JP2006507240A - 免疫機能の調節 - Google Patents
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Abstract
i)Notchシグナル伝達経路の調節因子の有効量;およびii)インターフェロンまたはインターフェロンをコードするポリヌクレオチドの有効量を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法が記載される。
Description
本発明は、免疫機能の調節に関する。
国際公開第98/20142号パンフレットは、Notchシグナル伝達経路の操作を、免疫療法にならびにT細胞媒介性疾患の予防および/または治療に用いる方法を記載する。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、腫瘍によって誘導されたT細胞系の異常、および感染症を標的とすることができる。
また、抗原特異的寛容を他のT細胞へ伝達することができる調節T細胞の一種を生じることが可能であることも示されており、伝染性寛容と呼ばれる過程である(国際公開第98/20142号パンフレット)。
Notchシグナル伝達経路の説明およびそれによって影響される条件は、たとえば、下記の我々の公開されたPCT出願に見出すことができる;
PCT/GB97/03058(出願日1997年11月6日、国際公開第98/20142号;出願日1996年11月7日の英国特許第9623236.8号、出願日1997年7月24日の英国特許第9715674.9号、および出願日1997年9月11日の英国特許第9719350.2号の優先権を主張);
PCT/GB99/04233(出願日1999年12月15日、国際公開第00/36089号;出願日1999年12月15日の英国特許第9827604.1号の優先権を主張);
PCT/GB00/04391(出願日2000年11月17日、国際公開第0135990号;出願日1999年11月18日の英国特許第9927328.6号の優先権を主張);
PCT/GB01/03503(出願日2001年8月3日、国際公開第02/12890号;出願日2000年8月4日の英国特許第0019242.7号の優先権を主張);
PCT/GB02/02438(出願日2002年5月24日、国際公開第02/096952号;出願日2001年5月25日の英国特許第0112818.0号の優先権を主張);
PCT/GB02/03381(出願日2002年7月25日、国際公開第03/012111号;出願日2001年7月25日の英国特許第0118155.1号の優先権を主張);
PCT/GB02/03397(出願日2002年7月25日、国際公開第03/012441号;出願日2001年7月25日の英国特許第0118153.6号、出願日2002年4月5日の英国特許第0207930.9号、出願日2002年5月28日の英国特許第0212282.8号および出願日2002年5月28日の英国特許第0212283.6号の優先権を主張);
PCT/GB02/03426(出願日2002年7月25日、国際公開第03/011317号;出願日2001年7月25日の英国特許第0118153.6号、出願日2002年4月5日の英国特許第0207930.9号、出願日2002年5月28日の英国特許第0212282.8号および出願日2002年5月28日の英国特許第0212283.6号の優先権を主張);
PCT/GB02/04390(出願日2002年9月27日、国際公開第03/029293号;出願日2001年9月28日の英国特許第0123379.0号の優先権を主張);
PCT/GB02/05137(出願日2002年11月13日、国際公開第03/041735号;出願日2001年11月14日の英国特許第0127267.3号、出願日2002年7月25日のPCT/GB02/03426号、出願日2002年9月7日の英国特許第0220849.4号、出願日2002年9月10日の英国特許第0220913.8号および出願日2002年9月27日のPCT/GB02/004390号の優先権を主張);
PCT/GB02/05133(出願日2002年11月13日、国際公開第03/042246号;出願日2001年11月14日の英国特許第0127271.5号および出願日2002年9月10日の英国特許第0220913.8号の優先権を主張)。
PCT/GB97/03058(出願日1997年11月6日、国際公開第98/20142号;出願日1996年11月7日の英国特許第9623236.8号、出願日1997年7月24日の英国特許第9715674.9号、および出願日1997年9月11日の英国特許第9719350.2号の優先権を主張);
PCT/GB99/04233(出願日1999年12月15日、国際公開第00/36089号;出願日1999年12月15日の英国特許第9827604.1号の優先権を主張);
PCT/GB00/04391(出願日2000年11月17日、国際公開第0135990号;出願日1999年11月18日の英国特許第9927328.6号の優先権を主張);
PCT/GB01/03503(出願日2001年8月3日、国際公開第02/12890号;出願日2000年8月4日の英国特許第0019242.7号の優先権を主張);
PCT/GB02/02438(出願日2002年5月24日、国際公開第02/096952号;出願日2001年5月25日の英国特許第0112818.0号の優先権を主張);
PCT/GB02/03381(出願日2002年7月25日、国際公開第03/012111号;出願日2001年7月25日の英国特許第0118155.1号の優先権を主張);
PCT/GB02/03397(出願日2002年7月25日、国際公開第03/012441号;出願日2001年7月25日の英国特許第0118153.6号、出願日2002年4月5日の英国特許第0207930.9号、出願日2002年5月28日の英国特許第0212282.8号および出願日2002年5月28日の英国特許第0212283.6号の優先権を主張);
PCT/GB02/03426(出願日2002年7月25日、国際公開第03/011317号;出願日2001年7月25日の英国特許第0118153.6号、出願日2002年4月5日の英国特許第0207930.9号、出願日2002年5月28日の英国特許第0212282.8号および出願日2002年5月28日の英国特許第0212283.6号の優先権を主張);
PCT/GB02/04390(出願日2002年9月27日、国際公開第03/029293号;出願日2001年9月28日の英国特許第0123379.0号の優先権を主張);
PCT/GB02/05137(出願日2002年11月13日、国際公開第03/041735号;出願日2001年11月14日の英国特許第0127267.3号、出願日2002年7月25日のPCT/GB02/03426号、出願日2002年9月7日の英国特許第0220849.4号、出願日2002年9月10日の英国特許第0220913.8号および出願日2002年9月27日のPCT/GB02/004390号の優先権を主張);
PCT/GB02/05133(出願日2002年11月13日、国際公開第03/042246号;出願日2001年11月14日の英国特許第0127271.5号および出願日2002年9月10日の英国特許第0220913.8号の優先権を主張)。
PCT/GB97/03058号(国際公開第98/20142号)、PCT/GB99/04233号(国際公開第00/36089号)、PCT/GB00/04391号(国際公開第0135990号)、PCT/GB01/03503号(国際公開第02/12890号)、PCT/GB02/02438号(国際公開第02/096952号)、PCT/GB02/03381号(国際公開第03/012111号)、PCT/GB02/03397号(国際公開第03/012441号)、PCT/GB02/03426号(国際公開第03/011317号)、PCT/GB02/04390号(国際公開第03/029293号)、PCT/GB02/05137号(国際公開第03/041735号)およびPCT/GB02/05133号(国際公開第03/042246号)のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
ホイネ(Hoyne)G.F.他(1999) Int Arch Allergy Immunol 118:122−124;Hoyne 他 (2000) Immunology 100:281−288;Hoyne G.F.他 (2000) Intl Immunol 12:177−185;Hoyne,G.他(2001) Immunological Reviews 182:215−227もまた参照される;そのそれぞれもまた参照により本開示に含まれる。
米国特許出願公開第20020034500A1号明細書(レビングス(Levings))は、たとえば移植術関係で有用であると言われているTr1細胞の収量を増加させるための方法を記載する。
本発明は、免疫系を調節するためのさらなる方法を提供することを目指す。
本発明の最初の一態様によると、免疫系の調節(抑制または活性化)を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、Notchシグナル伝達経路の調節因子および、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子を含む製品が提供される。
本発明の別の一態様によると、Notchシグナル伝達経路の調節因子の有効量、およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節(抑制または活性化)する方法が提供される。
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節における、同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための、Notchシグナル伝達経路の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との組み合わせが提供される。
本発明の別の一態様によると、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と、同時に、同時期に、別々にまたは順次に組み合わせての免疫系の調節における使用のための、Notchシグナル伝達経路の調節因子が提供される。
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための薬剤の製造における、Notchシグナル伝達経路の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との組み合わせの使用が提供される。
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための薬剤の製造における、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と、同時に、同時期に、別々にまたは順次に組み合わせての、Notchシグナル伝達経路の調節因子の使用が提供される。
本発明の別の一態様によると、Notchシグナル伝達経路の調節因子、およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子を含むキットが提供される。
本発明の別の一態様によると、第1の処置手順でNotchシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する;および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量を投与する段階を(任意の順序で)含む、免疫系を調節するための方法が提供される。
本発明の別の一態様によると、第1の処置手順でNotchシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する;および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階を(任意の順序で)含む、免疫系を調節するための方法が提供される。
本発明の方法、製品、および用途は、生物学的または治療的効果の促進を提供する。ここで用いられる「生物学的または治療的効果の促進」の語は、たとえば、効力の増大、有効性の増大、副作用の減少、活性スペクトルの改善、などを含む。
好ましくはNotchシグナル伝達経路の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子とは相乗的に作用し、相乗作用的に有効な量で用いられる。相乗作用は任意の生物学的にまたは治療上関係する性質、エフェクター活性に現れる可能性があるが、典型的には、たとえば、IL−10といったサイトカインの発現の相乗的な調節に現れる。
