CN104903351A - 抗-notch3抗体及抗体-药物缀合物 - Google Patents

抗-notch3抗体及抗体-药物缀合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104903351A
CN104903351A CN201380069303.2A CN201380069303A CN104903351A CN 104903351 A CN104903351 A CN 104903351A CN 201380069303 A CN201380069303 A CN 201380069303A CN 104903351 A CN104903351 A CN 104903351A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
notch3
seq
cell
fab
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380069303.2A
Other languages
English (en)
Inventor
K·G·盖莱斯
Y·高
P·萨普拉
L·G·奇思蒂亚科娃
B-B·S·周
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Publication of CN104903351A publication Critical patent/CN104903351A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供抗-Notch3抗体、抗-Notch3抗体-药物缀合物及其制备和使用方法。

Description

抗-NOTCH3抗体及抗体-药物缀合物
相关申请
本申请要求2012年11月7日申请的美国临时申请第61/723,772号和2013年10月11日申请的美国临时申请第61/889,744号的权益，其通过引用将其全文并入本文。
序列表
本申请经EFS-Web电子提交，并且包括电子提交的.txt格式的序列表。.txt文件含有2013年10月11日产生的名为"PC071980A_Sequence_Listing.txt"的序列表，大小为61KB。.txt文件中包含的序列表是说明书一部分并且通过引用将其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及抗-Notch3抗体及抗-Notch3抗体-药物缀合物。本发明进一步涉及使用这种抗体和抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。
背景技术
Notch信号传导是由细胞外受体与配体相互作用而触发的。通过配体诱导的蛋白酶解触发的信号传导级联，Notch受体在多细胞生物体中控制正常细胞增殖、分化和死亡。在位点S1的弗林蛋白酶样蛋白酶裂解之后，成熟Notch异二聚体转移进细胞膜中，在此其通过膜旁负调节区(NRR)而保持自身抑制状态，所述NRR由三个Lin12/Notch重复(LNR-A、B、C)和异二聚化(HD)结构域组成。HD结构域在位点S1裂解后分为N-末端(HD1)半和C-末端(HD2)半。通过一种未确定的机制，Delta/Serrate/Lag-2(DSL)家族的配体与胞外EGF-重复区的结合解除这种抑制并诱导两个另外的裂解事件。首先，ADAM-型金属蛋白酶介导在HD-2结构域的C-末端区域附近的位点S2的裂解，从而从细胞表面释放胞外结构域(ECD)，其随后经历反式胞吞进入表达配体的细胞中。接着，γ-分泌酶介导在跨膜结构域内的位点S3的裂解，其从细胞膜释放Notch的胞内结构域(Notch-ICD)，允许其转移至核并激活靶基因的转录(Bray,S.,Nature Reviews Molecular Cell Biology,2006,volume7,678-689)。
自身抑制性构象的人Notch2-NRR结构域的X-射线晶体结构显示在包埋金属蛋白酶S2位点的NRR内LNR重复与异二聚化结构域之间的广泛相互作用，提示实质的构象运动是在被配体激活期间暴露该位点所必需的(Gordon,W.R.,et.al,Nature Structural&Molecular Biology,2007,volume 14,295-300)。研究提示NRR内的所述相互作用的稳定化可阻止配体诱导的Notch激活。关于Notch自身抑制性构象的结构信息的可利用性提供了开发靶向Notch信号传导的疗法，特别是抗体的新机会(Li,K.,et.al,Journal ofBiological Chemistry,2008,volume 283,8046-8054；Aste-Amezaga,M,et.al,PLOS ONE,2010,volume 5,e9094；Wu,Y.,et.al,Nature,2010,volume 464,1052-1057)。
在哺乳动物细胞中，有四种已知的Notch受体。Notch-1、-2、-3和-4在胚胎和成体组织中具有广泛的重叠表达模式，及在造血干细胞特化、T细胞发育、肠道隐窝细胞(crypt cell)特化及血管发育期间实现非冗余作用。Notch3主要在血管平滑肌细胞(vSMC)、各种胸腺细胞亚群及发育中的神经系统中表达。与其受限的组织分布一致，鼠Notch3的靶向删除不导致如Notch1和Notch2删除的胚胎性致死性。反而，Notch3-失效小鼠是可存活的，但是在vSMC的成熟和分化中有缺陷(Domenga,V.,et.al,Genes andDevelopment,2004,volume 18,2730-2735)。
Notch激活在许多情况中是致癌的；所有四种Notch同系物的组成型活性胞内形式在体外和在转基因小鼠模型中起致癌基因的作用。近来的研究表明Notch3在各种人实体瘤中通常是扩增及过表达的，以及在人体癌症中发育信号途径如Notch3的过表达暗示其是肿瘤发生的关键介导物。正在开发一些阻断Notch信号传导的策略以治疗癌症；然而本领域仍需要更有效和有效的抗-Notch靶向治疗方法以治疗癌症。
抗体-药物缀合物(ADC)组合了高亲和性抗体的特异性和靶向性及治疗剂如细胞毒性剂、生物应答修饰剂、酶、细胞凋亡诱导剂和放射性同位素的细胞毒性。治疗剂从抗体释放可需要抗体-药物缀合物至溶酶体的运输和定位以及Notch3-ECD和Notch3-ICD均经历溶酶体降解，因此结合Notch3的抗体预期运输至溶酶体(Jia L,et.al,International Journal of Biochemistryand Cell Biology,2009,volume 41,2594-2598)。本发明提供新的抗-Notch3抗体及抗体-药物缀合物，其满足了在治疗癌症中诊断和治疗性应用中的未满足的临床需求。
发明概述
本发明提供抗-Notch3抗体及抗体-药物缀合物(ADC)。本发明还提供使用这种抗-Notch3抗体和抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。
在一个实施方案中，本发明提供结合Notch3的分离的抗体或者其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:13的CDR1、CDR2和CDR3，及具有SEQ IDNO:25的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段：(a)内在化到细胞中，(b)不抑制Notch3信号传导，或者(c)不激活Notch3信号传导。在进一步的实施方案中，本发明提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段：(a)结合Notch3NRR的LNR-C和HD-1结构域，(b)不将Notch3NRR保持于自身抑制性构象，或者(c)不抑制S2-裂解。
在进一步的实施方案中，本发明提供了结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有：(a)包含SEQ ID NO:15或16的重链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:19或20的重链CDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的重链CDR3；(d)包含SEQ ID NO:27的轻链CDR1；(e)包含SEQ ID NO:29的轻链CDR2；及(f)包含SEQ ID NO:31的轻链CDR3。
本发明还提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO:13具有至少90％相同性的重链可变区氨基酸序列或者与SEQID NO:25具有至少90％相同性的轻链可变区氨基酸序列。
本发明还提供结合Notch3的分离的抗体或抗原结合片段，其具有SEQID NO:13的重链可变区氨基酸序列，及结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:25的轻链可变区氨基酸序列。本发明还提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:33的重链氨基酸序列，及结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQID NO:35的轻链氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:37的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区及具有SEQ ID NO:49的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在进一步的实施方案中，本发明提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有：(a)包含SEQ ID NO:39或40的重链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43或44的重链CDR2；(c)包含SEQ ID NO:47的重链CDR3；(d)包含SEQ ID NO:51的轻链CDR1；(e)包含SEQ ID NO:53的轻链CDR2；及(f)包含SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
本发明还提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO:37具有至少90％相同性的重链可变区氨基酸序列或者与SEQID NO:49具有至少90％相同性的轻链可变区氨基酸序列。
本发明还提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:37的重链可变区氨基酸序列，及结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:49的轻链可变区氨基酸序列。本发明还提供结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列，及结合Notch3的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:59的轻链氨基酸序列。
本发明进一步提供分离的抗体，其与本发明的抗体或其抗原结合片段竞争特异性结合Notch3。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其具有与本发明的任何抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性剂。
在另一个实施方案中，本发明提供式Ab-(L-D)p的抗体-药物缀合物，或者其药物可接受的盐；Ab是结合Notch3的抗体或其抗原结合片段；L-D是接头-药物部分，其中L是接头，D是药物；p是从1至大约12的整数。
在进一步的实施方案中，本发明提供式Ab-(L-D)p的抗体-药物缀合物，或者其药物可接受的盐；Ab是本发明的任何抗体或其抗原结合片段；L-D是接头-药物部分，其中L接头，D是药物；p是从1至大约12的整数。
在另一个实施方案中，本发明提供抗体-药物缀合物，其中L选自vc、mc、me和MalPeg6C2。
在另一个实施方案中，本发明提供抗体-药物缀合物，其中D选自：(a)0101(2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)，(b)6780(2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙基-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)，(c)0131(2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐)，(d)3377(N,2-二甲基丙氨酰-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐)，及(e)8261(2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。
本发明进一步涉及提供抗体-药物缀合物，其中L-D选自：
具有下式的vc0101：
及下式的vc6780：
在另一个实施方案中，本发明提供抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)具有SEQ ID NO:13的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；及(b)具有SEQ ID NO:25的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其中Ab包含(a)包含SEQ IDNO:15的重链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:19的重链CDR2；(c)包含SEQID NO:23的重链CDR3；(d)包含SEQ ID NO:27的轻链CDR1；(e)包含SEQ ID NO:29的轻链CDR2；及(f)包含SEQ ID NO:31的轻链CDR3。
在另一个实施方案中，本发明提供抗体-药物缀合物，其中Ab包含(a)包含SEQ ID NO:37的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；(b)包含SEQID NO:49的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其中Ab包含(a)包含SEQ IDNO:39的重链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的重链CDR2；(c)包含SEQID NO:47的重链CDR3；(d)包含SEQ ID NO:51的轻链CDR1；(e)包含SEQ ID NO:53的轻链CDR2；及(f)包含SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其中Ab包含工程化的人IgG1重链恒定结构域(Cy)多肽，选自：(a)在如SEQ ID NO:61所示的位置L443具有一个氨基酸取代，及(b)在如SEQ ID NO:65所示的位置L443和K392具有两个氨基酸取代，根据Kabat的EU索引。
本发明进一步提供抗体-药物缀合物，其中Ab包含工程化的人κ轻链恒定结构域(CK)多肽，在如SEQ ID NO:63所示的位置K183具有一个氨基酸取代，根据Kabat的EU索引。
本发明进一步提供药物组合物，其具有本发明的任何抗体或其抗原结合片段，或者本发明的任何抗体-药物缀合物，及药物可接受的运载体。
此外，本发明提供一种治疗有需要的患者中与Notch3表达相关的病症的方法，包括给患者施用本发明的任何抗体-药物缀合物或者药物组合物。本发明还提供一种治疗癌症的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。进一步地，本发明提供治疗实体瘤癌症的方法，包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌和肉瘤。本发明还提供治疗癌症的方法，其中癌症是血液系统癌症，包括但不限于T-细胞恶性肿瘤、T-细胞白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、B-细胞恶性肿瘤、髓系恶性肿瘤、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病。
本发明提供用于治疗中的应用的本发明的任何抗体-药物缀合物或药物组合。本发明进一步提供在治疗中的应用，其中所述癌症是实体瘤癌症。本发明还提供在治疗中的应用，其中所述实体瘤癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌和肉瘤。本发明还提供在治疗中的应用，其中癌症是血液系统癌症，包括但不限于T-细胞恶性肿瘤、T-细胞白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、B-细胞恶性肿瘤、髓系恶性肿瘤、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病。本发明进一步提供本发明的任何抗体-药物缀合物在生产用于治疗的药物中的应用。本发明进一步提供本发明的抗体-药物缀合物的应用，其中所述应用是治疗表达Notch3的癌症。
本发明进一步提供编码本发明的Notch3抗体或其抗原结合片段的核酸，包含所述核酸的载体，及包含所述载体的宿主细胞。本发明还提供一种产生本发明的Notch3抗体的方法，其中所述方法包括培养包含上述载体的宿主细胞及从细胞培养物回收抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种产生本发明的抗体-药物缀合物的方法，包括：连接L与D；将L-D与回收自本发明培养物的抗体缀合；及纯化所述抗体-药物缀合物。
本发明进一步提供具有特异性结合Notch3的本发明的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物。
在进一步的实施方案中，本发明提供通过确定来自对象的生物学样品是否表达Notch3而预测患有癌症的对象是否应答本发明的任何抗体-药物缀合物的方法。
本发明进一步提供一种确定生物学样品中Notch3水平的方法，包括如下步骤：将来自疑似患有癌症的对象的样品与本发明的任何抗体或其抗原结合片段接触；确定样品上Notch3的细胞表面水平；及将Notch3的细胞表面水平与参考对象或标准水平进行对比。
附图说明
图1显示具有Avi和His标签的重组S1裂解的异源二聚体Notch3NRR蛋白质免疫原的示意图。
图2显示纯化的人和小鼠Notch3NRR重组蛋白质的氨基酸和核苷酸序列。
图3显示r28和r75抗体可变区(以下划线标出CDR)的氨基酸和核苷酸序列。
图4A-4C显示hu28VH 1.0和CDR(Kabat和Chothia)的氨基酸和核苷酸序列[A]，hu28VL 1.0和CDR(Kabat和Chothia)的氨基酸和核苷酸序列[B]及hu28HC 1.0和LC 1.0的氨基酸和核苷酸序列[C]。
图5A-5C显示hu75VH 1.9和CDR(Kabat和Chothia)的氨基酸和核苷酸序列[A]，hu75VL 1.3和CDR(Kabat和Chothia)的氨基酸和核苷酸序列[B]及hu75HC 1.9和LC 1.3的氨基酸和核苷酸序列[C]。
图6显示重组人Notch1NRR和Notch3NRR结构域交换嵌合构建体以进行抗-Notch3抗体ch28和ch75的表位作图。
图7显示使用D11B8抗体对Notch3阳性和阴性细胞系的Western印迹分析。
图8A-8E显示[A]在MDA-MB-468乳腺癌细胞中在0小时的抗-Notch3抗体hu75-Alexa 488的细胞膜定位及用pHrodoTM red葡聚糖的酸性囊泡标记，[B]在MDA-MB-468乳腺癌细胞中在5小时的抗-Notch3抗体hu75-Alexa 488的细胞内运输及与pHrodoTM red葡聚糖的共定位(箭头所示)，[C]在MDA-MB-468乳腺癌细胞中在0小时的抗-Notch3抗体hu28-DyLight650的细胞膜定位及pHrodoTM red葡聚糖的酸性囊泡标记(细胞内色斑)，[D]在MDA-MB-468乳腺癌细胞中在8小时的抗-Notch3抗体hu28-DyLight650的细胞内运输及与pHrodoTM red葡聚糖的共定位(箭头所示)，以及[E]表明MDA-MB-468细胞中随着时间的hu28-DyLight650和pHrodoTM red葡聚糖荧光标记重叠或共定位程度的皮尔逊相关系数。
图9显示S2-裂解测定的Western印迹分析，使用以抗-Notch3hu28和hu75处理的HCC2429和MDA-MB-468细胞。M.W.＝分子量。
图10显示用抗-Notch3hu28-vc0101处理OVCAR3卵巢癌细胞破坏有丝分裂细胞中的微管(用抗-α微管蛋白抗体染色)，所述有丝分裂细胞通过磷酸化-组蛋白H3染色鉴定。
图11显示从2-3只小鼠(M)收获的异种移植物的Notch3-ECD的Western印迹分析。
图12显示抗-Notch3hu28-vc0101和hu75-vc0101在3mg/kg剂量与5mg/kg剂量的顺铂相比在源于37622A1NSCLC患者的异种移植模型中的效力。
图13A和13B显示[A]抗-Notch3hu28-vc0101在MDA-MB-468乳腺模型中的效力，及[B]抗-Notch3hu75-vc0101在MDA-MB-468乳腺模型中的效力。
图14A和14B显示[A]抗-Notch3hu28-vc6780在MDA-MB-468乳腺模型中的效力，及[B]抗-Notch3hu75-vc6780在MDA-MB-468乳腺模型中的效力。
图15显示抗-Notch3hu28-vc0101在OVCAR3卵巢模型中的效力。
图16A-16E显示[A]剂量为5mg/kg的大鼠-人嵌合抗-Notch3抗体-药物缀合物在HCC2429肺异种移植物中的效力；[B和C]剂量为5mg/kg的大鼠-人嵌合抗-Notch3抗体-药物缀合物在MDA-MB-468乳腺异种移植物中的效力；[D和E]剂量为5mg/kg的大鼠-人嵌合抗-Notch3抗体-药物缀合物在N87胃异种移植物中的效力。
图17A和17B显示[A]单一半胱氨酸突变体hu28HC 1.0L443C和hu28LC 1.0κK183C的氨基酸和核苷酸序列，及[B]双半胱氨酸突变体hu28HC1.0L443C/K392C的氨基酸和核苷酸序列。
发明详述
本发明提供用以治疗癌症的抗-Notch3抗体或其抗原结合片段，及抗体-药物缀合物(ADC)。为了更好地理解本发明，首先定义一些术语和通用技术。
本文中使用的所有氨基酸缩写均是由美国专利商标局认可的那些缩写，如37C.F.R.§1.822(d)(1)所示。
除非特别定义，本发明中使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非文中特别需要，单数术语应包括复数术语，及复数术语应包括单数术语。通常地，本发明中使用的命名及本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学以及杂交方面的技术均是本领域技术人员熟知且常用的。
除非特别指出，本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，如在本说明书中列举和论述的各种一般和更特定的参考文献所述。见例如Sambrook J.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan et al.,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)所述。
“Notch3”或“Notch-3”是指人Notch3蛋白质的天然的、变体、同种型(isoform)和物种同系物。例如，天然人Notch3蛋白质是由前导肽、大表皮生长因子(EGF)-样重复区、三个Lin12重复、N末端异二聚化结构域(HD-1)、C末端异二聚化结构域(HD-2)、跨膜(TM)序列及胞内结构域(Notch3ICD)组成。全长人Notch3的NCBI/GenBank编号为NM_000435.2。
如本文使用，除非特别指出，“Notch3负调节区”或者“Notch3NRR”是指Notch3的任何天然或合成的多肽区，其由三个Lin12结构域和位于三个Lin12结构域之间的氨基酸序列加上Notch3的HD1和HD2组成。在一个实施方案中，“Notch3NRR”包括三个Lin12结构域和两个异二聚化结构域HD-1和HD-2，其中Notch3的HD-1与HD-2结构域共价结合及尚未被弗林蛋白酶样蛋白酶裂解(在S1裂解之前)。在另一个实施方案中，“Notch3NRR”包括三个Lin12结构域和两个异二聚化结构域HD-1和HD-2，其中HD-1和HD-2结构域是非共价结合的(在S1裂解之后)。在这个实施方案的一个方面，HD-2结构域内的S2位点尚未被ADAM-型金属蛋白酶裂解。在这个实施方案的另一特定方面，HD-2结构域内的S2位点正在被ADAM-型金属蛋白酶裂解或者已经被其裂解(Gordon,W.R.,et.al,Nature Structural&Molecular Biology,2007,volume 14,295-300)。
“抗体”或“Ab”是免疫球蛋白分子，能通过位于免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合靶如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包含保留特异性结合指定抗原(例如靶Notch3)的其任何抗原结合部分(例如抗原结合片段)或其单链，包含抗体的融合蛋白，及免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构象，其包含抗原识别位点，例如但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、单一结构域抗体(dAb)片段、分离的互补决定区(CDR)、单链(scFv)和单一结构域抗体(例如鲨鱼和骆驼抗体)、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体(intrabodies)、双体(diabodies)、三体(triabodies)、四体(tetrabodies)、v-NAR和双scFv(见例如Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology 23(9):1126-1136)。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或者其亚类)，及不需要是任何特定类别的抗体。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可指定为不同类别。免疫球蛋白有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为亚类(同种型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应于不同类别免疫球蛋白的重链(HC)恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型为本领域熟知。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合Notch3的分离的抗体基本上不含特异性结合除了Notch3之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合Notch3的分离的抗体可具有与其它抗原如来自其它物种的Notch3分子的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化合物。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链(VL)的可变区或抗体重链(VH)的可变区。如本领域所已知，重链和轻链的可变区均由通过也称作超变区的三个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)连接的四个框架区(FR)组成，有助于抗体的抗原结合位点的形成。如果想要对象可变区的变体，特别是具有CDR区外部的氨基酸残基取代(即在框架区中)，可以通过对比对象可变区与和所述对象可变区相同主类(canonical class)的含有CDR1和CDR2序列的其它抗体的可变区而鉴定适当的氨基酸取代，优选保守性氨基酸取代(Chothia and Lesk,J Mol Biol 196(4):901-917,1987)。当选择在对象CDR侧面的FR时，例如当人源化或优化抗体时，优选来自相同主类的含有CDR1和CDR2序列的抗体的FR。
