JP2005526701A - 内科療法 - Google Patents

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Abstract

癌の治療に用いる薬剤の製造において、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤が用いられる。

Description

本発明は、特にＮｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用のモジュレーターの使用による、免疫機能の調節及び／又は癌の治療に関する。
国際特許公開ＷＯ９８／２０１４２は、免疫療法、並びにＴ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療において、どのようにＮｏｔｃｈシグナリング経路の操作を用い得るかを記載している。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、Ｔ細胞系の腫瘍誘発異常、並びにたとえばマラリア原虫種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュウドモナス、トキソプラスマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキシカラに起因する感染症を標的にすることができる。
感染寛容と称される過程である、抗原特異的寛容を他のＴ細胞に伝えることのできるある種の調節性Ｔ細胞の産生が可能であることも示されている（ＷＯ９８／２０１４２）。これらの細胞の機能活性は、それらの細胞表面、又は抗原提示細胞の表面におけるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質の過剰発現によって模倣され得る。特に、調節性Ｔ細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質のＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅファミリーのメンバーの過剰発現によって生じ得る。１つの抗原エピトープに特異的なＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ誘導Ｔ細胞は、同一抗原又は関連抗原の他のエピトープを認識するＴ細胞に寛容を伝えることもでき、これは「エピトープ拡散」と称される現象である。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現は、癌においても役割を果たす。実際、アップレギュレートされたＮｏｔｃｈリガンド発現が、いくつかの腫瘍細胞で観察されている。これらの腫瘍細胞は、特定の抗原による再刺激に対するＴ細胞不応答性を付与することができ、したがって腫瘍細胞がどのように正常なＴ細胞応答を妨げるかという説明を提供する。Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのＮｏｔｃｈシグナリングのダウンレギュレーションは、腫瘍特異抗原を認識するそれらのＴ細胞で、腫瘍細胞が免疫寛容を誘導するのを妨げるために用いることができる。次いで、これによりＴ細胞が腫瘍細胞に対する免疫応答を開始することが可能になる（ＷＯ００／１３５９９０）。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、及びそれにより影響を受ける状態の説明は、本出願人等の公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（１９９７年１１月６日出願であり、１９９６年１１月７日出願のＧＢ９６２３２３６．８、１９９７年７月２４日出願のＧＢ９７１５６７４．９、及び１９９７年９月１１日出願のＧＢ９７１９３５０．２の優先権を主張、ＷＯ９８／２０１４２として公開）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（１９９９年１２月１５日出願であり、１９９９年１２月１５日出願のＧＢ９８２７６０４．１の優先権を主張、ＷＯ００／３６０８９として公開）、及びＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（２０００年１１月１７日出願であり、１９９９年１１月１８日出願のＧＢ９９２７３２８．６の優先権を主張、ＷＯ０１３５９９０として公開）に見出すことができる。ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（ＷＯ９８／２０１４２）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（ＷＯ００／３６０８９）、及びＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（ＷＯ０１３５９９０）のそれぞれを、参照により本明細書の一部とする。
ＷＯ９８／２０１４２ ＷＯ００／１３５９９０ ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（１９９７年１１月６日出願であり、１９９６年１１月７日出願のＧＢ９６２３２３６．８、１９９７年７月２４日出願のＧＢ９７１５６７４．９、及び１９９７年９月１１日出願のＧＢ９７１９３５０．２の優先権を主張、ＷＯ９８／２０１４２として公開） ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（１９９９年１２月１５日出願であり、１９９９年１２月１５日出願のＧＢ９８２７６０４．１の優先権を主張、ＷＯ００／３６０８９として公開） ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（２０００年１１月１７日出願であり、１９９９年１１月１８日出願のＧＢ９９２７３２８．６の優先権を主張、ＷＯ０１３５９９０として公開） ＵＳ５４２８１３０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ） ＵＳ６１２１０４５（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ） ＷＯ９７／０１５７１ ＷＯ９６／２７６１０ ＷＯ９２／１９７３４ Ｇｅｙｓｅｎ、１９８４年９月１３日公開の欧州特許第０１３８８５５号 ＵＳ６２８１３４４（Ｐｈｙｌｏｓ） ＵＳ−Ａ−２００２０１１９５４０ ＵＳ５６４８４６４ ＵＳ５８４９８６９ ＵＳ６００４９２４ ＷＯ００２０５７６ ＵＳ５８５９２０５ ＥＰ−Ａ−０１２０６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ） ＥＰ−Ａ−０１２５０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．及びＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ） ＥＰ−Ａ−０１７１４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ） ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） ＷＯ８６／０１５３３（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ） ＥＰ−Ａ−０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒ） ＷＯ８９／０７４５２（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ） ＷＯ９０／０７８６１、Ｑｕｅｅｎ等 ＧＢ０１１８１５３．６の優先権を主張する本出願人等の同時係属国際特許出願 ＷＯ９１／１３２８１ ＥＰ３１１８６３Ｂ ＵＳ６０２５３４１ ＵＳ５０５７５４０ ＷＯ９６／０２５５５ ＧＢ２２２０２１１ ＥＰ０３２５４８９ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．等、１９９５及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、及び１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、１９９２及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ Ｔａｍｕｒａ Ｋ等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４１６〜１４２３ Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：２２５〜２３２ Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ等（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：７７０〜７７６ Ｌｉｅｂｅｒ等（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ７（１０）：１９４９〜６５ Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ Ｅ．Ｈ．等（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９３（６６８３）：３８２〜６ Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ、Ｓｔｒｕｈｌ Ｇ等（１９９８）Ｃｅｌｌ９３（４）：６４９〜６０ Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ Ｇ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０：３６３〜３６９ Ｌｕ Ｆ．Ｍ．等（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ９３（１１）：５６６３〜７ Ｍｕｎｒｏ Ｓ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｍ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：８１３〜８２０ Ｊｕ ＢＪ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０５：１９１〜１９５ Ｍｏｌｏｎｅｙ ＤＪ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０６：３６９〜３７５ Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｋ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０６：４１１〜４１５ Ｐａｎｉｎ ＶＭ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８７：９０８〜９１２ Ｈｉｃｋｓ Ｃ等（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：５１５〜５２０ Ｉｒｖｉｎｅ ＫＤ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．９：４３４〜４４１ Ｏｓｂｏｒｎｅ Ｂ、Ｍｉｅｌｅ Ｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１１：６５３〜６６３ Ｍａｔｓｕｎｏ等（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１（８）：２６３３〜４４ Ｍａｔｓｕｎｏ Ｋ等（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：７４〜７８ Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ等（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２２３０〜２２３９ Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ Ｋ．等（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６９（７）：１５０〜６ Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ Ｃ．等（１９９９）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ８５（１−２）：１７３〜７ ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ Ｔ．等（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３５（３）：４７３〜８５ Ｈｓｉｅｈ等（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６（３）：９５２〜９５９ Ｓｔｒｏｂｌ等（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ７４（４）：１７２７〜３５ Ｋｕｓａｎｏ及びＲａａｂ−Ｔｒｕａｂ（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５（１）：３８４〜３９５ Ｇ．Ｃｅｓａｒｉｎｉ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０７（１）：６６〜７０（１９９２年７月） Ｈ．Ｇｒａｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６１：１６９〜１７６（１９９３） Ｃ．Ｓｕｍｍｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３７５６〜３７６０（１９９２年５月） Ａｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０ Ｗｏｏｔｔｏｎ及びＦｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：１４９〜１６３ Ｃｌａｖｅｒｉｅ及びＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：１９１〜２０１ Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、１９８７、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ １５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ Ｇａｕｔｉｅｒ等、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１ Ｉｎｏｕｅ等、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８ Ｉｎｏｕｅ等、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０ Ｓｔｅｉｎ等（１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９） Ｓａｒｉｎ等、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８〜７４５１ Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８） Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６、１９８８） Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４、１９８８） Ｎｅａｎｓ Ｇ．Ｅ．及びＦｅｅｎｅｙ Ｒ．Ｅ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４、３９〜４３頁 Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８ Ｒｅｅｓ等、１９８８、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２０５３〜２０６１ Ｋｎｕｓｔ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．７６１〜７６６ Ｒｏｔｈｂｅｒｇ等、１９８８、Ｃｅｌｌ５５：１０４７〜１０５９ Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８９１〜１８９７ Ｓｕｄｈｏｆ等、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：８１５〜８２２ Ｋｕｒｏｓａｗａ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６３：５９９３〜５９９６ Ａｐｐｅｌｌａ等、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４３７〜４４４０ Ｂｒｕｔｌａｇ等（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７〜２４５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５） Ｇｌｕｃｋ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２、１０、９１５〜９２０ Ｂａｒｒｙ等、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９４、１６、６１６〜６１９ Ｄａｖｉｓ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３、１１、１８４７〜１８５１ Ｔａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３５６、１５２〜１５４ Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、３３３８〜３３４４ Ｗｏｌｆｆ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２４７、１４６５〜１４６８ Ｃｏｘ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、５６６４〜５６６７ Ｆｙｎａｎ等、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３、１２、７８５〜７８９ Ｕｌｍｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、２５９、１７４５〜１７４９ Ｘｉａｎｇ等、Ｖｉｒｏｌ．１９９４、１９９、１３２〜１４０ Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖｏｌｌｅｒ等編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８ Ｉｎａｂａ Ｋ等（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１１５７〜１１６７ Ｃａｕｘ Ｃ等、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８〜２６１ Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９〜１１１８ Ｃｏｆｆｉｎ ＲＳ等（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１８〜７２２ Ｗｉｇｚｅｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：２３、１９６９ Ｍａｇｅ等、Ｊ．Ｉｍｎｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５：４７、１９７７ Ｗｙｓｏｃｋｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：２８４４、１９７８ Ｓｃｈｒｅｍｐｆ−Ｄｅｃｋｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．３２：２８５、１９８０ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ等、Ｃｅｌｌ、４４：６５３、１９８６ Ｇｅｅ等、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．８０：１５４、１９８８ Ｇｒｉｆｆｉｎ等、Ｂｌｏｏｄ、６３：９０４、１９８４ Ｈａｒａ等、Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＩＩＩ，Ｒａｐｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ２８ｋＤ／３２ｋＤ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｅａｒｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＥＡ−１）ｂｙ １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｍｉｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１９８８（１９８６） Ｃｏｓｕｌｉｃｈ等、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＬＲ３）Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｓｔｅｐ ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ、８４：４２０５（１９８７） 「Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ」Ｌｅｗｉｓ Ｃ．Ｅ．及びＪ．Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９２、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ．「Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ」Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９、４７号、１８７〜３７６頁 「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ」の第７章「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｍａｋ Ｔ．Ｗ．及びＪ．Ｊ．Ｌ．Ｓｉｍａｒｄ、１９９８
本発明は、特にＮｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を改変することによる、癌を治療するため、特に癌に対する免疫応答を促進するためのさらなる方法を提供することを目的とする。
本発明の第１の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、
ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＥＧＦドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＥＧＦドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
好ましくは、この方法は、癌に対する免疫応答を促進することを含む。好ましくは、この方法は、癌抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を促進又は増強することを含む。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＥＧＦドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＥＧＦドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法が提供される。
好ましくは、そのような方法において、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、癌抗原又は癌抗原決定基、或いは癌抗原又は癌抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドと同時、個別、又は順次組み合わせで投与される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む癌ワクチンが提供される。
好ましくは、このワクチンはさらに、癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含む。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
好ましくは、この製品は、癌に対する免疫応答を促進するために用いられる。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＥＧＦドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するＥＧＦドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
適切には、そのような製品は、薬剤組成物又はキットの形態を取ることができる。
適切には、そのような製品は、癌を治療するための治療ワクチン組成物又はキット（いわゆる「ファーマクチン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅ）」を含む）の形態を取ることができる。
適切には、タンパク質又はポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＦｃ）ドメイン、たとえばヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃドメインなどの異種アミノ酸配列と融合している。
適切には、タンパク質又はポリペプチドはさらに、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインを含む。
好ましい実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、癌に対する免疫応答を促進するために用いられる。
好ましくは、本発明は、癌又は腫瘍に対する免疫応答の増大、好ましくは、癌又は腫瘍抗原又は抗原決定基に対する免疫応答の増大、好ましくは、癌細胞に対するＴ細胞活性の増大を提供する。
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤」及び「Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤」という用語は、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化を生じる、又は活性化から生じる（かつ活性化を含む）任意の１つ又は複数の上流又は下流の事象を低減することのできる任意の因子を含む。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドの発現をダウンレギュレートすることによって作用しない。
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、ＡＰＣ、Ｂ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞においてＮｏｔｃｈシグナリングを阻害する。
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤は、内因性Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用（「Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用」とも称される）を妨げるように、Ｎｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈリガンドと相互作用する、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する因子である。そのような因子は、「Ｎｏｔｃｈアンタゴニスト」と称することができる。好ましくは、この阻害剤は、リンパ球及びＡＰＣなどの免疫細胞において、好ましくはリンパ球、好ましくはＴ細胞において、Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用を阻害する。
一実施形態において、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｄｅｌｔａの細胞外ドメイン、或いはその断片、誘導体、又は相同体のドメインを含む又はコードすることができる。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｓｅｒｒａｔｅ又はＪａｇｇｅｄの細胞外ドメイン、或いはその断片、誘導体、又は相同体のドメインを含む又はコードする。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン、或いはその断片、誘導体、又は相同体のドメインを含む又はコードする。
好ましくは２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを有するタンパク質又はポリペプチドを用いる利点は、競合アゴニスト活性をほとんど又はまったく伴わない有効なＮｏｔｃｈシグナリングの阻害を提供し、したがってより選択的な阻害作用を提供することである。そのようなタンパク質及びポリペプチドは、特に、たとえば細菌発現系においてより容易に生じることもできる。
或いは、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、抗体、抗体断片、又は抗体誘導体、或いは抗体、抗体断片、又は抗体誘導体をコードするポリペプチドを含むことができる。適切には、抗体、抗体断片、又は抗体誘導体は、Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用を妨げるように、Ｎｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、約１０００μＭ未満、好ましくは約１００μＭ未満、好ましくは約１０μＭ未満、好ましくは約１０００ｎＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、適切には約０．１から約１００ｎＭのＩＣ５０（好ましくは実施例１２のＤｙｎａｂｅａｄｓアッセイを用いて、好ましくは本明細書に記載のアッセイにおいて測定）を有することができる。
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメイン及び免疫グロブリンＦｃセグメント（たとえば、ＩｇＧ１Ｆｃ又はＩｇＧ４Ｆｃ、好ましくはヒトＩｇＧ１Ｆｃ又はヒトＩｇＧ４Ｆｃ）のドメインを含む融合タンパク質、或いはそのような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むことができる。そのような融合タンパク質の調製に適した方法は、たとえばＷＯ９８／２０１４２の実施例２に記載されている。ＩｇＧ融合タンパク質は、たとえばＵＳ５４２８１３０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に記載されているように、当分野でよく知られているとおり調製することができる。
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤は、タンパク質又はポリペプチド対間の化学的架橋又はジスルフィド結合の形成によって、多量体化、好ましくは２量体化することができる。たとえば、タンパク質又はポリペプチドが免疫グロブリンＦｃドメインの形態で異種アミノ酸配列を含む場合、これらはＦｃドメイン間に形成されたジスルフィド結合によって結合した２量体に集めることができる（たとえば添付の図に示す２量体コンストラクトの概略図を参照のこと）。
タンパク質又はポリペプチドがこのように多量体化又は２量体化されている場合、その多量体化／２量体化形態は、個々の単量体に関して記載されているより多くのＤＳＬ及びＥＧＦドメインを含有することができる。しかしながら、ＤＳＬとＥＧＦの比は、たとえば多量体化集合体全体としてＤＳＬとＥＧＦ様ドメインの比が１：０、１：１、又は１：２となるように、好ましくは変化しない。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｉｉ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
そのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
そのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
本明細書では、「本質的にからなるもの（ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｃｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、同定された配列及びドメインを含むが、実質的に他の配列又はドメインを含まない、特に実質的に他の任意のＮｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド配列又はドメインを含まないコンストラクトを意味する。
疑いを避けるために、「含む」という用語は、任意の追加の特徴又は成分が存在できることを意味する。
本発明の他の態様によれば、第１及び第２の配列を含むコンジュゲートであって、第１の配列は、癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含み、第２の配列は、Ｎｏｔｃｈシグナリング調節のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドを含むコンジュゲートが提供される。
本明細書では、「癌抗原又は抗原決定基」或いは「腫瘍抗原又は抗原決定基」という用語は、好ましくは、癌細胞に存在し（又は関連し）、典型的に正常細胞に存在しない抗原又は抗原決定基、或いは正常（非癌）細胞に存在するより多い量で癌細胞に存在する抗原又は抗原決定基、或いは正常（非癌）細胞に見出されるものとは異なる形態で癌細胞に存在する抗原又は抗原決定基を意味する。
癌抗原には、たとえば（非限定的に）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータ鎖（ｈＣＧベータ）抗原、癌胎児抗原、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原、ＧｌｏｂｏＨ抗原、ＧＭ２抗原、ＧＰ１００抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、ＫＳＡ抗原、Ｌｅ（ｙ）抗原、ＭＵＣＩ抗原、ＭＡＧＥ１抗原、ＭＡＧＥ２抗原、ＭＵＣ２抗原、ＭＵＣ３抗原、ＭＵＣ４抗原、ＭＵＣ５ＡＣ抗原、ＭＵＣ５Ｂ抗原、ＭＵＣ７抗原、ＰＳＡ抗原、ＰＳＣＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、ＴＲＰ１抗原、ＴＲＰ２抗原、腫瘍特異免疫グロブリン可変領域及びチロシナーゼ抗原が含まれる。
本発明の他の態様によれば、第１及び第２の配列を含むコンジュゲートであって、第１の配列は、癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含み、第２の配列は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を含む又はコードするコンジュゲートが提供される。
好ましくは、コンジュゲートは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターをコードしている第１のポリヌクレオチド配列、及び癌抗原又は抗原決定基をコードしている第２のポリヌクレオチド配列を含むベクターの形態である。
好ましくは、コンジュゲートは、発現ベクターの形態である。
好ましくは、そのようなコンジュゲートにおいて、第１のポリヌクレオチド配列は、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド、或いはその断片、誘導体、相同体、類似体、又は対立遺伝子変異体をコードする。
適切には、コンジュゲートの第１のポリヌクレオチド配列は、Ｄｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄタンパク質、或いはその断片、誘導体、相同体、類似体、又は対立遺伝子変異体をコードする。
適切には、コンジュゲートの第１のポリヌクレオチド配列は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び任意選択で少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドをコードする。
適切には、コンジュゲートの第１のポリヌクレオチド配列は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び少なくとも２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドをコードする。
適切には、コンジュゲートの第１のポリヌクレオチド配列は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドをコードする。
適切には、コンジュゲートの第１及び第２のポリヌクレオチド配列は、それぞれ１つ又は複数のプロモーターに機能可能に結合している。
本発明の一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで患者に投与される。或いは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に投与し、その後、細胞を患者に投与することができる。
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、白血球、線維芽細胞、又は上皮細胞においてＮｏｔｃｈシグナリングを改変する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、樹状細胞、リンパ球、若しくはマクロファージ、又はそれらの前駆体若しくは組織特異誘導体、或いは癌細胞においてシグナリングを改変する。
好ましくは、本発明で用いられるＮｏｔｃｈシグナリング又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用の阻害剤である。適切には、そのようなＮｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用の阻害剤は、内因性Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を妨げ、同時に内因性Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用から生じるよりも低いＮｏｔｃｈ受容体の活性化をもたらすか、好ましくは著しい活性化をもたらさないように、Ｎｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する因子である。たとえば、阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ受容体のＥＧＦ様ドメイン１１及び／又はＥＧＦ様ドメイン１２、或いはＤｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、又はＪａｇｇｅｄなどのＮｏｔｃｈリガンドのＤＳＬドメイン及び／又はＥＧＦ様ドメイン１及び／又はＥＧＦ様ドメイン２に結合することができる。したがって、たとえば、阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ受容体のＥＧＦ様ドメイン１１及び１２を含むことができる。或いは、阻害剤は、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、又はＪａｇｇｅｄなどのＮｏｔｃｈリガンドのＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン及び少なくとも１つのＥＧＦ様ドメインを含むことができる。適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞外ドメイン、たとえばＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４の細胞外ドメインを含むことができる。或いは、阻害剤は、Ｄｅｌｔａ（たとえば、哺乳動物Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４）、Ｓｅｒｒａｔｅ、又はＪａｇｇｅｄ（たとえば、哺乳動物Ｊａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２）などのＮｏｔｃｈリガンドの細胞外ドメインを含むことができる。
阻害剤がＮｏｔｃｈ受容体に結合する場合、阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ１などの１つのＮｏｔｃｈ受容体に選択的に結合することができ、或いは適切には、それらの類似構造により、一連のＮｏｔｃｈ受容体、又は実質的にそれらのすべてに対してある程度の親和性を有することができる。同様に、阻害剤がＮｏｔｃｈリガンドに結合する場合、阻害剤は、Ｄｅｌｔａ１などの１つのＮｏｔｃｈリガンドに選択的に結合することができ、或いは適切には、それらの類似構造により、一連のＮｏｔｃｈリガンド、又は実質的にそれらのすべてに対してある程度の親和性を有することができる
或いは、阻害剤は、１つ又は複数のＮｏｔｃｈ受容体に特異的に結合する抗体を含むことができる。好ましくは、抗体は、その抗体は結合するが、天然Ｎｏｔｃｈリガンドの結合を低減するか、実質的に妨げる、或いは少なくともＮｏｔｃｈ受容体の活性化を低減するか、実質的に妨げるように、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する。適切には、たとえば、そのような抗体は、Ｎｏｔｃｈ受容体（たとえば、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及び／又はＮｏｔｃｈ４）のＥＧＦ１１及び／又は１２に結合することができる。抗体は、Ｎｏｔｃｈ１などの１つのＮｏｔｃｈ受容体に選択的であることができ、或いは適切には、それらの類似構造により、一連のＮｏｔｃｈ受容体、又は実質的にそれらのすべてに対してある程度の親和性を有することができる。
或いは、阻害剤は、１つ又は複数のＮｏｔｃｈリガンドに特異的に結合する抗体を含むことができる。好ましくは、抗体は、その抗体は結合するが、天然Ｎｏｔｃｈ受容体へのリガンドの結合を低減するか、実質的に妨げる、或いは少なくともＮｏｔｃｈ受容体の活性化を低減するか、実質的に妨げるように、Ｎｏｔｃｈリガンドに結合する。適切には、たとえば、そのような抗体は、Ｎｏｔｃｈリガンド（たとえば、哺乳動物Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１、又はＪａｇｇｅｄ２）のＤＳＬドメイン及び／又はＥＧＦ様ドメイン１及び／又は２に結合することができる。抗体は、Ｄｅｌｔａ１などの１つのＮｏｔｃｈリガンドに選択的であることができ、或いは適切には、それらの類似構造により、一連のＮｏｔｃｈリガンド、又は実質的にそれらのすべてに対してある程度の親和性を有することができる。
相補的特異性を有する抗体の組み合わせを用いてもよいことが理解される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを投与することによって、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）を投与することによって、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することによって、癌に対する免疫応答を改変する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを投与することによって、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）を投与することによって、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することによって、癌に対する免疫応答を増大する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを投与することによって、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）を投与することによって、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することによって、癌細胞に対する免疫寛容を低減する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを投与することによって、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）を投与することによって、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することによって、腫瘍細胞に対するＴ細胞活性を改変する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを投与することによって、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）を投与することによって、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することによって、腫瘍細胞に対するヘルパー（ＴＨ）又は細胞傷害性（ＴＣ）Ｔ細胞活性を増大する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを投与することによって、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）を投与することによって、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することによって、調節性Ｔ細胞の活性を低減する方法が提供される。
適切には、調節性Ｔ細胞は、Ｔｒ１又はＴｈ３調節性Ｔ細胞である。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いるための、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが提供される。
本発明の他の態様によれば、癌の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、或いはポリヌクレオチドであって、
本質的に以下の成分からなる、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｉｉ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、或いはポリヌクレオチドが提供される。
本発明の他の態様によれば、癌に対する免疫応答を促進する薬剤の製造における、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍に対する免疫寛容を低減する薬剤の製造における、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍に対するＴ細胞活性を増大する薬剤の製造における、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍に対するヘルパー（ＴＨ）又は細胞傷害性（ＴＣ）Ｔ細胞活性を増大する薬剤の製造における、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、任意選択で薬剤として許容される担体との組み合わせで、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択で１つ又は２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む薬剤組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、任意選択で薬剤として許容される担体との組み合わせで、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｉｉ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む薬剤組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、任意選択で薬剤として許容される担体との組み合わせで、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１つのＥＧＦリピートドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む薬剤組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、任意選択で薬剤として許容される担体との組み合わせで、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む薬剤組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、
ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメイン、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数のさらなる異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１つのＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２つのＥＧＦドメイン、及び
ｉｉｉ）任意選択で１つ又は複数の異種アミノ酸配列、
或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、
或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
本発明の他の態様によれば、上述のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本発明はさらに、そのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本発明の他の態様によれば、その表面に上述のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをディスプレイし、かつ／又はそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞が提供される。
適切には、タンパク質又はポリペプチドは、細胞に結合していない。或いは、タンパク質又はポリペプチドは、細胞結合性であることができる。
一実施形態において、タンパク質又はポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃセグメントのすべて又は一部に対応する異種アミノ酸配列と融合していることができる。好ましくは、特にＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドが、２つのみのＥＧＦリピートドメインを含む場合、異種アミノ酸配列は、ＴＳＳＴ配列ではなく、好ましくはスーパー抗原配列ではない。
好ましくは、タンパク質又はポリペプチドは、哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列の少なくとも一部を含む。
適切には、タンパク質又はポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、又はＪａｇｇｅｄのＮｏｔｃｈリガンドドメイン、或いはそれらに対して少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性（又は好ましくは同一性）を有するドメインを含む。
適切には、タンパク質又はポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１、又はＪａｇｇｅｄ２のＮｏｔｃｈリガンドドメイン、或いはそれらに対して少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性（又は好ましくは同一性）を有するドメインを含む。
好ましくは、このタンパク質又はポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ受容体を阻害する。適切には、このタンパク質又はポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈシグナリングアンタゴニストである。
本発明の他の態様によれば、上述のタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが提供される。本発明の他の態様によれば、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
本発明の他の態様によれば、その表面に上述のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをディスプレイし、かつ／又はそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞が提供される。
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例として、添付の図面を参照してより詳細に記載する。
本発明の実施は、別段の指示のないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の通常の技法を用い、それらは当分野の技術者の能力の範囲内である。そのような技法は文献に説明されている。たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．等（１９９５及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、及び１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、並びにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ（１９９２及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を参照されたい。それぞれの全般的な原文を参照により本明細書の一部とする。
疑いを避けるために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び脊椎動物名は交換可能に用いられ、すべての相同体は、本発明の範囲内である。
Ｎｏｔｃｈシグナリング
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」という表現は、「Ｎｏｔｃｈシグナリング経路」という表現と同義であり、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化を生じる、又は活性化から生じる（かつ活性化を含む）任意の１つ又は複数の上流又は下流の事象を指す。
好ましくは、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」によって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用の活性化又は阻害、Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンド発現又は活性のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション、並びにたとえばＮｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂、及びＲａｓ−Ｊｎｋシグナリング経路のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを含む、Ｎｏｔｃｈシグナリング変換の活性化又は阻害を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化又は阻害の直接上流又は下流の任意の事象を指す。
したがって、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」によって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ受容体タンパク質と遺伝子及び／又は分子的に相互作用する因子を含むシグナル変換経路としてのＮｏｔｃｈシグナリング経路を指す。たとえば、分子及び遺伝子両方に基づいてＮｏｔｃｈタンパク質と相互作用する因子は、単に例として、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＤｅｌｔｅｘである。遺伝子的にＮｏｔｃｈタンパク質と相互作用する因子は、単に例として、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｓｕ（Ｈ）、及びプレセニリンである。
一態様において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、細胞外又は細胞膜で起こるシグナリング事象を含む。他の態様において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、細胞内、たとえば細胞質内部、又は細胞核内部で起こるシグナリング事象を含む。
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター
本明細書では、「調節する」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、又はその標的シグナリング経路の生物活性の変化及び変更を指す。「モジュレーター」という用語は、好ましくはＮｏｔｃｈシグナリングのアンタゴニスト又は阻害剤、すなわち少なくともある程度、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の正常な生物活性を遮断する化合物を指す。好都合には、そのような化合物は、本明細書において阻害剤又はアンタゴニストと呼ぶことができる。好ましくは、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのアンタゴニスト、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体のアンタゴニスト（たとえば、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及び／又はＮｏｔｃｈ４受容体のアンタゴニスト）である。
Ｎｏｔｃｈ受容体のアンタゴニストは、好ましくは、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合して、シグナリングの活性化を低減又は阻害する因子である。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ受容体のアンタゴニストは、ＡＰＣ、Ｂ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞においてＮｏｔｃｈに結合する。
或いは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｎｏｔｃｈリガンドに結合して、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合する、かつ／又はＮｏｔｃｈ受容体を活性化するそれらの能力を低減することができる。好ましくは、そのような阻害剤は、ＡＰＣ、Ｂ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞においてＮｏｔｃｈリガンドに結合する。
本発明の活性因子は、有機化合物又は他の化学物質であることができる。一実施形態において、モジュレーターは、２つ以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物である。本明細書では、「ヒドロカルビル基」という用語は、少なくともＣ及びＨを含み、任意選択で１つ又は複数の他の適切な置換基を含む基を意味する。そのような置換基の例には、ハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環式基などが含まれる。置換基が環式基である可能性に加えて、置換基の組み合わせが環式基を形成することもできる。ヒドロカルビル基が２つ以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、それらの炭素の少なくとも２つは、適切な元素又は基を介して結合していることができる。したがって、ヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含有することができる。適切なヘテロ原子は、当分野の技術者に明らかであり、たとえば硫黄、窒素、及び酸素が含まれる。候補モジュレーターは、少なくとも１つの環式基を含むことができる。環式基は、非縮合多環式基などの多環式基であることができる。いくつかの適用例の場合、この因子は、他のヒドロカルビル基に結合した少なくとも１つの前記環式基を含む。
好ましい一実施形態において、モジュレーターは、アミノ酸配列、又はその化学的誘導体、或いはそれらの組み合わせである。他の好ましい実施形態において、モジュレーターは、ヌクレオチド配列であり、これはセンス配列又はアンチセンス配列であることができる。モジュレーターは、抗体であることもできる。
モジュレーターは、合成化合物、又は天然単離化合物であることができる。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の非常に重要な成分は、Ｎｏｔｃｈ受容体／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用である。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈリガンド又は受容体、或いは結果として生じる開裂産物の発現、性質、量、又は活性の変化を含み得る。さらに、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路膜タンパク質又はＧタンパク質、或いはＮｏｔｃｈシグナリング経路酵素、たとえばプロテアーゼ、キナーゼ（たとえばセリン／トレオニンキナーゼ）、ホスファターゼ、リガーゼ（たとえばユビキチンリガーゼ）、又はグリコシルトランスフェラーゼの発現、性質、量、又は活性の変化を含み得る。或いは、シグナリングは、ＤＮＡ結合因子、たとえば転写因子などの発現、性質、量、又は活性の変化を含み得る。
本発明の好ましい形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは特異なシグナリングであり、検出されたシグナルが、たとえばサイトカインシグナリングなどの他の著しい干渉又は競合要因ではなく、実質的に又は少なくとも主としてＮｏｔｃｈシグナリング経路、好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用に起因することを意味する。したがって、好ましい実施形態において、本明細書で「Ｎｏｔｃｈシグナリング」という用語は、サイトカインシグナリングを除外する。したがって、好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター又は阻害剤はサイトカインでなく、好ましくはミトゲンではない。
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｄｅｌｔａ及び／又はＳｅｒｒａｔｅなどのＮｏｔｃｈシグナリングの発現を阻害又はダウンレギュレートすることによって主として作用する因子ではない。したがって、そのような阻害又はダウンレギュレーションは、Ｎｏｔｃｈシグナリングモジュレーターの主要な様式の作用の結果として起こる可能性があるが、好ましくはモジュレーターの主たる様式の作用でないことが理解される。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングモジュレーターの主たる様式の作用は、免疫細胞にすでに発現しているＮｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンド間の相互作用を調節（好ましくは、阻害）することである。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路は、以下により詳しく記載する。
Ｎｏｔｃｈ依存性転写活性化の重要な標的は、エンハンサーオブスプリット複合体（Ｅ［ｓｐｌ］）の遺伝子である。さらに、これらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接の標的であり、Ｎｏｔｃｈシグナリングに応答して転写活性化されることが示されている。ＥＢＮＡ２から類推して、哺乳動物Ｓｕ（Ｈ）相同体ＣＢＦ１と相互作用して、おそらく他のタンパク質と連携してそれを転写リプレッサーから転写アクチベーター、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインに転換するウイルスコアクチベータータンパク質は、Ｓｕ（Ｈ）と結合して活性化ドメインに寄与することができ、それによってＳｕ（Ｈ）がＥ（ｓｐｌ）並びに他の標的遺伝子の転写を活性化することが可能になる。Ｓｕ（Ｈ）はすべてのＮｏｔｃｈ依存性決定に必要とされるわけではなく、これはＮｏｔｃｈが他のＤＮＡ結合転写因子と連携して、又は細胞外シグナルを変換する他の機構を用いて一部の細胞運命選択を媒介することを示唆していることにも留意されたい。
一実施形態において、この活性因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈリガンドをコードしているポリヌクレオチドであることができる。本発明に有用なＮｏｔｃｈリガンドには、典型的に種々の哺乳動物細胞、たとえば造血幹細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することのできる内因性Ｎｏｔｃｈリガンドが含まれる。
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して、生物学的作用をもたらすことのできる因子を意味する。この用語には、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅなどの天然タンパク質リガンド、及び同等の活性を有する人工／修飾コンストラクトが含まれる。
今日までに同定されている哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンドの特定の例には、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａ又はＤｅｌｔａ様１（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＦ００３５２２、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＦ０８４５７６、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、及びＤｅｌｔａ様３（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＮＭ＿０１６９４１）、及びＵＳ６１２１０４５（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、Ｄｅｌｔａ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＢ０４３８９４及びＡＦ２５３４６８、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、並びにＳｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１及びＳｅｒｒａｔｅ−２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、及びＷＯ９２／１９７３４）、Ｊａｇｇｅｄ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号Ｕ７３９３６、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）及びＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＦ０２９７７８、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、並びにＬＡＧ−２が含まれる。ファミリーメンバー間の相同性は広範である。
知られている哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンドのさらなる相同体は、標準的な技法を用いて同定することができる。「相同体」によって、たとえば上に記載した知られているＮｏｔｃｈリガンドの任意の１つに対して、配列相同性、アミノ酸又は核酸配列相同性を示す遺伝子産物を意味する。典型的に、知られているＮｏｔｃｈリガンドの相同体は、対応する知られているＮｏｔｃｈリガンドに対して、そのＮｏｔｃｈリガンドの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、適切には少なくとも１００のアミノ酸の配列に渡って、又は全長に渡って、アミノ酸レベルで少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％同一である。２つ以上のアミノ酸又は核酸配列間の配列相同性を算出する技法及びソフトウエアは、当分野でよく知られている（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
今日までに同定されているＮｏｔｃｈリガンドは、タンパク質のアミノ末端に２０から２２個のアミノ酸を含む診断用ＤＳＬドメイン（Ｄ．Ｄｅｌｔａ、Ｓ．Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌ．Ｌａｇ２）、及び細胞外表面に１４個まで、又はそれ以上のＥＧＦ様リピートを有する。したがって、Ｎｏｔｃｈリガンドの相同体も、Ｎ末端にＤＳＬドメイン、及び細胞外表面に１４個まで、又はそれ以上のＥＧＦ様リピートを含むことが好ましい。
さらに、適切な相同体は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合することができる。結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを含む種々の知られている技法によって評価することができる。
Ｎｏｔｃｈリガンドの相同体は、いくつかの方法で同定することができ、たとえば、中から高ストリンジェンシー条件下（たとえば、約５０℃から約６０℃で０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）Ｎｏｔｃｈリガンドをコードしている核酸のすべて又は一部を含むプローブでゲノム又はｃＤＮＡライブラリをプローブすることによる。或いは、相同体は、一般に保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。このプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを有する配列のクローニングに用いられるより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤の活性又は発現を模倣又は増強することによっても達成できる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するためのポリペプチドには、任意のＮｏｔｃｈシグナリング阻害剤の活性又は発現を模倣又は増強することのできる分子が含まれる。好ましくは、この分子は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の下流成分の発現又は活性において低減を生じることのできる化合物の生成又は活性を増大するポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。そのような分子には、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリー、及び増殖因子、たとえば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、及びアクチビンなど、それらの誘導体、断片、変異体、及び相同体が含まれる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するためのタンパク質、又はそのようなタンパク質をコードしているポリヌクレオチドによって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、或いはＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の１つ又は複数の成分を阻害することのできる分子を意味する。
一実施形態において、この分子は、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド発現を低減又は防止することができる。そのような分子は、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド発現を低減又は防止することのできる核酸配列であることができる。
適切には、この核酸配列は、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリー、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、及びアクチビンなどの増殖因子から選択されたポリペプチドをコードする。好ましくは、この因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド、たとえばノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体の発現において増大を生じることのできる化合物の生成を低減する又は妨げるポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。
或いは、この核酸配列は、Ｎｏｔｃｈリガンド、及びＮｏｔｃｈリガンド発現をアップレギュレートすることのできるポリペプチド、たとえばノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体から選択されたポリペプチドをコードしているセンスヌクレオチド配列由来のアンチセンスコンストラクトであることができる。
しかしながら、好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を阻害することのできる分子である。分子は、Ｎｏｔｃｈとその天然リガンドとの相互作用を、好ましくは治療効果を提供するために充分な程度に阻害することができる場合、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節するとみなすことができる。
Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節する因子は、たとえば抗体、抗体断片又は誘導体、ペプチド、有機低分子、ペプチド擬似体などであることができる。抗体は好ましい因子である。そのような抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、完全又は短縮型であることができ、かつたとえば異種、同種、又は同系であることができる。
たとえば、Ｎｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈリガンドに結合することのできる抗体は、本発明に従って正常なＮｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を阻害するために用いることができる。
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用」という表現は（「Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用」という用語と交換可能に用いることができる）、Ｎｏｔｃｈファミリーメンバーと、そのような１つ又は複数のメンバーと結合することのできるリガンドとの間の相互作用を意味する。
ある因子は、Ｎｏｔｃｈとそのリガンドとの相互作用を、好ましくは治療効果を提供するために充分な程度に阻害することができる場合、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を阻害するとみなすことができる。
オリゴペプチド及びペプチドは好ましい因子であることができるが、コンビナトリアルライブラリなどの他の供給源は、必要な結合特性を有するオリゴペプチド以外の化合物を提供する。
非ペプチド因子には多数の化学種が含まれるが、典型的に、それらは有機分子、好ましくは約５０から約２５００ダルトンの分子量を有する有機低分子である。適切な因子は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、しばしば、たとえばアミノ、カルボニル、カルボキシル、ヒドロキシル、又はスルフヒドリル基から選択された少なくとも１つの基、好ましくは少なくとも２つのそのような官能化学基を含む。化合物は、たとえば、１つ又は複数のそのような官能基で置換された環式若しくは複素環式構造及び／又は芳香族若しくは多環芳香族構造であることができる。
適切には、この因子は、ヒトＮｏｔｃｈのヒトＤｅｌｔａ及び／又はＳｅｒｒａｔｅとの結合を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、又は１００％遮断する。
好ましくは、阻害剤が、受容体、又は受容体をコードしている核酸配列であるとき、受容体は活性化される。したがって、たとえば、因子が核酸配列であるとき、受容体は、好ましくは発現時に構成的に活性である。
Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤にはさらに、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の下流阻害剤、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現を妨げる、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路によって抑制される遺伝子の発現を誘導する化合物が含まれる。そのようなタンパク質の例には、Ｄｓｈ又はＮｕｍｂ、及びＮｏｔｃｈＩＣ又はＤｅｌｔｅｘの優性陰性型が含まれる。Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するためのタンパク質にはさらに、それらの存在がシグナリング経路を変換するのではなく遮断するように修飾されているＮｏｔｃｈシグナリング経路の野生型成分の変異体が含まれる。そのような化合物の例は、その細胞内ドメインのタンパク質分解性開裂がもはや可能でないように修飾されているＮｏｔｃｈ受容体である。
Ｎｏｔｃｈシグナリング変換
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路は、胚において二分細胞運命決定を方向づける。Ｎｏｔｃｈは、２種の異なるリガンド、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅの受容体として機能する膜貫通タンパク質としてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで最初に記載された。脊椎動物は、複数のＮｏｔｃｈ受容体及びリガンドを発現する（以下で論じる）。今日までヒト細胞において、少なくとも４種のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、及びＮｏｔｃｈ−４）が同定されている（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ 寄託番号ＡＦ３０８６０２、ＡＦ３０８６０１、及びＵ９５２９９、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを参照のこと）。
Ｎｏｔｃｈタンパク質は単一ポリペプチド前駆体として合成され、これはフリン様コンバターゼによって開裂を受け、２つのポリペプチド鎖を生じ、さらに処理されて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体は、２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解性開裂産物のヘテロ２量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部分、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなるＣ末端断片を含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化するＮｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂段階は、ゴルジ装置で起こり、フリン様コンバターゼによって媒介される。
Ｎｏｔｃｈ受容体は、３６までの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピートを含有する細胞外ドメイン［Ｎｏｔｃｈ１／２＝３６、Ｎｏｔｃｈ３＝３４、Ｎｏｔｃｈ４＝２９］、３つのシステインリッチリピート（Ｌｉｎ−Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）リピート）、及び細胞質ドメインを含有する膜貫通サブユニットからなるヘテロ２量体分子として膜に挿入される。Ｎｏｔｃｈの細胞質ドメインは、６つのアンキリン様リピート、ポリグルタミンストレッチ（ＯＰＡ）、及びＰＥＳＴ配列を含有する。ＲＡＭ２３と称されるさらなるドメインは、アンキリンリピートに近接して位置し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのへアレスのサプレッサー［Ｓｕ（Ｈ）］、及び脊椎動物のＣＢＦ１として知られる転写因子への結合に関与する（Ｔａｍｕｒａ Ｋ等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４１６〜１４２３（Ｔａｍｕｒａ））。Ｎｏｔｃｈリガンドはさらに、すべてのＮｏｔｃｈリガンドの特徴である、システインリッチＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ Ｌａｇ２）ドメインと共に、細胞外ドメインに複数のＥＧＦ様リピートを示す（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：２２５〜２３２、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ等（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：７７０〜７７６）。
Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＳｃａｂｒｏｕｓなどの細胞外リガンドの、Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインのＥＧＦ様リピートへの結合によって活性化される。Ｄｅｌｔａは、活性化のために開裂を必要とする。これは細胞表面においてＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼＫｕｚｂａｎｉａｎによって開裂され、この開裂事象はＤｅｌｔａの可溶性かつ活性な形態を放出する。ＴＡＮ−１としても知られる、短縮型細胞外ドメインを有するヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発癌性変異体は、構成的に活性であり、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメインリピートは、細胞内シグナル変換タンパク質との物理的相互作用を媒介する。もっとも顕著には、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートは、へアレスのサプレッサー［Ｓｕ（Ｈ）］と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｃプロモーター結合因子１［ＣＢＦ−１］、エプスタイン−バーウイルス誘発性のＢ細胞不朽化に関与する哺乳動物ＤＮＡ結合タンパク質のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同体である。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）は細胞質のｃｄｃ１０／アンキリンリピートと結合し、隣接細胞のリガンドＤｅｌｔａとのＮｏｔｃｈ受容体の相互作用により、核に転移することが実証されている。Ｓｕ（Ｈ）は、いくつかの遺伝子のプロモーターに見出される応答因子を含み、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の重要な下流タンパク質であることが知られている。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Ｈａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている。
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）はさらに、直接核機能を有する（Ｌｉｅｂｅｒ等（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ７（１０）：１９４９〜６５（Ｌｉｅｂｅｒ））。最近の研究は実際に、Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６つのｃｄｃ１０／アンキリンリピートが核に達し、転写活性化に関与する必要のあることを示している。Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部におけるタンパク質分解性開裂の部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間（部位３、又はＳ３と称される）であることが同定されている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ Ｅ．Ｈ．等（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９３（６６８３）：３８２〜６（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ））。核内移行のためにｃｄｃ１０／アンキリンリピートを放出するタンパク質分解性開裂段階は、プレセニリン活性に依存すると考えられている。
細胞内ドメインは、核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）と転写アクチベーター複合体を形成することが示されている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ、Ｓｔｒｕｈｌ Ｇ等（１９９８）Ｃｅｌｌ９３（４）：６４９〜６０（Ｓｔｒｕｈｌ））。このＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ Ｇ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０：３６３〜３６９（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ））。このＮｏｔｃｈの核機能は、哺乳動物Ｎｏｔｃｈ相同体に関しても示されている（Ｌｕ Ｆ．Ｍ．等（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ９３（１１）：５６６３〜７（Ｌｕ））。
Ｓ３プロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に応答してのみ起こる。Ｇｏｌｇｉの初期Ｎｏｔｃｈ受容体の翻訳後修飾（Ｍｕｎｒｏ Ｓ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｍ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：８１３〜８２０（Ｍｕｎｒｏ）、Ｊｕ ＢＪ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０５：１９１〜１９５（Ｊｕ））は、少なくともある程度、細胞表面での２種のリガンドの発現を制御すると考えられる。Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｌｉｎ／Ｎｏｔｃｈモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素Ｆｒｉｎｇｅによって細胞外ドメインで修飾される。Ｆｒｉｎｇｅは、ＥＧＦ様リピートにＯ結合フコース基を添加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（Ｍｏｌｏｎｅｙ ＤＪ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０６：３６９〜３７５（Ｍｏｌｏｎｅｙ）、Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｋ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０６：４１１〜４１５（Ｂｒｕｃｋｅｒ））。このＦｒｉｎｇｅによる修飾は、リガンド結合を妨げないが、Ｎｏｔｃｈにおけるリガンド誘導性コンフォメーション変化に影響を及ぼす可能性がある。さらに最近の研究は、Ｆｒｉｎｇｅの作用はＮｏｔｃｈのＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドとの機能的な相互作用を妨げるが、Ｄｅｌｔａとの選択的な結合を許容することを示唆している（Ｐａｎｉｎ ＶＭ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８７：９０８〜９１２（Ｐａｎｉｎ）、Ｈｉｃｋｓ Ｃ等（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：５１５〜５２０（Ｈｉｃｋｓ））。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは単一のＦｒｉｎｇｅ遺伝子を有するが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Ｒａｄｉｃａｌ、Ｍａｎｉｃ、及びＬｕｎａｔｉｃ Ｆｒｉｎｇｅｓ）（Ｉｒｖｉｎｅ ＫＤ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．９：４３４〜４４１（Ｉｒｖｉｎｅ））。
Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル変換は、２つの異なる経路によって起こり得る（図１）。より明確な経路は、核に転移し、ＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）と転写アクチベーター複合体を形成する、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）のタンパク質分解性開裂を含む。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈはさらに、細胞質ジンクフィンガー含有タンパク質Ｄｅｌｔｅｘを含むＣＢＦ−１非依存性の様式でシグナルを伝達することもできる。ＣＢＦ１とは異なり、Ｄｅｌｔｅｘは、Ｎｏｔｃｈ活性化後に核に移動せず、その代わりに、Ｇｒｂ２と相互作用し、Ｒａｓ−Ｊｎｋシグナリング経路を調節する。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の標的遺伝子には、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓファミリーの遺伝子（特にＨｅｓ−１）、スプリットのエンハンサー［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４、及びＤｌｌ−１が含まれる。
細胞内ドッキングタンパク質であるＤｅｌｔｅｘはＳｕ（Ｈ）を置換し、Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部との相互作用の部位を残す。Ｄｅｌｔｅｘは、ジンクフィンガーを含有する細胞質タンパク質である（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：２２５〜２３２、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ等（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：７７０〜７７６、Ｏｓｂｏｒｎｅ Ｂ、Ｍｉｅｌｅ Ｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１１：６５３〜６６３（Ｏｓｂｏｒｎｅ））。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインのアンキリンリピートと相互作用する。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｇｒｂ２と相互作用し、Ｒａｓ−ＪＮＫシグナリング経路を調節することによって、Ｎｏｔｃｈ経路の活性化を促進することが研究で示されている（Ｍａｔｓｕｎｏ等（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１（８）：２６３３〜４４、Ｍａｔｓｕｎｏ Ｋ等（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：７４〜７８）。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部と結合するのを妨げるドッキングタンパク質としても作用する（Ｍａｔｓｕｎｏ）。したがって、Ｓｕ（Ｈ）は核に放出され、そこで転写モジュレーターとして作用する。最近の証拠はさらに、脊椎動物Ｂ細胞系において、Ｓｕ（Ｈ）相同体ＣＢＦ１ではなくＤｅｌｔｅｘが、Ｅ４７機能阻害の原因であることを示唆している（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ等（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２２３０〜２２３９（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ））。Ｄｅｌｔｅｘの発現は、正のフィードバックループのＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｄｅｌｔｅｘ（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０５３７００に見出すことができる。
Ｈｅｓ−１（スプリット−１のヘアリーエンハンサー）（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ Ｋ．等（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６９（７）：１５０〜６（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ））は、塩基性へリックス−ループ−へリックス構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１は、ＣＤ４サイレンサーの重要な機能部位に結合し、ＣＤ４遺伝子発現の抑制をもたらす。したがって、Ｈｅｓ−１は、Ｔ細胞の運命決定に強く関与する。Ｈｅｓファミリーの他の遺伝子には、その発現もＮｏｔｃｈ活性化によってアップレギュレートされるＨｅｓ−５（哺乳動物スプリットのエンハンサー相同体）、及びＨｅｓ−３が含まれる。Ｈｅｓ−１の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｈｅｓ−１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ１６４６４に見出すことができる。
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ Ｃ．等（１９９９）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ８５（１−２）：１７３〜７（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ））は７つの遺伝子を含み、Ｅ（ｓｐｌ）及びＧｒｏｕｃｈｏのみが、変異時に可視的表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）は、Ｓｐｌｉｔ突然変異を増強する能力にちなんで命名されたものであり、ＳｐｌｉｔはＮｏｔｃｈの別名である。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体遺伝子の発現を調節することによって、Ｄｅｌｔａを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン産生を抑制することのできる、Ｔｈ２細胞によって産生された因子として、マウスにおいて最初に特徴づけられた。その後、ＩＬ−１０は、マクロファージ、ケラチノサイト、Ｂ細胞、Ｔｈ０及びＴｈ１細胞を含む他の多くの細胞型によって産生されることが示された。現在はウイルスＩＬ−１０と称されるエプスタイン−バーｂｃｒｆ１遺伝子と広範な相同性を示す。少数の免疫刺激作用が報告されているが、主として免疫抑制サイトカインとみなされる。ＩＬ−１０によるＴ細胞応答の阻害は、主として抗原提示細胞の補助的機能の低減によって媒介される。ＩＬ−１０は、マクロファージによって多数の炎症性サイトカインの産生を抑制し、共刺激分子及びＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害することが特に報告されている。ＩＬ−１０はさらに、好中球及び好酸球などの他の骨髄性細胞に抗炎症性作用を及ぼす。Ｂ細胞において、ＩＬ−１０は、アイソタイプスイッチ及び増殖に影響を及ぼす。より最近では、ＩＬ−１０が、調節性Ｔ細胞の誘発において役割を果たし、それらの抑制作用の可能な媒介物質であることが報告された。ＩＬ−１０がＮｏｔｃｈシグナリング経路の直接下流標的であるかどうかは明白でないが、その発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化と同時に強くアップレギュレートされることが認められている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＧＩ１０４１８１２に見出すことができる。
ＣＤ−２３は、Ｂ細胞活性化及び増殖の鍵分子である、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）である。これはＩｇＥの低親和性受容体である。さらに、短縮型分子が分泌され、有効なマイトジェン増殖因子として機能し得る。ＣＤ−２３の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＧＩ１７８３３４４に見出すことができる。
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球活性化タンパク質４）は、Ｔ細胞の表面に見出される補助分子であり、アレルゲン吸入後の気道炎症細胞漸増の調節及びＴヘルパー細胞分化に役割を果たすと考えられている。ＣＴＬＡ４をコードしている遺伝子のプロモーター領域は、ＣＢＦ１応答因子を有し、その発現はＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ４の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ１５００６に見出すことができる。
Ｄｌｘ−１（ディスタルレス（ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ）−１）（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ Ｔ．等（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３５（３）：４７３〜８５（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ））発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。Ｄｌｘの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ５１０００−３に見出すことができる。
ＣＤ−４発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。ＣＤ−４抗原の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＸＭ００６９６６に見出すことができる。
Ｎｕｍｂ、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、及びＤｓｈなどのＮｏｔｃｈシグナリング経路に関与する他の遺伝子、並びにその発現がＮｏｔｃｈ活性化によって調節されるすべての遺伝子は、本発明の範囲に含まれる。
上述のとおり、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーは、Ｔ細胞運命決定に影響を及ぼす細胞−細胞シグナリング事象に関与する。このシグナリングにおいて、ＮｏｔｃｈＩＣは核に局在し、活性化受容体として機能する。哺乳動物ＮｏｔｃｈＩＣは、転写リプレッサーＣＢＦ１と相互作用する。この相互作用にＮｏｔｃｈＩＣｃｄｃ１０／アンキリンリピートが不可欠であることが提示されている。Ｈｓｉｅｈ等（Ｈｓｉｅｈ等（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６（３）：９５２〜９５９）はさらに、マウスＮｏｔｃｈＩＣのＮ末端１１４アミノ酸領域が、ＣＢＦ１相互作用ドメインを含有することを示唆している。さらに、ＮｏｔｃｈＩＣは、核内のＤＮＡ結合ＣＢＦ１を標的とし、抑制ドメインのマスキングによってＣＢＦ１媒介性抑制を止めることによって作用することが提示されている。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）不朽化タンパク質ＥＢＮＡ’’も、ＣＢＦ１抑制Ｂ細胞遺伝子の発現をアップレギュレートするために、ＣＢＦ１の係留及び抑制のマスキングを利用する。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル変換の模倣は、ＥＢＶ駆動不朽化に関与する。Ｓｔｒｏｂｌ等（Ｓｔｒｏｂｌ等（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ７４（４）：１７２７〜３５）は、同様に「ＥＢＮＡ２はしたがって活性化Ｎｏｔｃｈ受容体の機能的等価物としてみなすことができる」ことを報告している。このカテゴリーにはいる他のＥＢＶタンパク質には、ＢＡＲＦ０（Ｋｕｓａｎｏ及びＲａａｂ−Ｔｒｕａｂ（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５（１）：３８４〜３９５（Ｋｕｓａｎｏ及びＲａａｂ−Ｔｒｕａｂ）及びＬＭＰ２Ａが含まれる。
任意の１つ又は複数の適切な標的、たとえばアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列などは、様々な薬剤スクリーニング技法のいずれかの技法で、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を調節することのできる化合物及び／又は標的分子を同定するために用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液に遊離しているか、固体支持体に付着しているか、細胞表面に支持されているか、又は細胞内に位置していることができる。
薬剤スクリーニングの技法は、Ｇｅｙｓｅｎ、１９８４年９月１３日公開の欧州特許第０１３８８５５号に記載の方法に基づくことができる。要約すれば、多数の異なる低分子ペプチド候補モジュレーター又は標的分子を、プラスチックピン又はいくつかの他の表面などの固体基板に合成する。ペプチド試験化合物を、適切な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、たとえば当分野でよく知られている適切に適応させた方法などによって、結合した実体を検出する。精製された標的は、薬剤スクリーニング技法に用いるために、プレートに直接被覆することもできる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に用いるプレートは、好ましくは９６３８４、又は３８４を超えるウェル／プレートを有する、マルチウェルプレートである。細胞は「芝生」のように広げることもできる。或いは、ペプチドを捕獲し、それを固体支持体に固定するために、非中和抗体を用いることもできる。合成化合物に関して上に述べたハイスループットスクリーニングは、有機候補モジュレーター及び標的分子を同定するために用いることもできる。
本発明はさらに、標的を特異的に結合することのできる中和抗体が、標的への結合に関して試験化合物と競合する、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用を企図する。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の成分に結合することのできる、抗体、ペプチド擬似体、及び有機低分子などの因子のスクリーニング及び開発に用いる技法は、当分野でよく知られている。これらの技法には、シグナリングタンパク質を発現するためのファージディスプレイ系の使用、及び潜在的な結合化合物の結合研究用のタンパク質を産生するためにトランスフェクトされたＥ．ｃｏｌｉ又は他の微生物の培養を用いることが含まれる（たとえば、Ｇ．Ｃｅｓａｒｉｎｉ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０７（１）：６６〜７０（１９９２年７月）、Ｈ．Ｇｒａｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６１：１６９〜１７６（１９９３）、及びＣ．Ｓｕｍｍｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３７５６〜３７６０（１９９２年５月）を参照のこと）。さらなるライブラリ及びスクリーニング技法は、たとえばＵＳ６２８１３４４（Ｐｈｙｌｏｓ）に記載されている。
ポリペプチド、タンパク質、及びアミノ酸配列
本明細書では、「アミノ酸配列」という用語は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、用語「ペプチド」と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、用語「タンパク質」と同義である。
一般に「ペプチド」は、１０から４０アミノ酸長、好ましくは１０から３５アミノ酸の短いアミノ酸配列を指す。
アミノ酸配列は、適切な供給源から調製及び単離することができ、或いは合成によって製造することができ、或いは組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。
ヌクレオチド配列
本明細書では、「ヌクレオチド配列」という用語は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成、或いは組換え由来のＤＮＡ又はＲＮＡである。これらは標準的な技法によってクローン化することもできる。ヌクレオチド配列は、センス又はアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせであっても、２本鎖又は１本鎖であることができる。
長いヌクレオチド配列は一般に、組換え手段、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて産生される。これには、クローン化を所望する標的化配列の領域に隣接するプライマー（たとえば約１５から３０ヌクレオチド）対を作る段階、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させる段階、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階、増幅断片を単離する段階（たとえばアガロースゲルで反応混合物を精製することによる）、及び増幅ＤＮＡを回収する段階を含む。このプライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化できるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。一般にプライマーは合成手段によって産生され、１度に１ヌクレオチドずつ段階的に所望の核酸配列を製造することを含む。自動化技法を用いてこれを達成する技法は、当分野で容易に利用可能である。
「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、或いはいずれかのヌクレオチド型の修飾形態である、少なくとも１０塩基から１００００塩基までの長さ、又はそれ以上のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡの１本鎖及び２本鎖形態、並びにタンパク質核酸（ＰＮＡ）などの誘導体型も含む。
これらは、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて構築することができる。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡであることができ、好ましくはＤＮＡである。核酸がＲＮＡである場合、操作はｃＤＮＡ中間体を経て行うことができる。一般に、第１領域をコードしている核酸配列が調製され、５’及び／又は３’末端に適切な制限部位が提供される。好都合には、この配列は、標準的な実験ベクター、たとえばｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１９に基づくプラスミドベクター（下記を参照のこと）などにおいて操作する。適切な技法の正確な詳細に関してはＳａｍｂｒｏｏｋ等によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）、又は同様の標準的な参考文献を挙げることができる。
核酸の供給源は、既刊の文献、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクを参照することにより確認することができる。所望の第１又は第２配列をコードしている核酸は、そのような供給源がその材料を提供することをいとわない場合には学究的又は営利的供給源から得ることができ、或いは配列データのみが得られる場合には適切な配列の合成又はクローニングによって得ることができる。一般的に、これは当該遺伝子のクローニングを記載している文献を参照することにより行うことができる。
或いは、限られた配列データが入手可能である場合、或いは知られている核酸に相同の又は関連した核酸を発現することが所望である場合、代表的な核酸は、当分野で知られている核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列とみなすことができる。
いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡである。いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列は組換えＤＮＡ技法（たとえば組換えＤＮＡ）を用いて調製される。いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列は天然型と同じであることができる。
或いは、限られた配列データが入手可能である場合、或いは知られている核酸に相同の又は関連した核酸を発現することが所望である場合、代表的な核酸は、当分野で知られている核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列とみなすことができる。
多数の異なるヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明に用いられる同じタンパク質をコードできることを当分野の技術者は理解するであろう。さらに当分野の技術者は、通常の技法を用いて、本発明の標的タンパク質又はＮｏｔｃｈシグナリングを調節するためのタンパク質が発現する任意の特定の宿主有機体のコドン使用を反映するために、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質に影響を及ぼさないヌクレオチド代替物を作成できることが理解される。
変異体、誘導体、類似体、相同体、及び断片
本明細書に記載の特定のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列に加えて、本発明はさらにそれらの変異体、誘導体、類似体、相同体、及び断片の使用を包含する。
本発明において、任意の所与の配列の変異体とは、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドが少なくとも１つの内因性機能を維持するような様式で、残基（アミノ酸又は核酸残基）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、天然タンパク質に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、修飾、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、及び／又は変更によって改変され得る。
本明細書では、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して「誘導体」という用語は、結果として生じるタンパク質又はポリペプチドが少なくとも１つの内因性機能を維持するという条件で、その配列から又はその配列への、１つ（又は複数）のアミノ酸残基の置換、変更、修飾、置換、削除、及び／又は付加を含む。
本明細書では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して「類似体」という用語は、任意の擬似体、すなわちそれが擬態するポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１つの内因性機能を有する化学化合物を含む。
本発明に有用な「タンパク質」及び「ポリペプチド」の定義の範囲内で、特定のアミノ酸残基は、当該タンパク質が少なくとも１つの内因性機能を維持するような様式で修飾されることができ、そのような修飾タンパク質は、「変異体」と称される。変異体タンパク質は、天然タンパク質に存在する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、及び／又は置換によって改変され得る。
典型的に、アミノ酸置換は、修飾された配列が所要の標的活性又はＮｏｔｃｈシグナリングを調節する能力を維持するという条件で、たとえば１、２、又は３から１０又は２０の置換からなることができる。アミノ酸置換には、非天然類似体の使用を含むことができる。
本発明に有用なタンパク質は、サイレント変化を生じ、機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を有することができる。意図的なアミノ酸置換は、標的又は調節機能が維持されるかぎり、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、負の電荷を持つアミノ酸には、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が含まれ、正の電荷を持つアミノ酸には、リシン、又はアルギニンが含まれ、類似の親水性値を持つ非電荷極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
参照を簡略化するために、主要な天然アミノ酸の１文字及び３文字の符号（並びに関連コドン）を以下に示す。
＃１ 記号
＃２ ３文字
＃３ 意味
＃４ コドン
＃５ アラニン
アスパラギン酸
アスパラギン
システイン
アスパラギン酸
グルタミン酸
フェニルアラニン
グリシン
ヒスチジン
イソロイシン
リシン
ロイシン
メチオニン
アスパラギン
プロリン
グルタミン
アルギニン
セリン
トレオニン
バリン
トリプトファン
未知
チロシン
グルタミン酸
グルタミン
終止
＃６ Ｅｎｄ