好ましくは免疫系の調節は免疫療法を含む。
好ましくは免疫系の調節はT細胞活性の調節を含む。
一実施形態では免疫系の調節はT細胞活性の低下を含む。たとえば、免疫系の調節は、エフェクターT細胞活性の低下、たとえばヘルパー(TH)および/または細胞傷害性(TC)T細胞活性の低下を含みうる。適切には免疫系の調節は、Th1および/またはTh2免疫反応の低下を含みうる。
別の一実施形態では、免疫系の調節はT細胞活性の増大を含みうる。
適切には免疫系の調節は、たとえばTrlまたはTh3調節T細胞といった調節T細胞の生成、または調節T細胞の活性を増大することを含む。
適切には免疫系の調節は、IL−10、IL−5、またはTNF−アルファといったサイトカインの発現の調節(増加または減少)を含む。
適切には免疫系の調節はIL−10発現の増加(好ましくは相乗的な増加)を含む。
適切には免疫系の調節は、IL−5またはTNF−アルファといった選択されたサイトカインの発現の低下を含む。
適切には免疫系の調節は、IL−10発現の増加とIL−5発現の減少を有する免疫調節サイトカインプロファイルを生じさせることを含む。
適切には免疫系の調節は、免疫反応を調節する(増加させるかまたは減少させる)ことを含む。
好ましくは免疫系の調節は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発される免疫系の異常、または感染症の治療を含む。
好ましくはNotchシグナル伝達経路の調節因子はNotch受容体を活性化することができる物質(「Notch受容体作用因子」)である。適切にはたとえばその調節因子は、Notchリガンドまたは、Notchリガンドの生物学的に活性な断片または誘導体でありうる。
Notch受容体を活性化することができる他の物質、たとえばNotch受容体を活性化することができるペプチドミメティック(特に天然に存在するNotchリガンドのミメティック)、抗体および小さい(たとえば合成)有機分子もまた、Notchの活性化因子と考えられる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、ここで用いられる「ミメティック」の語は、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも1つを有する化合物を含む。
適切にはNotchシグナル伝達経路の調節因子は、融合タンパク質を含みうるかまたは融合タンパク質をコードしうる。たとえば、調節因子はNotchリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンEIセグメントを含む融合タンパク質を含みうるかまたはコードしうる。
適切にはNotchシグナル伝達経路の調節因子は、Notchリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンFCセグメント(たとえばIgG1FcまたはIgG4FC)を含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
適切なそのような融合タンパク質は、たとえば国際公開第98/20142号パンフレットの実施例2に記載されている。IgG融合タンパク質は、たとえば、米国特許第5428130号明細書(ジェネンテック社(Genentech))に記載のように、本分野で既知である通り調製することができる。
別の一実施形態ではNotchシグナル伝達経路の調節因子は、抗体、たとえば抗Notch抗体、適切には抗ヒトNotch抗体(たとえばヒトNotch1、Notch2、Notch3、またはNotch4に結合する抗体)を含むことができる。
適切にはNotchシグナル伝達経路の調節因子は、NotchリガンドDSLまたはEGFドメイン、またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含むタンパク質またはポリペプチドを含むかまたはコードする。
好ましくはNotchシグナル伝達経路の調節因子は、1個のNotchリガンドDSLドメインおよび少なくとも1個のEGF反復モチーフ、適切には少なくとも1ないし20、適切には少なくとも3ないし15、たとえば少なくとも5ないし10個のEGF反復モチーフを含むかまたはコードする。適切にはそのDSLおよびEGF配列は哺乳類配列であるかまたは哺乳類配列に対応する。好ましい配列は、哺乳類配列、好ましくはヒト配列を含む。
代替的に、または加えて、Notchシグナル伝達経路の調節因子は、Notch細胞内ドメイン(NotchIC)またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Notch細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。
適切にはNotchシグナル伝達経路の調節因子は、Deltaまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Deltaまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。
代替的に、または加えて、Notchシグナル伝達経路の調節因子は、SERRATE/JAGGEDまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、SERRATE/JAGGEDまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
代替的に、または加えて、Notchシグナル伝達経路の調節因子は、Notchまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Notchまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
代替的に、または加えて、Notchシグナル伝達経路の調節因子は、Notchシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはNotchシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
代替的に、または加えて、Notchシグナル伝達経路の調節因子は、NotchリガンドまたはNotchシグナル伝達経路の下流構成成分の発現または活性をアップレギュレートすることができるポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。
適切にはNotchシグナル伝達経路の調節因子は、抗体、抗体断片または抗体誘導体、または、抗体、抗体断片または抗体誘導体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
本発明の別の一態様によると、免疫系によるIL−10産生を高めるための、Notchシグナル伝達の調節因子と、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との組み合わせの用途が提供される。
本発明の別の一態様によると、寛容を促進することができるリンパ球または抗原提示細胞(APC)を作製する方法であって、患者または患畜から得られたリンパ球またはAPCを(i)Notchシグナル伝達経路の調節因子および(ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と共にインキュベートすることを含む方法が提供される。
適切にはその方法は、患者または患畜から得られたリンパ球またはAPCを、(i)Notchシグナル伝達経路の調節因子および(ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の存在下でAPCとインキュベートすることを含む。
本発明の別の一態様によると、T細胞に寛容を誘導することができるAPCを作製する方法であって、APCを(i)Notchシグナル伝達経路の調節因子および(ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と接触させることを含む方法が提供される。
本発明の別の一態様によると、寛容を促進することができるリンパ球またはAPCを作製する方法であって、患者または患畜から得られたリンパ球またはAPCを、上記の通り作製されたリンパ球またはAPCとインキュベートすることを含む方法が提供される。適切にはそのような方法ではそのリンパ球またはAPCをex−vivoでインキュベートすることができる。
適切には抗原または抗原決定基(抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド)もまた、本発明の方法、用途および製品の一部として投与することができる。
一実施形態では抗原または抗原決定基は、自己抗原またはその抗原決定基、または、自己抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、アレルゲンまたはその抗原決定基、または、アレルゲンまたはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、移植抗原またはその抗原決定基、または、移植抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
別の一実施形態では抗原または抗原決定基は腫瘍抗原またはその抗原決定基、または、腫瘍抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
別の一実施形態では抗原または抗原決定基は病原体抗原またはその抗原決定基、または、病原体 抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドであることができる。
「調節する」、「調節」および「調節している」などの語は、関係する効果、反応、またはシグナル伝達を増加および減少させることの両方を含む。
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態を、非限定的な実施例を用いて、および添付の図を参照して、より詳細に説明する。
本発明の実施は、別に指示されない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNAおよび免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献に説明されている。たとえば、J.サムブルック(Sambrook)、E.F.フリッチェ(Fritsch)、およびT.マニアチス(Maniatis)、1989,『分子クローニング;実験の手引き』(Molecular Cloning;A Laboratory Manual)第二版、1〜3巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社(Cold Spring Harbor Laboratory Press);アウスベル(Ausubel)、 F.M.他 (1995および定期補遺;『分子生物学最新プロトコル』(Current Protocols in Molecular Biology)9,13,および16章,ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社(John Wiley & Sons)、ニューヨーク州ニューヨーク;B.ロー(Roe)、J.クラブツリー(Crabtree)およびA.カーン(Kahn)、1996,『DNA単離および配列決定;基幹技術』(DNA Isolation and Sequencing;Essential Techniques)ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社;J.M.ポラック(Polak)およびジェームスO’D.マクジー(James O’D.McGee)、 1990,『In Situハイブリダイゼーション;原理と実践』(In Situ Hybridization;Principles and Practice);オックスフォード大学出版会;M.J.ゲイト(Gait)(編集)、1984,『オリゴヌクレオチド合成;実践的手法』(Oligonucleotide Synthesis;A Practical Approach)Irl出版(Irl Press);D.M.J.リリー(Lilley)およびJ.E.ダールベルク(Dahlberg)、1992,『酵素学の方法;DNA構造パートA;DNAの合成および物理分析』(Methods of Enzymology;DNA Structure Part A;Synthesis and Physical Analysis of DNA)Methods in Enzymology,アカデミックプレス社(Academic Press);およびJ.E.コリガン(Coligan)、A.M.クルイスビーク(Kruisbeek)、D.H.マーグリース(Margulies)、E.M.シェバッハ(Shevach)およびW.ストロバー(Strober)(1992および定期補遺;『免疫学最新プロトコル』(Current Protocols in Immunology)、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク)を参照。これらの一般的文献のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
