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Abstract

免疫療法に用いる薬剤の製造におけるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用、及びそのようなモジュレーターを検出する方法。

Description

本発明は、プレセニリン及びプレセニリン依存性γセクレターゼ活性のモジュレーターを含む、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）プロテアーゼ活性のモジュレーターの使用に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）の病因学的な原理はまだ明らかになっていないが、ＡＤの主たる部分は遺伝要因に帰する可能性がある。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）は遺伝子には異種のものがあり、６０歳を境界として用いて、発症年齢に従って分類することができる。早期発症ＦＡＤ遺伝子には、第２１染色体上のアミロイドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）遺伝子、第１４染色体上のプレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子、及び第１染色体上のプレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子が含まれる。早発ＦＡＤの約５０％はこれらの遺伝子の欠陥が原因であり、その大部分はＰＳ１遺伝子に生じる。
プレセニリンは、Ｎｏｔｃｈシグナリング、より詳細にはその細胞内ドメインを核に放出するＮｏｔｃｈのタンパク質分解に関与するとされている。さらに、γセクレターゼも、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路においてこのステップに影響を及ぼすことが報告されている（ＤｅＳｔｒｏｏｐｅｒ）。これはＳｅｌｋｏｅに概説されている。Ｎｏｔｃｈシグナル変換も、脊椎動物及び非脊椎動物組織の細胞運命決定において重要な役割を果たす。Ｎｏｔｃｈは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの胚及び幼虫発生の多くの段階、並びに多くの異なる細胞で発現し、神経発生、並びに中胚葉及び内胚葉細胞の分化における重要な役割を含む広範な機能を示唆している。したがって近年の研究は、アルツハイマー病及び他の神経関連疾患を治療するため、並びに細胞の運命を変えるための、プレセニリンのアンタゴニストに集中している（たとえばＷＯ０１／０３７４３、及びＨａｄｌａｎｄ等を参照のこと）。
胸腺での成熟中、Ｔ細胞は「自己寛容」と称される過程である自己抗原を非自己抗原から識別する能力を獲得する。しかしながら、非自己抗原に対する寛容は、その抗原を含むペプチド断片による特定の条件下での免疫化によって誘導される可能性がある。多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病などの自己免疫疾患においては、寛容の適切な調節の不全がある。寛容を再確立する改善された治療法は、自己免疫疾患に望ましい。同様にアレルギー状態、及びドナー個体からの器官又は組織の移植においても、特定の異種抗原又は異種抗原プロファイルに対する寛容の誘導が望ましい。
Ｎｏｔｃｈ、並びにそのリガンド、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅの末梢免疫系の正常な成体細胞の細胞表面での発現は、Ｔ細胞獲得免疫能におけるこれらのタンパク質の役割を示唆している（Ｈｏｙｎｅ等（２０００）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２：１７７〜１８５）。Ｔ細胞は、Ｎｏｔｃｈ ｍＲＮＡを構成的に発現する。Ｎｏｔｃｈシグナリングは末梢の不応答（寛容又は無反応）、連鎖抑制、及び感染寛容の誘導において中心的な役割を果たし、Ｎｏｔｃｈ受容体リガンドファミリーは胚発生後も免疫系で細胞運命決定の調節を続ける（Ｅｌｌｉｓｅｎ）という考えを、これらの観察は強固なものにする。
連鎖抑制は、完全抗原分子がチャレンジ免疫化に用いられるときに起こり、標的抗原だけでなく、抗原分子の他の非標的領域に対して寛容化されている細胞によって特徴づけられる（Ｈｏｙｎｅ等、（２０００））。感染寛容は、それによって抗原特異的寛容を他の隣接Ｔ細胞に伝えることのできるある種の調節性Ｔ細胞の産生が可能になる過程である（Ｑｉｎ及びＷＯ９８／２０１４２）。これらの細胞の機能活性は、それらの細胞表面、又は抗原提示細胞の表面におけるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質の過剰発現によって模倣され得る。特に、調節性Ｔ細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質のＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅファミリーのメンバーの過剰発現によって生じ得る。１つの抗原エピトープに特異的なＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ誘導Ｔ細胞は、同一抗原又は関連抗原の他のエピトープを認識するＴ細胞に寛容を伝えることもでき、「エピトープ拡散」と称される現象である。
したがって、ＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９、及びＷＯ０１／３５９９０に記載されているように、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の操作は、免疫療法、並びにＴ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、Ｔ細胞系の腫瘍誘発異常、並びにたとえばマラリア原虫種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュウドモナス、トキソプラスマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキシカラに起因する感染症を標的にすることができる。Ｎｏｔｃｈリガンド発現は、癌においても役割を果たす。実際、アップレギュレートされたＮｏｔｃｈリガンド発現が、いくつかの腫瘍細胞で観察されている。これらの腫瘍細胞は、特異的な抗原による再刺激に対するＴ細胞不応答性を付与することができ、したがって腫瘍細胞がどのように正常なＴ細胞応答を妨げるかという説明を提供する。Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのＮｏｔｃｈシグナリングのダウンレギュレーションは、腫瘍特異抗原を認識するそれらのＴ細胞で、腫瘍細胞が免疫寛容を誘導するのを妨げるために用いることができる。次いで、これによりＴ細胞が腫瘍細胞に対する免疫応答を開始することが可能になる（ＷＯ００／３５９９０）。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、及びそれにより影響を受ける状態の説明は、本出願人等の公開ＰＣＴ出願ＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９、及びＷＯ０１３５９９０に見出すことができる。ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（ＷＯ９８／２０１４２）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（ＷＯ００／３６０８９）、及びＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（ＷＯ０１３５９９０）それぞれの原本を参照により本明細書の一部とする。
ＷＯ０１／０３７４３ ＷＯ９８／２０１４２ ＷＯ００／３６０８９ ＷＯ０１／３５９９０ ＷＯ９７／０１５７１ ＷＯ９６／２７６１０ ＷＯ９２／１９７３４ Ｇｅｙｓｅｎ、１９８４年９月１３日公開、欧州特許出願８４／０３５６４ ＷＯ−Ａ−８４／０３５６４ ＷＯ９１／１３２８１ ＥＰ３１１８６３Ｂ ＥＰ−Ａ−４１４３７４ ＥＰ−Ａ−０３０４５７８ ＥＰ−Ａ−１９８４７４ ＷＯ９６／２６２７７ ＵＳ５８４３４６４ ＷＯ０９７／４１７３１ ＷＯ９６／２９４１２ ＷＯ９０／０６９５１ ＷＯ９９／０３８８４ ＵＳ５０５７５４０ ＷＯ９６／０２５５５ ＧＢ２２２０２１１ ＷＯ９９／４４５８３ Ｈｏｙｎｅ等（２０００）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２：１７７〜１８５ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．等、１９９５及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、及び１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、１９９２及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８ Ｒｅｅｓ等、１９８８、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２０５３〜２０６１ Ｋｎｕｓｔ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．７６１〜７６６ Ｒｏｔｈｂｅｒｇ等、１９８８、Ｃｅｌｌ５５：１０４７〜１０５９ Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８９１〜１８９７ Ｓｕｄｈｏｆ等、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：８１５〜８２２ Ｋｕｒｏｓａｗａ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６３：５９９３〜５９９６ Ａｐｐｅｌｌａ等、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４３７〜４４４０ Ｂｒｕｔｌａｇ等、１９９０、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９９２、Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｇｌｕｃｋ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２、１０、９１５〜９２０ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１９８９、６７、１００７、Ｒｕｂｉｎｓ等、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２５、３３７〜３４２ Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖｏｌｌｅｒ等編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８
本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を改変することにより、免疫系を調節するさらなる方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様によれば、免疫療法に用いる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
換言すれば、本発明は、免疫療法を必要とする個体に有効量のＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む、免疫療法の方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態は、プレセニリン活性のモジュレーターの使用に関する。
本発明の他の実施形態は、プレセニリン依存性γセクレターゼ活性のモジュレーターの使用に関する。
「免疫療法」とは、本明細書では免疫系によって影響を受ける疾患、感染、又は状態の診断、予防、又は治療を含む。
一実施形態において、免疫療法は、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、Ｔ細胞の腫瘍誘発異常、及び感染症の１種又は複数に起因するＴ細胞媒介性疾患又は感染などのＴ細胞媒介性疾患又は感染の治療を含む、Ｔ細胞活性の制御を含む。
本明細書では、「ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を活性化するために、タンパク質分解的に作用してＮｏｔｃｈ受容体を開裂し、Ｎｏｔｃｈ受容体からの細胞内（ＩＣ）領域のすべて又は一部の放出をもたらす酵素又は酵素複合体を意味する。そのような開裂に関与すると考えられる酵素には、プレセニリン及びγセクレターゼ酵素、並びにプレセニリン依存性γセクレターゼ酵素、又は複合体が含まれる。
本明細書では、「プレセニリン依存性γセクレターゼ」という用語は、活性又は活性化にプレセニリンを必要とするγセクレターゼタンパク質分解活性を有する酵素を意味する。プレセニリンは、たとえばコアクチベーターとして、又は酵素複合体の一部として必要とされる可能性がある。
一実施形態において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと組み合わせて用いられる。たとえば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤は、ＣＳＬ非依存性経路の相対的シグナリングを増大する（たとえばＲａｓ−ＭＡＰキナーゼ経路のＮｏｔｃｈ誘導シグナリングを増大する）Ｎｏｔｃｈ受容体のアクチベーターと組み合わせて用いることができる。
最近の研究は、Ｎｏｔｃｈ活性化は一般に、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６つのｃｄｃ１０／アンキリンリピートが核に達し、転写活性化に関与する必要のあることを示している。Ｎｏｔｃｈ１の細胞内尾部のタンパク質分解性開裂の重要部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間（部位３、又はＳ３と称される）であることが同定されている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）。核内移行のためにＮｏｔｃｈＩＣを放出するタンパク質分解性開裂段階は、好ましくはプレセニリン活性を含むと考えられている。
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは、核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリーのメンバーＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）（Ｓｃｈｒｏｅｓｔｅｒ、Ｓｔｒｕｈｌ）、及びＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ（ＭＡＭＬ１／２）などの他の転写因子と転写調節因子複合体を形成することが示されている。このＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）。このＮｏｔｃｈの核機能は、哺乳動物Ｎｏｔｃｈ相同体に関しても示されている（Ｌｕ）。
好ましくは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターは、免疫細胞、好ましくはリンパ球、より好ましくは末梢Ｔ細胞においてＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性を調節する。
一実施形態において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼのモジュレーターは、たとえば活性を低減する酵素の活性部位又はその近傍に結合する因子であることができる。そのような因子は、約１０００Ｄａ未満、好ましくは約５００Ｄａ未満の分子量を有する、いわゆる「低分子」であることができる。適切には、そのような阻害剤は、たとえば約５００マイクロモル未満、適切には約１００マイクロモル未満、好ましくは約１０マイクロモル未満のＩＣ50を有する。
本発明において調節されることのできるプレセニリンタンパク質の例には、プレセニリン−１（ＰＳ１）、及びプレセニリン−２（ＰＳ２）が含まれる。
ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターは、好ましくはポリペプチド及びその断片、直鎖ペプチド、環状ペプチド、及びそれをコードしている核酸、低分子量有機又は無機化合物を含めた合成及び天然化合物、並びに抗体から選択される。このモジュレーターは、たとえば、任意選択でそれぞれＮｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレートする、又はダウンレギュレートすることのできる因子と組み合わせた、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニスト又はアンタゴニストであることができる。
本発明に用いることのできるプレセニリンのアゴニストの例には、ニカストリン（Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）又はＡＬＧ−３、或いはそれをコードしている核酸配列が含まれる。本発明に用いることのできるプレセニリンのアンタゴニストの例は、２６Ｓプロテアソーム、又はそれをコードしている核酸配列である。合成阻害剤には、たとえば以下の式を有するＣｉｔｒｏｎ等、及びＷｏｌｆｅ等に記載のジフルオロケトン阻害剤、
Figure 2005515971
 Ｓｉｎｈａ及びＬｉｅｄｅｒｂｕｒｇに記載の阻害剤（２−ナフトイル−ＶＦ−ＣＨＯ、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｖａｌ−フェニルアラニナール、及びＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−フェニルアラニナール Ｚ−ＬＦ−ＣＨＯ）、Ｅｓｌｅｒ等に記載の阻害剤、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ−Ｐｅｒｅｉｒａ等に記載の阻害剤（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−ロイシナール Ｚ−ＬＬ−ＣＨＯ）、Ｈｉｇａｋｉ等に記載の阻害剤（Ｎ−ｔｒａｎｓ−３，５−ジメトキシシンナモイル）−Ｉｌｅ−ロイシナール ｔ−３，５−ＤＭＣ−ＩＬ−ＣＨＯ）、Ｍｕｒｐｈｙ等に記載の阻害剤（Ｂｏｃ−ＧＶＶ−ＣＨＯ Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−バリナール）、及びＲｉｓｔｏｎ等に記載の阻害剤（１−（Ｓ）−ｅｎｄｏ−Ｎ−（１，３，３）−トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−４−フルオロフェニルスルホンアミド）が含まれる。
セクレターゼ活性は、メタロプロテアーゼによって阻害されることができる。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の発現をアップレギュレートすることができ、本発明に用いることのできる因子には、これに限定されるものではないが、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａファミリーのＮｏｔｃｈリガンド、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、ホリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、Ｘｎｒ３、ＦＧＦ、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体、並びに免疫抑制性サイトカイン、又はそれらの組み合わせ、並びにそれらをコードしている核酸配列が含まれる。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路をダウンレギュレートすることができ、本発明に用いることのできる因子には、これに限定されるものではないが、Ｔｏｌｌ様受容体、サイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、又はアクチビン、或いはそれらをコードしている核酸配列が含まれる。
本発明の他の態様において、免疫療法に用いるためのＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが提供される。
本発明の他の態様において、細胞媒介性疾患、状態、又は感染に影響を与えるために用いるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが提供される。
本発明の他の態様において、連鎖抑制に影響を与えるために用いるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが提供される。
本発明の他の態様において、感染寛容に影響を与えるために用いるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが提供される。
一実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのモジュレーターは、上述のＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと組み合わせて用いることができる。
本発明の他の態様において、アレルゲン、抗原、又は抗原決定基に対する寛容を誘導する能力を有するリンパ球又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法が提供され、その方法は、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、（ｉ）プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニスト、及び任意選択でリンパ球及び／又はＡＰＣで内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドをアップレギュレートすることのできる因子と、（ｉｉ）アレルゲン、抗原、又は抗原決定基と共にインキュベートすることを含む。
一実施形態において、上述の方法によって産生されたＡＰＣは、Ｔ細胞寛容を誘導することができる。したがって、アレルゲン、抗原、又は抗原決定基に対する寛容を有するＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで産生する方法がさらに提供され、その方法は、ヒト又は動物の患者から得たＴ細胞を、（ｉ）プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニスト、及び任意選択でＡＰＣ及び／又はＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現をアップレギュレートすることのできる因子と、（ｉｉ）アレルゲン又は抗原の存在下、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共にインキュベートすることを含む。
本発明の他の態様において、アレルゲン、抗原、又は抗原決定基に対する寛容を有するリンパ球又はＡＰＣを産生する方法が提供され、その方法は、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、上述のいずれか１つの方法によって産生されたリンパ球又はＡＰＣと共にインキュベートすることを含む。
一実施形態において、アレルゲン又は抗原に対する寛容を誘導する能力を有するＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで産生するための上述の方法が提供され、その方法は、ヒト又は動物の患者から得たＴ細胞を、上述のいずれか１つの方法によって産生されたＴ細胞と共にインキュベートすることを含む。
本発明の他の態様において、哺乳動物でのアレルゲン又は抗原に対する免疫応答の抑制における、本発明のいずれか１つの方法によって産生されたリンパ球又はＡＰＣの使用が提供される。
本発明の他の態様において、不適切なリンパ球活性を特徴とする疾患に罹患している患者を治療する方法が提供され、その方法は、本発明の方法によって産生されたリンパ球を患者に投与することを含む。
本発明の他の態様において、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法が提供され、その方法は、
（ａ）体内に存在する前記腫瘍細胞を有する患者からＴ細胞を単離すること、
（ｂ）任意選択でＴ細胞において内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、Ｔ細胞をＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
（ｃ）Ｔ細胞を患者に再導入することを含み、
Ｔ細胞は腫瘍細胞によって発現した腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体を含む。
本発明の他の態様において、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法が提供され、その方法は、
（ａ）患者の体内に存在する腫瘍から抗原提示細胞（ＡＰＣ）を単離すること、
（ｂ）任意選択でＴ細胞をＡＰＣに接触させたときにＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、ＡＰＣをＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
（ｃ）ＡＰＣを患者に再導入することを含む。
本発明の他の態様において、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法が提供され、その方法は、
（ａ）患者の体内に存在する腫瘍から腫瘍細胞を単離すること、
（ｂ）任意選択でＴ細胞を腫瘍細胞に接触させたときにＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、腫瘍細胞をＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
（ｃ）腫瘍細胞を患者に再導入することを含む。
一実施形態において、上述の方法に用いられるＴ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
本発明の他の態様において、腫瘍に対抗して患者にワクチン接種する方法が提供され、その方法は、
（ａ）腫瘍によって発現した腫瘍抗原又は抗原決定基を患者に（適切には皮膚に）投与すること、及び
（ｂ）患者に存在するＡＰＣを、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露することを含む。
本発明の他の態様において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターのアッセイ方法であって、Ｎｏｔｃｈ及び任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの存在下、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼを候補化合物と接触させること、並びにその化合物がＮｏｔｃｈシグナリング経路に影響を与えるかどうかを判定することを含む方法が提供される。適切には、このアッセイは、免疫細胞、たとえばリンパ球又はリンパ球細胞系で行われる。
本発明の他の態様において、プレセニリン結合タンパク質（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質とそれぞれプレセニリンタンパク質、又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの相互作用に影響を与える物質を同定するアッセイ方法であって、
（ａ）プレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、それぞれプレセニリン結合タンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質、及び候補物質を含有する調剤を提供すること、並びに
（ｂ）前記候補物質が、前記プレセニリン結合タンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質と前記プレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの前記相互作用に影響を与えるかどうかを検出する段階を含む方法が提供される。
一実施形態において、プレセニリン結合タンパク質は、Ｎｏｔｃｈ、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路のメンバーである。
本発明の他の態様において、本発明のいずれか１つの使用又は方法における、上述のいずれか１つのアッセイ方法を用いて同定可能なプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼモジュレーターなどのＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様において、１つ又は複数の容器に、（ａ）Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び（ｂ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを含むキットが提供される。
本発明の他の態様によれば、免疫応答を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。一実施形態において、免疫応答を増強する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用が提供される。或いは、免疫応答を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、選択された抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、リンパ球活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、エフェクターＴ細胞活性などの、Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
したがって、一実施形態において、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。一実施形態において、これはヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用を含むことができる。別の実施形態において、これはヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用を含むことができる。
本発明の他の態様によれば、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。一実施形態において、これは細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用を含むことができる。別の実施形態において、これは細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用を含むことができる。
本発明の他の態様によれば、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。一実施形態において、これは調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用を含むことができる。別の実施形態において、これは調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用を含むことができる。
本発明の他の態様によれば、Ｔｒ１又はＴｈ３調節性Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。一実施形態において、これはＴｒ１又はＴｈ３調節性Ｔ細胞活性を阻害する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用を含むことができる。別の実施形態において、これはＴｒ１又はＴｈ３調節性Ｔ細胞活性を増強する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用を含むことができる。
本発明の他の態様によれば、リンホカイン発現又はモノカイン発現などの、サイトカイン発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
特に、Ｎｏｔｃｈ媒介性サイトカイン発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈ媒介性」という用語は、主として又は実質的にＮｏｔｃｈシグナリング経路の活性化又は阻害に、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体の活性化の程度に起因する、又は影響される作用を意味する。
本発明のそのような一態様によれば、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。好ましくは、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
したがって、本発明の一態様において、ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を低減する、好ましくはＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用が提供される。或いは、ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を増大する、好ましくはＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を増大する、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用が提供される。
或いは、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を低減する、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用が提供される。
或いは、減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用が提供される。
本発明はさらに、減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用を提供する。
本発明の他の態様によれば、炎症又は炎症性状態を治療する薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、
抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節する薬剤の製造における、
ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサー又は阻害剤、及び
ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドの組み合わせの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドとの同時、同時期、個別、又は順次組み合わせによる、免疫系を調節する薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサー又は阻害剤の使用が提供される。
適切には、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターは、ｉｎ ｖｉｖｏで患者に投与することができる。或いは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターは、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に投与することができる。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む免疫療法の方法が提供される。適切には、この方法は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと組み合わせてＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む。
適切には、このモジュレーターは、任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレートすることのできる因子と組み合わせた、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニストであることができる。このプレセニリンのアゴニストは、たとえばニカストリン又はＡＬＧ−３から選択されたポリペプチド、或いはそれらをコードしている核酸配列であることができる。