可变结构域的“CDR”是可变区内的氨基酸残基，其根据以下定义鉴定：Kabat、Chothia、Kabat和Chothia的积累、AbM、接触和/或构象定义或者本领域熟知的任何CDR确定方法。抗体CDR可以通过最初由Kabat等定义的超变区鉴定。见例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C。CDR的位置也可以鉴定为结构性环形结构，最初由Chothia等描述。见例如Chothia et al.,1989,Nature 342:877-883。鉴定CDR的其它方法包括“AbM定义”，这是介于Kabat与Chothia之间的折中方案，使用Oxford Molecular'sAbM抗体建模软件(现在为)而获得，或者如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745所述基于观测的抗原接触的CDR“接触定义”。在另一方法中，本文提及CDR的“构象定义”时，CDR位置可以鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基。见例如Makabe et al.,2008,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166。再其它的CDR边界定义可不严格采用上述方法之一，但是与Kabat CDR的至少部分重叠，尽管其根据预测或实验性发现特定残基或残基组或者甚至全部CDR不显著影响抗原结合而可以缩短或延长。如本文所用，CDR可以是指通过本领域已知的任何方法包括组合方法定义的CDR。本发明使用的方法可利用根据任何这些方法定义的CDR。对于含有一个以上CDR的任何指定的实施方案，CDR可以根据任何Kabat、Chothia、扩展的AbM、接触和/或构象定义进行定义。
本文可互换使用的术语“IgG Fc区”、“Fc区”、“Fc结构域”和“Fc”是指IgG分子的一部分，其与通过木瓜蛋白酶消化IgG分子获得的可结晶片段相关联。Fc区由通过二硫键连接的IgG分子的两个重链的C-末端半部分组成。其不具有抗原结合活性，但是含有碳水化合物部分及补体和Fc受体包括FcRn受体(见下文)的结合位点。Fc片段含有完整的第二恒定结构域CH2(人IgG1的残基231-340，根据Kabat编号系统)及第三恒定结构域CH3(残基341-447)。
本文可互换使用的术语“工程化的Fc多肽”、“工程化的Fc区”和“工程化的Fc”是指包含至少一个突变(例如氨基酸取代)的Fc多肽或其部分，导入位点以进行缀合。优选地，所述突变导入半胱氨酸代替在这该位置的天然存在的氨基酸残基，其中突变产生反应性位点(例如反应性巯基基团)以将一部分与Fc缀合。
术语“单克隆抗体”或者“mAb”是指源自单一拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，不是产生其的方法。优选地，本发明的单克隆抗体存在于同质或者基本同质的群体中。
“人源化”抗体是指非人(例如大鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
“人抗体或者完全人抗体”是指源自携带人抗体基因的转基因小鼠或者源自人细胞的那些抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自大鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“治疗剂”是对癌细胞或者激活的免疫细胞发挥细胞毒性、抑制细胞生长和/或免疫调节作用的药物。举例的治疗剂包括细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞生长抑制剂和免疫调节剂。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的一种化学化合物。
“细胞毒性作用”是指消耗、消除和/或杀死靶细胞。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性和/或抑制细胞生长作用的药物。
“抑制细胞生长作用”是指抑制细胞增殖。“细胞生长抑制剂”是指对细胞具有细胞抑制作用，从而抑制特定细胞亚类的生长和/或扩展的药物。
“抗体-药物缀合物”或者“ADC”涉及与Notch3结合并与细胞毒性、抑制细胞生长和/或治疗剂缀合的抗体或其抗体片段，包括抗体衍生物。
“抗-Notch3抗体-药物缀合物”或者“抗-Notch3ADC”是指如本文所述通过接头(L)与药物(D)连接的抗-Notch3抗体或其抗原结合片段。
“接头(L)”描述了抗体与药物的直接或间接连接。接头与抗体的附着可以各种方式实现，如通过表面赖氨酸与氧化性碳水化合物的还原性结合，及通过还原链间二硫键释放的半胱氨酸残基进行。本领域已知多种抗体-药物缀合物连接系统，包括基于腙、二硫键和肽键的连接。
“药物(D)”是具有生物学或可检测活性的任何物质，例如治疗剂、可检测标记、结合剂等，以及前体药物，其在体内被代谢为活性剂。术语药物、有效荷载(payload)和化合物在本文可互换使用。
“L-D”是得自药物(D)与接头(L)连接的接头-药物组分。
术语“表位”是指在一或多个抗体的抗原结合区能由抗体识别并结合的分子的一部分。表位通常由分子的化学活性表面基团组成如氨基酸或糖侧链，并具有特定的三维结构以及特定的电荷特性。如本文所用，术语“抗原性表位”被定义为抗体可特异性结合的多肽的部分，通过本领域熟知的任何方法确定，例如通过常规免疫测定确定。“非线性表位”或者“构象表位”包含特异于表位的抗体结合的抗原性蛋白质内不连续的多肽(或氨基酸)。一旦确定了抗原上的希望的表位，可以产生该表位的抗体，例如使用本发明描述的技术产生。在发现的过程中，抗体的产生和鉴定可解释关于希望的表位的信息。根据这种信息，可以竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现这个目的的方法是进行竞争性和交叉竞争性研究，以发现彼此竞争或交叉竞争的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。
如本文所用，术语“结合亲和性(KD)”是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。KD是解离速率(也称作“off-rate(kd)”)与结合速率(或者“on-rate(ka)”)的比率。因此KD等于kd/ka，以摩尔浓度(M)表示。由此得出结论，KD越小结合亲和性较强。因此，1μM的KD表示与1nM的KD相比较弱的结合亲和性。抗体的KD值可以使用本领域确立的方法确定。一种确定抗体KD的方法是使用表面等离子体共振，通常使用生物传感器系统如系统。
“优先结合”或者“特异性结合”(在本文可互换使用)靶(例如Notch3蛋白质)的抗体、抗体缀合物或者多肽是本领域充分了解的术语，确定这种特异性或优先结合的方法也为本领域熟知。如果一种分子与一种特定细胞或物质比其与另外的细胞或物质以更频繁、更快速地更长持续时间和/或更高亲和性地反应或结合，则称该分子呈现出“特异性结合”或者“优先结合”。如果抗体与其结合其它物质相比较高的亲和性、亲合力、更容易地和/或更长持续时间地结合靶，则该抗体“特异性结合”或者“优先结合”靶。例如，特异性或优先结合Notch3表位的抗体是这样的抗体，其结合这个表位较其结合其它Notch3表位或非Notch3表位具有更高的亲和性、亲合力、更容易和/或更长的持续时间。通过阅读这个定义应理解，例如特异性或优先结合第一个靶的抗体(或者组分或表位)可以或者不可以特异性或优先结合第二个靶。正如此，“特异性结合”或者“优先结合”不必要地要求(尽管其可包括)排他性结合。通常地，但非必需地，提及结合时是指优先结合。“EC50”是结合能力的度量，定义为抗体或抗体-药物缀合物的半数最大有效浓度，即产生在基线与最大值之间一半的应答所需的浓度。
如本文所用，“药物可接受的盐”是指分子或大分子的药物可接受的有机或无机盐。
术语“效力(potency)”是生物学活性的度量，可以指定为IC50，或者抑制50％的Notch3-依赖性报道基因活性或者Notch3阳性细胞系的生长(如分别在实施例9和12中所描述的)所需的抗体或抗体药物缀合物对抗原Notch3的抑制性浓度。
如本文所用，短语“有效量”或者“治疗有效量”是指实现希望的治疗结果所需的量(剂量及给药时间和给药方式)。有效量至少是赋予对象治疗益处必需的活性剂的最小量，但是低于毒性量。
如本文使用，关于本发明抗体的生物学活性所用术语“抑制”或者“中和”是指抗体基本上拮抗、禁止、阻止、限制、减缓、破坏、消除、终止、降低或逆转例如被抑制的包括但不限于生物学活性的进展或严重度的能力。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中，可以但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用，术语“多核苷酸”或者“核酸分子”是指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链DNA。
编码本发明抗体的多核苷酸可包括如下序列：仅变体的编码序列，变体的编码序列和另外的编码序列如功能性多肽，或者信号或分泌序列或者前蛋白序列；抗体的编码序列和非编码序列，如内含子或抗体编码序列的5’和/或3’非编码序列。术语“编码抗体的多核苷酸”涵盖包含变体的另外的编码序列的多核苷酸，也涵盖包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本领域已知针对特定宿主细胞/表达系统优化的多核苷酸序列可容易地得自希望的蛋白质的氨基酸序列(见GENEART AG,Regensburg,Germany)。
“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以或者已经是载体的接受体以掺入多核苷酸插入体。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，及可以是与原始亲代细胞由于天然、偶发或有意突变所致而非必须完全相同(在形态学或在基因组DNA互补序列中)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
术语“载体”是指一种构建体，其能输送及优选地在宿主细胞中表达一或多个感兴趣的基因。举例的载体包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、在脂质体中包囊的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞如生产细胞。
术语“表达控制序列”是指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者增强子。表达控制序列与被转录的核酸序列可操纵地连接。
编码本发明抗体的多核苷酸通常包含与抗体编码序列可操纵地连接的表达控制多核苷酸序列，包括本领域已知的天然相关的或者异源启动子区域。优选地，表达控制序列是在载体中能转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统，但是也可以使用原核宿主的控制序列。一旦载体已经被掺入合适的宿主细胞系中，使所述宿主细胞在适于表达核苷酸序列及在需要时适于收集和纯化抗体的条件下增殖。优选的真核细胞系包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞，或者人胚胎肾细胞系。最优选的宿主细胞是CHO细胞系。
抗体
本发明的抗体可以使用本领域熟知的技术产生，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或者这些技术的组合或者本领域已知的其它技术(见例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45:1628-50(1999)和Fellouse,F.A.,et al,J.MoI.Biol.,373(4):924-40(2007))。
本发明的一个实施方案是抗体，其特异性结合与包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体相同的Notch3表位，所述第一氨基酸序列与SEQID NO:13具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:25具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
本发明的另一实施方案是抗体，其特异性结合与包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体相同的Notch3表位，所述第一氨基酸序列与SEQID NO:37具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:49具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合Notch3，及抗体或其抗原结合片段与包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体竞争结合，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:13具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:25具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合Notch3，及抗体或其抗原结合片段与包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗体竞争结合，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO:37具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:49具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
药物与抗体的缀合
所述药物具有或者被修饰为包含与抗体上缀合点反应的基团。例如，可以通过烷化(例如在赖氨酸ε-氨基基团或者抗体N-末端)、还原性胺化氧化的碳水化合物、羟基与羧基基团之间的酯基转移及与硫醇缀合附着药物。在一些实施方案中，每个抗体分子缀合的药物的数目p的范围是平均1-12、1-11、1-10、1-9、1-8；1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或者1-2。在一些实施方案中，p的范围是平均2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或者2-3。在其它实施方案中，p是平均1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，p的范围是平均大约1-大约12、大约1-大约11、大约1-大约10、大约1-大约9、大约1-大约8；大约1-大约7、大约1-大约6、大约1-大约5、大约1-大约4、大约1-大约3或者大约1-大约2。在一些实施方案中，p的范围是大约2-大约12、大约2-大约11、大约2-大约10、大约2-大约9、大约2-大约8、大约2-大约7、大约2-大约6、大约2-大约5、大约2-大约4或者大约2-大约3。例如，可用于缀合的化学作用见例如Current Protocols in Protein Science(John Wiley&Sons,Inc.),Chapter 15(Chemical Modifications of Proteins)所述。
接头
接头是一种双功能化合物，可用于连接药物与抗体以形成抗体药物缀合物(ADC)。这种缀合物可用于例如形成针对肿瘤相关抗原的免疫缀合物。这种缀合物使得可以选择性输送细胞毒性剂至肿瘤细胞。
合适的接头包括例如可裂解的及非可裂解的接头。可裂解的接头通常在细胞内条件下可被裂解。合适的可裂解接头包括例如肽接头，其可以由细胞内蛋白酶如溶酶体蛋白酶或核内体蛋白酶裂解。在举例的实施方案中，接头可以是二肽接头，如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头，或者马来酰亚胺己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(vc)接头。另一接头是磺基琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己基-1-羧酸盐(smcc)。磺基-smcc缀合通过与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生，而其磺基-NHS酯与伯胺反应(见于赖氨酸及蛋白质或肽N末端)。另一接头是马来酰亚胺己酰(mc)。其它合适的接头包括在特定pH或pH范围可水解的接头，如腙接头。其它合适的可裂解的接头包括二硫化物接头。该接头可以与抗体共价结合，由此抗体必须在细胞内降解以释放药物，例如mc接头等。
本发明的接头包括马来酰亚胺己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(vc)和马来酰亚胺乙酰(mc)、me和MalPeg6C2。
工程化的Fc多肽
先前已经报道可能存在于抗体重链的CH2或CH3结构域表面上或者轻链恒定区上或者其它可接近部位的某些残基，适于用例如半胱氨酸取代天然存在的野生型氨基酸，及因此可用于工程化能与各种制剂缀合的位点，如通过引用将其并入本文的国际公布第WO/2013/093809号所述。
氨基酸修饰可以通过本领域已知的任何方法产生，许多这种方法为本领域技术人员熟知且常规使用。例如但不限于，氨基酸取代、删除和插入可以通过使用任何熟知的基于PCR的技术实现。氨基酸取代可以通过定点诱变而产生(见例如Zoller and Smith,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-6500；和Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:488)。
在一些实施方案中，本发明的工程化的Fc多肽可用于制备抗体或其抗原结合片段，由此抗体或其片段包含工程化的Fc区域，其可用于在工程化的位点(即与野生型未修饰的Fc相比取代的氨基酸)与各种部分缀合。
在一些实施方案中，本发明的工程化的κ轻链恒定区多肽可用于制备抗体或其抗原结合片段，由此抗体或其片段包含具有氨基酸突变的工程化的CL区或其片段，其可用于在工程化的氨基酸残基缀合各种组分。
应注意在Fc多肽中的单一取代，例如半胱氨酸残基，由于IgG抗体分子的同源二聚体性质导致所得IgG抗体中展示两个相应残基。因此，本发明所得工程化的IgG抗体可展示至少1、2、3、4或更多个反应基团以缀合药物或化合物。在一个实施方案中，一或多个取代是用半胱氨酸残基取代，所得工程化抗体可展示至少1、2、3、4或更多个硫醇基团以缀合药物或化合物。
在一些实施方案中，本发明的工程化Fc多肽包含选自在抗体重链位置443和392的一或多个取代，其中恒定区的编号系统是如Kabat等(如前述)所述EU索引。
在一些实施方案中，工程化的Fc多肽包含一个氨基酸取代(L443C)，如在SEQ ID NO:61中提供。在另一个实施方案中，工程化的Fc多肽包含两个氨基酸取代(L443C/K392C)，如在SEQ ID NO:65中提供。
工程化的Cκ多肽
本发明的抗-Notch3抗体可涵盖工程化的抗体轻链恒定区(LC)或其片段，其中亲代、天然的或野生型抗体的抗体轻链的1、2或3个氨基酸由另一氨基酸(包括天然和非天然/合成的氨基酸)取代，其中轻链恒定区的编号系统是如Kabat et al.(1991,NIH Publication 91-3242,National TechnicalInformation Service,Springfield,VA，后文称作Kabat)所述Kabat编号系统。
在其它实施方案中，由于许多抗体的二聚体性质(例如IgG包含两个轻链和两个重链，每个重链包含一个Fc多肽)，本发明的抗体可包含至少一个工程化的Fc多肽，及可进一步包含至少一个工程化轻链恒定多肽，从而提供至少两个位点特异性缀合位点，一个在Fc多肽中，另一个在CL多肽中。
在一些实施方案中，本发明的工程化的Cκ多肽包含在抗体轻链的位置183的至少一个取代。在一些实施方案中，工程化的Cκ多肽包含一个氨基酸取代(κK183C)，如在SEQ ID NO:63中提供。
癌症治疗
癌症，包括但不限于肿瘤、肿瘤转移或者特征在于不受控的细胞生长的其它疾病或病症，可以通过施用本发明的抗体或其抗原结合片段或者抗体-药物缀合物(ADC)而治疗或预防。
举例的抗-Notch3抗体或其抗原结合片段及抗体-药物缀合物可用于治疗癌症，其中相对于参考对象或标准(例如非癌性或正常组织)Notch3表达或过表达。根据本发明描述的方法，表达Notch3的癌症的治疗或预防可以通过给需要这种治疗的对象施用有效量的抗-Notch3抗体或其抗原结合片段和/或抗体-药物缀合物而实现。在一些实施方案中，施用抗-Notch3全长抗体或其抗原结合片段，其与细胞毒性剂缀合。在一些举例的实施方案中，本发明的抗-Notch3抗体-药物缀合物将(i)结合表达Notch3的癌细胞，及(ii)发挥细胞毒性或抑制细胞生长作用，例如抑制表达Notch3的癌细胞的增殖或者杀死表达Notch3的癌细胞。
在其它实施方案中，抗-Notch3抗体或其抗原结合片段和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物与另一治疗剂共同施用，或者与另一治疗剂相继施用。在一些实施方案中，抗-Notch3抗体或其抗原结合片段和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物与化疗药(包括医护标准的化疗药)共同施用，或者相继施用。
在一些实施方案中，其它治疗剂是待治疗的特定疾病的医护标准药物，或者是待治疗的特定疾病的抢救方案的部分。抗癌剂和化疗方案包括例如抗癌抗体，包括例如抗-CD52抗体(例如阿伦单抗)、抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗)及抗-CD40抗体(例如SGN40)；化疗方案包括例如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)；CVP(环磷酰胺、长春新碱和强的松)；RCVP(利妥昔单抗+CVP)；RCHOP(利妥昔单抗+CHOP)；RICE(利妥昔单抗+异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)；RDHAP(利妥昔单抗+地塞米松、阿糖胞苷、顺铂)；RESHAP(利妥昔单抗+依托泊苷、甲基强的松龙、阿糖胞苷、顺铂)；吉西他滨；长春新碱、强的松和蒽环类抗肿瘤药的组合治疗，有或没有天冬酰胺酶；道诺霉素、长春新碱、强的松和天冬酰胺酶的组合治疗；替尼泊苷与Ara-C(阿糖胞苷)的组合治疗；氨甲喋呤与亚叶酸的组合治疗；博来霉素、道诺霉素、依托泊苷、氮芥、强的松、长春碱与长春新碱的组合治疗；小分子抑制剂；及蛋白酶体抑制剂包括例如硼替佐米。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括给需要其的患者施用有效量的抗-Notch3抗体或者其抗原结合片段和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物组合放射治疗，及任选地，另一治疗剂。在一些实施方案中，抗-Notch3抗体或其抗原结合片段和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物与抗癌剂(例如化疗剂)和/或与放射治疗同时或相继施用。在一些实施方案中，在施用本发明的化合物之前或随后至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1个月、几个月(例如直至三个月)施用化疗剂或放射治疗。
通常地，为了施用抗-Notch3抗体和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物，初始候选物剂量可以是大约2mg/kg。对于本发明，典型的每日剂量根据上述因素可以是大约3μg/kg至30μg/kg，至300μg/kg至3mg/kg，至30mg/kg，至100mg/kg或更多。例如，可以使用剂量为大约1mg/kg、大约2.5mg/kg、大约5mg/kg、大约10mg/kg及大约25mg/kg。为了在几天或更长时间重复施用，根据病况，持续治疗直至出现希望的症状的抑制或者直至达到足够的治疗水平，例如抑制或延缓肿瘤生长/进展或癌细胞的转移。举例的剂量方案包括施用初始剂量为大约2mg/kg，随后每周维持剂量为大约1mg/kg的抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物，或者随后维持剂量为每隔一周大约1mg/kg。其它举例的剂量方案包括施用增加的剂量(例如初始剂量1mg/kg及在每周或更长时间逐步增加至一或多个更高的剂量)。根据主治医生希望达到的药代动力学衰减模式，也可以使用其它剂量方案。例如，在一些实施方案中，期望一周1-4次给药。在其它实施方案中，涵盖一个月一次或者每隔一个月一次或者每三个月一次以及每周、两周及每三周一次的剂量方案。这种治疗程序可以通过常规技术和测定进行监测。剂量方案(包括使用的抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物)可以随着时间改变。