疑いを避けるため、ショウジョウバエ(Drosophila)および脊椎動物名は互いに交換可能に用いられ、すべてのホモログは本発明の範囲内に含まれる。
インターフェロンおよびインターフェロンをコードするポリヌクレオチド
たとえば米国特許第6299869号明細書(ジェネンテック社(Genentech))に記載の通り、インターフェロンはウイルスまたはある種の他の物質に進入された細胞によって放出される相対的に小さい一本鎖糖タンパク質である。インターフェロンは現在3つの主要な種類に分類されており、白血球インターフェロン(インターフェロン−アルファ、α−インターフェロン、IFN−α)、線維芽細胞インターフェロン(インターフェロン−ベータ、β−インターフェロン、IFN−β)、および免疫インターフェロン(インターフェロン−ガンマ、γ−インターフェロン、IFN−γ)とされている。ウイルス感染に反応して、リンパ球は主にアルファ−インターフェロン(より少ない量の、一般にオメガインターフェロン、LPN−ωと呼ばれる異なる種類のインターフェロンと共に)を合成する一方、線維芽細胞の感染は通常、β−インターフェロンを誘導する。インターフェロンα、β、およびωは、MHCクラスI抗原を誘導することが知られていて、I型インターフェロンと呼ばれ、一方、IFN−γはMHCクラスII抗原発現を誘導し、またII型インターフェロンとも呼ばれる。
たとえば米国特許第6299869号明細書(ジェネンテック社(Genentech))に記載の通り、インターフェロンはウイルスまたはある種の他の物質に進入された細胞によって放出される相対的に小さい一本鎖糖タンパク質である。インターフェロンは現在3つの主要な種類に分類されており、白血球インターフェロン(インターフェロン−アルファ、α−インターフェロン、IFN−α)、線維芽細胞インターフェロン(インターフェロン−ベータ、β−インターフェロン、IFN−β)、および免疫インターフェロン(インターフェロン−ガンマ、γ−インターフェロン、IFN−γ)とされている。ウイルス感染に反応して、リンパ球は主にアルファ−インターフェロン(より少ない量の、一般にオメガインターフェロン、LPN−ωと呼ばれる異なる種類のインターフェロンと共に)を合成する一方、線維芽細胞の感染は通常、β−インターフェロンを誘導する。インターフェロンα、β、およびωは、MHCクラスI抗原を誘導することが知られていて、I型インターフェロンと呼ばれ、一方、IFN−γはMHCクラスII抗原発現を誘導し、またII型インターフェロンとも呼ばれる。
IFN−αの異なる変異体をコードする多数の異なる遺伝子が同定されている。以前に同定されたアルファインターフェロン種は2つの主要な種類であるIとIIに分類され、IとIIのそれぞれが複数の別個のタンパク質を含む(バロン(Baron)他,Critical Reviews in Biotechnology 10,1790190 (1990);ナガタ(Nagata)他,Nature 287,401−408 (1980);ナガタ(Nagata)他 ,Nature 284,316−320 (1980);ストロイリ(Streuli)他 ,Science 209,1343−1347 (1980);ゲーデル(Goeddel)他 ,Nature 290,20−26 (1981) ;ローン(Lawn)他,Science 212,1159−1162 (1981) ;ウルリッヒ(ULLRICH)他 ,J.Mol.Biol.156,467−486 (1982) ;ワイスマン(Weissmann)他 ,Phil.Trans.R.Soc.Lond.B299,7−28 (1982);ルント(Lund)他 ,Proc.Natl.Acad.Sci.81,2435−2439 (1984) ;カポン(Capon)他 ,Mol.Cell.Biol.5,768 (1985) )。さまざまなIFN−α種は、IFN−αA(IFN−α2)、IFN−αB、IFN−αC、IFN−αC1、IFN−.αD(IFN−α1)、IFN−αE、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αJ2、IFN−αK、IFN−αL、IFN−α4B、IFN−α5、IFN−α6、IFN−α74、IFN−α76、IFN−α4a)、IFN−α88、およびこれらの種の対立遺伝子を含む。
ヒトでは、IFN−アルファサブタイプは、166−172アミノ酸のすべてが近縁であるタンパク質をコードする約20個の遺伝子の多遺伝子ファミリーを包含する。この多様性とは対照的に、ヒトインターフェロン−ベータ(IFN−ベータ)遺伝子は1つしかなく、また166アミノ酸のタンパク質をコードする。すべてのIFN−アルファおよびIFN−ベータ(また一般にI型インターフェロンファミリーともいう)は、さまざまな細胞型に幅広く分布する130kDの糖タンパク質である共通の高親和性細胞表面受容体に結合するように見える。I型インターフェロンは、受容体サブユニットifnar1およびifnar2を含む複合体、およびそれらに随伴するJanusチロシンキナーゼTyk2およびJak1によって認識され、これは転写因子STAT1およびSTAT2を活性化し、転写因子複合体ISGP3(インターフェロン刺激化遺伝子因子3(Interferon stimulated gene factor 3))の形成に繋がる[リー(Li)他 ,Biochemie 80 (8−9);703−20 (1998);ナドー(Nadeau)他 ,J.Biol.Chem.274 (7);4045−52 (1999)]。
IFNを産生する主要な細胞型は;リンパ球、単球およびマクロファージ(IFN−アルファについて);線維芽細胞および一部の上皮細胞およびリンパ芽球腫細胞(IFN−ベータについて);および活性化Tリンパ球(IFN−ガンマについて)である。
インターフェロンは当初、バフィーコート白血球および線維芽細胞といった天然の起源から、インターフェロン産生を増加させる既知の誘導物質を任意に用いて、産生された。インターフェロンはまた組み換えDNA技術によっても産生することができる。
組み換えIFN−アルファA(rIFN−αA,別名IFN−α2)のクローニングおよび発現は、ゲーデル(Goeddel)他,Nature 287,411 (1980)によって記載された。rIFN−αA、B、C、D、F、G、H、KおよびLのアミノ酸配列は、コードするヌクレオチド配列と共に、ペストカ(Pestka)によってArchiv.Biochem.Biophys.221,1 (1983)に記載されている。rIFN−αE、IおよびJのアミノ酸配列および基礎となるヌクレオチド配列は、1982年1月20日公開の英国特許第2,079,291号明細書に記載されている。さまざまなIFN−αのハイブリッドもまた知られており、たとえば前出のペストカ(Pestka)他によって開示されている。ナグカタ(Nagcata)他,Nature 284,316(1980)は、rIFN−αDとは114位のアミノ酸1個が異なるポリペプチド(未成熟型の)をコードしたIFN−α遺伝子の発現を記載した。同様に、rIFN−αAとは23位のアミノ酸1個が異なるポリペプチドを生じるIFN−α遺伝子(rIFN−α2という)のクローニングおよび発現が、1981年7月15日公開の欧州特許出願公開第32134号明細書に記載された。
たとえば、ヒトIFNアルファの1つの型についてのアミノ酸配列が、下記の通りGenBankに報告されている(登録番号M54886);
MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKD
RHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTEL
YQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEV
VRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
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VRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
同様に、たとえば、ヒトIFNベータ−1の1つの型についてのアミノ酸配列が、下記の通りGenBankに報告されている(登録番号M28622);
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLK
DRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNBTIVENLLA
NVYHQINHLKTVLEEKLEKBDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYS
HCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN
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DRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNBTIVENLLA
NVYHQINHLKTVLEEKLEKBDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYS
HCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN
他のインターフェロン配列が、たとえば、登録番号J00210(アルファ−d)、X66186(アルファ−2)、K02055(アルファ−WA)、M27318(アルファ−M1)、M11003(アルファ−II−1)、M12350(アルファ−F)、K01900(アルファ201型)およびM34913(アルファ−J1)にて提供される。
成熟rIFN−βのクローニングおよび発現は、ゲーデル(Goeddel)他,Nucleic Acids Res.8,4057 (1980)によって記載されている。成熟rIFN−γのクローニングおよび発現は、グレイ(Gray)他,Nature 295,503 (1982)によって記載されている。IFN−ωは、カポン(Capon)他 ,Mol.Cell.Biol.5,768 (1985)によって記載されている。IFN−τはホエーリー(Whaley)他 ,J.Biol.Chem.269,10864−8 (1994)によって同定され開示されている。
既知のIFN−α、−β、および−γのすべてが、複数のシステイン残基を含む。これらの残基は、分子間ジスルフィド結合を形成することができるスルフヒドリル側鎖を含む。たとえば、成熟組み換えrIFN−αAのアミノ酸配列は1,29,98および138位にシステイン残基を含む。ウェッツェル(Wetzel)他,Nature 289,606(1981)は、1位と98位のシステイン残基間、および29位と138位のシステイン残基間に分子内ジスルフィド結合を割り当てた。
さまざまなインターフェロンを特異的に結合する抗体もまた本分野でよく知られている。たとえば、抗α−インターフェロン作用因子抗体がツクイ(Tsukui)他,Microbiol.Immunol.30,112901139 (1986);デュアルテ(Duarte)他,Interferon−Biotechnol.4,221− 232 (1987);バラソエイアン(Barasoaian)他 ,J.Immunol.143,507−512 (1989);エクスリー(Exley)他 ,J.Gen.Virol.65,2277−2280 (1984);シアラー(Shearer)他 ,J.Immunol.133,3096−3101 (1984);アルカン(Alkan)他,Ciba Geigy Foundation Symposium 119,264−278 (1986);ノル(Noll)他 ,Biomed.BIOCHIM.Acta 48,165−176 (1989);ヘルツォーク(Hertzog)他 ,J.Interferon Res.10 (Suppl.1) (1990);コンツェク(Kontsek)他 ,J.Interferon Res.(special issue) 73−82 (1991)、および1983年12月27日発行の米国特許第4,423,147号明細書によって報告されている。
