세포주를 Notch3 음성/저 대조 세포주로서 사용하였다. hu28 및 hu75 둘 다는 음성 대조군 huNeg8.8보다 별로 높지 않은 U-2 OS에 대한 결합의 낮은 수준을 가졌다. 또한, 데이터는 hu28 및 hu75가 Notch3 과다발현 세포, U2OS/hNotch3 및 MDAMB468/hNotch3, 및 Notch3 내인성 발현 세포 MDA-MB-468, HCC2429 및 OVCAR3에 특이적으로 결합하였음을 보여준다. 또한, 데이터는, 세포-기반 ELISA에 의한 결합 활성의 관찰과 유사하게 모든 Notch3 발현 세포주에 대한 hu28의 결합 활성이 hu75보다 더 컸음을 보여준다.
표 12. 항-Notch3 항체에 대한 FACS 분석에 의한 MFI 값.
Figure pct00033
실시예 13
시험관내 세포독성 검정
항-Notch3 ADC의 효과를 MTS 세포 생존율 인디케이터 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 1) Notch3 단백질을 내인성 발현하는 세포주: HCC2429 (폐암), OVCAR3 (난소암) 및 MDA-MB-468 (유방암), 2) 전장 인간 Notch3 단백질을 과다발현하도록 조작된 세포주: MDA-MB-468/hNotch3 및 U2OS/hNotch3, 및 3) 음성 대조군 세포주 (SW900) 상에서 평가하였다. 이들 세포주를, 본 발명의 다양한 링커-페이로드 조합에 접합된 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체, ch28 및 ch75, 및 인간화 항-Notch3 항체, hu28 및 hu75를 포함하는, 증가하는 농도의 항-Notch3 ADC와 함께 배양하였다. 항-Notch3-ADC에 대한 특이성 대조군으로서, 비-표적화 대조-ADC (huNeg8.8-ADC 또는 ch2H6-ADC)도 또한 동일한 세포주 상에서 시험하였다. 4일 후, 각각의 배양물의 생존율을 평가하였다. IC50 값을 XL 피트 v4.2 (IDBS, 영국 서리주 길포드)를 이용하여 로지스틱 비-선형 회귀, 모델 #203에 의해 계산하고, ng Ab/mL로 표시하였다. 약물 항체 비 (DAR)를 또한 제공하였다.
표 13은 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC 처리의 IC50 (ng Ab/mL) 값을 보여준다. 2-4회의 개별적인 반복을 갖는 실험의 경우에, 평균 IC50 값은 평균의 표준 오차 (S.E.M.)와 함께 계산하였다. 데이터는 다양한 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 Notch3 발현 및 과다발현 암 세포주 HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA-MB-468/hNotch3, U2OS/hNotch3에서 활성이고 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 비-표적화 대조-ADC는 효력이 결핍되었고 (LP) 따라서 나타낸 바와 같이 IC50 값이 생성되지 않았거나, 또는 시험한 가장 높은 용량에서 최소한으로 활성이었다. 대조-ADC에 대한 IC50 값과 동일하거나 또는 그보다 높은 IC50 값을 갖는 항-Notch3 ADC는 시험관내에서 효력이 결핍된 것으로 간주하였으며, LP로 표시하였다.
표 13. 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC의 IC50 (ng Ab/mL) 값 (nd= 결정되지 않음).
Figure pct00034
표 14는 인간화 항-Notch3 ADC 처리의 IC50 (ng Ab/mL) 값을 보여준다. HCC2429 및 MDA-MB-468/hNotch3 세포주는 2회의 개별적인 반복을 가졌다. 데이터는 다양한 링커-페이로드를 갖는 인간화 항-Notch3 ADC가 Notch3 발현 및 과다발현 암 세포주 HCC2429, OVCAR3, MDA-MB-468, MDA-MB-468/hNotch3, U2OS/hNotch3에서 활성이며 세포 사멸을 유도하였으나, Notch3 발현이 결핍된 음성 대조군 세포주 SW900에서는 그렇지 않았음을 보여준다. 비-표적화 대조-ADC는 효력이 결핍되었고 (LP) 따라서 나타낸 바와 같이 IC50 값이 생성되지 않았거나, 또는 시험한 가장 높은 용량에서 최소한으로 활성이었다. 대조-ADC에 대한 IC50 값과 동일하거나 또는 그보다 높은 IC50 값을 갖는 항-Notch3 ADC는 시험관내에서 효력이 결핍된 것으로 간주하였으며, LP로 표시하였다. 비접합 인간화 항-Notch3 항체 hu28 및 hu75는 HCC2429 또는 MDAMB468/hNotch3의 생존율에 영향을 미치지 않았고, 이는 세포독성이 페이로드에 특이적으로 기인할 수 있음을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음).
표 14. 인간화 항-Notch3 ADC의 IC50 (ng Ab/mL) 값.
Figure pct00035
siRNA를 사용한 Notch3 녹다운을 이용하여 항-Notch3 ADC의 시험관내 세포독성이 Notch3 단백질의 발현에 의존적임을 확인하였다. siRNA 형질감염을 온-타겟 + 스마트(SMART) 풀 인간 Notch3 (L-011093-00), 온-타켓 + 대조군 비-표적화 풀 (D-001810-10) (써모 사이언티픽 다마콘(Thermo Scientific Dharmacon)) 및 리포펙타민 RNAiMAX 시약 (인비트로젠)을 사용하여 생성하였다. 2 내지 2.5x106개 세포의 HCC2429, OVCAR3 및 MDA-MB-468/hNotch3 세포를 형질감염 전날에 10cm 디쉬에서 항생제 무함유의 성장 배지에 플레이팅하였다. 다음날, 항생제 무함유의 새로운 배지를 첨가하였다. siRNA 및 리포펙타민 RNAiMAX를 OPTI-MEM 배지 중에 희석하고, 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 각각의 세포주를 대조군 및 Notch3 siRNA로 형질감염시켰다. 세포를 가습된, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 형질감염 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, MTS 세포 생존율 인디케이터 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)를 사용한 평가를 위해 세포를 트립신처리하고 플레이팅하였다.
이어서, 세포주에 따라, 세포를 처리 24시간 전에 웰당 2,500 내지 5,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포를 3배 연속 희석된 인간화 항-Notch3 ADC로, 10개 농도 (0-30 μg Ab/ml 범위)에서 3회 반복으로 처리하였다. 상대적 세포 생존율을 처리 96시간 후에 비처리 대조군의 백분율로서 결정하고, IC50 값을 XL 피트 v4.2 (IDBS, 영국 서리주 길포드)를 이용하여 로지스틱 비-선형 회귀, 모델 #203에 의해 계산하고, ng Ab/mL로 표시하였다. 2회의 개별적인 반복을 갖는 실험의 경우에, 평균 IC50 값은 평균의 표준 오차 (S.E.M.)와 함께 계산하였다. 대조군 및 Notch3 siRNA-처리된 세포로부터 제조된 추출물에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하여, Notch3 녹다운이 144시간까지 동안 발생하였음을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). Notch3을 발현하는 세포주 (본원에서 대조군 siRNA로 칭함) 또는 siRNA 녹다운 후에 감소된 Notch3 발현을 갖는 세포주 (본원에서 Notch3 siRNA로 칭함)를 증가하는 농도의 인간화 항 Notch3 ADC와 함께 배양하였다. 항-Notch3 ADC에 대한 특이성 대조군으로서, 비-표적화 대조-ADC (huNeg8.8-ADC)를 또한 동일한 세포주 상에서 시험하였다. 4일 후, 각각의 배양물의 생존율을 평가하였다. IC50 값을 XL 피트 v4.2 (IDBS, 영국 서리주 길포드)를 이용하여 로지스틱 비-선형 회귀, 모델 #203에 의해 계산하고, ng Ab/mL로 표시하였다. 약물 항체 비 (DAR)를 또한 제공하였다.
표 15는 대조군 siRNA 또는 Notch3 siRNA 처리된 암 세포주의 패널의 인간화 항-Notch3 ADC 처리의 IC50 (ng Ab/mL) 값을 보여준다. 데이터는 다양한 링커-페이로드를 갖는 인간화 항-Notch3 ADC가 Notch3-발현 암 세포주 (대조군 siRNA)에서 활성이고 세포 사멸을 유도하였음을 보여준다. siRNA 녹다운 후에 Notch3 발현이 감소된 세포 (Notch3 siRNA)에서, IC50 값은 대조군 siRNA보다 더 컸고, 이는 Notch3 발현의 감소가 항-Notch3 ADC의 세포독성의 감소를 수반하였음을 나타낸다. 대조-ADC는 효력이 결핍되었고 (LP), 따라서 나타낸 바와 같이 IC50 값이 생성되지 않았거나, 또는 시험된 최대 용량에서 최소한으로 활성이었다. 데이터는 또한 인간화 항-Notch3 ADC가 Notch3 발현 및 과다발현 암 세포주 상에서 세포 사멸을 특이적으로 유도하였음을 보여준다. 동일한 세포 상에서의 Notch3 siRNA 녹다운이 항-Notch3 ADC에 의한 세포 사멸을 감소시켰기 때문에, 관찰된 세포독성은 Notch3 발현에 의존적이다. 따라서, 인간화 항-Notch3 ADC는 그의 시험관내 세포독성에 대해 Notch3 발현에 의존적이다.
표 15. 인간화 항-Notch3 ADC의 IC50 (ng Ab/ml) 값.
Figure pct00036
실시예 14
항-Notch3 ADC 작용 메카니즘의 시험관내 평가
A. 미세관의 항-Notch3 ADC 교란
Notch3-ADC로부터의 페이로드의 내재화 및 세포내 방출 후에, 방출된 페이로드의 작용의 추정 메카니즘은 세포 분열에 요구되는 미세관의 교란으로 세포 주기 정지, 아폽토시스 및 세포 사멸을 일으킨다는 것이었다. 이러한 작용 메카니즘을 확인하기 위해, OVCAR3 난소암 세포를 hu28-vc0101, huNeg8.8-vc0101 (ADC 대조군)로 처리하거나, 비처리로 두고, 이어서 항-알파-튜불린 항체로의 염색에 의해 미세관 및 항-포스포-히스톤 H3 항체를 마킹하여 면역형광 분석에 적용함으로써 유사분열이 진행되고 있는 세포 또는 정지된 세포를 확인하였다.