对于本发明，抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物的合适剂量根据使用的抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物(或者其组合物)、待治疗的症状的类型和严重度、所述药物是否为治疗目的而施用、先前的治疗、患者的临床病史及对药物的应答、患者对所施用的药物的清除速率以及临床医生的判断而定。临床医生可以施用抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物直至达到获得希望的结果并超越的剂量。剂量和/或频率可以在治疗期间变化，但是也可以保持恒定。根据经验的考虑，如半衰期，通常有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体，如人源化抗体或完全人抗体，可用于抗体的延长半衰期及防止抗体被宿主免疫系统攻击。在治疗期间可以确定及调节施用频率，通常但非必需地基于症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟发生，例如肿瘤生长抑制或延迟等。或者，抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物的持久的连续释放配制物是合适的。本领域已知实现持久释放的各种配制物和装置。
在一个实施方案中，抗-Notch3抗体或抗-Notch3抗体-药物缀合物的剂量可以在已经施用一或多次抗-Notch3抗体或其抗-Notch3抗体-药物缀合物的个体中根据经验确定。给予个体增加剂量的抗-Notch3抗体或Notch3拮抗剂。为了评估效力，可以随访疾病的指征。
在本发明的方法中施用抗-Notch3抗体或者抗-Notch3抗体-药物缀合物根据例如接受者的生理状况，无论是治疗性还是预防性，及根据本领域技术人员已知的其它因素而可以是持续的或者间歇的。施用抗-Notch3抗体或者抗-Notch3抗体-药物缀合物在预选的时期基本上可以是持续的或者可以是一系列有间隔的施用。
在一些实施方案中，可以存在一种以上的抗-Notch3抗体或者抗-Notch3抗体-药物缀合物。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的或更多的抗-Notch3抗体或者抗-Notch3抗体-药物缀合物。通常地，这些抗-Notch3抗体或者抗-Notch3抗体-药物缀合物可以具有彼此无不利影响的互补活性。例如，可以使用一或多种如下抗-Notch3抗体：针对Notch3上一个表位的第一抗-Notch3抗体，及针对Notch3上不同表位的第二抗-Notch3抗体。
本发明的抗-Notch3抗体或其抗原结合片段和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物可以是药物组合物形式，其被配制为适于所选择的施用模式，及药物可接受的稀释剂或赋形剂如缓冲液、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂、运载体等。Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton Pa.,18th ed.,1995提供了配制技术概述，其为本领域技术人员普遍已知。
这些药物组合物可以通过本领域已知的实现治疗癌症的指定目的的任何方式施用。在一个实施方案中，施用途径是肠道外途径，在本文定义为是指包括但不限于静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下和关节内注射及输注的施用模式。施用的剂量依赖于接受者的年龄、健康状况和体重、同时进行的治疗的种类，及如果有的话是治疗频率和希望的作用性质。
本发明范围内的组合物包括所有组合物，其中抗-Notch3抗体或其抗原结合片段和/或抗-Notch3抗体-药物缀合物是以有效实现治疗癌症希望的医学作用的量存在。虽然个体需要彼此不同，但是确定所有成分的最佳有效量范围在临床医生的能力范围内。
诊断
本发明的抗体或其抗原结合片段也可以用于在体外或体内检测生物学样品中的Notch3。在一个实施方案中，本发明的抗-Notch3抗体或其抗原结合片段用于确定组织或源自的细胞中Notch3的水平。在一个实施方案中，所述组织是患病组织。在一些实施方案中，所述组织是肿瘤或其活检组织。在一个实施方案中，患者的组织或活检组织中Notch3的水平可以在用本发明的抗体或其抗原结合片段的免疫测定中确定。所述组织或其活检组织可以从患者中切除及可冷冻或固定。相同方法可用于确定Notch3蛋白质的其它性质，如其细胞表面水平或者细胞定位。
上述方法可用于在已知或疑似具有癌症的对象中诊断癌症，其中将在患者中测量的Notch3水平与参考对象或标准对比。所述方法可用于确定肿瘤是否表达Notch3，其可以提示肿瘤将良好应答本发明的抗体-药物缀合物的治疗。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤是实体瘤，包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌和肉瘤，或者血癌，包括但不限于T-细胞恶性肿瘤、T-细胞白血病、T-细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、B-细胞恶性肿瘤、骨髓性恶性肿瘤、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病，其中表达Notch3，以及确定其中主要表达Notch3的其它癌症。
本发明的一个实施方案是治疗表达Notch3的癌症的方法，所述方法包括：确定生物学样品中Notch3的水平，包括如下步骤：将得自疑似具有癌症的对象的样品与抗-Notch3抗体或者其抗原结合片段接触；确定样品中Notch3的细胞表面水平；将Notch3细胞表面水平与参考对象或标准对比；及给所述对象施用本发明的抗体-药物缀合物。任选地，所述方法可包括从疑似患有癌症的对象中获得样品的步骤。
本发明的另一实施方案是治疗表达Notch3的癌症的方法，所述方法包括：确定生物学样品中Notch3的水平，包括如下步骤：将得自疑似患有癌症的对象的样品进行原位杂交(ISH)；确定样品中Notch3mRNA的水平；将Notch3mRNA水平与参考对象或标准进行对比；给对象施用本发明的抗体-药物缀合物。任选地，所述方法可包括从疑似患有癌症的对象中获得样品的步骤。
本发明进一步提供单克隆抗体、人源化抗体及其表位结合片段，其进一步标记以用于研究或诊断应用中。在一些实施方案中，所述标记是放射性标记、荧光团、生色团、成像剂或者金属离子。
本发明还提供一种诊断方法，其中给疑似患有癌症的对象施用标记的抗体或其表位结合片段，测量或监测对象机体内所述标记的分布。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，包含例如所述细胞毒性缀合物和使用细胞毒性缀合物杀死特定类型细胞的说明书。所述说明书可包括关于体外、体内或离体使用细胞毒性缀合物的说明。通常地，试剂盒具有含有细胞毒性缀合物的区室。所述细胞毒性缀合物可以是冻干形式、液体形式或者可修正以包含在试剂盒中的其它形式。试剂盒还可以包含实施试剂盒说明书上描述的方法需要的其它元件，如无菌溶液以复水冻干的粉末，在给患者施用之前与细胞毒性缀合物组合的其它制剂，以及有助于给患者施用所述缀合物的器具。
上文或在如下实施例中引用的所有出版物和专利文献在此均通过引用将其全文并入本文，且引用程度与单独指示的程度相同。
本发明参考如下实施例得以进一步描述；然而，应理解本发明不限于这些实施例。
用于实施本发明的特定方面的如下实施例只是为了例证本发明，而无以任何方式限制本发明范围之意。
实施例1：产生重组的Notch3蛋白质免疫原
将编码在N末端具有信号肽及在C末端具有Avi和His6标签的人Notch3NRR区的cDNA构建体克隆进表达载体pSMED2中。将这些构建体瞬时转染进中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，在条件培养基中分泌的蛋白质在SDS-PAGE上分析。在S1裂解位点加工后，Notch3NRR结构域的N-末端～26kDa(LNR-A、B、C和HD1)和C-末端～12kDa(HD2和Avi_His标签)部分通过非共价相互作用保持结合形成异二聚体复合物，如图1所示。Notch3NRR的S1加工在从CHO细胞中制备的样品中确定为大约50％或更低。为了增强在S1裂解位点的加工，将Notch3NRR表达构建体转染进CHO-PACE细胞中(Harrison et,al,Semin Hematol.1998Apr；35(2Suppl2):4-10)，选择具有Notch3NRR最高表达和完整加工的稳定细胞系。这些细胞系的培养按比例扩大以收集从中纯化Notch3NRR蛋白的条件化培养基。
纯化的人和小鼠Notch3NRR_Avi_His标签蛋白质(后文称作Notch3NRR重组蛋白)的氨基酸和核苷酸序列在图2中提供。小写字母表示Avi_His标签。SDS-PAGE分析显示>90％的纯化的蛋白质被正确地裂解为预期的Notch3NRR N-末端和C-末端肽大小(数据未显示)。
实施例2：产生和克隆大鼠抗-Notch3抗体
A.免疫和杂交瘤产生
Sprague-Dawley大鼠通过皮下注射含有在弗氏完全佐剂中的人(SEQID NO.1)和小鼠(SEQ ID NO.3)Notch3重组蛋白质各20μg的混合物进行免疫。间隔2周重复免疫共12周。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测第一次注射后第0、35、49和63天收集的血清样品的循环抗-Notch3抗体效价活性。当达到最佳效价时，将最终剂量的蛋白质混合物静脉内(尾静脉)注射进具有最佳抗体效价的大鼠中，4天后处死大鼠收集脾细胞。使用PEG1500将来自大鼠的全部脾细胞(2×108)与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63.Ag8.653(2.5×107)融合。将融合的细胞铺板在96孔平板(0.2mL/孔)中，并进行HAT选择(RPMI 1640，含有5×10-4M次黄嘌呤、1.6×10-5M胸苷、4×10-4M氨基蝶呤及20％热失活的FCS)。
在融合后14天，收获杂交瘤上清并检测Notch3结合活性的存在。通过ELISA检测，两个亲代大鼠克隆28和75(后文分别称作r28和r75)通过ELISA检测呈现与人Notch3NRR重组蛋白的结合活性及通过基于细胞的ELISA呈现与稳定过表达人全长Notch3的U-2OS细胞表面的结合活性，在0.1-1nM抗体浓度的O.D.450nM值为1或其上。此外，r28而不是r75通过ELISA检测呈现与小鼠Notch3NRR重组蛋白质的结合活性，及通过基于细胞的ELISA检测呈现出与稳定过表达小鼠全长Notch3的U-2OS细胞的细胞表面的结合活性，在0.1-1nM抗体浓度的O.D.450nM值为1或其上。
B.抗-Notch3抗体的克隆与测序
将r28和r75可变区进行亚克隆以进一步分析。提取来自亚克隆的RNA，通过RT-PCR克隆获得得自表达的抗体的可变区DNA序列。将1-5百万的亚克隆的杂交瘤细胞匀浆，使用QIAGEN RNAeasy Mini试剂盒分离总RNA。然后使用SuperScript III RT试剂盒(Invitrogen)产生第一链cDNA。随后通过PCR扩增，使用来自大鼠IgG重链(IgG1，2a，2b)和轻链(κ或λ)恒定区的引物，产生抗-Notch3IgG可变区的双链cDNA，如下文描述。PCR循环条件是：1次循环，95℃ 1分钟；25次循环，95℃ 1分钟，63℃ 1分钟及73℃ 1分钟。将所得RT-PCR产物克隆进TOPO-Blunt克隆载体(Invitrogen)中，通过常规方法测序。r28和r75可变区的氨基酸和核苷酸序列在图3中提供。CDR以下划线显示。
实施例3：产生和鉴定嵌合抗-Notch3抗体
将来自r28和r75的可变区cDNA亚克隆进哺乳动物表达载体中，其中大鼠可变重链(VH)符合读框地与人IgG1(hIgG1)融合，大鼠可变轻链与人κ融合。通过在HEK293细胞中瞬时转染，从这些构建体中产生大鼠-人嵌合抗体28和75(后文分别称作ch28和ch75)并进一步分析。
在重组蛋白质ELISA中检测ch28和ch75的结合活性。将纯化的人或小鼠Notch3NRR重组蛋白质在CoStar hi-结合的96孔ELISA平板上在具有浓度为1μg/ml的Mg/Ca的100μl PBS中包被过夜。将平板用PBS-Mg/Ca洗涤，并用在PBS-Mg/Ca中的1％BSA封闭1小时。从平板中倒出封闭溶液，将在封闭溶液中1:3系列稀释的抗体加到平板中。在室温温育1小时后，将平板用PBS-Mg/Can再次洗涤，之后加入在封闭缓冲液中稀释(1:20,000)的HRP(辣根过氧化物酶)-缀合的抗体。当检测的一抗是大鼠IgG时，二抗是山羊抗-大鼠IgG Fc(Bethyl Biotech)；当一抗是人IgG时，二抗是山羊抗-人IgG Fc(Southern Biotech)。
在与二抗温育1小时后，如上述再次洗涤平板，加入TMB底物溶液。使生色反应进行10分钟，之后加入终止溶液0.18M H2SO4。测量在O.D.450nM的吸光率，对数据进行绘图并用Microsoft Excel和Graphpad-Prism软件分析。ch28和ch75呈现出与人Notch3NRR重组蛋白的强结合活性，EC50为1nM或更低，以及是ch28而不是ch75还呈现出与小鼠Notch3NRR重组蛋白的强结合活性，EC50为1nM或更低。选择ch28和ch75进行进一步的基于细胞的ELISA，如下文描述。
实施例4：人源化
选择r28和r75进行人源化以进一步开发。人源化是通过在人接受体框架上移植CDR而进行，重链为DP-54，轻链为DPK9，随后是在人接受体中的选择的回复突变以恢复亲代大鼠抗体的完全活性。表1显示在人接受体框架中针对不同变体的选择的回复突变。
表1：人源化抗-Notch3抗体变体的选择的回复突变
通过Genewiz合成cDNAs，其含有在人接受体框架DP-54和DPK9上的r28和r75的移植的CDR供体序列，具有选择的回复突变。将合成的cDNA产物亚克隆及分别在哺乳动物表达载体pSMED2和pSMEN3中符合读框地针对重链与人IgG1重链恒定区融合及针对轻链与人κ融合。
人源化r28变体VH1.0/VL1.0(后文称作hu28)完全保留ch28的抗原结合表位和亲和性且缺少在ch28中观测到的有效的信号传导抑制活性。hu28的VH和VL区的CDR分别与r28的VH和VL区的CDR相同。人源化r75变体VH1.9/VL1.3(后文称作hu75)完全保留ch75的抗原结合表位和亲和性及在ch75中观测到的有效的信号传导抑制活性。hu75的VH区的CDR2和CDR3分别与r75的VH区的CDR2和CDR3相同。hu75的VH区的CDR1含有一个回复突变V34M。hu75的VL区的CDR与r28的VL区CDR相同。图4A-4C提供了具有鉴定了的CDR的hu28的氨基酸和核苷酸序列(Kabat和Chothia)，图5A-5C提供了具有鉴定了的CDR的hu75的氨基酸和核苷酸序列(Kabat和Chothia)。
关于r28与hu28及r75与hu75的人接受体框架的VH和VL区的排列对比在表2中显示。Kabat CDR以下划线显示。大鼠和人源化序列之间构建残基的不同以小写字母显示。关于r28与hu28可变区的人接受体框架之间的同源性对于VH为73％，对于VL为76％。关于r75与hu75可变区的人接受体框架之间的同源性对于VH为46％，对于VL为64％。Kabat CDR以下划线显示。
表2：抗-Notch3抗体的人接受体框架的比对
实施例5：hu28和hu75的鉴定
A.基于细胞的ELISA
在基于细胞的ELISA中针对细胞表面Notch3结合对人源化hu28和hu75及大鼠-人嵌合的ch28和ch75的抗-Notch3抗体进行筛选。在进行ELISA测定前一天，将在细胞表面稳定过表达人或小鼠全长Notch3蛋白质的U-2OS细胞(后文分别称作U2OS/hNotch3和U2OS/mNotch3)以50,000个细胞/孔铺板于96孔平板(白色不透明，BD/VWR)。在进行ELISA当天，从孔中除去培养基，将系列稀释(在封闭缓冲液中1:3稀释)的抗体溶液用于该平板。将平板在室温温育2小时，之后用PBS-Mg/Ca洗涤。然后应用HRP-缀合的二级抗体，如上述与细胞温育1小时以进行重组蛋白质ELISA。将平板用PBS-Mg/Ca洗涤，之后用Pico-化学发光生色试剂盒(ThermalScientific)生色，根据厂商指导进行化学发光测量。使用Microsoft Excel和Graphpad-Prism软件进行数据绘图和分析。EC50(nM)值从细胞表面Notch3结合ELISA中计算，在表3中提供。
数据表明hu28在结合在U2OS/hNotch3细胞表面上表达的全长人Notch3方面与ch28相似。进一步地，数据表明hu28完全保留ch28与在U2OS/mNotch3细胞表面表达的小鼠Notch3的交叉反应性。数据还表明hu75与ch75在结合在U2OS/hNotch3细胞表面表达的全长人Notch3方面相似。进一步地，数据表明hu75完全保留ch75与人Notch3的特异性，观测到与在U2OS/mNotch3细胞表面表达的小鼠Notch3无交叉反应性。N/B表示无结合。
表3：关于抗-Notch3抗体的细胞表面Notch3结合ELISA的EC50(nM)值
B.竞争ELISA
针对hu28与ch28及hu75与ch75关于细胞表面表达的全长人Notch3进行竞争ELISA。将96孔细胞培养平板接种U2OS/hNotch3细胞(细胞培养平板，Co-star)。将存在0.8nM的ch28(生物素化的)或ch75(生物素化的)抗体的系列稀释的(在封闭缓冲液中1:3稀释)抗体溶液用于该平板。在温育2小时后，如上述洗涤平板，并应用在封闭缓冲液中1:5000稀释的HRP-缀合的链霉亲和素(Southern Biotech)。在与链霉亲和素温育30分钟后，再次洗涤平板，之后用TMB溶液生色10分钟。生色反应通过加入0.18MH2SO4终止，测量在450nM的吸光度。使用Microsoft Excel和Graphpad-Prism软件进行数据绘图和分析。
表4显示来自结合在U2OS/hNotch3细胞表面上表达的全长人Notch3的竞争ELISA的EC50(nM)值。数据显示hu28与未标记的r28具有相似的EC50值，表明hu28以及未标记的ch28与生物素化的ch28竞争结合在U2OS/hNotch3细胞表面上表达的全长人Notch3。数据表明hu28结合与ch28相同或者高度相似的在U2OS/hNotch3细胞表面表达的全长人Notch3上的表位。
数据进一步显示hu75与未标记的ch75具有相似的EC50值，表明hu75以及未标记的ch75与生物素化的ch75竞争结合在U2OS/hNotch3细胞表面表达的全长人Notch3。数据表明hu75结合与ch75相同或者高度相似的在U2OS/hNotch3细胞表面表达的全长人Notch3上的表位。
表4：抗-Notch3抗体的竞争ELISA的EC50(nM)值
C.与其它人Notch同系物的结合特异性
Notch受体家族的其它成员在生物进程中发挥重要作用。例如，Notch1或Notch2缺陷在小鼠模型中导致胚胎死亡。相反，Notch4缺陷在小鼠模型中导致不可检测的表型。Notch3NRR区的最接近的同系物是Notch1和Notch2(～50％同源性)，Notch4是更远的同系物(～30％同源性)。抗-Notch3抗体与Notch家族其它成员，特别是Notch1和2的交叉反应性在患者中可导致不希望的作用。因此，评估r28与hu28以及r75与hu75与其它Notch家族成员的潜在交叉反应性。
将与人IgG1Fc片段融合的编码人Notch1和Notch2NRR区的表达构建体稳定导入CHO-PACE细胞中。收集来自表达NRR-Fc融合体的这些细胞的条件培养基。人Notch2NRR-Fc和人Notch1NRR-Fc通过蛋白质A亲和性及随后大小排阻层析(SEC)进行纯化。将纯化的制备物在具有1mMCaCl2的TBS中透析，及在分析性SEC上分析纯度>99％。
如表5显示，r28与hu28以及r75与hu75均没有与人Notch2NRR-Fc融合蛋白的可检测的结合。进一步地，hu28和hu75也没有与全长人Notch1NRR-Fc的可检测的结合。这表明hu28和hu75与Notch1或Notch2不交叉反应。N/B表示无结合。
表5：抗-Notch3抗体与Notch2NRR-Fc和Notch1NRR-Fc的结合
D.与人Notch3NRR的结合亲和性
抗-Notch3NRR相互作用的动力学常数通过表面等离子共振确定(T100,Biacore Inc.,Piscataway,NJ)。将CM5芯片的流式细胞用大约10,000应答单位(RU)的在10mM甘氨酸pH 5.0中的抗-人IgG-Fc()以10μl/分钟固定600秒。将10μg/ml抗-Notch3抗体ch28和hu28及ch75和hu75在具有1mM CaCl2的TBS中稀释，在10μl/分钟捕获。记录3分钟在具有1mM CaCl2的TBS中在100μl/分钟的四种浓度的人Notch3NRR重组蛋白质(3.7-100nM)及零浓度(运行缓冲液)的结合。测量10分钟复合物的解离。通过以10μl/分钟注射60秒具有3mM EGTA的3M MgCl2而再生芯片表面。使用T100评估软件()，将在减去参考和缓冲液信号后获得的曲线使用与1:1Langmuir结合模型拟合。
Ka、Kd和KD在表6中显示。动力学分析显示针对ch28和hu28相似的ka(on)和kd(off)比率。进一步地，观测到hu75比ch75较高的ka(on)和较低的kd(off)速率，导致hu75较低的KD值。
表6：抗-Notch3抗体的动力学分析
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
ch28 4.09E+05 2.49E-04 0.61
hu28VH1.0/VL1.0 3.86E+05 3.47E-04 0.90
ch75 5.70E+04 9.92E-04 17.40
hu75VH1.9/VL1.3 3.48E+04 3.40E-04 9.76
D.热稳定性
在蛋白质或蛋白质结构域的热稳定性与蛋白质或蛋白质结构域的整体稳定性之间存在正相关性。蛋白质或蛋白质结构域的较高解链点通常提供改良的可生产性和较长的贮存期。使用示差扫描量热法(DSC)分别评估hu28和hu75相对于ch28和ch75的热稳定性。将蛋白质样品在PBS中稀释为0.3mg/ml，体积为250μl。相应的配制缓冲液空白用于参考样品。使用MicroCal ThermoVac Sample Degassing and Thermostat(Microcal,Inc.,Northampton,MA)将这两个样品彻底除气，设定在8℃。将样品分配在MicroCal VP-DSC Capillary Cell MicroCalorimter(MicroCal,Inc.,Northampton,MA)的合适单元中。将样品在15℃平衡4分钟，然后以每小时100℃的速度直至100℃扫描。选择20秒的过滤时间。基线校正原始数据，然后标准化蛋白质浓度。使用Origin Software(OriginLabCorporation,Northampton,MA)将数据与具有适当转换数目的MN2-State模型拟合。
如表7所示，hu28和hu75分别与ch28和ch75相比在其Fab区具有较高的热稳定性，如由较高的解链点显示(均高于77℃)。
表7：抗-Notch3抗体的热稳定性(DSC)分析
实施例6：结构域交换嵌合的构建体
如实施例3所示，hu28和hu75没有与Notch1蛋白质的交叉反应性。制备Notch1和Notch3NRR的结构域交换嵌合的构建体以进行抗-Notch3ch28和ch75抗体的表位作图。将编码具有C-末端Fc(人IgG1Fc片段)融合的人Notch1-Notch3(后文称作Notch 1-3)NRR区结构域交换嵌合体的表达构建体单独转染进CHO-PACE中，建立表达每个嵌合体的稳定集合。将来自每个稳定集合的条件培养基用于蛋白质A亲和性层析，随后进行大小排阻层析(SEC)以纯化嵌合的融合蛋白。将纯化的制备物在具有1mM CaCl2的TBS中透析，并在分析性SEC上分析。图6显示重组NRR嵌合蛋白质由与人Fc(未显示)融合的各个Notch1(以灰色显示)和Notch3(以黑色显示)结构域组成。
如实施例3和5所述在ELISA中检测ch28和ch75与Notch 1-3NRR结构域交换嵌合物的相对结合能力。将Notch 1-3NRR结构域交换嵌合物以1μg/ml包被在ELISA平板上，随后用在PBS中具有0.9mM Mg2+和Ca2+的1％BSA封闭。然后将在封闭缓冲液中稀释的5μg/ml的ch28和ch75应用于该封闭的平板。在温育1小时后，将平板用具有0.9mM Mg2+和Ca2+的PBS洗涤，之后在所述平板应用与HRP缀合的二级山羊抗人Fc抗体并温育。再次洗涤后，将该平板用TMB生色，生色反应通过加入0.18M H2SO4而终止。在平板读器上读取O.D.450nM，相对结合能力以O.D.值表示。
如图6所示，ch28和ch75与Notch3NRR的结构域的表位结合图是不同的。更特别地，ch28与Notch3NRR的结合更依赖于LNR-C和HD-1结构域，而ch75更依赖于LNR-A及HD-1和HD-2结构域。观测到的ch28和ch75的结合图与抗体的信号传导抑制活性一致。特别地，ch28仅与Notch3NRR异二聚体(HD-1)的N-末端相互作用，其在自身抑制性构象中不保留为抑制Notch3信号传导激活所需的Notch3NRR区。相反，ch75与Notch3NRR异二聚体的HD-1和HD-2结构域均相互作用，其在自身抑制性构象中保留Notch3NRR区，从而抑制Notch3信号传导的激活。
实施例7：表达Notch3的癌细胞系的鉴定
通过western印迹分析在一组癌细胞系中确定Notch3的表达，以鉴定Notch3阳性细胞，以进一步分析和检测抗-Notch3抗体和抗-Notch3抗体-药物缀合物。该组包括HCC2429肺癌细胞系、OVCAR3卵巢癌细胞系、MDA-MB-468乳腺癌细胞系、N87胃癌细胞系，以及工程化为过表达人Notch3的细胞系包括U-2OS和MDA-MB-468细胞，后文分别称作U2OS/hNotch3和MDAMB468/hNotch3。使用标准western印迹方法，使用兔单克隆抗-Notch3抗体D11B8(Cell Signaling Technologies)或者小鼠单克隆1G5(Abnova)检测Notch3。
D11B8抗-Notch3抗体结合在人Notch3蛋白质的C-末端尾部内Glu2312周围的表位，并识别未裂解的全长Notch3(～270kDa)和裂解的含有Notch3蛋白质片段的C-末端结构域(～80-90kDa)。分子量为～80-90kDa的Notch3条带表示TMIC(跨膜和细胞内结构域)和/或NEXT(Notch细胞外截短)蛋白酶解片段，如图7显示。1G5抗体结合Notch3细胞外结构域(ECD)的47-156位氨基酸内的表位，并识别未裂解的全长蛋白质(～270kDa)及裂解的N-末端片段(～210kDa)(数据未显示)。
在HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、N87、MDAMB468/hNotch3和U2OS/hNotch3中检测到Notch3-ECD(数据未显示)及含有Notch3蛋白质片段的裂解的C-末端结构域，如图7所示。进一步地，在SW900肺癌细胞系中未检测到Notch3，因此表示是Notch3阴性对照细胞系。
实施例8：抗-Notch3抗体的内在化和运输