I型インターフェロンの作用は、細胞表面上のIFN−αa受容体複合体との結合によって媒介されるように見える。この受容体は、IFN−αR1(ウゼ(Uze)他,Cell 60,225−234[1990])およびIFN−αR2(ノビック(Novick)他 CELL 77,391−400 [1994])と同定される、それぞれ2種類および3種類のスプライス変異体を有する、少なくとも2つの異なるサブユニットで構成される。IFN−αR2は既知の型のインターフェロンの結合サブユニットであり、一方、IFN−αR1はより高い親和性の結合およびシグナル伝達に寄与する。リガンド結合による受容体の結合は、Janusファミリーキナーゼ(JAK)および原形質潜在シグナル伝達因子および転写(STAT)タンパク質の活性化因子を、チロシンリン酸化によって活性化する。活性化されたSTATは複合体の形で核へ移行して、IFN−刺激化遺伝子(ISGS)の認識エンハンサー配列と相互作用し、対応する転写活性化および生物学的反応に結びつく(ダーネル(DARNELL)他,Science 264,1415−21(1994))。
ここで用いられる「インターフェロン」の語は、天然に存在するインターフェロンおよびその生物学的に活性な断片、誘導体、ホモログおよび変異体を含む。また、抗体、小分子、およびペプチドミメティックといった、対応する活性を有する人工の同等物も含む。
好ましくは、「インターフェロン」はI型またはII型インターフェロンをいい、アルファ、ベータ、ガンマ、およびオメガと一般に呼ばれるもの、およびその混合物を含み、共通配列を含む。インターフェロンは幅広い市販品から入手可能であり、多数の適応の治療について承認されている。インターフェロンは天然起源由来でありうるが、しかし適切には組み換え産物である。本発明の目的のためには、「インターフェロン」の語はまた、特に米国特許第5,582,824号明細書、第5,593,667号明細書、および第5,594,107号明細書で開示されるように、たとえば生物学的活性の性質に影響することなく安定性を高めるために配列修飾が導入されているインターフェロンのキメラ型または突然変異型といった、インターフェロン活性を有するポリペプチドまたはその断片、誘導体、複合体、ホモログおよび変異体も含む。
たとえば、IFN−ベータ配列の変異体、用途、および作製手順はよく知られている;たとえば米国特許第4,450,103号;第4,518,584号;第4,588,585号;第4,737,462号;第4,738,844号;第4,738,845号;第4,753,795号;第4,769,233号;第4,793,995号;第4,914,033号;第4,959,314号;第5,183,746号;第5,376,567号;第5,545,723号;第5,730,969号;第5,814,485号;第5,869,603号明細書およびそれらの参考文献を参照。
一実施形態では、たとえば、本発明における用途のためのインターフェロンは、ここで特定されるI型インターフェロン配列に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列類似性、好ましくは配列同一性を有しうる。
一実施形態では、インターフェロンは、ここで特定されるIFN−アルファ配列に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列類似性、好ましくは配列同一性を有しうる。
一実施形態では、インターフェロンは、ここで特定されるIFN−ベータ配列に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列類似性、好ましくは配列同一性を有しうる。
インターフェロンはグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよいことが理解される。
好ましくは本発明で用いられるインターフェロンは、I型インターフェロン、好ましくはアルファ−インターフェロンであるかまたはその活性を有する。好ましくはインターフェロンはヒトインターフェロンであるかまたはヒトインターフェロンに由来する。
たとえば米国特許第6154729号明細書で報告される通り、IFNは炎症性疾患、ウイルス性疾患、および悪性疾患といった症状において治療的価値を有することが示されている(たとえば、デスミター(Desmyter)他 ,Lancet 2 (7987);645−7 (1976);マコワー(Makower)およびワドラー(Wadler),Semin.Oncol.26 (6);663−71 (1999);ストルゼベッカー(Sturzebecher)他 ,J.Interferon Cytokine Res.19 (11);1257−64 (1999);ゼイン(Zein),Cytokines Cell.Mol.Ther.4 (4);229−41 (1998;ムシュ(Musch)他 ,Hepatogastroeneterology 45 (24);2282−94 (1998) ;ワドラー(Wadler)他 ,Cancer J.Sci.Am.4 (5);331−7 (1998)を参照)。 IFN−ベータは市販薬であり(バーレックス社(Berlex)製のベータセロン(Betaseron)(登録商標)、およびバイオジェン(Biogen)社製のアボネックス(Avonex)(登録商標))、多発性硬化症(MS)の治療における用途について承認されている(アルナソン(Arnason),Biomed Pharmacother 53 (8);344−50,(1999);コミ(Comi)他 ,Mult.Scler.1 (6);317−20 (1996);アーポス(Aappos),Lancet 353 (9171);2242−3 (1999))。ベータセロン(Betaseron)は大腸菌(E.coli)で発現された組み換えIFN−ベータであって、165アミノ酸(最初のメチオニンを欠く)を含み、17位にシステインの代わりにセリンを含むように遺伝子組み換えされている。ベータセロンはIFN−ベータの非グリコシル化型である。アボネックス(Avonex)はヒトIFN−ベータであって、166アミノ酸を含み、組み換えDNA技術によってCHO細胞で産生される。アボネックスはIFN−ベータのグリコシル化型である。また、近年の研究は、有望なIFN有効性を、B型およびC型肝炎といったある種のウイルス疾患、およびがんで示している。
ヒトでの使用に関して承認された市販のインターフェロンは、たとえば;インターフェロンアルファ−2a(ロフェロンA(Roferon A)(登録商標)、より入手可能);インターフェロンアルファ−2b(イントロンA(Intron A)(登録商標)、米国ロシュ社(Roche)より入手可能);インターフェロンアルファcon−1 (インファジェン(Infergen)(登録商標)、米国インターミューン社(InterMune)より入手可能);インターフェロン アルファ−n3 (ヒト 白血球由来) (アルフェロンN(Alferon N)(登録商標)、米国ヘミスフェリクス・バイオファーマ社(Hemispherx Biopharma,Inc)より入手可能);インターフェロンベータ−1a(レビフ(Rebif)(登録商標)、米国セロノ/ファイザー社(Serono/Pfizer)より入手可能);およびインターフェロンガンマ−1b(アクチミューン(Actimmune)(登録商標)、米国インターミューン社(InterMune)より入手可能)を含む。
インターフェロンは、たとえばPegインターフェロンアルファ−2a(ペガシス(Pegasys)、米国ロシュ社(Roche)より入手可能)およびPEGインターフェロンアルファ−2b(PEG−イントロン(PEG−INTRON)、米国シェリング社(Schering)より入手可能)の場合のように、たとえばポリエチレングリコール(PEG)といったポリマーと結合した誘導体化された形でも用いることができる。PEGといった物質の結合は、インターフェロンをより長く体内に留まらせ、したがってインターフェロンの作用を延長させる。これらおよび他の誘導体もまたここで用いられる「インターフェロン」の語の意味に含まれることが理解される。
本発明の製品および方法は、たとえば自己免疫疾患、マイコバクテリア疾患、神経変性疾患、寄生虫疾患、およびウイルス製疾患を治療するのに用いることができる。特に本発明は、関節炎、糖尿病、狼瘡、および多発性硬化症といった自己免疫疾患、ハンセン病および結核といったマイコバクテリア疾患、脳炎およびクロイツフェルト−ヤコブ症候群といった神経変性疾患、マラリアといった寄生虫疾患、および子宮頸がん、性器ヘルペス、B型およびC型肝炎、HIV、HPV、およびHSV−1および2といったウイルス性疾患を治療するための方法を提供する。
インターフェロン誘導因子
本発明の一実施形態では、インターフェロン誘導因子を、インターフェロンまたはインターフェロンをコードするポリヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、用いることができる。
本発明の一実施形態では、インターフェロン誘導因子を、インターフェロンまたはインターフェロンをコードするポリヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、用いることができる。
「インターフェロン誘導因子」の語は、インターフェロン合成および/または放出を増加させる(誘導する)任意の物質を含む。たとえばポリI;Cといったポリヌクレオチドのような、インターフェロンのさまざまな誘導因子が既知である。適切には、低分子量の、経口投与可能なインターフェロン誘導因子を用いることができる。そのような誘導因子は本分野でよく知られており、たとえば、チロロン(tirolone)(米国特許第3592819号明細書;アルブレヒト(Albrecht)他,J.Med.Chem.1974 17 ;1150−1156)およびキノロン誘導体であるイミキモド(imiquimod)(サベッジ(Savage)他;Brit.J.Cancer,1996 74;1482−1486)がある。
Notchシグナル伝達の調節因子
ここで用いられる「Notchシグナル伝達経路の調節」の語は、Notchシグナル伝達経路またはその標的シグナル伝達経路の生物学的活性の変化または改変をいう。「Notchシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Notchシグナル伝達の拮抗因子または阻害因子、すなわちNotchシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、遮断する化合物をいうことができる。そのような化合物は阻害因子または拮抗因子ということができ、便利である。代わりに、「Notchシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Notchシグナル伝達の作用因子、すなわちNotchシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、刺激またはアップレギュレートする化合物をいうことができる。そのような化合物はアップレギュレーターまたは作用因子ということができ、便利である。好ましくは、調節因子はNotchシグナル伝達の作用因子であり、好ましくはNotch受容体の作用因子である(たとえば、好ましくはヒトNotch受容体である、Notch1、Notch2、Notch3および/またはNotch4受容体の作用因子)。好ましくはそのような作用因子(「Notchの活性化因子」)は、好ましくはヒトNotch1、Notch2、Notch3および/またはNotch4といったヒトNotch受容体を含む、Notch受容体と結合しそれを活性化する。Notch受容体との結合および/またはその活性化は、たとえばここに記載されるようなin vitro結合測定法および活性測定法を含む本分野で既知のさまざまな技術によって評価することができる。
ここで用いられる「Notchシグナル伝達経路の調節」の語は、Notchシグナル伝達経路またはその標的シグナル伝達経路の生物学的活性の変化または改変をいう。「Notchシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Notchシグナル伝達の拮抗因子または阻害因子、すなわちNotchシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、遮断する化合物をいうことができる。そのような化合物は阻害因子または拮抗因子ということができ、便利である。代わりに、「Notchシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Notchシグナル伝達の作用因子、すなわちNotchシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、刺激またはアップレギュレートする化合物をいうことができる。そのような化合物はアップレギュレーターまたは作用因子ということができ、便利である。好ましくは、調節因子はNotchシグナル伝達の作用因子であり、好ましくはNotch受容体の作用因子である(たとえば、好ましくはヒトNotch受容体である、Notch1、Notch2、Notch3および/またはNotch4受容体の作用因子)。好ましくはそのような作用因子(「Notchの活性化因子」)は、好ましくはヒトNotch1、Notch2、Notch3および/またはNotch4といったヒトNotch受容体を含む、Notch受容体と結合しそれを活性化する。Notch受容体との結合および/またはその活性化は、たとえばここに記載されるようなin vitro結合測定法および活性測定法を含む本分野で既知のさまざまな技術によって評価することができる。