OVCAR3 세포를 커버 #1.5 보로실리케이트 멸균 슬라이드 (써모 피셔 사이언티픽 인크.)를 갖는 Lab Tec II 4 챔버형 커버글라스에 시딩하였다. 다음날, 세포를 1.0 μg/ml의 hu28-vc0101, 대조군 huNeg8.8-vc0101로 처리하거나, 또는 비처리로 두었다. 48시간 후, 세포를 HBSS++로 2회 세척하고, 10분 동안 4% 파라포름알데히드 중에서 고정하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 2분 동안 0.5 % 트리톤 X-100으로 투과시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 실온에서 30분 동안 3% BSA/PBS로 차단하였다. 이어서, 세포를 2%BSA/PBS 중 1:100의 항-포스포-히스톤 H3 (Ser10) (셀 시그널링) 및 2 μg/ml의 항-알파-튜불린 (밀리포어)과 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 이어서 염소 항-마우스 알렉사 플루오르 488 및 염소 항-토끼 555의 1:500 희석물과 함께 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 샘플을 LSM710 공초점 현미경 (자이스) 상에서 영상화하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 세포 주기의 유사분열 기에 있는 비처리된 OVCAR3 세포는 포스포-히스톤 H3에 양성으로 염색되고, 항-알파-튜불린 염색에 의해 입증된 바와 같이 정상적인 양극 방추체 장치를 함유한다. hu28-vc0101로의 처리 (그러나 대조군 huNeg8.8-vc0101은 제외)는 포스포-히스톤 H3 염색된 세포에서의 그의 비정상적 형태학에 의해 입증된 바와 같이 유사분열 방추 장치의 구조를 교란시켰다. 데이터는 hu28-vc0101이, 세포 분열의 완료를 위해 유사분열 동안 요구되는 미세관을 교란시킴으로써 세포 증식을 억제하였음을 보여준다.
B. 아폽토시스의 항-Notch3 ADC 유도
카스파제-3 및 카스파제-7 (카스파제-3/7) 프로테아제는 포유동물 세포의 후기 아폽토시스 사건을 매개하는 역할을 하는 프로그램화된 세포 사멸 기구의 핵심 구성원이다. 카스파제-3/7의 활성을 Notch3-ADC로 처리된 Notch3 발현 세포주에서 측정하였다.
OVCAR3, HCC2429 및 MDA-MB-468/hNotch3 세포를 불투명 백색 조직 배양 플레이트에 시딩하고, 밤새 인큐베이션하였다. OVCAR3 및 HCC2429를 1.1 μg/ml로 처리하고, MDA-MB-468/hNotch3 세포를 1μg/ml의 hu28-vc0101 및 huNeg8.8-vc010 (ADC 대조군)으로 처리하였다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 실온에서 2시간 동안 카스파제-글로 3/7 시약 (프로메가 #G8090)으로 처리하였다. 발광을 발광측정기로 측정하고, 배경을 차감한 후, 값을 상대적 발광 단위로 보고하였다.
표 16은 hu28-vc0101이 Notch3 발현 세포주 MDA-MB-468/hNotch3, HCC2429 및 OVCAR3 세포에서 대조군 Neg8.8-vc0101 처리된 세포에 비해 2-3배 카스파제-3/7의 활성을 유도하였음을 보여준다. 따라서, hu28-vc0101은 아포토시스를 유도함으로써 세포 성장을 억제한다.
표 16. 항-Notch3 ADC에 대한 상대적 발광 단위.
Figure pct00037
실시예 15
Notch3 면역조직화학
항-Notch3 ADC의 효과를, 이종이식된 인간 종양 세포의 세포 막에서 Notch3 발현의 검출가능한 수준을 갖는 전임상 모델에서 평가하였다. Notch3을 발현하는 전임상 모델을 확인하기 위해, 항-Notch3 항체를 사용한 면역조직화학 (이하 "IHC"은)을, 다음을 포함하는 이종이식편 모델의 패널에서 수행하였다: 37622A1 NSCLC (환자 유래), HCC2429 폐암, MDA-MB-468 유방암 및 N87 위암 이종이식편 모델.
각각의 이종이식편으로부터의 조직 단편을 포르말린-고정하고, 표준 조직학 절차를 이용하여 파라핀 포매 (FFPE)하였다. 5 마이크로미터 FFPE 절편을 절단하여, 왁스를 제거한 후, 증류수에 수화시켰다. 압력 쿠커 내의 EDTA 완충제 pH 8.0 중에 항원을 회수하였다. 내인성 퍼옥시다제를 10분 동안 3.0 % H2O2로 차단하였다. 절편을 DAKO 단백질 블록과 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 토끼 항-Notch3 (D11B8; 셀 시그널링 테크놀로지스)의 1:2000 희석물을 실온에서 1시간 동안 절편에 적용하였다. 시그날스테인 부스트(Signalstain Boost) 항-토끼 IgG-HRP 중합체 (셀 시그널링 테크놀로지스)를 실온에서 30분 동안 절편에 적용하였다. DAB를 사용하여 5분 동안 색상을 발색시켰다. 메이어(Mayer) 헤마톡실린 중에서 절편을 간단하게 대조염색하고, 탈수하고, 정화하고, 커버슬립을 덮었다. 표 17은 0-4의 등급으로 스코어링된 염색 강도 및 염색 분포 등급을 보여주며, 여기서 0은 음성이고, 4는 최고 강도이다.
표 17. 염색 강도 및 염색 분포 등급.
Figure pct00038
표 18에 나타낸 바와 같이, Notch3 단백질을 37622A1 NSCLC, HCC2429, MDA-MB-468 및 N87 이종이식편으로부터 세포 막 (Mem) 상에서, 및 세포의 세포질 (Cyto) 및/또는 핵 (Nuc)에서 검출하였다. 데이터는 HCC2429 및 N87 이종이식편 둘 다가 세포의 76-100%의 세포 막에서 Notch3 단백질의 균질한 분포를 가졌음을 보여준다. 또한, 데이터는 37622A1 NSCLC 및 MDA-MB-468 이종이식편이 세포의 51-75%에서 세포 막에 Notch3 단백질의 불균질한 분포를 가졌음을 보여준다. 또한, D11B8 항체를 사용한 일부 상피 종양 세포의 핵에서의 Notch3 C-말단 세포내 도메인의 검출은 Notch3 신호전달이 이들 세포에서 활성이었음을 시사한다.
표 18. 이종이식편 모델의 패널에 대한 Notch3 면역조직화학의 세포하 국재화, 강도 및 분포 스코어.
Figure pct00039
도 11에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석으로 생체내 효능 연구에 사용된 이종이식편의 패널에서의 Notch3 발현 수준을 확인하였다. 세포외 도메인의 ~210 kDa Notch3 단백질 단편 (이하 Notch3-ECD)을 마우스 모노클로날 항-Notch3 항체 1G5 (압노바)를 사용하여 HCC2429, MDA-MB-468, N87 및 37622A1 이종이식편 추출물에서 검출하였다. 따라서, 항-Notch3 항체 D11B8을 사용한 IHC로부터의 데이터는 인간 상피 종양 세포의 세포 막에서의 Notch3을 입증하였고, 항-Notch3 항체 1G5를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 항-Notch3 ADC의 표적인 NRR 도메인을 함유하는 Notch3-ECD의 발현을 입증하였다.
실시예 16
생체내 종양 이종이식편 모델
인간화 항-Notch3 항체, hu28 및 hu75, 및 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체, ch28 및 ch75를 다양한 링커-페이로드 조합에 접합시키고, 37622A1 비소세포 폐암 (NSCLC), HCC2429 폐암, MDA-MB-468 유방암 및 N87 위암 이종이식편 모델에서 시험하였다. 하기 기재된 각각의 모델에 대해 제1 용량을 제0일에 제공하였다. 종양을 적어도 주 1회 측정하고, 그의 부피를 하기 식으로 계산하였다: 종양 부피 (mm3) = 0.5 x (종양 폭2)(종양 길이). 각각의 치료군에 대한 평균 종양 부피 (± S.E.M.)를 최대 10마리의 동물 및 최소 6마리의 동물을 포함시켜 계산하였다.
A. 37622A1 환자 유래 NSCLC 이종이식편
적절한 동의 절차 (애스터랜드(Asterand))에 따라 수득한 새로이 절개된 37622A1 NSCLC 종양의 단편으로부터 확립된 인간 종양 이종이식편의 생체내 성장에 대한 항-Notch3 ADC의 효과를 면역결핍 마우스에서 검사하였다. 37622A1 NSCLC 환자-유래 이종이식편을 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에서 동물 → 동물 단편으로서 생체내에서 피하 계대시켰다. 종양이 150 내지 300 mm3의 부피에 도달했을 때, 다양한 치료군 간의 종양 크기의 균일성을 보증하기 위해 종양을 단계 구분하였다. 37622A1 NSCLC 환자-유래 이종이식편 모델에 PBS 비히클, 인간화 항-Notch3 ADC, 대조군 huNeg-8.8 ADC 및 시스플라틴을 표 19에 제공된 용량으로 4일마다 4회 (Q4dx4) 정맥내 투여하였다. 도 12는 시스플라틴 (5 mg/kg) 및 PBS 비히클과 비교한 3 mg/kg 용량의 vc0101 링커-페이로드를 갖는 ADC의, 표 19로부터 데이터의 그래프를 보여준다.
시스플라틴은 암의 치료에 사용되는 백금-기반 항암제이고, 표준 관리 요법으로 간주된다. 시스플라틴은 DNA를 가교시키고, 그로 인해 아폽토시스 및 세포 성장 억제를 유도한다. 데이터는 항-Notch3 ADC hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 및 hu75-vc6780이 37622A1 NSCLC 환자-유래 이종이식편 종양의 성장을 억제하였음을 보여준다. 3 mg/kg 용량의 hu28-vc0101이 본 연구에서 시험된 가장 강력한 ADC였고, 연구 중 84일째까지 9마리의 동물 중 4마리가 여전히 무종양이었다. 또한, 데이터는 항-Notch3 ADC가 대조군 huNeg8.8-ADC보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 항-Notch3 ADC가 시스플라틴보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였음을 보여주며, 이는 백금-기반 표준 관리 화학요법 약물보다 더 큰 효력을 나타낸다 (도 12).