抗-Notch3抗体-药物缀合物由与一系列细胞毒性剂缀合的肽可裂解的马来酰亚胺己酰-缬氨酸-谷氨酸-p-氨基苄氧基羰基(vc)接头或者非可裂解的基于硫醚的马来酰亚胺己酰(mc)接头组成。有效载荷从抗体中的释放需要抗体-药物缀合物运输和定位至具有蛋白酶如组织蛋白酶B的溶酶体，以裂解vc-型接头，或者晚期溶酶体以完成抗体的分解代谢以释放mc-连接的有效载荷。抗-Notch3抗体至溶酶体小泡的内在化和细胞内运输通过基于间接和直接免疫荧光显微镜检测而监测。为了直接目测抗-Notch3抗体的细胞内运输，将其与荧光染料缀合并与活细胞在存在pHrodoTM red葡聚糖(LifeTechnologies)条件下温育，以染色酸性小泡如溶酶体。进行活细胞成像以鉴定荧光标记的抗体与溶酶体及其它酸性小泡的共定位。进一步地，对细胞进行基于间接免疫荧光显微镜检测以证实抗-Notch3抗体与LAMP1、溶酶体相关蛋白的共定位。
A.内在化和溶酶体运输
将HCC2429或MDA-MB-468细胞在具有#1.5硼硅酸盐无菌玻片盖(Thermo Fisher Scientific Inc.)的Lab Tec II 4隔室的盖片中培养。在第1天，将pHrodoTM red葡聚糖(Life Technologies)加入培养基中，浓度为10μg/ml，温育16小时以染色酸性小泡如溶酶体。在第2天，将细胞用HBSS++(GibcoLife Technologies)洗涤两次。将抗-Notch3抗体hu75与Alexa Fluor 488缀合(后文称作hu75-Alexa488)(Life Technologies Protein Labeling kit)，及将hu28与DyLight650马来酰亚胺试剂直接缀合(后文称作hu28-DyLight650)(Thermo Scientific)，根据厂商指导进行。将Hu75-Alexa488或hu28-DyLight650标记的抗体加入细胞中，浓度为5μg/ml在2％牛血清白蛋白(BSA)/HBSS++中，在湿冰上进行25分钟。将细胞用在冰上冰冷的HBSS++洗涤两次，置于2％BSA/HBSS++中，并在装备eXcelon Evolve 512相机(Photometrics)和XL S系列区室(Zeiss)的旋转盘CSU-X1M 5000显微镜(Yokogawa)上控制温度、湿度和5％CO2条件下成像，从5分钟至12-18小时。使用Zen CZI文件格式(Zeiss)每5分钟捕获一次图像并组合。使用Volocity v6.3软件(PerkinElmer)计算Pearson’s相关系数以确定hu28-DyLight650与pHrodoTM red葡聚糖之间的共定位程度。
制备细胞以进行活细胞成像后，由于为了获得图像装置的仪器的设定及优化所致可以评估的最早时间点是10分钟。在将细胞置于湿化的37℃的5％CO2区室中之后大约10分钟，可以在细胞表面以及在细胞内部一些点状结构中观测hu75-Alexa488，如图8A所示。这个结果表明抗-Notch3抗体hu75在细胞膜结合Notch3受体基础上快速经历内在化。在早期时间点(10分钟至大约65分钟)，细胞内抗-Notch3抗体hu75-Alexa488及用pHrodoTM red葡聚糖染色的酸性小泡呈现出非共定位的分立的斑点。从大约70分钟及随后的时间，抗-Notch3抗体hu75和pHrodoTM red葡聚糖标记的小泡共定位于相同分立的点状结构，如图8B中箭头所示。这个数据提示抗-Notch3抗体hu75在表达Notch3的HCC2429(数据未显示)和MDA-MB-468细胞中内在化并运输至酸性小泡如溶酶体，如图8B所示。
将细胞置于湿化的37℃的5％CO2区室中之后大约10分钟后，可以在细胞表面观测hu28-DyLight650，如图8C所示。细胞内抗-Notch3抗体hu28-DyLight650和pHrodoTM red葡聚糖染色的酸性小泡呈现出分立的斑点及随着时间逐步共定位，如图8D中箭头所示。计算皮尔逊相关系数(PCC)以确定在MDA-MB-468细胞中随着时间hu28-DyLight650与pHrodoTMred葡聚糖荧光标记之间的重叠或共定位程度。PCC数越高，则hu28-DyLight650与pHrodoTMred葡聚糖荧光标记之间共定位程度更高。图8E表明在直至大约360分钟共定位稳定提高，hu28-DyLight650与pHrodoTMred葡聚糖之间的最大共定位在大约420分钟，然后进入平稳期。数据提示抗-Notch3抗体hu28-DyLight650在表达Notch3的MDA-MB-468细胞中内在化并运输至酸性小泡如溶酶体。
B.与溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)的共定位
将HCC2429或MDA-MB-468细胞在具有#1.5硼硅酸盐无菌玻片的LabTec II 4区室化盖片(Thermo Fisher Scientific Inc.)中培养。为了进行结合和内在化测定，将细胞用HBSS++洗涤两次，并将未缀合的抗-Notch3抗体hu75和hu28加入细胞中，浓度为10μg/ml在2％牛血清白蛋白(BSA)/HBSS++中，在冰上进行25分钟。为了目测在0分钟的膜结合情况，将对照细胞用冰冷的HBSS++洗涤，然后在PBS中的4％多聚甲醛中固定10分钟。对于抗体内在化，将细胞用冰冷的HBSS++洗涤两次，然后将预温的完全生长培养基加入细胞中并置于湿化的37℃的5％CO2温育仪内部。在从5分钟至18个小时的多个时间点从温育仪中除去细胞，如前所述洗涤并固定。然后将细胞用PBS洗涤3次，用在PBS中的0.3％Triton X-100渗透10分钟。将细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后在3％BSA/PBS中封闭1小时。加入在2％BSA/PBS中1:100的抗-LAMP-1小鼠单克隆抗体(H4A3，Abcam)，在4℃温育过夜。将细胞用PBS洗涤两次，每次5分钟，然后加入山羊抗人Alexa Fluor 488和山羊抗小鼠Alexa Fluor 555(Lifetechnologies)二抗，避光45分钟。将细胞用PBS洗涤3次，及在Zeiss LSM510聚焦显微镜或者CSU-X1M 5000(Yokogawa)旋转盘聚焦显微镜上成像。
对照细胞在冰上与抗-Notch3抗体温育，然后立即固定，hu28和hu75定位在表达Notch3的细胞的细胞表面，在细胞内部观测到无染色。在对照细胞中，溶酶体抗-LAMP1抗体染色，呈现出细胞内部分立的点状结构，其不与抗-Notch3抗体hu28和hu75共定位。在37℃温育90分钟后，观测到抗-Notch3抗体hu28和hu75在细胞内部点状结构，其与抗-LAMP1抗体共定位。在37℃温育后，抗-Notch3抗体hu28和hu75的细胞膜染色降低，最终变得不可检测。这个数据提示抗-Notch3抗体hu28和hu75在与细胞在冰上温育后结合细胞之后表面，然后在37℃经历温度依赖性内在化。内在化，抗-Notch3抗体hu28和hu75与LAMP1蛋白质共定位，表明其特异性运输至溶酶体(数据未显示)。
实施例9：基于细胞的测定中抗-Notch3抗体对Notch3信号传导的作用
Notch3信号传导是通过配体诱导的蛋白酶解而起始的。在位点S1在furin-样蛋白酶裂解之后成熟Notch3异二聚体通过近膜阴性调节区(NRR)保持自身抑制状态。配体如DLL4或Jagged1与Notch3-ECD的结合诱导在S2和S3位点的两个连续的额外的裂解，分别由ADAM-型金属蛋白酶和γ-分泌酶催化。后者裂解释放Notch3的细胞内结构域(NICD3)，使其转位于细胞核并激活含有CSL蛋白质的共有DNA结合位点基序的靶基因的转录。
抗-Notch3嵌合抗体ch28-huIgG1和ch75-huIgG1及人源化抗体hu28和hu75抑制Notch3信号传导的能力在Notch3-依赖性报道基因共培养测定中检测。将抗-Notch3抗体与Notch3报道细胞预温育，然后与DLL4-HEK293细胞共培养以激活Notch3信号传导或者与亲代HEK293细胞共培养作为对照。
A.用于Notch3报道基因共培养测定的细胞系构建
为了产生Notch3报道细胞系，在U-2OS人骨肉瘤细胞系(ATCC,Manassas,VA)中进行一系列三次相继的稳定转染。第一次转染使用载体基于pCMV6-Entry-Myc-Flag主链(Origene)表达全长人Notch3，证实Notch3插入体的正确DNA序列。在用TransIT-LT1转染试剂(Mirus,Madison,WI)转染后，在G418中选择U-2OS细胞并分离克隆系。其次，将稳定的表达Notch3的U-2OS克隆用含有CSL增强子序列(CGTGGGAAAAT)的8个串联拷贝的pGL4.27[luc2P/minP/Hygro]载体(Promega,Madison,WI)再转染，在潮霉素B加上G418中选择并分离克隆系。所述8×CSL萤火虫荧光素酶报道构建体应答激活的Notch信号传导(例如见Jeffries et al.,Mol.Cell.Biol.22(11):3927-3941,2002)。第三，将人Notch3 8×CSL萤火虫荧光素酶U-2OS细胞用Cignal Lenti Renilla Control(luc)(Qiagen,CA)慢病毒颗粒转导，在嘌呤霉素、潮霉素B和G418中选择，并分离克隆系。Cignal Lenti Renilla对照(luc)载体编码海肾-荧光素酶基因，其从CMV启动子组成型表达并作为内部对照。将三个一组的稳定转染的U-2OS细胞系(后文称作Notch3报道细胞)维持在McCoy’s 5A培养基(Gibco,Grand Island,NY)中，其中含有10％FBS、1×青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Gibco)、0.25mg/ml G418硫酸盐、0.3mg/ml潮霉素B和0.001mg/ml嘌呤霉素。
为了产生表达配体的细胞，将HEK293细胞(ATCC)用载体转染以表达人DLL4。所述载体基于pCMV6-AC-HA-His主链(Origene,Rockville,MD)，证实DLL4插入体的正确DNA序列。在转染之后，将HEK293细胞在0.5mg/ml G418中选择，分离克隆系，扩展并分析DLL4表达。在U-2OS细胞中具有高DLL4表达和高Notch3报道基因活性诱导的克隆用于评估抗-Notch3抗体的抑制作用。
从萤火虫荧光素酶中读取的荧光除以读取的内部对照的海肾荧光素酶荧光以标准化信号(后文称作“F/R比率”)。为了计算Notch3信号传导的诱导倍数，将从DLL4-HEK293共培养报道物测定中产生的F/R比率除以来自亲代HEK293共培养物的F/R比率，称作相对荧光素酶单位(RLU)或活性。
B.报道基因共培养物测定
将人Notch3报道细胞胰蛋白酶解并从培养平板测定培养基中收获并计数，培养基由50％完全McCoy’s 5A培养基(McCoy’s 5A，具有10％FBS和青霉素、链霉素，Invitrogen)及50％完全MEM培养基(MEM，具有10％FBS和青霉素、链霉素，Invitrogen)组成。使用相同培养基产生适当的细胞稀释液，以使得在存在系列稀释(在完全McCoy’s 5A培养基中1:3稀释)的抗体溶液或杂交瘤培养上清条件下，在96孔培养平板(白色不透明，BD/VWR)上总体积45μl/孔，10,000个细胞/孔。将细胞与抗体稀释液的混合物在无菌罩中在平板上室温温育1小时，之后在每个孔中加入30,000/45μl人DLL4-HEK293细胞。在加入hDLL4-HEK293细胞后，将平板在培养箱中进一步温育20小时，使用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测量萤火虫荧光素酶和内部对照海肾荧光素酶活性，根据厂商指导进行。使用Microsoft Excel和Graphpad-Prism软件对数据进行绘图并分析。
在人Notch3报道基因共培养测定中ch75-huIgG1和hu75的效价证明了以剂量依赖性方式对Notch3信号传导的有效抑制。表8显示在人Notch3报道细胞中ch75-huIgG1和hu75抗体针对Notch3依赖性信号传导的抑制活性。ch75-huIgG1和hu75在人Notch3依赖性信号传导报道基因测定中显示相似的中和化活性。因此，hu75完全保留ch75-huIgG1的抑制活性。
ch28-huIgG1和hu28均微弱地抑制Notch3信号传导，与对照ch2H6-huIgG1和huNeg8.8抗体处于相似水平。这表明ch28-huIgG1和hu28的抑制活性是非特异性的。进一步地，数据表明抗-Notch3抗体ch28-huIgG1和hu28不抑制Notch3信号传导，因此与ch75-huIgG1和hu75在功能上不同。
表8：人源化和嵌合抗体的剂量依赖性抑制活性
从Notch3报道基因共培养测定的Notch3-依赖性信号传导的抑制计算ch75-huIgG1和hu75变体的IC50(nM)值。对来自两或三个独立实验的IC50(nM)数据求平均值，如在表9中提供。hu75和ch75-huIgG1均具有较低的IC50值，表明其是Notch3信号传导的有效抑制剂。
表9：hu75和ch75-hIgG1的抑制活性的IC50值(nM)
抗体 IC50(nM) SD
hu75VH1.9/VL1.3 4.43 2.36
ch75-hIgG1 2.10 0.66
C.抗-Notch3抗体对通过金属蛋白酶的位点2裂解的作用
为了证实抗-Notch3抗体hu75而非hu28与Notch3的NRR结构域的结合伴随S2-裂解降低，进行western印迹分析。兔单克隆抗-Notch3抗体D11B8(Cell Signaling Technologies)识别Notch3C-末端片段，其是S1和S2蛋白酶解事件的产物。正如通过NRR结构域交换实验证实，抗-Notch3抗体hu75同时结合位于NRR的通过在位点1(S1)的弗林蛋白酶裂解分隔的两个非共价连接的区域上的LNR-A,HD-1和HD-2结构域。抗-Notch3抗体hu28结合LNR-C和HD1结构域，其位于是S1位点的N末端的NRR结构域的线性的共价连接的区域。期望抑制性抗体通过以自身抑制性构象稳定NRR结构域及因此阻止S2-裂解而降低S2-裂解的Notch3的检测，同时非抑制性抗体不期望对S2-裂解有作用。
Notch3报道基因的位点2(S2)-裂解通过蛋白质的western印迹分析而评估，使用D11B8(Cell Signaling Technologies)抗体，其识别在C-末端结构域中Glu2312周围的表位。HCC2429和MDA-MB-468乳腺癌细胞用于检验抑制性抗-Notch3抗体hu75和非抑制性抗-Notch3抗体hu28对S2-裂解的作用。对于该测定，将1-2.5×106个细胞铺板于完全生长培养基中。加入hu75、hu28和huNeg8.8对照抗体，浓度为5μg/ml。将细胞在37℃在5％CO2培养箱中温育24小时，然后在缓冲液中直接裂解。将提取物通过在7.5％聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad criterion gel)上进行变性SDS-PAGE而分离(resolve)，并使用iBlot Gel转移系统(Invitrogen)移至硝化纤维纸上。通过标准western印迹方法使用D11B8抗体及作为荷载对照的抗-GAPDH(Sigma)检测Notch3。
图9显示S2-裂解测定的Western印迹分析。在未处理和对照huNeg8.8-处理24小时的HCC2429和MDA-MB-468细胞中，正如所期望的，S1-和S2-裂解的C-末端Notch3蛋白质片段均可以使用D11B8抗体通过western印迹分析检测。进一步地，在用抑制性抗-Notch3抗体hu75处理的细胞中，检测到S1-裂解的Notch3C-末端片段，但是S2-裂解的片段未检测到，表明金属蛋白酶裂解被hu75阻断。此外，在用非抑制性抗-Notch3抗体hu28处理的细胞中，检测到S1-和S2-裂解的Notch3C-末端片段，表明hu28不抑制受体的蛋白酶解。因此，如实施例5表明hu28以高亲和性结合Notch3-NRR，及对于在细胞表面上表达的全长Notch3具有高结合活性，但是不抑制Notch3信号传导，表明其与抑制性抗体抗-Notch3-NRR包括hu75在功能上不同。
实施例10：化合物的合成
根据通过引用而并入本文的国际专利公开第WO/2013/072813号中所述方法制备化合物0101、6780、0131、3377和8261。
A.化合物0101的实验物(在图表中是#54)
制备2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚基-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54)
步骤1：合成N-[(9H-芴基-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#53)。根据一般程序D(下文)，从二氯甲烷中的#32(2.05g,2.83mmol,1eq.)(20mL,0.1M)及N,N-二甲基甲酰胺(3mL)、胺#19(2.5g,3.4mmol,1.2eq.)、HATU(1.29g,3.38mmol,1.2eq.)和三乙胺(1.57mL,11.3mmol,4eq.)合成粗制的希望的物质，将其通过硅胶层析纯化(梯度：0％-55％庚烷中的丙酮)，产生固体的#53(2.42g,74％)。LC-MS：m/z 965.7[M+H+],987.6[M+Na+]，保留时间＝1.04分钟；HPLC(方案A):m/z 965.4[M+H+]，保留时间＝11.344分钟(纯度>97％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)，推测是旋转异构体的混合物，特征性信号：δ7.86-7.91(m,2H),[7.77(d,J＝3.3Hz)和7.79(d,J＝3.2Hz),共1H]，7.67-7.74(m,2H),[7.63(d,J＝3.2Hz)和7.65(d,J＝3.2Hz)，共1H]，7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),7.11-7.30(m,5H),[5.39(ddd,J＝11.4,8.4,4.1Hz)和5.52(ddd,J＝11.7,8.8,4.2Hz)，共1H],[4.49(dd,J＝8.6,7.6Hz)和4.59(dd,J＝8.6,6.8Hz)，共1H]，3.13,3.17,3.18和3.24(4s,共6H),2.90和3.00(2br s,共3H),1.31和1.36(2br s,共6H),[1.05(d,J＝6.7Hz)和1.09(d,J＝6.7Hz)，共3H]。
步骤2.合成2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷基-1-基}-5-甲基-1-氧代庚基-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54)。
根据一般程序A(下文)，从二氯甲烷中的#53(701mg,0.726mmol)(10mL,0.07M)合成粗制的希望的物质，将其通过硅胶层析纯化(梯度:0％-10％甲醇在二氯甲烷中)。将残余物用二乙醚和庚烷稀释，并真空浓缩以提供白色固体的#54(406mg,75％)。LC-MS:m/z 743.6[M+H+]，保留时间＝0.70分钟；HPLC(方案A):m/z 743.4[M+H+],保留时间＝6.903分钟，(纯度>97％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)，推测是旋转异构体的混合物，特征性信号：δ[8.64(br d,J＝8.5Hz)和8.86(br d,J＝8.7Hz),共1H],[8.04(br d,J＝9.3Hz)和8.08(br d,J＝9.3Hz),共1H],[7.77(d,J＝3.3Hz)和7.80(d,J＝3.2Hz),共1H],[7.63(d,J＝3.3Hz)和7.66(d,J＝3.2Hz),共1H],7.13-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J＝11,8.5,4Hz)和5.53(ddd,J＝12,9,4Hz),共1H],[4.49(dd,J＝9,8Hz)和4.60(dd,J＝9,7Hz),共1H],3.16,3.20,3.21和3.25(4s,共6H),2.93和3.02(2br s,共3H),1.21(s,3H),1.13和1.13(2s,共3H),[1.05(d,J＝6.7Hz)和1.10(d,J＝6.7Hz),共3H],0.73-0.80(m,3H)。
B.化合物6780的实验物(在图表中是#112)
制备2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷基-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚基-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#112)。
步骤1.合成tert-丁基(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷基-1-羧酸盐(#109)。向#11(2.00g,6.96mmol,1eq.)的二氯甲烷(21mL,0.3M)溶液和N,N-二甲基甲酰胺(3mL)加入HATU(3270mg,8.35mmol,1.2eq.)。2分钟后，加入胺(1R,2S)-(+)-去甲麻黄碱(1.07mg,6.96mmol,1eq.)和三乙胺(1.94mL,13.9mmol,2eq.)。2小时后，将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，用1M盐酸水性溶液及用浓盐水洗涤，经过硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，及通过硅胶层析纯化(梯度:0％-60％乙酸乙酯在庚烷中)以提供白色固体的#109(2.18g,74％)。LC-MS:m/z 321.3[(M-Boc)+H+]，保留时间＝3.14分钟；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)，推测是旋转异构体的混合物，特征性信号：δ7.64(d,J＝8.6Hz,1H),7.24-7.33(m,4H),7.15-7.21(m,1H),5.35(br d,J＝5Hz,1H),4.45(br dd,J＝5,5Hz,1H),3.91-4.00(m,1H),3.30-3.39(m,1H),3.26(s,3H),2.94-3.07(m,1H),2.04-2.14(m,1H),1.46-1.78(m,4H),1.40(s,9H),0.97-1.04(m,6H)。
步骤2.合成(2R,3R)-N-[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺，三氟乙酸盐(#110)。根据一般程序C(下文)，在0℃从#109(414mg,0.984mmol,1eq.)、二氧杂环乙烷(5mL,0.2M)和4M的氯化氢的二氧杂环乙烷溶液(15mL,60mmol,60eq.)合成粗制的希望的化合物，将其通过反向层析(方法C)纯化以提供粘性液体的#110(120mg,34％)。LC-MS:m/z 321.1[M+H+],保留时间＝0.55分钟；1H NMR(400MHz,DMSO-d6),特征性信号:δ7.90(d,J＝8.6Hz,1H),7.28-7.36(m,4H),7.20-7.27(m,1H),4.46(d,J＝6.2Hz,1H),3.48(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),3.38(s,3H),2.92-3.16(m,3H),2.24-2.35(m,1H),1.49-1.88(m,4H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H),1.01(d,J＝6.6Hz,3H)。
步骤3.合成N-[(9H-芴基-9-甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#111)。根据一般程序D(下文)，从#32(140mg,0.230mmol,1eq.),
#110(110mg,0.253mmol,1.1eq.)、二氯甲烷(3mL,0.08M)、N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)、HATU(96.2mg,0.253mmol,1.1eq)和三乙胺(96μL,0.69mmol,3eq.)合成粗制的希望的产物，将其通过硅胶层析纯化(梯度:0％-40％丙酮于庚烷中)以提供#111(220mg,95％)。LC-MS:m/z 912.4[M+H+],935.4[M+Na+],保留时间＝2.15分钟；HPLC(方案B):m/z 912.5[M+H+],934.5[M+Na+],保留时间＝10.138分钟(纯度>94％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)，推测是旋转异构体的混合物，特征性信号：δ7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.66-7.75(m,2H),7.41(dd,J＝7.4,7.4Hz,2H),7.12-7.20(m,1H),[5.33(d,J＝4.7Hz)和5.38(d,J＝4.7Hz),共1H],3.15,3.18,3.22和3.23(4s,共6H),1.30,1.33,1.36和1.39(4s,共6H),0.95-1.06(m,6H)。
步骤4.合成2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#112)。根据一般程序A(下文)，从#111(210mg,0.230mmol)在二氯甲烷(5mL,0.05M)中和二乙胺(5mL)中合成粗制的希望的材料，将其通过硅胶层析纯化(梯度:0％-10％甲醇于二氯甲烷中)，以提供油和固体的混合物。加入二乙醚和庚烷，将混合物真空浓缩，产生白色固体的#112(81mg,51％)。LC-MS:m/z 690.4[M+H+],保留时间＝1.10分钟；HPLC(方案A):m/z 690.5[M+H+],712.4[M+Na+],保留时间＝7.229分钟(纯度>90％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)，推测是旋转异构体的混合物，特征性信号:δ[7.62(br d,J＝8Hz),7.88(br d,J＝8Hz),8.07(br d,J＝9Hz)和8.11(br d,J＝9Hz),共2H],7.15-7.34(m,5H),[5.34(d,J＝4Hz)和5.41(d,J＝5Hz),共1H],3.18,3.21,3.23和3.25(4s,共6H),2.93和3.08(2br s,共3H),1.15,1.18,1.21和1.25(4s,共6H)。
C.一般程序
一般程序A：使用二乙胺或哌啶除去Fmoc。向含有Fmoc的化合物的二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺(也称作DMF)溶液中加入等体积的二乙胺或哌啶。反应进程通过LC-MS(或者HPLC或TLC)监测。真空除去溶剂，在一些情况中将残余物与庚烷共沸1-4次。在加载到硅胶上之前，通常用二氯甲烷和少量甲醇稀释残余物，通过在硅胶上层析纯化，用在二氯甲烷(或前体合适的溶剂混合物)中的甲醇洗脱，提供希望的材料(或者立即使用的粗材料)。