たとえば、任意の特定の物質がNotchシグナル伝達を活性化するかどうか(たとえばNotchの活性化因子またはNotch作用因子である)は、任意の適当な測定法の使用によって、たとえばロランティス社(Lorantis Ltd)の名義の国際公開第03/012441号パンフレット(たとえばその実施例8および9を参照)に記載された型のHES−L/CBF−1レポーター測定の使用によって、容易に決定することができる。逆に、拮抗因子活性は、たとえば、ロランティス社(Lorantis Ltd)の名義の国際公開第03/012441号パンフレットまたは国際公開第03/041735号パンフレット(たとえば実施例10、11および12を参照)に記載されたような、既知のNotchシグナル伝達作用因子によってシグナル伝達を低下させることにおけるその物質の何らかの効果を監視することによって容易に決定することができる(すなわちいわゆる「拮抗因子」測定法で)。
本発明の活性物質はたとえば有機化合物またはその他の化学物質でありうる。一実施形態では、調節因子は2個以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物となる。ここで、「ヒドロカルビル基」の語は、少なくともCおよびHを含む基を意味し、また任意に1つ以上の他の適当な置換基を含みうる。そのような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環状基などを含みうる。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組み合わせは環状基を形成しうる。ヒドロカルビル基が2個以上のCを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、少なくとも2個の炭素は、適当な元素または基を介して結合することができる。このように、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含むことができる。適当なヘテロ原子は当業者に明らかとなり、たとえば、硫黄、窒素、および酸素を含む。調節因子候補は少なくとも1つの環状基を含みうる。環状基は、非融合型多環基といった多環基であることができる。一部の用途のためには、本物質は、別のヒドロカルビル基と結合した、前記環状基のうち少なくとも1つを含む。
好ましい一実施形態では、調節因子はアミノ酸配列またはその化学誘導体である。別の好ましい一実施形態では、調節因子はヌクレオチド配列であって、センス配列またはアンチセンス配列でありうる。調節因子はまた抗体であることができる。
「抗体」の語は、完全な分子および、抗原決定基と結合することができるFab、F(ab’)2、Fv、およびscFvといったその断片を含む。これらの抗体断片はその抗原または受容体と選択的に結合する能力の一部を保持し、たとえば下記を含む;
(i)Fabは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、酵素パパインを用いての完全な抗体の消化によって作製することができ、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を生じる;
(ii)Fab’は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元して、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を生じることによって得ることができる;抗体分子あたり2個のFab’断片が得られる;
(iii)F(ab’)2は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる;F(ab’)2は2本のジスルフィド結合によって結びついた2個のFab’断片の二量体である;
(iv)scFvは、重鎖および軽鎖の可変領域を融合した一本鎖分子として含む、遺伝子操作された断片を含む。
(i)Fabは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、酵素パパインを用いての完全な抗体の消化によって作製することができ、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を生じる;
(ii)Fab’は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元して、完全な軽鎖および1つの重鎖の一部を生じることによって得ることができる;抗体分子あたり2個のFab’断片が得られる;
(iii)F(ab’)2は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる;F(ab’)2は2本のジスルフィド結合によって結びついた2個のFab’断片の二量体である;
(iv)scFvは、重鎖および軽鎖の可変領域を融合した一本鎖分子として含む、遺伝子操作された断片を含む。
これらの断片を作製する一般的方法は本分野で既知である(たとえば、参照により本開示に含まれるハーロー(Harlow)およびレーン(Lane),『抗体;実験の手引き』(Antibodies;A Laboratory Manual)コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社(Cold Spring Harbor Laboratory),ニューヨーク(1988)を参照)。
調節因子は合成化合物または天然の単離された化合物でありうる。
好ましくはNotchシグナル伝達の調節因子は多量体化された形である。
たとえば、ビーズといった粒子状担体と結合したNotchリガンドタンパク質/ポリペプチドの形のNotchシグナル伝達の調節因子は、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第03/011317号パンフレット(ロランティス社(Lorantis))およびロランティス社の同時出願中のPCT出願PCT/GB2003/001525(2003年4月4日出願)に記載されている(たとえば特にPCT/GB2003/001525の実施例17、18、19を参照)。
高分子担体と結合したNotchリガンドタンパク質/ポリペプチドの形のNotchシグナル伝達の調節因子は、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社(Lorantis Ltd)の同時出願中のPCT出願(2003年8月1日出願、英国特許第0218068.5号の優先権を主張)に記載されている(たとえば特に、デキストラン複合体を開示するその実施例5を参照)。
一形態では、Notchシグナル伝達経路の調節のための物質は、Notchシグナル伝達のためのタンパク質でありうる。
Notchシグナル伝達のためのタンパク質とは、Notchの活性化、Notchシグナル伝達経路の下流現象、下流標的遺伝子の転写調節、および他の非転写的下流現象(たとえば既存のタンパク質の翻訳後修飾)を含む、Notch受容体を介したシグナル伝達に関与する分子を意味する。より具体的には、タンパク質は、Notchシグナル伝達経路の標的遺伝子の活性化を可能にするドメイン、またはそれをコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。
Notchシグナル伝達経路の非常に重要な成分は、Notch受容体/Notchリガンド相互作用である。このようにNotchシグナル伝達は、Notchリガンドまたは受容体またはそれらの結果として生じる切断産物の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。加えて、Notchシグナル伝達は、Notchシグナル伝達経路膜タンパク質またはG−タンパク質、またはプロテアーゼ、キナーゼ(たとえばセリン/スレオニンキナーゼ)、ホスファターゼ、リガーゼ(たとえばユビキチンリガーゼ)またはグリコシルトランスフェラーゼといったNotchシグナル伝達経路酵素の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。代替的にシグナル伝達は、転写因子といったDNA結合配列の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。
本発明では、Notch シグナル伝達は好ましくは特異的シグナル伝達を意味し、シグナル伝達が、サイトカインシグナル伝達といった何らかの他の顕著な干渉するかまたは競合する原因でなく、実質的に、または少なくとも主に、Notchシグナル伝達経路から、および好ましくはNotch/Notchリガンド相互作用から結果として生じることを意味する。好ましくはしたがってここで用いられる「Notchシグナル伝達」の語は、サイトカインシグナル伝達を除外する。Notchシグナル伝達経路を下記により詳細に説明する。
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列(HISオリゴマー、免疫グロブリンFc、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、FLAGなどといった)を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断(たとえば化学的にまたは酵素的に)して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり(IgFc融合タンパク質の場合のように)、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
Notchシグナル伝達
Notch依存性転写活性化の主要な標的は、Enhancer of split複合体遺伝子(E[spl])である。さらにこれらの遺伝子は、Su(H)タンパク質による結合の直接の標的であること、およびNotchシグナル伝達に反応して転写活性化されることが示されている。哺乳類Su(H)ホモログCBF1と相互作用してそれを転写抑制因子から転写活性化因子へ変換するウイルスコアクチベータータンパク質であるEBNA2との類推によって、Notch細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と共同して、Su(H)と結合してSu(H)がE(spl)および他の標的遺伝子の転写を活性化することを可能にする活性化ドメインに寄与しうる。Su(H)はすべてのNotch依存性の決定に必要ではないこともまた注目すべきであり、これは、Notchが他のDNA結合性転写因子と結合することによって、または細胞外シグナルを伝達する他の機構を用いることによって、一部の細胞運命選択を媒介することを示す。
Notch依存性転写活性化の主要な標的は、Enhancer of split複合体遺伝子(E[spl])である。さらにこれらの遺伝子は、Su(H)タンパク質による結合の直接の標的であること、およびNotchシグナル伝達に反応して転写活性化されることが示されている。哺乳類Su(H)ホモログCBF1と相互作用してそれを転写抑制因子から転写活性化因子へ変換するウイルスコアクチベータータンパク質であるEBNA2との類推によって、Notch細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と共同して、Su(H)と結合してSu(H)がE(spl)および他の標的遺伝子の転写を活性化することを可能にする活性化ドメインに寄与しうる。Su(H)はすべてのNotch依存性の決定に必要ではないこともまた注目すべきであり、これは、Notchが他のDNA結合性転写因子と結合することによって、または細胞外シグナルを伝達する他の機構を用いることによって、一部の細胞運命選択を媒介することを示す。
本発明の一態様によると、活性物質はNotch、またはNotchのシグナル伝達能力を保持するその断片、またはNotchのシグナル伝達能力を有するNotchのアナログであることができる。