或いは、このモジュレーターは、任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をダウンレギュレートすることのできる因子と組み合わせた、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアンタゴニストであることができる。このプレセニリンのアンタゴニストは、たとえば２６Ｓプロテアソーム又はその成分、或いはＳｅｌ１０、或いはそれらをコードしている核酸配列であることができる。或いは、このアンタゴニストは、活性を低減するように、たとえば活性部位又はその近傍でＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼに結合する因子であることができる。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、免疫応答を調節する方法が提供される。そのような一実施形態において、本発明は、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、選択された抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節する方法を提供する。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、リンパ球、好ましくはＴ細胞活性を調節する方法が提供される。
したがって、一実施形態において、本発明は、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、エフェクターＴ細胞活性を調節する方法を提供する。
他の実施形態において、本発明は、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を調節する方法を提供する。そのような一態様において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を増大する方法が提供される。或いは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を低減する方法が提供される。
本発明はさらに、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を調節する方法を提供する。そのような一態様において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を増大する方法が提供される。或いは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を低減する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を調節する方法が提供される。そのような一実施形態において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を低減する方法が提供される。或いは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を増大する方法が提供される。この調節性Ｔ細胞は、たとえばＴｒ１又はＴｈ３Ｔ細胞であることができる。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、リンホカイン又はモノカイン発現などの、サイトカイン発現を調節する方法が提供される。特に、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、Ｎｏｔｃｈ媒介性サイトカイン発現を調節する方法が提供される。
本発明はさらに、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を調節する方法を提供する。好ましくは、調節されるサイトカイン発現は、Ｎｏｔｃｈ媒介性サイトカイン発現である。
したがって、一態様において、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を低減する、好ましくはＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する方法が提供される。そのような一実施形態において、本発明は、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を増大する方法を提供する。或いは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を増大する方法が提供される。好ましくは、調節されるサイトカイン発現は、Ｎｏｔｃｈ媒介性発現である。
或いは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を低減する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、炎症又は炎症性状態を治療する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドの組み合わせを、同時、同時期、個別、又は順次に投与することによって、抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法が提供され、その方法は、
（ａ）体内に存在する前記腫瘍細胞を有する患者からＴ細胞を単離すること、
（ｂ）任意選択でＴ細胞において内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、Ｔ細胞をＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
（ｃ）Ｔ細胞を患者に再導入することを含み、
Ｔ細胞は腫瘍細胞によって発現した腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体を含む。
本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法が提供され、その方法は、
（ａ）患者の体内に存在する腫瘍から抗原提示細胞（ＡＰＣ）を単離すること、
（ｂ）任意選択でＴ細胞をＡＰＣに接触させたときにＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、ＡＰＣをＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
（ｃ）ＡＰＣを患者に再導入することを含む。
本発明の他の態様において、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法が提供され、その方法は、
（ａ）患者の体内に存在する腫瘍から腫瘍細胞を単離すること、
（ｂ）任意選択でＴ細胞を腫瘍細胞に接触させたときにＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、腫瘍細胞をＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
（ｃ）腫瘍細胞を患者に再導入することを含む。
本発明の他の態様によれば、腫瘍に対抗して患者にワクチン接種する方法が提供され、その方法は、
（ａ）腫瘍によって発現した腫瘍抗原を患者に投与すること、及び
（ｂ）任意選択でＴ細胞においてＮｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現、相互作用、又はプロセシングを低減又は防止することのできる因子の存在下、患者に存在するＡＰＣをＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露することを含む。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターをアッセイする方法であって、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの存在下、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを候補化合物と接触させること、並びにその化合物がＮｏｔｃｈシグナリング経路に影響を与えるかどうかを判定することを含む方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、プレセニリン結合タンパク質、又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質とそれぞれプレセニリンタンパク質、又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの相互作用に影響を与える物質を同定する方法であって、
（ａ）プレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、それぞれプレセニリン結合タンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、及び候補物質を含有する調剤を提供すること、並びに
（ｂ）前記候補物質が、前記プレセニリン結合タンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質と前記プレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの前記相互作用に影響を与えるかどうかを検出することを含む方法が提供される。
適切には、プレセニリン結合タンパク質は、Ｎｏｔｃｈ、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路のメンバーである。
好ましくは、このアッセイは、免疫細胞を用いて行われる。
本発明の他の態様によれば、上述のいずれかの使用又は方法における、上述のアッセイ方法を用いて同定可能なプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、１つ又は複数の容器に、（ａ）Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び（ｂ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを含むキットが提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを、
前記抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節するための同時、同時期、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを、
前記抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節するための同時、同時期、個別、又は順次使用の併用調剤として含む薬剤組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、
ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含む薬剤キットが提供される。
本発明の他の態様によれば、免疫刺激剤として用いられる薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、病原体に対抗するワクチン接種のための薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍に対抗するワクチン接種のための薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を増大するための薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、免疫系を刺激する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、腫瘍又は病原体に対抗して対象にワクチン接種する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、腫瘍又は病原体に対する対象の免疫応答を増大する方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基に対する対象の免疫応答を増大する方法であって、前記腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基と同時、同時期、個別、又は順次に、或いは前記腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドと同時、同時期、個別、又は順次に、有効量のＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを含むアジュバント組成物が提供される。
本発明の他の態様によれば、そのようなアジュバント組成物、及び腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基、或いは腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含むワクチン組成物が提供される。
適切には、このワクチン組成物は、ウイルス、真菌、寄生虫、又は細菌性抗原又は抗原決定基、或いはウイルス、真菌、寄生虫、又は細菌性抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドの形態で、病原体抗原又は抗原決定基を含む。或いは、このワクチン組成物は、腫瘍抗原又は抗原決定基を含むことができる。
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
ｉｉ）腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基、或いは腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを、
前記腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節するための同時、同時期、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品が提供される。
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例として、添付の図面を参照して説明する。
本発明の実施は、別段の指示のないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の通常の技法を用い、それらは当分野の技術者の能力の範囲内である。そのような技法は文献に説明されている。たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．等（１９９５及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、及び１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、並びにＥ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、１９９２及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。それぞれの全般的な原文を参照により本明細書の一部とする。
疑いを避けるために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び脊椎動物名は、本明細書を通じて交換可能に用いられる。両方（該当する場合には、すべて）の相同体は、本発明の範囲内である。
プレセニリン及びＮｏｔｃｈシグナリング経路
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」という表現は、「Ｎｏｔｃｈシグナリング経路」という表現と同義であり、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化を生じる、又は活性化から生じる（かつ活性化を含む）任意の１つ又は複数の上流又は下流の事象を指す。
好ましくは、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」によって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用の活性化又は阻害、Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンド発現又は活性のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション、並びにたとえばＮｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂、及びＲａｓ−Ｊｎｋシグナリング経路のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを含む、Ｎｏｔｃｈシグナリング変換の活性化又は阻害を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化又は阻害の直接上流又は下流の任意の事象を指す。
換言すれば、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」によって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ受容体タンパク質と遺伝子及び／又は分子的に相互作用する因子を含むシグナル変換経路としてのＮｏｔｃｈシグナリング経路を指す。たとえば、分子及び遺伝子両方に基づいてＮｏｔｃｈタンパク質と相互作用する因子は、単に例として、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＤｅｌｔｅｘである。遺伝子的にＮｏｔｃｈタンパク質と相互作用する因子は、単に例として、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｓｕ（Ｈ）、及びプレセニリンである。
一態様において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、細胞外又は細胞膜で起こるシグナリング事象を含む。他の態様において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、細胞内、たとえば細胞質内部、又は細胞核内部で起こるシグナリング事象を含む。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の非常に重要な成分は、Ｎｏｔｃｈ受容体／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用である。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈリガンド又は受容体、或いは結果として生じる開裂産物の発現、性質、量、又は活性の変化を含み得る。さらに、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路Ｇタンパク質、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路酵素、たとえばプロテアーゼ、キナーゼ（たとえばセリン／トレオニンキナーゼ）、ホスファターゼ、リガーゼ（たとえばユビキチンリガーゼ）、又はグリコシルトランスフェラーゼの発現、性質、量、又は活性の変化を含み得る。或いは、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、ＤＮＡ結合因子、たとえば転写因子などの発現、性質、量、又は活性の変化を含み得る。
本発明の好ましい形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングとは特異なシグナリングを意味し、検出されたシグナルが、サイトカインシグナリングなどの他の重要な干渉又は競合要因ではなく、実質的に又は少なくとも主としてＮｏｔｃｈシグナリング経路、好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用に起因することを意味する。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路は、より詳しく以下に記載する。
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、胚において二分細胞運命決定を方向づける。Ｎｏｔｃｈは、２種の異なるリガンド、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅの受容体として機能する膜貫通タンパク質としてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで最初に記載された。脊椎動物は、複数のＮｏｔｃｈ受容体及びリガンドを発現する。今日までヒト細胞で、少なくとも４種のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、及びＮｏｔｃｈ−４）が同定されている。
Ｎｏｔｃｈタンパク質は単一ポリペプチド前駆体として合成され、これはフリン様コンバターゼによって開裂を受け、２つのポリペプチド鎖を生じ、さらに処理されて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体は、２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解性開裂産物のヘテロ２量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部分、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなるＣ末端断片を含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化は、ＴＮＦコンバターゼ（ＴＡＣＥ）を含む細胞外ドメインのタンパク質分解性開裂、及びプレセニリン依存性γ−セクレターゼ活性による膜内開裂を含む。
Ｎｏｔｃｈ受容体は、３６までの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピートを含有する細胞外ドメイン、及び細胞質ドメインを含有する膜貫通サブユニットからなるジスルフィド結合ヘテロ２量体分子として膜に挿入される。Ｎｏｔｃｈの細胞質ドメインは、６つのアンキリン様リピート、ポリグルタミンストレッチ（ＯＰＡ）、及びＰＥＳＴ配列を含有する。ＲＡＭ２３と称される他のドメインは、アンキリンリピートに近接して位置し、アンキリン様リピートと同様に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのへアレスのサプレッサー［Ｓｕ（Ｈ）］、及び脊椎動物のＣＢＦ１として知られる転写因子への結合に関与する（Ｔａｍｕｒａ）。Ｎｏｔｃｈリガンドはさらに、すべてのＮｏｔｃｈリガンドの特徴である、システインに富むＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ Ｌａｇ２）ドメインと共に、細胞外ドメインに複数のＥＧＦ様リピートを示す（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ）。
Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｄｅｌｔａ（Ｄｅｌｔａ１、３、又は４）、Ｓｅｒｒａｔｅ（Ｓｅｒｒａｔｅ１又は２、或いはそれらの相同体Ｊａｇｇｅｄ１及び２）、及びＳｃａｂｒｏｕｓなどの細胞外リガンドの、Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインのＥＧＦ様リピートへの結合によって活性化される。Ｄｅｌｔａは、活性化のための開裂を必要とする可能性がある。これは細胞表面においてＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼＫｕｚｂａｎｉａｎによって開裂され、この開裂事象はＤｅｌｔａの可溶性で活性な細胞外断片を放出する。ＴＡＮ−１としても知られる、短縮細胞外ドメインを有するヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発癌性変異体は、構成的に活性であり、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメインリピートは、細胞内シグナル変換タンパク質との物理的相互作用を媒介する。もっとも顕著には、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートは、へアレスのサプレッサー［Ｓｕ（Ｈ）］と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｃプロモーター結合因子１［ＣＢＦ−１］、エプスタイン−バーウイルス誘発性のＢ細胞不朽化に関与する哺乳動物ＤＮＡ結合タンパク質のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同体である。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）は細胞質のｃｄｃ１０／アンキリンリピートと結合することが実証されている。隣接細胞のリガンドＤｅｌｔａとのＮｏｔｃｈ受容体の相互作用により、Ｓｕ（Ｈ）はＮｏｔｃｈ細胞内ドメインから解離し、そこでＤｅｌｔｅｘに置換され、核に転移する。Ｓｕ（Ｈ）はいくつかの遺伝子のプロモーターに見出される応答因子と相互作用し、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の重要な下流タンパク質であることが知られている。Ｓｕ（Ｈ）及び一般的なＮｏｔｃｈシグナリングの標的遺伝子を以下に挙げる。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Ｈａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている。
上述のように、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）はさらに、直接核機能を有する（Ｌｉｅｂｅｒ）。最近の研究は実際に、Ｎｏｔｃｈ活性化は一般に、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６つのｃｄｃ１０／アンキリンリピートが核に達し、転写活性化に関与する必要のあることを示している。Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部におけるタンパク質分解性開裂の部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間（部位３、又はＳ３と称される）であることが同定されている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）。核内移行のためにＮｏｔｃｈＩＣを放出するタンパク質分解性開裂段階は、プレセニリン活性に依存すると考えられている。
細胞内ドメインは、核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリーのメンバーＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）（Ｓｃｈｒｏｅｓｔｅｒ、Ｓｔｒｕｈｌ）、及びＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ（ＭＡＭＬ１／２）などの他の転写因子と転写調節因子複合体を形成することが示されている。このＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）。このＮｏｔｃｈの核機能は、哺乳動物Ｎｏｔｃｈ相同体に関しても示されている（Ｌｕ）。
ＮｏｔｃｈＩＣプロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に応答して起こる。Ｇｏｌｇｉの初期Ｎｏｔｃｈ受容体の翻訳後修飾（Ｍｕｎｒｏ、Ｊｕ）は、少なくともある程度、細胞表面での２種のリガンドとの相互作用を制御すると考えられる。Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｎｏｔｃｈ／Ｌｉｎモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素Ｆｒｉｎｇｅによって細胞外ドメインで修飾される。Ｆｒｉｎｇｅは、ＥＧＦ様リピートにＯ結合フコース基を添加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（Ｍｏｌｏｎｅｙ、Ｂｒｕｃｋｎｅｒ）。このＦｒｉｎｇｅによる修飾は、リガンド結合を妨げないが、Ｎｏｔｃｈのリガンド誘導性のコンフォメーション変化に影響を及ぼす可能性がある。さらに最近の研究は、Ｆｒｉｎｇｅの作用はＮｏｔｃｈのＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドとの機能的な相互作用を妨げるが、Ｄｅｌｔａとの選択的な相互作用を許容することを示唆している（Ｐａｎｉｎ、Ｈｉｃｋｓ）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは単一のＦｒｉｎｇｅ遺伝子を有するが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Ｒａｄｉｃａｌ、Ｍａｎｉｃ、及びＬｕｎａｔｉｃ Ｆｒｉｎｇｅｓ）（Ｉｒｖｉｎｅ）。
したがって、Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル変換は、異なる経路によって起こり得る（図１）。より明確な経路は、核に転移し、ＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）と転写活性複合体を形成する、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）のタンパク質分解性開裂を含む。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでＤｅｌｔｅｘ又はｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈはさらに、細胞質ジンクフィンガー含有タンパク質Ｄｅｌｔｅｘを含むＣＢＦ−１非依存性の様式でシグナルを伝達することもできる（図１）。ＣＢＦ１とは異なり、Ｄｅｌｔｅｘは、Ｎｏｔｃｈ活性化後に核に移動しない。その代わりに、Ｇｒｂ２と相互作用し、Ｒａｓ−Ｊｎｋシグナリング経路を調節し、次いでこれが標的遺伝子の転写を調節する。
プレセニリンは７から８つの膜貫通ドメイン、及び膜貫通ドメイン６と７の間に位置する親水性ループを有する内因性膜タンパク質である。これまでに２種のプレセニリン遺伝子、ＰＳ１及びＰＳ２が同定されている。ＰＳ１及びＰＳ２の配列の６０％を超えるアミノ酸残基が保存されている。この２種のタンパク質は、主要な構造上の類似性、組織特異選択的スプライシングパターン、及び推定３次構造を共有する。プレセニリン遺伝子は、早期発症家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の主たる原因遺伝子として同定されている。ＦＡＤ変異は、ＰＳ１分子全体を通して見出される。しかしながら、このタンパク質の正しい機能には残基２５７及び３８５の２つの膜内アスパラギン酸が重要であることが明らかにされている（Ｃａｐｅｌｌ等）。
ＰＳ１及びＰＳ２遺伝子及びタンパク質の非ヒト相同体が、同定、単離、及びクローン化されている。これらのなかに、ヒトＰＳ１のマウス相同体（ＰＳ１）、プレセニリン遺伝子ファミリーのＣ．ｅｌｅｇａｎｓメンバー（ＳＥＬ−１２）及びＤ．ｍｅｌａｎｇｏｓｔｅｒメンバー（ＤｍＰＳ）がある。これらの各遺伝子及びタンパク質は、ＰＳ１／ＰＳ２遺伝子に対する高度の相同性に基づいて同定されている。これらの任意の遺伝子及びタンパク質、或いは知られている又は利用できるようになる他の任意の遺伝子及びタンパク質のモジュレーターは、本発明の範囲に含まれる。
ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター
本明細書では、一般にＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性に関して、特にプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ活性に関して「調節する」という用語は、ＮｏｔｃｈＩＣを放出するＮｏｔｃｈの開裂を引き起こす酵素の生物活性の変化及び変更を指す。したがって、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の調節には、たとえば少なくともある程度、そのような酵素の正常な生物活性を遮断する化合物による、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害又はダウンレギュレーションが含まれる。或いは「調節」という用語は、たとえば少なくともある程度、そのような酵素の正常な生物活性を刺激又はアップレギュレートする化合物による、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の活性化又はアップレギュレーションを指すこともできる。
好ましくは、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターは、プレセニリン、プレセニリン依存性γセクレターゼ、又はプレセニリン依存性γセクレターゼ複合体などのＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターである。
換言すれば、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのモジュレーターには、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現及び／又は活性を活性化又は阻害することのできる化合物が含まれる。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼアクチベーター
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化できる化合物によって、本出願人等は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼファミリー、特にＰＳ１及びＰＳ２の任意の１つ又は複数のポリペプチド又はポリヌクレオチドを活性化することのできる化合物、並びにそれらの任意の相同体、誘導体、又は変異体を指す。
一実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化するための分子は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼリプレッサーの優性陰性型である。他の実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化するための分子は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼリプレッサーを阻害することができる。他の実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化するための分子は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの陽性アクチベーターである。
特定の実施形態において、この分子は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現を誘導又は増大することができる。そのような分子は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現を誘導又は増大することのできる核酸配列であることができる。
一実施形態において、この分子は、標的細胞において内因性プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現をアップレギュレートすることができる。特に、この分子は、標的細胞において内因性プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現をアップレギュレートすることができる免疫抑制性サイトカイン、又はそのようなサイトカインをコードしているポリヌクレオチドであることができる。免疫抑制性サイトカインには、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、及びＦＬＴ３リガンドが含まれる。
好ましくは、この分子は、ＡＬＧファミリー、特にＡＬＧ−３、ニカストリン、カルセニリン（Ｃａｌｓｅｎｉｌｉｎ）、β−カテニン、又はＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）のポリペプチド、或いはそれらの変異体、誘導体、又は断片から選択されたポリペプチド、或いはそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、或いはその変異体、誘導体、又は断片であることができる。
ＡＬＧ−３は、第１染色体の家族性アルツハイマー病遺伝子ＰＳ２のマウス相同体である。ＡＬＧ−３は、ＰＳ２のアポトーシスの役割を阻害することのできる短縮型ＰＳ２ポリペプチド（１０３ＣＯＯＨ末端ＰＳ２アミノ酸）をコードしている（Ｄ’Ａｄａｍｉｎｏ等）。実際に、ＰＳ２は、多様な細胞型の一部の形態の細胞死に必要であり、ＡＬＧ−３は、Ｆａｓリガンド誘導及びＦａｓシグナリングを阻害することによって、マウスＴハイブリドーマ３ＤＯ細胞をＴ細胞受容体誘導アポトーシスから救うことが見出されている（Ｌａｃａｎａ等）。ＡＬＧ−３はさらに、プロテアーゼ活性を低減し、Ｆａｓのトリガーによってポリメラーゼ開裂に対抗することが示されている。ＡＬＧ−３のポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ４９１１１に見出すことができる。