표 19. 37622A1 NSCLC 이종이식편에서의 항-Notch3 ADC의 효능.
Figure pct00040
B. HCC2429 폐 이종이식편
유사한 생체내 실험을 HCC2429 폐암 세포주로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에 50% 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 중 3.5x106개의 HCC2429 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 200 내지 400 mm3의 부피에 도달했을 때, 다양한 치료군 간의 종양 덩이의 균일성을 보증하기 위해 종양을 단계 구분하였다. HCC2429 폐 모델에 PBS 비히클, 인간화 항-Notch3 ADC 및 대조군 huNeg-8.8 ADC를 표 20 및 21에 제공된 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 데이터는 항-Notch3 ADC hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 및 hu75-vc6780이 HCC2429 폐 이종이식편의 성장을 용량-의존적 방식으로 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 항-Notch3 ADC가 vc0101 링커-페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC의 경우에는 1 및 3 mg/kg 용량에서, 및 vc6780 링커-페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC의 경우에는 3 및 10 mg/kg 용량에서 대조군 huNeg8.8-ADC보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 3mg/kg 용량의 hu28-vc0101이 10 mg/kg 용량의 hu28-vc6780보다 더 강력하였음을 보여준다.
표 20. HCC2429 폐 이종이식편에서의 항-Notch3-vc0101 ADC의 효능.
Figure pct00041
표 21. HCC2429 폐 이종이식편에서의 항-Notch3-vc6780 ADC의 효능.
Figure pct00042
또한, HCC2429 폐 모델에 PBS 비히클, 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC 및 대조군 huNeg-8.8 ADC를 도 16a에 제공된 바와 같이 5mg/kg의 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 데이터는 비-절단성 (mc) 링커 및 절단성 (vc) 링커 및 다양한 페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC가 HCC2429 폐 이종이식편의 성장을 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 대조군 huNeg8.8-ADC보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 vc0101 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 시험된 다른 항-Notch3 ADC보다 더 강력하였음을 보여준다.
추가의 생체내 실험을 비접합된 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체, ch75-hIgG1을 사용하여 HCC2429 폐암 세포주로 수행함으로써, ch75-hIgG1의 Notch3 신호전달 억제가 항-Notch3 hu75-ADC의 관찰된 효력에 기여하였는지의 여부를 결정하였다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에 50% 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 중 3.5x106개의 HCC2429 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 75 내지 200 mm3의 부피에 도달했을 때, 다양한 치료군 간의 종양 덩이의 균일성을 보증하기 위해 종양을 단계 구분하였다.
HCC2429 폐 모델에 PBS 비히클, 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체, ch75-hIgG1 및 인간화 항-Notch1 항체, hu438 VH1.1/VL1.8을 표 22에 제공된 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 8마리의 동물로부터, 각각의 치료군에 대한 평균 종양 질량 (± SEM)을 계산하고, 대조군 PBS 비히클 군과 비교하였다. 엑셀 내장된 통계 함수를 이용하여, 분산 분석 (ANOVA) 기반의 P-값을 계산함으로써, 항-Notch 처리 대 대조군 PBS의 관찰된 성장 억제의 통계적 유의성을 결정하였다. 연구 최종일의 측정으로부터 비히클-처리 마우스와 비교하여 약물-처리된 마우스에 대한 퍼센트 (%) 성장 억제 값을, 식 100*{1 - [(처리제14일 - 처리제0일)/(대조군제14일 - 대조군제0일)]}로 계산하였다.
데이터는 PBS 비히클 처리된 종양과 비교하여 항-Notch1 인간화 항체 hu438 VH1.1/VL1.8이 종양 성장을 57% 억제하였고, 비접합된 래트-인간 키메라 항-Notch3 항체 ch75-hIgG1이 종양 성장을 억제하지 않았음을 보여준다. 또한, 데이터는 표 20, 21 및 도 16a에 보고된, ch75 항체로 생성된 Notch3 ADC를 사용하여 HCC2429 이종이식편에서 관찰된 종양 성장 억제가 신호전달 억제로 인한 것이 아님을 보여준다.
표 22. HCC2429 폐 이종이식편에서의 억제 항-Notch3 및 항-Notch1 항체의 효과.
Figure pct00043
C. MDA-MB-468 유방 이종이식편
유사한 생체내 실험을 MDA-MB-468 유방암 세포주로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. MDA-MB-468 세포는 이들이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2)의 발현이 결핍되어 있기 때문에 삼중-음성 유방암 (TNBC) 기저-유사 하위유형으로 분류된다 (Lehmann, BD, et al., J Clin Invest. 2011;121(7):2750-2767). 이종이식편을 생성하기 위해, 암컷 SCID 헤어리스 비근교계 (SHO) 마우스에 50% 매트리겔 (BD 바이오사이언시스)을 함유하는 10x106개의 MDA-MB-468 세포를 유방 지방 패드 내에 같은자리 이식하였다. 종양이 250 내지 450 mm3의 부피에 도달했을 때, 다양한 치료군 간의 종양 덩이의 균일성을 보증하기 위해 종양을 단계 구분하였다. MDA-MB-468 유방 모델에 PBS 비히클, 인간화 항-Notch3 ADC 및 대조군 huNeg-8.8 ADC를 표 23 및 24에 제공된 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 도 13a 및 13b는 대조군 huNeg-8.8 ADC 및 PBS 비히클과 비교한 vc0101 링커-페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC의, 표 23으로부터의 데이터의 그래프를 보여준다. 도 14a 및 14b는 대조군 huNeg-8.8 ADC 및 PBS 비히클과 비교하여 vc6780 링커-페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC의, 표 24로부터의 데이터의 그래프를 보여준다.
데이터는 항-Notch3 ADC hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 및 hu75-vc6780이 MDA-MB-468 유방 이종이식편의 성장을 용량-의존적 방식으로 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 항-Notch3 ADC가 vc0101 링커-페이로드를 갖는 ADC의 경우에는 1 및 3 mg/kg 용량, 및 vc6780 링커-페이로드를 갖는 ADC의 경우에는 1, 3 및 10 mg/kg 용량에서 대조군 huNeg8.8-ADC보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였음을 보여준다. 또한, 데이터는 1 mg/kg 용량의 vc0101 링커-페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC가 3 mg/kg 용량의 vc6780 링커-페이로드를 갖는 항-Notch3 ADC보다 더 강력하였음을 보여준다.
표 23. MDA-MB-468 유방 이종이식편에서의 항-Notch3-vc0101 ADC의 효능.
Figure pct00044
Figure pct00045
표 24. MDA-MB-468 유방 이종이식편에서의 항-Notch3-vc6780 ADC의 효능.
Figure pct00046
MDA-MB-468 유방암 모델에 PBS 비히클, 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC 및 대조군 huNeg-8.8 ADC를 도 16b와 16c에 제공된 바와 같이 5mg/kg 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 데이터는 비-절단성 (mc) 및 절단성 (vc) 링커 및 다양한 페이로드 조합을 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 MDA-MB-468 유방 이종이식편의 성장을 억제했다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 대조군 huNeg8.8-ADC보다 더 강력하게 종양 성장을 억제했다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 vc0101 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 시험된 다른 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC보다 더 강력하다는 것을 보여준다.
MDA-MB-468 유방암 모델을 사용하여 hu28-vc0101의 작용의 생체내 메카니즘을 검사하였다. hu28-vc0101의 약력학을 ADC 처리된 이종이식편에서 유사분열 마커 포스포-히스톤 H3에 의한 염색에 의해 세포 수준에서 가시화하였다. 히스톤 H3은 세포 주기의 유사분열 기 동안 염색질 내의 Ser-10 잔기 상에 인산화된다 (이하 "pHH3").
MDA-MB-468 유방 이종이식편을 보유한 마우스에게 항-Notch3 ADC hu28-vc0101, huNeg-8.8-vc0101 (ADC 대조군) 또는 PBS를 단일 3 mg/kg 용량으로 정맥내로 제공하였다. 3개의 이종이식편을 6, 24 및 96시간 후에 수확하고 표준 면역조직화학 처리를 하였다. 5 마이크로미터 두께의 포르말린 고정 파라핀 포매된 조직 절편을, 단계적인 알콜에서 증류수까지 사용하여 재수화하면서 크실렌 기질 중에서 파라핀 제거하였다. 항원 부위를 노출시키기 위해, 조직 절편을 압력 쿠커 (리트리버(Retriever); 일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences))에서 10mM 시트레이트 완충제 pH 6.0 (랩비전(Labvision)) 중에서 가열하고, 실온으로 냉각시켰다. 내인성 퍼옥시다제 활성은 15분 동안 3% 과산화수소에 의해 비활성화하였다. 비-특이적 단백질 상호작용은 UV 블록(랩비전)을 이용한 10분 인큐베이션에 의해 차단하였다. 조직 절편을 1시간 동안 항-pHH3 항체와 함께 인큐베이션하고, 30분 동안 시그날스테인 부스트 시약 (8114, 셀 시그널링 테크놀로지스)으로 검출하고 5분 동안 DAB+ (다코(DAKO))로 발색시켰다. 모든 절편을 헤마톡실린 QS (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))로 대조염색하고, 수돗물 중에 세척하고, 단계적으로 알콜로 탈수시키고, 크실렌 기질 중에서 정화시키고, 퍼마운트 마운팅 배지 (피셔케미컬즈(FisherChemicals), 뉴저지주 페어 론)에 배치하였다.