一般程序C：使用在二氧杂环乙烷中的盐酸除去Boc或者tert-丁基酯(也称作t-Bu酯)裂解。向含有Boc的化合物或含有tert-丁基酯的化合物的二氧杂环乙烷溶液中(或者在一些情况中无溶液，或者其它相关溶剂)加入4M盐酸的二氧杂环乙烷溶液。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)监测。将反应物真空浓缩，及在一些情况中与庚烷共沸1-4次。
一般程序D：与O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基铀六氟磷酸盐(HATU)结合。向胺(1.0eq.)和酸(1.0-2.0eq.)的二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(也称作DMF)中或者二者的混合物的搅拌溶液中加入HATU(1.0-2.0eq.)，随后加入三乙胺(2.0-4.0eq.)或者二异丙基乙胺(2.0-4.0eq.，也称作Hunig’s base)。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)监测；反应通常在三小时内完成。真空除去溶剂。残余物通过硅胶或反向层析纯化，或者在一些情况中与庚烷共沸三次，在硅胶或者C18结合的硅胶上降低之前用少量的乙酸乙酯稀释，及通过硅胶或反向层析进行纯化。
D.其它化合物
本发明中使用的进一步的化合物在国际专利公开第WO/2013/072813号中描述并在下文显示。
如本文所用，化合物0131或2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐(#118)具有下式：
如本文所用，化合物3377或N,2-二甲基丙氨酰-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐(#115)具有下式：
如本文所用，化合物8261或2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#69)具有下式：
实施例11：抗-Notch3抗体-药物缀合物(ADC)的制备
本发明的ADC使用具有结合化学化合物的反应位点的接头的部分及导入具有抗体的反应位点的接头单元的另一部分而制备。一方面，接头单元具有反应位点，其具有与抗体单元如抗体上存在的亲核基团反应的亲电子基团。抗体上的有用的亲核基团包括但不限于巯基、羟基和氨基基团。抗体的亲核基团的杂原子与接头单位上的亲电子基团反应，形成与接头单位的共价键。接头上的有用的亲电基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
接头单位具有反应位点，其具有与抗体单位上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上的亲电子基团提供便于附着接头单位的位点。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基基团。接头单位的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应，形成与抗体的共价键。接头单位上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸盐和芳基酰肼。
如本文所用，“mc-”也称作“MalC-”，是指：
如本文所用，“vc-”也称作“mcValCitPABC-”或者“MalCValCitPABC-”，是指：
如本文所用，“me-”是指：
如本文所用，“MalPeg6C2-”是指下文所示“MalPegXC2-”，其中X＝6：
本发明的ADC通过用三(2-羧基乙基)磷化氢(TCEP)部分还原抗体，随后还原的半胱氨酸残基与希望的马来酰亚胺末端的接头有效荷载反应而制备。特别地，将抗体通过加入过量大约2.3-3.0倍摩尔的三(2-羧基乙基)磷化氢(TCEP)于100mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液)，pH7.0和1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)中在37℃部分还原2小时。然后将希望的接头-有效荷载加入反应混合物中，接头-有效荷载/抗体摩尔比率为大约7-8，在存在15％v/v二甲基乙酰胺(DMA)条件下在25℃额外反应1小时。在1小时温育期后，加入过量3倍的N-乙基马来酰亚胺以覆盖未反应的硫醇并使反应15分钟，随后加入过量6倍的L-Cys以终止任何未反应的接头-有效荷载。将反应混合物在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4中在4℃透析过夜，通过SEC(AKTA explorer,Superdex 200)纯化。通过将纯化的ADC在100mM硼酸盐pH 9.2缓冲液中在37℃温育24-72小时进一步实现琥珀酰亚胺环的水解。环开放通过液相层析电喷射离子化串联质谱分析(LC-ESI MS)监测，及通过大小排阻层析(SEC)纯化。ADC通过纯度SEC、疏水性相互作用层析(HIC)和液相层析电喷射离子化串联质谱分析(LC-ESI MS)进一步鉴定，以计算药物-抗体比率(荷载)。蛋白质浓度通过UV分光光度计确定。
vc0101(显示通过半胱氨酸残基与抗体X缀合)
vc6780(显示通过半胱氨酸残基与抗体X缀合)
将人源化的抗-Notch抗体hu28和hu75及大鼠-人嵌合的抗-Notch抗体ch28和ch75与各种接头-有效荷载组合缀合，如表10提供。ADC及其元件根据本发明方法及根据国际专利公开第WO/2013/072813号所述制备。
表10：抗-Notch3ADC命名
ADC命名 相应的ADC接头-有效载荷#
hu28-vc0101 Notch3-28-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#54
hu28-vc6780 Notch3-28-v1010-hG1-(C)_mcValCitPABC-#112
hu75-vc0101 Notch3-75-v1913-hG1-(C)_mcValCitPABC-#54
hu75-vc6780 Notch3-75-v1913-hG1-(C)_mcValCitPABC-#112
ch28-vc0101 Notch3-28-cG1-(C)_mcValCitPABC-#54
ch28-vc6780 Notch3-28-cG1-(C)_mcValCitPABC-#112
ch28-mc0101 Notch3-28-cG1-(C)_mc-#54
ch28-mc0131 Notch3-28-cG1-(C)_mc-0#118
ch28-mc3377 Notch3-28-cG1-(C)_mc-#115
ch28-mc8261 Notch3-28-cG1-(C)_mc-#69
ch28-MalPeg6C2-0131 Notch3-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-0#118
ch28-MalPeg6C2-8261 Notch3-28-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69
ch28-me0131 Notch3-28-cG1-(C)_me-0#118
ch28-m(H2O)c-0131 Notch3-28-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118
ch75-vc0101 Notch3-75-cG1-(C)_mcValCitPABC-#54
ch75-vc6780 Notch3-75-cG1-(C)_mcValCitPABC-#112
ch75-mc0131 Notch3-75-cG1-(C)_mc-0#118
ch75-mc3377 Notch3-75-cG1-(C)_mc-#115
ch75-MalPegC2-0131 Notch3-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-0#118
ch75-MalPeg6C2-8261 Notch3-75-cG1-(C)_MalPeg6C2-#69
ch75-me0131 Notch3-75-cG1-(C)_me-0#118
ch75-m(H2O)c-0131 Notch3-75-cG1-(C)_m(H2O)c-0#118
huNeg8.8-vc0101 huNeg8.8-(C)_mcValCitPABC-#54
huNeg8.8-vc6780 huNeg8.8-(C)_mcValCitPABC-#112
huNeg8.8-mc0131 huNeg8.8-(C)_mc-0#118
huNeg8.8-mc3377 huNeg8.8-(C)_mc-#115
huNeg8.8-me0131 huNeg8.8-(C)_me-0#118
huNeg8.8-MalPeg6C2-8261 huNeg8.8-(C)_MalPeg6C2-#69
ch2H6-mc8261 ch2H6-(C)_mc-#69
实施例12：抗-Notch3抗体与ADC的结合活性和特异性
A.基于细胞的ELISA
在基于细胞的ELISA中筛选未缀合的抗-Notch3抗体、抗-Notch3ADC和阴性对照抗体(huNeg8.8)与表达Notch3的细胞系的细胞表面结合活性。在进行ELISA测定前一天，将过表达Notch3细胞系U2OS/hNotch3和内源表达Notch3细胞系HCC2429和MDA-MB-468分别以50,000、200,000和100,000个细胞/孔密度铺板于96孔平板(白色不透明，BD/VWR)中。在ELISA当天，从孔中除去培养基，及在该平板中应用系列稀释的(在具有氯化钙和氯化镁(Ca/Mg)及1％BSA的DPBS中1:3稀释)抗体和ADC溶液。将平板在室温温育2小时，之后用具有Ca/Mg和1％BSA的DPBS洗涤。然后应用HRP-缀合的二级抗体，与细胞温育1小时。将平板用具有Ca/Mg和1％BSA的DPBS洗涤，之后用Pico-化学发光生色试剂盒(ThermalScientific)生色，根据厂商指导测量化学发光。使用Microsoft Excel和Graphpad-Prism软件对数据进行绘图和分析。
表11显示针对未缀合的抗-Notch3抗体hu28和hu75及抗-Notch3ADC抗体hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101和hu75-vc6780在2-4个单独实验中从细胞表面Notch3结合ELISA中计算的EC50(nM)值和标准误差(SD)。数据表明hu28-ADC和hu75-ADC分别与未缀合的抗体hu28和hu75在结合在U2OS/hNotch3、HCC2429和MDA-MB-468细胞表面表达的全长人Notch3方面是相似的。进一步地，数据表明各种接头-有效荷载与hu28和hu75抗体的缀合不影响或改变结合特性。此外，数据表明hu28及hu28-vc0101和hu28-vc6780对于细胞表面Notch3均具有较高结合能力，通过其与hu75及hu75-vc0101和hu75-vc6780相比较低的EC50值证实。阴性对照的未缀合的huNeg8.8抗体不结合任何所检测的细胞系。对于没有结合(LB)的对照抗体，如所标示地，EC50值未产生(SD＝标准误差)。
表11：未缀合的抗-Notch3抗体与抗-Notch3ADC的EC50(nM)值(SD＝标准误差)
B.流式细胞计量术
通过流式细胞计量术检验未缀合的抗-Notch3抗体hu28和hu75与表达Notch3的细胞系的细胞表面结合活性。根据标准程序进行荧光激活的细胞淘选(FACS)分析。将细胞在具有氯化钙和氯化镁的HBSS(本文称作HBSS++)中漂洗，使用无EDTA的胰蛋白酶收获及用含有FBS的培养基中和化。将细胞在冰上与在含有3％HICS(热失活的胎牛血清)的HBSS++中的4μg/mL抗-Notch3抗体hu28和hu75温育30分钟。将细胞用冷却的HBSS++,3％HICS缓冲液洗涤三次。细胞在别藻蓝蛋白缀合的AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗-人IgG、Fc片段二级抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.,West Grove,PA)中以10μg/mL在冰上避光温育30分钟。将细胞用冷却的HBSS++/3％HICS缓冲液洗涤一次。细胞再悬浮于HBSS++/3％HICS、25mM HEPES、1mM MgCl2和25μg/ml DNaseI中。加入7-AAD(7-氨基-放线菌素D)以排除非存活的细胞。将活细胞在BDFACSCalibur流式细胞计量仪(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析。使用FlowJo流式细胞计量分析软件(Ashland,OR)计算来自通道FL-4的平均荧光强度(MFI)。
表12显示通过FACS分析未缀合的抗-Notch3抗体hu28和hu75与一组表达Notch3的细胞系的结合活性。U-2OS细胞系用作Notch3阴性/低水平对照细胞系。hu28和hu75均具有低水平的结合U-2OS，其最低限度地高于阴性对照huNeg8.8。进一步地，数据表明hu28和hu75特异性结合过表达Notch3的细胞U2OS/hNotch3和MDAMB468/hNotch3以及内源性表达Notch3的细胞MDA-MB-468、HCC2429和OVCAR3。此外，数据表明对于所有表达Notch3的细胞系，hu28的结合活性均高于hu75，与通过基于细胞的ELISA的结合活性观测结果相似。
表12：通过FACS分析抗-Notch3抗体的MFI值
实施例13：体外细胞毒性测定
在如下细胞系评估抗-Notch3ADC的作用：1)内源性表达Notch3蛋白的细胞系：HCC2429(肺癌)、OVCAR3(卵巢癌)和MDA-MB-468(乳腺癌)；2)工程化为过表达全长人Notch3蛋白的细胞系：MDA-MB-468/hNotch3和U2OS/hNotch3；及3)阴性对照细胞系(SW900)，使用MTS细胞存活力指示器(Promega,Madison,WI)。将这些细胞系与增加浓度的抗-Notch3ADC一起培养，所述ADC包含与本发明的各种接头-有效荷载组合缀合的大鼠-人嵌合的抗-Notch3抗体ch28和ch75及人源化抗-Notch3抗体hu28和hu75。作为抗-Notch3-ADC的特异性对照，非靶向性对照-ADC(huNeg8.8-ADC或ch2H6-ADC)也在相同细胞系上检测。4天后，评估每个培养物的存活力。IC50值通过对数非线性回归计算，模型#203具有XL fit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)，以ng Ab/mL表示。也提供了药物抗体比率(DAR)。
表13显示大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC处理的IC50(ng Ab/mL)值。对于2-4个个体重复试验，计算平均IC50值以及平均数标准误差(S.E.M.)。数据表明具有各种接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC在表达和过表达Notch3的癌细胞系HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、MDA-MB-468/hNotch3、U2OS/hNotch3中是有活性的且诱导细胞死亡。非靶向的对照-ADC的没有效力(LP)及因此如所表示的IC50值未产生，或者在检测的最高剂量呈现最低活性。认为与对照-ADC相比具有相等或高于其IC50值的抗-Notch3ADC在体外没有效力，以LP表示。
表13：大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC的IC50(ng Ab/mL)值(nd＝未确定)
表14显示人源化的抗-Notch3ADC处理的IC50(ng Ab/mL)值。HCC2429和MDA-MB-468/hNotch3细胞系具有两个单独重复。数据表明具有各种接头-有效载荷的人源化抗-Notch3ADC在表达和过表达Notch3的癌细胞系HCC2429、OVCAR3、MDA-MB-468、MDA-MB-468/hNotch3、U2OS/hNotch3中是活性的并诱导细胞死亡，但是在没有Notch3表达的阴性对照细胞系SW900中则否。非靶向的对照-ADC没有效力(LP)及因此如所表示的未产生IC50值，或者在检测的最高剂量呈现最低活性。认为与对照-ADC相比具有相等或高于其IC50值的抗-Notch3ADC在体外没有效力，以LP表示。未缀合的人源化抗-Notch3抗体hu28和hu75不影响HCC2429或MDAMB468/hNotch3的存活力，表明细胞毒性可明确地归因于有效载荷(数据未显示)。
表14：人源化抗-Notch3ADC的IC50(ng Ab/mL)值
用siRNA抑制Notch3证实抗-Notch3ADC的体外细胞毒性依赖于Notch3蛋白的表达。使用ON-TARGET加上SMART集合人Notch3(L-011093-00)、ON-TARGET加上对照非靶向集合(D-001810-10)(ThermoScientific Dharmacon)和Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen)产生siRNA转染。在转染前一天，将2-2.5×106个HCC2429、OVCAR3和MDA-MB-468/hNotch3细胞铺板于10cm培养皿中无抗生素的生长培养基中。第二天，加入无抗生素的新鲜培养基。将siRNA和LipofectamineRNAiMAX在OPTI-MEM培养基中稀释并根据厂商指导使用。将每个细胞系用对照和Notch3siRNA转染。将细胞与转染混合物在湿化的37℃、5％CO2培养箱中温育24小时。24小时后，将细胞经胰蛋白酶解并铺板以使用MTS细胞存活力指示器(Promega,Madison,WI)进行评估。
根据细胞系，然后在处理之前24小时将细胞以2,500-5,000个细胞/孔的密度接种。细胞用3倍系列稀释的人源化抗-Notch3ADC一式三份以10个浓度(0-30μg Ab/ml)处理。相对细胞存活力以与未处理的对照组在处理96小时后的百分比表示，IC50值通过对数非线性回归用XL fit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)，模型#203计算，以ng Ab/mL表示。对于2个单独重复的实验，计算平均IC50值以及平均数标准误差(S.E.M.)。对从对照和Notch3siRNA处理的细胞中制备的提取物进行Western印迹分析，以证实Notch3抑制在直至144小时存在(数据未显示)。表达Notch3的细胞系(本文称作对照siRNA)或者在siRNA抑制后具有降低的Notch3表达的细胞系(本文称作Notch3siRNA)与增加浓度的人源化抗Notch3ADC培养。作为抗-Notch3ADC的特异性对照，非靶向性对照-ADC(huNeg8.8-ADC)也在相同细胞系上检测。4天后，评估每个培养物的存活力。通过对数非线性回归用XL fit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)，模型#203计算IC50值，以ng Ab/mL表示。也提供了药物抗体比率(DAR)。
表15显示一组对照siRNA或Notch3siRNA处理的癌细胞系的人源化抗-Notch3ADC处理的IC50(ng Ab/mL)。数据表明具有各种接头-有效载荷的人源化抗-Notch3ADC在表达Notch3的癌细胞系(对照siRNA)中是活性的并诱导细胞死亡。在siRNA抑制之后具有降低的表达的细胞中(Notch3siRNA)，IC50值高于对照siRNA，表明Notch3表达的降低伴随抗-Notch3ADC细胞毒性的降低。对照-ADC没有效力(LP)及因此如所表示的未产生IC50值，或者在检测的最高剂量呈现最低活性。数据进一步表明人源化抗-Notch3ADC特异性诱导表达和过表达Notch3的癌细胞系的细胞死亡。观测到的细胞毒性依赖于Notch3表达，因为在相同细胞上的Notch3siRNA抑制降低了由抗-Notch3ADC造成的细胞死亡。因此，人源化抗-Notch3ADC的体外细胞毒性依赖于Notch3表达。
表15：人源化抗-Notch3ADC的IC50(ng Ab/ml)
实施例14：体外评估抗-Notch3ADC作用机制
A.抗-Notch3ADC的微管破坏作用
在Notch3-ADC有效载荷内在化及细胞内释放之后，推测的释放的有效载荷的作用机制是破坏细胞分裂所需的微管，从而导致细胞周期停滞，诱导细胞凋亡和细胞死亡。为了证实这个作用机制，将OVCAR3卵巢癌细胞用hu28-vc0101、huNeg8.8-vc0101(对照ADC)处理或者不处理，然后进行免疫荧光分析，通过抗-α-微管蛋白抗体染色标记微管及抗-磷酸-组蛋白H3抗体鉴定经历有丝分裂或有丝分裂停滞的细胞。
将OVCAR3细胞接种在具有#1.5硼硅酸盐无菌玻片(Thermo FisherScientific Inc.)覆盖的Lab Tec II 4区室的盖玻片中。第二天，将细胞用1.0μg/ml的hu28-vc0101、对照huNeg8.8-vc0101处理或不处理。48小时后，将细胞用HBSS++洗涤两次，在4％多聚甲醛中固定10分钟。细胞用PBS洗涤三次，用0.5％Triton X-100渗透2分钟。在将细胞用PBS洗涤三次后，细胞用3％BSA/PBS在室温封闭30分钟。然后将细胞与1:100的抗-磷酸-组蛋白H3(Ser10)(Cell Signaling)和2μg/ml抗-α-微管蛋白(Millipore)在2％BSA/PBS中在室温温育2小时。2小时后，将细胞用PBS洗涤两次，然后与1:500稀释的山羊抗小鼠Alexa Fluor 488和山羊抗兔555在室温温育45分钟。将细胞用PBS洗涤两次，样品在LSM710聚焦显微镜(Zeiss)上成像。
如图10所示，未处理的OVCAR3细胞在细胞周期的有丝分裂阶段对于磷酸-组蛋白H3染色阳性，含有正常的双极纺锤体结构，通过抗-α-微管蛋白染色证实。用hu28-vc0101而不是对照huNeg8.8-vc0101处理，破坏有丝分裂纺锤体结构，通过其在磷酸-组蛋白H3染色的细胞中的异常形态学证实。数据表明hu28-vc0101通过破坏在有丝分裂期间完成细胞分裂所需的微管而抑制细胞增殖。
B.抗-Notch3ADC诱导细胞凋亡
Caspase-3和caspase-7(caspase-3/7)蛋白酶是程序化细胞死亡机制的关键，所述机制负责介导哺乳动物细胞中随后的细胞凋亡事件。在用Notch3-ADC处理的表达Notch3的细胞系中测量caspase-3/7的活性。
将OVCAR3、HCC2429和MDA-MB-468/hNotch3细胞接种在不透明的白色组织培养平板上，温育过夜。将OVCAR3和HCC2429用1.1μg/mlhu28-vc0101和huNeg8.8-vc010(对照ADC)处理，MDA-MB-468/hNotch3细胞用1μg/ml处理。48小时后，将细胞用Caspase-Glo 3/7试剂(Promega#G8090)在室温处理2小时。在光度计中测量发光，在减去背景之后，以相对荧光单位报告数值。
表16显示在表达Notch3的细胞系MDA-MB-468/hNotch3、HCC2429和OVCAR3中hu28-vc0101诱导的caspase-3/7活性超过对照Neg8.8-vc0101处理的细胞2-3倍。因此，hu28-vc0101通过诱导细胞凋亡而抑制细胞生长。
表16：抗-Notch3ADC的相对发光单位
hu28-vc0101 huNeg8.8-vc0101
MDA-MB-468/hNotch3 78,622±1160 47,362±678
HCC2429 128,518±3483 55,255±2965
OVCAR3 209,715±15572 118,150±4280
实施例15：Notch3免疫组织化学测定
抗-Notch3ADC的作用在临床前模型中评估，所述模型具有可检测水平的Notch3在异种移植的人肿瘤细胞的细胞膜的表达。为了鉴定表达Notch3的临床前模型，使用抗-Notch3抗体对一组异种移植模型进行免疫组织化学测定(后文称作IHC)，包括37622A1NSCLC(源于患者的)，HCC2429肺癌，MDA-MB-468乳腺癌和N87胃癌异种移植模型。
将来自每个异种移植物的组织片段经福尔马林固定及石蜡包埋(FFPE)，使用标准组织学方法进行。切成5微米FFPE切片，脱蜡及与蒸馏水水合。在高压锅中在EDTA缓冲液pH 8.0中恢复(retrieve)抗原。将内源性过氧化物酶用％H2O2封闭10分钟。将切片与DAKO蛋白质封闭物(Protein block)温育20分钟。将1:2000稀释的兔抗-Notch3(D11B8；Cell SignalingTechnologies)在室温应用于该切片1小时。Signalstain Boost抗-兔IgG-HRP聚合物(Cell Signaling Technologies)在室温应用于切片30分钟。使用DAB生色5分钟。将切片在Mayer’s苏木精中简单复染，脱水，澄清并盖上盖玻片。表17显示染色强度和染色分布级别，以0-4分赋分，0是阴性，4是最高强度。
表17：染色强度和染色分布级别
染色强度级别 染色分布级别
0＝阴性 0＝阴性
1＝最小 1＝0-25％
2＝轻度 2＝26-50％
3＝中等 3＝51-75％
4＝显著 4＝76-100％
如图18所示，在来自37622A1NSCLC、HCC2429、MDA-MB-468和N87异种移植物的细胞的细胞膜(Mem)和细胞质(Cyto)和/或细胞核(Nuc)中检测到Notch3蛋白。数据表明HCC2429和N87异种移植物在76-100％细胞的细胞膜具有Notch3蛋白的同源分布。进一步地，数据表明37622A1NSCLC和MDA-MB-468异种移植物在51-75％细胞的细胞膜具有Notch3蛋白的异源分布。此外，在具有D11B8抗体的一些上皮肿瘤细胞的细胞核中检测到Notch3C-末端胞内结构域，提示Notch3信号传导在这些细胞中是有活性的。
表18：在一组异种移植物模型上Notch3免疫组织化学的亚细胞定位、强度和分布得分
如图11所示，Western印迹分析证实在一组异种移植物中的Notch3表达水平，用于体内效力研究。将胞外结构域的～210kDa Notch3蛋白质片段(后文称作Notch3-ECD)在HCC2429、MDA-MB-468、N87和37622A1异种移植物提取物中检测到，使用小鼠单克隆抗-Notch3抗体1G5(Abnova)进行。因此，来自使用抗-Notch3抗体D11B8的IHC的数据表明Notch3在人上皮肿瘤细胞的细胞膜，使用抗-Notch3抗体1G5的Western印迹分析表明Notch3-ECD的表达，其含有NRR结构域，是抗-Notch3ADC的靶。
实施例16：体内肿瘤异种移植模型