保存的置換は、たとえば以下の表に従って行うことができる。第２列の同じブロック、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。
＃１ 脂肪族
＃２ 芳香族
＃３ 非極性
＃４ 極性−非荷電
＃５ 極性−荷電



本明細書では、「タンパク質」という用語は、１本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有又は非共有手段で結合している複数ポリペプチド複合体を含む。本明細書では、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であって、ペプチド又はジスルフィド結合によって結合しているポリマーを指す。サブユニット及びドメインという用語は、生物機能を有するポリペプチド及びペプチドを指すこともできる。
本発明に有用なペプチドは、少なくとも標的又はシグナリング調節能力を有する。「断片」も変異体であり、この用語は典型的に、結合アッセイにおいて対象となり、結合対が知られている又は確定可能であるタンパク質の選択された領域を指す。したがって、「断片」は、完全長ポリペプチドの一部、たとえば約８から約１５００のアミノ酸長、好ましくは約８から約７４５のアミノ酸長、好ましくは約８から約３００、より好ましくは約８から約２００のアミノ酸、さらに好ましくは約１０から約５０又は１００のアミノ酸長であるアミノ酸配列を指す。「ペプチド」は、１０から４０のアミノ酸長、好ましくは１０から３５のアミノ酸の短いアミノ酸配列を指す。
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。挿入が行われる場合、挿入部位のいずれかの側の天然配列に対応する５’及び３’フランキング領域と共に挿入物をコードしている合成ＤＮＡが挿入される。配列が適切な酵素で切断され、合成ＤＮＡが切断部にライゲートできるように、フランキング領域は天然配列の部位に対応する都合のよい制限部位を含有する。次いで、本発明に従ってＤＮＡを発現させ、コードされたタンパク質を製造する。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作するための当分野で知られている多数の標準的技法の例示にすぎず、知られている他の技法も用いることができる。
ヌクレオチド配列の変異体も作製することができる。そのような変異体は、好ましくはコドン最適化配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡ安定性、したがって遺伝子発現を増強する方法として当分野で知られている。遺伝子コードの重複は、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードしている可能性のあることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、及びセリンは、それぞれ６つの異なるコドンによってコードされる。異なる有機体は、異なるコドンの使用を優先する。たとえば、ＨＩＶなどのウイルスは、多数の希少コドンを使用する。通常用いられる対応する哺乳動物コドンによって希少コドンが置き換えられるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳動物標的細胞において配列の発現を増大することができる。コドン使用表は哺乳動物細胞に関して当分野でよく知られており、種々の他の有機体に関しても同様である。
活性因子がヌクレオチド配列である場合、適切には哺乳動物細胞における発現に関して最適化されたコドンであることができる。好ましくは、配列の少なくとも一部は、コドン最適化されている。より好ましくは、配列の全体がコドン最適化されている。
配列相同性、類似性、同一性
本明細書では、「相同性」という用語は「同一性」と同義であり得る。相同性配列は、少なくとも７５、８５、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むものと理解される。特に、相同性は典型的に、活性に必須であることが知られている配列の領域に関して（たとえば５１、５６、及び５７位のアミノ酸）考慮されるべきである。相同性は類似性（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）という点から考慮されることもできるが、本発明においては、配列同一性という点から相同性を表すことが好ましい。
相同性の比較は、目視で行うことができるが、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性％を算出することができる。
相同性のパーセントは、連続した配列について算出することができ、すなわち１つの配列を他の配列とアラインし、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と１度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップのない（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的に、そのようなギャップのないアラインメントは、比較的に短い残基数についてのみ行われる。
これは非常に簡単で一貫性のある方法であるが、たとえば、他の点では同一である配列対において、１つの挿入又は欠失によって、それに続くアミノ酸残基がアラインメントから押し出され、したがってグローバルアラインメントを行ったとき、潜在的に相同性％の大きな低減が生じることを考慮できない。その結果、たいていの配列比較法は、全体的な相同性スコアに不当にペナルティを課すことなく、挿入及び欠失の可能性を考慮に入れた最適なアラインメントを生じるように設計されている。これは、局所的な相同性を最大にするために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかしながら、より複雑な方法は、同一アミノ酸が同数である場合、可能なかぎり少ないギャップを有する（２つの比較配列間の高い関連性を反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列アラインメントに比べて高いスコアを得られるように、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に比較的高いコストを課し、そのギャップ内の連続した各残基に小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が典型的に用いられる。これはもっとも一般的に用いられるギャップスコアシステムである。高いギャップペナルティは当然ながら、より少ないギャップを有する最適化アラインメントを生じる。たいていのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの変更が可能である。しかしながら、配列比較にそのようなソフトウエアを使用するとき、デフォルト値を用いることが好ましい。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記を参照のこと）を使用するとき、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップが−１２、各伸長は−４である。
したがって、最大相同性％の算出には、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アラインメントをまず作製することが必要である。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）である。配列比較を行うことのできる他のソフトウエアの例には、これに限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０（Ａｔｓｃｈｕｌ））、及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式が含まれる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは共にオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９、同上、７−５８から７−６０頁を参照のこと）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムの使用が好ましい。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは、以下のタスクを実行する。
ｂｌａｓｔｐ−アミノ酸問い合わせ配列を、タンパク質配列データベースと比較する。
ｂｌａｓｔｎ−ヌクレオチド問い合わせ配列を、ヌクレオチド配列データベースと比較する。
ｂｌａｓｔｘ−ヌクレオチド問い合わせ配列の６フレームの概念翻訳産物を（両鎖）、タンパク質配列データベースと比較する。
ｔｂｌａｓｔｎ−タンパク質問い合わせ配列を、６つすべてのリーディングフレームにおいて（両鎖）動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する。
ｔｂｌａｓｔｘ−ヌクレオチド問い合わせ配列の６フレーム翻訳物を、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物と比較する。
ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメータを用いる。
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索に関して、スコアのヒストグラムを表示する。デフォルトはイエス（ｙｅｓ）（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＨを参照のこと）。
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−報告されるマッチング配列の短い記述数を、指定された数に制限。デフォルト限界は１００記述である（マニュアルページのパラメータＶを参照のこと）。
ＥＸＰＥＣＴ−データベース配列に対する、報告されるマッチの統計的有意性閾値。Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率論的モデルに従って、１０のマッチが偶然によってのみ見出されるように、デフォルト値は１０である。マッチに帰する統計的有意性がＥＸＰＥＣＴ閾値より大きい場合、マッチは報告されない。低いＥＸＰＥＣＴ閾値はよりストリンジェントであり、報告されるマッチの可能性は低くなる。少数は許容される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＥを参照のこと）。
ＣＵＴＯＦＦ−ハイスコアセグメント対を報告するためのスコアカットオフ。デフォルト値は、ＥＸＰＥＣＴ値（上記参照）から算出される。ＨＳＰは、それらに帰する統計的有意性が、ＣＵＴＯＦＦ値に等しいスコアを有する単一のＨＳＰに帰するものと少なくとも同じ程度に高い場合にのみ、データベース配列に関して報告される。高いＣＵＴＯＦＦ値はよりストリンジェントであり、報告されるマッチの可能性は低くなる（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＳを参照のこと）。典型的に、有意性閾値は、ＥＸＰＥＣＴを用いてより直感的に管理できる。
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−ハイスコアセグメント対を報告するために指定された数にデータベース配列を制限。デフォルト限界は５０である。期せずして、これより大きいデータベース配列が報告される統計的有意性閾値を満たす場合（ＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦを参照）、最大統計有意性とされるマッチのみが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＢを参照のこと）。
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、及びＴＢＬＡＳＴＸに関する代替スコアリングマトリクスを指定する。デフォルトマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２）。有効な代替選択肢には、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０、及びＩＤＥＮＴＩＴＹが含まれる。ＢＬＡＳＴＮに利用可能な代替スコアリングマトリクスはなく、ＢＬＡＳＴＩＮ要求にＭＡＴＲＩＸ命令が指定されるとエラー応答が戻る。
ＳＴＲＡＮＤ−ＴＢＬＡＳＴＮ検索を、データベース配列の上端又は下端鎖に制限、或いはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、又はＴＢＬＡＳＴＸ検索を、問い合わせ配列の上端又は下端鎖のリーディングフレームに限定する。
ＦＩＬＴＥＲ−Ｗｏｏｔｔｏｎ及びＦｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：１４９〜１６３のＳＥＧプログラムによって決定される構造の複雑度の低い問い合わせ配列のセグメント、或いはＣｌａｖｅｒｉｅ及びＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：１９１〜２０１のＸＮＵプログラム、又はＢＬＡＳＴＮの場合、Ｔａｔｕｓｏｖ及びＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）によって決定される短周期内部リピートからなるセグメントをマスキングする。フィルタリングは、統計的に有意であるが、生物学的に意味のない報告をアウトプットから除去し（たとえば、酸性、塩基性、又はプロリンリッチ領域）、データベース配列との特定のマッチングに利用可能な問い合わせ配列の生物学的により興味深い領域を残すことができる。
フィルタープログラムによって見出される低複雑度配列は、ヌクレオチド配列では文字「Ｎ」（たとえば「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」、タンパク質配列では文字「Ｘ」（たとえば「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）を用いて置き換えられる。
フィルタリングは、問い合わせ配列（又はその翻訳産物）のみに適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮの場合はＤＵＳＴ、他のプログラムの場合はＳＥＧである。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴの配列に適用したとき、ＳＥＧ、ＸＮＵ、又はその両方によってまったくマスキングされないことも稀でなく、そのためフィルタリングが常に効果をもたらすことを予期するべきではない。さらに、場合によっては配列全体がマスキングされ、フィルタリングされていない問い合わせ配列に対して報告された任意のマッチの統計的有意性を疑うべきであることを示唆する。
ＮＣＢＩ−ｇｉ−寄託及び／又は遺伝子座名に加えて、ＮＣＢＩ ｇｉ識別子をアウトプットに示させる。
より好ましくは、配列比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴに提供される簡単なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて行われる。
本発明のいくつかの態様において、配列同一性を決定するとき、ギャップペナルティは用いられない。
最終的な相同性％は同一性の点から測定できるが、アラインメントのプロセス自体は典型的に、オールオアナッシングの対比較には基づいていない。その代わりに、一般的に、化学的類似性又は進化距離に基づく各対比較にスコアを割り当てる、調整類似性スコアマトリクスが用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリクスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、すなわち一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリクスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般にパブリックデフォルト値、又は供給されている場合にはカスタムシンボル比較表を用いる（さらなる詳細はユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージの場合にはパブリックデフォルト値の使用が好ましく、他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリクスの使用が好ましい。
ソフトウエアによって最適アラインメントを作製した後、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することができる。ソフトウエアは典型的に、配列比較の一部としてこれを行い、数値で結果を示す。
本発明で用いられる配列に相同性であるか、又は配列の変異体であるヌクレオチド配列は、いくつかの方法によって、たとえば様々な供給源から作製されたＤＮＡライブラリをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のウイルス／細菌、又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、及び霊長類細胞）に見出された細胞の相同体を得ることができ、一般にそのような相同体及びその断片は、本明細書の配列リストに示した配列に選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリをプローブし、中から高ストリンジェンシー条件下、参照ヌクレオチド配列のすべて又は一部を含むプローブでそのようなライブラリをプローブすることによって得ることができる。本発明に有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体の獲得にも同様の考えが適用される。
変異体、及び株／種相同体も、本発明に有用な配列内の保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、たとえばいくつかの変異体／相同体のアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で知られているコンピュータソフトウエアを用いて行うことができる。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
変異体、及び株／種相同体も、本発明に有用な配列内の保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、たとえばいくつかの変異体／相同体のアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で知られているコンピュータソフトウエアを用いて行うことができる。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、１４節に記載されているように、ＰＣＲ技術は、核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドを選択するための方法を以下に記載する。
本明細書では、プローブは、たとえば同数又はより多数の隣接塩基と同一（又は相補体）である１０から５０、好ましくは１５から３０、もっとも好ましくは少なくとも約２０の隣接塩基を含むヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。プローブとして選択された核酸配列は、偽陽性の結果が最小限となるように、充分な長さであり、充分に明確であるべきである。このヌクレオチド配列は一般に、保存された、又は高度に相同性のヌクレオチド配列又はポリペプチドの領域に基づいている。プローブとして用いられる核酸は、１つ又は複数の位置で縮重していることができる。
プローブが構築される好ましい領域には、５'及び／又は３’コード配列、リガンド結合部位をコードすることが予測される配列などが含まれる。たとえば、本明細書に開示の完全長ｃＤＮＡクローン又はその断片をプローブとして用いることができる。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーション時に容易に検出される適切な標識手段で標識される。たとえば、適切な標識手段は、放射性標識である。ＤＮＡ断片を標識する好ましい方法は、当分野でよく知られているように、ランダムプライミング反応において、α３２ＰｄＡＴＰをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と組み合わせることによるものである。オリゴヌクレオチドは一般に、γ３２Ｐ標識化ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで末端標識される。しかしながら、断片又はオリゴヌクレオチドを標識するために、他の方法（たとえば非放射性）も用いることができ、たとえば酵素標識、適切な蛍光団による蛍光標識、及びビオチン標識を含む。
好ましくは、高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする配列プローブである。
或いは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴決定した配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえばそのヌクレオチド配列が発現する特定の宿主細胞のコドン選択を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である可能性がある。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチド又はコードされたポリペプチドの活性を変えるために、望ましい可能性がある。
一般的に、本発明に用いられるヌクレオチド配列に関して、「変異体」、「相同体」、又は「誘導体」という用語には、結果として生じるヌクレオチド配列が標的タンパク質又はＴ細胞シグナリングを調節するタンパク質をコードするという条件で、その配列から又はその配列への、１つ（又は複数）の核酸の置換、変更、修飾、置換、削除、及び／又は付加を含む。
上述のとおり、配列相同性に関して、好ましくは参照配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。より好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。ヌクレオチド相同性比較は、上述のとおり行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、上に記載したＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリクスは、各同一ヌクレオチドに対して１０のマッチ値を有し、各ミスマッチは−９である。各ヌクレオチドに関して、デフォルトギャップ開始ペナルティは−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは−３である。
ハイブリダイゼーション
本発明はさらに、参照配列、或いはその任意の変異体、断片、又は誘導体、或いは上述の任意の相補体に、選択的にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列を包含する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチドの長さである。
本明細書では、「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が、塩基対の形成によって相補鎖と結合する過程」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で行われる増幅過程を含む。
本明細書に示したヌクレオチド配列又はそれらの相補体に選択的にハイブリダイズすることのできる本発明に有用なヌクレオチド配列は、一般に少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５又は３０、たとえば少なくとも４０、６０、又は１００以上の隣接ヌクレオチドに渡って、本明細書に示した対応するヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列に相同な領域を含み、好ましくは少なくとも８０又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％ヌクレオチド配列に相同である。
「選択的にハイブリダイズできる」という用語は、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドを充分に超えるレベルでプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で、プローブとして用いられるヌクレオチド配列が用いられることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、たとえばスクリーニングされるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリに、他のヌクレオチド配列が存在するために起こる可能性がある。この事象において、バックグラウンドは、プローブとライブラリの非特異的ＤＮＡメンバーとの相互作用によって生じるシグナルのレベルを示し、標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の強度である。相互作用の強度は、たとえばプローブを、たとえば３２Ｐで放射性標識することによって測定できる。
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（１９８７、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ １５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明する明確な「ストリンジェンシー」を与える。
もっとも高いストリンジェンシーは、典型的に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）で、高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃から１０℃下で、中ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃から２０℃下で、低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃から２５℃下で生じる。当分野の技術者に理解されるとおり、最高のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一ヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いることができ、中程度（又は低い）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、類似又は関連ポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いることができる。
好ましい態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下（たとえば６５℃及び１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）で、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列を含む。本発明のヌクレオチド配列が２本鎖である場合、２本鎖の両方の鎖は、個々に又は組み合わせで本発明に包含される。ヌクレオチド配列が１本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列も本発明の範囲内に含まれることが理解される。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。そのような条件は、当分野の技術者には明白である。当分野の技術者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映され、配列相同性が１％低下するごとに約１から１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、高いストリンジェンシー条件下で行い、その後、種々のストリンジェンシーの洗浄を行う。
本明細書では、高ストリンジェンシーは、好ましくは６５〜６８℃、１Ｍ Ｎａ＋で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。高ストリンジェンシー条件は、たとえば６×ＳＳＣ、５×デンハルト、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ＋ピロリン酸、及び非特異的競合体として０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する水溶液でのハイブリダイゼーションによって提供され得る。ハイブリダイゼーションに続いて、数段階の高ストリンジェンシー洗浄を行い、最終洗浄（約３０分）はハイブリダイゼーション温度、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。
これらの条件は、種々の緩衝液、たとえばホルムアミドをベースとする緩衝液、及び温度を用いて、適合及び再現できることが理解される。デンハルト溶液及びＳＳＣは当分野の技術者によく知られており、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液も同様である（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等編、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、又はＡｕｓｕｂｅｌ等編、（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。ハイブリダイズ対の長さ及びＧＣ含量も影響を与えるので、最適なハイブリダイゼーション条件は実験的に求められなければならない。
クローニング及び発現
本発明の配列に１００％は相同性でないが、本発明の範囲内であるヌクレオチド配列は、いくつかの方法によって得ることができる。本明細書に記載した配列の他の変異体は、たとえば様々な供給源から作製されたＤＮＡライブラリをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のウイルス／細菌、又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、及び霊長類細胞）に見出された細胞の相同体を得ることができ、一般にそのような相同体及びその断片は、本明細書の配列リストに示した配列に選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリをプローブし、中から高ストリンジェンシー条件下、参照ヌクレオチド配列のすべて又は一部を含むプローブでそのようなライブラリをプローブすることによって得ることができる。本発明に有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体の獲得にも同様の考えが適用される。
変異体、及び株／種相同体も、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、たとえばいくつかの変異体／相同体のアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で知られているコンピュータソフトウエアを用いて行うことができる。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
或いは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴決定した配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえばそのヌクレオチド配列が発現する特定の宿主細胞のコドン選択を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である可能性がある。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、或いは標的タンパク質又はヌクレオチド配列によってコードされたＴ細胞シグナリングを調節するタンパク質の活性を変えるために、望ましい可能性がある。
本発明に有用なＤＮＡポリヌクレオチドなどのヌクレオチド配列は、組換え、合成、又は当分野の技術者に利用可能な任意の手段によって産生することができる。これらは標準的な技法によってクローン化することもできる。
一般にプライマーは合成手段によって産生され、１度に１ヌクレオチドずつ段階的に所望の核酸配列を製造することを含む。自動化技法を用いてこれを達成する技法は、当分野で容易に利用可能である。
長いヌクレオチド配列は一般に、組換え手段、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて産生される。これには、クローン化を所望する標的化配列の領域に隣接するプライマー（たとえば約１５から３０ヌクレオチド）対を作る段階、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させる段階、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階、増幅断片を単離する段階（たとえばアガロースゲルで反応混合物を精製することによる）、及び増幅ＤＮＡを回収する段階を含む。このプライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化できるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
本発明はさらに、本発明に有用なポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作されている宿主細胞、及びそのような技法による本発明に有用なポリペプチドの産生に関する。
組換え産生の場合、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系又は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓ等及びＳａｍｂｒｏｏｋ等など、多くの標準的な実験マニュアルに記載されている方法、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、バリスティック導入、及び感染などによって行うことができる。そのような方法は、薬剤送達系としてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで用い得ることが理解される。
適切な宿主の代表的な例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、Ｅ．ｃｏｌｉ、ストレプトミセス、及び枯草菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞及びアスペルギルス細胞などの真菌細胞、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞、並びに植物細胞が含まれる。
本発明に有用なポリペプチドを産生するために、多種多様な発現系を用いることができる。そのようなベクターには、特に、染色体、エピソーム、及びウイルス由来ベクター、たとえば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、並びにそれらの組み合わせ由来のベクター、たとえばコスミド及びファージミドなどの、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するものなどが含まれる。発現系コンストラクトは、発現を生じるだけでなく、発現を調節する制御領域を含むことができる。一般に、この点に関して、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増殖、又は発現し、かつ／又はポリペプチドを発現するのに適した任意の系又はベクターを、発現に用いることができる。適切なＤＮＡ配列は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載のものなど、よく知られている種々の慣例的な技法のいずれかによって発現系に挿入することができる。
翻訳されたタンパク質を、小胞体の内腔、ペリプラズマ間隙、又は細胞外環境に分泌するために、適切な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに内因性であることができ、或いは異種シグナルであることもできる。
タンパク質又はポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であることができ、又は融合タンパク質又は前駆体などの大きなタンパク質の一部であることもできる。たとえば、精製を助けるために分泌又はリーダー配列又は前配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなど）を含有する追加のアミノ酸配列を含むことが多くの場合有利である。同様に、そのような追加配列は、組換え産生中に付加的な安定性を提供することが望ましいことがある。そのような場合、追加配列を開裂して（たとえば、化学的又は酵素的に）、最終産物を生じることができる。しかしながら、場合によって追加配列は望ましい薬理的プロファイルを付与することもあり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合など）、この場合には投与時に最終産物に追加配列が存在するように、追加配列が除去されないことが好ましい可能性がある。
タンパク質又はポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であることができ、又は融合タンパク質又は前駆体などの大きなタンパク質の一部であることもできる。たとえば、精製を助けるために分泌又はリーダー配列又は前配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなど）を含有する追加のアミノ酸配列を含むことが多くの場合有利である。同様に、そのような追加配列は、組換え産生中に付加的な安定性を提供することが望ましいことがある。そのような場合、追加配列を開裂して（たとえば、化学的又は酵素的に）、最終産物を生じることができる。しかしながら、場合によって追加配列は望ましい薬理的プロファイルを付与することもあり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合など）、この場合には投与時に最終産物に追加配列が存在するように、追加配列が除去されないことが好ましい可能性がある。
さらに、そのようなベクター又は融合タンパク質をコードしている他のポリヌクレオチドを含む哺乳動物及び微生物宿主細胞、並びにそれらの産生及び使用も本発明に含まれる。
本発明に用いられる活性因子は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈降、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含む、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。もっとも好ましくは、精製に高速液体クロマトグラフィを用いる。単離及び／又は精製中にポリペプチドが変性するとき、活性な立体構造を再生するために、タンパク質をリフォールドするための知られている技法を用いることができる。
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例としてより詳細に記載する。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現を阻害することによってＮｏｔｃｈシグナリングを調節するために用いることのできる物質には、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードしている遺伝子の発現に影響を及ぼすポリペプチドをコードしている核酸が含まれる。たとえば、Ｄｅｌｔａ発現の場合、細胞外ＢＭＰ（骨形成タンパク質、Ｗｉｌｓｏｎ及びＨｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ、Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ及びＭｅｌｔｏｎ）のその受容体への結合は、ａｃｈａｅｔｅ／ｓｃｕｔｅ複合体の転写因子の発現の阻害によってＤｅｌｔａ転写のダウンレギュレーションをもたらす。この複合体は、Ｄｅｌｔａ発現の調節に直接関与すると考えられている。したがって、ＢＭＰ発現をアップレギュレートする、かつ／又はＢＭＰのその受容体への結合を刺激する任意のポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ及び／又はＳｅｒｒａｔｅなどのＮｏｔｃｈリガンドの発現に低減を生じることができる可能性がある。例には、ＢＭＰ自体をコードしている核酸が含まれる。さらに、ａｃｈａｅｔｅ／ｓｃｕｔｅ複合体の転写因子の発現を阻害する任意の物質も、Ｎｏｔｃｈリガンド発現をダウンレギュレートする可能性がある。
ＢＭＰファミリーのメンバーには、ＢＭＰ１からＢＭＰ６、ＯＰ１とも呼ばれるＢＭＰ７、ＯＰ２（ＢＭＰ８）などが含まれる。ＢＭＰは、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦベータ）スーパーファミリーに属し、これにはＴＧＦベータに加えて、アクチビン／インヒビン（たとえばアルファインヒビン）、ミューラー阻害物質、及びグリア細胞系由来神経栄養因子が含まれる。
Ｄｅｌｔａ及び／又はＳｅｒｒａｔｅの発現を阻害するポリペプチドの他の例には、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ）又は先天免疫系に結合した他の任意の受容体（たとえばＣＤ１４、補体受容体、スカベンジャー受容体、又はディフェンシンタンパク質）、及びノギン（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）、コーディン（Ｓａｓａｉ）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ（Ｉｅｍｕｒａ）、Ｘｎｒ３、並びにそれらの誘導体及び変異体の産生を低減する又は妨げる他のポリペプチドが含まれる。ノギン及びコーディンは、ＢＭＰに結合し、それによってそれらのシグナリングカスケードの活性化を防止し、Ｄｅｌｔａ転写の低減をもたらす。したがって、ノギン及びコーディンレベルの低減は、Ｎｏｔｃｈリガンド、特にＤｅｌｔａ発現の減少をもたらす可能性がある。
より詳細には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、Ｔｏｌｌ膜貫通受容体は、特に先天非特異的免疫応答を制御するシグナリング経路で中心的な役割を果たす。このＴｏｌｌ媒介免疫応答は、広範な有機体で相同成分を有する祖先型保存シグナリング系を反映する。ヒトＴｏｌｌ相同体は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）遺伝子及びＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体様（ＴＩＬ）遺伝子のなかで同定されており、特徴的なＴｏｌｌモチーフである細胞外ロイシンリッチリピートドメイン及び細胞質インターロイキン−１受容体様領域を含有する。Ｔｏｌｌ様受容体遺伝子（ＴＩＬ遺伝子を含む）には、現在ＴＬＲ４、ＴＩＬ３、ＴＩＬ４、及び同定された他の４種のＴＬＲ遺伝子が含まれる。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現をダウンレギュレートするために用いることのできる他の適切な配列には、免疫共刺激分子（たとえばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＳＬＡＭ）及び免疫相乗作用に関連する他の補助分子（たとえばＣＤ２、ＬＦＡ−１）をコードしている配列が含まれる。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現をダウンレギュレートするために用いることのできる他の適切な物質には、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーなどの形質転換増殖因子の作用を阻害する核酸が含まれる。ＦＧＦは、哺乳動物塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、又はＦＧＦファミリーの他のメンバー、たとえばＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７であることができる。好ましくは、このＦＧＦは、酸性ＦＧＦではない（ＦＧＦ−１、Ｚｈａｏ等、１９９５）。もっとも好ましくは、ＦＧＦは、ＡＰＣでＳｅｒｒａｔｅポリペプチドの発現のアップレギュレーションを刺激することによって作用するＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦファミリーのメンバーが、ＡＰＣでＳｅｒｒａｔｅ−１遺伝子発現をアップレギュレートできることが示されている。
アンチセンスコンストラクトの使用によるＮｏｔｃｈシグナリングの阻害
適切な核酸配列は、アンチセンスコンストラクト、たとえばアンチセンスＮｏｔｃｈリガンドコンストラクト又は上述のＮｏｔｃｈシグナリング経路の他の成分に対応するアンチセンス配列をコードしている核酸配列を含むことができる。アンチセンス核酸は、合成１本鎖ＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドであることができる。しかしながら、より好ましくは、アンチセンスは、遺伝子ベクター導入の結果として患者自身の細胞で産生されたアンチセンスＲＮＡである。このベクターは、ベクターの宿主細胞への導入における所望の特異性を有するアンチセンスＲＮＡの産生をもたらす。
アンチセンス核酸は、２本鎖又は１本鎖、ＲＮＡ又はＤＮＡ、或いはそれらの修飾又は誘導体であるオリゴヌクレオチドであることができ、それらは細胞に直接投与することができ、又は外因性導入配列の転写によって細胞内に産生されることができる。
たとえば、ＵＳ−Ａ−２００２０１１９５４０に記載されているように、阻害性アンチセンス又は２本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことができ、これに限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含むグループから選択される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえばアラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、又はヘキソースなどの、１つ又は複数の修飾糖部分を含むこともできる。
他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、所望であれば、たとえばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール、又はそれらの類似体などの、少なくとも１つの修飾リン酸主鎖を含むことができる。或いは、修飾ポリペプチド主鎖などの他のポリマー主鎖も用いることができる（たとえば、タンパク質核酸：ＰＮＡ）。
他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルファアノマーオリゴヌクレオチドであることができる。アルファアノマーオリゴヌクレオチドは、通常のベータユニットと異なり鎖が互いに平行している、相補ＲＮＡを含む特定の２本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ等、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、たとえば２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ等、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）であることができる。オリゴヌクレオチドは、たとえば自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販され入手可能なものなど）を用いて、当分野で知られている標準的な方法によって合成することができる。単に例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ等（１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、細孔性ガラスポリマー支持体を用いて調製することができる（Ｓａｒｉｎ等、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８〜７４５１）。
好ましくは、本発明に用いる核酸配列は、樹状細胞などのＡＰＣにおいて、Ｓｅｒｒａｔｅ及びＤｅｌｔａ、好ましくはＳｅｒｒａｔｅ１及びＳｅｒｒａｔｅ２、並びにＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、及びＤｅｌｔａ４の発現を阻害することができる。特に、核酸配列は、ＡＰＣ又はＴ細胞において、Ｓｅｒｒａｔｅ発現を阻害することができるが、Ｄｅｌｔａ発現を阻害しないか、或いはＤｅｌｔａ発現を阻害することができるが、Ｓｅｒｒａｔｅ発現を阻害しない可能性がある。或いは、本発明に用いる核酸配列は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞などのＴ細胞、又はＤｅｌｔａを発現する免疫系の他の細胞において（たとえば細胞表面受容体の刺激に応答して）、Ｄｅｌｔａ発現を阻害することができる。特に、核酸配列は、Ｔ細胞において、Ｄｅｌｔａ発現を阻害することができるが、Ｓｅｒｒａｔｅ発現を阻害しない可能性がある。特に好ましい一実施形態において、核酸配列は、Ｔ細胞及びＡＰＣの両方においてＮｏｔｃｈリガンド発現を阻害することができ、たとえばＡＰＣでＳｅｒｒａｔｅ発現を阻害し、Ｔ細胞でＤｅｌｔａ発現を阻害することができる。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現をダウンレギュレートするために用いることのできる好ましい適切な物質には、増殖因子及びサイトカインが含まれる。より好ましくは、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド発現を阻害するために、可溶性タンパク質増殖因子を用いることができる。たとえば、Ｎｏｔｃｈリガンド発現は、ＢＭＰ又はアクチビン（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）を加えることによって、低減又は阻害することができる。さらに、Ｔ細胞、ＡＰＣ、又は腫瘍細胞は、単独又はＢＭＰとの組み合わせで、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αを含む炎症型サイトカインの存在下で培養することができる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するための分子にはさらに、細胞膜又はシグナリング経路でのＮｏｔｃｈ−タンパク質発現又は提示を改変することのできる、ポリペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチドが含まれる。完全な機能の細胞膜タンパク質としての提示を低減する又は妨げる分子には、ヒドロキシメートをベースとする阻害剤などのＭＭＰ阻害剤を含むことができる。
ＮｏｔｃｈとＮｏｔｃｈリガンドとの相互作用を低減するために用いることのできる他の物質は、外因性Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド、或いはその機能誘導体である。たとえば、Ｎｏｔｃｈリガンド誘導体は、好ましくは、Ｎ末端にＤＳＬドメイン、及び細胞外表面に１から８個、適切には２から５個のＥＧＦ様リピートを有する。ｈＪａｇｇｅｄ１、及びｈＪａｇｇｅｄ１の細胞外部分の可溶性形態を発現するＣＯＳ細胞の上清のＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ＬＡＧ−２ドメインに対応するペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１の阻害においてＪａｇｇｅｄ１の作用を模倣することが見出された（Ｌｉ）。
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンド誘導体は、融合タンパク質、たとえばＮｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメント、及びＩｇＧＦｃ又はＩｇＭＦｃなどの免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質であることができる。
或いは、このモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンドに結合して内因性Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用を低減することのできる、Ｎｏｔｃｈ受容体（たとえばＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、又はそれらの相同体）の細胞外ドメインのすべて又は一部を含むことができる。Ｎｏｔｃｈの第１１及び第１２ドメインはＮｏｔｃｈリガンド相互作用に重要であると考えているので、好ましくは、そのようなモジュレーターは少なくともＮｏｔｃｈの第１１及び第１２ドメイン（ＥＧＦ１１及びＥＧＦ１２）を含むことができる。
たとえば、ラットＮｏｔｃｈ−１／Ｆｃ融合タンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ及びＡｂｉｎｇｄｏｎ、Ｏｘｏｎ、ＵＫ、カタログ番号１０５７−ＴＫ）から入手可能である。これは、ポリペプチドリンカーを介して（ＩＥＧＲＭＤ）、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（Ｐｒｏ１００からＬｙｓ３３０）に融合したラットＮｏｔｃｈ−１の１２アミノ末端ＥＧＦドメイン（アミノ酸残基Ｍｅｔ１からＧｌｕ４８８）を含む。
他のＮｏｔｃｈシグナリング経路アンタゴニストには、たとえばＮｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドの抗体など、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の成分間の相互作用を阻害する抗体が含まれる。
「抗体」という用語は、エピトープ決定基に結合することのできる、完全分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖなどのそれらの断片を含む。これらの抗体断片は、その抗原又は受容体と選択的に結合する一部の能力を保持し、たとえば以下を含む。
（ｉ）Ｆａｂ、抗体分子の１価抗原結合断片を含有するこの断片は、全抗体を酵素パパインで消化して、１つの完全な軽鎖、及び１つの重鎖の一部を生じることによって産生できる。
（ｉｉ）Ｆａｂ’、抗体分子のこの断片は、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元して、１つの完全な軽鎖、及び重鎖の一部を生じることによって得ることができ、抗体分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる。
（ｉｉｉ）（Ｆａｂ’）２、全抗体を後に還元することなくペプシンで処理することによって得られる抗体の断片であり、Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって結合した２つのＦａｂ’断片の２量体である。
（ｉｖ）Ｆｖ、可変な遺伝子融合単一鎖分子を含有する遺伝子操作された断片として定義される。
（ｖ）本質的に抗体の可変（ＶＨ又はＶＬ）抗原結合ドメインのみからなる断片（いわゆる「ドメイン抗体」）。
抗体を作製する一般的な方法は、当分野で知られている（たとえば、その原本を参照により本明細書の一部とする、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであることができるが、好ましくはモノクローナルである。
適切には、結合親和性（平衡結合定数（Ｋａ））は、少なくとも約１０６Ｍ−１、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、又は少なくとも約１０９Ｍ−１であることができる。
適切には、抗体、誘導体、又は断片は、Ｎｏｔｃｈリガンドの１つ又は複数のＤＳＬ、ＥＧＦ、又はＮ末端ドメイン、或いはＮｏｔｃｈの１つ又は複数のＥＧＦ又はＬｉｎ／Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）ドメイン（たとえばＮｏｔｃｈのＥＧＦリピート１１及び１２）に結合する。
一実施形態において、この因子は、Ｎｏｔｃｈに結合する抗体、誘導体、又は断片であることができる。
他の実施形態において、この因子は、Ｄｅｌｔａに結合する抗体、誘導体、又は断片であることができる。
他の実施形態において、この因子は、Ｓｅｒｒａｔｅ又はＪａｇｇｅｄに結合する抗体、誘導体、又は断片であることができる。
遮断剤として用いる適切な抗体は、Ｎｏｔｃｈ、或いはＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ／ＪａｇｇｅｄなどのＮｏｔｃｈリガンドのすべて又は一部を含むペプチドで宿主動物を免疫化することによって得られる。
用いられるペプチドは、完全タンパク質、或いはその断片又は誘導体を含むことができる。好ましい免疫原は、ヒトＮｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、又はＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの細胞外ドメインのすべて又は一部を含み、これらの残基は、グリコシル化などの天然タンパク質に見出される任意の翻訳後修飾を含有する。細胞外ドメインを含む免疫原は、通常の組換え法を用いるクローン遺伝子の発現、及び／又は高レベルのＮｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドを発現するＴ細胞又は細胞集団からの単離など、当分野でよく知られているいくつかの技法によって産生することができる。
モノクローナル抗体は、当分野でよく知られている手段によって産生することができる。一般に、免疫化宿主動物の脾臓及び／又はリンパ節は、形質細胞の供給源を提供する。形質細胞は、骨髄腫細胞との融合によって不朽化し、ハイブリドーマ細胞を産生する。個々のハイブリドーマの培養上清を、標準的な技法を用いてスクリーニングして、所望の特異性を有する抗体を生じるものを同定する。この抗体は、不溶性担体プロテインＡセファロースなどに結合したＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はその断片を用いるアフィニティクロマトグラフィなどの通常の技法によって、ハイブリドーマ細胞上清又は腹水から精製することができる。
たとえば、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドに対する抗体は、ＵＳ５６４８４６４、ＵＳ５８４９８６９、及びＵＳ６００４９２４（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に記載されており、それらの原本を参照により本明細書の一部とする。
Ｎｏｔｃｈ受容体に対して産生された抗体は、ＷＯ００２０５７６（この原本も参照により本明細書の一部とする）にも記載されている。たとえば、この文献は、ヒトＮｏｔｃｈ−１ＥＧＦ様リピート１１及び１２に対する抗体の産生を開示している。たとえば、特定の実施形態において、ＷＯ００２０５７６は、Ａ６と称される、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２６５４を有するハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体、Ｃｌ１と称される、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２６５６を有するハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体、及びＦ３と称される、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２６５５を有するハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体を開示している。
好ましくは、ヒト患者の治療に用いられる抗体は、キメラ又はヒト化抗体である。抗体「ヒト化」技法は、当分野でよく知られている。それらの技法は、典型的に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードしているＤＮＡ配列を操作するために、組換えＤＮＡ技術の使用を含む。
ＵＳ５８５９２０５に記載されているように、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）をヒト化する初期の方法はキメラ抗体の産生を含み、１つの抗体の完全な可変領域を含む抗原結合部位は、他の抗体由来の定常領域に結合している。そのようなキメラ化手順は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＥＰ−Ａ−０１２５０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．及びＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）、ＥＰ−Ａ−０１７１４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、及びＷＯ８６／０１５３３（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。たとえば、ＷＯ８６／０１５３３は、マウスＭＡｂの可変領域、及びヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体分子を調製する方法を開示している。
ＥＰ−Ａ−０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されている他のアプローチにおいて、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、長いオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発によって、ヒト免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域にグラフトされる。そのようなＣＤＲグラフトヒト化抗体は、それらが含有する非ヒトアミノ酸配列の割合がはるかに低いために、ヒト化キメラ抗体に比べて、抗抗体反応を生じる可能性が低い。リゾチームを認識するマウスＭＡｂ及びヒトＴ細胞の抗原を認識するラットＭＡｂがＣＤＲグラフト化によってヒト化された例は、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６、１９８８）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ等（Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４、１９８８）にそれぞれ記載されている。ヒトＴ細胞の抗原に対するＣＤＲグラフト化抗体の調製は、ＷＯ８９／０７４５２（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）にも記載されている。
ＷＯ９０／０７８６１において、Ｑｕｅｅｎ等は、ヒト化免疫グロブリンを設計するための４つの基準を提示している。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、ヒト化される非ヒトドナー免疫グロブリンに著しく相同である特定のヒト免疫グロブリンのフレームワークを用いる、又は多くのヒト抗体の共通フレームワークを用いることである。第２の基準は、フレームワークの特定の残基においてヒト配列として、そのヒトアクセプター残基が例外的であり、ドナー残基が典型的である場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を用いることである。第３の基準は、ＣＤＲに直接隣接する位置でアクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を用いることである。第４の基準は、フレームワーク位置でドナーアミノ酸残基を用いることであり、アミノ酸は３次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Ａ以内に側鎖原子を有し、抗原又はヒト化ＣＤＲと相互作用することができると予測される。基準２、３、又は４は、基準１に加えて、又は基準１の代わりに適用でき、単独又は組み合わせて適用できることが提示される。
アイソタイプの選択は、補体結合、又は抗体依存性細胞傷害の活性などの所望のエフェクター機能によって左右される。適切なアイソタイプには、ＩｇＧ１
、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれる。適切には、ヒト軽鎖定常領域、カッパ又はラムダを用いることができる。
化学結合
化学的に結合した配列は、（必要である場合）個々のタンパク質配列から調製し、知られている化学的結合技法を用いて結合することができる。このコンジュゲートは、通常の液相又は固相ペプチド合成方法を用いて集め、末端アミノ基のみが脱保護反応性形態である完全保護前駆体を生じることができる。その後、この官能基を、Ｔ細胞シグナリングを調節するためのタンパク質、又はその適切な反応性誘導体と直接反応させることができる。或いは、このアミノ基は、カーゴ部分又はリンカーとの反応に適した異なる官能基に変換することができる。したがって、たとえばアミノ基の無水コハク酸との反応は、選択的にアドレス可能なカルボキシル基を提供し、システイン誘導体によるさらなるペプチド鎖の伸長は、選択的にアドレス可能なチオール基を生じる。ひとたび送達ベクター前駆体に適切な選択的にアドレス可能な官能基が得られたら、Ｔ細胞シグナリングを調節するためのタンパク質又はその誘導体を、たとえばアミド、エステル、又はジスルフィド結合形成によって結合することができる。用いることのできる架橋試薬は、たとえばＮｅａｎｓ Ｇ．Ｅ．及びＦｅｅｎｅｙ Ｒ．Ｅ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４、３９〜４３頁に記載されている。
上述のとおり、標的タンパク質及びＴ細胞シグナリングを調節するためのタンパク質は、開裂可能なリンカー部分を介して直接又は間接的に結合することができる。直接的な結合は、Ｔ細胞シグナリング調節のタンパク質において、ヒドロキシ、カルボキシ、又はアミノ基などの任意の通常の官能基を介して生じる。好ましい間接的な結合は、結合部分を介して生じる。適切な結合部分には、二官能及び多官能アルキル、アリール、アラルキル、又はペプチド部分、アルキル、アリール、又はアラルキルアルデヒド、酸、エステル、及び無水物、スルフヒドリル又はカルボキシル基、たとえばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体、及びスクシンイミド誘導体などが含まれ、或いは臭化又は塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステル、又はスルホン酸ハロゲン化物などに由来してもよい。一方ではリンカーとＴ細胞シグナリング調節のタンパク質との共有結合、並びに他方ではリンカーと標的タンパク質との共有結合を形成するために用いられるこのリンカー部分の官能基は、２つ以上の、たとえばアミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、及びカルボキシル基などであることができる。リンカー部分は、それによってリンカー部分が標的タンパク質に結合するシステイン残基を任意選択で含む、１から４個のアミノ酸残基の短い配列を含むことができる。
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
上述のとおり、天然Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的にいくつかの異なるドメインを含む。種々の天然ヒトＮｏｔｃｈリガンドのいくつかの予測される／潜在的ドメイン位置（前駆タンパク質のアミノ酸番号に基づく）を以下に示す。
＃１ ヒトＤｅｌｔａ１
＃２ 成分
＃３ アミノ酸
＃４ 推定機能／ドメイン
＃５ シグナル
＃６ 鎖
＃７ ドメイン
＃８ 膜貫通
＃９ ドメイン
＃１０ シグナル
＃１１ Ｄｅｌｔａ様タンパク質１
＃１２ 細胞外
＃１３ 膜貫通
＃１４ 細胞質
＃１５ ＥＧＦ様