ニカストリンは、アミノペプチダーゼ／トランスフェリン受容体スーパーファミリーに見出されるドメインを有する１型膜貫通糖タンパク質である（Ｆａｇａｎ等）。ニカストリンは、ＰＳ１及びＰＳ２と機能複合体を形成することによって、∃−アミロイド前駆体タンパク質のプレセニリン媒介γセクレターゼ開裂の重要な調節因子として作用する。ニカストリンは、Ｎｏｔｃｈのプレセニリン媒介プロセシングにおいて主要な役割を果たす（Ｇａｎｇ等）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの胚におけるニカストリン発現の抑制は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの両方のプレセニリン相同体で同時無発現変異によって誘導されるものと類似のＮｏｔｃｈ表現型のサブセットを誘導する。したがって、ニカストリンとプレセニリンは、Ｎｏｔｃｈタンパク質の膜内タンパク質分解に必要とされる多量体複合体の機能成分である。ニカストリンのポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０２１６０７（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＡＦ２４０４７０（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びＡＦ２４０４６８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）に見出すことができる。
Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバーであるＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）はＰＳ１及びＰＳ２のカルボキシル末端断片と相互作用することが示されている（Ｐａｓｓｅｒ等）。さらに、Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）及びＰＳ２は部分的に小胞輸送系の部位に共局在することが実証されている。Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）のポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００４０５０に見出すことができる。
カルセニリンは、ＰＳ１及びＰＳ２と相互作用することが示されている神経カルシウム結合タンパク質のレコベリン（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）ファミリーのメンバーである。カルセニリンは、調節されたエンド型タンパク質分解性開裂によって産生された内因性２５−ｋＤａプレセニリンＣ末端断片と相互作用する能力を有する。したがって、カルセニリンの発現は、プレセニリンの活性タンパク質分解産物のレベルを調節できる（Ｃｈｏｉ等）。カルセニリンのポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０３２４６２（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ＸＭ＿０１５４１４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、及びＮＭ＿０１９７８９（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に見出すことができる。
β−カテニンは、アルツハイマー病の機構と考えられる相互作用においてＰＳ１と結合する。サイクリン依存性キナーゼｐ３５／ｃｄｋ５は、βカテニンを結合かつリン酸化し、それによってＰＳ１との相互作用を調節する（Ｋｅｓａｖａｐａｎｙ等）。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉｓβカテニンのポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ７７０１３に見出すことができる。
好ましい実施形態において、アクチベーターは、構成的に活性なプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、或いはその相同体、変異体、誘導体、又は断片、或いはそのようなプレセニリンをコードしているポリヌクレオチドである。或いは、アクチベーターは、構成的に活性なプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの分子擬似体であることができる。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化するためのポリペプチド又はポリヌクレオチドによって、本出願人等はさらに、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ活性化の結果として活性化又は発現した分子、及びそのような分子の活性化又は発現に関与する任意の化合物を含む。そのような分子の例は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）、ＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）、ｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ１及びＨＥＳ５である。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの活性化は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの阻害剤を抑制することによって活性化することもできる。したがって、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアクチベーターには、それぞれ任意のプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ阻害剤を抑制することのできる分子が含まれる。好ましくは、この分子は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現又は活性において低減を生じることのできる化合物の生成又は活性を低減する又は妨げる、ポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。好ましい実施形態において、この分子は、２６Ｓプロテアソームなどのポリペプチドを抑制することができる。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ阻害剤
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを阻害することのできるポリペプチドによって、本出願人等は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼファミリー、特にＰＳ１及びＰＳ２の任意の１つ又は複数のポリペプチド又はポリヌクレオチド、並びにそれらの任意の相同体、誘導体、又は変異体を阻害することのできる分子を意味する。
一実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを阻害するための分子は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼアクチベーターの優性陰性型である。他の実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを阻害するための分子は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼアクチベーターを阻害することができる。他の実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化するための分子は、それぞれプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの直接リプレッサーである。
特定の実施形態において、この分子は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現を低減又は防止することができる。そのような分子は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現を低減又は防止することのできる核酸配列であることができる。
一実施形態において、この分子は、標的細胞において内因性プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現及び／又は活性をダウンレギュレートすることができる。好ましくは、この分子は、プロテアソームファミリー、特に２６Ｓプロテアソーム又はＳｅｌ１０、及びその哺乳動物相同体、或いはその変異体、誘導体、又は断片から選択されたポリペプチド、或いはそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、或いはその変異体、誘導体、又は断片である。
２６Ｓプロテアソームは、残基２９８近傍のタンパク質のエンド型タンパク質分解性開裂を引き起こすことによって、ＰＳ１を分解することができる（Ｆｒａｓｅｒ等）。
他の実施形態において、阻害剤は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現において増大を生じることのできる化合物の生成を低減する又は妨げるポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。
或いは、阻害剤は、ポリヌクレオチド、好ましくはプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、及びプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼアクチベーター、たとえばＡＬＧ−３、ニカストリン、カルセニリン、β−カテニン、又はＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）、それらの誘導体、断片、変異体、又は相同体などから選択されたポリペプチドをコードしているセンスヌクレオチド配列由来のアンチセンスコンストラクトである。
プレセニリンの阻害剤にはさらに、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現又は活性によって正常に活性化された分子の発現又は活性を抑制することのできる化合物（たとえばＣＢＦ１、ＨＥＳ１、又はＨＥＳ５）、及びプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現又は活性によって発現又は活性が正常に抑制される化合物が含まれる。プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを阻害するためのタンパク質にはさらに、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを活性化又は変換するのではなく遮断するように修飾されている、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの上述のアクチベーターの変異体が含まれる。そのような阻害剤の例は、Ｎｏｔｃｈに結合するが、開裂しないように修飾されたプレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼである。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター
本発明の好ましい実施形態において、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、すなわちＮｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることのできる化合物と共に用いられる。
本明細書では、「調節する」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、又はその標的シグナリング経路の生物活性の変化及び変更を指す。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングの調節には、たとえば少なくともある程度、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の正常な生物活性を遮断する化合物による、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害又はダウンレギュレーションが含まれる。或いは「調節」という用語は、たとえば少なくともある程度、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の正常な生物活性を刺激又はアップレギュレートする化合物による、Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化又はアップレギュレーションを指すこともできる。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のアップレギュレーター
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレートすることのできる化合物は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を変換又は活性化することのできる化合物である。Ｎｏｔｃｈシグナリング変換のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドによって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈの活性化、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の下流事象、下流標的遺伝子の転写調節、及び他の非転写下流事象（たとえば既存タンパク質の翻訳後修飾）を含むＮｏｔｃｈ受容体によるシグナリングに加わる分子を含む。より詳細には、第２の配列は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の標的遺伝子の活性化を可能にするドメイン、又はそれをコードしているポリヌクレオチド配列である。
換言すれば、Ｎｏｔｃｈシグナリング変換の調節によって、本出願人等は、
ａ）（ｉ）リプレッサーの優性陰性又は阻害剤、及び（ｉｉ）アクチベーターによるＮｏｔｃｈシグナリング経路の活性化、並びに
ｂ）（ｉ）アクチベーターの優性陰性又は阻害剤、及び（ｉｉ）阻害剤によるＮｏｔｃｈシグナリング経路の遮断を含む。
Ｎｏｔｃｈ依存性転写活性化の重要な標的は、エンハンサーオブスプリット複合体（Ｅ［ｓｐｌ］）の遺伝子である。さらに、これらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接の標的であり、Ｎｏｔｃｈシグナリングに応答して転写活性化されることが示されている。ＥＢＮＡ２から類推して、哺乳動物Ｓｕ（Ｈ）相同体ＣＢＦ１と相互作用して、おそらく他のタンパク質と連携してそれを転写リプレッサーから転写アクチベーター、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインに転換するウイルスコアクチベータータンパク質は、Ｓｕ（Ｈ）と結合して活性化ドメインに寄与することができ、それによってＳｕ（Ｈ）がＥ（ｓｐｌ）並びに他の標的遺伝子の転写を活性化することが可能になる。Ｓｕ（Ｈ）はすべてのＮｏｔｃｈ依存性決定に必要とされるわけではなく、これはＮｏｔｃｈが他のＤＮＡ結合転写因子と連携して、又は細胞外シグナルを変換する他の機構を用いて一部の細胞運命選択を媒介することを示唆していることにも留意されたい。
本発明の一態様によれば、第２の配列は、Ｎｏｔｃｈポリペプチド又はポリヌクレオチド、或いはＮｏｔｃｈのシグナリング変換能を保持するその断片、或いはＮｏｔｃｈのシグナリング変換能を有するＮｏｔｃｈのアナログである。Ｎｏｔｃｈによって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、Ｎｏｔｃｈ−４、及び他の任意のＮｏｔｃｈ相同体又はアナログを意味する。特定の好ましい実施形態において、第２のアミノ酸配列は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）、又はそのサブ断片である。
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈのアナログ」という用語は、Ｎｏｔｃｈのシグナリング変換能を保持する変異体を含む。「アナログ」によって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈシグナリング変換能を有するが、一般にＮｏｔｃｈとは異なる進化上の起源を有するタンパク質を含む。Ｎｏｔｃｈのアナログには、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０、又はＬＭＰ２Ａなどのエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質が含まれる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するためのポリペプチド又はポリヌクレオチドによって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、或いはＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の１つ又は複数の成分を活性化することのできる分子を意味する。
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するための分子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングリプレッサーの優性陰性型である。他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するための分子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングリプレッサーを阻害することができる。他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するための分子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの陽性アクチベーターである。
特定の実施形態において、この分子は、Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導又は増大することができる。そのような分子は、Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導又は増大することのできる核酸配列であることができる。
一実施形態において、この分子は、標的細胞においてＮｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドをコードしている内因性遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。特に、この分子は、標的細胞において内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現をアップレギュレートすることができる免疫抑制性サイトカイン、又はそのようなサイトカインをコードしているポリヌクレオチドであることができる。免疫抑制性サイトカインには、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、及びＦＬＴ３リガンドが含まれる。
好ましくは、この分子は、ノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体から選択されたポリペプチド、或いは上述の任意の１つ又は複数をコードしているポリヌクレオチドである。
他の実施形態において、この分子は、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈリガンドをコードしているポリヌクレオチドであることができる。本発明に用いられるＮｏｔｃｈリガンドには、典型的に種々の哺乳動物細胞、たとえば造血幹細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することのできる内因性Ｎｏｔｃｈリガンドが含まれる。
今日までに同定されており、本発明に有用な哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンドの特定の例には、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａ（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＦ００３５２２、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＦ０８４５７６、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、及びＤｅｌｔａ様３（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、並びにＳｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１及びＳｅｒｒａｔｅ−２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、及びＷＯ９２／１９７３４）、Ｊａｇｇｅｄ−１及びＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＡＦ０２９７７８、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、並びにＬＡＧ−２が含まれる。ファミリーメンバー間の相同性は広範である。たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ−２はＳｅｒｒａｔｅに４０．６％の同一性、５８．７％の類似性を有する。
好ましい実施形態において、アクチベーターは、構成的に活性なＮｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン、或いはそのような受容体又は細胞内ドメインをコードしているポリヌクレオチドである。
他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのアクチベーターは、Ｎｏｔｃｈ受容体の下流で作用する。したがって、たとえばＮｏｔｃｈシグナリングのアクチベーターは、構成的に活性なＤｅｌｔｅｘポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであることができる。本発明に有用なＮｏｔｃｈシグナリング経路の他の下流成分には、好ましくは構成的に活性な形態の、Ｄｅｌｔｅｘ−１、Ｄｅｌｔｅｘ−２、Ｄｅｌｔｅｘ−３、Ｄｅｌｔｅｘのサプレッサー（ＳｕＤｘ）、Ｎｕｍｂ及びそのイソ型、Ｎｕｍｂ関連キナーゼ（ＮＡＫ）、Ｎｏｔｃｈｌｅｓｓ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）、ｅｍｂ５、Ｆｒｉｎｇｅ遺伝子（Ｒａｄｉｃａｌ、Ｌｕｎａｔｉｃ、及びＭａｎｉｃなど）、Ｆｒｉｎｇｅ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ＰＯＮ、ＬＮＸ、Ｄｉｓａｂｌｅｄ、Ｎｕｍｂｌｉｋｅ、Ｎｕｒ７７、ＮＦｋＢ２、Ｍｉｒｒｏｒ、Ｗａｒｔｈｏｇ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１及びＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２、Ｌｉｐ−１及びその相同体、Ｄｅｌｔｅｘによって調節されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、プレセニリンなどのＮｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂に関与するポリペプチド、及びＮｏｔｃｈ標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチド、並びにそれらのアナログ、誘導体、変異体、及び断片が含まれる。
Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するためのポリペプチド又はポリヌクレオチドはさらに、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として発現した任意のポリペプチド、及びそのようなポリペプチドの発現に関与する任意のポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを意味する。
Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤を抑制することによっても達成できる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するためのポリペプチドには、任意のＮｏｔｃｈシグナリング阻害剤を抑制することのできる分子が含まれる。好ましくは、この分子は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の下流成分の発現又は活性において低減を生じることのできる化合物の生成又は活性を低減する又は妨げるポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。好ましい実施形態において、この分子は、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリー、サイトカイン、たとえばＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び増殖因子、たとえば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、及びアクチビン、それらの誘導体、断片、変異体、及び相同体のポリペプチドを抑制することができる。
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
上述のとおり、Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的にいくつかの異なるドメインを含む。種々の天然ヒトＮｏｔｃｈリガンドのいくつかの予測される／潜在的ドメイン位置（前駆タンパク質のアミノ酸番号に基づく）を以下に示す。
ヒトDelta 1
成分 アミノ酸 推定機能／ドメイン
シグナル 1-17 シグナル
鎖 18-723 Delta様タンパク質1
ドメイン 18-545 細胞外
膜貫通 546-568 膜貫通
ドメイン 569-723 細胞質
ドメイン 159-221 DSL
ドメイン 226-254 EGF様1
ドメイン 257-285 EGF様2
ドメイン 292-325 EGF様3
ドメイン 332-363 EGF様4
ドメイン 370-402 EGF様5
ドメイン 409-440 EGF様6
ドメイン 447-478 EGF様7
ドメイン 485-516 EGF様8

ヒトDelta 3
成分 アミノ酸 推定機能／ドメイン
ドメイン 158-248 DSL
ドメイン 278-309 EGF様1
ドメイン 316-350 EGF様2
ドメイン 357-388 EGF様3
ドメイン 395-426 EGF様4
ドメイン 433-464 EGF様5

ヒトDelta 4
成分 アミノ酸 推定機能／ドメイン
シグナル 1-26 シグナル
鎖 27-685 Delta様タンパク質4
ドメイン 27-529 細胞外
膜貫通 530-550 膜貫通
ドメイン 551-685 細胞質
ドメイン 155-217 DSL
ドメイン 218-251 EGF様1
ドメイン 252-282 EGF様2
ドメイン 284-322 EGF様3
ドメイン 324-360 EGF様4
ドメイン 362-400 EGF様5
ドメイン 402-438 EGF様6
ドメイン 440-476 EGF様7
ドメイン 480-518 EGF様8

ヒトJagged 1
成分 アミノ酸 推定機能／ドメイン
シグナル 1-33 シグナル
鎖 34-1218 Jagged1
ドメイン 34-1067 細胞外
膜貫通 1068-1093 膜貫通
ドメイン 1094-1218 細胞質
ドメイン 167-229 DSL
ドメイン 234-262 EGF様1
ドメイン 265-293 EGF様2
ドメイン 300-333 EGF様3
ドメイン 340-371 EGF様4
ドメイン 378-409 EGF様5
ドメイン 416-447 EGF様6
ドメイン 454-484 EGF様7
ドメイン 491-522 EGF様8
ドメイン 529-560 EGF様9
ドメイン 595-626 EGF様10
ドメイン 633-664 EGF様11
ドメイン 671-702 EGF様12
ドメイン 709-740 EGF様13
ドメイン 748-779 EGF様14
ドメイン 786-817 EGF様15
ドメイン 824-855 EGF様16
ドメイン 863-917 フォンビルブラント因子C

ヒトJagged 2
成分 アミノ酸 推定機能／ドメイン
シグナル 1-26 シグナル
鎖 27-1238 Jagged2
ドメイン 27-1080 細胞外
膜貫通 1081-1105 膜貫通
ドメイン 1106-1238 細胞質
ドメイン 178-240 DSL
ドメイン 249-273 EGF様1
ドメイン 276-304 EGF様2
ドメイン 311-344 EGF様3
ドメイン 351-382 EGF様4
ドメイン 389-420 EGF様5
ドメイン 427-458 EGF様6
ドメイン 465-495 EGF様7
ドメイン 502-533 EGF様8
ドメイン 540-571 EGF様9
ドメイン 602-633 EGF様10
ドメイン 640-671 EGF様11
ドメイン 678-709 EGF様12
ドメイン 716-747 EGF様13
ドメイン 755-786 EGF様14
ドメイン 793-824 EGF様15
ドメイン 831-862 EGF様16
ドメイン 872-949 フォンビルブラント因子C
ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができる。
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
好ましくは、ＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができ、
Cys Xaa Xaa Xaa ARO ARO Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys BAS NOP
BAS ACM ACM Xaa ARO NOP ARO Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa NOP Xaa Xaa
Xaa Cys Xaa Xaa NOP ARO Xaa NOP Xaa. Xaa Cys
配列中、
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はヒスチジンなどの芳香族アミノ酸残基であり、
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンなどの非極性アミノ酸残基であり、
ＢＡＳは、アルギニン、又はリシンなどの塩基性アミノ酸残基であり、
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンなどの酸又はアミドアミノ酸である。
好ましくは、ＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができ、
Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Arg Pro
Arg Asx Asp Xaa Phe Gly His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa
Xaa Cys Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Cys
（配列中、Ｘａａは任意のアミノ酸であることができ、Ａｓｘはアスパラギン酸又はアスパラギンである）。
種々の供給源由来のＮｏｔｃｈリガンドのＤＳＬドメインのアラインメントを図３に示す。
用いられるＤＳＬドメインは、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ラット、マウス、又はヒトを含む、適切な任意の種に由来することができる。好ましくは、ＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列由来である。
本明細書では、「ＤＳＬドメイン」という用語は、天然ドメインに相当する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、及び擬似体を含むことが理解される。
適切には、たとえば、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、ＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンドだけでなく、血液凝固カスケードに関与するものを含む種々のタンパク質に見出されている（Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８）。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸ及びＸなどの細胞外タンパク質（Ｒｅｅｓ等、１９８８、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２０５３〜２０６１、Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８）、他のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子（Ｋｎｕｓｔ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．７６１〜７６６、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ等、１９８８、Ｃｅｌｌ５５：１０４７〜１０５９）、並びにいくつかの細胞表面受容体タンパク質、たとえばトロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８９１〜１８９７）及びＬＤＬ受容体（Ｓｕｄｈｏｆ等、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：８１５〜８２２）などに見出されている。タンパク質結合部位は、トロンボモジュリン及びウロキナーゼのＥＧＦリピートドメインにマッピングされている（Ｋｕｒｏｓａｗａ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６３：５９９３〜５９９６、Ａｐｐｅｌｌａ等、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４３７〜４４４０）。
ＰＲＯＳＩＴＥによって報告されているとおり、典型的なＥＧＦドメインは、（ＥＧＦにおいて）ジスルフィド結合に含まれることが示されている６つのシステイン残基を含むことができる。その主要な構造は、必ずしも必須ではないが、２本鎖βシートであり、Ｃ末端短２本鎖シートへのループが続くことが報告されている。保存システイン間のサブドメインは、以下の典型的なＥＧＦ様ドメインの概略図に示すように、長さが非常に多様であり、
Figure 2005515971
 図中、
Ｃは、ジスルフィド結合に関与する保存システインであり、
Ｇは、多くの場合、保存グリシンであり、
ａは、多くの場合、保存芳香族アミノ酸であり、
＊は、両パターンの位置であり、
ｘは、任意の残基である。
第５システインと第６システインの間の領域は、２つの保存グリシンを含有し、少なくともその１つは一般にたいていのＥＧＦ様ドメインに存在する。
用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ラット、マウス、又はヒトを含む、適切な任意の種に由来することができる。好ましくは、ＥＧＦ様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列由来である。
本明細書では、「ＥＧＦドメイン」という用語は、天然ドメインに相当する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、及び擬似体を含むことが理解される。
適切には、たとえば、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
実用の問題として、任意の特定のアミノ酸配列が他の配列に対して少なくともＸ％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に求めることができる。たとえば、グローバル配列アラインメントとも称される、問い合わせ配列と対象配列との間の全体的な最大の一致は、Ｂｒｕｔｌａｇ等（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７〜２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムなどのプログラムを用いて求めることができる。ある配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列及び対象配列は、共にヌクレオチド配列であるか、又は共にアミノ酸配列である。グローバル配列アラインメントの結果は、同一性のパーセントとして与えられる。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のダウンレギュレーター
Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するためのポリペプチド又はポリヌクレオチドによって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、或いはＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の１つ又は複数の成分を阻害することのできる分子を意味する。
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するための分子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化又は変換することのできる化合物の優性陰性型である。
他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するための分子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化又は変換できる化合物を抑制することができる。他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するための分子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤である。
特定の実施形態において、この分子は、Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現を低減又は防止することができる。そのような分子は、Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現を低減又は防止することのできる核酸配列であることができる。
好ましくは、この核酸配列は、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリー、サイトカイン、たとえばＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、又は増殖因子、たとえば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、及びアクチビンから選択されたポリペプチドをコードしている。好ましくは、この因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド、たとえばノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体の発現において増大を生じることのできる化合物の生成を低減する又は妨げるポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。
或いは、この核酸配列は、Ｎｏｔｃｈリガンド、及びＮｏｔｃｈリガンド発現をアップレギュレートすることのできるポリペプチド、たとえばノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体から選択されたポリペプチドをコードしているセンスヌクレオチド配列由来のアンチセンスコンストラクトである。
他の好ましい実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節することのできる分子である。分子は、Ｎｏｔｃｈとそのリガンドとの相互作用を、好ましくは治療効果を提供するために充分な程度に阻害することができる場合、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節するとみなすことができる。
この実施形態において、この分子は、Ｔｏｌｌ様受容体、サイトカイン、たとえばＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、又は増殖因子、たとえばＢＭＰ、ＢＭＰ受容体、及びアクチビンから選択されたポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、このポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈリガンド、たとえばノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、相同体、及びアナログの発現において増大を生じることのできる因子の生成を低減する又は妨げる。
好ましくは、阻害剤が、受容体、又は受容体をコードしている核酸配列であるとき、受容体は活性化される。したがって、たとえば、因子が核酸配列であるとき、受容体は発現時に構成的に活性である。
Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害剤にはさらに、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の下流阻害剤（Ｄｓｈ及びＮｕｍｂなど）、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現を妨げる、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路によって抑制される遺伝子の発現を誘導する化合物、及びＮｏｔｃｈシグナリング変換分子の優性陰性型（ＮｏｔｃｈＩＣ及びＤｅｌｔｅｘの優性陰性型など）が含まれる。Ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害するためのタンパク質にはさらに、それらの存在がシグナリング経路を変換するのではなく遮断するように修飾されているＮｏｔｃｈシグナリング経路の野生型成分の変異体が含まれる。そのような化合物の例は、その細胞内ドメインのタンパク質分解性開裂がもはや可能でないように修飾されているＮｏｔｃｈ受容体である。
本発明で有用な細胞
本発明において有用な細胞は、腫瘍細胞、又は免疫系の細胞であることができ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を変換することができる。
Ｎｏｔｃｈリガンド発現腫瘍細胞
メラノーマ細胞系においてＮｏｔｃｈリガンドの発現が同定されている。他の腫瘍細胞も、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの検出、又はウエスタンブロッティングによるＮｏｔｃｈリガンドポリペプチドの検出など、当分野で知られている種々の技法を用いてＮｏｔｃｈリガンドの発現を試験することができる。試験を行うのに適切な腫瘍細胞には、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、膀胱、ＣＮＳ、食道、頭又は頸部、肝臓、精巣、胸腺、又は甲状腺の癌など、悪性腫瘍に存在する細胞が含まれる。悪性血球、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、リンパ球前駆体、又は骨髄性細胞前駆体も試験することができる。
Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する腫瘍細胞は、充実性腫瘍又は非充実性腫瘍由来の腫瘍細胞であることができ、原発腫瘍細胞、又は播種性転移性（２次性）腫瘍細胞であることができる。非充実性腫瘍には、メラノーマ、白血病（急性又は慢性、リンパ性又は骨髄性）、たとえば急性骨髄芽球性、急性前骨髄球性、急性骨髄単球性、急性単球性、赤白血病など、並びにリンパ腫、たとえばホジキン、非ホジキン、及びバーキットリンパ腫などが含まれる。充実性腫瘍には、癌腫、結腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、メラノーマ、基底細胞又は扁平上皮癌、中皮腫、腺癌、神経芽種、神経膠種、星状細胞腫、髄芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨原性肉腫、肝癌、及び精上皮腫が含まれる。
抗原提示細胞
本発明に用いられる抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞であることができ、又はＴ細胞に抗原を提示するように誘導され得る他の細胞であることができる。或いは、ＡＰＣを産生する培養条件下で分化する又は活性化されるＡＰＣ先駆体を用いることができる。本発明のｅｘ ｖｉｖｏ法で用いられるＡＰＣは、典型的に患者の体内で見出される腫瘍又は末梢血から単離される。好ましくは、ＡＰＣ又は前駆体は、ヒト由来である。しかしながら、ＡＰＣが適切な核酸配列を同定及び試験するための予備ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング手順に用いられる場合、健康な患者などの任意の適切な供給源のＡＰＣを用いることができる。
ＡＰＣには、樹状細胞（ＤＣ）、たとえば相互連結ＤＣ又は濾胞ＤＣなど、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、或いは上皮細胞、線維芽細胞、又は内皮細胞などのトランスフェクションによって活性化又は操作されてその表面にＭＨＣ分子（クラスＩ又はＩＩ）を発現する他の細胞型が含まれる。ＡＰＣの前駆体には、ＣＤ３４+細胞、単球、線維芽細胞、及び内皮細胞が含まれる。ＡＰＣ又は前駆体は、培養条件によって修飾することができ、或いはたとえば抗原提示及び／又は免疫相乗作用を促進する選択されたサイトカインの組み合わせ（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８など）において役割を果たすタンパク質をコードしている１つ又は複数の遺伝子のトランスフェクションによって遺伝子的に修飾することもできる。そのようなタンパク質には、ＭＨＣ分子（クラスＩ又はＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＣＤ４０が含まれる。もっとも好ましくは、ＤＣ又はＤＣ前駆体がＡＰＣの供給源として含まれる。
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの手段によって単離／調製することができ、たとえば樹状細胞は、末梢血から直接精製する、或いはたとえばＧＭ−ＣＳＦによる処理によって末梢血に移行した後にＣＤ３４+前駆体細胞から、又は骨髄から直接生じることができる。末梢血からの接着前駆体はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（Ｉｎａｂａ等、１９９２）、或いは骨髄からの非接着ＣＤ３４+細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αで処理することができる（Ｃａｕｘ等、１９９２）。ＤＣは、精製末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、接着細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で２時間処理するＳａｌｌｕｓｔｏ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（１９９４）の方法と同様に、ヒト志願者の末梢血から慣例的に調製することもできる。必要に応じて、これらは電磁ビーズを用いてＣＤ１９+Ｂ細胞、及びＣＤ３+、ＣＤ２+Ｔ細胞を除去することができる（Ｃｏｆｆｉｎ等、１９９８を参照のこと）。培養条件には、維持するためのＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−４などの他のサイトカイン、或いは樹状細胞又は他の抗原提示細胞の活性が含まれ得る。
Ｔ細胞
本発明のｅｘ ｖｉｖｏ法にＴ細胞が用いられる場合、Ｔ細胞は典型的に、癌を罹患している個体の体内の充実性腫瘍から単離された浸潤性Ｔリンパ球である。或いは、ＣＤ８+細胞などの他のＴ細胞を用いることができる。Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞系を用いるのも好都合である。しかしながら、Ｔ細胞が適切な核酸配列を同定及び試験するための予備ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング手順に用いられる場合、健康な患者などの任意の適切な供給源からのＴ細胞を用いることができ、血液又は他の供給源（リンパ節、脾臓、又は骨髄など）から得ることができる。Ｔ細胞は場合によって標準的な手順で濃縮又は精製することができる。Ｔ細胞は、同一又は異なる個体から得られた他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。或いは、Ｔ細胞及び他の細胞型の供給源として、全血、或いは白血球濃縮血又は精製白血球を用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+）の使用が特に好ましい。
腫瘍細胞によって提示される抗原を認識する抗原受容体を有するリンパ球（腫瘍反応リンパ球（ＴＲＬ））は、末梢血、リンパ節、又は腫瘍組織（腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））から単離することができる。ＴＲＬを単離及び培養する方法は、当分野でよく知られている。たとえば、Ｖｏｓｅ等（１９７７）を参照されたい。ＴＩＬ及び他のＴＲＬは、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ等（１９８８）、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ等（１９８９）、及びＳｐｉｅｓｓ等（１９８７）によって記載のとおり、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８などのサイトカインの存在下で単離及び増殖することができる。同定された腫瘍抗原に反応性のＴＲＬ及びＴＩＬは、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ４量体技術を用いて単離することもできる（Ｄｕｎｂａｒ等、１９９８、Ｒｏｍｅｒｏ等、１９９８）。
したがって本明細書では、「抗原提示細胞など」という用語は、ＡＰＣに限定されるものではないことが理解される。当分野の技術者は、Ｔ細胞集団に提示することのできる任意のビヒクルを使用できることを理解するであろうが、便宜上これらのすべてを指すためのＡＰＣという用語を用いる。上述のとおり、適切なＡＰＣの好ましい例には、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞、又は脂質膜などの合成ＡＰＣが含まれる。
アッセイ
本発明の一実施形態において、低分子は、プレセニリン、或いはプレセニリン含有複合体又は成分、或いはプレセニリン含有複合体、特にヒトＰＳ１又はＰＳ２に結合する能力に関してスクリーニングすることができる。他の実施形態において、化合物は、プレセニリン、特にヒトＰＳ１又はＰＳ２の発現を誘導又は抑制する能力に関して試験することができる。他の実施形態において、化合物は、プレセニリン依存性γ−セクレターゼの活性を誘導又は抑制する能力に関して試験することができる。たとえばアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）などのプレセニリン依存性γ−セクレターゼの標的由来のものを含む、合成ペプチド物質を、モジュレーターを検出するためのアッセイに用いることができる。これらの実施形態、及び他の実施形態を以下に記載する。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼモジュレーターの同定
本発明のアッセイは、候補化合物による、免疫系の細胞におけるプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ発現及び／又は活性の阻害又は増強を検出するために提供される。これらの化合物は、低分子、タンパク質、抗体、又は他のリガンドであることができる。プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの量又は活性は、標準的アッセイ技法及び適切なコントロールを用いて、試験される各化合物に関して測定される。好ましくは、検出されたシグナルを参照シグナルと比較し、参照シグナルに対する任意の調節を測定する。このアッセイは、それぞれＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性及び／又は発現を回復することのできる化合物を同定するために、知られているプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼアンタゴニストの存在下で行うこともできる。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現及び／又は活性は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の開裂に応じて、或いはＮＩＣＤシグナリング経路の下流成分の活性又は発現レベルに応じて測定される。そのような成分は、ＮＩＣＤシグナリング経路の「標的」と称される。知られている標的には、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１、Ｅ（ｓｐｌ）、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、Ｄｌｘ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−４、Ｎｕｍｂ、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、及びＤｓｈが含まれる。
アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列などの任意の１つ又は複数の適切な標的を、様々な薬剤スクリーニング技法のいずれかの技法で、免疫系の細胞においてＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性及び／又は発現を調節することのできる化合物を同定するために用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液に遊離しているか、固体支持体に付着しているか、細胞表面に支持されているか、又は細胞内に位置していることができる。
本発明のアッセイは、それによっていくつかの因子が試験されるスクリーニングであることができる。一態様において、本発明のアッセイ法は、ハイスループットスクリーニングである。
薬剤スクリーニングの技法は、Ｇｅｙｓｅｎ、１９８４年９月１３日公開の欧州特許出願８４／０３５６４に記載の方法に基づくことができる。要約すれば、多数の異なる低分子ペプチド試験化合物を、プラスチックピン又はいくつかの他の表面などの固体基板に合成する。ペプチド試験化合物を、適切な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、たとえば当分野でよく知られている適切に適応させた方法などによって、結合した実体を検出する。精製された標的は、薬剤スクリーニング技法に用いるために、プレートに直接被覆することもできる。或いは、ペプチドを捕獲し、それを固体支持体に固定するために、非中和抗体を用いることもできる。
本発明はさらに、標的を特異的に結合することのできる中和抗体が、標的への結合に関して試験化合物と競合する、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用を企図する。
スクリーニングの他の技法は、それらの物質に対する適切な結合親和性を有する因子のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を提供し、ＷＯ−Ａ−８４／０３５６４に詳細に記載されている方法に基づく。
本発明のアッセイ方法は、試験化合物の小規模及び大規模スクリーニング、並びに定量アッセイに適切であることが予期される。
種々の核酸アッセイが知られている。知られている、又は後に開示される任意の通常の技法を用いることができる。適切な核酸アッセイの例を以下に述べるが、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ブロット法、スペクトロメトリ、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ、及び他のハイブリダイゼーション法が含まれる。
遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用いて、たとえば通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって直接試料中で測定することができる。当分野の技術者は、所望であれば、これらの方法をどのように変更できるか容易に想定できるであろう。
ＰＣＲは当初、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技法は、反応溶液を繰り返し加熱及び冷却し、プライマーを標的配列にアニーリングさせ、重複娘鎖の形成のためにそれらのプライマーを伸長する温度サイクルに基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素によって第１のｃＤＮＡ鎖を産生するためにＲＮＡ鋳型を用いる。次いで、このｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコルに従って増幅する。合成サイクルの反復及び変性によって、産生される標的ＤＮＡのコピー数が指数的に増加する。しかしながら、反応成分が限界となるにつれ、プラトーに達し、ＰＣＲ産物の純増加がほとんど又はまったくなくなるまで、増幅の速度は減少する。拡散標的の開始コピー数が大きいほど、この「エンドポイント」に早く到達する。
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグ又は蛍光色素によって標識されたプローブを用い、さらに定数のサイクル後に産物の蓄積を測定するのではなく、蓄積時にＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量アッセイのエンドポイントＰＣＲとは異なる。この反応は、サイクル中の時点で標的配列の増幅が蛍光の著しい増加によって最初に検出されることを特徴とする。
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮアーゼ保護）アッセイは、溶液中の特意的ＲＮＡを定量するための極めて感度の高い技法である。リボヌクレアーゼ保護アッセイは、総細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択ｍＲＮＡを標的として行うことができる。リボヌクレアーゼ保護アッセイの感度は、高比放射能に放射性標識された相補ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写プローブの使用に由来する。このプローブ及び標的ＲＮＡを溶液中でハイブリダイズし、その後、混合物を希釈し、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）で処理して、残存するすべての１本鎖ＲＮＡを分解する。プローブのハイブリダイズされた部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動、それに続くオートラジオグラフィによって視覚化することができる。保護断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるので、リボヌクレアーゼ保護アッセイは、ｍＲＮＡの特徴を正確にマッピングするために用いることができる。プローブが標的ＲＮＡに対してモル過剰にハイブリダイズされる場合、生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。
たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、１４節に記載されているように、ＰＣＲ技術は、核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドを選択するための方法を以下に記載する。
本明細書では、プローブは、たとえば同数又はより多数の隣接塩基と同一（又は相補体）である１０から５０、好ましくは１５から３０、もっとも好ましくは少なくとも約２０の隣接塩基を含むヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。プローブとして選択された核酸配列は、偽陽性の結果が最小限となるように、充分な長さであり、充分に明確であるべきである。このヌクレオチド配列は一般に、保存された、又は高度に相同性のヌクレオチド配列又はポリペプチドの領域に基づいている。プローブとして用いられる核酸は、１つ又は複数の位置で縮重していることができる。
プローブが構築される好ましい領域には、５’及び／又は３’コード配列、リガンド結合部位のエンコードが予測される配列などが含まれる。たとえば、本明細書に開示の全長ｃＤＮＡクローン又はその断片をプローブとして用いることができる。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーション時に容易に検出される適切な標識手段で標識される。たとえば、適切な標識手段は、放射性標識である。ＤＮＡ断片を標識する好ましい方法は、当分野でよく知られているように、ランダムプライミング反応において、α32ＰｄＡＴＰをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と組み合わせることによるものである。オリゴヌクレオチドは一般に、γ32Ｐ標識化ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで末端標識される。しかしながら、断片又はオリゴヌクレオチドを標識するために、他の方法（たとえば非放射性）も用いることができ、たとえば酵素標識、適切な蛍光団による蛍光標識、及びビオチン標識を含む。
好ましくは、高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする配列プローブである。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。そのような条件は、当分野の技術者には明白である。当分野の技術者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映され、配列相同性が１％低下するごとに約１から１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、高いストリンジェンシー条件下で行い、その後、種々のストリンジェンシーの洗浄を行う。
本明細書では、高ストリンジェンシーは、６５〜６８℃、１Ｍ Ｎａ＋で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。高ストリンジェンシー条件は、たとえば６×ＳＳＣ、５×デンハルト、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ＋ピロリン酸、及び非特異的競合体として０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する水溶液でのハイブリダイゼーションによって提供され得る。ハイブリダイゼーションに続いて、数段階の高ストリンジェンシー洗浄を行い、最終洗浄（約３０分）はハイブリダイゼーション温度、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。
そのような条件は、種々の緩衝液、たとえばホルムアミドをベースとする緩衝液、及び温度を用いて、適合及び再現できることが理解される。デンハルト溶液及びＳＳＣは当分野の技術者によく知られており、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液も同様である（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等編、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、又はＡｕｓｕｂｅｌ等編、（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。ハイブリダイズ対の長さ及びＧＣ含量も影響を与えるので、最適なハイブリダイゼーション条件は実験的に求められなければならない。
遺伝子発現は、リポーター系を用いて検出することもできる。そのようなリポーター系は、たとえばモニターされている遺伝子など、発現系の制御下で容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出し、選別することのできる蛍光マーカーが好ましい。特に好ましくは、ＧＦＰ及びルシフェラーゼである。他の種類の好ましいリポーターは、細胞表面マーカーであり、すなわち細胞表面に発現し、容易に同定可能なタンパク質である。
一般に、リポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナリングを検出するために有用なリポーターコンストラクトは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）の一般的な教示に従って構築することができる。典型的に、本発明によるコンストラクトは、対象となる遺伝子によるプロモーター、及びたとえばＧＦＰ又はルシフェラーゼなどの、所望のレポーターコンストラクトをコードしているコード配列を含む。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードしているベクターは、当分野で知られており、市販され入手可能である。好ましい実施形態において、プレセニリン遺伝子、特にヒトＰＳ１又はＰＳ２、又はプレセニリン依存性γセクレターゼ遺伝子の５’調節領域を操作的にリポーター遺伝子に結合し、この組換えコンストラクトで細胞を形質転換する。その後、組換え細胞は、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現に影響を与える化合物のハイスループットアッセイに用いることができる。
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上に例示したように、当分野で知られている任意の技法によって行うことができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリ又はＦＡＣＳによって選別することができる。全般的な参考文献として、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
フローサイトメトリは、細胞を研究及び精製するための強力な方法である。フローサイトメトリは、特に免疫学及び細胞生物学において広範な適用が見出されているが、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多くの分野に適用することができる。頭字語ＦＡＣＳは、蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）を表し、「フローサイトメトリ」と互換的に用いられる。細い流体に保持された個々の細胞が１つ又は複数のレーザービームを通過し、それによって光が散乱し、蛍光色素が様々な周波数で光を放射することがＦＡＣＳの原理である。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気信号に変換し、それがソフトウエアで解釈されて細胞に関するデータを生じる。明確な特徴を有する細胞の亜集団を同定し、非常に高い純度で（〜１００％）懸濁液から自動的に選別することができる。
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の遺伝子発現を測定するために用いることができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接、又はコンストラクトのレポーター遺伝子を用いて間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光性基質を用いて、ＦＡＣＳによって検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、酵素で開裂されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕獲される。したがって、１つの酵素が多量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰコンストラクトを発現する細胞は、基質の添加なしに蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが、同じチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの変異体が利用可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置において、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって２つのトランスフェクションを同時にアッセイできる。
細胞を選別する別の手段も用いることができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブは、後に手動又はＦＡＣＳ選別法を用いて選別できるように、個々にポリペプチドを発現する細胞を同定するために用いることができる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）によって記載されている一般的な手順を用い、上述の教示に従って調製することができる。
好ましい実施形態において、本発明は、ＦＡＣＳ細胞選別法で用いることのできる蛍光団にコンジュゲートした、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用を含む。
いわゆる遺伝子チップアレイ又は高密度ＤＮＡアレイを用いて、遺伝子発現及び同一性に関する情報を得るための方法も記載されている（Ｃｈｅｅ）。これらの高密度アレイは、特に診断及び予後のために有用である。ｉｎ ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）を用いることもできる（Ｃａｍｉｌｌｉ）。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較したときに、たとえば治療又は疾患中にアップレギュレートされた遺伝子を同定する。
タンパク質アッセイを用いる利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接に測定できることである。ポリペプチドのレベルを判定するために用いることのできるアッセイ技法は、当分野の技術者によく知られている。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、ＦＡＣＳ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明は、特異的にポリペプチドを認識及び結合する抗体を含む。
抗体は、免疫された動物の血清から回収することができる。モノクローナル抗体は、免疫された動物由来の細胞から通常の方法で調製することができる。
本発明の抗体は、モニターされている遺伝子を発現する細胞を同定するのに有用である。
本発明による抗体は、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体などの自然種の全抗体であることができるが、好ましくはＩｇＧ抗体である。さらに本発明は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳｃＦｖなどの抗体断片を含む。Ｆｖ及びＳｃＦｖなどの小さい断片は、その小さいサイズ、及び結果として生じる優れた組織分布のために、診断及び治療適用例に有利な特性を有する。
抗体は、標識を含むことができる。特に好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ神経系細胞において抗体の画像化を可能にする標識である。そのような標識は、組織内で容易に視覚化できる金属粒子などの放射性標識又はＸ線不透明標識であることができる。さらに、そのような標識は、組織内で視覚化でき、細胞選別に用いることのできる、蛍光標識又は他の標識であることができる。
臨床適用例に用いる寛容化Ｔ細胞のモニター又は検出を含むアッセイの場合、このアッセイは一般に、細胞内ドメインの開裂から生じるシグナルを検出する段階に先立って、患者から試料を摘出することを含む。
本発明はさらに、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性及び／又は発現の候補モジュレーターをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、適切な量のプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを適切な量のＮｏｔｃｈと共に緩衝液に混合する段階であって、Ｎｏｔｃｈの開裂をモニターするための検出手段によってＮｏｔｃｈが適切に標識されている段階、及び候補リガンドの試料、及びＮｏｔｃｈの任意の開裂をモニターする段階を含む。