면역 조직화학적으로 염색된 슬라이드를 영상 분석에 의해 평가하였다. 슬라이드를 하마마츠 나노줌머(Hamamatsu NanoZoomer) 자동화 슬라이드 스캐너를 이용하여 20X로 영상화하였다. 디지털화한 후, 가상 슬라이드를 데피닌스(Definiens) 조직 스튜디오 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 각각의 이종이식편 절편을 세포충실성 및 형태학에 기초하여 영역별로 분할하고 분류하였다. 개별적 핵이 이종이식편의 생존 영역 내에서 확인되었고, 각각의 핵의 평균 갈색 발색체 강도를 이용하여 양성도를 결정하였다. 데이터는 하기 식을 이용하여 계산되는 퍼센트 (%) pHH3 양성도로 제공된다: (pHH3 양성 핵의 수 (생존 영역)/핵의 총 수 (생존 영역))*100. 통계적 유의성의 결정은 양측 T 검정을 이용하는 그래프 패드 프리즘으로 24시간 시점에 PBS 대조군과 비교하여 각각의 치료군 및 시점에 대해 결정하였다.
hu28-vc0101과 같은 미세관 억제제에 의해 생성된 ADC는 히스톤 H3이 염색질 내의 Ser-10 잔기 상에 인산화되었을 때 세포 주기의 유사분열 기에서 세포 증식을 정지시킬 것으로 예상된다. ADC 처리된 이종이식편 중에서 pHH3 염색의 축적은 암 세포가 유사분열에서 정지되었다는 것을 나타낸다. 표 25는 항-Notch3 hu28-vc0101 및 huNeg-8.8-vc0101 (ADC 대조군) 처리된 MDA-MB-468 이종이식편 및 비처리된 MDA-MB-468 이종이식편에서의 pHH3 염색 세포의 백분율을 포함한다. 데이터는 hu28-vc0101 (huNeg8.8-vc0101 대조군은 제외)이 PBS 대조군과 비교하여 처리후 24 및 96 시간째에 MDA-MD-468 암 세포에서 pHH3 염색 핵의 백분율이 통계적으로 유의한 2 배수 증가를 유도하였다는 것을 보여준다. 데이터는 항-Notch3 hu28-vc0101이 적어도 부분적으로 세포 주기의 유사분열 기에서 세포를 정지시켜 증식을 방지함으로써 생체내 종양 성장을 억제한다는 것을 나타낸다.
표 25. Notch3 ADC 처리된 MDA-MB-468 유방암 이종이식편에서 pHH3 염색된 핵의 백분율 (n.d.=결정되지 않음)
Figure pct00048
D. N87 위 이종이식편
유사한 생체내 실험을 상기 기재한 바와 같이 N87 위암 세포주로 수행하였다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에게 50% 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 중 8x106개의 N87 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 250 내지 450 mm3의 부피에 도달했을 때, 다양한 치료군 간의 종양 덩이의 균일성을 보증하기 위해 종양을 단계 구분하였다. N87 위 모델에 PBS 비히클, 인간화 항-Notch3 ADC, 대조군 huNeg-8.8 ADC 및 시스플라틴을 표 26 및 27에 제공된 용량으로 Q4dx4로 정맥내 제공하였다. 데이터는 항-Notch3 ADC hu28-vc0101, hu28-vc6780, hu75-vc0101 및 hu75-vc6780이 용량-의존성 방식으로 N87 위 이종이식편의 성장을 억제했다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 항-Notch3 ADC가 vc0101 링커-페이로드를 갖는 ADC의 경우 1, 3, 5 mg/kg 용량 및 vc6780 링커-페이로드를 갖는 ADC의 경우 3 및 10 mg/kg 용량에서 huNeg8.8-ADC 대조군보다 더 강력하게 종양 성장을 억제했다는 것을 보여준다. 133일까지, hu28-vc0101의 5 mg/kg 용량 군은 9마리 중 6마리의 무종양 동물을 포함했고, hu75-vc0101은 9마리 중 4마리를 가졌고 huNeg8-8-vc0101 대조군은 8마리 중 1마리의 무종양 동물을 가졌다. 또한, vc0101 링커-페이로드를 갖는 ADC는 일반적으로 시스플라틴 표준 관리 요법 및 vc6780 링커-페이로드를 갖는 ADC보다 더 효력이 있었다.
표 26. N87 위 이종이식편에서의 항-Notch3-vc0101 ADC의 효능.
Figure pct00049
표 27. N87 위 이종이식편에서의 항-Notch3-vc6780 ADC의 효능.
Figure pct00050
또한, N87 위 모델에 PBS 비히클, 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC 및 대조군 huNeg-8.8 ADC를 도 16d에 제공된 바와 같이 5mg/kg 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 데이터는 비-절단성 (mc) 링커 및 절단성 (vc) 링커 및 다양한 페이로드 조합을 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 N87 위 이종이식편의 성장을 억제하였다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 대조군 huNeg8.8-ADC보다 더 강력하게 종양 성장을 억제하였다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 vc0101 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 시험된 다른 항-Notch3 ADC보다 더 효력있다는 것을 보여준다.
또한, N87 위 모델에 PBS 비히클 및 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC ch28-mc0131, ch75-mc0131, ch28-m(H2O)c-0131 및 ch75-m(H2O)c-0131을 도 16e에 제공된 바와 같이 5mg/kg의 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 데이터는 mc0131 및 m(H2O)c-0131 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 N87 위 이종이식편의 성장을 억제하였다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 m(H2O)c-0131 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC가 mc0131 링커-페이로드를 갖는 래트-인간 키메라 항-Notch3 ADC보다 더 효력있다는 것을 보여준다.
E. OVCAR3 난소 이종이식편
유사한 생체내 실험을 OVCAR3 난소 세포주로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 이종이식편을 생성하기 위해, SCID 헤어리스 비근교계 (SHO) 암컷 마우스에 50% 매트리겔 (BD 바이오사이언시스) 중 5 x106개의 OVCAR3 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 120 내지 290 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 치료군 간의 종양 덩이의 균일성을 보증하기 위해 종양을 단계 구분하였다. OVCAR3 모델에 PBS 비히클, 인간화 항-Notch3 ADC hu28-vc0101 및 대조군 ADC huNeg-8.8-vc0101을 Q4dx4로 정맥내 투여하고; 파클리탁셀을 Q7dx4로 복강내 (30 mg/kg 1일에 2회) 및 카르보플라틴을 Q7dx8로 표 28에 제공된 용량으로 투여하였다. 도 15 및 표 28은 hu28-vc0101이 용량-의존성 방식으로 OVCAR3 난소 이종이식편의 성장을 억제했다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 hu28-vc0101이 huNeg8.8-vc0101 대조군 및 카르보플라틴 표준 관리 화학요법보다 더 종양 성장을 강력하게 억제했다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 SHO 마우스에서 3 mg/kg Q4dx4로 투여된 hu28-vc0101이 파클리탁셀의 최대 허용 용량인 60 mg/kg, Q7dx4로 투여된 파클리탁셀과 유사한 효력을 갖는다는 것을 보여준다.
표 28. OVCAR3 난소 이종이식편에서의 항-Notch3 ADC hu28-vc0101의 효능.
Figure pct00051
Figure pct00052
실시예 17
부위-특이적 접합을 위한 시스테인 돌연변이체 생성
이전 실시예에 기재된 항-Notch3 ADC는 표적 항체의 시스테인 아미노산 잔기에 대한 링커-페이로드의 통상적 비-특이적 접합을 통하여 생성하였다. 항체에 대한 링커-페이로드의 부위-특이적 접합은 균질한 약물 로딩을 용이하게 하고 잠재적으로 변경된 항원-결합 또는 약동학 특성을 갖는 ADC 하위집단을 회피하기 위해 수행되었으며, 상기 하위집단은 통상의 접합 방법에 의해 생성된 일부의 ADC에서 관찰될 수 있다. 한가지 이러한 부위-특이적 접합 전략은 시스테인 잔기를 표적 항체의 아미노산 서열 중의 특정한 부위에 도입하도록 설계되었다. 국제 공개 번호 WO/2013/093809에 기재된 바와 같이, 불변 중쇄 및 불변 경쇄에서의 수많은 아미노산 위치가 확인되었고, hu28 항체에서의 특정한 아미노산 위치에서 시스테인 잔기로 치환된다.
부위-특이적 시스테인 치환은 위치 L443 및 K392에서 Fc 폴리펩티드 또는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (Cy) 내로 가도록 조작되었다 (본원에서 L443C 및 K392C). 부위-특이적 시스테인 치환은 위치 K183에서 인간 카파 (κ) 경쇄 불변 도메인 (Cκ) 폴리펩티드 내로 가도록 조작되었다 (본원에서 κK183C). 시스테인 돌연변이체의 CDR은 부모 야생형 hu28과 동일하게 똑같이 유지된다. 도 17a 및 17b는 기재된 부위-특이적 시스테인 치환을 갖는 hu28 항체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 제공한다. hu28 항체의 시스테인 치환은 하기 항체의 생성을 유도한다: hu28-(L443C), hu28-(L443C/K392C) 및 hu28-(L443C/κK183C). 국제 공개 번호 WO/2013/093809에 기재된 바와 같이, 모든 시스테인 돌연변이는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 구축되었다. 이러한 돌연변이체 항체를 위한 발현 구축물은 CHO 세포의 안정한 발현을 위해 부위-특이적 집적화 (SSI) 발현 벡터 (론자(Lonza))로 생성하였다. 시스테인 돌연변이체 항체를 발현하는 형질감염된 CHO 세포의 안정한 풀을 확립하고 조건화 배지를 생성하였다. 표준 단백질 A 친화도 정제, 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 이전 실시예에서 기재된 바와 같이, 조건화 배지로부터 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 항체를 정제하였다.
실시예 18
시스테인 돌연변이체의 특성화
비접합 시스테인 돌연변이체 인간화 항-Notch3 항체를 이전 실시예에 기재된 바와 같이, 세포-기반 ELISA에서 Notch3 발현 세포주에 대한 세포 표면 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 표 29는 비접합 시스테인 돌연변이체인 hu28-(L443C), hu28-(L443/K382) 및 hu28-(L443/κK183C)에 대한 세포 표면 Notch3 결합 ELISA로부터 계산된 EC50 (nM) 값을 나타낸다. 데이터는 시스테인 돌연변이체 항체가 U2OS/hNotch3, HCC2429 및 OVCAR3 세포의 세포 표면에 발현된 전장 인간 Notch3과의 결합에 있어서 부모 야생형 hu28 항체와 유사한 EC50 값을 갖는다는 것을 보여준다. 또한, 데이터는 인간화 hu28 항체의 중쇄, 또는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 불변 영역 내로의 시스테인 아미노산의 치환은 그의 결합 특성에 영향을 미치거나 이를 변경하지 않는다는 것을 보여준다. 음성 대조군 huNeg8.8 항체는 시험된 어떤 세포주와도 결합하지 않았다. 결합이 결핍된 (LB) 대조군 항체에 대해서는, 나타내어진 바와 같이 EC50 값이 생성되지 않았다.