＃１ ヒトＤｅｌｔａ３
＃２ 成分
＃３ アミノ酸
＃４ 推定機能／ドメイン
＃５ ドメイン
＃６ ＥＧＦ様

＃１ ヒトＤｅｌｔａ４
＃２ 成分
＃３ アミノ酸
＃４ 推定機能／ドメイン
＃５ シグナル
＃６ 鎖
＃７ ドメイン
＃８ 膜貫通
＃９ ドメイン
＃１０ シグナル
＃１１ Ｄｅｌｔａ様タンパク質４
＃１２ 細胞外
＃１３ 膜貫通
＃１４ 細胞質
＃１５ ＤＳＬ
＃１６ ＥＧＦ様


＃１ ヒトＪａｇｇｅｄ１
＃２ 成分
＃３ アミノ酸
＃４ 推定機能／ドメイン
＃５ シグナル
＃６ 鎖
＃７ ドメイン
＃８ 膜貫通
＃９ ドメイン
＃１０ シグナル
＃１１ Ｊａｇｇｅｄ１
＃１２ 細胞外
＃１３ 膜貫通
＃１４ 細胞質
＃１５ ＤＳＬ
＃１６ ＥＧＦ様
＃１７ フォンビルブラント因子Ｃ


＃１ ヒトＪａｇｇｅｄ２
＃２ 成分
＃３ アミノ酸
＃４ 推定機能／ドメイン
＃５ シグナル
＃６ 鎖
＃７ ドメイン
＃８ 膜貫通
＃９ ドメイン
＃１０ シグナル
＃１１ Ｊａｇｇｅｄ２
＃１２ 細胞外
＃１３ 膜貫通
＃１４ 細胞質
＃１５ ＤＳＬ
＃１６ ＥＧＦ様
＃１７ フォンビルブラント因子Ｃ



ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができる。

好ましくは、ＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができ、

配列中、
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はヒスチジンなどの芳香族アミノ酸残基であり、
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンなどの非極性アミノ酸残基であり、
ＢＡＳは、アルギニン、又はリシンなどの塩基性アミノ酸残基であり、
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンなどの酸又はアミドアミノ酸である。
好ましくは、ＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができ、

（配列中、Ｘａａは任意のアミノ酸であることができ、Ａｓｘはアスパラギン酸又はアスパラギンである）。
種々の供給源由来のＮｏｔｃｈリガンドのＤＳＬドメインのアラインメントを図３に示す。
用いられるＤＳＬドメインは、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ラット、マウス、又はヒトを含む、適切な任意の種に由来することができる。好ましくは、ＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列由来である。
本明細書では、「ＤＳＬドメイン」という用語は、天然ドメインに相当する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、及び擬似体を含むことが理解される。
適切には、たとえば、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、ＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンドだけでなく、血液凝固カスケードに関与するものを含む種々のタンパク質に見出されている（Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８）。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸ及びＸなどの細胞外タンパク質（Ｒｅｅｓ等、１９８８、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２０５３〜２０６１、Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８）、他のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子（Ｋｎｕｓｔ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．７６１〜７６６、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ等、１９８８、Ｃｅｌｌ５５：１０４７〜１０５９）、並びにいくつかの細胞表面受容体タンパク質、たとえばトロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８９１〜１８９７）及びＬＤＬ受容体（Ｓｕｄｈｏｆ等、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：８１５〜８２２）などに見出されている。タンパク質結合部位は、トロンボモジュリン及びウロキナーゼのＥＧＦリピートドメインにマッピングされている（Ｋｕｒｏｓａｗａ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６３：５９９３〜５９９６、Ａｐｐｅｌｌａ等、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４３７〜４４４０）。
ＰＲＯＳＩＴＥによって報告されているとおり、典型的なＥＧＦドメインは、（ＥＧＦにおいて）ジスルフィド結合に含まれることが示されている６つのシステイン残基を含むことができる。その主要な構造は、必ずしも必須ではないが、２本鎖βシートであり、Ｃ末端短２本鎖シートへのループが続くことが報告されている。保存システイン間のサブドメインは、以下の典型的なＥＧＦ様ドメインの概略図に示すように、長さが非常に多様である。