本明細書では、「試料」という用語は、天然（たとえば生物又は他の標本）又は人工的に構築された集団、たとえば実験室で見出されるかつ／又は混合され得る因子などに見出される無機、有機、又は生化学的分子の採取物を指す。生物試料は、有機体全体を指すこともできるが、より一般的には、その組織、細胞、又は構成部分（たとえばこれに限定されるものではないが、血液、粘液、唾液、及び尿を含む体液）のサブセットを指す。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのモジュレーターを同定するさらなる方法を以下に記載する。プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのモジュレーターは、たとえば酵素、共受容体、リガンド、又は安定剤であり得る。これらの化合物とプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの相互作用は、調節機能の指標となる。したがって、そのような相互作用を検出及び／又は分析するためのアッセイは、本発明の範囲に含まれる。
可溶性組換えプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ融合タンパク質は、適切なベクター（たとえば酵母２−ハイブリッド、バキュロウイルス、及びファージディスプレイ系）において製造することができ、或いはプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼアミノ酸（特に機能ドメインアミノ酸）をコードしているヌクレオチド配列を発現することができ、ＰＳ１又はＰＳ２と相互作用するタンパク質を同定するために用いることができる。これらの相互作用を調節し、それによって免疫系の疾患、及びＰＳ１又はＰＳ２遺伝子或いはそれらの遺伝子産物の後天性又は遺伝性異常に関連する他の状態を調節するように、療法を設計することができる。これらの療法の潜在的有効性は、ＰＳ１遺伝子、ＰＳ２遺伝子、或いは他のプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ相同体の機能ドメインに相当する合成ペプチド又は組換えタンパク質を用い、親和性の標準的な薬物動態測定（Ｋｄ及びＶｍａｘなど）によって、その治療薬剤への暴露後にそれらの相互作用の親和性及び機能を分析することによって試験できる。
プレセニリンタンパク質の親水性ループなど、機能ドメインを含む任意の相互作用の影響をアッセイする他の方法は、その治療薬剤の存在下及び不在下、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、及び代謝パルスチェイス標識実験によって、関連遺伝子の細胞内輸送及び翻訳後修飾の変化をモニターすることである。他の方法は、（ｉ）ＡＰＰ及びその産物の細胞内代謝、輸送、及び標的化の変化、（ｉｉ）セカンドメッセンジャー事象、たとえばｃＡＭＰ細胞内Ｃａ++プロテインキナーゼ活性などの変化を含む「下流」事象の作用をモニターすることである。
４つのドメインが、プレセニリンに機能特異性を提供することが認められている。これらの機能ドメインは、（１）Ｎ末端（ＰＳ１及びＰＳ２のユニーク配列）、（２）ＴＭ６→７ループ（フランキング保存疎水性配列及びユニーク内部配列の集合変異）、（３）ＴＭ１、ＴＭ２ドメイン、及びＴＭ１→２結合配列（いくつかの家族性ＡＤ変異の集積）、及び（４）Ｃ末端である。これらの機能ドメインと相互作用するタンパク質を単離するために、これらの領域に対応するＧＳＴ融合コンストラクト及び合成ペプチドを用いて、プレセニリン結合タンパク質のスクリーニングを行う。たとえば、ＰＳ２の場合、ＧＳＴ融合ペプチドはアミノ酸１から８７（Ｎ末端）又は２７２〜３９０（ＴＭ６→７ループ）に対応する配列を含んで作られ、或いは合成ペプチドはアミノ酸１０７から１３４（ＴＭ１→２結合）に対応して作られ、ＰＳ１の場合、ＧＳＴ融合ペプチドはアミノ酸１から８１（Ｎ末端）又は２６６〜４１０（ＴＭ６→７ループ）に対応する配列を含んで作られ、或いは合成ペプチドはアミノ酸１０１から１３１（ＴＭ１→２結合）に対応して作られる。プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質を単離するために、以下の方法を用いることができる。
（１）ＧＳＴ融合タンパク質及び合成ペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィによる直接抽出
（２）免疫沈降によるプレセニリン及び結合タンパク質の共分離
（３）ＧＳＴ融合獲得系を利用する生体分子相互作用アッセイ（ＢＩＡＣｏｒｅ）
（４）ツーハイブリッド酵母系
ＰＳ１及びＰＳ２のＮ末端及びＴＭ６→７ループ配列を含有するＧＳＴ融合タンパク質を用いてヒトの患者組織をプローブし、タンパク質の単離採取物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ミクロ配列決定する（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ及びＦｉｅｌｄｓ、１９９５）。配列決定される帯が確実に１つのタンパク質種のみを含有するように、プレセニリン融合又はプレセニリン依存性γセクレターゼ融合及び結合タンパク質を、転移及び配列決定に先立って２Ｄゲル電気泳動によって分離する。ブロックＮ末端を有するタンパク質の場合、追加のＨＰＬＣ精製及び特定の結合タンパク質の開裂（ＣＮＢｒ及び／又はトリプシン）を用いて、ペプチド断片を放出する。さらなるＨＰＬＣによる精製、及び通常の方法によるミクロ配列決定によって、そのようなブロックタンパク質の内部配列データを提供する。
ＴＭ１→２結合配列は、Ｎ末端及びＴＭ６→７ループとは膜の反対側に存在することが予測されており、膜貫通伝達において重要である可能性がある。このことは、早期発症家族性ＡＤ（３０〜４０歳）を有する家系に観察されているＴｙｒ１１５Ｈｉｓ変異、及びこのループを不安定化することが予測されるＴＭ１／２へリックスにおけるさらなる変異によって支持される。ＴＭ１→２ループは比較的短く（ＰＳ１：残基１０１〜１３１、ＰＳ２：残基１０７〜１３４）、そのためこの配列は通常のペプチド合成を受け入れやすい。追加のＣ末端システイン残基を含有するＰＳ１断片（３１ｍｅｒ）が合成されている。ミクロ配列決定の結合タンパク質を単離するアフィニティクロマトグラフィ（Ｓｕｌｆｏ−ｌｉｎｋ、Ｐｉｅｒｃｅ）のアフィニティ基質を作るために、このペプチドが用いられる。ＰＳ２配列に対応するペプチドは、同様に合成され、異なる結合タンパク質をスクリーニングするために用いられる。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、及びそれらの関連タンパク質を単離するためのさらなる技法は、抗体による直接免疫沈降である。この手順は、たとえば多くのシナプス小胞関連タンパク質を単離するために首尾よく用いられている。
結合タンパク質の検出及び単離に有用な方法は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒによって開発され、製造者プロトコルに記載されているＢＩＡｃｏｒｅシステムである（ＬＫＢ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。このシステムは、アフィニティ精製抗ＧＳＴ抗体を用いて、ＧＳＴ融合タンパク質をセンサーチップに固定する。このセンサーは、屈折率の変化を検出する光学現象である表面プラスモン共鳴を用いる。対象となる組織のホモジネートを固定融合タンパク質に通し、タンパク質−タンパク質相互作用を屈折率の変化として登録する。このシステムは、観察された任意の結合が生理的関連性の結合であるかどうかを評価するために、結合の動態を求めるのに用いることができる。
ツーハイブリッド系は、２つの物理的に分離可能な機能ドメインからなる転写因子を利用する（Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ）。もっとも一般的に用いられるのは、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインからなる酵母ＧＡＬ４転写アクチベーターである。２つの異なるクローニングベクターを用いて、潜在的結合タンパク質をコードしている遺伝子とＧＡＬ４ドメインの分離融合タンパク質を産生する。この融合タンパク質は共発現され、核を標的とし、相互作用が起こる場合には、レポーター遺伝子（たとえばｌａｃＺ）の活性化が検出可能な表現型を生じる。たとえば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ−２は、プレセニリンＧＡＬ４結合ドメイン融合クローンを伴うＣｌｏｎｔｈｅｃｈ ｃＤＮＡ ＧＡＬ４活性化ドメイン融合ライブラリをスクリーニングするために用いることができる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）。
低分子に基づく療法は、そのような分子は大きなタンパク質に基づく薬剤に比べて経口投与後に容易に吸収され、かつ／又は潜在的抗原決定基が少ないので特に好ましい。本発明の開示に照らして、当分野の技術者は、免疫疾患を治療するための低分子候補薬剤の同定に有用である薬剤スクリーニング方法を開発することができるであろう。特に、技術者は、正常及び／又は変異ＰＳ１又はＰＳ２と結合し、正常又は変異プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を調節する候補物質を同定するために、低分子の大きなライブラリをスクリーニングできるであろう。さらに、技術者は、選択的又は優先的にプレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼの変異形態に結合する低分子を同定することができるであろう。
候補タンパク質結合分子に関して低分子ライブラリをスクリーニングする方法は当分野でよく知られており、本発明の開示に照らして、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの正常又は変異形態に結合する化合物を同定するために用いることができる。
簡潔には、一実施形態において、正常又は変異ＰＳ１又はＰＳ２タンパク質をカラム又はフィルタなどの基質に固定し、結合を許容する条件下、試験化合物を含む溶液をプレセニリンタンパク質と接触させる。次いで実質的に生理的条件を反映する溶液でこの基質を洗浄して、非結合又は結合の弱い低分子を除去する。その後、２回目の洗浄で、固定化正常又は変異プレセニリンに強く結合した化合物を溶出することができる。或いは、低分子試験化合物を固定し、正常又は変異ＰＳ１又はＰＳ２の溶液を、カラム、フィルタ、又は他の基質と接触させることもできる。プレセニリンの低分子に結合する能力は、上述のとおり求めることができ、或いはプレセニリンの標識形態（たとえば放射性標識又は化学発光法）を用いて、基質−固定化化合物への結合をより容易に評価することができる。
さらに、ＰＳ１及びＰＳ２は共に膜関連タンパク質であると考えられており、適切な折り畳みを促進するために、プレセニリンタンパク質を脂質２重層（たとえばリポソーム）に組み入れることが好ましい可能性がある。そのようなプレセニリン−リポソームは、基質に固定する（直接、又はリポソーム膜の他の成分によって）、固定化低分子を含む基質を通す、或いは膜タンパク質のよく知られている他の様々な結合アッセイのいずれかで用いることができる。他の一連の実施形態において、正常又は変異、遊離又は膜結合ＰＳ１又はＰＳ２を、結合を許容する条件下、候補化合物を含む溶液に混合し、プレセニリンを免疫沈降させることができる。その後、プレセニリンと共免疫沈降する低分子を同定することができる。当分野の技術者に明らかなように、正常又は変異プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼに結合する化合物を同定するために、個々の低分子、又は低分子の大きなライブラリ（たとえばファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングする他の数多くの方法がある。これらの方法はすべて、正常又は変異プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを試験化合物と混合する段階、結合（存在する場合）させる段階、及び結合複合体をアッセイする段階を含む。
プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの正常又は変異、或いは両方の形態に結合する化合物は、治療に有用である可能性がある。正常プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼにのみ結合する化合物は、たとえばその正常な活性のエンハンサーとして作用し、それによって、免疫疾患を罹患している患者のプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの変異形態の欠失した又は異常な活性を少なくとも部分的に補う可能性がある。プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの正常及び変異形態の両方に結合する化合物は、それらが正常な機能からの全体的な逸脱を軽減するように、２種の形態の活性に差別的に影響を及ぼす場合、有用である可能性がある。
或いは、ヘテロ接合体においてＰＳ１又はＰＳ２の正常及び変異形態両方の活性を遮断することは、疾患の通常の進行に比べて重篤でない生理的及び臨床的結果を有する可能性があり、したがってプレセニリンの正常及び変異形態の両方に結合し、活性を阻害する化合物は有用である可能性がある。しかしながら、好ましくは、正常プレセニリンより変異プレセニリンに対して高い結合親和性を有し（たとえばＫaが５〜１０倍高い）、変異形態の活性を選択的又は優先的に阻害する化合物が同定される。そのような化合物は、上述のいずれかの技法を用い、次いでＰＳ１又はＰＳ２の正常及び変異形態に関して候補化合物の結合親和性を比較することによって同定することができる。
上述の方法によって同定した後、候補化合物は薬剤投与又は試験に充分な量で生成することができ、或いは新しい薬剤の設計及び開発において「リード化合物」として役割を果たすこともできる。たとえば、当分野でよく知られているように、低分子の連続修飾（たとえば、アミノ酸残基のペプチドによる置換、官能基のペプチド又は非ペプチド化合物による置換）は、製薬業界において新しい薬剤を開発するための標準的なアプローチである。そのような開発は一般的に、所望の薬剤の少なくとも一部の活性（たとえばＰＳ１結合活性）を有することが示されている「リード化合物」から開始する。特に、対象の少なくとも一部の活性（たとえばＰＳ１結合）を有する１つ又は複数の化合物が同定されるとき、分子の構造比較は、リード化合物の保存されるべき部分、及び新しい候補化合物の設計において変化してよい部分を示唆することによって、技術者に大いに情報を提供することができる。したがって、本発明はさらに、連続して修飾して、免疫疾患の治療に用いる新しい候補化合物を生成することのできるリード化合物を同定する手段を提供する。これらの新しい化合物は、次いでプレセニリン結合又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合に関して（たとえば上述の結合アッセイにおいて）、及び治療有効性に関して（たとえば本明細書に記載の動物モデルにおいて）試験することができる。これらの手順は、所望の治療活性及び／又は有効性を有する化合物が同定されるまで繰り返すことができる。
他の一連の実施形態において、本発明は、ＰＳ１、ＰＳ２、或いは他のプレセニリン関連又はプレセニリン依存性γセクレターゼ関連遺伝子又はタンパク質の発現を誘導又は阻害することのできる低分子又は他の化合物を同定するためのアッセイを提供する。このアッセイは、非形質転換細胞、不朽化細胞系、又は組換え細胞系を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。さらに、このアッセイは、ｍＲＮＡ発現の増大又は減少（たとえば本明細書に開示され使用可能な核酸プローブを用いて）、ＰＳ１、ＰＳ２、或いは他のプレセニリン関連又はプレセニリン依存性γセクレターゼ関連タンパク質産物レベルの増大又は減少（たとえば本明細書に開示され使用可能な抗プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ抗体を用いて）、又は組換えコンストラクトにおいてプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ５’調節領域に操作的に結合したレポーター遺伝子（たとえばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）の発現レベルの増大又は減少に基づいて、ＰＳ１、ＰＳ２、或いは他のプレセニリン関連又はプレセニリン依存性γセクレターゼ関連遺伝子又はタンパク質の増大又は減少した発現の存在を検出することができる。
したがって、たとえば、特定のプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼを発現することが知られている細胞を培養し、その培地に１種又は複数の試験化合物を添加することができる。充分な時間（たとえば６〜７２時間）化合物にプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼの発現を誘導又は阻害させた後、確立したベースラインからの発現レベルの変化を、上述の当分野で知られているいずれかの技法を用いて検出することができる。特に好ましい実施形態において、細胞は、ヒトグリア芽腫細胞系又はハイブリドーマ−グリオーマ細胞系などの不朽化細胞系由来である。本明細書で開示され使用可能な核酸プローブ及び／又は抗体の使用、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ発現の変化の検出、及びプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ発現の誘導因子又は抑制因子としての化合物の同定は、慣例的な実験のみを必要とする。
特に好ましい実施形態において、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ遺伝子の５’調節領域に操作的に結合する組換えアッセイが用いられる。そのような調節領域は、本発明に開示のそれらの遺伝子のコード領域に照らして、当分野の技術者によって容易に単離及びクローン化することができる。レポーター遺伝子及び調節領域は、レポーター遺伝子の転写及び翻訳がプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ調節エレメントの制御下で進行できるように、インフレームで（又は３つの可能なリーディングフレームのそれぞれで）結合される。次いで、この組換えコンストラクトを、任意の適切な細胞型に導入することができるが、哺乳動物細胞が好ましく、ヒト細胞がもっとも好ましい。この形質転換細胞を培養で増殖し、レポーター遺伝子発現のベースラインレベルを確立した後、培地に試験化合物を添加することができる。レポーター遺伝子発現の検出の容易さによって、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ遺伝子の誘導因子及び抑制因子を同定するための迅速なハイスループットアッセイが提供される。
この方法によって同定される化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＳ１、ＰＳ２、或いは他のプレセニリン関連又はプレセニリン依存性γセクレターゼ関連遺伝子の発現の調節に潜在的な有用性を有する。これらの化合物は、もっとも効力のあるｉｎ ｖｉｖｏ効果を有する化合物を同定するために、本明細書に開示され使用可能な動物モデルでさらに試験することができる。さらに、プレセニリン結合又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合活性を有する低分子に関して上に記載したとおり、これらの分子は、たとえば連続修飾、分子モデリング、及び合理的な薬剤設計に用いられる他の慣例的な方法にこれらの化合物を供することによって、さらなる薬剤の開発の「リード化合物」として役割を果たすことができる。
候補化合物
本発明の化合物は、有機化合物、又は他の化学物質であることができる。好ましい一実施形態において、この化合物は、アミノ酸配列、又はその化学的誘導体、或いはそれらの組み合わせである。他の好ましい実施形態において、この化合物は、ヌクレオチド配列であり、これはセンス配列又はアンチセンス配列であることができる。この化合物は、抗体であることもできる。
或いは、この化合物は、２つ以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物である。本明細書では、「ヒドロカルビル基」という用語は、少なくともＣ及びＨを含み、任意選択で１つ又は複数の他の適切な置換基を含む基を意味する。そのような置換基の例には、ハロ、アルキル、ニトロ、アルキル基、環式基などが含まれる。置換基が環式基である可能性に加えて、置換基の組み合わせが環式基を形成することもできる。ヒドロカルビル基が２つ以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、それらの炭素の少なくとも２つは、適切な元素又は基を介して結合していることができる。したがって、ヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含有することができる。適切なヘテロ原子は、当分野の技術者に明らかであり、たとえば硫黄、窒素、及び酸素が含まれる。この化合物は、少なくとも１つの環式基を含むことができる。環式基は、非縮合多環式基などの多環式基であることができる。いくつかの適用例の場合、薬剤は、他のヒドロカルビル基に結合した少なくとも１つの前記環式基を含む。
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
アミノ酸配列
本明細書では、「アミノ酸配列」という用語は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、用語「ペプチド」と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」という用語は、用語「タンパク質」と同義である。
一般に「ペプチド」は、１０から４０のアミノ酸、好ましくは１０から３５のアミノ酸の短いアミノ酸配列を指す。
アミノ酸配列は、適切な供給源から調製及び単離することができ、或いは合成によって製造することができ、或いは組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。
ヌクレオチド配列
本明細書では、「ヌクレオチド配列」という用語は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成、或いは組換え由来のＤＮＡ又はＲＮＡである。これらは標準的な技法によってクローン化することもできる。ヌクレオチド配列は、センス又はアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせであっても、２本鎖又は１本鎖であることができる。
長いヌクレオチド配列は一般に、組換え手段、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて産生される。これには、クローン化を所望する標的化配列の領域に隣接するプライマー（たとえば約１５から３０ヌクレオチド）対を作る段階、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させる段階、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階、増幅断片を単離する段階（たとえばアガロースゲルで反応混合物を精製することによる）、及び増幅ＤＮＡを回収する段階を含む。このプライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化できるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。一般にプライマーは合成手段によって産生され、１度に１ヌクレオチドずつ段階的に所望の核酸配列を製造することを含む。自動化技法を用いてこれを達成する技法は、当分野で容易に利用可能である。
「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、或いはいずれかのヌクレオチド型の修飾形態である、少なくとも１０塩基から１０００塩基までの長さ、或いはそれ以上のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡの１本鎖及び２本鎖形態を含む。
これらは、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて構築することができる。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡであることができ、好ましくはＤＮＡである。核酸がＲＮＡである場合、操作はｃＤＮＡ中間体を経て行うことができる。一般に、第１領域をコードしている核酸配列が調製され、５’及び／又は３’末端に適切な制限部位が提供される。好都合には、この配列は、標準的な実験ベクター、たとえばｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１９に基づくプラスミドベクター（下記を参照のこと）などにおいて操作する。適切な技法の正確な詳細に関してはＳａｍｂｒｏｏｋ等によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）、又は同様の標準的な参考文献を挙げることができる。
核酸の供給源は、既刊の文献、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクを参照することにより確認することができる。所望の第１又は第２配列をコードしている核酸は、そのような供給源がその材料を提供することをいとわない場合には学究的又は営利的供給源から得ることができ、或いは配列データのみが得られる場合には適切な配列の合成又はクローニングによって得ることができる。一般的に、これは当該遺伝子のクローニングを記載している文献を参照することにより行うことができる。
或いは、限られた配列データが入手可能である場合、或いは知られている核酸に相同の又は関連した核酸を発現することが所望である場合、代表的な核酸は、当分野で知られている核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列とみなすことができる。
いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡである。いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列は組換えＤＮＡ技法（たとえば組換えＤＮＡ）を用いて調製される。いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。いくつかの適用例において、好ましくは、ヌクレオチド配列は天然型と同じであることができる。
ヌクレオチド配列は、たとえば、タンパク質エンコードドメイン、アンチセンス配列、又は機能モチーフ、たとえばタンパク質結合ドメインなどを含むことができ、それらの変異体、誘導体、アナログ、及び断片が含まれる。この用語は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドも指す。
変異体、誘導体、アナログ、相同体、及び断片
本明細書に記載の特定のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列に加えて、本発明はさらにそれらの変異体、誘導体、アナログ、相同体、及び断片を包含する。
本発明において、任意の所与の配列の変異体とは、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドが少なくとも１つの内因性機能を維持するような様式で、残基（アミノ酸又は核酸残基）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、天然タンパク質に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、修飾、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、及び／又は変更によって改変され得る。
本明細書では、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して「誘導体」という用語は、結果として生じるタンパク質又はポリペプチドが少なくとも１つの内因性機能を維持するという条件で、その配列から又はその配列への、１つ（又は複数）のアミノ酸残基の置換、変更、修飾、置換、削除、及び／又は付加を含む。
本明細書では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して「アナログ」という用語は、任意の擬似体、すなわちそれが擬態するポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１つの内因性機能を有する化学化合物を含む。
典型的に、アミノ酸置換は、修飾された配列が所要の活性又は能力を維持するという条件で、たとえば１、２、又は３から１０又は２０の置換からなることができる。アミノ酸置換には、非天然アナログの使用を含むことができる。
本発明に有用なタンパク質は、サイレント変化を生じ、機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を有することができる。意図的なアミノ酸置換は、輸送又は調節機能が維持されるかぎり、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、負の電荷を持つアミノ酸には、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が含まれ、正の電荷を持つアミノ酸には、リシン、又はアルギニンが含まれ、類似の親水性値を持つ非電荷極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
参照を簡略化するために、主要な天然アミノ酸の１文字及び３文字の符号（並びに関連コドン）を以下に示す。
Figure 2005515971
 保存的置換は、たとえば以下の表に従って行うことができる。第２列の同じブロック、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。
Figure 2005515971
 本明細書では、「タンパク質」という用語は、１本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有又は非共有手段で結合している複数ポリペプチド複合体を含む。本明細書では、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であって、ペプチド又はジスルフィド結合によって結合しているポリマーを指す。サブユニット及びドメインという用語は、生物機能を有するポリペプチド及びペプチドを指すこともできる。
「断片」も変異体であり、この用語は典型的に、機能的に又はたとえばアッセイにおいて対象となるポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸又は核酸配列を指す。
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。挿入が行われる場合、挿入部位のいずれかの側の天然配列に対応する５’及び３’フランキング領域と共に挿入物をコードしている合成ＤＮＡ（が挿入される）。配列が適切な酵素で切断され、合成ＤＮＡが切断部にライゲートできるように、フランキング領域は天然配列の部位に対応する都合のよい制限部位を含有する。次いで、本発明に従ってＤＮＡを発現させ、コードされたタンパク質を製造する。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作するための当分野で知られている多数の標準的技法の例示にすぎず、知られている他の技法も用いることができる。
ポリヌクレオチド変異体は、好ましくはコドン最適化配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡ安定性、したがって遺伝子発現を増強する方法として当分野で知られている。遺伝子コードの重複は、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードしている可能性のあることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、及びセリンは、それぞれ６つの異なるコドンによってコードされる。異なる生体は、異なるコドンの使用を優先する。たとえば、ＨＩＶなどのウイルスは、多数の希少コドンを使用する。通常用いられる対応する哺乳動物コドンによって希少コドンが置き換えられるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳動物標的細胞において配列の発現を増大することができる。コドン使用表は哺乳動物細胞に関して当分野でよく知られており、種々の他の生体に関しても同様である。好ましくは、配列の少なくとも一部は、コドン最適化されている。より好ましくは、配列の全体がコドン最適化されている。
本明細書では、「相同性」という用語は「同一性」と同義であり得る。相同性配列は、少なくとも７５、８５、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むものと理解される。特に、相同性は典型的に、活性に必須であることが知られている配列の領域に関して（たとえば５１、５６、及び５７位のアミノ酸）考慮されるべきである。相同性は類似性（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）という点から考慮されることもできるが、本発明においては、配列同一性という点から相同性を表すことが好ましい。
相同性の比較は、目視で行うことができるが、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性％を算出することができる。
相同性のパーセントは、連続した配列について算出することができ、すなわち１つの配列を他の配列とアラインし、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と１度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップのない（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的に、そのようなギャップのないアラインメントは、比較的に短い残基数についてのみ行われる。
これは非常に簡単で一貫性のある方法であるが、他の点では同一である配列対において、１つの挿入又は欠失によって、それに続くアミノ酸残基がアラインメントから押し出され、したがってグローバルアラインメントを行ったとき、潜在的に相同性％の大きな低減が生じることを考慮できない。その結果、たいていの配列比較法は、全体的な相同性スコアに不当にペナルティを課すことなく、挿入及び欠失の可能性を考慮に入れた最適なアラインメントを生じるように設計されている。これは、局所的な相同性を最大にするために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかしながら、より複雑な方法は、同一アミノ酸が同数である場合、可能なかぎり少ないギャップを有する（２つの比較配列間の高い関連性を反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列アラインメントに比べて高いスコアを得られるように、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に比較的高いコストを課し、そのギャップ内の連続した各残基に小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が典型的に用いられる。これはもっとも一般的に用いられるギャップスコアシステムである。高いギャップペナルティは当然ながら、より少ないギャップを有する最適化アラインメントを生じる。たいていのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの変更が可能である。しかしながら、配列比較にそのようなソフトウエアを使用するとき、デフォルト値を用いることが好ましい。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記を参照のこと）を使用するとき、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップが−１２、各伸長は−４である。
したがって、最大相同性％の算出には、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アラインメントをまず作製することが必要である。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）である。配列比較を行うことのできる他のソフトウエアの例には、これに限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ）、及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式が含まれる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは共にオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９、同上、７−５８から７−６０）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムの使用が好ましい。