ここで用いられる「Notchのアナログ」の語は、Notchのシグナル伝達能力を保持しているその変異体を含む。「アナログ」には、Notchシグナル伝達能力を持つが、一般的にNotchとは異なる進化的起源を有するタンパク質を含める。Notchのアナログは、EBNA2、BARF0、またはLMP2Aといった、エプスタイン・バーウイルス(EBV)由来のタンパク質を含む。
Notchシグナル伝達活性化のためのタンパク質で、我々はNotch、Notchシグナル伝達経路またはNotchシグナル伝達経路の任意の1つ以上の成分を活性化することができる分子を意味する。
一実施形態では、活性物質は、Notchリガンド、またはNotchリガンドをコードするポリヌクレオチドでありうる。本発明で有用であるNotchリガンドは、典型的にはたとえば造血幹細胞といったさまざまな哺乳類細胞の膜に存在するNotch受容体ポリペプチドと結合することができる内因性Notchリガンドを含む。
ここで用いられる「Notchリガンド」の語は、Notch受容体と相互作用して生物学的効果を生じることができる物質を意味する。ここで用いられるその語はしたがって、DeltaおよびSerrate/Jagged(たとえば哺乳類リガンドDelta1、Delta3、Delta4、Jagged1およびJagged2およびホモログ)といった天然に存在するタンパク質リガンド(たとえばショウジョウバエ(Drosophila)、脊椎動物、哺乳類由来)およびその生物学的に活性な断片およびNotch受容体に対する抗体、およびペプチドミメティック、天然リガンドに対して対応する生物学的作用を有する抗体および小分子を含む。好ましくはNotchリガンドはNotch受容体と結合によって相互作用する。
現在までに同定された哺乳類Notchリガンドの具体例は、Deltaファミリー、たとえばDeltaまたはDelta−like1(Genbank登録番号AF003522−ヒト(Homo sapiens));Delta−3(Genbank登録番号AF084576−ラット(Rattus norvegicus))およびDelta−like 3(マウス(Mus musculus))(Genbank登録番号NM_016941−ヒト(Homo sapiens))および米国特許第6121045号明細書(ミレニアム社(Millennium))、Delta−4(Genbank登録番号AB043894およびAF253468−ヒト(Homo sapiens));およびSerrateファミリー、たとえばSerrate−1およびSerrate−2(国際公開第97/01571号パンフレット、国際公開第96/27610号パンフレットおよび国際公開第92/19734号パンフレット)Jagged−1(Genbank登録番号U73936−ヒト(Homo sapiens))およびJagged−2(Genbank登録番号AF029778−ヒト(Homo sapiens))、およびLAG−2を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
一実施形態では、活性化因子は構成的に活性であるNotch受容体またはNotch細胞内ドメイン、またはそのような受容体または細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドであることができる。
別の一実施形態では、Notchシグナル伝達の活性化因子はNotch受容体の下流で作用する。したがって、たとえば、Notchシグナル伝達の活性化因子は構成的に活性であるDeltexポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることができる。
本発明で有用であるNotchシグナル伝達経路の他の下流成分は、好ましくは構成的に活性な型での、Deltexによって触媒されるRas/MAPKカスケードに関与するポリペプチド、プレセニリン(Presenilin)といったNotchのタンパク質分解切断に関与するポリペプチド、およびNotch標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチドを含む。
Notchシグナル伝達活性化のためのポリペプチドとは、Notch活性化の結果として発現する任意のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの発現に関与する任意のポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意味する。
Notchシグナル伝達阻害のためのタンパク質またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドで、我々はNotch、Notchシグナル伝達経路、またはNotchシグナル伝達経路の任意の1つ以上の成分、を阻害することができる分子を意味する。
特定の一実施形態では、その分子はNotchまたはNotchリガンド発現を低下または阻害することができる可能性がある。そのような分子はNotchまたはNotchリガンド発現を低下または阻害することができる核酸配列でありうる。
別の一実施形態ではNotchシグナル伝達の調節因子はNotch−Notchリガンド相互作用を調節することができる分子でありうる。ある分子は、好ましくは治療的有効性を提供するのに十分な程度に、リガンドとのNotchの相互作用を促進または阻害することができる場合、Notch−Notchリガンド相互作用を調節すると考えられる。
好ましくは、阻害因子が受容体または受容体をコードする核酸配列である場合、受容体が活性化される。したがって、たとえば、その物質が核酸配列である場合、受容体は好ましくは発現された際に構成的に活性である。
Notchシグナル伝達の阻害因子はまた、Notchシグナル伝達経路の下流阻害因子、Notch標的遺伝子の発現を妨げるかまたはNotchシグナル伝達経路によって抑制される遺伝子の発現を誘導する化合物も含む。そのようなタンパク質の例は、DshおよびNumb、およびNotchICおよびDeltexの優性阻害型を含む。Notchシグナル伝達阻害のためのタンパク質はまた、その存在がシグナル伝達経路を伝達するのでなく遮断するように改変されたNotchシグナル伝達経路の野生型成分の変異型も含む。そのような化合物の一例は、細胞内ドメインのタンパク質分解切断が不可能になるように改変されているNotch受容体である。
任意の1つ以上の適当な標的−たとえばアミノ酸配列および/またはヌクレオチド配列−は、Notchシグナル伝達経路を調節することができる化合物および/または標的化分子を同定するために、さまざまな医薬スクリーニング技術の任意のものにおいて、用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液中で遊離しているか、固体担体上に付加されているか、細胞表面上に保持されているか、または細胞内に位置することができる。
医薬スクリーニングのための技術は、ゲイセン(Geysen)の1984年9月13日公開の欧州特許第0138855号明細書に記載の方法に基づくことができる。要約すると、多数の異なる小ペプチド候補調節因子または標的化分子が、プラスチックピンまたは何らかの他の表面といった固体基材上に合成される。ペプチド被験化合物を適当な標的またはその断片と反応させ洗浄する。結合物をその後に、たとえば本分野でよく知られた方法を適当に当てはめることによって、検出する。精製された標的はまた、医薬スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接被覆することができる。高処理量スクリーニング(HTS)用に有用であるプレートは、好ましくは96、384、または384を超えるウェル/プレートを有するマルチウェルプレートとなる。細胞はまた、「芝生状(lawns)」として広げることができる。代替として、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉して固体担体上に固定化することができる。高処理量スクリーニングを、合成化合物について上述したように、有機候補調節因子および標的化分子を同定するために用いることができる。
本発明はまた、標的と結合することができる中和抗体が、標的との結合について特異的に被験化合物と競合する、競合医薬スクリーニング分析も考慮する。
Notchシグナル伝達経路の成分と結合することができる抗体、ペプチドミメティックおよび小有機分子といった物質のスクリーニングおよび開発のための技術は本分野でよく知られている。これらは、シグナル伝達タンパク質を発現するためのファージディスプレイ系の使用、およびトランスフェクションした大腸菌(E.coli)またはその他の微生物の培養を用いて結合化合物候補の結合試験のためのタンパク質を産生することを含む(たとえば、G.セサリーニ(Cesarini),FEBS Letters,307(1);66−70 (July 1992);H.グラム(Gram)他,J.Immunol.Meth.,161;169−176 (1993);およびC.サマー(Summer)他,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89;3756−3760 (1992年5月)を参照)。他のライブラリおよびスクリーニング技術は、たとえば、米国特許第6281344号明細書(ファイロス(Phylos))に記載されている。
Notchシグナル伝達およびNotch受容体活性化
Notchはショウジョウバエ(Drosophila)で、2つの異なるリガンドDeltaおよびSerrateについての受容体として機能する膜貫通タンパク質として最初に記載された。脊椎動物は複数のNotch受容体およびリガンドを発現する(下記で考察)。少なくとも4種類のNotch受容体(Notch−1、Notch−2、Notch−3、およびNotch−4)が現在までにヒト細胞で同定されている(たとえばGenBank登録番号AF308602,AF308601およびU95299−ヒト(Homo sapiens)を参照)。
Notchはショウジョウバエ(Drosophila)で、2つの異なるリガンドDeltaおよびSerrateについての受容体として機能する膜貫通タンパク質として最初に記載された。脊椎動物は複数のNotch受容体およびリガンドを発現する(下記で考察)。少なくとも4種類のNotch受容体(Notch−1、Notch−2、Notch−3、およびNotch−4)が現在までにヒト細胞で同定されている(たとえばGenBank登録番号AF308602,AF308601およびU95299−ヒト(Homo sapiens)を参照)。
Notchタンパク質は単一のポリペプチド前駆体として合成され、フリン様転換酵素による切断を受けて2つのポリペプチド鎖を生じ、それがさらにプロセシングされて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するNotch受容体は2つのNotchタンパク質分解産物のヘテロ二量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部から成るN末端断片、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化する、Notchのタンパク質分解による切断段階は、ゴルジ装置で起こり、フリン様転換酵素によって媒介される。
Notch受容体は、最大36個の上皮成長因子(EGF)様反復[Notch1/2=36、Notch3=34、およびNotch4=29]、3個のシステインリッチ反復(Lin−Notch(L/N)反復)を含む細胞外ドメイン、および細胞質ドメインを含む1個の膜貫通サブユニットを含むヘテロ二量体分子として膜に付着している。Notchの細胞質ドメインは6個のアンキリン様反復、1個のポリグルタミン鎖(OPA)および1個のPEST配列を含む。RAM23という別の1個のドメインがアンキリン反復の近位側に存在し、ショウジョウバエ(Drosophila)ではHairless抑制因子(Suppressor of Hairless)[Su(H)]、脊椎動物ではCBF1として知られる転写因子との結合に関与している(タムラ(Tamura)K,他(1995) Curr.Biol.5 ;1416−1423(TAMURA))。Notchリガンドはまた、複数のEGF様反復を細胞外ドメイン中に、すべてのNotchリガンドに特徴的であるシステインに富むDSL(Delta−Serrate Lag2)ドメインと共に示す(アルタバニス・ツァコマス(Artavanis−Tsakomas)他 (1995)Science 268;225−232,アルタバニス・ツァコマス(Artavanis−Tsakomas)他(1999) Science 284;770−776)。