図中、
Ｃ：ジスルフィド結合に関与する保存システイン
Ｇ：多くの場合、保存グリシン
ａ：多くの場合、保存芳香族アミノ酸
＊：両パターンの位置
ｘ：任意の残基
第５システインと第６システインの間の領域は、２つの保存グリシンを含有し、少なくともその１つは一般にたいていのＥＧＦ様ドメインに存在する。
用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ラット、マウス、又はヒトを含む、適切な任意の種に由来することができる。好ましくは、ＥＧＦ様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列由来である。
本明細書では、「ＥＧＦドメイン」という用語は、天然ドメインに相当する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、及び擬似体を含むことが理解される。
適切には、たとえば、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
実用の問題として、任意の特定のアミノ酸配列が他の配列に対して少なくともＸ％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に求めることができる。たとえば、グローバル配列アラインメントとも称される、問い合わせ配列と対象配列との間の全体的な最大の一致は、Ｂｒｕｔｌａｇ等（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７〜２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムなどのプログラムを用いて求めることができる。ある配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列及び対象配列は、共にヌクレオチド配列であるか、又は共にアミノ酸配列である。グローバル配列アラインメントの結果は、同一性のパーセントとして与えられる。
「ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン」という用語は、Ｎ末端からＤＳＬドメインの開始までのＮｏｔｃｈリガンド配列の部分を意味する。この用語は、天然ドメインに相当する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、及び擬似体を含むことが理解される。
本明細書では、「異種アミノ酸配列」又は「異種ヌクレオチド配列」という用語は、天然配列（たとえば、あるＮｏｔｃｈリガンド配列が、天然Ｎｏｔｃｈリガンド配列に見出されない場合）又はそのコード配列に見出されない配列を意味する。好ましくは、任意のそのような異種アミノ酸配列は、ＴＳＳＴ（毒ショック症候群毒素）配列でなく、好ましくはスーパー抗原配列でない。（スーパー抗原には一般に、抗原性ペプチド結合の通常の溝の外側でＴＣＲ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合し、複数のＴ細胞クローンの非特異的活性化をもたらすある種の細菌及びウイルス糖タンパク質が含まれる）。
ある物質がＮｏｔｃｈを活性化するために用い得るかどうかは、たとえばＧＢ０１１８１５３．６の優先権を主張する本出願人等の同時係属国際特許出願、及び本明細書の実施例に記載されている適切なスクリーニングアッセイを用いて判定することができる。
スクリーニングアッセイ
ある物質がＮｏｔｃｈシグナリングを調節するために用い得るかどうかは、適切なスクリーニングアッセイ（たとえば本明細書の実施例を参照のこと）を用いて判定することができる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、タンパク質アッセイ、又は核酸アッセイによってモニターすることができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解性開裂、及び細胞核への転移をもたらす。本明細書では、「検出可能なシグナル」とは、Ｎｏｔｃｈの開裂した細胞内ドメインの存在に起因する任意の検出可能な徴候を指す。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングの増大は、開裂したＮｏｔｃｈドメインの細胞内濃度を測定することによって、タンパク質レベルで評価することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化も、一連の下流の反応を触媒し、ある種の明確な遺伝子の発現レベルに変化をもたらす。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングの増大は、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することによって、核酸レベルで評価することができる。本発明の好ましい一実施形態において、アッセイはタンパク質アッセイである。本発明の他の好ましい実施形態において、アッセイは核酸アッセイである。
核酸アッセイを用いる利点は、感度が高く、小さい試料を分析できることである。
所与の任意の時間に測定された特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、その時間における対応する遺伝子の発現レベルを反映する。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の下流標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、免疫系のＴ細胞の間接的なアッセイで測定することができる。特に、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１、及び／又はＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルの増大は、たとえばアネルギーの誘発を示す可能性があり、Ｄｌｌ−１又はＩＦＮ−γｍＲＮＡレベル、或いはＩＬ−２、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３などのサイトカインをコードしているｍＲＮＡのレベルの増大は、応答性の向上を示す可能性がある。
種々の核酸アッセイが知られている。知られている、又は後に開示される任意の通常の技法を用いることができる。適切な核酸アッセイの例を以下に述べるが、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ブロット法、スペクトロメトリ、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ、及び他のハイブリダイゼーション法が含まれる。
特に、遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用いて、たとえば通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって直接試料中で測定することができる。当分野の技術者は、所望であれば、これらの方法をどのように変更できるか容易に想定できるであろう。
ＰＣＲは当初、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技法は、反応溶液を繰り返し加熱及び冷却し、プライマーを標的配列にアニーリングさせ、重複娘鎖の形成のためにそれらのプライマーを伸長する温度サイクルに基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素によって第１のｃＤＮＡ鎖を産生するためにＲＮＡ鋳型を用いる。次いで、このｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコルに従って増幅する。合成及び変性の反復サイクルによって、産生される標的ＤＮＡのコピー数が指数的に増加する。しかしながら、反応成分が限界となるにつれ、プラトーに達し、ＰＣＲ産物の純増加がほとんど又はまったくなくなるまで、増幅の速度は減少する。核酸標的の開始コピー数が大きいほど、この「エンドポイント」に早く到達する。プライマーは、たとえばＴａｑｍａｎ（商標）技術といった当分野の標準的な手順を用いて設計することができる。
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグによって標識されたプローブを用い、さらに定数のサイクル後に産物の蓄積を測定するのではなく、蓄積時にＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量アッセイのエンドポイントＰＣＲとは異なる。この反応は、サイクル中の時点で標的配列の増幅が蛍光の著しい増加によって最初に検出されることを特徴とする。リアルタイムＰＣＲの利点は、試料中の標的配列の量を正確に求められることである。適切なプロトコルは、たとえばＭｅｕｅｒ Ｓ．等（２０００）に記載されている。
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮアーゼ保護）アッセイは、溶液中の特定のＲＮＡを定量するための極めて感度の高い技法である。リボヌクレアーゼ保護アッセイは、総細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択ｍＲＮＡを標的として行うことができる。リボヌクレアーゼ保護アッセイの感度は、高比放射能に放射性標識された相補ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写プローブの使用に由来する。このプローブ及び標的ＲＮＡを溶液中でハイブリダイズし、その後、混合物を希釈し、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）で処理して、残存するすべての１本鎖ＲＮＡを分解する。プローブのハイブリダイズされた部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動、それに続くオートラジオグラフィによって視覚化することができる。保護断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるので、リボヌクレアーゼ保護アッセイは、ｍＲＮＡの特徴を正確にマッピングするために用いることができる。プローブが標的ＲＮＡに対してモル過剰にハイブリダイズされる場合、生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。
遺伝子発現は、レポーター系を用いて検出することもできる。そのようなレポーター系は、たとえばモニターされている遺伝子など、発現系の制御下で容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出し、選別することのできる蛍光マーカーが好ましい。特に好ましくは、ＧＦＰ及びルシフェラーゼである。他の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカーであり、すなわち細胞表面に発現し、容易に同定可能なタンパク質である。
一般に、レポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナリングを検出するために有用なレポーターコンストラクトは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）の一般的な教示に従って構築することができる。典型的に、本発明によるコンストラクトは、対象となる遺伝子によるプロモーター、及びたとえばＧＦＰ又はルシフェラーゼなどの、所望のレポーターコンストラクトをコードしているコード配列を含む。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードしているベクターは、当分野で知られており、市販され入手可能である。
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上に例示したように、当分野で知られている任意の技法によって行うことができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリ又はＦＡＣＳによって選別することができる。全般的な参考文献として、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
フローサイトメトリは、細胞を研究及び精製するための強力な方法である。フローサイトメトリは、特に免疫学及び細胞生物学において広範な適用が見出されているが、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多くの分野に適用することができる。頭字語ＦＡＣＳは、蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）を表し、「フローサイトメトリ」と互換的に用いられる。細い流体に保持された個々の細胞が１つ又は複数のレーザービームを通過し、それによって光が散乱し、蛍光色素が様々な周波数で光を放射することがＦＡＣＳの原理である。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気信号に変換し、それをソフトウエアで解釈して細胞に関するデータを生じる。明確な特徴を有する細胞の亜集団を同定し、非常に高い純度で（〜１００％）懸濁液から自動的に選別することができる。
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の遺伝子発現を測定するために用いることができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接、又はコンストラクトのレポーター遺伝子を用いて間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光性基質を用いて、ＦＡＣＳによって検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、酵素で開裂されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕獲される。したがって、１つの酵素が多量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰコンストラクトを発現する細胞は、基質の添加なしに蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが、同じチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの変異体が利用可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置において、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって２つのトランスフェクションを同時にアッセイできる。
細胞を選別する別の手段も用いることができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブは、後に手動又はＦＡＣＳ選別法を用いて選別できるように、個々にポリペプチドのｍＲＮＡを発現する細胞を同定するために用いることができる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）によって記載されている一般的な手順を用い、上述の教示に従って調製することができる。
好ましい実施形態において、本発明は、ＦＡＣＳ細胞選別で用いることのできる蛍光団にコンジュゲートした、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用を含む。
いわゆる遺伝子チップアレイ又は高密度ＤＮＡアレイを用いて、遺伝子発現及び同一性に関する情報を得るための方法も記載されている（Ｃｈｅｅ）。これらの高密度アレイは、特に診断及び予後に有用である。ｉｎ ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）を用いることもできる（Ｃａｍｉｌｌｉ）。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較したときに、たとえば治療又は疾患中にアップレギュレートされた遺伝子を同定する。
タンパク質アッセイを用いる利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを判定するために用いることのできるアッセイ技法は、当分野の技術者によく知られている。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、ＦＡＣＳ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の発現又は相互作用を調節するために処理された免疫細胞であることもできる。そのような細胞は、たとえばその原本を参照により本明細書の一部とするＬｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ．のＷＯ００／３６０８９に記載されているとおり、容易に調製することができる。
薬剤組成物
適切には、活性因子は、薬剤として許容される希釈剤、担体、又は賦形剤と組み合わせて（すなわち、薬剤組成物として）投与される。この薬剤組成物は、ヒト及び獣医学においてヒト又は動物に使用するものであることができる。
治療上の使用に許容される担体又は希釈剤は、薬学分野でよく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬剤担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図される投与経路、及び標準的な薬剤の実施を考慮して選ぶことができる。この薬剤組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤として、或いはそれに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。防腐剤、安定剤、染料、及び香味剤も、薬剤組成物に提供することができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁化剤も用いることができる。
いくつかの適用例の場合、活性因子は、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤の形態で、或いは単独又は賦形剤との組み合わせでカプセル剤又は小卵剤で、或いは香味剤又は着色剤を含有するエリキシル剤、液剤、又は懸濁剤の形態で経口によって投与することができる。
或いは、又はそれに加えて、活性因子は、吸入、鼻腔内、エアロゾルの形態、或いは座剤又は膣座剤の形態で投与することができ、或いはローション、溶液、クリーム、軟膏、又は粉剤の形態で局所的に適用することもできる。経皮投与の別の手段は、皮膚パッチの使用による。たとえば、ポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性エマルションからなるクリームに混合することができる。活性因子はさらに、必要に応じて上記の安定剤及び防腐剤と共に、白色ワックス又は白色軟質パラフィンベースからなる軟膏に、１から１０重量％の濃度で混合することもできる。
ポリヌクレオチド及びタンパク質／ポリペプチドなどの活性因子は、ウイルス又は非ウイルス技法によって投与することもできる。ウイルス送達機構には、これに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが含まれる。非ウイルス送達機構には、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン面状両親媒性物質（ＣＦＡ）、及びその組み合わせが含まれる。そのような送達機構の経路には、これに限定されるものではないが、粘膜、鼻腔、経口、非経口、胃腸管、局所、又は舌下経路が含まれる。活性因子は、ＤＮＡワクチン接種などの通常のＤＮＡ送達技法、或いは注射、又は無針システムによる送達、たとえば表皮、又は粘膜表面などの他の部位に送達するためにＤＮＡで被覆した粒子のバリスティック送達などによって投与することができる。
典型的に、医師は、個々の患者にもっとも適している実際の投与量を決定し、その投与量は、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なる。上記の用量は、平均的な場合の例である。当然ながら、より高い又はより低い用量範囲が有利である個々の事例もあり、それらは本発明の範囲内である。
一般に、治療上有効な経口又は静脈内用量は、治療される対象の体重１ｋｇ当たり０．０１から５０ｍｇ、好ましくは０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲である可能性が高い。コンジュゲートは、静脈内注入によって投与することができ、用量は０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時の範囲である可能性が高い。
コンジュゲートの錠剤又はカプセル剤は、必要に応じて、１度に１つ又は２つ以上投与することができる。コンジュゲートを持続作用性製剤で投与することもできる。
活性因子は、たとえば空洞内、静脈内、筋内、皮内、又は皮下に非経口で注射することもできる。
非経口投与の場合、活性因子は、他の物質、たとえば血液と等張の溶液を作るのに充分な塩又は単糖を含有することができる無菌水溶液の形態で用いることができる。
頬又は舌下投与の場合、活性因子は、通常の方法で製剤化できる錠剤又はロゼンジの形態で投与することができる。
対象（患者など）に経口、非経口、頬、及び舌下投与する場合、活性因子並びにそれらの薬剤として許容される塩及び溶媒和物の用量レベルは、典型的に１０から５００ｍｇ（単回又は分割投与）であることができる。したがって、例として、錠剤又はカプセル剤は、必要に応じて、１度に１つ又は２つ以上を投与するために、５〜１００ｍｇの活性因子を含有することができる。上記のとおり、医師は、個々の患者にもっとも適している実際の投与量を決定し、その投与量は、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なる。上記の用量は平均的な場合の例であるが、当然ながら、より高い又はより低い用量範囲が有利である個々の事例もあり、それらは本発明の範囲内であることに留意されたい。
熟練した医師は、たとえば患者の年齢、体重、及び状態に応じて、任意の特定の患者に最適な投与経路及び投与量を容易に決定することができるので、記載した投与経路及び投与量は指針にすぎない。
本明細書では、治療又は療法という用語は、診断及び予防適用例を含むものと考えられるべきである。
本発明の治療は、ヒト及び獣医学両方の適用例を含む。
活性因子は、これに限定されるものではないが、従来の注射器、無針注射装置、又は「マイクロプロジェクタイル衝撃遺伝子銃」を含む、任意の適切な手段で投与することもできる。或いは、ポリヌクレオチドなどの活性因子は、個体から除去されている細胞に種々の手段で導入することもできる。そのような手段には、たとえばｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオポレーション、マイクロインジェクション、及びマイクロプロジェクタイル衝撃が含まれる。因子が細胞に取り込まれた後、細胞を個体に再移植することができる。さらに、組み込まれた遺伝子コンストラクトを有する他の点では非免疫原性である細胞は、そのワクチン接種細胞が元は他の個体から採取された場合であっても、ある個体に移植できることが企図される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態によれば、活性因子は、無針注射装置を用いて個体に投与することができる。たとえば、活性因子は、無針注射装置を用いて皮内、皮下、及び／又は筋内経路で個体に投与することができ、或いは同様に、たとえば気道、胃腸管、又は尿生殖管の粘膜組織に送達することができる。無針注射装置は、よく知られており、広く入手可能である。無針注射装置は、特に遺伝物質を組織に送達するのに適している。無針注射装置は、特に遺伝物質を皮膚及び筋肉細胞に送達するのに有用である。いくつかの実施形態において、たとえば、ＤＮＡ分子を含有する液体を個体の皮膚の表面に噴射するために無針注射装置を用いることができる。この液体は、皮膚との衝撃で液体が皮膚の表面に浸透し、下の皮膚及び／又は筋肉組織に浸透するように、充分な速度で噴射される。したがって、遺伝物質は皮内、皮下、及び筋内に、同時又は選択的に投与される。いくつかの実施形態において、無針注射装置を用いて、核酸分子を器官の細胞に導入するために、他の器官の組織に遺伝物質を送達することができる。
好ましくは、本発明による薬剤調剤は、無菌であり、発熱物質を含まない。
薬剤投与
典型的に、医師は、個々の対象にもっとも適している実際の投与量を決定し、その投与量は、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なる。下記の用量は、平均的な場合の例である。当然ながら、より高い又はより低い用量範囲が有利である個々の事例も存在し得る。
一実施形態において、本発明に用いられる治療剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接患者に投与できることが理解される。或いは、又はそれに加えて、この薬剤は、ｅｘ ｖｉｖｏの様式で、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣなどの免疫細胞に投与することができる。たとえば、Ｔ細胞又はＡＰＣなどの白血球を、知られている様式で患者又はドナーから得て、本発明の様式でｅｘ ｖｉｖｏで処理／インキュベートし、その後、患者に投与することができる。
一般に、本発明による活性因子のコンジュゲートの治療上有効な１日用量は、たとえば治療される対象の体重１ｋｇ当たり０．０１から５０ｍｇ、好ましくは０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。
熟練した医師は、たとえば患者の年齢、体重、及び状態に応じて、任意の特定の患者に最適な投与経路及び投与量を容易に決定することができる。好ましくは、薬剤組成物は、単位投与形態である。本発明は、ヒト及び獣医学両方の適用例を含む。
「同時に」とは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが実質的に同時に、好ましくは同一の製剤において共に投与されることを意味する。
「同時期に」とは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが接近した時間に投与されることを意味し、たとえば癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターが投与される前又は後、約１分から約１日以内に投与される。任意の同時期の時間が有用である。しかしながら、多くの場合、同時に投与されないとき、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドは、約１分から約８時間以内に、好ましくは約１時間から約４時間未満内に投与される。同時期に投与される場合、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドは、好ましくは動物の同じ部位に投与される。「同じ部位」という用語は、正確な位置を含むが、約０．５から約１５ｃｍ以内、好ましくは約０．５から約５ｃｍ以内であり得る。
本明細書では、「個別に」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが、ある間隔で、たとえば約１日から数週間又は数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性因子は、いずれの順序で投与してもよい。
さらに、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドより頻繁に投与することができ、又はその逆も同様である。
本明細書では、「順次」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び癌抗原、抗原決定基、或いはその癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが、順に、たとえば数分、数時間、数日、又は数週の間隔で投与されることを意味する。適切な場合、活性因子は規則的な繰り返し周期で投与される。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現腫瘍細胞
ＷＯ０１３５９９０に記載のとおり、Ｎｏｔｃｈリガンドの発現は、メラノーマ細胞系においてすでに同定されている。本発明に関連する可能性のある他の腫瘍細胞には、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、膀胱、ＣＮＳ、食道、頭又は頸部、肝臓、精巣、胸腺、又は甲状腺の癌などの悪性腫瘍に存在する細胞、或いは悪性血球、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、リンパ球前駆体、又は骨髄性細胞前駆体が含まれる。
腫瘍細胞は、充実性腫瘍又は非充実性腫瘍由来の腫瘍細胞であることができ、原発腫瘍細胞又は播種性転移性（２次性）腫瘍細胞であることができる。非充実性腫瘍には、メラノーマ、白血病（急性又は慢性、リンパ性又は骨髄性）、たとえば急性骨髄芽球性、急性前骨髄球性、急性骨髄単球性、急性単球性、赤白血病など、並びにリンパ腫、たとえばホジキン、非ホジキン、及びバーキットリンパ腫などが含まれる。充実性腫瘍には、癌腫、結腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、メラノーマ、基底細胞又は扁平上皮癌、中皮腫、腺癌、神経芽種、神経膠種、星状細胞腫、髄芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨原性肉腫、肝癌、及び精上皮腫が含まれる。
治療的使用
本発明の因子は、悪性腫瘍に罹患している患者に投与することができ、その悪性腫瘍は典型的に、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する癌細胞を含む。Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する、特に過剰発現する癌細胞の存在は、たとえば患者から得た癌組織の試料を上述の方法を用いて試験することによって判定することができる。
治療することのできる悪性腫瘍の例には、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、膀胱、ＣＮＳ、食道、頭又は頸部、肝臓、精巣、胸腺、又は甲状腺の癌が含まれる。血球、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、リンパ球前駆体、又は骨髄性細胞前駆体の悪性腫瘍も治療することができる。
腫瘍は、充実性腫瘍又は非充実性腫瘍であることができ、原発腫瘍又は播種性転移性（２次性）腫瘍であることができる。非充実性腫瘍には、メラノーマ、白血病（急性又は慢性、リンパ性又は骨髄性）、たとえば急性骨髄芽球性、急性前骨髄球性、急性骨髄単球性、急性単球性、赤白血病など、並びにリンパ腫、たとえばホジキン、非ホジキン、及びバーキットリンパ腫などが含まれる。充実性腫瘍には、癌腫、結腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、メラノーマ、基底細胞又は扁平上皮癌、中皮腫、腺癌、神経芽種、神経膠種、星状細胞腫、髄芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨原性肉腫、肝癌、及び精上皮腫が含まれる。
腫瘍は、腫瘍特異抗原（たとえばウイルス性コード抗原、ＭＵＣ１などのｎｅｏ抗原、抗体イディオタイプ）、腫瘍細胞の表面に過剰発現される抗原、癌／精巣（ＣＴ）抗原を含む腫瘍胎児抗原、又は分化抗原（チロシナーゼ及びメラノサイト抗原など）を含む細胞内又は膜結合抗原を提示するものであることができる。患者は、Ｔｈ１又はＴｈ２型免疫応答などの腫瘍の抗原に対する進行性免疫応答を有することができ、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって判定される検出可能な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、ＮＫ細胞活性、及び／又は腫瘍に対する抗体応答を有することができる。
ワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物及び調剤は、口／頬／腸管／膣／直腸又は鼻腔経路などの粘膜経路によって前記ワクチンを投与することにより、疾患に罹患しやすい、又は罹患している哺乳動物を防御又は治療するために用いることができる。そのような投与は、液滴、スプレー、又は乾燥粉末形態であることができる。適切である場合には、ネブライザー化又はエアロゾル化ワクチン製剤も用いることができる。
腸溶性製剤、たとえば経口投与用の胃耐性カプセル剤及び顆粒剤、直腸又は膣投与用の座剤も用いることができる。本発明はさらに、たとえば皮内、経真皮、又は経皮膚送達によって皮膚に適用される抗原の免疫原性を増強するために用いることもできる。さらに、本発明のアジュバントは、たとえば筋内又は皮下投与によって非経口で送達することができる。
投与経路に応じて、種々の送達装置を用いることができる。たとえば、鼻腔内投与の場合、市販のＡｃｃｕｓｐｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などのスプレー装置を用いることができる。
鼻腔内に用いる好ましいスプレー装置は、装置の動作が使用者によって加えられる圧力に依存しない装置である。これらの装置は、圧閾値装置として知られている。液体は、閾値圧に達したときにのみノズルから放出される。これらの装置によって、一定の液滴径を有する噴霧を容易に得ることができる。本発明での使用に適した圧閾値装置は当分野で知られており、たとえばＷＯ９１／１３２８１及びＥＰ３１１８６３Ｂに記載されている。そのような装置は、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍｂＨから市販されている。
ある種のワクチン製剤の場合、製剤に他のワクチン成分を含むことができる。たとえば、本発明のアジュバント製剤はさらに、胆汁酸、又はコール酸の誘導体を含むことができる。適切には、コール酸の誘導体は、その塩、たとえばナトリウム塩である。胆汁酸の例には、コール酸自体、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、並びに上記胆汁酸のグリコ、タウロ、アミドプロピル−１−、プロパンスルホン酸、及びアミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、又はＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドなどの誘導体が含まれる。
適切には、本発明のアジュバント製剤は、非小胞形態の水溶液又は懸濁液の形態であることができる。そのような製剤は、製造及び滅菌（たとえば、４５０又は２２０ｎｍ孔膜の最終濾過）に好都合である。
適切には、前記宿主への投与経路は、皮膚、筋内、又は鼻粘膜などの粘膜表面である。混合物が鼻粘膜を経て投与されるとき、その混合物は、たとえばスプレーとして投与することができる。免疫応答を増強する方法は、ワクチンのプライミング又はブースト投与のいずれかであってよい。
本明細書では、「アジュバント」という用語は、脊椎動物対象の免疫系の抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を増強する能力を有する因子を含む。
「免疫応答」という用語は、対象の免疫系による抗原又は抗原決定基に対する任意の応答を含む。免疫応答には、たとえば、体液性免疫応答（たとえば抗原特異抗体の産生）、及び細胞媒介性免疫応答（たとえばリンパ球増殖）が含まれる。
「細胞媒介性免疫応答」という用語には、リンパ球によってもたらされる免疫防御、たとえばＴ細胞リンパ球がそれらの犠牲細胞に接近したとき、Ｔ細胞リンパ球によってもたらされる防御などが含まれる。
「リンパ球増殖」を測定するとき、特定の抗原に応答して増殖するリンパ球の能力を測定することができる。リンパ球増殖には、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、又はＣＴＬ細胞増殖が含まれる。
本発明の組成物は、多種多様な供給源に由来する抗原を含有するワクチンを製剤するために用いることができる。たとえば、抗原は、ヒト、細菌、又はウイルスの核酸、癌由来抗原又は抗原製剤、ＧｎＲＨ及びＩｇＥペプチドを含む宿主由来抗原、組換えによって産生されたタンパク質又はペプチド、及びキメラ融合タンパク質を含むことができる。
好ましくは、本発明のワクチン製剤は、ヒト癌抗原に対する免疫応答を誘出することのできる抗原又は抗原組成物を含有する。この１つ又は複数の抗原は、たとえばペプチド／タンパク質、多糖、及び脂質であってよい。
本発明のこの態様に従って、抗原及び抗原決定基は多くの異なる形態で用いてよいことが理解される。たとえば、抗原及び抗原決定基は、単離タンパク質又はペプチド（たとえば、いわゆる「サブユニットワクチン」）、或いはたとえば細胞関連又はウイルス関連抗原又は抗原決定基（たとえば生又は死細胞株）として存在することができる。或いは、抗原又は抗原決定基は、抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを用いて、対象のｉｎ ｓｉｔｕで産生することができる（いわゆる「ＤＮＡワクチン接種」であるが、上で論じたように、このアプローチに用いることのできるポリヌクレオチドは、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡ及び修飾ポリヌクレオチドを含んでよいことが理解される）。
本明細書では、「遺伝子ワクチン」という用語は、ポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）を含む薬剤製剤を指す。遺伝子ワクチンには、予防及び／又は治療的免疫応答を誘発するのに有用な薬剤製剤が含まれる。治療用ワクチンは、「ファーマクチン」とも称される。
たとえばＵＳ６０２５３４１などに論じられているように、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドの直接注射は、免疫化のために抗原を送達する有望な方法である（Ｂａｒｒｙ等、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９４、１６、６１６〜６１９、Ｄａｖｉｓ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３、１１、１８４７〜１８５１、Ｔａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３５６、１５２〜１５４、Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、３３３８〜３３４４、及びＷｏｌｆｆ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２４７、１４６５〜１４６８）。このアプローチは、マウス及びニワトリでインフルエンザウイルスに対して、マウス及びウシでウシヘルペスウイルス１に対して、並びにマウスにおいて狂犬病ウイルスに対して、防御免疫を生じるために首尾よく用いられている（Ｃｏｘ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、５６６４〜５６６７、Ｆｙｎａｎ等、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３、１２、７８５〜７８９、Ｕｌｍｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、２５９、１７４５〜１７４９、及びＸｉａｎｇ等、Ｖｉｒｏｌ．１９９４、１９９、１３２〜１４０）。
本発明による使用に適した遺伝子ワクチンは、たとえば、約１ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡなどのポリヌクレオチド、適切には約１０ナノグラムから約８００マイクログラム、適切には約０．１から約５００マイクログラム、適切には約１から約３５０マイクログラム、適切には約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡなどのポリヌクレオチドを含む。
ワクチン投与量中のタンパク質の量は、典型的な受容者において、著しい有害な副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が用いられるか、どのように提示されるかによって決まることになる。典型的に、各投与量は、１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、もっとも好ましくは１〜５０μｇのタンパク質を含むことが予期される。最初のワクチン接種後、対象は、適切な間隔で１回又は数回のブースター免疫付与を受けることができる。
本発明のワクチンは、経口によって投与することもできる。そのような場合、薬剤として許容される賦形剤には、アルカリ緩衝液、或いは腸溶性カプセル剤又は微顆粒剤も含まれる。本発明のワクチンは、膣経路によって投与することもできる。そのような場合、薬剤として許容される賦形剤には、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬなどのポリマー、膣クリーム及び座剤の他の知られている安定剤が含まれる。本発明のワクチンは、直腸経路によって投与することもできる。そのような場合、賦形剤には、直腸座剤の形成用に当分野で知られているワックス及びポリマーが含まれる。
本発明の製剤は、予防及び治療目的の両方に用いることができる。ワクチンの調製は、一般的に、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖｏｌｌｅｒ等編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。
本発明のアジュバントはさらに、他のアジュバントと組み合わせてもよいことが理解され、たとえばコレラ毒素及びそのＢサブユニット、Ｅ．Ｃｏｌｉ熱不安定エンテロトキシンＬＴ、そのＢサブユニットＬＴＢ、及びｍＬＴなどのその無毒化型、免疫的に活性なサポニン分画、たとえば南米の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するＱｕｉｌ Ａ及びその誘導体（たとえばＱＳ２１、ＵＳ５０５７５４０に記載）、オリゴヌクレオチドアジュバント系ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５に記載）、特に５’ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ３（配列番号１）、及びモノホスホリル脂質Ａ及びその非毒性誘導体３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ、ＧＢ２２２０２１１に記載）が含まれる。
本発明は、免疫応答の大きさの増大及び／又は持続期間の増大を提供する。好ましくは、本発明は、増大した防御免疫応答を提供する。
本発明はさらに、選択的Ｔｈ１又はＴｈ２免疫性を生じることを企図する。一般に、Ｔ細胞は、異なるエフェクター機能を示す異なる亜集団で作用し得る。Ｔ細胞応答は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を特徴とする炎症性Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）であり得る。Ｔｈ１細胞は、細胞防御のヘルパー細胞であるが、抗体分泌にはほとんど役に立たない。他の種類のＴ細胞応答は、一般に抗炎症性であり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０を産生するが、ＩＬ−２又はＩＦＮ−ガンマはほとんど又はまったく産生しないＴｈ２細胞によって媒介される。Ｔｈ２細胞は、抗体産生のヘルパー細胞である。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞は共にこれらの亜集団で生じる。Ｔｈ１／Ｔｈ２：ＣＤ４、Ｔｃ１／Ｔｃ２：ＣＤ８。
好ましい実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター／阻害剤は、抗原に対する細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞応答を増大する。
コンジュゲート
上記のとおり、本発明はさらに、第１及び第２の配列を含むコンジュゲートを提供し、第１の配列は、癌抗原又は抗原決定基、或いはそのような抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含み、第２の配列は、Ｎｏｔｃｈシグナリング調節のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。本発明のコンジュゲートは、タンパク質／ポリペプチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートであることができる。
コンジュゲートがポリヌクレオチドコンジュゲートである場合、適切には、癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド配列及びＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターをコードしているポリヌクレオチド配列を含むプラスミドなどのポリヌクレオチドベクターの形態を取ることができ、好ましくは、各配列は真核細胞における発現に必要とされる調節因子に機能可能に結合している。そのような一形態のベクターの概略を図１１に示す。
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターをコードしているポリヌクレオチド配列は、Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１、又はＪａｇｇｅｄ２などのＮｏｔｃｈリガンドをコードしているヌクレオチド配列、或いはそのような配列の生物活性のある断片、誘導体、又は相同体であることができる。ヒトの治療が意図される場合、適切には、ヒト配列に基づく配列を用いることができる。
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターをコードしているポリヌクレオチド配列は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び少なくとも１から２０、適切には少なくとも２から１５、適切には少なくとも２から１０、たとえば少なくとも３から８のＥＧＦ様ドメインをコードしているヌクレオチド配列であることができる。適切には、ＤＳＬ及びＥＧＦ様ドメイン配列は、哺乳動物配列であるか、哺乳動物配列に対応している。適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターをコードしているポリヌクレオチド配列はさらに、膜貫通ドメイン、及び適切にはＮｏｔｃｈリガンド細胞内ドメインを含むことができる。好ましい配列には、ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１、又はＪａｇｇｅｄ２配列などのヒト配列が含まれる。
所望であれば、癌抗原又は抗原決定基をコードするポリヌクレオチド配列にはさらに、投与される細胞内で抗原又は抗原決定基の輸送を方向づけるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。たとえば、そのようなシグナル配列は、細胞質、細胞膜、小胞体、又はリソソームに分泌又は局在される抗原又は抗原決定基を方向づけることができる。
ＤＮＡ発現の調節因子には、プロモーター、及びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、所望であれば、Ｋｏｚａｋ領域などの他の因子も含むことができる。開始及び終止シグナルは、多くの場合コード配列の一部とみなされる調節因子である。
適切なプロモーターの例には、これに限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター、並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが含まれる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、眼内上皮細胞に特異的な組織特異プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、ケラチン、Ｗｎｔ−１、及びロドプシンプロモーターである。適切には、ＳＰＣなどの上皮細胞プロモーターを用いることができる。
適切なポリアデニル化シグナルの例には、これに限定されるものではないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれる。たとえば、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）で用いられるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いることができる。
ＤＮＡ発現に必要な調節因子に加えて、コンジュゲートに他の因子も含むことができる。そのような追加の因子には、たとえばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、並びにＣＭＶ、ＲＳＶ、及びＥＢＶなどに由来するウイルスエンハンサーから選択することのできるエンハンサーが含まれる。
細胞に投与され、取り込まれるとき、ヌクレオチドコンジュゲートは、たとえば機能性染色体外分子としてその細胞内に存在したままであり、かつ／又は細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることができる。ＤＮＡは細胞に導入されることができ、そこで１つ又は複数のプラスミドの形態で分離した遺伝物質のままである。或いは、染色体に組み込まれ得る線状ＤＮＡを、細胞に導入することができる。ＤＮＡが細胞に導入されるとき、ＤＮＡの染色体への組込みを促進する試薬を添加することができる。組込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列を、ＤＮＡ分子に含むこともできる。或いは、ＲＮＡを細胞に投与することができる。たとえば、セントロメア、テロメア、及び複製起点を含むミニ染色体の形態でコンジュゲートを提供することが可能である。
所望であれば、コンジュゲートは、染色体外にコンストラクトを維持し、細胞内にコンストラクトの複数のコピーを産生するために、哺乳動物複製起点を含むことができる。たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）のプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン−バーウイルス複製起点、及び組込みなしにエピソーム複製の大量コピーを生じる核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含有する。
タンパク質の産生を最大にするために、コンストラクトが投与される細胞型における遺伝子発現に適した調節配列を選択することができる。さらに、細胞内でもっとも効率よく転写されるコドンを選択することができる。
そのようなコンジュゲートは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤、及び癌抗原又は抗原決定基の両方の発現を提供するために、「遺伝子ワクチン接種」アプローチによってｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで用いることができる。
促進剤
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、促進剤の投与と併せて送達することができる。核酸分子と併せて投与される促進剤は、核酸分子との混合物として投与することができ、或いは核酸分子の投与と同時、投与前、又は投予後に、個別に投与することができる。促進剤の例には、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタン、及びその塩酸塩、たとえば局所麻酔剤群などが含まれる。
エステルの例には、安息香酸エステル、たとえばピペロカイン、メプリルカイン、及びイソブカインなど、パラアミノ安息香酸エステル、たとえばプロカイン、テトラカイン、ブテタミン、プロポキシカイン、及びクロロプロカインなど、メタブタミン及びプリマカインを含むメタアミノ安息香酸エステル、パラエトキシ安息香酸エステル、たとえばパルエトキシカインなどが含まれる。アニリドの例には、リドカイン、エチドカイン、メピバカイン、ブピバカイン、ピロカイン、及びプリロカインが含まれる。そのような化合物の他の例には、ジブカイン、ベンゾカイン、ジクロニン、プラモキシン、プロパラカイン、ブタカイン、ベノキシネート、カルボカイン、メチルブピバカイン、ブタシンピクラート（ｂｕｔａｓｉｎ ｐｉｃｒａｔｅ）、フェナカイン、ジオタン（ｄｉｏｔｈａｎ）、ルカイン、イントラカイン、ヌペルカイン、メタブトキシカイン、ピリドカイン、ビフェナミン、及び植物由来の２環式、たとえばコカイン、シンナモイルコカイン、トルキシリン（ｔｒｕｘｉｌｌｉｎｅ）、及びコカエチレン、並びに塩酸塩と複合したそれらのすべての化合物が含まれる。
促進剤は、遺伝子コンストラクトの前、それと同時に、又はそれに続いて投与することができる。促進剤及び遺伝子コンストラクトは、同じ組成物に製剤化することができる。
ブピバカイン−ＨＣｌは、化学的に、２−ピペリジンカルボキサミド，１−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）一塩酸塩一水和物と表され、Ａｓｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｏｒｏ、Ｍａｓｓ）、Ｓａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒｏｐ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ．Ｙ．）を含む多くの供給元から薬剤に用いるために広く市販されている。ブピバカインは、メチルパラベンを含むか含まずに、かつエピネフリンを含むか含まずに、市販として製剤化されている。そのような任意の製剤を用いることができる。薬剤として用いるために濃度０．２５％、０．５％、及び０．７５％で市販により入手可能であり、それを本発明に用いることができる。所望であれば、所望の作用を誘出する別の濃度、特に０．０５％〜１．０％の濃度を調製することもできる。適切には、たとえば、約２５０μｇから約１０ｍｇのブピバカインを投与することができる。
抗原提示細胞
必要であれば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞であることができ、又はＴ細胞に抗原を提示するように誘導され得る他の細胞であることができる。或いは、ＡＰＣを産生する培養条件下で分化する又は活性化されるＡＰＣ先駆体を用いることができる。本発明のｅｘ ｖｉｖｏ法で用いられるＡＰＣは、典型的に患者の体内で見出される腫瘍又は末梢血から単離される。好ましくは、ＡＰＣ又は前駆体は、ヒト由来である。しかしながら、ＡＰＣが適切な核酸配列を同定及び試験するための予備ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング手順に用いられる場合、健康な患者などの任意の適切な供給源のＡＰＣを用いることができる。
ＡＰＣには、樹状細胞（ＤＣ）、たとえば相互連結ＤＣ又は濾胞ＤＣなど、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、或いは上皮細胞、線維芽細胞、又は内皮細胞などのトランスフェクションによって活性化又は操作されてその表面にＭＨＣ分子（クラスＩ又はＩＩ）を発現する他の細胞型が含まれる。ＡＰＣの前駆体には、ＣＤ３４＋細胞、単球、線維芽細胞、及び内皮細胞が含まれる。ＡＰＣ又は前駆体は、培養条件によって修飾することができ、或いはたとえば抗原提示及び／又は免疫相乗作用を促進する選択されたサイトカインの組み合わせ（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８など）において役割を果たすタンパク質をコードしている１つ又は複数の遺伝子のトランスフェクションによって遺伝子的に修飾することもできる。そのようなタンパク質には、ＭＨＣ分子（クラスＩ又はＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＣＤ４０が含まれる。もっとも好ましくは、ＤＣ又はＤＣ前駆体がＡＰＣの供給源として含まれる。
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの手段によって単離／調製することができ、たとえば樹状細胞は、末梢血から直接精製する、或いはたとえばＧＭ−ＣＳＦによる処理によって末梢血に移行した後にＣＤ３４＋前駆体細胞から、又は骨髄から直接生じることができる。末梢血からの接着前駆体はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（Ｉｎａｂａ Ｋ等（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１１５７〜１１６７（Ｉｎａｂａ））、或いは骨髄からの非接着ＣＤ３４＋細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αで処理することができる（Ｃａｕｘ Ｃ等、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８〜２６１（Ｃａｕｘ））。ＤＣは、精製末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、接着細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で２時間処理するＳａｌｌｕｓｔｏ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９〜１１１８）の方法と同様に、ヒト志願者の末梢血から慣例的に調製することもできる。必要に応じて、これらは電磁ビーズを用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞、及びＣＤ３＋、ＣＤ２＋Ｔ細胞を除去することができる（Ｃｏｆｆｉｎ ＲＳ等（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１８〜７２２（Ｃｏｆｆｉｎ））。培養条件には、維持するためのＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−４などの他のサイトカイン、或いは樹状細胞又は他の抗原提示細胞の活性が含まれ得る。
したがって本明細書では、「抗原提示細胞など」という用語は、ＡＰＣに限定されるものではないことが理解される。当分野の技術者は、Ｔ細胞集団に提示することのできる任意のビヒクルを使用できることを理解するであろうが、便宜上これらのすべてを指すためのＡＰＣという用語を用いる。上述のとおり、適切なＡＰＣの好ましい例には、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞、又は脂質膜などの合成ＡＰＣが含まれる。
Ｔ細胞
必要に応じて、健康な患者などの任意の適切な供給源由来のＴ細胞を用いることができ、血液又は他の供給源（リンパ節、脾臓、又は骨髄など）から得ることができる。Ｔ細胞は場合によって標準的な手順で濃縮又は精製することができる。Ｔ細胞は、同一又は異なる個体から得られた他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。或いは、Ｔ細胞及び他の細胞型の供給源として、全血、或いは白血球濃縮血又は精製白血球を用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）の使用が特に好ましい。或いは、ＣＤ８＋細胞などの他のＴ細胞を用いることができる。Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞系を用いるのも好都合である。
したがって本明細書では、「抗原提示細胞など」という用語は、ＡＰＣに限定されるものではないことが理解される。当分野の技術者は、Ｔ細胞集団に提示することのできる任意のビヒクルを使用できることを理解するであろうが、便宜上これらのすべてを指すためのＡＰＣという用語を用いる。上述のとおり、適切なＡＰＣの好ましい例には、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞、又は脂質膜などの合成ＡＰＣが含まれる。
ＡＰＣ及びＴ細胞への因子の暴露
Ｔ細胞／ＡＰＣ／腫瘍細胞は、上述のとおり培養することができる。ＡＰＣ／Ｔ細胞／腫瘍細胞は、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド発現を妨げる又はダウンレギュレートすることのできる物質にインキュベート／暴露することができる。Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド発現がダウンレギュレートされた、結果として生じるＴ細胞／ＡＰＣ／腫瘍細胞は、使用できる状態である。たとえば、患者に投与するために調製することができ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でＴ細胞と共にインキュベートすることができる。
たとえば、腫瘍物質を分離し、たとえばＴｏｌｌ様受容体又はＢＭＰ受容体及び／又は共刺激分子（適切な共刺激剤は上述している）をコードする核酸配列でトランスフェクトし、かつ／又はたとえばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２などのサイトカインで処理し、その後、ＴＲＬ及び／又はＴＩＬ細胞をプライムするためにｉｎ ｖｉｔｒｏで用いることができる。
ｅｘ ｖｉｖｏで処理される場合、本発明の修飾細胞は、好ましくは患者のリンパ節への直接注射によって、宿主に投与される。典型的に、１０４から１０８の処理細胞、好ましくは１０５から１０７の細胞、より好ましくは約１０６の細胞が患者に投与される。好ましくは、細胞は濃縮細胞集団の形態を取る。
本明細書では、本発明の細胞集団に適用される「濃縮」という用語は、それらが天然に伴っている他の細胞を少なく有する、より均質な細胞集団を指す。細胞の濃縮集団は、当分野で知られているいくつかの方法で得ることができる。たとえば、Ｔ細胞の濃縮集団は、Ｔ細胞でのみ見出される決定基に特異的なモノクローナル抗体を用い、イムノアフィニティクロマトグラフィを用いて得ることができる。
濃縮集団は、正の選択（所望の細胞のみを回収）又は負の選択（所望でない細胞を除去）によって、混合細胞懸濁液から得ることもできる。親和性材料の特定細胞を獲得する技術は、当分野でよく知られている（Ｗｉｇｚｅｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：２３、１９６９、Ｍａｇｅ等、Ｊ．Ｉｍｎｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５：４７、１９７７、Ｗｙｓｏｃｋｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：２８４４、１９７８、Ｓｃｈｒｅｍｐｆ−Ｄｅｃｋｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．３２：２８５、１９８０、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ等、Ｃｅｌｌ、４４：６５３、１９８６）。
成熟分化細胞に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体は、所望でない細胞を除去する、たとえばそれぞれ同種異系又は自己骨髄移植片からＴ細胞又は悪性細胞を枯渇させるために、種々の負の選択法で用いられてきた（Ｇｅｅ等、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．８０：１５４、１９８８）。モノクローナル抗体及び免疫磁気ミクロスフェアを用いる負の選択によるヒト造血細胞の精製は、複数のモノクローナル抗体を用いて達成することができる（Ｇｒｉｆｆｉｎ等、Ｂｌｏｏｄ、６３：９０４、１９８４）。
細胞を分離する手順には、抗体被覆電磁ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィ、モノクローナル抗体と結合又はモノクローナル抗体と組み合わせた細胞傷害剤、たとえば補体及び細胞毒素、並びに固体マトリクス、たとえばプレートに結合させた抗体を用いる「パニング」、又は他の好都合な技法を含むことができる。正確な分離を提供する技法には、蛍光活性化細胞分離装置が含まれ、これは複数のカラーチャネル、小角及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、様々な程度の精度を有する。
一実施形態において、本発明に用いられる治療剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接患者に投与できることが理解される。或いは、又はそれに加えて、この薬剤は、ｅｘ ｖｉｖｏの様式で、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣなどの細胞に投与することができる。たとえば、Ｔ細胞又はＡＰＣなどの白血球を、知られている様式で患者又はドナーから得て、本発明の様式でｅｘ ｖｉｖｏで処理／インキュベートし、その後、患者に投与することができる。さらに所望であれば、投与経路の組み合わせを用いてよいことが理解される。たとえば、適切な１つの成分（Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターなど）をｅｘ ｖｉｖｏで投与し、他の成分をｉｎ ｖｉｖｏで投与することができ、又はその逆であってもよい。
ＡＰＣ及びＴ細胞への核酸配列の導入
上述のＴ細胞及びＡＰＣは、任意選択でウシ胎児血清の存在下、ＤＭＥＭ又は他の規定培地などの適切な培地で培養される。
ポリペプチド物質は、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣにおいてポリペプチドの発現を可能にする条件下、ポリペプチドをコードしている核酸コンストラクト／ウイルスベクターを細胞に導入することによって、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣに投与することができる。同様に、アンチセンスコンストラクトをコードしている核酸コンストラクトは、トランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によって、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣに導入することができる。
好ましい実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターをコードしているヌクレオチド配列は、コントロール配列に機能可能に結合され、これにはプロモーター／エンハンサー、及び他の発現調節シグナルが含まれる。「機能可能に結合」という用語は、記載の成分が、意図された様式でそれらが機能できる関係にあることを意味する。コード配列に「機能可能に結合」した調節配列は、好ましくは、コード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下で達成されるようにライゲートされる。
プロモーターは、典型的に、哺乳動物細胞において機能するプロモーターから選択されるが、真核生物プロモーター、及び他の真核細胞で機能するプロモーターも用いることができる。プロモーターは、典型的に、ウイルス又は真核生物遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、発現が起こる細胞のゲノムから得ることができる。真核生物プロモーターに関しては、偏在的な様式（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターなど）、或いは組織特異的な様式（ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーターなど）で機能するプロモーターであることができる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、及び眼内上皮細胞に特異的な組織特異プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、ケラチン１４、Ｗｎｔ−１、及びロドプシンプロモーターである。好ましくは、上皮細胞プロモーターＳＰＣが用いられる。特定の刺激に応答するプロモーターであってもよく、たとえばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターである。ウイルスプロモーターも用いることができ、たとえばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、又はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターである。
細胞の生存期間中、異種遺伝子の発現レベルが調節され得るように、プロモーターが誘導可能であることも有利である可能性がある。誘導可能とは、プロモーターを用いて得られる発現のレベルが調節できることを意味する。
上述の任意のプロモーターは、さらなる調節配列、たとえばエンハンサー配列を加えることによって修飾できる。２つ以上の異なるプロモーターの配列要素を含むキメラプロモーターも用いることができる。
或いは（又はそれに加えて）、対象となる遺伝子が本発明で用いられる細胞でのみ発現するように、調節配列は細胞特異性であることができる。そのような細胞には、たとえばＡＰＣ及びＴ細胞が含まれる。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現をアップレギュレートすることのできる核酸コンストラクトを含む、結果として生じるＴ細胞及び／又はＡＰＣは、使用できる状態である。必要であれば、細胞の少量のアリコートを、上に記載のとおりＮｏｔｃｈリガンド発現のアップレギュレーションに関して試験することができる。細胞は患者に投与するために調製することができ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でＴ細胞と共にインキュベートすることができる。
上述の任意のアッセイは（「アッセイ」を参照のこと）、臨床適用例に用いるために、免疫細胞における応答性をモニター又は検出するように適合させることができる。そのようなアッセイには、たとえば、宿主細胞におけるＮｏｔｃｈリガンド活性の検出、又はドナー細胞におけるＮｏｔｃｈ開裂のモニターが含まれる。免疫細胞活性をモニターするさらなる方法を以下に記載する。
免疫細胞活性は、当分野の技術者に知られている任意の適切な方法によってモニターすることができる。たとえば、細胞傷害活性をモニターすることができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、活性化後の増強された細胞傷害活性を実証する。したがって、細胞傷害性の低下又は安定化は、応答性の低減を示唆する。
活性化後、白血球は様々な新しい細胞表面抗原を発現する。ＮＫ細胞は、活性化後、たとえばトランスフェリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ２５ ＩＬ−２受容体を発現する。したがって、応答性の低減は、これらの抗原の発現をモニターすることによって評価することができる。
Ｈａｒａ等、Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＩＩＩ，Ｒａｐｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ２８ｋＤ／３２ｋＤ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｅａｒｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＥＡ−１）ｂｙ １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｍｉｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１９８８（１９８６）及びＣｏｓｕｌｉｃｈ等、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＬＲ３）Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｓｔｅｐ ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ、８４：４２０５（１９８７）は、活性化直後に、Ｔ細胞に発現する細胞表面抗原を記載している。これらの抗原、ＥＡ−１及びＭＬＲ３はそれぞれ、２８ｋＤ及び３２ｋＤの主要成分を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１及びＭＬＲ３は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではなく、さらにＭＬＲ３Ｍａｂは、ＩＬ−１結合を遮断する。これらの抗原は、１８時間以内に活性化Ｔ細胞に出現し、したがって免疫細胞応答性をモニターするために用いることができる。
さらに、白血球応答性は、参照により本明細書の一部とするＥＰ０３２５４８９に記載のとおりモニターすることができる。簡潔には、これは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９６２７と称されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって認識される細胞抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３」）を用いて行われる。
Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、活性化され抗原刺激された白血球の細胞表面抗原を認識する。活性化ＮＫ細胞において、抗原Ｌｅｕ２３は、活性化後４時間以内に発現し、長ければ活性化後７２時間発現を続ける。Ｌｅｕ２３は、少なくとも２つのＮ結合炭水化物を有する２４ｋＤサブユニットからなるジスルフィド結合ホモ２量体である。
ＮＫ細胞におけるＬｅｕ２３の出現は、細胞傷害性の発生と相関し、ある種のＴ細胞におけるＬｅｕ２３の出現は、Ｔ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、白血球の応答性をモニターするのに有用である。
免疫細胞応答性をモニターするための技法のさらなる詳細は、参照により本明細書の一部とする「Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ」Ｌｅｗｉｓ Ｃ．Ｅ．及びＪ．Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９２、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ．「Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ」Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９、４７号、１８７〜３７６頁、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ」の第７章「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｍａｋ Ｔ．Ｗ．及びＪ．Ｊ．Ｌ．Ｓｉｍａｒｄ、１９９８に見出すことができる。
プライムされたＡＰＣ及びリンパ球の調製
本発明の一態様によれば、免疫細胞は、抗原又はアレルゲンを提示するために用いることができ、かつ／又はＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の発現又は相互作用を調節するために処理することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、任意選択でウシ胎児血清などの血清の存在下、ＤＭＥＭ又は他の規定培地などの適切な培地で培養することができる。最適サイトカイン濃度は、滴定によって求めることができる。次いで、典型的には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることのできる１種又は複数の物質を、対象となる抗原と共に培地に添加する。抗原は、物質の前、後、又は実質的に同時に添加することができる。細胞は、典型的に、物質及び抗原と共に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、３７℃でインキュベートする。必要であれば、上述のように、調節された標的遺伝子発現に関して、細胞の少量のアリコートを試験することができる。或いは、細胞の活性は、ＷＯ９８／２０１４２に記載されているように、表面マーカー、サイトカイン分泌又は増殖をモニターすることにより、Ｔ細胞活性化の阻害によって測定することもできる。たとえばＳｅｒｒａｔｅの発現を方向づける核酸コンストラクトでトランスフェクトしたＡＰＣを、コントロールとして用いることができる。
上に論じたように、ＡＰＣにおいてポリペプチドの発現を可能にする条件下、ポリペプチドをコードしている核酸コンストラクト／ウイルスベクターを細胞に導入することによって、ポリペプチド物質をＡＰＣに投与することができる。同様に、抗原をコードしている核酸コンストラクトは、トランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によって、ＡＰＣに導入することができる。増大したＮｏｔｃｈシグナリングレベルを示す、結果として生じたＡＰＣは使用できる状態である。
寛容化アッセイ
上述の任意のアッセイは（「アッセイ」を参照のこと）、臨床適用例に用いるために、免疫細胞における応答性及び寛容化の程度をモニター又は検出するように適合させることができる。そのようなアッセイには、たとえば、宿主細胞における低減したＮｏｔｃｈシグナリング活性の検出、又はドナー細胞におけるＮｏｔｃｈ開裂のモニターが含まれる。免疫細胞活性をモニターするさらなる方法を以下に記載する。
免疫細胞活性は、当分野の技術者に知られている任意の適切な方法によってモニターすることができる。たとえば、細胞傷害活性をモニターすることができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、活性化後の増強された細胞傷害活性を実証する。したがって、細胞傷害性の低下又は安定化は、応答性の低減を示唆する。
活性化後、白血球は様々な新しい細胞表面抗原を発現する。ＮＫ細胞は、活性化後、たとえばトランスフェリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ２５ ＩＬ−２受容体を発現する。したがって、応答性の低減は、これらの抗原の発現をモニターすることによって評価することができる。
Ｈａｒａ等、Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＩＩＩ，Ｒａｐｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ２８ｋＤ／３２ｋＤ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｅａｒｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＥＡ−１）ｂｙ １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｍｉｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１９８８（１９８６）及びＣｏｓｕｌｉｃｈ等、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＬＲ３）Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｓｔｅｐ ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ、８４：４２０５（１９８７）は、活性化直後に、Ｔ細胞に発現する細胞表面抗原を記載している。これらの抗原ＥＡ−１及びＭＬＲ３はそれぞれ、２８ｋＤ及び３２ｋＤの主要成分を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１及びＭＬＲ３は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではなく、ＭＬＲ３Ｍａｂは、ＩＬ−１結合を遮断する。これらの抗原は、１８時間以内に活性化Ｔ細胞に出現し、したがって免疫細胞応答性をモニターするために用いることができる。
さらに、白血球応答性は、参照により本明細書の一部とするＥＰ０３２５４８９に記載のとおりモニターすることができる。簡潔には、これは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９６２７と称されるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体によって認識される細胞抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３」）を用いて行われる。
Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、活性化され抗原刺激された白血球の細胞表面抗原を認識する。活性化ＮＫ細胞において、抗原Ｌｅｕ２３は、活性化後４時間以内に発現し、長ければ活性化後７２時間発現を続ける。Ｌｅｕ２３は、少なくとも２つのＮ結合炭水化物を有する２４ｋＤサブユニットからなるジスルフィド結合ホモ２量体である。
ＮＫ細胞におけるＬｅｕ２３の出現は、細胞傷害性の発生と相関し、ある種のＴ細胞におけるＬｅｕ２３の出現は、Ｔ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、白血球の応答性をモニターするのに有用である。
免疫細胞応答性をモニターするための技法のさらなる詳細は、参照により本明細書の一部とする「Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ」Ｌｅｗｉｓ Ｃ．Ｅ．及びＪ．Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９２、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ．「Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ」Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９、４７号、１８７〜３７６頁、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ」の第７章「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｍａｋ Ｔ．Ｗ．及びＪ．Ｊ．Ｌ．Ｓｉｍａｒｄ、１９９８に見出すことができる。
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な実施例によってさらに詳しく記載する。
Ｎｏｔｃｈシグナリング阻害剤の調製（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質）
ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに融合したヒトＤｅｌｔａ１（「ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ」）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインをコードしているヌクレオチド配列（たとえばＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ００３５２２を参照のこと）を発現ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）に挿入し、ＣＨＯ細胞に得られたコンストラクトを発現させることによって調製した。
ｉ）クローニング
ヒトＤｅｌｔａ様リガンド１（ｈＥＣＤＬＬ−１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００３５２２を参照のこと）の１６２２ｂｐ細胞外（ＥＣ）断片を、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてゲル精製した。次いで、その断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩ切断ｐＣＲ Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）にライゲートし、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、及びＡｐａｌ部位を除去した。
このライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）プレートに画線培養し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートから３ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いて培養物から精製し、その後、診断的にＨｉｎｄＩＩＩで消化した。クローンを選択し、修飾ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ｈＥＣＤＬＬ−１のグリセロールストックを用いてＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）プレートに画線培養し、３７℃で一晩インキュベートした。このプレートからコロニーを６０ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で一晩インキュベートした。培養物を、製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いてマキシプレップし、最終ＤＮＡペレットをｄＨ２Ｏ３００μｌに再懸濁して、−２０℃で保存した。
５μｇの修飾ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ｈＥＣＤＬＬ−１ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、ＡｐａＩで部分的に消化した。次いで、１６２２ｂｐのｈＥＣＤＬＬ−１断片を、製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ３０５１−１）を用いてゲル精製した。ＤＮＡを別のＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）カラムに通し、ＰＣＲプロトコルにより単離後、試料の濃度をライゲーションに使用可能なアガロースゲル分析によって調べた。
プラスミドｐｃｏｎγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩで切断し、以下のオリゴをライゲートした（配列番号２）。

このライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートを形質転換物２００μｌで画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１２のクローンを２×ＹＴ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で終日増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いて培養物から精製し、診断的にＮｏｔＩで消化した。クローン（「ｐＤｅｖ４１」とする）を選択し、ｐＤｅｖ４１のグリセロールストックを用いてＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートを画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、このプレートからクローンを６０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）に取り、振盪しながら、３７℃で一晩インキュベートした。このクローンを、製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いてマキシプレップし、−２０℃で保存した。その後、ｐＤｅｖ４１クローン５マキシプレップを、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩで消化して、ＩｇＧ４Ｆｃ断片（１６２４ｂｐ）を生じた。この消化物を、１％アガロースゲルで精製し、主要なバンドを切り出し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ３０５１−１）を用いて精製した。
その後、ポリヌクレオチドを、強力なｈＣＭＶプロモーターエンハンサー領域（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の下流、後期ＳＶ４０プロモーターの制御下にあり、所望の遺伝子の転写を方向づけるｈＣＭＶプロモーターを有する、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（グルタミンを含まない培地での選択に必要とされるＧＳ遺伝子をコードする；ＧＳミニ遺伝子−ＧＳｃＤＮＡを含有し、これは野生型ハムスターＧＳ遺伝子のポリリンカーアデニル化シグナル及び最後のイントロンを含む）の上流で、ｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）のポリリンカー領域にクローン化した。ｐＥＥ１４．４のマキシプレップ５μｇを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、産物をゲル抽出し、アルカリホスファターゼで処理した。
ｉｉ）発現コンストラクトの生成
３断片ライゲーションを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ切断ｐＥＥ１４．４、修飾ｐＣＲ ＢｌｕｎｔのＥＣＤＬＬ−１（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ）、及びｐＤｅｖ４１から切断されたＩｇＧ４Ｆｃ断片（ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ）を用いて行った。これをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートを形質転換２００μｌで画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１２のクローンを２×ＹＴ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で終日増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いてプレップから精製し、診断的に消化し（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）、マキシプレップのためにクローン（クローン８、「ｐＤｅｖ４４」とする）を選択した。ｐＤｅｖ４４クローン８のグリセロールストックを、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、コロニーを６０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）培養液に取り、３７℃で一晩インキュベートした。このプラスミドＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いて単離した。
ｉｉｉ）最適ＫＯＺＡＫ配列の付加
Ｋｏｚａｋ配列を、以下のように発現コンストラクトに挿入した。
オリゴヌクレオチドはキナーゼ処理し、アニールして、次の配列を生じた。
（配列番号３）


（配列番号４）



ｐＤｅｖ４４をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＢＩで消化し、ゲル精製し、アルカリホスファターゼで処理した。消化物をオリゴでライゲートし、熱ショックによってＤＨ５α細胞に形質転換した。各形質転換物２００μｌをＬＢ＋Ａｍｐプレート（１００μｇ／ｍｌ）に画線し、３７℃で一晩インキュベートした。ミニプレップを３ｍｌ、２×ＹＴ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（カタログ番号２７１０６）を用いてミニプレップから精製し、診断的にＮｃｏＩで消化した。クローン（ｐＤｅｖ４６）を選択し、配列を確認した。グリセロールストックを画線培養し、培養液を増殖させ、プラスミドをマキシプレップした。
ｉｖ）トランスフェクション
約１００μｇのｐＤｅｖ４６クローン１ＤＮＡを、制限酵素ＰｖｕＩで線状化した。生じたＤＮＡ試料を、フェノール／クロロホルム／ＩＡＡ抽出を用いて洗浄し、その後エタノールで洗浄し、析出させた。そのペレットを滅菌水に再懸濁し、線状化及び定量化を、アガロースゲル電気泳動及びＵＶスペクトロメトリで検査した。
４０μｇの線状化ＤＮＡ（ｐＤｅｖ４６クローン１）及び１×１０７ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、室温で４ｍｍのキュベット中、無血清ＤＭＥＭに混合した。次いで、細胞を２８０ｖ、９５０μＦでエレクトロポレートし、非選択ＤＭＥＭに洗い流し、９６ウェルプレートに希釈し、インキュベートした。２４時間後、培地を除去し、選択培地（２５μＭ、Ｌ−ＭＳＸ）と交換した。６週後、培地を除去し、ＩｇＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。選択培地を交換した。陽性クローンを同定し、選択培地Ｌ−ＭＳＸ２５μｍに継代接種した。
ｖ）発現
細胞は、セミコンフルエントまで選択ＤＭＥＭ（２５μｍ、Ｌ−ＭＳＸ）で増殖させた。その後、３〜５日間、培地を無血清培地（ＵｌｔｒａＣＨＯ）と置き換えた。生じた培地からＨＰＬＣによって、タンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質）を精製した。
得られた発現融合タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりであった（配列番号５）。