最終的な相同性％は同一性の点から測定できるが、アラインメントのプロセス自体は典型的に、オールオアナッシングの対比較には基づいていない。その代わりに、一般的に、化学的類似性又は進化距離に基づく各対比較にスコアを割り当てる、調整類似性スコアマトリックスが用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、すなわち一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般にパブリックデフォルト値、又は供給されている場合にはカスタムシンボル比較表を用いる（さらなる詳細はユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージの場合にはパブリックデフォルト値の使用が好ましく、他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスの使用が好ましい。
ソフトウエアによって最適アラインメントを作製した後、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することができる。ソフトウエアは典型的に、配列比較の一部としてこれを行い、数値で結果を示す。
本発明で用いられる配列に相同性であるか、又は配列の変異体であるヌクレオチド配列は、いくつかの方法によって、たとえば様々な供給源から作製されたＤＮＡライブラリをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のウイルス／細菌、又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、及び霊長類細胞）に見出された細胞の相同体を得ることができ、一般にそのような相同体及びその断片は、本明細書の配列リストに示した配列に選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリをプローブし、中から高ストリンジェンシー条件下、参照ヌクレオチド配列のすべて又は一部を含むプローブでそのようなライブラリをプローブすることによって得ることができる。本発明に有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体の獲得にも同様の考えが適用される。
変異体、及び株／種相同体も、本発明に有用な配列内の保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、たとえばいくつかの変異体／相同体のアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で知られているコンピュータソフトウエアを用いて行うことができる。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
或いは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴決定した配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえばそのヌクレオチド配列が発現する特定の宿主細胞のコドン選択を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である可能性がある。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチド又はコード化ポリペプチドの活性を変えるために、望ましい可能性がある。
免疫療法
本発明のアッセイ方法によって同定されたものを含む本発明のモジュレーターは、治療薬として、すなわち治療適用例において用いることができる。
「治療」という用語には、治癒効果、緩和効果、及び予防効果が含まれる。治療は、ヒト又は動物の治療であることができる。
本発明のモジュレーターは、免疫療法において、すなわち免疫系の障害及び／又は状態を治療するために用いることができる。特に、この化合物は、Ｔ細胞媒介性疾患又は障害の治療に用いることができる。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の影響を受ける状態の詳細な記載は、本出願人等のＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９、及びＷＯ／００１３５９９０に見出すことができる。
Ｔ細胞によって媒介されるとみなすことのできる疾患又は感染状態には、これに限定されるものではないが、喘息、アレルギー、Ｔ細胞系の腫瘍誘発異常、並びにマラリア原虫種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュウドモナス、トキソプラスマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキシカラに起因する感染症のいずれか１種又は複数が含まれる。したがって、Ｔ細胞によって媒介される、治療又は予防することのできる特定の状態には、多発性硬化症、関節リウマチ、及び糖尿病が含まれる。本発明はさらに、臓器移植又は骨髄移植に用いることができる。本発明はさらに、自己免疫障害などの免疫障害、又は同種移植拒絶などの移植拒絶の治療にも有用である。
自己免疫障害の例は、器官特異疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アディソン病、重症筋無力症など）から関節リウマチ又はエリテマトーデスなどの全身性疾患に及ぶ。他の障害には、アレルギー反応などの免疫過敏症が含まれる。
より詳細には、器官特異自己免疫疾患には、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、いくつかの形態の貧血（再生不良性貧血、溶血性貧血）、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）が含まれる。
全身性自己免疫疾患には、関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及びアレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発性筋痛、本態性（混合型）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、多発性筋炎及び他の特発性炎症性筋障害、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、種々の形態の炎症性皮膚炎が含まれる。
より広範な障害の一覧には、望ましくない免疫応答及び炎症、たとえば関節リウマチを含む関節炎、過敏症に伴う炎症、アレルギー性反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病及び他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症に伴う炎症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化性潰瘍に伴う炎症、潰瘍性大腸炎及び他の胃腸管疾患、肝線維症、肝硬変又は他の肝疾患、甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎又は他の耳鼻咽頭疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周病又は他の歯性疾患、精巣炎又は精巣精巣上体炎、不妊症、精巣外傷又は他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症及び他の免疫及び／又は炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎又は類嚢胞黄斑水腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性眼底疾患の免疫及び炎症性成分、眼外傷の炎症性成分、感染による眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経障害、たとえば緑内障濾過手術後の過剰瘢痕、眼球移植に対する免疫及び／又は炎症反応及び他の免疫及び炎症関連眼疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の任意の器官の免疫及び／又は炎症抑制が有益である自己免疫疾患又は状態又は障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療の合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合型ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病及び他のＣＮＳの変性疾患、状態、又は障害、卒中の炎症性成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫及び炎症性成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギランバレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫症又はＣＮＳ外傷又はＣＮＳ感染の炎症性成分、筋萎縮又は筋ジストロフィーの炎症性成分、並びに中枢神経系及び末梢神経系の免疫及び炎症関連疾患、状態、又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、外科手術又は器官の炎症性合併症又は副作用、たとえばウイルスキャリアによる感染、又はＡＩＤＳに伴う炎症に起因する、体液及び／又は細胞性免疫応答を抑制又は阻害するため、単球又はリンパ球の量を低減することによって、たとえば白血病などの単球又は白血球増殖性疾患を治療又は改善するため、天然又は人工細胞、組織、及び器官、たとえば角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織などの移植の場合には移植片拒絶の予防及び／又は治療のための、遺伝子療法の炎症及び／又は免疫合併症及び副作用が含まれる。
本発明はさらに、癌の治療、特に上皮細胞から癌への転換を含む疾患に有用である。本発明は、腺癌、たとえば小細胞肺癌、並びに腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、及び乳房の癌に関して特に有用である。
したがって本発明は、腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法を提供する。
より詳細には、本発明の方法によって調製されたＴ細胞、ＡＰＣ、及び／又は腫瘍細胞は、悪性腫瘍に罹患している患者に投与することができ、その悪性腫瘍は典型的に、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する癌細胞を含む。Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する、特に過剰発現する癌細胞の存在は、たとえば患者から得た癌組織の試料を上述の方法を用いて試験することによって判定することができる。
一般的に、患者は、処置されたＴ細胞、ＡＰＣ、及び／又は腫瘍細胞を得た患者と同一の患者である。治療することのできる悪性腫瘍の例には、乳房、子宮頸部、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、膀胱、ＣＮＳ、食道、頭又は頸部、肝臓、精巣、胸腺、又は甲状腺の癌が含まれる。血球、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、リンパ球前駆体、又は骨髄性細胞前駆体の悪性腫瘍も治療することができる。
腫瘍は、充実性腫瘍又は非充実性腫瘍であることができ、原発腫瘍又は播種性転移性（２次性）腫瘍であることができる。非充実性腫瘍には、メラノーマ、白血病（急性又は慢性、リンパ性又は骨髄性）、たとえば急性骨髄芽球性、急性前骨髄球性、急性骨髄単球性、急性単球性、赤白血病など、並びにリンパ腫、たとえばホジキン、非ホジキン、及びバーキットリンパ腫などが含まれる。充実性腫瘍には、癌腫、結腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、メラノーマ、基底細胞又は扁平上皮癌、中皮腫、腺癌、神経芽種、神経膠種、星状細胞腫、髄芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨原性肉腫、肝癌、及び精上皮腫が含まれる。
腫瘍は、腫瘍特異抗原（たとえばウイルス性コード抗原、ＭＵＣ１などの新抗原、抗体イディオタイプ）、腫瘍細胞の表面に過剰発現される抗原、癌／精巣（ＣＴ）抗原を含む腫瘍胎児抗原、又は分化抗原（チロシナーゼ及びメラノサイト抗原など）を含む細胞内又は膜結合抗原を提示するものであることができる。患者は、Ｔｈ１又はＴｈ２型免疫応答などの腫瘍の抗原に対する進行性免疫応答を有することができ、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって判定される検出可能な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、ＮＫ細胞活性、及び／又は腫瘍に対する抗体応答を有することができる。
或いは、本発明のＡＰＣ及び／又はリンパ球は、Ｔｈ１又はＴｈ２細胞活性などの不適切なリンパ球活性を特徴とする疾患を治療するために患者に転移されるとき、選択された１つ又は複数の抗原に有効に感染寛容を伝えるために用いることができる。したがって、ＡＰＣ及び／又はリンパ球は、進行性免疫応答（アレルギー状態又は自己免疫疾患など）を治療するために用いることができ、或いは本発明のリンパ球細胞で免疫的に寛容を生じるために用いることができる。これらは、動物及びヒトで不適切なリンパ球活性を特徴とする疾患を治療及び予防するための治療的方法において用いることができる。ＡＰＣ及び／又はリンパ球は、単一の抗原、又は複数の抗原に寛容を付与するために用いることができる。典型的に、ＡＰＣ及び／又はリンパ球は、患者又はドナーから得られ、患者に戻す前に上述のとおりプライムされる（ｅｘ ｖｉｖｏ療法）。
本発明は、アレルゲン又は抗原に対する寛容を有するリンパ球又はＡＰＣを産生するために用いることもできる。
抗原及びアレルゲン
抗原は、免疫系によって一般に異種と認識され得る任意の物質であり、一般に抗原受容体によって認識される。好ましくは、本発明に用いられる抗原は、免疫原である。以前に遭遇した抗原に宿主が再暴露されたとき、アレルギー反応が起こる。
抗原に対する免疫応答は、一般に細胞媒介性（Ｔ細胞媒介性致死）又は体液性（全抗原の認識を介する抗体産生）である。免疫応答に関与するＴＨ細胞によるサイトカイン産生のパターンは、これらの応答型のいずれが優勢であるかを左右することができ、細胞媒介性免疫（ＴＨ１）は、高いＩＬ−２及びＩＦＮγ産生、低いＩＬ−４産生を特徴とし、体液性免疫（ＴＨ２）では、そのパターンはＩＬ−２及びＩＦＮγが低く、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０が高い。この分泌パターンは２次リンパ器官又は細胞のレベルで調節されるので、特定のＴＨサイトカインパターンを薬理学的に操作することによって、生じる免疫応答の型と程度に影響を与えることができる。
ＴＨ１−ＴＨ２バランスとは、ヘルパーＴ細胞の２種の異なる形態の相対的発現量を指す。これらの２種の形態は、免疫系に大規模な対立する影響を及ぼす。免疫応答がＴＨ１細胞に有利に働く場合、これらの細胞は細胞応答を促進し、ＴＨ２細胞は抗体優勢応答を促進する。いくつかのアレルギー反応の原因となる抗体の型は、ＴＨ２細胞によって誘導される。
本発明に用いられる抗原又はアレルゲンは、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、タンパク質、糖タンパク質、或いはタンパク質複合体、細胞膜調剤、全細胞（生存又は非生存細胞）、細菌細胞、又はウイルス／ウイルス性成分などの複数の抗原エピトープを含有するより複雑な材料であることができる。特に、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症に関連）、コラーゲン（関節リウマチに関連）、及びインスリン（糖尿病）などの自己免疫疾患に関連することが知られている抗原、又はＭＨＣ抗原などの非自己組織の拒絶に関連する抗原を用いることが好ましい。本発明のプライムされたＡＰＣ及び／又はＴ細胞が組織移植手技に用いられる場合、抗原は組織ドナーから得る。
抗原又はアレルゲン部分は、たとえば合成ＭＨＣ−ペプチド複合体、すなわち抗原の要素を持つ抗原溝を有するＭＨＣ分子の断片であることができる。そのような複合体は、Ａｌｔｍａｎ等、１９９６に記載されている。
用いることのできる腫瘍関連抗原には、たとえばヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖（ｈＣＧβ）抗原、癌胎児抗原、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原、ＧｌｏｂｏＨ抗原、ＧＭ２抗原、ＧＰ１００抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、ＫＳＡ抗原、Ｌｅ（ｙ）抗原、ＭＵＣＩ抗原、ＭＡＧＥファミリー抗原（ＭＡＧＥ１抗原、ＭＡＧＥ２抗原、ＭＡＧＥ４Ａ抗原など）、ＭＵＣ２抗原、ＭＵＣ３抗原、ＭＵＣ４抗原、ＭＵＣ５ＡＣ抗原、ＭＵＣ５Ｂ抗原、ＭＵＣ７抗原、ＰＳＡ抗原、ＰＳＣＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、ＴＲＰ１抗原、ＴＲＰ２抗原、腫瘍特異免疫グロブリン可変領域及びチロシナーゼ抗原、Ｗｉｌｍｓ腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＫＨ−１抗原、ｐ５３、ＲＡＳ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、たとえばＨＳＰ７０及びＨＳＰ１１０などが含まれる。
類似又は同等の活性を有するそのような抗原及び抗原決定基の活性断片も用いることができる。抗原は、たとえば離散タンパク質／ポリペプチドとして、或いは全体又は分裂細胞又は膜と会合して、或いは対象に抗原及び抗原決定基が発現するように、そのような抗原及び抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを投与することによって投与できる。
代わりに、又はさらに加えて、自己又は異種腫瘍細胞或いは誘導体を用いることができる。たとえば、腫瘍細胞、及び腫瘍／ＡＰＣハイブリッド細胞などの全細胞抗原調剤を用いることができる。
プライムＡＰＣ及びリンパ球の調製
リンパ球不在下ｅｘ ｖｉｖｏでのプライムＡＰＣの調製
上述のように、ＡＰＣは、任意選択でウシ胎児血清の存在下、ＤＭＥＭ又は他の規定培地などの適切な培地で培養する。サイトカインは、存在する場合、典型的に１０００Ｕ／ｍｌまで添加する。最適濃度は、滴定によって求めることができる。次いで、典型的にプレセニリンを調節することのできる１種又は複数の物質、及び任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることのできる１種又は複数の物質を、対象の抗原と共に培地に添加する。この抗原は、物質の前、後、又は実質的に同時に添加することができる。細胞は、典型的に物質及び抗原と共に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、適切には少なくとも２４時間から７２時間、３７℃でインキュベートする。必要であれば、上述のように、調節された標的遺伝子発現に関して細胞の少量のアリコートを試験することができる。或いは、細胞の活性は、ＷＯ９８／２０１４２に記載されているように、Ｔ細胞増殖の阻害によって測定することもできる。たとえばＳｅｒｒａｔｅの発現を方向づける核酸コンストラクトでトランスフェクトしたＡＰＣを、コントロールとして用いることができる。
上に論じたように、ＡＰＣにおいてポリペプチドの発現を可能にする条件下、ポリペプチドをコードしている核酸コンストラクト／ウイルスベクターを細胞に導入することによって、ポリペプチド物質をＡＰＣに投与することができる。同様に、抗原をコードしている核酸コンストラクトは、トランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によって、ＡＰＣに導入することができる。
増大したＮｏｔｃｈシグナリングレベルを示す、結果として生じたＡＰＣは使用可能な状態である。
ｅｘ ｖｉｖｏでの調節Ｔ細胞（Ｂ細胞）の調製
以下に記載する技法はＴ細胞に関して述べるが、Ｂ細胞にも同様に適用できる。用いられる技法は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されることを除いて、ＡＰＣのみに関して記載した技法と本質的に同じである。しかしながら、まずプライムＡＰＣを調製し、次いでそれらをＴ細胞と共にインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、プライムＡＰＣを調製した後、それらを沈殿させ、ＰＢＳで洗浄した後、新鮮培地に再懸濁することができる。これは、たとえばＡＰＣと共に用いたものとは異なるプレセニリンを調節することのできる物質でＴ細胞を処理することを望む場合、ＡＰＣに用いた異なる物質とＴ細胞を接触させないという利点を有する。或いは、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、及び任意選択でＮｏｔｃｈシグナリングを調節するために、Ｔ細胞を第１の物質（又は一連の物質）と共にインキュベートし、洗浄し、再懸濁し、次いでＡＰＣを調節するために用いた物質及びＴ細胞を調節するために用いた物質の不在下、プライムＡＰＣと共にインキュベートすることができる。或いはＴ細胞を培養し、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）を含む又は含まない抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）などのＡＰＣ代替物を用いて、ＡＰＣの不在下プライムすることができ、或いはＴ細胞はＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば４量体）を用いて活性化することができる。
インキュベーションは、典型的に、適切な培地において３７℃で、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間又は６時間、適切には約４８時間から７２時間である。プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ調節の進行は、上述の方法を用いて、細胞の少量のアリコートに関して判定することができる。たとえばＤｅｌｔａの発現を方向づける核酸コンストラクトでトランスフェクトしたＴ細胞を、コントロールとして用いることができる。免疫寛容の導入は、Ｔ細胞を続けて抗原で感作し、ＡＰＣに暴露していないコントロール細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって判定することができる。
プライムＴ細胞又はＢ細胞は、同様の培養技法及びインキュベーション時間を用いて、ＡＰＣの不在下、他のＴ細胞又はＢ細胞に免疫寛容を誘導するために用いることもできる。
薬剤組成物
本発明は、治療上有効量の本発明の方法によって同定された化合物、及び薬剤として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（それらの組み合わせを含む）を投与することを含む、薬剤組成物を提供する。
この薬剤組成物は、ヒト及び獣医学においてヒト及び動物に使用するものであることができ、典型的に薬剤として許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のいずれか１種又は複数を含む。治療上の使用に許容される担体又は希釈剤は、薬学分野でよく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬剤担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図される投与経路、及び標準的な薬剤の実施を考慮して選ぶことができる。この薬剤組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤として、或いはそれに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
防腐剤、安定剤、染料、及び香味剤も、薬剤組成物に提供することができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁化剤も用いることができる。
種々の送達系に応じて、異なる組成物／製剤要件が存在する可能性がある。例として、本発明の薬剤組成物は、ミニポンプを用いて、或いはたとえば吸入用の鼻腔スプレー又はエアロゾル、又は摂取可能溶液として粘膜経路で、或いは組成物がたとえば静脈内、筋内、又は皮下経路によって送達される注入可能型で製剤化される非経口経路で送達されるように製剤化することができる。或いは、この製剤は、両方の経路で送達されるように設計することができる。
化合物が、胃腸粘膜を通して粘膜から送達される場合、化合物は胃腸管を通過する間、安定性を持続できるべきであり、たとえばタンパク質分解に耐性であり、酸性ｐＨに安定であり、胆汁の洗浄作用に耐性であるべきである。
適切な場合には、この薬剤組成物は、吸入、座剤又は膣座剤の形態で、或いはローション、溶液、クリーム、軟膏、又は粉剤の形態、皮膚用パッチ剤の使用により局所的に、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤の形態、或いは単独又は賦形剤と組み合わせてカプセル剤又は小卵剤、或いは香味剤又は着色剤を含有するエリキシル剤、液剤、又は懸濁剤の形態で経口によって投与することができ、或いはこの薬剤組成物は、たとえば静脈内、筋内、又は皮下に非経口で注入することもできる。非経口投与の場合、この組成物は、他の物質、たとえば血液と等張の溶液を作るのに充分な塩又は単糖を含有することができる無菌水溶液の形態で用いるのが最善である可能性がある。頬又は舌下投与の場合、この組成物は、通常の方法で製剤化できる錠剤又はロゼンジの形態で投与することができる。
ワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物及び調剤は、口／頬／腸管／膣／直腸又は鼻腔経路などの粘膜経路によって前記ワクチンを投与することにより、疾患に罹患しやすい、又は罹患している哺乳動物を防御又は治療するために用いることができる。そのような投与は、液滴、スプレー、又は乾燥粉末形態であることができる。適切である場合には、ネブライザー化又はエアロゾル化ワクチン製剤も用いることができる。
腸溶性製剤、たとえば経口投与用の胃耐性カプセル及び顆粒、直腸又は膣投与用の座剤も用いることができる。本発明はさらに、たとえば皮内、経真皮、又は経皮膚送達によって皮膚に適用される抗原の免疫原性を増強するために用いることもできる。さらに、本発明のアジュバントは、たとえば筋内又は皮下投与によって非経口で送達することができる。
投与経路に応じて、種々の送達装置を用いることができる。たとえば、鼻腔内投与の場合、市販のＡｃｃｕｓｐｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などのスプレー装置を用いることができる。
鼻腔内に用いる好ましいスプレー装置は、装置の動作が使用者によって加えられる圧力に依存しない装置である。これらの装置は、圧閾値装置として知られている。液体は、閾値圧に達したときにのみノズルから放出される。これらの装置によって、一定の液滴径を有する噴霧を容易に得ることができる。本発明での使用に適した圧閾値装置は当分野で知られており、たとえばＷＯ９１／１３２８１及びＥＰ３１１８６３Ｂに記載されている。そのような装置は、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍｂＨから市販されている。
ある種のワクチン製剤の場合、製剤に他のワクチン成分を含むことができる。たとえば、本発明のアジュバント製剤はさらに、胆汁酸、又はコール酸の誘導体を含むことができる。適切には、コール酸の誘導体は、その塩、たとえばナトリウム塩である。胆汁酸の例には、コール酸自体、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、並びに上記胆汁酸のグリコ、タウロ、アミドプロピル−１−、プロパンスルホン酸、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、又はＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドなどの誘導体が含まれる。
適切には、本発明のアジュバント製剤は、非小胞形態の水溶液又は懸濁液の形態であることができる。そのような製剤は、製造及び滅菌（たとえば、４５０又は２２０ｎｍ孔膜の最終濾過による）に好都合である。
適切には、前記宿主への投与経路は、皮膚、筋内、又は鼻粘膜などの粘膜表面である。混合物が鼻粘膜を経て投与されるとき、その混合物は、たとえばスプレーとして投与することができる。免疫応答を増強する方法は、ワクチンのプライミング又はブースト投与のいずれかであってよい。
本明細書では、「アジュバント」という用語は、脊椎動物対象の免疫系の抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を増強する能力を有する因子を含む。
「免疫応答」という用語は、対象の免疫系による抗原又は抗原決定基に対する任意の応答を含む。免疫応答には、たとえば体液性免疫応答（たとえば抗原特異抗体の産生）、及び細胞媒介性免疫応答（たとえばリンパ球増殖、サイトカイン分泌、及び細胞傷害活性）が含まれる。
「細胞媒介性免疫応答」という用語には、リンパ球によってもたらされる免疫防御、たとえばＴ細胞リンパ球がそれらの犠牲細胞に接近したとき、Ｔ細胞リンパ球によってもたらされる防御などが含まれる。
「リンパ球増殖」を測定するとき、特異的な抗原に応答して増殖するリンパ球の能力を測定することができる。リンパ球増殖には、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、又はＣＴＬ細胞増殖が含まれる。
本発明の組成物は、多種多様な供給源に由来する抗原を含有するワクチンを製剤するために用いることができる。たとえば、抗原は、ヒト、細菌、又はウイルスの核酸、病原体由来抗原又は抗原製剤、ＧｎＲＨ及びＩｇＥペプチドを含む宿主由来抗原、組換えによって産生されたタンパク質又はペプチド、及びキメラ融合タンパク質を含むことができる。
好ましくは、本発明のワクチン製剤は、ヒト病原体に対する免疫応答を誘出することのできる抗原又は抗原組成物を含有する。この１つ又は複数の抗原は、たとえばペプチド／タンパク質、多糖、及び脂質であってよく、以下のようにウイルス、細菌、及び寄生虫／真菌などの病原体に由来することができる。
ウイルス抗原
ウイルス抗原又は抗原決定基は、たとえば以下に由来することができる。
サイトメガロウイルス（特にヒト、たとえばｇＢ又はその誘導体など）、エプスタイン−バーウイルス（ｇｐ３５０など）、フラビウイルス（たとえば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、肝炎ウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス（たとえば、ＥＰ−Ａ−４１４３７４、ＥＰ−Ａ−０３０４５７８、及びＥＰ−Ａ−１９８４７４に記載されているＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２ Ｓ抗原などのＢ型肝炎表面抗原）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びＥ型肝炎ウイルスなど、ＨＩＶ−１（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０、又はｇｐ１６０など）、ヒトヘルペスウイルス、たとえばｇＤ又はその誘導体、或いはＨＳＶ１又はＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７などの最初期タンパク質など、ヒト乳頭腫ウイルス（たとえばＨＰＶ６、１１、１６、１８）、インフルエンザウイルス（全生存又は不活化ウイルス、卵又はＭＤＣＫ細胞又はＶｅｒｏ細胞又は全フルウイロソームで増殖したスプリットインフルエンザウイルス（Ｇｌｕｃｋ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２、１０、９１５〜９２０に記載のとおり）、或いはその精製又は組換えタンパク質、たとえばＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、又はＭタンパク質など）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（Ｆ及びＧタンパク質など）、ロタウイルス（弱毒性ウイルスを含む）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ｇｐＩ、ＩＩ、及びＩＥ６３など）、性器イボの原因と考えられているヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６又はＨＰＶ１１など）、及び子宮頸部癌の原因であるＨＰＶウイルス（たとえばタンパク質Ｄキャリアと融合してＨＰＶ１６からタンパク質Ｄ−Ｅ６又はＥ７融合体を形成する初期タンパク質Ｅ６又はＥ７、その組み合わせ、或いはＥ６又はＥ７のＬ２との組み合わせ（たとえばＷＯ９６／２６２７７を参照のこと））。
細菌抗原
細菌抗原又は抗原決定基は、たとえば以下に由来することができる。