Notch受容体は、DeltaおよびSerrateといった細胞外リガンドの、Notchの細胞外ドメインのEGF様反復との結合によって活性化される。Deltaは活性化のために時に切断を必要としうる。DeltaをADAMディスインテグリンメタロプロテアーゼであるクズバニアン(Kuzbanian)によって細胞表面で切断することができ、その切断現象はDeltaの可溶性の活性型を放出する。ヒトNotch−1タンパク質の発がん性変異体、別名TAN−1は、短縮された細胞外ドメインを持つが、構成的に活性であり、T細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
cdc10/アンキリン細胞内ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を媒介する。非常に顕著なことに、cdc10/アンキリン反復は、サプレッサー・オブ・ヘアレス(Suppressor of Hairless)[Su(H)]と相互作用する。Su(H)は、B細胞のエプスタイン・バーウイルス誘導性不死化に関与する哺乳類DNA結合タンパク質であるC−プロモーター結合因子−1[CBF−1]のショウジョウバエ(Drosophila)ホモログである。少なくとも培養細胞において、Su(H)はcdc10/アンキリン反復と細胞質中で結合し、隣接する細胞上のリガンドであるDeltaとのNotch受容体の相互作用の際に、核へ移動することが示されている。Su(H)はいくつかの遺伝子のプロモーター中に見出される応答配列を含み、Notchシグナル伝達経路において重要な下流タンパク質であることが見出されている。転写におけるSu(H)の関与は、Hairlessによって調節されると考えられている。
Notchの細胞内ドメイン(NotchIC)はまた、直接の核機能を有する(リーバー(Lieber)他(1993)Gene Dev 7(10);1949−65 (Lieber))。近年の研究は実際に、Notch活性化は、Notch細胞内ドメインの6個のcdc10/アンキリン反復が核に到達し転写活性化に参加することを必要とすることを示している。Notchの細胞内尾部のタンパク質分解切断部位は、gly1743とval1744の間と同定されている(部位3、またはS3という)(シュレーター(Schroeter),E.H.他(1998)Nature 393(6683);382−6(Schroeter))。核への進入のためにcdc10/アンキリン反復を放出するタンパク質分解切断段階は、プレセニリン(Presenilin)活性に依存すると考えられている。
細胞内ドメインは核内に蓄積し、そこでCSLファミリータンパク質であるCBF1(ショウジョウバエ(Drosophila)ではsuppressor of hairless,Su(H)、線虫(C.elegans)ではLag−2)と転写活性化因子複合体を形成することが示されている(シュレーター(Schroeter);シュトルール(Struhl),G.他 (1998) Cell 93(4);649−60 (Struhl))。NotchIC−CBF1複合体はその後、bHLHタンパク質であるHES(hairy−enhancer of split like)1および5といった標的遺伝子を活性化する(ワインマスター(Weinmaster)G.(2000) Curr.Opin.Genet.Dev.10;363−369 (WEINMASTER))。このNotchの核機能はまた、哺乳類Notchホモログについても示されている(ルー(Lu),F.M.他(1996)Proc Natl Acad Sci 93(11);5663−7 (Lu))。
S3プロセシングは、NotchリガンドDeltaまたはSerrate/Jaggedの結合に反応してのみ生じる。初期のNotch受容体のゴルジにおける翻訳後修飾(ムンロー(Munro)S,フリーマン(Freeman)M.(2000) Curr.Biol.10;813−820 (Munro);ユー(Ju)BJ,他 (2000) Nature 405;191−195 (Ju))は、少なくとも部分的に、2種類のリガンドのどちらが細胞表面上に発現されるかを調節するように見える。Notch受容体は、Lin/Notchモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ(Fringe)によって細胞外ドメインで修飾される。フリンジは、O−結合型フコース基をEGF様反復に付加することによってNotchを修飾する(モロニー(Moloney)DJ,他 (2000) Nature 406;369−375 (Moloney)、ブルッカー(Brucker)K,他 (2000) Nature 406;411−415 (Brucker))。フリンジによるこの修飾はリガンド結合を妨げないが、リガンドに誘導されるNotchにおける立体構造変化に影響しうる。さらに、近年の研究は、フリンジの作用はNotchを修飾してSerrate/Jaggedリガンドと機能性に相互作用することを妨げるが、優先的にDeltaと結合することを可能にすることを示唆する(パニン(Panin)VM,他 (1997) Nature 387;908−912 (Panin)、ヒックス(Hicks)C,他 (2000) Nat.Cell.Biol.2;515−520 (Hicks))。ショウジョウバエ(Drosophila)は単一のフリンジ遺伝子を持つが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている(Radical,ManicおよびLunatic Fringes)(アーヴィン(Irvine)KD (1999) Curr.Opin.Genet.Devel.9;434−441 (Irvine))。
Notch受容体からのシグナル伝達は、2つの異なる経路を介して起こりうる(たとえば図1を参照)。よりよく定義された経路は、Notchの細胞内ドメイン(NotchIC)のタンパク質分解切断を含み、NotchICは核へ移動して、CSLファミリータンパク質のCBF1(ショウジョウバエ(Drosophila)ではsuppressor of hairless,Su(H)、線虫(C.elegans)ではLag−2)と転写活性化因子複合体を形成する。NotchIC−CBF1複合体はその後、bHLHタンパク質であるHES(hairy−enhancer of split like)1および5といった標的遺伝子を活性化する。Notchはまた、タンパク質Deltexを含む細胞質亜鉛フィンガーが関与するCBF1−非依存的な方法でシグナル伝達することができる。CBF1とは異なり、DeltexはNotch活性化後に核へ移動しないが、Grb2と相互作用してRas−JNKシグナル伝達経路を調節することができる。
Notchシグナル伝達経路の標的遺伝子は、Deltex、Hesファミリーの遺伝子(特にHes−1)、Enhancer of Split[E(spl)]複合体遺伝子、IL−10、CD−23、CD−4およびDll−1を含む。
Deltexは、細胞内ドッキングタンパク質であり、Su(H)がNotchの細胞内尾部との相互作用部位から離れる際にSu(H)と置き換わる。Deltexは亜鉛フィンガーを含む細胞質タンパク質である(アルタバニス・ツァコマス(Artavanis−Tsakomas)他(1995)Science 268;225−232;アルタバニス・ツァコマス(Artavanis−Tsakomas)他(1999)Science 284;770−776;オズボーン(Osborne)B,ミーレ(Miele)L.(1999)Immunity 11;653−663 (Osborne))。DeltexはNotch細胞内ドメインのアンキリン反復と相互作用する。DeltexはGrb2と相互作用してRas−JNKシグナル伝達経路を調節することにより、Notch経路活性化を促進することを研究が示している(マツノ(Matsuno)他(1995)Development 121(8);2633−44;マツノ(Matsuno)K,他(1998)Nat.Genet.19;74−78)。Deltexはまた、Su(H)がNotchの細胞内尾部と結合することを妨げるドッキングタンパク質として作用する(マツノ(Matsuno))。このように、Su(H)は核内へ放出され、そこで転写調節因子として作用する。近年の証拠はまた、脊椎動物B細胞系において、Su(H)ホモログのCBF1でなくDeltexが、E47機能の阻害を担っていることを示唆する(オルデントリッヒ(Ordentlich)他(1998)Mol.Cell.Biol.18;2230−2239 (Ordentlich))。Deltexの発現は、Notch活性化の結果として、正のフィードバックループによってアップレギュレートされる。ヒト(Homo sapiens)Deltex(DTX1)mRNA配列はGenBank登録番号AF053700に見出される。
HES−1(HAIRY−ENHANCER of Split−1)(タケバヤシ(Takebayashi)K.他(1994)J Biol Chem 269(7);150−6 (Takebayashi))は、へリックス−ループ−へリックスの基本構造を有する転写因子である。Hes−1はCD4サイレンサー中の重要な機能部位と結合し、CD4遺伝子発現の抑制に結びつく。このように、Hes−1はT細胞運命の決定に強力に関与している。Hesファミリーからの他の遺伝子は、Notch活性化によってもまた発現がアップレギュレートされるHes−5(Splitホモログの哺乳類エンハンサー)、およびHes−3を含む。Hes−1の発現は、Notch活性化の結果としてアップレギュレートされる。マウス(Mus musculus)Hes−1の配列はGenBank登録番号D16464に見出される。
E(spl)遺伝子複合体[E(spl)−C](ライマイスター(Leimeister)C.他(1999)Mech Dev 85(1−2);173−7 (Leimeister))は7個の遺伝子を含み、そのうちE(spl)およびGrouchoだけが突然変異により目に見える表現型を示す。E(spl)はSplit突然変異を促進する能力に因んで命名され、SplitはNotchの別名である。実際、E(spl)−C遺伝子はachaete−scute複合体遺伝子発現の調節を介してDeltaを抑制する。E(spl)の発現は、Notch活性化の結果としてアップレギュレートされる。
インターロイキン−10(IL−10)は、Th1細胞によるサイトカイン産生を抑制することができる、Th2細胞によって産生される因子としてマウスで最初に特徴づけられた。その後、IL−10はマクロファージ、ケラチノサイト、B細胞、Th0細胞、およびTh1細胞を含む多数の他の細胞型によって産生されることが示された。IL−10は、現在はウイルスIL−10と表されるエプスタイン−バーbcrf1遺伝子と大きなホモロジーを示す。いくつかの免疫刺激効果が報告されているが、IL−10は主に免疫抑制性サイトカインと考えられている。T細胞応答のIL−10による阻害は、抗原提示細胞の付帯機能の低下を通じて主に媒介される。IL−10は特に、マクロファージによる数々の炎症促進性サイトカインの産生を抑制すること、および共刺激分子およびMHCクラスII発現を阻害することが報告されている。IL−10はまた、好中球および好酸球といった他の骨髄細胞に対して抗炎症作用を発揮する。B細胞に対しては、IL−10はアイソタイプ転換および増殖に影響する。より近年に、IL−10は調節T細胞の誘導において、およびその抑制作用の可能な媒介因子として、役割を果たすことが報告された。IL−10がNotchシグナル伝達経路の直接の下流の標的かどうかは不明であるが、その発現はNotch活性化と一致して強くアップレギュレートされることが見出されている。IL−10のmRNA配列はGenBank整理番号GI1041812に見出される。
CD−23は、B細胞活性化および増殖のための重要な分子であるヒト白血球分化抗原CD23(FCE2)である。CD−23はIgEに対する低親和性受容体である。さらに、短縮型分子を分泌することができ、その後、強力な細胞分裂誘起性増殖因子として機能する。CD−23の配列はGenBank整理番号GI1783344に見出される。
CTLA4(Tリンパ球活性化タンパク質4)は、T細胞の表面上に見出される付属分子であり、気道炎症細胞動員の調節およびアレルゲン吸入後のTヘルパー細胞分化に役割を果たすと考えられている。CTLA4をコードする遺伝子のプロモーター領域はCBF1応答配列を有し、その発現はNotch活性化の結果としてアップレギュレートされる。CTLA4の配列はGenBank登録番号L15006に見出される。
Dlx−1(distalless−1)(マクギネス(McGuinness)T.他(1996)Genomes 35(3);473−85 (McGuiness))発現は、Notch活性化の結果としてダウンレギュレートされる。Dlx遺伝子の配列はGenBank登録番号U51000−3に見出される。