将人源化抗-Notch3抗体hu28和hu75及大鼠-人嵌合的抗-Notch3抗体ch28和ch75与各种接头-有效载荷组合缀合，并在37622A1非小细胞肺癌(NSCLC)、HCC2429肺癌、MDA-MB-468乳腺癌和N87胃癌异种移植模型中检测。对于下文描述的每个模型，在第0天给予第一剂。肿瘤每周测量至少一次，其体积以如下公式计算：肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤宽度2)(肿瘤长度)。计算每个处理组的平均肿瘤体积(±S.E.M.)，最多10只动物，最少6只动物。
A.37622A1患者来源的NSCLC异种移植物
在免疫缺陷的小鼠中检测抗-Notch3ADC对于人肿瘤异种移植物的体内生长的作用，所述人异种移植物是通过根据适当的准许程序(Asterand)获得的新鲜切除的37622A1NSCLC肿瘤的片段建立的。将37622A1NSCLC患者来源的异种移植物以片段形式在雌性裸鼠(Nu/Nu)之间经皮下体内传代(passaged)。当肿瘤达到150-300mm3体积时，将其分成阶段以保证各个处理组中肿瘤大小一致。为37622A1NSCLC患者来源的异种移植物模型经静脉内每隔四天施用四次(Q4d×4)PBS运载工具、人源化的抗-Notch3ADC、对照huNeg-8.8ADC和顺铂，剂量在表19中提供。图12显示来自表19的数据图，3mg/kg剂量的具有vc0101接头-有效载荷的ADC与顺铂(5mg/kg)和PBS运载工具的对比。
顺铂是一种基于铂的抗癌剂，用于治疗癌症并被认为是医护标准治疗。顺铂与DNA交联，从而诱导细胞凋亡和细胞生长抑制。数据表明抗-Notch3ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101和hu75-vc6780抑制37622A1NSCLC患者来源的异种移植物肿瘤的生长。在这项研究中3mg/kg剂量的hu28-vc0101是最有效的ADC，在第84天，仍在研究中的9只动物中的4只动物保持无肿瘤。进一步地，数据显示抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效地抑制肿瘤生长。此外，数据显示抗-Notch3ADC比顺铂更有效地抑制肿瘤生长，表明比基于顺铂的医护标准化疗药物更强效(图12)。
表19：在37622A1NSCLC异种移植物中抗-Notch3ADC的效力
B.HCC2429肺异种移植物
如上述使用HCC2429肺癌细胞系进行相似体内实验。为了产生异种移植物，将雌性裸鼠(Nu/Nu)皮下植入在50％Matrigel(BD Biosciences)中的3.5×106个HCC2429细胞。当肿瘤达到200-400mm3体积时，对肿瘤进行分期以保证各个处理组中肿瘤团块的均匀性。以PBS运载工具、人源化抗-Notch3ADC和对照huNeg-8.8ADC对HCC2429肺模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量在表20和21中提供。数据表明抗-Notch3ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101和hu75-vc6780以剂量依赖性方式抑制HCC2429肺异种移植物生长。进一步地，数据显示抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效地抑制肿瘤生长，对于具有vc0101接头-有效载荷的抗-Notch3ADC的剂量为1和3mg/kg，对于具有vc6780接头-有效载荷的抗-Notch3ADC的剂量为3和10mg/kg。此外，数据表明3mg/kg剂量的hu28-vc0101比10mg/kg剂量的hu28-vc6780更有效。
表20：在HCC2429肺异种移植物中抗-Notch3-vc0101ADC的效力
表21：在HCC2429肺异种移植物中抗-Notch3-vc6780ADC的效力
也以PBS运载工具、大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC和对照huNeg-8.8ADC对HCC2429肺模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量为5mg/kg，如图16A提供。数据表明具有不可裂解的(mc)和可裂解的(vc)接头及各种有效载荷组合的抗-Notch3ADC抑制HCC2429肺异种移植物生长。进一步地，数据显示大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效地抑制肿瘤生长。此外，数据表明具有vc0101接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比检测的其它抗-Notch3ADC更有效。
使用HCC2429肺癌细胞系进行另外的体内实验，使用未缀合的大鼠-人嵌合的抗-Notch3抗体ch75-hIgG1，以确定ch75-hIgG1’s Notch3信号传导抑制是否有助于观测到的抗-Notch3hu75-ADC的效力。为了产生异种移植物，将雌性裸鼠(Nu/Nu)皮下植入在50％Matrigel(BD Biosciences)中的3.5×106个HCC2429细胞。当肿瘤达到75to 200mm3体积时，对肿瘤分期以保证各个处理组中肿瘤团块的均匀性。
以PBS运载工具、大鼠-人嵌合的抗-Notch3抗体ch75-hIgG1及人源化抗-Notch1抗体hu438VH1.1/VL1.8对HCC2429肺模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量在表22中提供。从8只动物计算每个处理组的平均肿瘤团块(±SEM)，与对照PBS运载工具组对比。计算基于的方差分析(ANOVA)的P值以确定观测到的抗-Notch处理相对于对照PBS的生长抑制的统计学显著性，使用Excel内置统计学函数进行。生长抑制百分比(％)从在研究最后一天药物处理组与运载工具处理组小鼠的测量值中计算，使用如下算式：100*{1-[(处理第14天–处理第0天)/(对照第14天–对照第0天)]}。
数据表明与PBS运载工具处理的肿瘤相比，抗-Notch1人源化抗体hu438VH1.1/VL1.8的肿瘤生长抑制57％，未缀合的大鼠-人嵌合的抗-Notch3抗体ch75-hIgG1不抑制肿瘤生长。进一步地，数据表明在表20、
21和图16A中报道的在HCC2429异种移植物中用ch75抗体产生的Notch3ADC的观测到的肿瘤生长抑制作用不是由于信号传导抑制所致。
表22：抑制性抗-Notch3和抗-Notch1抗体在HCC2429肺异种移植物中的作用
C.MDA-MB-468乳腺异种移植物
如上述使用MDA-MB-468乳腺癌细胞系进行相似的体内实验。MDA-MB-468细胞分类为三阴性乳腺癌(TNBC)基底样亚型，因为其没有雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达(Lehmann,BD,et al,J Clin Invest.2011；121(7):2750–2767)。为了产生异种移植物，将雌性SCID无毛远系繁殖(SHO)小鼠在乳房脂肪垫中原位植入含有10×106个MDA-MB-468细胞的50％Matrigel(BD Biosciences)。当肿瘤达到250-450mm3体积时，对肿瘤分期以保证各个处理组中肿瘤团块的一致性。为MDA-MB-468乳腺模型经静脉内Q4d×4施用PBS运载工具、人源化抗-Notch3ADC和对照huNeg-8.8ADC，剂量在表23和24中提供。图13A和13B显示来自表23的数据图，显示具有vc0101接头-有效载荷的抗-Notch3ADC与对照huNeg-8.8ADC和PBS运载工具相比。图14A和14B显示来自表24的数据图，显示具有vc6780接头-有效载荷的抗-Notch3ADC与对照huNeg-8.8ADC和PBS运载工具相比。
数据表明抗-Notch3ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101和hu75-vc6780以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-468乳腺异种移植物的生长。进一步地，数据显示抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效地抑制肿瘤生长，对于具有vc0101接头-有效载荷的ADC剂量为1和3mg/kg，对于具有vc6780接头-有效载荷的ADC剂量为1、3和10mg/kg。此外，数据表明1mg/kg剂量的具有vc0101接头-有效载荷的抗-Notch3ADC比3mg/kg剂量的具有vc6780接头-有效载荷的抗-Notch3ADC更有效。
表23：抗-Notch3-vc0101ADC在MDA-MB-468乳腺异种移植物中的效力
表24：抗-Notch3-vc6780ADC在MDA-MB-468乳腺异种移植物中的效力
也以PBS运载工具、大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC和对照huNeg-8.8ADC对MDA-MB-468乳腺癌模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量为5mg/kg，如图16B和16C提供。数据表明具有不可裂解的(mc)和可裂解的(vc)接头和各种有效载荷组合的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC抑制MDA-MB-468乳腺异种移植物生长。进一步地，数据显示大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效的抑制肿瘤生长。此外，数据表明具有vc0101接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比检测的其它大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC更有效。
MDA-MB-468乳腺癌模型用于检验hu28-vc0101的体内作用机制。hu28-vc0101的药效学通过在ADC处理的异种移植物中用有丝分裂标志物磷酸-组蛋白H3染色而在细胞水平观测。在细胞周期的有丝分裂阶段期间组蛋白H3在染色质内的Ser-10残基磷酸化(后文称作pHH3)。
静脉内给予携带MDA-MB-468乳腺异种移植物的小鼠单一3mg/kg剂量的抗-Notch3ADC hu28-vc0101、huNeg-8.8-vc0101(对照ADC)或者PBS。在6、24和96小时后收获这三种异种移植物并处理以进行标准免疫组织化学测定。将5微米厚度的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片在二甲苯替代物中脱蜡，用分级醇到蒸馏水再水合。为了暴露抗原性位点，将组织切片在高压锅(Retriever；Electron Microscopy Sciences)中10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0(Labvision)中加热并冷却至室温。内源性过氧化物酶活性使用3％过氧化氢失活15分钟。非特异性蛋白质相互作用通过与UV Block(Labvision)温育10分钟而封闭。组织切片与抗-pHH3抗体温育1小时，用Signalstain Boost试剂(8114,Cell Signaling Technologies)检测30分钟，及用DAB+(DAKO)生色5分钟。所有切片均用苏木精QS(Vector Laboratories)复染，用自来水洗涤，在分级醇中脱水，在二甲苯替代物中澄清，及用PermountMounting Medium(FisherChemicals,Fair Lawn,NJ)封片。
免疫组织化学染色的玻片通过成像分析评估。使用HamamatsuNanoZoomer自动玻片扫描仪在20X对玻片成像。数字化之后，使用Definiens Tissue Studio软件分析虚拟玻片。每个异种移植物切片均区域性分开并基于细胞性(cellularity)和形态学分类。在异种移植物存活区内鉴定各个核，使用每个核的平均褐色生色团强度确定阳性。数据以pHH3阳性百分比(％)表示，使用如下等式计算：(pHH3阳性核的数目(存活区)/核总数(存活区))*100。在24小时时间点使用Graph Pad Prism及使用正反T测试针对与PBS对照组相比每个处理组和时间点确定统计学显著性。
当组蛋白H3在染色质内Ser-10残基磷酸化时，使用微管抑制剂如hu28-vc0101产生的ADC预期在细胞周期的有丝分裂阶段阻止细胞增殖。ADC处理的异种移植物中pHH3染色的累积表明癌细胞停滞在有丝分裂阶段。表25包含抗-Notch3hu28-vc0101和huNeg-8.8-vc0101(对照ADC)处理的MDA-MB-468异种移植物和未处理的MDA-MB-468异种移植物中pHH3染色的细胞的百分比。数据表明hu28-vc0101而不是对照huNeg8.8-vc0101在处理后24和96小时与PBS对照组相比导致MDA-MD-468癌细胞中pHH3染色的核的百分比统计学显著性增加2倍。数据表明抗-Notch3hu28-vc0101抑制体内肿瘤生长，至少部分通过在细胞周期的有丝分裂阶段阻滞细胞，因此阻止增殖。
表25：在Notch3ADC处理的MDA-MB-468乳腺癌异种移植物中pHH3染色的核的百分比(n.d.＝未确定)
D.N87胃异种移植物
如上述使用N87胃癌细胞系进行相似的体内实验。为了产生异种移植物，将雌性裸鼠(Nu/Nu)皮下植入在50％Matrigel(BD Biosciences)中的8×106个N87细胞。当肿瘤达到250-450mm3体积时，对肿瘤分期以保证各个处理组中肿瘤团块的均匀性。以PBS运载工具、人源化抗-Notch3ADC、对照huNeg-8.8ADC和顺铂对N87胃模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量在表26和27中提供。数据表明抗-Notch3ADC hu28-vc0101、hu28-vc6780、hu75-vc0101和hu75-vc6780以剂量依赖性方式抑制N87胃异种移植物生长。进一步地，数据显示抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效地抑制肿瘤生长，对于具有vc0101接头-有效载荷的ADC剂量为1、3、5mg/kg，对于具有vc6780接头-有效载荷的ADC剂量为3和10mg/kg。在第133天，5mg/kg剂量的hu28-vc0101组9只动物中的6只无肿瘤，hu75-vc0101组9只动物中4只无肿瘤，对照huNeg8-8-vc0101组8只动物中1只无肿瘤。此外，数据表明具有vc0101接头-有效载荷的ADC通常比顺铂标准治疗及具有vc6780接头-有效载荷的ADC更有效。
表26：抗-Notch3-vc0101ADC在N87胃异种移植物中的效力
表27：抗-Notch3-vc6780ADC在N87胃异种移植物中的效力
也以PBS运载工具、大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC和对照huNeg-8.8ADC对N87胃模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量为5mg/kg，如图16D提供。数据表明具有不可裂解的(mc)和可裂解的(vc)接头和各种有效载荷组合的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC抑制N87胃异种移植物生长。进一步地，数据显示大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比对照huNeg8.8-ADC更有效地抑制肿瘤生长。此外，数据表明具有vc0101接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比检测的其它抗-Notch3ADC更有效。
也以PBS运载工具和大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC ch28-mc0131、ch75-mc0131、ch28-m(H2O)c-0131和ch75-m(H2O)c-0131对N87胃模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量为5mg/kg，如图16E提供。数据表明具有mc0131和m(H2O)c-0131接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC抑制N87胃异种移植物生长。进一步地，数据表明具有m(H2O)c-0131接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC比具有mc0131接头-有效载荷的大鼠-人嵌合的抗-Notch3ADC更有效。
E.OVCAR3卵巢异种移植物
如上述使用OVCAR3卵巢癌细胞系进行相似的体内实验。为了产生异种移植物，将SCID无毛远系繁殖(SHO)的雌性小鼠皮下植入在50％Matrigel(BD Biosciences)中的5×106个OVCAR3细胞。当肿瘤达到120-290mm3体积时，对肿瘤分期以保证各个处理组中肿瘤团块的均匀性。以PBS运载工具、人源化抗-Notch3ADC hu28-vc0101和对照ADChuNeg-8.8-vc0101对OVCAR3模型进行经静脉内Q4d×4给药；及以紫杉醇进行经腹膜内Q7d×4给药(30mg/kg，一天两次)及以卡铂进行经腹膜内Q7d×8给药，剂量在表28中提供。图15和表28表明hu28-vc0101以剂量依赖性方式抑制OVCAR3卵巢异种移植物生长。进一步地，数据显示hu28-vc0101比对照huNeg8.8-vc0101和卡铂标准化疗更有效地抑制肿瘤生长。此外，数据表明3mg/kg Q4d×4剂量的hu28-vc0101与在60mg/kg Q7d×4剂量的紫杉醇具有相似效力，所述紫杉醇的剂量是在SHO小鼠中最大紫杉醇耐受剂量。
表28：抗-Notch3ADC hu28-vc0101在OVCAR3卵巢异种移植物中的效力
实施例17：产生半胱氨酸突变体以进行位点特异性缀合
在先前实施例中描述的抗-Notch3ADC通过接头-有效载荷与靶抗体的半胱氨酸氨基酸残基常规的非特异性缀合产生。进行接头-有效载荷与抗体的位点特异性缀合，以促进同质药物荷载及避免具有潜在改变的抗原结合或药代动力学性质的ADC亚群产生，其可以在通过常规缀合方法产生的一些ADC中观测到。一种这样的位点特异性缀合策略已经设计为在靶抗体的氨基酸序列的特定位点导入半胱氨酸残基。鉴定恒定重链和恒定轻链中的一些氨基酸位置，如国际专利公开No.WO/2013/093809中描述，及在hu28抗体的特定氨基酸位置用半胱氨酸残基取代。
位点特异性半胱氨酸取代被工程化进Fc多肽或者人IgG1重链恒定区(Cy)的位置L443和K392(本文称作L443C和K392C)。位点特异性半胱氨酸取代被工程化进人κ轻链恒定区(Cκ)多肽的位置K183(本文称作κK183C)。半胱氨酸突变体的CDR保持与亲代野生型hu28相同。图17A和17B提供了具有所述位点特异性半胱氨酸取代的hu28抗体的氨基酸和核苷酸序列。hu28抗体中半胱氨酸取代导致如下抗体产生：hu28-(L443C)，hu28-(L443C/K392C)和hu28-(L443C/κK183C)。所有半胱氨酸突变均通过定向诱变构建，如国际专利公开第WO/2013/093809号中描述。这些突变体抗体的表达构建体在位点特异性整合(SSI)表达载体(Lonza)中产生以在CHO细胞中稳定表达。建立表达半胱氨酸突变体抗体的转染的CHO细胞的稳定集合并产生条件培养基。应用标准蛋白质A亲和性纯化随后大小排阻层析，以从条件培养基中纯化抗-Notch3半胱氨酸突变体抗体，如先前实施例中所述。
实施例18：半胱氨酸突变体的表征
如先前实施例中描述，在基于细胞的ELISA中筛选未缀合的半胱氨酸突变体人源化抗-Notch3抗体与表达Notch3的细胞系在细胞表面结合活性。表29显示从未缀合的半胱氨酸突变体hu28-(L443C)、hu28-(L443/K382)和hu28-(L443/κK183C)的细胞表面Notch3结合ELISA中计算的EC50(nM)值。数据表明半胱氨酸突变体抗体具有与亲代野生型hu28抗体结合在U2OS/hNotch3、HCC2429和OVCAR3细胞表面表达的全长人Notch3相似的EC50值。进一步地，数据表明人源化hu28抗体的重链或者重链和轻链的恒定区中半胱氨酸的氨基酸取代不影响或改变其结合特性。阴性对照huNeg8.8抗体不结合所检测的任何细胞系。对于没有结合(LB)的对照抗体，如所表示的未产生EC50值。
表29：未缀合的半胱氨酸突变体抗-Notch3抗体的EC50(nM)值
实施例19：半胱氨酸突变体ADC的体外细胞毒性测定
马来酰亚胺功能化的接头-有效载荷与抗-Notch3hu28半胱氨酸突变体抗体的缀合通过在100mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液)pH 7.0和1mM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)中在37℃用过量100倍摩尔的三(2-羧基乙基)磷化氢(TCEP)完全还原抗体2小时及随后脱盐以除去过量的TCEP而实现。将还原的抗体在2mM脱氢抗坏血酸(DHA)、100mMHEPES,pH 7.0和1mM DTPA中在4℃温育16小时，以重新形成链间二硫键。在脱盐后，在反应混合物中加入vc0101接头-有效载荷，接头-有效载荷/抗体的摩尔比率为大约7，在存在15％v/v二甲基乙酰胺(DMA)条件下在25℃反应1小时。在1小时温育后，加入6倍过量的L-Cys以终止任何未反应的接头-有效载荷。将反应混合物在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中在4℃透析过夜，及通过SEC(AKTA explorer,Superdex 200)纯化。将ADC通过纯度SEC、疏水性相互作用层析(HIC)和液相层析电喷射离子化串联质谱分析(LC-ESI MS)进一步表征，以计算药物-抗体比率(荷载)。蛋白质浓度通过UV分光光度计确定。另外的缀合技术在国际专利公开第WO/2013/093809号中描述。
这种方法产生抗-Notch3半胱氨酸突变体ADC：hu28-(L443C)-vc0101和hu28-(L443C/κK183C)-vc0101。抗-Notch3半胱氨酸突变体ADC的活性在内源性表达Notch3蛋白的细胞系上评估：HCC2429(肺癌)和OVCAR3(卵巢癌)，如先前实施例中所述使用MTS细胞存活力指示器进行。
表30显示抗-Notch3半胱氨酸突变体ADC处理的IC50(ng Ab/mL)值。数据表明DAR＝3.9的hu28-(L443C/κK183C)-vc0101是有活性的，且与DAR＝3.9的野生型hu28-vc0101ADC具有相似的效力，其在表达Notch3的癌细胞系HCC2429和OVCAR3中均诱导细胞死亡。数据进一步表明DAR＝2的单一半胱氨酸突变体hu28-(L443)-vc0101及DAR＝4的非靶向的对照huNeg8.8ADC在检测的最高剂量具有最低活性。
表30：半胱氨酸突变体人源化抗-Notch3ADC的IC50(ng Ab/mL)值
实施例20：半胱氨酸突变体ADC的体内作用
如先前实施例所述使用抗-Notch3半胱氨酸突变体ADC进行相似的体内实验，使用OVCAR3卵巢细胞系。以PBS运载工具、hu28-vc0101、抗-hu28-(L443C)-vc0101、hu28-(L443C/κK183C)-vc0101和对照huNeg-8.8ADC对OVCAR3模型进行经静脉内Q4d×4给药，剂量在表31中提供。数据表明双重半胱氨酸突变体hu28-(L443C/κ183C)-vc0101抑制OVCAR3卵巢异种移植物生长，在3mg/kg剂量活性与野生型hu28-vc0101相似，但是在1mg/kg剂量活性较低。数据进一步表明DAR＝2的单一半胱氨酸突变体hu28-(L443C)-vc0101在体内是有效的，但是在1mg/kg和3mg/kg剂量活性均比野生型hu28-vc0101和hu28-(L443C/κK183C)-vc0101低。数据表明通过位点特异性缀合产生的抗-Notch3半胱氨酸突变体ADC在体内是有效的，抑制肿瘤生长。
表31：抗-Notch3半胱氨酸突变体ADC在OVCAR3卵巢异种移植物中的体内效力

Claims (45)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其结合Notch3，所述抗体或抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:13的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区及包含SEQ ID NO:25的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段：
(a)内在化到细胞中，
(b)不抑制Notch3信号传导，或者
(c)不激活Notch3信号传导。
3.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段：
(a)结合Notch3NRR的LNR-C和HD-1结构域，
(b)不将Notch3NRR保持在自身抑制性构象，或者
(c)不抑制S2-裂解。
4.分离的抗体或其抗原结合片段，其结合Notch3，所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)包含SEQ ID NO:15或16的重链CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:19或20的重链CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:23的重链CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27的轻链CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:29的轻链CDR2；及
(f)包含SEQ ID NO:31的轻链CDR3。
5.权利要求1-4任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:13具有至少90％相同性的重链可变区氨基酸序列或者与SEQID NO:25具有至少90％相同性的轻链可变区氨基酸序列。
6.权利要求5的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:13的重链可变区氨基酸序列。
7.权利要求5或6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ IDNO:25的轻链可变区氨基酸序列。
8.权利要求1-7任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQID NO:33的重链氨基酸序列。
9.权利要求1-8任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQID NO:35的轻链氨基酸序列。