표 29. 비접합 시스테인 돌연변이체 항-Notch3 항체의 EC50 (nM) 값
Figure pct00053
실시예 19
시스테인 돌연변이체 ADC의 시험관내 세포독성 검정
100 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충제), pH 7.0 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 중 100배 몰 과량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 항체를 완전 환원시키고, 이어서 잉여 TCEP를 제거하기 위해 탈염하여, 말레이미드 관능화 링커-페이로드의 항-Notch3 hu28 시스테인 돌연변이체 항체에 대한 접합을 달성하였다. 환원된 항체를 2mM 데히드로 아스코르브산 (DHA), 100 mM HEPES, pH 7.0 및 1mM DTPA 중에서 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 쇄-간 디술피드 결합을 개질하였다. 탈염 후에, vc0101 링커-페이로드를 약 7의 링커-페이로드/항체 몰 비로 반응 혼합물에 첨가하고, 15%v/v의 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재 하에 25℃에서 추가로 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 인큐베이션 기간 후에, 임의의 미반응 링커-페이로드를 켄칭하기 위해 6배 과량의 L-Cys를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 밤새 포스페이트 완충 염수 (PBS) (pH 7.4) 중에서 투석시키고, SEC (AKTA 익스플로러, 수퍼덱스 200)를 통해 정제하였다. ADC를 SEC (순도에 대해), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여, 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 자외선 분광광도계를 통해 결정되었다. 추가적 접합 기술은 국제 공개 번호 WO/2013/093809에 기재되어 있다.
이 과정은 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 ADC를 생성했다: hu28-(L443C)-vc0101 및 hu28-(L443C/κK183C)-vc0101. 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 ADC의 활성을 Notch3 단백질을 내인성 발현하는 세포주: HCC2429 (폐암) 및 OVCAR3 (난소암)에 대해 이전 실시예에 기재된 바와 같이 MTS 세포 생존율 인디케이터를 이용하여 평가하였다.
표 30은 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 ADC 처리의 IC50 (ng Ab/mL) 값을 보여준다. 데이터는 DAR=3.9를 갖는 hu28-(L443C/κK183C)-vc0101이 활성이고, DAR=3.9를 갖는 야생형 hu28-vc0101 ADC와 유사한 효력을 가졌고, 둘 다가 Notch3 발현 암 세포주 HCC2429 및 OVCAR3에서 세포 사멸을 유도했다는 것을 보여준다. 데이터는 또한 DAR=2를 갖는 단일 시스테인 돌연변이체 hu28-(L443)-vc0101 및 DAR=4를 갖는 비-표적화 대조군 huNeg8.8 ADC가 시험된 가장 높은 용량에서 최소한으로 활성이었다는 것을 보여준다.
표 30. 인간화 항-Notch3 ADC의 IC50 값 (ng Ab/mL)
Figure pct00054
실시예 20
시스테인 돌연변이체 ADC의 생체내 효능
유사한 생체내 실험을 이전 실시예에 기재된 바와 같이 OVCAR3 난소 세포주를 사용하는 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 ADC로 수행하였다. OVCAR3 모델에 PBS 비히클, hu28-vc0101, 항-hu28-(L443C)-vc0101, hu28-(L443C/κK183C)-vc0101 및 대조군 huNeg-8.8 ADC를 표 31에 제공된 용량으로 Q4dx4로 정맥내 투여하였다. 데이터는 이중 시스테인 돌연변이체 hu28-(L443C/κK183C)-vc0101이 3 mg/kg 용량에서는 야생형 hu28-vc0101과 유사하지만 1 mg/kg 용량에서는 더 적은 활성으로 OVCAR3 난소 이종이식편의 성장을 억제했다는 것을 보여준다. 데이터는 또한 DAR=2를 갖는 단일 시스테인 돌연변이체 hu28-(L443C)-vc0101이 생체내 효능이 있지만, 3 1 mg/kg 및 3 mg/kg 용량 둘 다에서는 야생형 hu28-vc0101 및 hu28-(L443C/κK183C)-vc0101보다 다 덜 활성이었다는 것을 보여준다. 데이터는 부위-특이적 접합에 의해 생성된 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 ADC가 생체내 효능이 있고, 종양 성장을 억제하는 것을 나타낸다.
표 31. OVCAR3 난소 이종이식편에서의 항-Notch3 시스테인 돌연변이체 ADC의 생체내 효능
Figure pct00055
Figure pct00056
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Geles, Kenneth G. <120> ANTI-NOTCH3 ANTIBODIES AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATES <130> PC71980 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 1 Ala Pro Glu Val Ser Glu Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln 1 5 10 15 Ala Lys Arg Gly Asp Gln Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly 20 25 30 Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly Asp Pro Trp 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Ala Leu Gln Cys Trp Arg Leu Phe Asn Asn Ser Arg 50 55 60 Cys Asp Pro Ala Cys Ser Ser Pro Ala Cys Leu Tyr Asp Asn Phe Asp 65 70 75 80 Cys His Ala Gly Gly Arg Glu Arg Thr Cys Asn Pro Val Tyr Glu Lys 85 90 95 Tyr Cys Ala Asp His Phe Ala Asp Gly Arg Cys Asp Gln Gly Cys Asn 100 105 110 Thr Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Ser Glu Val Pro 115 120 125 Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Leu Val Leu Thr Val Leu Leu Pro Pro 130 135 140 Glu Glu Leu Leu Arg Ser Ser Ala Asp Phe Leu Gln Arg Leu Ser Ala 145 150 155 160 Ile Leu Arg Thr Ser Leu Arg Phe Arg Leu Asp Ala His Gly Gln Ala 165 170 175 Met Val Phe Pro Tyr His Arg Pro Ser Pro Gly Ser Glu Pro Arg Ala 180 185 190 Arg Arg Glu Leu Ala Pro Glu Val Ile Gly Ser Val Val Met Leu Glu 195 200 205 Ile Asp Asn Arg Leu Cys Leu Gln Ser Pro Glu Asn Asp His Cys Phe 210 215 220 Pro Asp Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Gly Ala Leu Ser Ala Val 225 230 235 240 Glu Arg Leu Asp Phe Pro Tyr Pro Leu Arg Asp Val Arg Gly Glu Pro 245 250 255 Leu Glu Pro Pro Glu Pro Ser Val Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly 275 280 285 Pro Pro His His His His His His 290 295 <210> 2 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 2 gcacccgagg tctcggagga gccgcggtgc ccgcgcgccg cctgccaggc caagcgcggg 60 gaccagcgct gcgaccgcga gtgcaacagc ccaggctgcg gctgggacgg cggcgactgc 120 tcgctgagcg tgggcgaccc ctggcggcaa tgcgaggcgc tgcagtgctg gcgcctcttc 180 aacaacagcc gctgcgaccc cgcctgcagc tcgcccgcct gcctctacga caacttcgac 240 tgccacgccg gtggccgcga gcgcacttgc aacccggtgt acgagaagta ctgcgccgac 300 cactttgccg acggccgctg cgaccagggc tgcaacacgg aggagtgcgg ctgggatggg 360 ctggattgtg ccagcgaggt gccggccctg ctggcccgcg gcgtgctggt gctcacagtg 420 ctgctgccgc cggaggagct actgcgttcc agcgccgact ttctgcagcg gctcagcgcc 480 atcctgcgca cctcgctgcg cttccgcctg gacgcgcacg gccaggccat ggtcttccct 540 taccaccggc ctagtcctgg ctccgaaccc cgggcccgtc gggagctggc ccccgaggtg 600 atcggctcgg tagtaatgct ggagattgac aaccggctct gcctgcagtc gcctgagaat 660 gatcactgct tccccgatgc ccagagcgcc gctgactacc tgggagcgtt gtcagcggtg 720 gagcgcctgg acttcccgta cccactgcgg gacgtgcggg gggagccgct ggagcctcca 780 gaacccagcg tcccgggagg gggaagcgga ggcggactga acgacatctt cgaggctcag 840 aaaatcgaat ggcacgaagg tggcccacca catcatcatc atcatcac 888 <210> 3 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 3 Ala Pro Glu Val Pro Glu Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln 1 5 10 15 Ala Lys Arg Gly Asp Gln Asn Cys Asp Arg Glu Cys Asn Thr Pro Gly 20 25 30 Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Val Asp Asp Pro Trp 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Ala Leu Gln Cys Trp Arg Leu Phe Asn Asn Ser Arg 50 55 60 Cys Asp Pro Ala Cys Ser Ser Pro Ala Cys Leu Tyr Asp Asn Phe Asp 65 70 75 80 Cys Tyr Ser Gly Gly Arg Asp Arg Thr Cys Asn Pro Val Tyr Glu Lys 85 90 95 Tyr Cys Ala Asp His Phe Ala Asp Gly Arg Cys Asp Gln Gly Cys Asn 100 105 110 Thr Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Ser Glu Val Pro 115 120 125 Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Leu Val Leu Thr Val Leu Leu Pro Pro 130 135 140 Glu Glu Leu Leu Arg Ser Ser Ala Asp Phe Leu Gln Arg Leu Ser Ala 145 150 155 160 Ile Leu Arg Thr Ser Leu Arg Phe Arg Leu Asp Ala Arg Gly Gln Ala 165 170 175 Met Val Phe Pro Tyr His Arg Pro Ser Pro Gly Ser Glu Ser Arg Val 180 185 190 Arg Arg Glu Leu Gly Pro Glu Val Ile Gly Ser Val Val Met Leu Glu 195 200 205 Ile Asp Asn Arg Leu Cys Leu Gln Ser Ala Glu Asn Asp His Cys Phe 210 215 220 Pro Asp Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Gly Ala Leu Ser Ala Val 225 230 235 240 Glu Arg Leu Asp Phe Pro Tyr Pro Leu Arg Asp Val Arg Gly Glu Pro 245 250 255 Leu Glu Ala Pro Glu Gln Ser Val Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly 275 280 285 Pro Pro His His His His His His 290 295 <210> 4 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 4 gcccctgagg tccccgagga gccacggtgc ccgcgagcgg cttgccaggc caagcgaggg 60 gaccagaact gcgatcgtga gtgcaacacc ccaggctgtg gctgggatgg cggtgactgc 120 tcactgaacg tggacgaccc ctggaggcag tgtgaggcac tgcagtgctg gcgtctcttc 180 aacaacagcc ggtgtgaccc ggcctgcagc tctccagcct gcctctatga caactttgac 240 tgctactctg gtggccgcga ccgcacctgc aaccctgttt atgagaagta ctgcgccgac 300 cactttgcag atggccgttg tgaccagggc tgcaacactg aggaatgcgg ctgggatggg 360 ctggactgtg ccagcgaggt cccggccctt ttggcccgag gggttctggt cctcacagtt 420 cttctgcctc ctgaagagtt gctgcgctcc agtgccgact ttctgcagcg actcagcgct 480 attctgcgca cctcactgcg cttccgcttg gacgcacgtg gccaggccat ggtcttcccc 540 tatcaccggc caagccctgg ctctgaatcc cgggtccgtc gtgagctggg tcctgaggtg 600 atcggctctg tggtgatgct ggagattgac aaccggctct gtctgcagtc agctgagaat 660 gaccactgct tccctgatgc ccagagtgct gctgactacc tgggagcctt gtcagcagtg 720 gagcgacttg atttcccata cccacttcgg gatgtgcgag gagagccgct ggaggcccca 780 gagcagagcg tgccaggagg gggaagcgga ggcggactga acgacatctt cgaggctcag 840 aaaatcgaat ggcacgaagg tggcccacca catcatcatc atcatcac 888 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Gly Pro Phe Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 6 gaggtgcaac tggtggagtc tggaggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc cctgacactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cactttcagg gactatggaa tgacctggat tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctgacatg ggttgcatat attagtagtg gtagcaatta catctattat 180 gcagaagcgg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga ccagtctgag gtctgaagac actgccttgt atttttgtac aagacgaggc 300 ccgtttgttt tggatgcctg gggtcaagga gcttcagtca ctgtctcctc a 351 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Gly Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asn Thr Trp Pro Asp 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 8 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 8 gacatccaga tgacccagtc tccttcattc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcaactgca aagcaagtca gagtattaac aggtacttac actggtttca gcagaaactt 120 ggagaagctc ccaaactcct gatatataat gcaaacggtt tgcaaacggg catcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactta ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagatgttg ccacatattt ctgcttgcag cataatacgt ggccggacac gtttggcgct 300 gggaccaagc tggaactgaa 320 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 9 Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Val Thr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Glu Ile Arg Tyr Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 10 caggtcaagc tgctgcagtc tggggctgca ctggtgaagc ctggagcctc tgtgaagatg 60 tcttgcaaag cttctggtta tgcattcact gactactggg tgacctgggt gaagcagagt 120 catggaaaga gccttgagtg gattggggaa atttctccta acagtggtgg tactaacttc 180 aatgaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatccaccag cacagcctat 240 atggagctca gcagattgac atctgaggac tctgcaatct attactgtac aagaggggaa 300 atccgttaca attggtttgc ttactggggc caaggcactc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Asn Asn 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 12 aacattgtga tgacccagtc tcccaaatcc atgtccatat cagtaggaga cagggtcacc 60 atgaactgca aggccagtca gaatgtgggt aataatatag cctggtatca acagaaacca 120 gggcagtctc ctaaactgtt gatctactat gcatctaacc ggtacactgg ggtccctgat 180 cgcttcacag gcggtggata tgggacagat ttcactctca ccatcaatag tatgcaagct 240 gaagatgcag ccttttatta ctgtcagcgt ctttacaatt ctccattcac gttcggctca 300 gggacgaagt tggaaataaa g 321 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Pro Phe Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 14 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagg gactatggaa tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcctat attagtagtg gtagcaatta catctattat 180 gcagaagcgg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacgaggc 300 ccgtttgttt tggatgcctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 15 Asp Tyr Gly Met Thr 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 16 Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 17 gactatggaa tgacc 15 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 18 ggattcactt tcagggacta t 21 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 19 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 20 Ser Ser Gly Ser Asn Tyr 1 5 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 21 tatattagta gtggtagcaa ttacatctat tatgcagaag cggtgaaggg c 51 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 