配列中、最初の下線を引いた配列はシグナルペプチド（成熟タンパク質から開裂）であり、２番目の下線を引いた配列はＩｇＧ４Ｆｃ配列である。このタンパク質は通常、システインジスルフィド結合によって結合した２量体として存在する（たとえば図１０の概略図を参照のこと）。この発現融合タンパク質のドメイン構造を図１２により詳しく示す。
Ｄｅｌｔａ１ビーズによって誘導されたサイトカイン産生の調節は可溶性ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃの添加によって阻害される
ｉ）ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質で被覆されたビーズの調製
Ｍ４５０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄ（商標）磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、ＵＳＡ）を、室温で３０分、抗体の存在下、それらを回転することによって、抗ヒトＩｇＧ４ビオチン化モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５５８７９）で被覆した。ビーズはＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄した。それらをｈＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４（上述の実施例１を参照）と共に室温で２時間さらにインキュベートし、ＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄した。
ｉｉ）ＥＬＩＳＡによるＮｏｔｃｈシグナリングの調査
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて血液から精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地２１ｍｌに載せ、１８〜２０℃で４０分間、４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、３回洗浄して、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いた。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びβ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中１０５ＣＤ４／ウェル／２００μｌで、９６ウェルプレート（平底）を用い３重でインキュベートした。
サイトカイン産生は、５：１（ビーズ：細胞）の比率でｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（上述の実施例１）で被覆したビーズの存在下、細胞を１：１（ビーズ：細胞）の比率で、Ｄｙｎａｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズで刺激することによって誘導した。いくつかのウェルでは、増量した可溶性ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質をさらに添加した。
３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気で３日間インキュベートした後、上澄みを除去し、サイトカイン産生を、ＩＬ−１０及びＩＬ−５に関してそれぞれ、製造者指示書に従ってＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ Ｓｅｔ ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡ ＳｅｔヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
添加した可溶性ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃの濃度増加の影響を示す結果を、図１３に示す。
これらの結果からわかるように、ビーズ固定化ヒトＤｅｌｔａ１は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によって、ＩＬ−１０産生を増強する。この作用は、ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃが培地に添加されたとき阻害された。
Ｄｅｌｔａ１ビーズによって誘導されたサイトカイン産生の調節は可溶性Ｎｏｔｃｈ１ＥＣドメイン／Ｆｃ融合タンパク質の添加によって阻害される
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて血液から精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地２１ｍｌに載せ、１８〜２０℃で４０分間、４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、３回洗浄して、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いた。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びβ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中１０５ＣＤ４／ウェル／２００μｌで、９６ウェルプレート（平底）を用い３重でインキュベートした。
サイトカイン産生は、５：１（ビーズ：細胞）の比率でｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（上述の実施例１）で被覆したビーズの存在下、細胞を１：１（ビーズ：細胞）の比率で、Ｄｙｎａｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズで刺激することによって誘導した。いくつかのウェルでは、増量した可溶性ラットＮｏｔｃｈ１細胞外ドメイン−ｈＩｇＧ１融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０５７−ＴＫ）をさらに添加した。
３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気で３日間インキュベートした後、上澄みを除去し、サイトカイン産生を、ＩＬ−１０及びＩＬ−５に関してそれぞれ、製造者指示書に従ってＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ Ｓｅｔ ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡ ＳｅｔヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
添加した可溶性ラットＮｏｔｃｈ１ＥＣ−ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の濃度増加の影響を示す結果を、図１４に示す。
これらの結果からわかるように、ビーズ固定化ヒトＤｅｌｔａ１−Ｆｃは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によって、ＩＬ−１０産生を増強する。この作用は、可溶性ラットＮｏｔｃｈ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃが培地に添加されたとき阻害された。
Ｎｏｔｃｈシグナリング阻害剤の調製：短縮型ヒトＪａｇｇｅｄ１融合タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ）
ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに融合したＥＧＦ２の末端までヒトＪａｇｇｅｄ１配列（リーダー配列、アミノ末端、ＤＳＬ、ＥＧＦ１＋２）を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤として作用することのできる融合タンパク質を（「ｈＪａｇｇｅｄ１（ＥＧＦ１＋２）−ＩｇＧ４Ｆｃ」）、ＡＴＧから第２ＥＧＦリピート（ＥＧＦ２）の末端までヒトＪａｇｇｅｄ１をコードしているヌクレオチド配列を発現ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）に挿入して、ＩｇＧ４Ｆｃタグを付加することによって調製した。次いで、この完全融合タンパク質を、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）選択系ベクターｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にシャトルした。得られたコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にトランスフェクトし、発現させた。
１．クローニング
ｉ）ＤＮＡ−ｐＤＥＶ４７及びｐＤＥＶ２０の調製
ヒトＪａｇｇｅｄ１をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＯＲ４７を得た。このｐＬＯＲ４７のＪａｇｇｅｄ１配列を、完全長ヒトＪａｇｇｅｄ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ６１２７６）に対してアラインし、少数のみの明らかなサイレント変化を有することが見出された。
次いで、プラスミドｐＬＯＲ４７を修飾して、２つのＤｒａＩＩＩ部位の１つを除去し（同時に完全細胞外ｈＪａｇｇｅｄ１のアミノ酸配列は維持、置換する）、後のクローニングを簡略化するためにＢｓｉＷＩ部位を付加した。得られたプラスミドは、ｐＤＥＶ２０と命名した。
プラスミドｐＬＯＲ４７を、ＤｒａＩＩＩで切断した。これにより、ｈＪａｇｇｅｄ１の細胞内、膜貫通領域、及び細胞外領域の３’末端、並びにベクター配列の一部を含む１．７ｋｂの断片が除去され、ｈＪａｇｇｅｄ１の細胞外領域（ＥＣ）のほぼすべてを含む主要ベクターバックボーンの７．３ｋｂｐの大きい断片が残された。切断ＤＮＡをアガロースゲルに流し、大きな断片を切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてゲル精製した。１対のオリゴヌクレオチドを、合わせてライゲートしたときに、５’末端にＤｒａＩＩＩに適合性の粘着末端を有し、元の制限部位に反応するＤＮＡの２本鎖片が得られるように配列した。この配列には、ＢｓｉＷＩ部位、次いで制限部位とは反応しない３’末端にＤｒａＩＩＩに適合性の他の粘着末端が続いた。
＃１ すなわち
＃２ 配列番号６



その後、このオリゴ対をＤｒａＩＩ切断ｐＬＯＲ４７にライゲートし、それによって５’ＤｒａＩＩＩ部位を維持し、ＢｓｉＷＩを挿入し、３’ＤｒａＩＩＩ部位を除去した。得られたプラスミドは、ｐＤＥＶ２０と命名した。
ｉｉ）ｈＪａｇｇｅｄ１ ＩｇＧ４Ｆｃ融合ＤＮＡの調製
修飾５’Ｋｏｚａｋ配列の付加、並びに３’末端の修復及び５’末端の修復によって完全ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣ配列を再構築するために、３断片ライゲーションが必要であった。
断片１：ＥＣｈＪａｇｇｅｄ配列
ｐＤｅｖ２０をＲｓｒＩＩ−ＤｒａＩＩＩで切断して、３断片を生じた。１２７０＋２４５９＋３６２１ｂｐ。これらの断片をアガロースゲルに流し、２４５９ｂｐのバンドを切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。これはｈＪａｇｇｅｄ１配列を含有し、３’配列（ＲｓｒＩＩ部位まで）を欠失、ＥＣ領域の末端で５’配列の一部を欠失した。
断片２：修飾Ｋｏｚａｋ配列
ｐＵＣ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾して、新しい制限酵素部位を挿入し、５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列を有する修飾Ｋｏｚａｋを導入した。新しいプラスミドは、ｐＬＯＲ４９と命名した。
ｐＵＣ１９ベクターＨｉｎｄＩＩＩＥｃｏＲＩを切断し、４つのオリゴヌクレオチド（２オリゴ対）にライゲートすることによって、ｐＬＯＲ４９を作製した。
１対は、ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端、続いて最適Ｋｏｚａｃ、及び５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列、続いてＲｓｒＩＩ付着末端を有する。
＃１ すなわち
＃２ 最適Ｋｏｚａｋ
＃３ ５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列
＃４ 配列番号７



他方の対は、付着ＲｓｒＩＩ末端、次いでＤｒａＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＢｓｉＷＩ部位、続いて付着ＥｃｏＲＩ部位を有する
＃１ すなわち
＃２ 配列番号８



したがって、ｐＬＯＲ４９は、ＨｉｎｄＩＩＩ、続いて最適Ｋｏｚａｃ、及び５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列を有するｐＵＣ１９バックボーンであり、ＥｃｏｒＩ部位との反応前に、特異ＲｓｒＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＢｓｉＷＩ部位が導入される。
その後、プラスミドｐＬＯＲ４９をＲｓｒＩＩ−ＢｓｉＷＩで切断して、２．７ｋｂｐのベクターバックボーン断片を得て、それをアガロースゲルに流し、バンドを切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。
断片３：ＢｓｉＷＩ部位ＰＣＲ断片を有する３’ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣの生成
ｐＬＯＲ４７をＰＣＲの鋳型として用い、ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣを増幅し、３’ＢｓｉＷＩ部位を付加した。
ｈＪａｇｇｅｄ１のＲｓｒＩＩの５’プライマー
３’結合ＢｓｉＷＩ部位を有するｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣの末端までの３’部位
得られた断片をＤｒａＩＩＩ及びＢｓｉＷＩで切断して、約６００ｂｐの断片を得た。これをアガロースゲルに流し、バンドを切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。
上述の３つの断片
１）ｐＤｅｖ２０切断ＲｓｒＩＩ−ＤｒａＩＩＩの２４５９ｂｐのｈＪａｇｇｅｄ１断片
２）ＲｓｒＩＩ−ＢｓｉＷＩＬｏｒ４９切断の２．７ｋｂｐの最適化Ｋｏｚａｋ及び５’ｈＪａｇｇｅｄ１
３）６００ｂｐの３’ＥＣｈＪａｇｇｅｄ１ＰＣＲ断片切断ＤｒａＩＩＩ−ＢｓｉＷＩを、合わせてライゲートして、プラスミドｐＤＥＶ２１を得た。
ｉｉｉ）さらなるライゲーション（ｐＤＥＶ１０）
外来配列を排除するために、さらなる３断片ライゲーションを行い、ベクターｐＣＯＮγ４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）に挿入した。
断片１：プラスミドｐＤＥＶ２１−４をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩで切断して、４９５８ｂｐ＋８９９ｂｐの断片を得た。それらをアガロースゲルに流し、小さい８８９ｂｐ断片のバンドを切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。
断片２：ｐＣＯＮγ４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩで切断して、ＩｇＧ４ＦＣの最初の５アミノ酸を欠失した、６６０２ｂｐのベクター断片を得た。この断片のバンドを切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。
断片３：リンカーオリゴヌクレオチド対を配列して、過剰のアミノ酸が導入されていない、ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ２の末端とＩｇＧ４ＦＣの３’開始との間にタイトジャンクションを得た。
＃１ すなわち
＃２ 配列番号９
＃３ ＤＬ＝ｈＪａｇｇｅｄ１配列
＃４ 残部＝ＩｇＧ４ＦＣ配列



上述の３つの断片
１）８９９ｂｐのｈＪａｇｇｅｄ１断片ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＩ切断ｐＤＥＶ２１−４
２）６６０２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩＡｐａＩ切断ｐＣｏｎγベクターバックボーン
３）オリゴリンカーＢｇｌＩＩ−ＡｐａＩを、合わせてライゲートして、プラスミドｐＤＥＶ１０を得た。
ライゲートしたＤＮＡをコンピテントＤＨ５アルファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、ＬＢａｍｐプレートに平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。コントロールとベクター及び挿入物との良好な比は明らかであり、したがって８つのコロニーのみを１０ｍｌのＬＢａｍｐ培養液に取り、３７℃で一晩インキュベートした。グリセロール培養液を作製し、細菌ペレットを−２０℃で凍結した。後に、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓｐｉｎキットを用いて抽出し、診断的にＳｃａＩで消化した。クローン２、４、及び５が正しいクローンと考えられたので、クローン２をＬＢａｍｐプレートに画線培養し、１／１００を１２０ｍｌのＬＢ＋ａｍｐ培養液に接種した。プレート及び培養液を、３７℃で一晩インキュベートした。それらの培養液からグリセロール培養液を作製し、後のマキシプレップのために、ペレットを凍結した。プラスミドＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｍａｘｉｐｒｅｐで抽出し、ＳｃａＩによる診断的消化を行い、ＵＶ分光光度法による定量及び品質検査のためにＤＮＡを希釈した。
ｉｖ）ｐＤＥＶＩＩクローニング
ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ融合のコード配列を、ｐＣＯＮγ４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）から、ｈＣＭＶプロモーター領域（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の下流、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの上流で、ｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にシャトルし、ＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を用いて選択される安定な細胞系を得た。プラスミドｐＥＥ１４．４は、ＧＳミニ遺伝子（後期ＳＶ４０プロモーターの制御下、野生型ハムスターＧＳ遺伝子のポリリンカーアデニル化シグナル及び最後のイントロンを含むＧＳｃＤＮＡ）を含有し、これはグルタミンを含まない培地での選択に必要とされるＧＳ遺伝子をコードする。
ｖ）挿入
ｐＤＥＶ１０クローン２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断し、５０２６ｂｐ＋２４９７ｂｐの２断片を生じた。２４９７ｂｐはｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ融合のコード配列を含有し、それをアガロースゲルから切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。
ｖｉ）ベクター
ｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断して、ＩｇＧ４ＦＣ配列を除去し、５０２６ｂｐ＋１５９３ｂｐの２断片を生じた。大きい５０２６ｂｐの断片をアガロースゲルから切除し、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてＤＮＡをゲル精製した。このｐＥＥ１４．４ベクターバックボーン及びｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ融合挿入物をライゲートして、最終トランスフェクションプラスミドｐＤＥＶ１１を得た。
このライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートから７ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に取り、振盪しながら３７℃で一晩培養した。グリセロール培養液を作製し、プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いて培養物から精製した。その後、ＤＮＡを診断的にＳａｐＩで消化した。
ｖｉｉ）トランスフェクションのためのマキシプレップ
正しいクローン（クローン１）を選択し、そのグリセロールストック１００μｇを１００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に接種し、さらにＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレートに画線した。プレートと培養液の両方を、３７℃で一晩インキュベートした。プレートは純粋増殖を示し、したがって培養物を製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いてマキシプレップした。最終ＤＮＡペレットを、ｄＨ２Ｏ５００μｌに再懸濁した。その後、ｐＬＯＲ１１クローン１ＤＮＡの試料を希釈し、ＤＮＡの濃度及び品質をＵＶ分光光度法によって評価した。試料はさらにＳａｐＩで診断的に消化し、正しいサイズのバンドを得た。
ｖｉｉｉ）ＤＮＡの線状化
約１００μｇのｐＤｅｖ１１クローン１ＤＮＡを、制限酵素ＰｖｕＩで線状化した。生じたＤＮＡ試料を、フェノール／クロロホルム／ＩＡＡ抽出を用いて洗浄し、その後エタノールで洗浄し、層流フード内に析出させた。そのペレットを滅菌水に再懸濁した。線状化をアガロースゲル電気泳動によって検査し、定量化及び品質をＵＶ分光光度法によって２６０及び２８０ｎｍで評価した。
２．トランスフェクション
４０μｇの線状化ＤＮＡ（ｐＤｅｖ１１クローン１）及び１×１０７ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｌｏｎｚａ）を、室温で４ｍｍのキュベット中、無血清ＤＭＥＭ５００μｌに混合した。次いで、細胞を２８０ｖ、９５０μＦでエレクトロポレートし、非選択ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／グルタミン／１０％ＦＣＳ）に洗い流した。この希釈６×９６ウェルプレートから、ウェル当たり５０μｌで接種した。元のストックの１／４希釈を作成し、この８×９６ウェルプレートから、ウェル当たり５０μｌで接種した。さらに第２のストックから１／１０希釈を作製し、この１２×９６ウェルプレートから、ウェル当たり５０μｌで接種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。２４時間後、培地を除去し、選択培地２００μｌ（２５μＭ、Ｌ−ＭＳＸ）と交換した。トランスフェクション後４〜６週に、ＩｇＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡによる分析のために、プレートから培地を除去した。選択培地を交換した。陽性クローンを同定し、選択培地２５μｍのＬ−ＭＳＸに継代接種し、増殖させた。
３発現
細胞は、セミコンフルエントまで選択ＤＭＥＭ（２５μｍ、Ｌ−ＭＳＸ）で増殖させた。その後、３〜５日間、培地を無血清培地（ＵｌｔｒａＣＨＯ、Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）と置き換えた。生じた培地からＦＰＬＣによって、タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質）を精製した。
発現融合タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ）のアミノ酸配列

（配列番号１０）太字＝ｈＪａｇｇｅｄ１細胞外ドメインリーダー配列、アミノ末端領域、ＤＳＬ、ＥＧＦ１＋２、下線＝ＩｇＧ４Ｆｃ配列
このタンパク質は、シグナルペプチドの開裂を伴う、システインジスルフィド結合によって結合した２量体として存在すると考えられている。
Ｄｅｌｔａ１ビーズによって誘導されたサイトカイン産生の調節は可溶性Ｊａｇｇｅｄ１（２ＥＧＦ短縮型）／Ｆｃ融合タンパク質の添加によって阻害される
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて血液から精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地２１ｍｌに載せ、１８〜２０℃で４０分間、４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、３回洗浄して、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いた。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びβ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中１０５ＣＤ４／ウェル／２００μｌで、９６ウェルプレート（平底）を用い３重でインキュベートした。
サイトカイン産生は、５：１（ビーズ：細胞）の比率でｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（上述の実施例１）で被覆したビーズの存在下、細胞を１：１（ビーズ：細胞）の比率で、Ｄｙｎａｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズで刺激することによって誘導した。いくつかのウェルでは、増量した可溶性Ｊａｇｇｅｄ−１（２ＥＧＦ）−ｈＩｇＧ１融合タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ、上記のとおり調製）をさらに添加した。
３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気で３日間インキュベートした後、上澄みを除去し、サイトカイン産生を、ＩＬ−１０及びＩＬ−５に関してそれぞれ、製造者指示書に従ってＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ Ｓｅｔ ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡ ＳｅｔヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
添加した可溶性ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃの濃度増加の影響を示す結果を、図１５に示す。
これらの結果からわかるように、ビーズ固定化ヒトＤｅｌｔａ１−Ｆｃは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によって、ＩＬ−１０産生を増強する。この作用は、可溶性ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｈｊ１Ｅ２Ｆｃ）が培地に添加されたとき阻害された。
マウスＣＤ４＋細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングモジュレーター活性を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ法
（ｉ）ＣＤ４＋細胞精製
８〜１０週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスから脾臓を摘出し、０．２μＭセルストレイナーから２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２２４０９）に２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの１０％ウシ胎児血清中β−メルカプトエタノールを添加）に通した。この細胞懸濁液を遠心分離し（１１５０ｒｐｍ、５分）、培地を除去した。
（赤血球を溶解するために）脾臓当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（再蒸留水中０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１．０Ｍ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）と共に４分間、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を、Ｒ１０Ｆ培地で１回洗浄し、カウントした。ＣＤ４＋細胞を、製造者指示書に従って、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０４９−２０１）を用い、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＭＡＣＳ）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｉｓｌｅｙ、ＵＫ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）で正の選択により懸濁液から精製した。
（ｉｉ）抗体被覆
９６ウェル平底プレートを抗体で被覆するために、次のプロトコルを用いた。
プレートを、１μｇ／ｍｌ抗ハムスターＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４００７）及び１μｇ／ｍｌ抗ＩｇＧ４抗体を含むＤＰＢＳで被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆混合物を添加した。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、各ウェルに、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＰＢＳ１００μｌ、又は抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及びｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＰＢＳ１００μｌを与えた。プレートを、３７℃で２〜３時間インキュベートし、次いで、再びＤＰＢＳで洗浄し、その後、細胞（上述のとおり調製）を添加した。
ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈシグナリング阻害の調査
マウスＣＤ４＋Ｔ細胞（上述のとおり調製）を、プレート結合ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（上述のとおり調製）及び最終濃度２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｎｅカタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）を含むか含まない抗ＣＤ３被覆プレートにおいて、２×１０５／ウェルで培養した。可溶性ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質を、示した濃度で最初に培養物に添加し、第３日に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）の抗体対を用いて、ＥＬＩＳＡによって、上澄みのＩＬ−１０を測定した。結果（図１６に示す）は、プレート結合ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質によって誘導されたＩＬ−１０放出の増加が、試験したすべての可溶性ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質濃度で実質的に逆転されることを示している。
ＣＨＯ−Ｎ２（Ｎ２７）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ（ｐＬＯＲ９１）の構築
ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ付着末端を有するアデノウイルス主後期プロモーターＴＡＴＡボックスモチーフを以下のように生じた。
（配列番号１１）



これを、ＢｇｉＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、プラスミドｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡを生じた。
ＢａｍＨ１及びＢｇｌＩＩ付着末端を有するＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１は２ＣＢＦ１リピートに相当）を以下のように生じた。
（配列番号１２）



この配列をＢｇｌＩＩ部位に繰り返し挿入することによって５量体化し、得られたＴＰ１の５量体（１０ＣＢＦ１リピートに相当）をＢｇｌＩＩ部位でｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡに挿入して、プラスミドｐＬＯＲ９１を生じた。
Ｂ）完全長Ｎｏｔｃｈ２及び１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃレポーターカセットを発現する安定なＣＨＯ細胞レポーター細胞系の産生
ヒトＮｏｔｃｈ２遺伝子の完全コード配列（たとえばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３１５３５６を参照）に及ぶｃＤＮＡクローンを以下のように構築した。細胞内ドメイン全体及び細胞外ドメインの一部をコードしている３’ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲに基づくスクリーニング法を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）から単離した。残存する５’コード配列を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）法を用いて単離し、両方の断片に共通のユニーク制限部位を用いて（Ｃｌａ Ｉ）、既存３’断片にライゲートした。次いで、得られた完全長ｃＤＮＡを、終止コドンを用いずに哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＯＲ９２を生じた。哺乳動物細胞に発現するとき、ｐＬＯＲ９２は細胞内ドメインの３’末端にＶ５及びＨｉｓタグを有する完全長ヒトＮｏｔｃｈ２タンパク質を発現する。
野生型ＣＨＯ−ＫＩ細胞（たとえばＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１参照）を、Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＬＯＲ９２（ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＮｏｔｃｈ２−Ｖ５−Ｈｉｓ）でトランスフェクトし、完全長ヒトＮｏｔｃｈ２（Ｎ２）を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを生じた。トランスフェクタントクローンを、限定希釈法を用い、９６ウェルプレートにおいて、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（（ＨＩ）ＦＣＳ）、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で選択した。個々のコロニーを、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭで増殖させた。クローンを、抗Ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞溶解産物のウェスタンブロットによって、Ｎ２の発現に関して試験した。次いで陽性クローンを、レポーターベクターｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）による一過性トランスフェクション、及び完全長ヒトＤｅｌｔａ様リガンド１（ＤＬＬ１、たとえばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１９６５７１を参照）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ）との共培養によって試験した。ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞は、Ｎｏｔｃｈ２の代わりにヒトＤＬＬ１を用い、ＣＨＯＮｏｔｃｈ２クローンと同じ方法で調製した。強陽性クローンを、抗Ｖ５ｍＡｂを用い、細胞溶解産物のウェスタンブロットによって選択した。
ｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）による一過性トランスフェクション、及び完全長ヒトＤＬＬ１（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ１）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローンとの共培養を行ったとき、１つのＣＨＯ−Ｎ２安定クローンＮ２７が、高レベルの誘導を与えることが見出された。ハイグロマイシン遺伝子カセット（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を、ＢａｍＨ１及びＳａｌ１を用いてｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）に挿入し、このベクター（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ−ｈｙｇｒｏ）を、Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＨＯ−Ｎ２安定クローン（Ｎ２７）にトランスフェクトした。トランスフェクタントクローンを、限定希釈法を用い、９６ウェルプレートにおいて、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．４ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭで選択した。個々のコロニーを、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭで増殖させた。
クローンを、ＣＨＯＤｅｌｔａ（完全長ヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ１）を発現）との共培養によって試験した。３つの安定レポーター細胞系、Ｎ２７＃１１、Ｎ２７＃１７、及びＮ２７＃３６が産生された。Ｎｏｔｃｈシグナリングの不在下でバックグラウンドシグナルが低く、したがってシグナリングが開始されたときに誘導倍率が高いことから、さらなる使用のためにＮ２７＃１１を選択した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１００μｌ／ウェル中、２×１０４Ｎ２７＃１１細胞／ウェルを用いて、９６ウェルプレートでアッセイを行った。
１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭでＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞（上に記載）を維持した。使用直前に、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いてＴ８０フラスコから細胞を除去し、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。細胞１０μｌをカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、５．０×１０５細胞／ｍｌに細胞密度を調整した。
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａアンタゴニストアッセイを行うために、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて、Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を除去し、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。細胞１０μｌをカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、２．０×１０５細胞／ｍｌに細胞密度を調整した。レポーター細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌ（すなわち、２．０×１０４細胞／ウェル）で平板培養し、インキュベーターに置き、少なくとも３０分間静置した。
上述のとおり調製したｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ（Ｎｏｔｃｈシグナリング可溶性リガンド阻害剤）を、アッセイに必要な最終濃度×５まで完全ＤＭＥＭに希釈し、希釈リガンド５０μｌを、９６ウェルプレート中１００μｌのＮ２７＃１１細胞に添加した。次いで、シグナリングを開始するために、５×１０５細胞／ｍｌで１００μｌのＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞を添加し、各ウェルの最終容量を２５０μｌとした。その後、プレートを３７℃で一晩、インキュベーターに置いた。
翌日、すべてのウェルから上澄み１５０μｌを取り、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加し、生じた混合物を室温で５分間放置した。その混合物を２回ピペットで上下させて確実に細胞融解し、各ウェルの内容物を白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。その後、ルミネセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。同じアッセイを、コントロールとしてＩｇＧ４を用いて行った。
結果を図１７に示す。
可溶性ｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−ＩｇＧ４ＦｃはＣＨＯ−Ｎ２細胞においてＮｏｔｃｈ活性化を拮抗する
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞のＮｏｔｃｈシグナリングアンタゴニストアッセイ
ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃの代わりにｈＪａｇｇｅｄ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃを用いて、実施例８の手順を繰り返した。比較のために、ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃを用いて、相当する実験を行った。
結果を図１８に示す。２ＥＧＦリピートのみを有する短縮Ｊａｇｇｅｄタンパク質（ｈｊａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ）は、完全長ヒトＤｅｌｔａ１細胞外ドメインを含む対応するタンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ）と実質的に同じＮｏｔｃｈシグナリング阻害を提供したことがわかる。
ｍＤＬＬ１−Ｆｃ被覆ＤｙｎａｂｅａｄｓのＮｏｔｃｈシグナリングアンタゴニストアッセイ
ヒトＤｅｌｔａ１の代わりにマウスＤｅｌｔａ１を用い、上述のｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃと同様に融合タンパク質を調製した（「ｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ」）。
ＦｃタグＮｏｔｃｈシグナリングモジュレーターを、以下のようにビオチン化α−ＩｇＧ−４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カタログ番号５５５８７９）のクローンＪＤＣ１４、０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ（ＵＫ）ＬｔｄのＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｉｎｄｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（カタログ番号１１５．２１）「ビーズ」、４．０×１０８ビーズ／ｍｌ）に固定化した。
必要とされる総数に相当するＤｙｎａｂｅａｄｓビーズの量を、ビーズストックから４．０×１０８ビーズ／ｍｌで除去した。これをＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄し、滅菌エッペンドルフ管のビオチン化抗ＩｇＧ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カタログ番号５５５８７９）のクローンＪＤＣ１４、０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ最終容量１００μｌに再懸濁し、室温で３０分間シェーカーに置いた。ビーズを被覆するために必要なビオチン化抗ＩｇＧ４抗体の量は、１×１０７のストレプタビジンＤｙｎａｂｅａｄｓが最大２μｇの抗体に結合するという事実から算出した。
ビーズを抗体で被覆したのち、ＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄し、最後に、ＰＢＳに希釈したｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質に再懸濁した。ビーズを２μｇ／ｍｌタンパク質溶液中で被覆し（通常、５μｇのｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質を、被覆されるビーズ１０７当たりに添加する）、懸濁液にビーズを保持するために回転式シェーカーで、室温で２時間（又は４℃で一晩）、リガンドを１ｍｌ容量中のビーズに結合させた。ビーズをｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃで被覆した後、ビーズをＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄し、最後に、２×１０４レポーター細胞のウェルにこれを１００μｌ添加することによって１００ビーズ：細胞の比率が得られるように、１ｍｌ当たりビーズ２×１０７で完全ＤＭＥＭに再懸濁した。
ビーズアンタゴニストアッセイを行うために、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて、Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を除去し、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。細胞１０μｌをカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、２．０×１０５細胞／ｍｌに細胞密度を調整した。レポーター細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌ（すなわち、２．０×１０４細胞／ウェル）で平板培養し、インキュベーターに置き、少なくとも３０分間静置した。
精製したｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃを、アッセイに必要な最終濃度×５まで完全ＤＭＥＭに希釈し、希釈リガンド５０μｌを、９６ウェルプレート中１００μｌのＮ２７＃１１細胞に添加した。次いで、シグナリングを開始するために、２×１０７ビーズ／ｍｌで１００μｌのｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４ＦｃＤｙｎａｂｅａｄｓを添加し、各ウェルの最終容量を２５０μｌとした。その後、プレートを３７℃で一晩、インキュベーターに置いた。
翌日、すべてのウェルから上澄み１５０μｌを取り、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加し、生じた混合物を室温で５分間放置した。その混合物を２回ピペットで上下させて確実に細胞融解し、各ウェルの内容物を９６ウェルプレート（Ｖ型ウェルを有する）に移し、プレートホルダー中、室温で５分間、１０００ｒｐｍで回転した。その後、ビーズペレットを残し、透明上澄みを白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。次いで、ルミネセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。結果を図１９に示す。
可溶性ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４ＦｃはＣＨＯ−Ｎ２細胞においてＮｏｔｃｈ活性化を拮抗する
ＤｅｌｔａビーズのＮｏｔｃｈシグナリングアンタゴニストアッセイ
ｍＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃの代わりにｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃを用いて、実施例８Ｂの手順を繰り返した。比較のためにｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃを用い、コントロールとしてＩｇＧ４Ｆｃを用いて、相当する実験を行った。
結果を図２０に示す。２ＥＧＦリピートのみを有する短縮Ｊａｇｇｅｄタンパク質（ｈｊａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ）は、完全長ヒトＤｅｌｔａ１細胞外ドメインを含む対応するタンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ）と実質的に同じＮｏｔｃｈシグナリング阻害を提供したことがわかる。いずれの場合も、コントロールと比較して、著しい阻害が生じた。
Ｊｕｒｋａｔ細胞系を用いるレポーターアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、単純な限定希釈法によってクローン化できないので、これらの細胞と共にメチルセルロース含有培地（ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）ＴＣＳ）を用いた。
ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞（リンパ芽球細胞系、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）を、製造者ガイドラインに従ってＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）トランスフェクト細胞選択（ＴＣＳ）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ、及びＭｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用い、クローン化した。
プラスミドｐＬＯＲ９２（上述のとおり調製）を、以下のとおり、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩエレクトロポレーターを用いてＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞にエレクトロポレートした。
活発に分裂している細胞を遠心沈殿し、２．０×１０７細胞／ｍｌで、１０％熱不活性化ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する氷冷ＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ）に再懸濁した。氷上に１０分間置いた後、細胞０．５ｍｌ（すなわち細胞１×１０７）を、プラスミドＤＮＡ２０μｇ（滅菌水に溶解したＥｎｄｏ−ｆｒｅｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡ）を含有する、予冷した４ｍｍエレクトロポレーションキュベットに入れた。この細胞を３００ｖ、９５０μＦでエレクトロポレートし、その後、エッペンドルフ管の加温完全ＲＰＭＩ培地０．５ｍｌ中に迅速に除去した。この細胞を、マイクロ遠心機で、１分間３０００ｒｐｍで回転し、３７℃で１５分間置き、エレクトロポレーションから回復させた。その後、上澄みを除去して、細胞を完全ＲＰＭＩ４ｍｌの６ウェル皿のウェルに平板培養し、３７℃で４８時間放置して、抗生物質耐性マーカーを発現させた。
４８時間後、細胞を遠心沈殿殿、新鮮な完全ＲＰＭＩ１０ｍｌに再懸濁した。次いで、これを１０×１５ｍｌのファルコン管に分け、あらかじめ加温したＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＴＣＳ培地８ｍｌを添加し、次いで選択に用いられる抗生物質の１０×最終濃度１ｍｌを添加した。Ｇ４１８選択の場合、Ｇ４１８の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、ＲＰＭＩ中の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、その１ｍｌをそれぞれの管に添加した。この管を反転によってよく混合し、室温で１５分間静置した後、１０ｃｍ組織培養皿に平板培養した。その後、それを１４日間ＣＯ２インキュベーターに置き、可視コロニーを検査した。
肉眼検査により可視コロニーをプレートから採取し、これらのコロニーを９６ウェルプレートから、２４ウェルプレート、Ｔ２５フラスコで増殖させた。
クローンを選択し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用い、ｐＬＯＲ９１レポーターコンストラクトで一過性トランスフェクトし、その後、プレート結合固定化ｈＤＬＬ１−Ｆｃを含有する９６ウェルプレートに平板培養した（各プレートの滅菌ＰＢＳに精製Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質１０μｇを添加し、プレートの蓋をパラフィルムで密封して４℃で一晩、又は３７℃で２時間インキュベートし、使用前にプレートをＰＢＳ２００μｌで洗浄することによってプレートを被覆した）。
その後、全般的に上に記載のとおり、ルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図２１に示す。
可溶性ｈＤＬＬ−１ＦｃによるＡ２０−Ｄｅｌｔａ及びＡ２０−ＪａｇｇｅｄＮｏｔｃｈシグナリングの拮抗作用
Ａ２０−Ｄｅｌｔａ及びＡ２０−Ｊａｇｇｅｄ細胞
プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）からＩＶＳ、ＩＲＥＳ、Ｎｅｏ、ｐＡエレメントを除去し、ニワトリベータアクチンプロモーターの下流で（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０２１９９を参照）ｐＵＣクローニングベクターに挿入した。マウスＤｅｌｔａ−１ｃＤＮＡ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００７８６５）を、アクチンプロモーターとＩＶＳエレメントの間に挿入し、３つすべてのリーディングフレームに複数の終止コドンを有する配列をＤｅｌｔａとＩＶＳエレメントの間に挿入した。
得られたコンストラクトを、エレクトロポレーション及びＧ４１８を用いてＡ２０細胞にトランスフェクトし、その表面にマウスＤｅｌｔａ１を発現するＡ２０細胞を得た（Ａ２０−Ｄｅｌｔａ）。
対応する細胞（Ａ２０−Ｊａｇｇｅｄ）を、ヒトＪａｇｇｅｄ１ｃＤＮＡ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６１２７６を参照）を用いて調製した。
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞の代わりにＡ２０−Ｄｅｌｔａ又はＡ２０−Ｊａｇｇｅｄ細胞（１×１０５／ウェル）を用いて、実施例の手順を繰り返した。ＩｇＧ４をコントロールとして用いた。結果を図２２に示す。これらの結果は、ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃが、Ｊａｇｇｅｄ１並びにＤｅｌｔａのＮｏｔｃｈシグナリングを阻害できたことを示している。
ヒトＤｅｌｔａ１の代わりにヒトＪａｇｇｅｄ１を用い、上述のｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃと同様に融合タンパク質を調製した（ｈＪａｇｇｅｄ１−ＩｇＧ４Ｆｃ）。
ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃの代わりにｈＪａｇｇｅｄ１−ＩｇＧ４Ｆｃを用いて実施例８の手順を繰り返し、比較のためにｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃを用い、相当する繰り返し実験を行った。結果を図２３に示す。
ヒトＪａｇｇｅｄ１ＤＳＬドメイン及びＥＧＦリピート１−２を有するＮｏｔｃｈ阻害剤コンストラクトの調製（「ｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−ＩｇＧ４Ｆｃ」）
ＤＳＬドメイン及び最初の２つのみの天然ＥＧＦリピートをコードするヒトＪａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ−１）欠失（すなわち、ＥＧＦリピート３から１６までを削除）を、以下のプライマー対を用いて、ＪＡＧ−１クローン（ヒトＪＡＧ−１の配列は、図４、及びたとえばＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ７３９３６を参照）からＰＣＲによって産生した。
（配列番号１３）及び