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（たとえばボツリヌス毒素）を含むＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ；Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（たとえばパータクチン、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉを含むＢｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（たとえば毒素、付着因子、及びインベーシン（ｉｎｖａｓｉｎ））及びＣ．ｃｏｌｉを含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ；Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（たとえばＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ（たとえばＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉを含むＣｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ；Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（破傷風毒素など）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（たとえばボツリヌス毒素）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（たとえばクロストリジウム毒素Ａ又はＢ）を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ；Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（たとえばジフテリア毒素）を含むＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ；Ｅ．ｅｑｕｉ及びヒトＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ Ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓの因子を含むＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ；Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉを含むＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍを含むＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ；エンテロトキシンＥ．ｃｏｌｉ（たとえば集落形成因子、非耐熱性毒素又はその誘導体、熱安定性毒素）、腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（たとえば志賀毒素様毒素）を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ；Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（たとえばＰＲＰ）、非定型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、たとえばＯＭＰ２６、高分子量付着因子、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄ及びリポタンパク質Ｄ、フィンブリン及びフィンブリン誘導ペプチド（たとえばＵＳ５８４３４６４を参照のこと）を含むＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（たとえばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ；Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを含むＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ；Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含むＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ；Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとも呼ばれるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（高分子量及び低分子量付着因子及びインベーシン）を含むＭｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ；Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ Ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（その外膜小胞及びＯＭＰ１０６（たとえばＷＯ０９７／４１７３１を参照のこと）を含む）；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（たとえばＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、Ｂ、又はＣ）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．Ｉｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ；Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（たとえば莢膜多糖及びそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、付着因子）を含むＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｇｉｔｉｄｉｓＢ（その外膜小胞及びＮｓｐＡ（たとえばＷＯ９６／２９４１２を参照のこと）を含む）；Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ；Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉを含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ（たとえば莢膜多糖及びそのコンジュゲート、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質）、及びタンパク質抗原Ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１９８９、６７、１００７、Ｒｕｂｉｎｓ等、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２５、３３７〜３４２）、及びその変異無毒化誘導体（たとえばＷＯ９０／０６９５１、ＷＯ９９／０３８８４を参照のこと）を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ；Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ（たとえば外膜タンパク質）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含むＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ；Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ（たとえばコレラ毒素）を含むＶｉｂｒｉｏ ｓｐｐ；並びにＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（たとえばＹｏｐタンパク質）、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含むＹｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ。
寄生虫／真菌抗原
寄生虫／真菌抗原又は抗原決定基は、たとえば以下に由来することができる。
Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉを含むＢａｂｅｓｉａ ｓｐｐ；Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを含むＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ；Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含むＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ；Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａを含むＥｎｔａｍｏｅｂａ ｓｐｐ；Ｇ．ｌａｍｂｉａを含むＧｉａｒｄｉａ ｓｐｐ；Ｌ．ｍａｊｏｒを含むＬｅｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｃｉｐａｒｕｍ（ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐのそれらのアナログ）；Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを含むＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ；Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉを含むＳｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ；Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓを含むＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ；Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ（たとえばＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ；Ｔ．ｃｒｕｚｉを含むＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ。
本発明のこの態様に従って、抗原及び抗原決定基は多くの異なる形態で用いてよいことが理解される。たとえば、抗原及び抗原決定基は、単離タンパク質又はペプチド（たとえば、いわゆる「サブユニットワクチン」）、或いはたとえば細胞関連又はウイルス関連抗原又は抗原決定基（たとえば生又は死病原体株）として存在することができる。生病原体は、好ましくは、知られている方法で弱毒化される。或いは、抗原又は抗原決定基は、抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを用いて、対象のｉｎ ｓｉｔｕで産生することができる（いわゆる「ＤＮＡワクチン接種」であるが、上で論じたように、このアプローチに用いることのできるポリヌクレオチドは、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡ及び修飾ポリヌクレオチドを含んでよいことが理解される）。
ワクチン投与量中のタンパク質の量は、典型的な受容者において、著しい有害な副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が用いられるか、どのように提示されるかによって決まることになる。典型的に、各投与量は、１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、もっとも好ましくは１〜５０μｇのタンパク質を含むことが予期される。最初のワクチン接種後、対象は、適切な間隔で、１回又は数回のブースター免疫付与を受けることができる。
本発明のワクチンは、経口によって投与することもできる。そのような場合、薬剤として許容される賦形剤には、アルカリ緩衝液、或いは腸溶性カプセル又は微顆粒も含まれる。本発明のワクチンは、膣経路によって投与することもできる。そのような場合、薬剤として許容される賦形剤には、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬなどのポリマー、膣クリーム及び座剤の他の知られている安定剤が含まれる。本発明のワクチンは、直腸経路によって投与することもできる。そのような場合、賦形剤には、直腸座剤の形成用に当分野で知られているワックス及びポリマーが含まれる。
本発明の製剤は、予防及び治療目的の両方に用いることができる。したがって、本発明は、感染性疾患又はアレルギー、或いは自己免疫疾患に罹患しやすい又は罹患している哺乳動物を治療する方法を提供する。本発明の他の態様において、医療での使用が本明細書で記載されたとおり、アジュバント組み合わせ及びワクチンが提供される。ワクチンの調製は、一般的に、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖｏｌｌｅｒ等編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されている。
本発明のアジュバントはさらに、他のアジュバントと組み合わせることができ、たとえばコレラ毒素及びそのＢサブユニット、Ｅ．Ｃｏｌｉ熱不安定エンテロトキシンＬＴ、そのＢサブユニットＬＴＢ、及びｍＬＴなどのその無毒化型、免疫的に活性なサポニン分画、たとえば南米の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するＱｕｉｌ Ａ及びその誘導体（たとえばＱＳ２１、ＵＳ５０５７５４０に記載）、オリゴヌクレオチドアジュバント系ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５に記載）、特に５’ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ３（配列番号１）、及びモノホスホリル脂質Ａ及びその非毒性誘導体３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ、ＧＢ２２２０２１１に記載）が含まれる。
本発明は、免疫応答の大きさの増大及び／又は持続期間の増大を提供する。好ましくは、本発明は、増強された防御免疫応答を提供する。
本発明はさらに、選択的Ｔｈ１又はＴｈ２免疫性を生じることを企図する。一般に、Ｔ細胞は、異なるエフェクター機能を示す異なる亜集団で作用し得る。Ｔ細胞応答は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を特徴とする炎症性Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）であり得る。Ｔｈ１細胞は、細胞防御のヘルパー細胞であるが、抗体分泌にはほとんど役に立たない。他の種類のＴ細胞応答は、一般に抗炎症性であり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０を産生するが、ＩＬ−２又はＩＦＮ−γはほとんど又はまったく産生しないＴｈ２細胞によって媒介される。Ｔｈ２細胞は、抗体産生のヘルパー細胞である。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞は共にこれらの亜集団で生じる。Ｔｈ１／Ｔｈ２：ＣＤ４、Ｔｃ１／Ｔｃ２：ＣＤ８。
それぞれの型の病原体／感染に対して、対象において感染因子に対抗するが、過剰な組織損傷をもたらさない、「適切な」（かつ異なる）型のＴ細胞応答（たとえばＴｈ１対Ｔｈ２、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋）が存在する可能性がある。「不適切な」型のＴ細胞応答が誘導された場合（Ｔｈ２ではなくＴｈ１、又はその逆）、対象に有害となり得る。一般的に、Ｔｈ１応答はウイルス又は細胞内細菌などの細胞内病原体を浄化し、Ｔｈ２応答は細胞外病原体を浄化することが所望される。
本発明は、予防及び治療ワクチンの両方に用いられることが理解される。たとえば、予防ワクチンは、防御免疫性を提供して、感染の確立に対する防御をもたらすために用いることができる。治療ワクチンは、たとえば感染が確立した後に、感染に対する免疫応答を増大するために用いることができる。適切には、治療ワクチンは慢性感染に対抗するために用いることができ、たとえば細菌感染（結核など）、寄生虫感染、又はウイルス感染（ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、又はＨＩＶ感染など）であることができる。
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター／阻害剤は、抗原に対する細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞応答を増大する。
投与
典型的に、医師は、個々の対象にもっとも適している実際の投与量を決定し、その投与量は、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なる。以下の用量は、平均的な場合の例である。当然ながら、より高い、又はより低い用量範囲が有利である個々の事例が存在し得る。
本発明の組成物は、直接注入によって投与することができる。組成物は、非経口、粘膜、筋内、静脈内、皮下、眼内、又は経皮投与用に製剤化できる。
「投与」という用語は、ウイルス又は非ウイルス技法による送達を含む。ウイルス送達機構には、これに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが含まれる。非ウイルス送達機構には、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン面状両親媒性物質（ＣＦＡ）、及びその組み合わせが含まれる。そのような送達機構の経路には、これに限定されるものではないが、粘膜、鼻腔、経口、非経口、胃腸管、局所、又は舌下経路が含まれる。
「投与」という用語には、これに限定されるものではないが、たとえば吸入用の鼻腔スプレー又はエアロゾルとして、又は摂取可能溶液として粘膜経路による送達、或いは送達がたとえば静脈内、筋内、真皮内、関節内、髄腔内、腹腔内、又は皮下経路、或いは消化管（たとえばパイアー斑）を経て行われる非経口経路による送達が含まれる。投与は、移植片、たとえばＷＯ９９／４４５８３に記載の皮下移植片の使用によることもできる（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ）。
本発明の細胞及び細胞含有薬剤は、典型的に、筋内、腹腔内、又は静脈内注入によって、或いは患者のリンパ節に直接注入することによって、好ましくはリンパ節への直接注入によって、患者に投与される。典型的に、１０4から１０8の処理細胞、好ましくは１０5から１０7の細胞、より好ましくは約１０6の細胞が患者に投与される。
熟練した医師は、たとえば患者の年齢、体重、及び状態に応じて、任意の特定の患者に最適な投与経路及び投与量を容易に決定することができるので、記載した投与経路及び投与量は指針にすぎない。好ましくは、薬剤組成物は、単位投与形態である。本発明は、ヒト及び獣医学両方の適用例を含む。
「同時に」とは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが実質的に同時に、好ましくは同一の製剤において共に投与されることを意味する。
「同時期に」とは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが接近した時間に投与されることを意味し、たとえば病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターが投与される前又は後、約１分から約１日以内に投与される。任意の同時期の時間が有用である。しかしながら、多くの場合、同時に投与されないとき、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドは、約１分から約８時間以内に、好ましくは約１時間から約４時間未満内に投与される。同時期に投与される場合、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドは、好ましくは動物の同じ部位に投与される。「同じ部位」という用語は、正確な位置を含むが、約０．５から約１５ｃｍ以内、好ましくは約０．５から約５ｃｍ以内であり得る。
本明細書では、「個別に」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが、ある間隔で、たとえば約１日から数週間又は数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性剤は、いずれの順序で投与してもよい。
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドより頻繁に投与することができ、又はその逆も同様である。
本明細書では、「順次」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び病原体抗原、抗原決定基、或いはその病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドが、順に、たとえば数分、数時間、数日、又は数週の間隔で投与されることを意味する。適切な場合、活性剤は規則的な繰り返し周期で投与される。
本明細書に言及したすべての刊行物は、参照により本明細書の一部とする。本発明の範囲及び精神から逸脱することのない本発明の記載した方法及び系の様々な修正及び変更は当分野の技術者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載したが、請求の本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定するべきでないことが理解されるべきである。実際に、生化学及び生命工学、又は関連分野の技術者に明らかである本発明を実施するために記載された方法の様々な修正は、添付の請求の範囲の範囲内であることが意図される。
本発明の様々な特徴及び実施形態を、以下の非限定的な実施例に関して記載する。
ＭＷ１６７のＮｏｔｃｈシグナリングへの影響
Ｃ２Ｃ１２細胞を、２４時間、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、プラスミドｐＬＯＲ３（ｍＨＥＳ１−Ｌｕｃレポーターコンストラクト）でトランスフェクトした。
９６ウェル組織培養プレートを、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌを用いて、４℃で一晩被覆した。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈した精製ｍＤｅｌｔａ１−Ｖ５−Ｈｉｓ融合タンパク質（ＢＤ３４）１００μｌを室温において２時間で添加した。プレートをＰＢＳで洗浄し、その後、トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞を添加した。
トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞をトリプシン処理し、４．０×１０5細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌ／ウェルで平板培養した。γ−セクレターゼ阻害剤、ＭＷ１６７（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ γ−セクレターゼ阻害剤ＩＩ、カタログ番号５６５７５５）を１０ｍＭでＤＭＳＯに溶解し、最終濃度１００μＭで２重のウェルに添加した。同じ希釈のＤＭＳＯ単独でコントロールウェルを調製した。プレートをＣＯ2インキュベーターに３７℃で２４時間置いた。
すべてのウェルから上澄みを除去し、ＰＢＳ１００μｌ、続いてＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ検定用試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加した。プレートを室温で５分間静置し、その後、２００μｌを除去し、白色９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ）組織培養プレートに入れ、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）計数器でルミネセンスを読んだ。結果を図４に示す。
ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質
ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに融合したヒトＤｅｌｔａ１（「ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ」）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインをコードしているヌクレオチド配列（たとえばＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ００３５２２を参照のこと）を発現ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）に挿入し、ＣＨＯ細胞にコンストラクトを発現させることによって調製した。得られた発現融合タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
（配列１）
Figure 2005515971
配列中、最初の下線を引いた配列はシグナルペプチド（成熟タンパク質から開裂）であり、２番目の下線を引いた配列はＩｇＧ４Ｆｃ配列である。
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるγ−セクレターゼ阻害剤によるサイトカイン産生の調節
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて血液から精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地２１ｍｌに載せ、１８〜２０℃で４０分間、４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、３回洗浄して、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いた。
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造者指示書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈの抗ＣＤ４マイクロビーズを用い、正の選択によって単離した。そのＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びｂ2−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中１０5ＣＤ４／ウェル／２００ｍｌで、９６ウェルプレート（平底）を用い３重でインキュベートした。
サイトカイン産生は、細胞を１：１（ビーズ：細胞）の比率で、Ｄｙｎａｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズで刺激することによって誘導した。ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質で被覆したＤｙｎａｌビーズ、又はコントロールビーズを、５：１（ビーズ：細胞）の比率でいくつかのウェルに添加し、γ−セクレターゼ阻害剤ＭＷ１６７（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ γ−セクレターゼ阻害剤ＩＩ、カタログ番号５６５７５５）を最終濃度０、０．４ｍＭ、２ｍＭ、及び１０ｍＭ（ＤＭＳＯ中）で様々に添加した。
３７℃／５％ＣＯ2／加湿雰囲気で３日間インキュベートした後、上澄みを除去し、サイトカイン産生を、ＩＬ−１０及びＩＬ−５に関してそれぞれ、製造者指示書に従ってＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ Ｓｅｔ ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡ ＳｅｔヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
結果を図５に示すが、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｄｅｌｔａ媒介性のＩＬ−１０発現増加を実質的に逆転し、さらにＤｅｌｔａ媒介性のＩＬ−５発現低減を実質的に逆転することが認められる。
Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ２細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングのＤｅｌｔａ媒介性活性化へのγ−セクレターゼ阻害剤の影響
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ（ｐＬＯＲ９１）の構築
ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ付着末端を有するアデノウイルス主後期プロモーターＴＡＴＡボックスモチーフを以下のように生じた。
（配列２）
Figure 2005515971
これを、ＢｇｉＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、プラスミドｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡを生じた。
ＢａｍＨ１及びＢｇｌＩＩ付着末端を有するＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１は２ＣＢＦ１リピートに相当）を以下のように生じた。
（配列３）
Figure 2005515971
この配列をＢｇｌＩＩ部位に繰り返し挿入することによって５量体化し、得られたＴＰ１の５量体（１０ＣＢＦ１リピートに相当）をＢｇｌＩＩ部位でｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡに挿入して、プラスミドｐＬＯＲ９１を生じた。
Ｂ）Ｎｏｔｃｈ２ベクター（ｐＬＯＲ９２）の生成
ヒトＮｏｔｃｈ２遺伝子の完全コード配列（たとえばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３１５３５６）に及ぶｃＤＮＡクローンを以下のように構築した。細胞内ドメイン全体及び細胞外ドメインの一部分をコードしている３’ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲに基づくスクリーニング方法を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）から単離した。残存する５’コード配列を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）方法を用いて単離し、両方の断片に共通のユニーク制限酵素認識部位を用いて（Ｃｌａ Ｉ）、既存３’断片にライゲートした。次いで、得られた完全長ｃＤＮＡを、終止コドンを用いずに哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＯＲ９２を生じた。哺乳動物細胞に発現するとき、ｐＬＯＲ９２は細胞内ドメインの３’末端にＶ５及びＨｉｓタグを有する完全長ヒトＮｏｔｃｈ２タンパク質を発現する。
Ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞系を用いるレポーターアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、単純な限定希釈法によってクローン化できないので、これらの細胞と共にメチルセルロース含有培地（ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）ＴＣＳ）を用いた。
ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞（リンパ芽球細胞系、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）を、製造者ガイドラインに従ってＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）トランスフェクト細胞選択（ＴＣＳ）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ、及びＭｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用い、クローン化した。
プラスミドｐＬＯＲ９２（上述のとおり調製）を、以下のとおり、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩエレクトロポレーターを用いてＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞にエレクトロポレートした。
活発に分裂している細胞を遠心沈殿し、２．０×１０7細胞／ｍｌで、１０％熱不活性化ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する氷冷ＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ）に再懸濁した。氷上に１０分間置いた後、プラスミドＤＮＡ２０μｇ（滅菌水に溶解したＥｎｄｏ−ｆｒｅｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡ）を含有する、予冷した４ｍｍエレクトロポレーションキュベットに入れた。この細胞を３００ｖ、９５０μＦでエレクトロポレートし、その後、エッペンドルフ管の加温完全ＲＰＭＩ培地０．５ｍｌ中に迅速に除去した。この細胞を、マイクロ遠心機で１分間３０００ｒｐｍで回転し、３７℃で１５分間置き、エレクトロポレーションから回復させた。その後、上澄みを除去して、細胞を完全ＲＰＭＩ４ｍｌの６ウェル皿のウェルに平板培養し、３７℃で４８時間放置して、抗生物質耐性マーカーを発現させた。
４８時間後、細胞を遠心沈殿し、新鮮完全ＲＰＭＩ１０ｍｌに再懸濁した。次いで、これを１０×１５ｍｌのファルコン管に分け、あらかじめ加温したＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＴＣＳ培地８ｍｌを添加し、次いで１０×選択に用いられる抗生物質の最終濃度１ｍｌを添加した。Ｇ４１８選択の場合、Ｇ４１８の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、ＲＰＭＩ中の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、１ｍｌをそれぞれの管に添加した。この管を反転によってよく混合し、室温で１５分間静置した後、１０ｃｍ組織培養皿に平板培養した。その後、それを１４日間ＣＯ２インキュベーターに置き、可視コロニーを検査した。
肉眼検査により可視コロニーをプレートから採取し、これらのコロニーを１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する完全ＲＰＭＩ中で、９６ウェルプレートから、２４ウェルプレート、Ｔ２５フラスコに増殖させた。
得られたクローンを、それぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用い（製造者プロトコルに従って）、ｐＬＯＲ９１で一時的にトランスフェクトし、その後、プレート結合固定化ｈＤｅｌｔａ−ＩｇＧ４Ｆｃ（下記のとおり調製）を含有する９６ウェルプレートに平板培養した。性能のよいクローン（＃２４）を選択し、さらなる研究に用いた。
Ｄ）Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質の９６ウェル組織培養プレートへの直接固定
精製ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質１０μｇを、滅菌エッペンドルフ管の滅菌ＰＢＳに添加し、最終容量１ｍｌを得て、１００μｌを９６ウェル組織培養プレートのウェルに添加した。プレートの蓋をパラフィルムで密封し、プレートを４℃で一晩、又は３７℃で２時間放置した。その後、タンパク質を除去し、プレートをＰＢＳ２００μｌで２度洗浄した。
アッセイは、ウェル当たり１００μｌのＤＭＥＭ、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ中ウェル当たり２×１０5Ｊｕｒｋａｔ細胞で被覆した９６ウェルプレートで行った。ＭＷ１６７を、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液から、完全ＲＰＭＩに最終濃度２０μＭに希釈した。コントロールウェルを、ＤＭＳＯ単独の同じ希釈で調製した。プレートを、ＣＯ2インキュベーターに一晩放置した。
Ｅ）ルシフェラーゼアッセイ
１００μｌの細胞及び培地を残し、すべてのウェルから上澄みを除去し、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加し、細胞を室温で５分間放置した。その混合物を２回ピペットで上下させて確実に細胞融解し、各ウェルの内容物を白色９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。ルミネセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。
プレート固定化ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質と共に上述のＪｕｒｋａｔ細胞を用いる試料アッセイの結果を図６に示す（Ｄｅｌｔａの不在下で培養した細胞と比較したレポーター活性の活性化倍率で表す）。
（参考文献）（本出願に関する参照として本明細書に組み込まれる）
Figure 2005515971
Figure 2005515971
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の概略を示す図である。 Ｎｏｔｃｈタンパク質（Ｎｏｔｃｈ１〜４）の概略を示す図である。 Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの概略を示す図である。 実施例１の結果（ｍＨｅｓ１−ルシフェラーゼでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングに対するγ−セクレターゼ阻害剤の影響）を示す図である。 実施例３の結果（ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるγ−セクレターゼ阻害剤によるサイトカイン産生の調節）を示す図である。 実施例４の結果（Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ２細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングのＤｅｌｔａ媒介性活性化に対するγ−セクレターゼ阻害剤の影響）を示す図である。

Claims (169)

  1. 免疫療法に用いる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  2. 免疫療法に用いる薬剤を製造するための、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと組み合わせたＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  3. モジュレーターが、任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレートすることのできる因子と組み合わせた、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニストである請求項１又は２に記載の使用。
  4. プレセニリンのアゴニストが、ニカストリン又はＡＬＧ−３から選択されたポリペプチド、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項３に記載の使用。
  5. Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の発現をアップレギュレートすることのできる因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド、ノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、ＦＧＦ、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体から選択されたポリペプチド、並びに免疫抑制性サイトカイン、又はそれらの組み合わせ、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項３又は４に記載の使用。