22 agtagtggta gcaattac 18 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 23 Arg Gly Pro Phe Val Leu Asp Ala 1 5 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 24 cgaggcccgt ttgttttgga tgcc 24 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Gly Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Trp Pro Asp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 26 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aagcaagtca gagtattaac aggtacttac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaaacggtt tgcaaacggg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtttgcag cataatacgt ggccggacac gtttggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 27 Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr Leu His 1 5 10 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 28 aaagcaagtc agagtattaa caggtactta cac 33 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 29 Asn Ala Asn Gly Leu Gln Thr 1 5 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 30 aatgcaaacg gtttgcaaac g 21 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 31 Leu Gln His Asn Thr Trp Pro Asp Thr 1 5 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 32 ttgcagcata atacgtggcc ggacacgttt 30 <210> 33 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Pro Phe Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 34 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 34 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagg gactatggaa tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcctat attagtagtg gtagcaatta catctattat 180 gcagaagcgg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacgaggc 300 ccgtttgttt tggatgcctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcgtcgacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ccccgggt 1338 <210> 35 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Gly Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Trp Pro Asp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 36 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 36 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aagcaagtca gagtattaac aggtacttac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaaacggtt tgcaaacggg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtttgcag cataatacgt ggccggacac gtttggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acggaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccccct 360 tccgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc tctgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagtccgg caactcccag 480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc taccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtcctctc ctgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 37 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Ile Arg Tyr Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 38 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggtta tgcattcact gactactgga tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgaa atttctccta acagtggtgg tactaacttc 180 aatgaaaagt tcaagggccg attcaccatc tccgttgaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggaa 300 atccgttaca attggtttgc ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 39 Asp Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 40 Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 41 gactactgga tgacc 15 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 42 ggttatgcat tcactgacta c 21 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 43 Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 44 Ser Pro Asn Ser Gly Gly 1 5 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 45 gaaatttctc ctaacagtgg tggtactaac ttcaatgaaa agttcaaggg c 51 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 46 tctcctaaca gtggtggt 18 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 47 Gly Glu Ile Arg Tyr Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 48 ggggaaatcc gttacaattg gtttgcttac 30 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Asn Asn 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 50 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 50 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gaatgtgggt aataatatag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatctaacc ggtacactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcgt ctttacaatt ctccattcac gttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 51 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Asn Asn Ile Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 52 aaggccagtc agaatgtggg taataatata gcc 33 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 53 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 54 tatgcatcta accggtacac t 21 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 55 Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 56 cagcgtcttt acaattctcc attcacgttc 30 <210> 57 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Ile Arg Tyr Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 58 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 58 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggtta tgcattcact gactactgga tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgaa atttctccta acagtggtgg tactaacttc 180 aatgaaaagt tcaagggccg attcaccatc tccgttgaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggaa 300 atccgttaca attggtttgc ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcg 360 tcgaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtcccc gggt 1344 <210> 59 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Asn Asn 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Leu Tyr Asn Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 60 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gaatgtgggt aataatatag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatctaacc ggtacactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcgt ctttacaatt ctccattcac gttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acggaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccccct 360 tccgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc tctgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagtccgg caactcccag 480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc taccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtcctctc ctgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 61 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Pro Phe Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 62 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 62 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagg gactatggaa tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcctat attagtagtg gtagcaatta catctattat 180 gcagaagcgg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacgaggc 300 ccgtttgttt tggatgcctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcgtcgacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctcctgct ccccgggt 1338 <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 63 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Gly Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Trp Pro Asp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 64 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 64 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aagcaagtca gagtattaac aggtacttac actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaaacggtt tgcaaacggg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtttgcag cataatacgt ggccggacac gtttggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagctgcg cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 65 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Glu Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Pro Phe Val Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 66 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 66 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagg gactatggaa tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcctat attagtagtg gtagcaatta catctattat 180 gcagaagcgg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacgaggc 300 ccgtttgttt tggatgcctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcgtcgacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tactgcacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctcctgct ccccgggt 1338 <210> 67 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 68 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 68 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (45)

  1. 서열 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 세포 내로 내재화되거나,
    (b) Notch3 신호전달을 억제하지 않거나, 또는
    (c) Notch3 신호전달을 활성화시키지 않는
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    (a) Notch3 NRR의 LNR-C 및 HD-1 도메인에 결합하거나,
    (b) Notch3 NRR을 자가-억제 입체형태로 유지하지 않거나, 또는
    (c) S2-절단을 억제하지 않는
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. (a) 서열 15 또는 16을 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열 19 또는 20을 포함하는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열 23을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열 27을 포함하는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열 29를 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열 31을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 13과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 서열 25와 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 서열 13의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 서열 25의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 33의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 35의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 서열 37의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. (a) 서열 39 또는 40을 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열 43 또는 44를 포함하는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열 47을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열 51을 포함하는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열 53을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열 55를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, Notch3에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 서열 37과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 서열 49와 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 서열 37의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 서열 49의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 57의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 59의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. Notch3에 결합하기 위해 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하고/거나 그와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합된 세포독성제를 포함하는 항체-약물 접합체.
  19. 하기 화학식의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서,
    (a) Ab는 Notch3에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이고;
    (c) p는 1 내지 약 12의 정수이다.
  20. 하기 화학식의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서,
    (a) Ab는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이고;
    (c) p는 1 내지 약 12의 정수이다.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, L이 vc, mc, me 및 MalPeg6C2로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체.
  22. 제21항에 있어서, D가
    (a) 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드),
    (b) 6780 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드),
    (c) 0131 (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염),
    (d) 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염), 및
    (e) 8261 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체.