（配列番号１４）



これらのプライマーは、リーダーペプチド領域ＲからＧのａａ．２を変える配列を生じる。
ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９５℃／２分で１サイクル
（９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／１１／２分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
次いで、ＤＮＡを、１×ＴＢＥ（トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ）中１％アガロースゲルから単離した。
ｐＣｏｎγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、以下のアダプターオリゴヌクレオチド配列をライゲートしてＸｈｏＩ部位を導入し、続いてＤＨ５α細胞にクローン化した。
（配列番号１５）



ｐＣｏｎγＸをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切断し、その後、シュリンプアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ゲル精製した。精製ＪＡＧ−１ ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切断し、制限ｐＣＯＮγＸにライゲートし、続いてＤＨ５α細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
得られたコンストラクト（ｐＣＯＮγｈＪ１Ｅ２）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧＦｃドメインに融合した以下のＪＡＧ−１アミノ酸配列（配列番号１６）をコードした。

（配列中、１本の下線を引いた太字部分の配列はＤＳＬドメインであり、２本の下線を引いた太字部分の配列はそれぞれＥＧＦリピート１及び２であり、イタリック体はリンカー／ヒンジである）
Ｊ１Ｅ２．Ｆｃ４配列をコードしているＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切除し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ｐＥＥ１４．４にライゲートした。得られたプラスミドｐＥＥ１４．Ｊ１Ｅ２．Ｆｃ４を、ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、産物の同定を配列決定によって確認した。
様々な数のＥＧＦリピートを含むヒトＤｅｌｔａ１をベースとする一連の短縮型を以下のように調製した。
Ａ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン及びＥＧＦリピート１−２
ＤＳＬドメイン及び最初の２つのみの天然ＥＧＦリピートをコードしているヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失（すなわち、ＥＧＦリピート３から８までを削除）を、以下のプライマー対を用いて、ＤＬＬ−１細胞外（ＥＣ）ドメイン／Ｖ５Ｈｉｓクローン（ヒトＤＬＬ−１ ＥＣドメインの配列は、図、及びたとえばＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ００３５２２を参照）からＰＣＲによって産生した。
（配列番号１７）及び


（配列番号１８）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９５℃／３分で１サイクル
（９５℃／１分、６０℃／１分、７２℃／２分）で１８サイクル及び
７２℃／２分で１サイクル
次いで、ＤＮＡを、１×Ｕ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中１％アガロースゲルから単離し、以下のプライマーによるＰＣＲの鋳型として用いた。
（配列番号１９）及び


（配列番号２０）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９４℃／３分で１サイクル
（９４℃／１分、６８℃／１分、７２℃／２分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
この断片をｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートし、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その後、シュリンプアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ゲル精製した。
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩにクローン化されたＤＬＬ−１欠失を、ＨｉｎｄＩＩＩ（及び後の所望のＤＮＡ産物の選択を容易にするためにＥｃｏＲＶ）で切断し、その後、ＡｐａＩ部分制限を行った。次いで、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲートし、それをＴＯＰ１０細胞にクローン化した。
プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生した。
得られたコンストラクト（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−２）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧＦｃドメインに融合した以下のＤＬＬ−１アミノ酸配列（配列番号２１）をコードした。

（配列中、１本の下線を引いた太字部分の配列はＤＳＬドメインであり、２本の下線を引いた太字部分の配列はそれぞれＥＧＦリピート１及び２である）
Ｂ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン及びＥＧＦリピート１−３
ＤＳＬドメイン及び最初の３つのみの天然ＥＧＦリピートをコードしているヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失（すなわち、ＥＧＦリピート４から８までを削除）を、以下のプライマー対を用いて、ＤＬＬ−１ＤＳＬ及びＥＧＦリピート１−４クローンからＰＣＲによって産生した。
（配列番号２２）及び


（配列番号２３）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９４℃／３分で１サイクル
（９４℃／１分、６８℃／１分、７２℃／２．５分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
次いで、ＤＮＡを、１×Ｕ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中１％アガロースゲルから単離し、ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯにライゲートし、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その後、シュリンプアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ゲル精製した。
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩにクローン化されたＤＬＬ−１欠失を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その後、ＡｐａＩ部分制限を行った。次いで、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲートし、それをＴＯＰ１０細胞にクローン化した。
プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
得られたコンストラクト（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−３）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧＦｃドメインに融合した以下のＤＬＬ−１配列（配列番号２４）をコードした。

（配列中、１本の下線を引いた太字部分の配列はＤＳＬドメインであり、２本の下線を引いた太字部分の配列はそれぞれＥＧＦリピート１から３である）
Ｃ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン及びＥＧＦリピート１−４
ＤＳＬドメイン及び最初の４つのみの天然ＥＧＦリピートをコードしているヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失（すなわち、ＥＧＦリピート５から８までを削除）を、以下のプライマー対を用いて、ＤＬＬ−１ＥＣドメイン／Ｖ５ＨｉｓクローンからＰＣＲによって産生した。
（配列番号）２５及び


（配列番号２６）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９５℃／３分で１サイクル
（９５℃／１分、６０℃／１分、７２℃／２．５分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
次いで、ＤＮＡを、１×Ｕ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中１％アガロースゲルから単離し、以下のプライマーによるＰＣＲの鋳型として用いた。
（配列番号２７）及び


（配列番号２８）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９４℃／３分で１サイクル
（９４℃／１分、６８℃／１分、７２℃／２．５分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
この断片をｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯにライゲートし、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その後、シュリンプアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ゲル精製した。
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩにクローン化されたＤＬＬ−１欠失を、ＨｉｎｄＩＩＩ（及び後の所望のＤＮＡ産物の選択を容易にするためにＥｃｏＲＶ）で切断し、その後、ＡｐａＩ部分制限を行った。次いで、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲートし、それをＴＯＰ１０細胞にクローン化した。
プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
得られたコンストラクト（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−４）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧＦｃドメインに融合した以下のＤＬＬ−１酸配列（配列番号２９）をコードした。

（配列中、１本の下線を引いた太字部分の配列はＤＳＬドメインであり、２本の下線を引いた太字部分の配列はそれぞれＥＧＦリピート１から４である）
Ｄ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン及びＥＧＦリピート１−７
ＤＳＬドメイン及び最初の７つの天然ＥＧＦリピートをコードしているヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失（すなわち、ＥＧＦリピート８を削除）を、以下のプライマー対を用いて、ＤＬＬ−１ＥＣドメイン／Ｖ５ＨｉｓクローンからＰＣＲによって産生した。
（配列番号３０）及び


（配列番号３１）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９５℃／３分で１サイクル
（９５℃／１分、６８℃／１分、７２℃／３分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
次いで、ＤＮＡを、１×Ｕ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中１％アガロースゲルから単離し、以下のプライマーによるＰＣＲの鋳型として用いた。
（配列番号３２）及び


（配列番号３３）



ＰＣＲ条件は次のとおりである。
９４℃／３分で１サイクル
（９４℃／１分、６８℃／１分、７２℃／３分）で１８サイクル及び
７２℃／１０分で１サイクル
この断片をｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯにライゲートし、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＣＲ産物の同定を配列決定によって確認した。
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その後、シュリンプアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ゲル精製した。
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩにクローン化されたＤＬＬ−１欠失を、ＨｉｎｄＩＩＩ（及び後の所望のＤＮＡ産物の選択を容易にするためにＥｃｏＲＶ）で切断し、その後、ＡｐａＩ部分制限を行った。次いで、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲートし、それをＴＯＰ１０細胞にクローン化した。
プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐキット（ＱＩＡｐｒｅｐ（商標））を用いて産生し、ＰＲＣ産物を配列決定した。
得られたコンストラクト（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−７）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧＦｃドメインに融合した以下のＤＬＬ−１酸配列（配列番号３４）をコードした。

（配列中、１本の下線を引いた太字部分の配列はＤＳＬドメインであり、２本の下線を引いた太字部分の配列はそれぞれＥＧＦリピート１から７である）
Ｅ）トランスフェクション及び発現
ｉ）コンストラクトＡ、Ｃ、及びＤのコンストラクトのトランスフェクション及び発現
Ｃｏｓ１細胞を、個別に上述の実施例１、３、及び４の各発現コンストラクト（すなわち、ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−２、ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−４、ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−７）、並びにｐＣＯＮγコントロールで以下のようにトランスフェクトした。
いずれの場合も、３×１０６の細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の１０ｃｍ皿に平板培養し、細胞を一晩プレートに付着させた。その細胞単層を、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞を８ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れた。１２μｇの適切なコンストラクトＤＮＡを８１０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地に希釈し、１４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）カチオン脂質トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を８１０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地に希釈した。次いで、このＤＮＡ含有、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬含有溶液を混合し、室温で最小２０分間インキュベートし、細胞に添加して、皿で確実にトランスフェクション混合物を均等に分布させた。細胞をトランスフェクション試薬と共に６時間インキュベートし、その後、培地を除去し、２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳと交換した。５日後、分泌されたタンパク質を含有する上澄みを細胞から回収し、上澄みに懸濁した死細胞を遠心法によって除去した（４５００ｒｐｍで５分間）。得られた発現産物を以下のように命名した。ｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−２Ｆｃ（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−２由来）、ｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−４Ｆｃ（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−４由来）、及びｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−７Ｆｃ（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−７由来）。
Ｆｃ融合タンパク質の発現を、ウェスタンブロットによって評価した。上澄み１０μｌ中のタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、セミドライ装置によって、Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）ニトロセルロース膜にブロットした（１７Ｖ、２８分間）。Ｆｃ融合タンパク質の存在は、ブロッキング溶液（５％無脂肪乳固体を含むトリス緩衝生理食塩水及びＴｗｅｅｎ２０界面活性剤ｊＴＢＳ−Ｔ）に１：５００に希釈したＪＤＣ１４抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いて、ウェスタンブロットによって検出した。このブロットを、その溶液中で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。それぞれ５分間３回洗浄した後、マウス抗ヒトＩｇＧ４抗体の存在を、ブロッキング溶液に１：１００００に希釈したＩｇＧ−ＨＰＲＴコンジュゲート抗血清を用いて検出した。このブロットを、その溶液中で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した（それぞれ５分間３回洗浄）。その後、Ｆｃ融合タンパク質の存在を、ＥＣＬ（商標）検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて視覚化した。
１０ｍｌの上澄みに存在するタンパク質の量を、１０ｎｇ（７）、３０ｎｇ（８）、及び１００ｎｇ（９）のタンパク質を含有するＫａｐｐａ鎖標準と比較することによって評価した。
ブロットの結果を、図２４に示す。
ｉｉ）コンストラクトＢのコンストラクトのトランスフェクション及び発現
Ｃｏｓ１細胞を、上述の実施例２の発現コンストラクト（すなわち、ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−３）で以下のようにトランスフェクトした。
７．１×１０５の細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）のＴ２５フラスコに平板培養し、細胞を一晩プレートに付着させた。その細胞単層を、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞を１．１４ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れた。２．８５μｇの適切なコンストラクトＤＮＡを１４３μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地に希釈し、１４．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）カチオン脂質トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１２９μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地に希釈し、室温で４５分間インキュベートした。次いで、このＤＮＡ含有、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬含有溶液を混合し、室温で１５分間インキュベートし、細胞に添加して、フラスコ内で確実にトランスフェクション混合物を均等に分布させた。細胞をトランスフェクション試薬と共に１８時間インキュベートし、その後、培地を除去し、３ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳと交換した。４日後、分泌されたタンパク質を含有する上澄みを細胞から回収し、上澄みに懸濁した死細胞を遠心法によって除去した（１２００ｒｐｍで５分間）。得られた発現産物を以下のように命名した。ｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−３Ｆｃ（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−３由来）。
Ｆ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
上述のＡからＤのＦｃタグＮｏｔｃｈリガンド発現産物（ｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−２Ｆｃ、ｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−４Ｆｃ、及びｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−７Ｆｃ）をそれぞれ、以下のようにビオチン化α−ＩｇＧ−４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カタログ番号５５５８７９）のクローンＪＤＣ１４、０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ（ＵＫ）ＬｔｄのＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｉｎｄｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（カタログ番号１１５．２１）「ビーズ」、４．０×１０８ビーズ／ｍｌ）に個別に固定化した。
分析するそれぞれの試料に関して、１×１０７のビーズ（４．０×１０８ビーズ／ｍｌでビーズ２５μｌ）及び２μｇのビオチン化α−ＩｇＧ４を用いた。ＰＢＳをビーズに添加して１ｍｌとし、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿した。さらにＰＢＳ１ｍｌで洗浄した後、混合物を再び遠心沈殿した。その後、ビーズを、滅菌エッペンドルフ管のビオチン化α−ＩｇＧ４を含有するＰＢＳ最終容量１００μｌに再懸濁し、室温で３０分間シェーカーに置いた。ＰＢＳを添加して１ｍｌとし、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿し、その後、さらに２回、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄した。
次いで、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿し、ビーズを試料当たり５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。５０μｌのビオチン化α−ＩｇＧ４被覆ビーズを各試料に添加し、混合物を４℃で一晩、回転式シェーカーでインキュベートした。その後、管を、室温で５分間、１０００ｒｐｍで回転した。ビーズをＰＢＳ１０ｍｌで洗浄し、遠心沈殿し、ＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、滅菌エッペンドルフ管に移し、さらに２×１ｍｌのＰＢＳで洗浄、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ最終容量１００μｌに、すなわち１．０×１０５ビーズ／μｌで再懸濁した。
安定Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて除去し、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。細胞１０μｌをカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、１．０×１０５細胞／ｍｌに細胞密度を調整した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１ｍｌ中、２４ウェルプレートにウェル当たり１．０×１０５の細胞を平板培養し、インキュベーターに置き、少なくとも３０分間静置した。
その後、ビーズ２０μｌを、１対のウェルに２重で添加し、２．０×１０６ビーズ／ウェル（１００ビーズ／細胞）とした。プレートを、ＣＯ２インキュベーターに一晩放置した。
その後、すべてのウェルから上澄みを除去し、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加し、生じた混合物を、室温で５分間放置した。
その後、混合物を２回ピペットで上下させて確実に細胞融解し、各ウェルの内容物を９６ウェルプレート（Ｖ型ウェルを有する）に移し、プレートホルダー中、室温で５分間、１０００ｒｐｍで回転した。
その後、ビーズペレットを残し、透明上澄み１７５μｌを白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。
次いで、ルミネセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。結果を図２５に示す（比較のために、完全Ｄｌｌ１ＥＣドメインを含む融合タンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ）の活性も示す）。
Ｊａｇｇｅｄ短縮型
様々な数のＥＧＦリピートを含むヒトＪａｇｇｅｄ１をベースとする類似の一連の短縮型を以下のように調製した。
実施例２１に記載したものと類似の方法で、ヒトＪａｇｇｅｄ１（ｈＪａｇ１）ＤＳＬドメイン及びそれぞれ最初の２、３、４、及び１６個の天然ＪａｇｇｅｄＥＧＦリピートをコードしているヌクレオチド配列を、ヒトＪａｇｇｅｄ−１（たとえばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６１２７６を参照）からＰＣＲによって産生した。その後、これらの配列を精製し、免疫グロブリンＦｃドメインをコードしているｐＣＯＮγ発現ベクターにライゲートし、発現させ、マイクロビーズに被覆した。これらの発現タンパク質は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧＦｃドメインに融合したそれぞれ最初の２つ（ｈＪａｇ１ＥＧＦ１−２）、３つ（ｈＪａｇ１ＥＧＦ１−３）、４つ（ｈＪａｇ１ＥＧＦ１−４）、及び１６個（ｈＪａｇ１ＥＧＦ１−１６）のＪａｇｇｅｄＥＧＦリピート、並びにＤＳＬドメインを含んだ。
次いで、それぞれの発現タンパク質で被覆されたビーズを、上述のＮｏｔｃｈシグナリングレポーターアッセイにおいて、活性に関して試験した。得られた活性のデータを図２６に示す。
より容易な比較のために、対応するＤｅｌｔａタンパク質と共に、発現Ｊａｇｇｅｄタンパク質を用いて、同様のアッセイを行った。結果を図２７に示す。
高感受性によるＪａｇｇｅｄＥＧＦ１−２のアッセイ
さらなる実験において、実施例７のヒトＪａｇｇｅｄ１ＤＳＬドメイン及び最初の２つのＥＧＦリピートを含む精製タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ）をビーズに被覆し、高い感受性を与える高いタンパク質負荷で、上述のＮｏｔｃｈレポーターアッセイにおいて活性に関して試験した。得られた活性のデータを図２８に示す（比較のために、完全Ｄｌｌ１ＥＣドメインを含む融合タンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ）の活性も示す）。
Ｎｏｔｃｈシグナリング阻害剤はＫＬＨに対する免疫応答を増強する
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループ８匹）を尾の底部に皮下によって、マウス当たり５０ｎｇ又は０．５ｎｇの、上述の実施例１のｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質（１００マイクログラム）を含む又は含まないフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）に乳化したＰｉｅｒｃｅのスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）用いて免疫化した。一部のマウスにはさらに、１日後、隣接皮下部位に追加のｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ（４００マイクログラム）を投与した。最初のＫＬＨプライミングから１４日後、それらのマウスを、２０マイクログラムのＫＬＨで右耳にチャレンジし、２４時間後に誘導された炎症反応による耳の厚さの増加として、耳の免疫応答をカリパスで測定した。
結果を図２９に示す。
すべての刊行物は、参照により本明細書の一部とする。本発明の範囲及び精神から逸脱することのない記載した本発明の方法及び系の様々な修正及び変更は当分野の技術者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載したが、請求の本発明はそのような特定の実施形態に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、生化学及び生命工学、又は関連分野の技術者に明らかである本発明を実施するために記載された方法の様々な修正は、添付の請求の範囲の範囲内であることが意図される。
Ｎｏｔｃｈ／リガンド相互作用の概略を示す図である。 Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の概略を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ１〜４の概略を示す図である。 Ｎｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａの概略を示す図である。 種々のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンド由来のＤＳＬドメインのアラインされたアミノ酸配列を示す図である。 ヒトＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３、及びＤｅｌｔａ−４のアミノ酸配列を示す図である。 ヒトＪａｇｇｅｄ−１及びＪａｇｇｅｄ−２のアミノ酸配列を示す図である。 ヒトＮｏｔｃｈ−１のアミノ酸配列を示す図である。 ヒトＮｏｔｃｈ−２のアミノ酸配列を示す図である。 本発明での使用に適したタンパク質構築体の概略を示す図である。 本発明による核酸発現コンストラクトの概略を示す図である。 実施例１の融合タンパク質のアミノ酸配列及びドメイン構造を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例３の結果を示す図である。 実施例５の結果を示す図である。 実施例６の結果を示す図である。 実施例７の結果を示す図である。 実施例８の結果を示す図である。 実施例９の結果を示す図である。 実施例１０の結果を示す図である。 実施例１１の結果を示す図である。 実施例１２の結果を示す図である。 実施例１３の結果を示す図である。 実施例１５の結果を示す図である。 実施例１５の結果を示す図である。 実施例１６の結果を示す図である。 実施例１６の結果を示す図である。 実施例１７の結果を示す図である。 実施例１８の結果を示す図である。

Claims (74)

  1. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  2. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  3. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  4. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  5. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  6. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  7. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  8. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  9. タンパク質又はポリペプチドが、異種アミノ酸配列に融合している請求項１〜９のいずれか一項に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  10. タンパク質又はポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＦｃ）ドメインに融合している請求項１０に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  11. ＩｇＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃドメインである請求項１１に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  12. タンパク質又はポリペプチドがさらに、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインを含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  13. 癌に対する免疫応答を促進するために用いる請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  14. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  15. 癌の治療に用いる、
    ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＥＧＦドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＥＧＦドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項１５に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  16. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法。
  17. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  18. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  19. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  20. ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  21. ｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  22. ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  23. ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含むＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤を投与することによる、請求項１７に記載の癌を治療する方法。
  24. タンパク質又はポリペプチドが、異種アミノ酸配列に融合している請求項１７から２４のいずれか一項に記載の方法。
  25. タンパク質又はポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＦｃ）ドメインに融合している請求項２５に記載の方法。
  26. ＩｇＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃドメインである請求項２６に記載の方法。
  27. タンパク質又はポリペプチドがさらに、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインを含む請求項２７に記載の方法。
  28. 癌に対する免疫応答を促進するための請求項１７から２８のいずれか一項に記載の方法。
  29. ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を投与することによって、癌に対する免疫応答を促進する方法。
  30. ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＥＧＦドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＥＧＦドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を投与することによる、請求項３０に記載の方法。
  31. Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤が、癌抗原又は癌抗原決定基、或いは癌抗原又は癌抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドと同時、個別、又は順次組み合わせで投与される請求項１７から３１のいずれか一項に記載の方法。
  32. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む癌ワクチン。
  33. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  34. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  35. ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  36. ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  37. ｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  38. ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  39. ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、
    ｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いは
    ｉｉｉ）そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、を含む請求項３３に記載の癌ワクチン。
  40. タンパク質又はポリペプチドが、異種アミノ酸配列に融合している請求項３３から４０のいずれか一項に記載の癌ワクチン。
  41. タンパク質又はポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＦｃ）ドメインに融合している請求項４１に記載の癌ワクチン。
  42. ＩｇＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃドメインである請求項４２に記載の癌ワクチン。
  43. タンパク質又はポリペプチドがさらに、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインを含む請求項３０から４３のいずれか一項に記載の癌ワクチン。
  44. 癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドをさらに含む請求項３０から４４のいずれか一項に記載の癌ワクチン。
  45. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品。
  46. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含み、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  47. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  48. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  49. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  50. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  51. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  52. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、又はＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する０、１、又は２つであるが、２つを超えないＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項４６に記載の製品。
  53. タンパク質又はポリペプチドが、異種アミノ酸配列に融合している請求項４６から５３のいずれか一項に記載の製品。
  54. タンパク質又はポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＦｃ）ドメインに融合している請求項５４に記載の製品。
  55. ＩｇＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃドメインである請求項５５に記載の製品。
  56. タンパク質又はポリペプチドがさらに、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインを含む請求項４６から５６のいずれか一項に記載の製品。
  57. 癌に対する免疫応答を促進するために用いる請求項４６から５７のいずれか一項に記載の製品。
  58. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品。
  59. ｉ）癌抗原又は抗原決定基、或いは癌抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＥＧＦドメイン、及びヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＥＧＦドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドの多量体（各単量体は同一でも異なっていてもよい）、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、癌を治療するための同時、個別、又は順次使用の併用調剤として含む請求項１５に記載のＮｏｔｃｈシグナリングの阻害剤。
  60. 癌に対する免疫応答を促進する薬剤の製造における、
    ａ）Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子の使用。
  61. 癌を治療する薬剤の製造における、
    ａ）Ｎｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子の使用。
  62. 抗体、断片、又は誘導体が、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節するように、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する請求項６１又は６２に記載の使用。
  63. 抗体、誘導体、又は断片が、モノクローナル抗体、或いはモノクローナル抗体の誘導体又は断片である請求項６１から６３のいずれか一項に記載の使用。
  64. 因子が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖから選択された抗体断片又は誘導体、或いはそのような断片又は誘導体をコードするポリヌクレオチドである請求項６１から６４のいずれか一項に記載の使用。
  65. 因子が、Ｎｏｔｃｈリガンドの１つ又は複数のＤＳＬ、ＥＧＦ、又はＮ末端ドメイン、或いはＮｏｔｃｈの１つ又は複数のＥＧＦ又はＬ／Ｎドメインに結合する抗体、誘導体、又は断片である請求項６１から６５のいずれか一項に記載の使用。
  66. 因子が、Ｎｏｔｃｈに結合する抗体、誘導体、又は断片である請求項６１から６６のいずれか一項に記載の使用。
  67. 因子が、Ｄｅｌｔａに結合する抗体、誘導体、又は断片である請求項６１から６６のいずれか一項に記載の使用。
  68. 因子が、Ｓｅｒｒａｔｅ又はＪａｇｇｅｄに結合する抗体、誘導体、又は断片である請求項６１から６６のいずれか一項に記載の使用。
  69. 癌が、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、膀胱、ＣＮＳ、食道、頭又は頸部、肝臓、精巣、胸腺、又は甲状腺の癌、或いは血球、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、リンパ球前駆体、又は骨髄性細胞前駆体の悪性腫瘍である請求項６１から６９のいずれか一項に記載の使用。
  70. ａ）Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子を投与することによって、癌に対する免疫応答を促進する方法。
  71. ａ）Ｎｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子を投与することによって、癌を治療する方法。
  72. ａ）Ｎｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子、及び薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物。
  73. 腫瘍抗原又は抗原決定基、或いはそのような抗原又は抗原決定基をコードするポリヌクレオチド、及び
    ａ）Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子を含む癌ワクチン組成物。
  74. （ｉ）腫瘍抗原又は抗原決定基、或いはそのような抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを投与する段階、及び
    （ｉｉ）ａ）Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドに結合する抗体、
    ｂ）そのような抗体の断片又は誘導体、或いは
    ｃ）そのような抗体、断片、又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から選択された因子を同時、個別、又は順次に投与する段階を含む、腫瘍に対抗して患者にワクチン接種する方法。
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