10.分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO:37的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，及包含SEQ ID NO:49的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
11.分离的抗体或其抗原结合片段，其结合Notch3，所述抗体或抗原结合片段包含：
(a)包含SEQ ID NO:39或40的重链CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:43或44的重链CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:47的重链CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:51的轻链CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:53的轻链CDR2；及
(f)包含SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
12.权利要求10或11的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQID NO:37具有至少90％相同性的重链可变区氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:49具有至少90％相同性的轻链可变区氨基酸序列。
13.权利要求12的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ IDNO:37的重链可变区氨基酸序列。
14.权利要求12或13的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ IDNO:49的轻链可变区氨基酸序列。
15.权利要求10-14任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:57的重链氨基酸序列。
16.权利要求10-15任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:59的轻链氨基酸序列。
17.分离的抗体或其抗原结合片段，其与权利要求1-16任一项的抗体竞争结合Notch3和/或与权利要求1-16任一项的抗体结合Notch3相同的表位。
18.抗体-药物缀合物，其包含与权利要求1-17任一项的抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性剂。
19.如下式所示抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p
或者其药物可接受的盐，其中：
(a)Ab是结合Notch3的抗体或其抗原结合片段；
(b)L-D是接头-药物部分，其中L是接头，D是药物；及
(c)p是从1至大约12的整数。
20.如下式所示抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)p
或者其药物可接受的盐，其中：
(a)Ab是权利要求1-17任一项的抗体或其抗原结合片段；
(b)L-D是接头-药物部分，其中L是接头，D是药物；及
(c)p是从1至大约12的整数。
21.权利要求19或20的抗体-药物缀合物，其中L选自vc、mc、me和MalPeg6C2。
22.权利要求21的抗体-药物缀合物，其中D选自：
(a)0101(2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)，
(b)6780(2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)，
(c)0131(2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐)，
(d)3377(N,2-二甲基丙氨酰-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐)，及
(e)8261(2-甲基丙氨酰-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。
23.权利要求22的抗体-药物缀合物，其中L-D选自：
具有下式的vc0101：
及具有下式的vc6780：
24.权利要求19-23任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO:13的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；及(b)包含SEQID NO:25的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
25.权利要求19-24任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO:15的重链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:19的重链CDR2；(c)包含SEQ ID NO:23的重链CDR3；(d)包含SEQ ID NO:27的轻链CDR1；(e)包含SEQ ID NO:29的轻链CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:31的轻链CDR3。
26.权利要求19-23任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO:37的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；及(b)包含SEQID NO:49的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
27.权利要求19-23或26任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含：(a)包含SEQ ID NO:39的重链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的重链CDR2；(c)包含SEQ ID NO:47的重链CDR3；(d)包含SEQ ID NO:51的轻链CDR1；(e)包含SEQ ID NO:53的轻链CDR2；及(f)包含SEQ ID NO:55的轻链CDR3。
28.权利要求19-25任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含工程化的人IgG1重链恒定结构域(Cy)多肽，所述Cy多肽选自：(a)在如SEQ IDNO:61所示的位置L443具有一个氨基酸取代，及(b)在如SEQ ID NO:65所示的位置L443和K392具有两个氨基酸取代，根据Kabat的EU索引。
29.权利要求19-25任一项的抗体-药物缀合物，其中Ab包含工程化的人κ轻链恒定结构域(CK)多肽，所述CK多肽在如SEQ ID NO:63所示的位置K183具有一个氨基酸取代，根据Kabat的EU索引。
30.一种药物组合物，其包含权利要求1-17任一项的抗体或其抗原结合片段或者权利要求18-29任一项的抗体-药物缀合物，及药物可接受的运载体。
31.一种治疗有需要的患者中与Notch3表达相关的病症的方法，包括给该患者施用权利要求18-29任一项的抗体-药物缀合物或者权利要求30的药物组合物。
32.权利要求31的方法，其中所述病症是癌症。
33.权利要求32的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。
34.权利要求33的方法，其中所述实体瘤癌症选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌和肉瘤。
35.权利要求32的方法，其中所述癌症是血液癌症，选自T-细胞恶性肿瘤、T-细胞白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、B-细胞恶性肿瘤、髓系恶性肿瘤、急性髓性白血病及慢性髓性白血病。
36.权利要求18-29任一项的抗体-药物缀合物，或者权利要求28的药物组合物，用于治疗中的应用。
37.权利要求18-29任一项的抗体-药物缀合物在生产用于治疗的药物中的应用。
38.权利要求36或37的应用，其中所述应用是治疗表达Notch3的癌症。
39.编码权利要求1-17任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸。
40.包含权利要求39的核酸的载体。
41.包含权利要求40的载体的宿主细胞。
42.一种产生抗体的方法，包括培养权利要求41的宿主细胞及从培养物回收抗体。
43.一种产生权利要求19-29任一项的抗体-药物缀合物的方法，包括：
(a)连接L与D；
(b)将L-D与权利要求42的从培养物回收的抗体缀合；及
(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
44.一种预测患有癌症的对象对权利要求18-29任一项的抗体-药物缀合物是否有应答的方法，包括确定来自该对象的生物学样品是否表达Notch3。
45.一种确定生物学样品中Notch3水平的方法，包括以下步骤：
(a)将来自疑似患有癌症的对象的样品与权利要求1-17任一项的抗体或其抗原结合片段接触；
(b)确定样品中Notch3的细胞表面水平；及
(c)与参考对象或标准比较Notch3的细胞表面水平。
CN201380069303.2A 2012-11-07 2013-11-04 抗-notch3抗体及抗体-药物缀合物 Pending CN104903351A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261723772P 2012-11-07 2012-11-07
US61/723,772 2012-11-07
US201361889744P 2013-10-11 2013-10-11
US61/889,744 2013-10-11
PCT/IB2013/059893 WO2014072897A1 (en) 2012-11-07 2013-11-04 Anti-notch3 antibodies and antibody-drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104903351A true CN104903351A (zh) 2015-09-09

Family

ID=49585464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380069303.2A Pending CN104903351A (zh) 2012-11-07 2013-11-04 抗-notch3抗体及抗体-药物缀合物

Country Status (19)

Country Link
US (2) US9433687B2 (zh)
EP (1) EP2917240A1 (zh)
JP (2) JP2016505513A (zh)
KR (1) KR20150082548A (zh)
CN (1) CN104903351A (zh)
AR (1) AR093377A1 (zh)
AU (1) AU2013343045A1 (zh)
BR (1) BR112015010436A2 (zh)
CA (1) CA2890571A1 (zh)
HK (1) HK1214282A1 (zh)
IL (1) IL238567A0 (zh)
MX (1) MX2015005810A (zh)
PE (1) PE20150892A1 (zh)
PH (1) PH12015501000A1 (zh)
RU (1) RU2015116480A (zh)
SA (1) SA515360395B1 (zh)
SG (1) SG11201503469WA (zh)
TW (3) TWI589590B (zh)
WO (1) WO2014072897A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105968038A (zh) * 2016-05-09 2016-09-28 湖北华世通生物医药科技有限公司 二肽类化合物的盐酸盐及其制备方法
CN108753833A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9907659B2 (en) 2007-04-17 2018-03-06 Biomet Manufacturing, Llc Method and apparatus for manufacturing an implant
US8603180B2 (en) 2006-02-27 2013-12-10 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular alignment guides
US8608749B2 (en) 2006-02-27 2013-12-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guides and associated instruments
US9173661B2 (en) 2006-02-27 2015-11-03 Biomet Manufacturing, Llc Patient specific alignment guide with cutting surface and laser indicator
US8608748B2 (en) 2006-02-27 2013-12-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient specific guides
US9113971B2 (en) 2006-02-27 2015-08-25 Biomet Manufacturing, Llc Femoral acetabular impingement guide
US10278711B2 (en) 2006-02-27 2019-05-07 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific femoral guide
US8568487B2 (en) 2006-02-27 2013-10-29 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific hip joint devices
US8535387B2 (en) 2006-02-27 2013-09-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific tools and implants
US8591516B2 (en) 2006-02-27 2013-11-26 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific orthopedic instruments
US9289253B2 (en) 2006-02-27 2016-03-22 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific shoulder guide
US9918740B2 (en) 2006-02-27 2018-03-20 Biomet Manufacturing, Llc Backup surgical instrument system and method
US8407067B2 (en) 2007-04-17 2013-03-26 Biomet Manufacturing Corp. Method and apparatus for manufacturing an implant
US8377066B2 (en) 2006-02-27 2013-02-19 Biomet Manufacturing Corp. Patient-specific elbow guides and associated methods
US7967868B2 (en) 2007-04-17 2011-06-28 Biomet Manufacturing Corp. Patient-modified implant and associated method
US20150335438A1 (en) 2006-02-27 2015-11-26 Biomet Manufacturing, Llc. Patient-specific augments
US9345548B2 (en) 2006-02-27 2016-05-24 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific pre-operative planning
US8092465B2 (en) 2006-06-09 2012-01-10 Biomet Manufacturing Corp. Patient specific knee alignment guide and associated method
US9339278B2 (en) 2006-02-27 2016-05-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guides and associated instruments
US9795399B2 (en) 2006-06-09 2017-10-24 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific knee alignment guide and associated method
ES2413087T3 (es) * 2006-06-13 2013-07-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer
US9458465B2 (en) 2007-12-04 2016-10-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods to modulate cell membrane resealing
US7981866B2 (en) * 2006-07-11 2011-07-19 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey MG53 compositions and methods of use
GB2442441B (en) * 2006-10-03 2011-11-09 Biomet Uk Ltd Surgical instrument
EP2125887A4 (en) 2007-01-24 2010-11-10 Oncomed Pharm Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER
EP2899211A1 (en) 2008-07-08 2015-07-29 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
DE102009028503B4 (de) 2009-08-13 2013-11-14 Biomet Manufacturing Corp. Resektionsschablone zur Resektion von Knochen, Verfahren zur Herstellung einer solchen Resektionsschablone und Operationsset zur Durchführung von Kniegelenk-Operationen
US8632547B2 (en) 2010-02-26 2014-01-21 Biomet Sports Medicine, Llc Patient-specific osteotomy devices and methods
US9271744B2 (en) 2010-09-29 2016-03-01 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific guide for partial acetabular socket replacement
KR101496794B1 (ko) 2010-11-05 2015-02-27 유니버시티 오브 메디신 앤드 덴티스트리 오브 뉴 저지 조직 손상에 대한 진단 마커로서의 혈청 ｍｇ５３
US9968376B2 (en) 2010-11-29 2018-05-15 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific orthopedic instruments
US9241745B2 (en) 2011-03-07 2016-01-26 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific femoral version guide
US8715289B2 (en) 2011-04-15 2014-05-06 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific numerically controlled instrument
US8668700B2 (en) 2011-04-29 2014-03-11 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific convertible guides
US8956364B2 (en) 2011-04-29 2015-02-17 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific partial knee guides and other instruments
SG194886A1 (en) * 2011-05-11 2013-12-30 Riesbeck Healthcare Sweden Ab Protein f - a novel haemophilus influenzae adhesin with laminin and vitronectin binding properties
US8532807B2 (en) 2011-06-06 2013-09-10 Biomet Manufacturing, Llc Pre-operative planning and manufacturing method for orthopedic procedure
US9084618B2 (en) 2011-06-13 2015-07-21 Biomet Manufacturing, Llc Drill guides for confirming alignment of patient-specific alignment guides
US8764760B2 (en) 2011-07-01 2014-07-01 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific bone-cutting guidance instruments and methods
US8597365B2 (en) 2011-08-04 2013-12-03 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific pelvic implants for acetabular reconstruction
US9066734B2 (en) 2011-08-31 2015-06-30 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific sacroiliac guides and associated methods
US9295497B2 (en) 2011-08-31 2016-03-29 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific sacroiliac and pedicle guides
US9386993B2 (en) 2011-09-29 2016-07-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific femoroacetabular impingement instruments and methods
US9451973B2 (en) 2011-10-27 2016-09-27 Biomet Manufacturing, Llc Patient specific glenoid guide
US9554910B2 (en) 2011-10-27 2017-01-31 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid guide and implants
EP3384858A1 (en) 2011-10-27 2018-10-10 Biomet Manufacturing, LLC Patient-specific glenoid guides
US9301812B2 (en) 2011-10-27 2016-04-05 Biomet Manufacturing, Llc Methods for patient-specific shoulder arthroplasty
KR20130046336A (ko) 2011-10-27 2013-05-07 삼성전자주식회사 디스플레이장치의 멀티뷰 디바이스 및 그 제어방법과, 디스플레이 시스템
US9060788B2 (en) 2012-12-11 2015-06-23 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guide for anterior approach
US9204977B2 (en) 2012-12-11 2015-12-08 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific acetabular guide for anterior approach
DK2935330T3 (da) 2012-12-19 2019-07-22 Aveo Pharmaceuticals Inc Anti-notch3-antistoffer
US9839438B2 (en) 2013-03-11 2017-12-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid guide with a reusable guide holder
US9579107B2 (en) 2013-03-12 2017-02-28 Biomet Manufacturing, Llc Multi-point fit for patient specific guide
US9498233B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Biomet Manufacturing, Llc. Universal acetabular guide and associated hardware