  23. 제22항에 있어서, L-D가
    하기 화학식을 갖는 vc0101:
    Figure pct00057

    및 하기 화학식을 갖는 vc6780:
    Figure pct00058

    으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 (a) 서열 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 (a) 서열 15를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 19를 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 23을 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 27을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 29를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (f) 서열 31을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  26. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 (a) 서열 37의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 49의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  27. 제19항 내지 제23항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 (a) 서열 39를 포함하는 중쇄 CDR1; (b) 서열 43을 포함하는 중쇄 CDR2; (c) 서열 47을 포함하는 중쇄 CDR3; (d) 서열 51을 포함하는 경쇄 CDR1; (e) 서열 53을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 (f) 서열 55를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  28. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따르면서, (a) 서열 61로 제시된 바와 같은, 위치 L443에서의 1개의 아미노산 치환, 및 (b) 서열 65로 제시된 바와 같은, 위치 L443 및 K392에서의 2개의 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 조작된 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (Cy) 폴리펩티드를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  29. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 카바트의 EU 인덱스에 따르면서, 서열 63으로 제시된 바와 같은, 위치 κK183에서의 1개의 아미노산 치환을 갖는 조작된 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (CK) 폴리펩티드를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  30. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  31. Notch3 발현과 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 환자에게 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 제30항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 Notch3 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상태가 암인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 암이 고형 종양 암인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 고형 종양 암이 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 두경부암, 방광암, 간암, 피부암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 암이 T-세포 악성종양, T-세포 백혈병, T-세포 림프종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 다발성 골수종, B-세포 악성종양, 골수성 악성종양, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액 암인 방법.
  36. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 항체-약물 접합체 또는 제약 조성물.
  37. 요법을 위한 의약의 제조에서의 제18항 내지 제29항 중 한 항의 항체-약물 접합체의 용도.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, Notch3 발현 암의 치료를 위한 용도.
  39. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  40. 제39항의 핵산을 포함하는 벡터.
  41. 제40항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  42. 제41항의 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체를 제조하는 방법.
  43. (a) L을 D에 연결시키고;
    (b) L-D를 제42항의 배양물로부터 회수한 항체에 접합시키고;
    (c) 항체-약물 접합체를 정제하는 것을
    포함하는, 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체를 제조하는 방법.
  44. 대상체로부터의 생물학적 샘플이 Notch3을 발현하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하는, 암을 앓는 대상체가 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체에 반응할지의 여부를 예측하는 방법.
  45. (a) 암을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    (b) 샘플에서 Notch3의 세포 표면 수준을 결정하는 단계; 및
    (c) Notch3의 세포 표면 수준을 참조 대상체 또는 표준물의 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서 Notch3의 수준을 결정하는 방법.
KR1020157015019A 2012-11-07 2013-11-04 항-notch3 항체 및 항체-약물 접합체 KR20150082548A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261723772P 2012-11-07 2012-11-07
US61/723,772 2012-11-07
US201361889744P 2013-10-11 2013-10-11
US61/889,744 2013-10-11
PCT/IB2013/059893 WO2014072897A1 (en) 2012-11-07 2013-11-04 Anti-notch3 antibodies and antibody-drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150082548A true KR20150082548A (ko) 2015-07-15

Family

ID=49585464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157015019A KR20150082548A (ko) 2012-11-07 2013-11-04 항-notch3 항체 및 항체-약물 접합체

Country Status (19)

Country Link
US (2) US9433687B2 (ko)
EP (1) EP2917240A1 (ko)
JP (2) JP2016505513A (ko)
KR (1) KR20150082548A (ko)
CN (1) CN104903351A (ko)
AR (1) AR093377A1 (ko)
AU (1) AU2013343045A1 (ko)
BR (1) BR112015010436A2 (ko)
CA (1) CA2890571A1 (ko)
HK (1) HK1214282A1 (ko)
IL (1) IL238567A0 (ko)
MX (1) MX2015005810A (ko)
PE (1) PE20150892A1 (ko)
PH (1) PH12015501000A1 (ko)
RU (1) RU2015116480A (ko)
SA (1) SA515360395B1 (ko)
SG (1) SG11201503469WA (ko)
TW (3) TW201726746A (ko)
WO (1) WO2014072897A1 (ko)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9113971B2 (en) 2006-02-27 2015-08-25 Biomet Manufacturing, Llc Femoral acetabular impingement guide
US8608749B2 (en) 2006-02-27 2013-12-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guides and associated instruments
US8092465B2 (en) 2006-06-09 2012-01-10 Biomet Manufacturing Corp. Patient specific knee alignment guide and associated method
US9289253B2 (en) 2006-02-27 2016-03-22 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific shoulder guide
US20150335438A1 (en) 2006-02-27 2015-11-26 Biomet Manufacturing, Llc. Patient-specific augments
US10278711B2 (en) 2006-02-27 2019-05-07 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific femoral guide
US9907659B2 (en) 2007-04-17 2018-03-06 Biomet Manufacturing, Llc Method and apparatus for manufacturing an implant
US8568487B2 (en) 2006-02-27 2013-10-29 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific hip joint devices
US8591516B2 (en) 2006-02-27 2013-11-26 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific orthopedic instruments
US9918740B2 (en) 2006-02-27 2018-03-20 Biomet Manufacturing, Llc Backup surgical instrument system and method
US7967868B2 (en) 2007-04-17 2011-06-28 Biomet Manufacturing Corp. Patient-modified implant and associated method
US9339278B2 (en) 2006-02-27 2016-05-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guides and associated instruments
US8603180B2 (en) 2006-02-27 2013-12-10 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular alignment guides
US8407067B2 (en) 2007-04-17 2013-03-26 Biomet Manufacturing Corp. Method and apparatus for manufacturing an implant
US9345548B2 (en) 2006-02-27 2016-05-24 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific pre-operative planning
US8535387B2 (en) 2006-02-27 2013-09-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific tools and implants
US8377066B2 (en) 2006-02-27 2013-02-19 Biomet Manufacturing Corp. Patient-specific elbow guides and associated methods
US8608748B2 (en) 2006-02-27 2013-12-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient specific guides
US9173661B2 (en) 2006-02-27 2015-11-03 Biomet Manufacturing, Llc Patient specific alignment guide with cutting surface and laser indicator
US9795399B2 (en) 2006-06-09 2017-10-24 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific knee alignment guide and associated method
US7919092B2 (en) * 2006-06-13 2011-04-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to notch receptors
EP2471815B1 (en) * 2006-07-11 2016-03-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Proteins, nucleic acids encoding the same and associated methods of use
GB2442441B (en) * 2006-10-03 2011-11-09 Biomet Uk Ltd Surgical instrument
US8088617B2 (en) 2007-01-24 2012-01-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind the glutamate ligand binding region of Notch1
EP2215126A4 (en) 2007-12-04 2011-03-23 Univ New Jersey Med COMPOSITIONS AND METHOD FOR MODULATING THE CELL MEMBRANE RE-SEALING
SG192467A1 (en) 2008-07-08 2013-08-30 Oncomed Pharm Inc Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
DE102009028503B4 (de) 2009-08-13 2013-11-14 Biomet Manufacturing Corp. Resektionsschablone zur Resektion von Knochen, Verfahren zur Herstellung einer solchen Resektionsschablone und Operationsset zur Durchführung von Kniegelenk-Operationen
US8632547B2 (en) 2010-02-26 2014-01-21 Biomet Sports Medicine, Llc Patient-specific osteotomy devices and methods
US9271744B2 (en) 2010-09-29 2016-03-01 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific guide for partial acetabular socket replacement
WO2012061793A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Trimedicine, Inc. Serum mg53 as a diagnostic marker for tissue injury
US9968376B2 (en) 2010-11-29 2018-05-15 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific orthopedic instruments
US9241745B2 (en) 2011-03-07 2016-01-26 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific femoral version guide
US8715289B2 (en) 2011-04-15 2014-05-06 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific numerically controlled instrument
US8668700B2 (en) 2011-04-29 2014-03-11 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific convertible guides
US8956364B2 (en) 2011-04-29 2015-02-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific partial knee guides and other instruments
US20140286977A1 (en) * 2011-05-11 2014-09-25 Riesbeck Healthcare Sweden Ab Protein F - A Novel Haemophilus Influenzae Adhesin with Laminin and Vitronectin binding Properties
US8532807B2 (en) 2011-06-06 2013-09-10 Biomet Manufacturing, Llc Pre-operative planning and manufacturing method for orthopedic procedure
US9084618B2 (en) 2011-06-13 2015-07-21 Biomet Manufacturing, Llc Drill guides for confirming alignment of patient-specific alignment guides
US8764760B2 (en) 2011-07-01 2014-07-01 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific bone-cutting guidance instruments and methods
US8597365B2 (en) 2011-08-04 2013-12-03 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific pelvic implants for acetabular reconstruction
US9066734B2 (en) 2011-08-31 2015-06-30 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific sacroiliac guides and associated methods
US9295497B2 (en) 2011-08-31 2016-03-29 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific sacroiliac and pedicle guides
US9386993B2 (en) 2011-09-29 2016-07-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific femoroacetabular impingement instruments and methods
US9554910B2 (en) 2011-10-27 2017-01-31 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid guide and implants
KR20130046336A (ko) 2011-10-27 2013-05-07 삼성전자주식회사 디스플레이장치의 멀티뷰 디바이스 및 그 제어방법과, 디스플레이 시스템
ES2635542T3 (es) 2011-10-27 2017-10-04 Biomet Manufacturing, Llc Guías glenoideas específicas para el paciente
US9301812B2 (en) 2011-10-27 2016-04-05 Biomet Manufacturing, Llc Methods for patient-specific shoulder arthroplasty
US9451973B2 (en) 2011-10-27 2016-09-27 Biomet Manufacturing, Llc Patient specific glenoid guide
US9060788B2 (en) 2012-12-11 2015-06-23 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guide for anterior approach
US9204977B2 (en) 2012-12-11 2015-12-08 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guide for anterior approach
PL2935330T3 (pl) 2012-12-19 2019-11-29 Aveo Pharmaceuticals Inc Przeciwciała przeciw notch3
US9839438B2 (en) 2013-03-11 2017-12-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid guide with a reusable guide holder
US9579107B2 (en) 2013-03-12 2017-02-28 Biomet Manufacturing, Llc Multi-point fit for patient specific guide
US9826981B2 (en) 2013-03-13 2017-11-28 Biomet Manufacturing, Llc Tangential fit of patient-specific guides
US9498233B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Biomet Manufacturing, Llc. Universal acetabular guide and associated hardware
US9683039B2 (en) * 2013-03-14 2017-06-20 New York University Notch agonists for the treatment of cancer
EP3611189A1 (en) * 2013-03-14 2020-02-19 Novartis AG Antibodies against notch 3
US9517145B2 (en) 2013-03-15 2016-12-13 Biomet Manufacturing, Llc Guide alignment system and method
US20150112349A1 (en) 2013-10-21 2015-04-23 Biomet Manufacturing, Llc Ligament Guide Registration
US10282488B2 (en) 2014-04-25 2019-05-07 Biomet Manufacturing, Llc HTO guide with optional guided ACL/PCL tunnels
US9408616B2 (en) 2014-05-12 2016-08-09 Biomet Manufacturing, Llc Humeral cut guide
RU2747989C2 (ru) * 2014-05-28 2021-05-18 Эдженсис, Инк. Производные пептидов долапроин-долаизолейина
US9839436B2 (en) 2014-06-03 2017-12-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid depth control
US9561040B2 (en) 2014-06-03 2017-02-07 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid depth control
IL283834B (en) 2014-09-28 2022-07-01 Univ California Modulation of stimulatory and non-stimulatory myeloid cells
US9826994B2 (en) 2014-09-29 2017-11-28 Biomet Manufacturing, Llc Adjustable glenoid pin insertion guide
US9833245B2 (en) 2014-09-29 2017-12-05 Biomet Sports Medicine, Llc Tibial tubercule osteotomy
US9820868B2 (en) 2015-03-30 2017-11-21 Biomet Manufacturing, Llc Method and apparatus for a pin apparatus
US10568647B2 (en) 2015-06-25 2020-02-25 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific humeral guide designs
US10226262B2 (en) 2015-06-25 2019-03-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific humeral guide designs
WO2017190025A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-notch3 antibody
CN105968038A (zh) * 2016-05-09 2016-09-28 湖北华世通生物医药科技有限公司 二肽类化合物的盐酸盐及其制备方法
US10722310B2 (en) 2017-03-13 2020-07-28 Zimmer Biomet CMF and Thoracic, LLC Virtual surgery planning system and method
US10858443B2 (en) 2017-05-31 2020-12-08 Trustees Of Boston University Synthetic notch protein for modulating gene expression
MX2020006213A (es) 2017-12-12 2020-09-14 Pionyr Immunotherapeutics Inc Anticuerpos anti-trem2 y metodos relacionados.