  6. モジュレーターが、任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をダウンレギュレートすることのできる因子と組み合わせた、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアンタゴニストである請求項１又は２に記載の使用。
  7. プレセニリンのアンタゴニストが、２６Ｓプロテアソーム又はＳｅｌ１０、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項６に記載の使用。
  8. Ｎｏｔｃｈシグナリング経路をダウンレギュレートすることのできる因子が、Ｔｏｌｌ様受容体、サイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、又はアクチビンから選択されたポリペプチド、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項６又は７に記載の使用。
  9. 免疫応答を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  10. 選択された抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  11. リンパ球活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  12. Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  13. エフェクターＴ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  14. ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  15. ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  16. ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  17. 細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  18. 細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  19. 細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  20. 調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  21. 調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を阻害する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  22. 調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を増強する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  23. Ｔｒ１調節性Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  24. Ｔｒ１調節性Ｔ細胞活性を阻害する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  25. Ｔｒ１調節性Ｔ細胞活性を増強する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  26. Ｔｈ３調節性Ｔ細胞活性を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  27. Ｔｈ３調節性Ｔ細胞活性を阻害する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  28. Ｔｈ３調節性Ｔ細胞活性を増強する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  29. サイトカイン発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  30. リンホカイン発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  31. モノカイン発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  32. Ｎｏｔｃｈ媒介性サイトカイン発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  33. ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  34. ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を調節する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  35. ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  36. ＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  37. ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターの使用。
  38. ＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターの使用。
  39. サイトカインがＩＬ−１０である請求項３５〜３８のいずれか記載の使用。
  40. サイトカインがＩＬ−４である請求項３５〜３８のいずれか記載の使用。
  41. ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  42. ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  43. ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターの使用。
  44. ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターの使用。
  45. サイトカインがＩＬ−２である請求項４１〜４４のいずれか記載の使用。
  46. サイトカインがＩＬ−５である請求項４１〜４４のいずれか記載の使用。
  47. サイトカインがＴＮＦ−αである請求項４１〜４４のいずれか記載の使用。
  48. サイトカインがＩＦＮ−γである請求項４１〜４４のいずれか記載の使用。
  49. サイトカインがＩＬ−１３である請求項４１〜４４のいずれか記載の使用。
  50. 増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  51. 増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  52. 減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  53. 減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤の使用。
  54. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが、白血球、線維芽細胞、又は上皮細胞においてサイトカイン発現を改変する請求項２９〜５３のいずれか記載の使用。
  55. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが、樹状細胞、リンパ球、又はマクロファージ、或いはそれらの前駆体又は組織特異的誘導体においてサイトカイン発現を改変する請求項２９〜５３のいずれか記載の使用。
  56. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが、リンパ球又はマクロファージにおいてサイトカイン発現を改変する請求項２９〜５３のいずれか記載の使用。
  57. 炎症又は炎症性状態を治療する薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーの使用。
  58. 免疫系を調節する薬剤の製造における、
    ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサー又は阻害剤、及び
    ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドの組み合わせの使用。
  59. 抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドとの同時、同時期、個別、又は順次組み合わせによる、免疫系を調節する薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサー又は阻害剤の使用。
  60. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターをｉｎ ｖｉｖｏで患者に投与する請求項１〜５９のいずれか記載の使用。
  61. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターをｅｘ ｖｉｖｏで細胞に投与する請求項１〜５９のいずれか記載の使用。
  62. 薬剤が、Ｔ細胞媒介性疾患又は感染の治療に用いるためのものである請求項１〜６１のいずれか記載の使用。
  63. Ｔ細胞媒介性疾患又は感染が、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、Ｔ細胞の腫瘍誘発異常、及び感染症のいずれか１種以上である請求項６２に記載の使用。
  64. プレセニリンモジュレーターが、プレセニリン１（ＰＳ１）又はプレセニリン２（ＰＳ２）のモジュレーターである請求項１〜６３のいずれか記載の使用。
  65. プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼモジュレーターが、ポリペプチド及びその断片、直鎖ペプチド、環状ペプチド、及びそれらをコードしている核酸、低分子量有機又は無機化合物を含めた合成及び天然化合物、並びに抗体から選択される請求項１〜６４のいずれか記載の使用。
  66. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む免疫療法の方法。
  67. Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと組み合わせてＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む免疫療法の方法。
  68. モジュレーターが、任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレートすることのできる因子と組み合わせたプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニストである、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. プレセニリンのアゴニストが、ニカストリン又はＡＬＧ−３から選択されたポリペプチド、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項６８に記載の方法。
  70. Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の発現をアップレギュレートすることのできる因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド、ノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、ＦＧＦ、並びにそれらの誘導体、断片、変異体、及び相同体から選択されるポリペプチド、並びに免疫抑制性サイトカイン、又はそれらの組み合わせ、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項６８又は６９に記載の方法。
  71. モジュレーターが、任意選択でＮｏｔｃｈシグナリング経路をダウンレギュレートすることのできる因子と組み合わせた、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアンタゴニストである請求項６６又は６７に記載の方法。
  72. プレセニリンのアンタゴニストが、２６Ｓプロテアソーム又はＳｅｌ１０、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項７１に記載の方法。
  73. Ｎｏｔｃｈシグナリング経路をダウンレギュレートすることのできる因子が、Ｔｏｌｌ様受容体、サイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、又はアクチビンから選択されるポリペプチド、或いはそれらをコードしている核酸配列である請求項７１又は７２に記載の方法。
  74. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む免疫応答を調節する方法。
  75. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、選択された抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を調節する方法。
  76. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、リンパ球活性を調節する方法。
  77. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、Ｔ細胞活性を調節する方法。
  78. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、エフェクターＴ細胞活性を調節する方法。
  79. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を調節する方法。
  80. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を増大する方法。
  81. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、ヘルパー（Ｔｈ）Ｔ細胞活性を低減する方法。
  82. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を調節する方法。
  83. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を増大する方法。
  84. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔ細胞活性を低減する方法。
  85. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を調節する方法。
  86. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を低減する方法。
  87. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、調節性（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞活性を増大する方法。
  88. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、Ｔｒ１調節性Ｔ細胞活性を調節する方法。
  89. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、Ｔｒ１調節性Ｔ細胞活性を阻害する方法。
  90. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、Ｔｒ１調節性Ｔ細胞活性を増大する方法。
  91. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、Ｔｈ３調節性Ｔ細胞活性を調節する方法。
  92. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、Ｔｈ３調節性Ｔ細胞活性を阻害する方法。
  93. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、Ｔｈ３調節性Ｔ細胞活性を増大する方法。
  94. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、サイトカイン発現を調節する方法。
  95. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、リンホカイン発現を調節する方法。
  96. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、モノカイン発現を調節する方法。
  97. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、Ｎｏｔｃｈ媒介性サイトカイン発現を調節する方法。
  98. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現を調節する方法。
  99. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を調節する方法。
  100. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を低減する方法。
  101. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する方法。
  102. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４の発現を増大する方法。
  103. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−１０又はＩＬ−４のＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する方法。
  104. サイトカインがＩＬ−１０である請求項９８〜１０３のいずれか記載の方法。
  105. サイトカインがＩＬ−４である請求項９８〜１０３のいずれか記載の方法。
  106. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現を増大する方法。
  107. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を増大する方法。
  108. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現を低減する方法。
  109. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のアクチベーターを投与することによって、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１３から選択されるサイトカインのＮｏｔｃｈ媒介性発現を低減する方法。
  110. サイトカインがＩＬ−２である請求項１０６〜１０９のいずれか記載の方法。
  111. サイトカインがＩＬ−５である請求項１０６〜１０９のいずれか記載の方法。
  112. サイトカインがＴＮＦ−αである請求項１０６〜１０９のいずれか記載の方法。
  113. サイトカインがＩＦＮ−γである請求項１０６〜１０９のいずれか記載の使用。
  114. サイトカインがＩＬ−１３である請求項１０６〜１０９のいずれか記載の使用。
  115. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法。
  116. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法。
  117. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法。
  118. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、減少したＩＬ−１０発現、及び増大したＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−α発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる方法。
  119. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが、白血球、線維芽細胞、又は上皮細胞においてサイトカイン発現を改変する請求項９４〜１１９のいずれか記載の方法。
  120. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが、樹状細胞、リンパ球、又はマクロファージ、或いはそれらの前駆体又は組織特異的誘導体においてサイトカイン発現を改変する請求項９４〜１１９のいずれか記載の方法。
  121. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターが、リンパ球又はマクロファージにおいてサイトカイン発現を改変する請求項９４〜１１９のいずれか記載の方法。
  122. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のエンハンサーを投与することによって、炎症又は炎症性状態を治療する方法。
  123. ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
    ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドの組み合わせを同時、同時期、個別、又は順次に投与することによって、免疫系を調節する方法。
  124. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターをｉｎ ｖｉｖｏで患者に投与する請求項６６〜１２３のいずれか記載の方法。
  125. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターをｅｘ ｖｉｖｏで細胞に投与する請求項６６〜１２３のいずれか記載の方法。
  126. Ｔ細胞媒介性疾患又は感染を治療するための請求項６６〜１２５のいずれか記載の方法。
  127. Ｔ細胞媒介性疾患又は感染が、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、Ｔ細胞の腫瘍誘発異常、及び感染症のいずれか１種以上である請求項１２６に記載の方法。
  128. プレセニリンモジュレーターが、プレセニリン１（ＰＳ１）又はプレセニリン２（ＰＳ２）のモジュレーターである請求項６６〜１２７のいずれか記載の方法。
  129. プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼモジュレーターが、ポリペプチド及びその断片、直鎖ペプチド、環状ペプチド、及びそれらをコードしている核酸、低分子量有機又は無機化合物を含めた合成及び天然化合物、並びに抗体から選択される請求項６６〜１２８のいずれか記載の方法。
  130. Ｔ細胞媒介性疾患又は感染に影響を与えるために用いるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター。
  131. 連鎖抑制に影響を与えるために用いるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター。
  132. 感染寛容に影響を与えるために用いるＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター。
  133. Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと組み合わせた請求項１３０〜１３２のいずれか記載のＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター。
  134. アレルゲン又は抗原に対する寛容を有するリンパ球又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法であって、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、（ｉ）プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニスト、及び任意選択でリンパ球及び／又はＡＰＣで内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドをアップレギュレートすることのできる因子、及び（ｉｉ）アレルゲン又は抗原と共にインキュベートすることを含む方法。
  135. Ｔ細胞寛容を誘導することのできるＡＰＣを産生する請求項１３４に記載の方法。
  136. アレルゲン又は抗原に対する寛容を有するＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで産生する方法であって、ヒト又は動物の患者から得たＴ細胞を、（ｉ）プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼのアゴニスト、及び任意選択でＡＰＣ及び／又はＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現をアップレギュレートすることのできる因子、及び（ｉｉ）アレルゲン又は抗原の存在下、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共にインキュベートすることを含む請求項１３４又は１３５に記載の方法。
  137. アレルゲン又は抗原に対する寛容を有するリンパ球又はＡＰＣを産生する方法であって、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、請求項１３４〜１３６のいずれか記載の方法によって産生されたリンパ球又はＡＰＣと共にインキュベートすることを含む方法。
  138. アレルゲン又は抗原に対する寛容を有するＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで産生する請求項１３７に記載の方法であって、ヒト又は動物の患者から得たＴ細胞を、請求項１３４〜１３６のいずれか記載の方法によって産生されたＴ細胞と共にインキュベートすることを含む方法。
  139. 哺乳動物でのアレルゲン又は抗原に対する免疫応答の抑制における、請求項１３４〜１３８のいずれか記載の方法によって産生されたリンパ球又はＡＰＣの使用。
  140. 不適切なリンパ球活性を特徴とする疾患に罹患している患者を治療する方法であって、請求項１３４〜１３８のいずれか記載の方法によって産生されたリンパ球を患者に投与することを含む方法。
  141. 腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法であって、
    （ａ）体内に存在する前記腫瘍細胞を有する患者からＴ細胞を単離すること、
    （ｂ）任意選択でＴ細胞において内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、Ｔ細胞をＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
    （ｃ）Ｔ細胞を患者に再導入することを含み、
    Ｔ細胞が腫瘍細胞によって発現した腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体を含む方法。
  142. 腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法であって、
    （ａ）患者の体内に存在する腫瘍から抗原提示細胞（ＡＰＣ）を単離すること、
    （ｂ）任意選択でＴ細胞をＡＰＣに接触させたときにＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、ＡＰＣをＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
    （ｃ）ＡＰＣを患者に再導入することを含む方法。
  143. 腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強する方法であって、
    （ａ）患者の体内に存在する腫瘍から腫瘍細胞を単離すること、
    （ｂ）任意選択でＴ細胞を腫瘍細胞に接触させたときにＴ細胞で内因性Ｎｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現又は相互作用を低減又は防止することのできる因子の存在下、腫瘍細胞をＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターに暴露すること、及び
    （ｃ）腫瘍細胞を患者に再導入することを含む方法。
  144. Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球である請求項１４１〜１４３のいずれか記載の方法。
  145. 腫瘍に対抗して患者にワクチン接種する方法であって、
    （ａ）腫瘍によって発現した腫瘍抗原を患者に投与すること、及び
    （ｂ）任意選択でＴ細胞においてＮｏｔｃｈ若しくはＮｏｔｃｈリガンドの発現、相互作用、又はプロセシングを低減又は防止することのできる因子の存在下、患者に存在するＡＰＣを、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ因子のモジュレーターに暴露することを含む方法。
  146. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターのアッセイ方法であって、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの存在下、プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼをそれぞれ候補化合物と接触させること、並びにその化合物がＮｏｔｃｈシグナリング経路に影響を与えるかどうかを判定することを含む方法。
  147. プレセニリン結合タンパク質、又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質とそれぞれプレセニリンタンパク質、又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの相互作用に影響を与える物質を同定するアッセイ方法であって、
    （ａ）プレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、それぞれプレセニリン結合タンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ、及び候補物質を含有する調剤を提供すること、並びに
    （ｂ）前記候補物質が、前記プレセニリン結合タンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼ結合タンパク質と前記プレセニリンタンパク質又はプレセニリン依存性γセクレターゼとの前記相互作用に影響を与えるかどうかを検出することを含む方法。
  148. プレセニリン結合タンパク質がＮｏｔｃｈ、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路のメンバーである請求項１４７に記載のアッセイ方法。
  149. 免疫細胞を用いてアッセイを行う、請求項１４６から１４８のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  150. 請求項１〜１４５のいずれか記載の使用又は方法における、請求項１４６〜１４９のいずれか記載のアッセイ方法を用いて同定可能なプレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼモジュレーターの使用。
  151. １つ又は複数の容器に、（ａ）Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーター、及び（ｂ）プレセニリン又はプレセニリン依存性γセクレターゼ活性のモジュレーターを含むキット。
  152. ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
    ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを、
    免疫系を調節するための同時、同時期、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品。
  153. ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
    ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを、
    免疫系を調節するための同時、同時期、個別、又は順次使用の併用調剤として含む薬剤組成物。
  154. ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、
    ｉｉ）抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチド、及び
    ｉｉｉ）薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物。
  155. エフェクターＴ細胞活性を増大するための請求項１５２〜１５４のいずれか記載の製品。
  156. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び抗原又は抗原決定基、或いは抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含む薬剤キット。
  157. 免疫刺激剤として用いる薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  158. 病原体に対抗するワクチン接種に用いる薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  159. 腫瘍又は病原体に対抗するワクチン接種に用いる薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  160. 腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を増大する薬剤の製造における、ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターの使用。
  161. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、免疫系を刺激する方法。
  162. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、腫瘍又は病原体に対抗して対象にワクチン接種する方法。
  163. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することによって、腫瘍又は病原体に対する対象の免疫応答を増大する方法。
  164. 腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基に対する対象の免疫応答を増大する方法であって、前記腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基と同時、同時期、個別、又は順次に、或いは前記腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドと同時、同時期、個別、又は順次に、有効量のＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを投与することを含む方法。
  165. ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーターを含むアジュバント組成物。
  166. 請求項１６５に記載のアジュバント組成物、及び腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基、或いは腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを含むワクチン組成物。
  167. ウイルス、真菌、寄生虫、又は細菌性抗原又は抗原決定基、或いはウイルス、真菌、寄生虫、又は細菌性抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドの形態で、病原体抗原又は抗原決定基を含む請求項１６６に記載のワクチン組成物。
  168. ｉ）ＮｏｔｃｈＩＣプロテアーゼ活性のモジュレーター、及び
    ｉｉ）腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基、或いは腫瘍又は病原体抗原又は抗原決定基をコードしているポリヌクレオチドを、
    免疫系を調節するための同時、同時期、個別、又は順次使用の併用調剤として含む製品。
  169. エフェクターＴ細胞活性を増大するための請求項１６８に記載の製品。

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