US9826981B2 (en) 2013-03-13 2017-11-28 Biomet Manufacturing, Llc Tangential fit of patient-specific guides
US9683039B2 (en) * 2013-03-14 2017-06-20 New York University Notch agonists for the treatment of cancer
WO2014159239A2 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Novartis Ag Antibodies against notch 3
US9517145B2 (en) 2013-03-15 2016-12-13 Biomet Manufacturing, Llc Guide alignment system and method
US20150112349A1 (en) 2013-10-21 2015-04-23 Biomet Manufacturing, Llc Ligament Guide Registration
US10282488B2 (en) 2014-04-25 2019-05-07 Biomet Manufacturing, Llc HTO guide with optional guided ACL/PCL tunnels
US9408616B2 (en) 2014-05-12 2016-08-09 Biomet Manufacturing, Llc Humeral cut guide
RU2747989C2 (ru) * 2014-05-28 2021-05-18 Эдженсис, Инк. Производные пептидов долапроин-долаизолейина
US9561040B2 (en) 2014-06-03 2017-02-07 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid depth control
US9839436B2 (en) 2014-06-03 2017-12-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific glenoid depth control
EA034921B1 (ru) 2014-09-28 2020-04-07 Зе Реджентс Оф Зе Юниверсити Оф Калифорния Модуляция стимулирующих и нестимулирующих миелоидных клеток
US9826994B2 (en) 2014-09-29 2017-11-28 Biomet Manufacturing, Llc Adjustable glenoid pin insertion guide
US9833245B2 (en) 2014-09-29 2017-12-05 Biomet Sports Medicine, Llc Tibial tubercule osteotomy
US9820868B2 (en) 2015-03-30 2017-11-21 Biomet Manufacturing, Llc Method and apparatus for a pin apparatus
US10226262B2 (en) 2015-06-25 2019-03-12 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific humeral guide designs
US10568647B2 (en) 2015-06-25 2020-02-25 Biomet Manufacturing, Llc Patient-specific humeral guide designs
DK3448420T3 (da) * 2016-04-29 2022-12-12 Aveo Pharmaceuticals Inc Anti-notch3-antistof
US10722310B2 (en) 2017-03-13 2020-07-28 Zimmer Biomet CMF and Thoracic, LLC Virtual surgery planning system and method
WO2018222880A1 (en) * 2017-05-31 2018-12-06 Trustees Of Boston University Mechano-activated control of gene expression
MX2020006213A (es) * 2017-12-12 2020-09-14 Pionyr Immunotherapeutics Inc Anticuerpos anti-trem2 y metodos relacionados.
US11912763B2 (en) 2018-06-17 2024-02-27 L & L Biopharma Co., Ltd. Antibody targeting CLDN18.2, bispecific antibody, ADC, and CAR, and applications thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008051797A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Genentech, Inc. Anti-notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of notch3-related diseases
WO2008057144A2 (en) * 2006-05-15 2008-05-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human notch1 and 2 and isolated lnr domains from human notch1
WO2008076960A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Genentech, Inc. Antagonist anti-notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of notch3-related diseases
WO2010005566A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch-binding agents and antagonists and methods of use thereof
WO2010141249A2 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-notch3 antibodies
WO2011041336A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using notch antagonists
WO2012131527A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates
WO2013072813A2 (en) * 2011-11-17 2013-05-23 Pfizer Inc. Cytotoxic peptides and antibody drug conjugates thereof

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US20040049014A1 (en) 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
AU689131B2 (en) 1993-10-01 1998-03-26 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Novel peptide derivative
CA2116628A1 (en) 1994-02-28 1995-08-29 Anne Marie Gisele Joutel Method for the diagnosis of cadasil
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
DK0831100T3 (da) 1995-04-21 2001-01-02 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd Nye peptidderivater
EP0780478A1 (en) 1995-12-21 1997-06-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for the indirect genotypic diagnosis of cadasil
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
FR2751986B1 (fr) 1996-08-01 1998-12-31 Inst Nat Sante Rech Med Gene implique dans le cadasil, methode de diagnostic et application therapeutique
US5985837A (en) 1998-07-08 1999-11-16 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
EP1117778A2 (en) 1998-10-02 2001-07-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Methods and compositions for inducing differentiation and apoptosis in cells that overexpress the notch protein
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2003020934A1 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to colon specific genes and proteins
JP2005526701A (ja) 2001-11-14 2005-09-08 ロランティス リミテッド 内科療法
US20050137130A1 (en) 2001-11-14 2005-06-23 Bodmer Mark W. Medical treatment
CA2465304A1 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Composition comprising inhibitors of the notch signalling pathway for the modulation of the immune system
US20060275287A1 (en) 2002-06-21 2006-12-07 Brad St Croix Scroll compressor
AU2003295328A1 (en) 2002-10-02 2004-04-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20060263774A1 (en) 2002-11-01 2006-11-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
US7282203B2 (en) 2003-11-26 2007-10-16 Health Research, Inc. Use of NOTCH pathway interfering agents for treatment of plasma cell disorders
US20070077245A1 (en) 2004-08-04 2007-04-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. NOTCH mutations leading to increased receptor signaling
WO2006053063A2 (en) 2004-11-05 2006-05-18 The Regents Of The University Of California Notch-1 assay to detect neurodegenerative diseases
WO2006094269A2 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Covx Technologies Ireland Limited Anti-angiogenic compounds
US8871720B2 (en) 2005-07-07 2014-10-28 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus
US20090305310A1 (en) 2005-11-22 2009-12-10 University Of Vermont And State Agricultural College Methods for Determining Notch Signaling and Uses Thereof
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
WO2007103114A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Notch inhibition in the treatment or prevention of atherosclerosis
UA102061C2 (ru) 2006-10-19 2013-06-10 Дженентек, Інк. Агонистическое антитело к notch3 и его применение для лечения notch3- ассоциированных заболеваний
ES2636089T3 (es) 2006-10-27 2017-10-05 Genentech, Inc. Anticuerpos e inmunoconjugados y usos para los mismos
US7807630B2 (en) 2007-09-14 2010-10-05 Vanderbilt University Targeting of Notch3 receptor function for cancer therapy
CN101969970B (zh) 2007-10-12 2014-10-15 西雅图基因公司 用抗体-药物偶联物联合治疗
WO2009117531A1 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
CA2720763A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the notch pathways and uses thereof
EP3505636A1 (en) 2009-04-27 2019-07-03 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PE20121494A1 (es) 2009-06-18 2012-11-01 Pfizer Anticuerpos anti notch-1
WO2011140295A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 President And Fellows Of Harvard College Modulators of notch receptor signaling and methods of use thereof
JP5913307B2 (ja) 2010-07-12 2016-04-27 コヴェックス・テクノロジーズ・アイルランド・リミテッド 多機能性抗体複合体
WO2012058137A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof
EP2635310A2 (en) 2010-11-05 2013-09-11 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
US9603894B2 (en) 2010-11-08 2017-03-28 President And Fellows Of Harvard College Materials presenting notch signaling molecules to control cell behavior
CA2821130C (en) 2010-12-15 2017-11-07 Wyeth Llc Anti-notch1 antibodies
WO2012080891A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Rinat Neuroscience Corp. Anti-notch-1 antibodies
CA2862798C (en) 2011-02-17 2021-04-06 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Multicomponent compositions and their uses
JP2015502397A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008057144A2 (en) * 2006-05-15 2008-05-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human notch1 and 2 and isolated lnr domains from human notch1
WO2008051797A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Genentech, Inc. Anti-notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of notch3-related diseases
WO2008076960A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Genentech, Inc. Antagonist anti-notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of notch3-related diseases
WO2010005566A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch-binding agents and antagonists and methods of use thereof
WO2010141249A2 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-notch3 antibodies
WO2011041336A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using notch antagonists
WO2011041336A3 (en) * 2009-09-30 2012-05-03 Genentech, Inc. Treating notch1-antagonist-resistant cancer (s) using notch3 antagonists
WO2012131527A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates
WO2013072813A2 (en) * 2011-11-17 2013-05-23 Pfizer Inc. Cytotoxic peptides and antibody drug conjugates thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DORONINA SVETLANA O等: "Novel peptide linkers for highly potent antibody-auristatin conjugate", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》 *
KANG LI等: "Modulation of Notch Signaling by Antibodies Specific for the Extracellular Negative Regulatory Region of NOTCH3", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
SVETLANA O. DORONINA等: "Enhanced Activity of Monomethylauristatin F through Monoclonal Antibody Delivery:Effects of Linker Technology on Efficacy and Toxicity", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》 *
WENDY R GORDON等: "Structual basis for autoinhibition of Notch", 《NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY》 *
WU YAN等: "Therapeutic antibody targeting of individual Notch receptors", 《NATURE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105968038A (zh) * 2016-05-09 2016-09-28 湖北华世通生物医药科技有限公司 二肽类化合物的盐酸盐及其制备方法
CN108753833A (zh) * 2018-05-28 2018-11-06 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法
CN108753833B (zh) * 2018-05-28 2021-12-03 上海海洋大学 斑马鱼notch3基因突变体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
SA515360395B1 (ar) 2017-06-07
TW201431880A (zh) 2014-08-16
TWI589590B (zh) 2017-07-01
TW201604207A (zh) 2016-02-01
CA2890571A1 (en) 2014-05-15
US20140127211A1 (en) 2014-05-08
SG11201503469WA (en) 2015-06-29
HK1214282A1 (zh) 2016-07-22
IL238567A0 (en) 2015-06-30
US20170014526A1 (en) 2017-01-19
EP2917240A1 (en) 2015-09-16
JP2017186337A (ja) 2017-10-12
WO2014072897A1 (en) 2014-05-15
AR093377A1 (es) 2015-06-03
KR20150082548A (ko) 2015-07-15
US9433687B2 (en) 2016-09-06
MX2015005810A (es) 2015-09-23
TW201726746A (zh) 2017-08-01
PE20150892A1 (es) 2015-06-11
AU2013343045A1 (en) 2015-05-21
RU2015116480A (ru) 2016-12-27
BR112015010436A2 (pt) 2017-08-22
JP2016505513A (ja) 2016-02-25
PH12015501000A1 (en) 2015-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104903351A (zh) 抗-notch3抗体及抗体-药物缀合物
US11332542B2 (en) Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof
CN105017420B (zh) 针对整联蛋白αvβ6的抗体和使用该抗体治疗癌症
KR102428492B1 (ko) 엽산 수용체 1의 검출을 위한 항체 및 분석
EP3095797A1 (en) Anti dll3 antibodies and methods of use thereof
EP2589609A1 (en) Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
TW202045536A (zh) 抗ｃｄ２２８抗體及抗體－藥物共軛體
US20190330353A1 (en) Igf-1r antibody and its use as addressing vehicle for the treatment of cancer
KR102649942B1 (ko) 클라우딘 18.2를 표적화하는 항체-약물 콘쥬게이트
CA3012270A1 (en) Endosialin-binding antibody
AU2013369339A1 (en) Anti-LAMP1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof
US20220169747A1 (en) Anti-her2 binding molecules
WO2024109944A1 (zh) 抗liv-1抗体、其药物偶联物及其医药用途
AU2019232796B2 (en) Antibodies to MUC16 and methods of use thereof
NZ624989B2 (en) Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1214282

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150909

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1214282

Country of ref document: HK