CN108753833B (zh) * 2018-05-28 2021-12-03 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法
JP7468903B2 (ja) 2018-06-17 2024-04-16 エルアンドエル バイオファーマ カンパニー リミテッド Ｃｌｄｎ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、ａｄｃ及びｃａｒならびにその使用

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US20040049014A1 (en) 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US5767237A (en) 1993-10-01 1998-06-16 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Peptide derivatives
US5616462A (en) 1994-02-28 1997-04-01 L'Assistance Publique--Hospitaux de Paris Method for the diagnosis of CADASIL
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
CN1113066C (zh) 1995-04-21 2003-07-02 帝国脏器制药株式会社 新型肽衍生物
EP0780478A1 (en) 1995-12-21 1997-06-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for the indirect genotypic diagnosis of cadasil
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
FR2751986B1 (fr) 1996-08-01 1998-12-31 Inst Nat Sante Rech Med Gene implique dans le cadasil, methode de diagnostic et application therapeutique
US5985837A (en) 1998-07-08 1999-11-16 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
CA2343963A1 (en) 1998-10-02 2000-04-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Apotosis inducing agents and methods
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2003020934A1 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to colon specific genes and proteins
US20050137130A1 (en) 2001-11-14 2005-06-23 Bodmer Mark W. Medical treatment
EP1446424A2 (en) 2001-11-14 2004-08-18 Lorantis Limited Composition comprising inhibitors of the notch signalling pathway for the modulation of the immune system
WO2003042246A2 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
JP2005530856A (ja) 2002-06-21 2005-10-13 ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン 膜関連腫瘍内皮マーカー
US20070224201A1 (en) 2002-10-02 2007-09-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2006515747A (ja) 2002-11-01 2006-06-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
ZA200603619B (en) 2003-11-06 2008-10-29 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
AU2004294563B2 (en) 2003-11-26 2009-03-26 Health Research, Inc. Use of notch pathway interfering agents for treatment of plasma cell disorders
US20070077245A1 (en) 2004-08-04 2007-04-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. NOTCH mutations leading to increased receptor signaling
WO2006053063A2 (en) 2004-11-05 2006-05-18 The Regents Of The University Of California Notch-1 assay to detect neurodegenerative diseases
KR101373140B1 (ko) 2005-03-03 2014-03-12 씨오브이엑스 테크놀로지스 아일랜드 리미티드 항-혈관형성 화합물
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
US20090305310A1 (en) 2005-11-22 2009-12-10 University Of Vermont And State Agricultural College Methods for Determining Notch Signaling and Uses Thereof
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
US8133857B2 (en) 2006-03-07 2012-03-13 The Brigham and Women's FHospital, Inc. NOTCH inhibition in the treatment of atherosclerosis
US20080241150A1 (en) * 2006-05-15 2008-10-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human NOTCH1 and 2 and isolated LNR domains from human NOTCH1
WO2008051797A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Genentech, Inc. Anti-notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of notch3-related diseases
WO2008136848A2 (en) 2006-10-19 2008-11-13 Genentech Inc. Novel anti-notch3 antibodies and their use in the detection and diagnosis of disease
RS53942B1 (en) 2006-10-27 2015-08-31 Genentech Inc. Antibodies and Immunoconjugates and Their Use
WO2008076960A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Genentech, Inc. Antagonist anti-notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of notch3-related diseases
US7807630B2 (en) 2007-09-14 2010-10-05 Vanderbilt University Targeting of Notch3 receptor function for cancer therapy
US8263083B2 (en) 2007-10-12 2012-09-11 Seattle Genetics, Inc. Combination therapy with antibody-drug conjugates
CA2718942A1 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
AU2009235467A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Single variable domains against the Notch pathways
SG192467A1 (en) * 2008-07-08 2013-08-30 Oncomed Pharm Inc Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
WO2010141249A2 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-notch3 antibodies
PE20121494A1 (es) 2009-06-18 2012-11-01 Pfizer Anticuerpos anti notch-1
ES2580229T3 (es) * 2009-09-30 2016-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos antagonistas anti-Notch3 para el tratamiento de una leucemia de linfocitos T positiva a un inhibidor de la gamma-secretasa que no responde a un anticuerpo antagonista anti-Notch1
WO2011140295A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 President And Fellows Of Harvard College Modulators of notch receptor signaling and methods of use thereof
CA2804185C (en) 2010-07-12 2017-03-21 Covx Technologies Ireland Limited Multifunctional antibody conjugates
WO2012058137A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof
CA2930801C (en) 2010-11-05 2019-05-28 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
WO2012064697A2 (en) 2010-11-08 2012-05-18 President And Fellows Of Harvard College Materials presenting notch signaling molecules to control cell behavior
AU2011342799B2 (en) 2010-12-15 2016-06-09 Wyeth Llc Anti-Notch1 antibodies
WO2012080891A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Rinat Neuroscience Corp. Anti-notch-1 antibodies
US9358272B2 (en) 2011-02-17 2016-06-07 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Multicomponent compositions and their uses
PE20140573A1 (es) * 2011-04-01 2014-05-14 Wyeth Llc Conjugados de anticuerpo-farmaco
ES2657014T3 (es) 2011-11-17 2018-03-01 Pfizer Inc. Péptidos citotóxicos y conjugados de fármaco anticuerpo de los mismos
EP3539982A3 (en) 2011-12-23 2020-01-15 Pfizer Inc Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
TW201604207A (zh) 2016-02-01
SA515360395B1 (ar) 2017-06-07
HK1214282A1 (zh) 2016-07-22
MX2015005810A (es) 2015-09-23
CN104903351A (zh) 2015-09-09
TW201431880A (zh) 2014-08-16
JP2017186337A (ja) 2017-10-12
BR112015010436A2 (pt) 2017-08-22
JP2016505513A (ja) 2016-02-25
PE20150892A1 (es) 2015-06-11
SG11201503469WA (en) 2015-06-29
CA2890571A1 (en) 2014-05-15
EP2917240A1 (en) 2015-09-16
US9433687B2 (en) 2016-09-06
AU2013343045A1 (en) 2015-05-21
AR093377A1 (es) 2015-06-03
PH12015501000A1 (en) 2015-07-27
IL238567A0 (en) 2015-06-30
TW201726746A (zh) 2017-08-01
US20140127211A1 (en) 2014-05-08
US20170014526A1 (en) 2017-01-19
WO2014072897A1 (en) 2014-05-15
TWI589590B (zh) 2017-07-01
RU2015116480A (ru) 2016-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150082548A (ko) 항-notch3 항체 및 항체-약물 접합체
CN109219618B (zh) 针对表皮生长因子受体变体iii和cd3的单特异性和双特异性抗体及其用途
KR101585990B1 (ko) 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체
DK2311877T3 (en) Monoclonal antibodies to claudin-18 for treating cancer
CN106659801B (zh) 抗-ptk7抗体-药物缀合物
KR101733853B1 (ko) 세포독성 펩티드 및 그의 항체 약물 접합체
US11939386B2 (en) AXL-targeting antibody, antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof
KR20130036993A (ko) ｃ-Ｍｅｔ의 ＳＥＭＡ 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체
KR20130036992A (ko) 항 ｃ-Ｍｅｔ 인간화 항체 및 그의 용도
AU2016202322B2 (en) Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
KR101995921B1 (ko) c-Met의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)