CD−4発現は、Notch活性化の結果としてダウンレギュレートされる。CD−4抗原の配列はGenBank登録番号XM006966に見出される。
上記の通り、Notch受容体ファミリーは、T細胞運命決定に影響する細胞−細胞シグナル伝達現象に関与する。このシグナル伝達において、NotchICは核に局在化し、活性化された受容体として機能する。哺乳類NotchICは転写抑制因子CBF1と相互作用する。NotchIC cdc10/アンキリン反復はこの相互作用に必須であると提案されている。シェ(Hsieh)他 (Hsieh et al.(1996) Molecular & Cell Biology 16(3);952−959)は、マウスNotchICのN末端114アミノ酸領域はCBF1相互作用ドメインを含むとさらに示している。また、NotchICは核内のDNAに結合したCBF1を標的にし、抑制ドメインの遮蔽によりCBF1媒介抑制を止めることによって作用すると提案されている。エプスタイン・バーウイルス(EBV)不死化タンパク質EBNAもまた、CBF1拘束および抑制の遮蔽を利用して、CBF1に抑制されたB細胞遺伝子の発現をアップレギュレートすることが知られている。このように、Notchシグナル伝達の模倣が、EBVに導かれる不死化に関与する。ストローブル(Strobl)ら(Strobl et al (2000) J Virol 74(4);1727−35)は、同様に「EBNA2はしたがって、活性化されたNotch受容体の機能的同等物とみなしうる」ことを報告する。このカテゴリに入る他のEBVタンパク質は、BARF0(クサノ(Kusano)およびラーブ・トルアブ(Raab−Truab)(2001) J Virol 75(1);384−395 (Kusano and Raab−Traub))およびLMP2Aを含む。
Notchリガンドおよびホモログ
上記の通り、現在までに同定された哺乳類Notchリガンドの例は、Deltaファミリー、たとえばDelta−1(Genbank登録番号AF003522−ヒト(Homo sapiens))、Delta−3(Genbank登録番号AF084576−ラット(Rattus norvegicus))およびDelta−like3(マウス(Mus musculus))、Serrateファミリー、たとえばSerrate−1およびSerrate−2(国際公開第97/01571号パンフレット、国際公開第96/27610号パンフレットおよび国際公開第92/19734号パンフレット)、Jagged−1およびJagged−2(Genbank登録番号AF029778−ヒト(Homo sapiens))、およびLAG−2を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
上記の通り、現在までに同定された哺乳類Notchリガンドの例は、Deltaファミリー、たとえばDelta−1(Genbank登録番号AF003522−ヒト(Homo sapiens))、Delta−3(Genbank登録番号AF084576−ラット(Rattus norvegicus))およびDelta−like3(マウス(Mus musculus))、Serrateファミリー、たとえばSerrate−1およびSerrate−2(国際公開第97/01571号パンフレット、国際公開第96/27610号パンフレットおよび国際公開第92/19734号パンフレット)、Jagged−1およびJagged−2(Genbank登録番号AF029778−ヒト(Homo sapiens))、およびLAG−2を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
「ホモログ」によって、たとえば上述のような既知のNotchリガンドのうち任意の1つと、アミノ酸または核酸配列ホモロジーのどちらかである配列ホモロジーを示す遺伝子産物を意味する。典型的には、既知のNotchリガンドのホモログは、少なくとも10個、好ましくは少なくとも20個、好ましくは少なくとも50個、適切には少なくとも100個のアミノ酸、またはNotchリガンドの全長の配列にわたって、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、対応する既知のNotchリガンドとアミノ酸レベルで同一である。2つ以上のアミノ酸または核酸配列の間の配列ホモロジーを計算するための技術およびソフトウェアは本分野でよく知られている(たとえばhttp;//www.NCBI.nlm.nih.govおよびアウスベル(Ausubel)他,『分子生物学の最新プロトコル』(Current Protocols in Molecular Biology)(1995)、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社(John Wiley & Sons,Inc.)を参照)。
上記の通り、現在までに同定されたNotchリガンドは、タンパク質のアミノ末端に20ないし22アミノ酸を含む診断的なDSLドメインを(D=Delta、S=Serrate、L=Lag2)、および細胞外表面上に16まで、またはそれ以上のEGF様反復を有する。したがって、Notchリガンドのホモログはまた、N末端にDSLドメインを、および細胞外表面上に16まで、またはそれ以上のEGF様反復を含むことが好ましい。
加えて、適当なホモログは好ましくはNotch受容体と結合する能力がある。結合は、in vitro結合測定法を含む、本分野で既知であるさまざまな技術によって評価することができ、また受容体の活性化(作用因子または部分作用因子の場合)は、たとえば、本文書の実施例および、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第03/012441号パンフレット(ロランティス社(Lorantis))に記載された通りの測定法の使用によって測定することができる。
Notchリガンドのホモログは、いくつかの方法によって、たとえばゲノムライブラリまたはcDNAライブラリを、Notchリガンドをコードする核酸のすべてまたは一部を含むプローブを用いて、中等度または高度に厳密な条件下で(たとえば0.03M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム、約50℃ないし約60℃にて)プロービングすることによって同定することができる。代替として、ホモログはまた、保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログの中の配列を標的とするように設計されたプライマーを一般的に使用する縮重PCRを用いて得ることができる。そのプライマーは1つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いた配列クローニングに使用されるよりも低い厳密条件下で用いられる。
ポリペプチド物質は、哺乳類細胞から精製するか、適当な宿主細胞における組み換え発現によって得るか、または購入することができる。代替として、当該ポリペプチドをコードする核酸構造を用いることができる。別の一例として、DeltaまたはSerrateといったNotchまたはNotchリガンドの過剰発現は、SerrateまたはDelta遺伝子といった内因性遺伝子を活性化することができる核酸構造の導入によって引き起こすことができる。特に、遺伝子活性化は、標的細胞のゲノム中のSerrateまたはDeltaプロモーターといった天然プロモーターの代わりに異種プロモーターを挿入する、相同組み換えの利用によって達成することができる。
本発明の活性化する分子は、別の一実施形態では、Notch−タンパク質発現または細胞膜上の提示またはシグナル伝達経路を修飾することができる可能性がある。標的細胞表面上の完全に機能するNotch−タンパク質の提示を促進する物質は、ショウジョウバエ(Drosophila)のKuzbanian遺伝子の産物といったマトリクスメタロプロテイナーゼ(ドクツ(Dkuz)他(1997)Cell 90;271−280 (Dkuz))および他のADAMALYSIN遺伝子ファミリーメンバーを含む。
Notchリガンドドメイン
上記で考察した通り、Notch リガンドは典型的にはいくつかの特徴的なドメインを含む。さまざまな天然に存在するヒトNotchリガンドについての一部の予想/候補ドメイン位置(前駆タンパク質中のアミノ酸番号付けに基づく)を下記に示す:
上記で考察した通り、Notch リガンドは典型的にはいくつかの特徴的なドメインを含む。さまざまな天然に存在するヒトNotchリガンドについての一部の予想/候補ドメイン位置(前駆タンパク質中のアミノ酸番号付けに基づく)を下記に示す:
好ましくはDSLドメインは下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる:
ここで:
AROは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはヒスチジンといった芳香族アミノ酸残基である;
NOPは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンといった非極性アミノ酸残基である;
BASは、アルギニンまたはリジンといった塩基性アミノ酸残基である;および
ACMは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンといった酸またはアミドアミノ酸残基である。
AROは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはヒスチジンといった芳香族アミノ酸残基である;
NOPは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンといった非極性アミノ酸残基である;
BASは、アルギニンまたはリジンといった塩基性アミノ酸残基である;および
ACMは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンといった酸またはアミドアミノ酸残基である。
さまざまな起源に由来するNotchリガンドからのDSLドメインの整列を図3に示す。
使用するDSLドメインは、たとえばショウジョウバエ(Drosophila)、ツメガエル(Xenopus)、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはDSLドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトNotchリガンド配列に由来する。
適切には、たとえば、本発明における用途のためのDSLドメインは、ヒトJagged1のDSLドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのDSLドメインは、たとえば、ヒトJagged2のDSLドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのDSLドメインは、たとえば、ヒトDelta1のDSLドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのDSLドメインは、たとえば、ヒトDelta3のDSLドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのDSLドメインは、たとえば、ヒトDelta4のDSLドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
EGF様ドメイン
EGF様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含む、さまざまなタンパク質、およびEGFおよびNotchおよびNotchリガンドで見つかっている(フュリーおよびフュリー(Furie and Furie),1988,Cell 53;505−518)。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子IXおよびXといった細胞外タンパク質で(リーズ(Rees)他,1988,EMBO J.7;2053−2061;フュリーおよびフュリー(Furie and Furie),1988,Cell 53;505−518)、他のショウジョウバエ(Drosophila)遺伝子で(クヌースト(Knust)他,1987 EMBO J.761−766;ロスバーグ(Rothberg)他,1988,Cell 55;1047−1059)、およびトロンボモジュリン(スズキ(Suzuki)他,1987,EMBO J.6;1891−1897)およびLDL受容体(ズドホフ(Sudhof)他,1985,Science 228;815−822)といった一部の細胞表面受容体タンパク質で見つかっている。タンパク質結合部位が、トロンボモジュリンおよびウロキナーゼ中のEGF反復ドメインにマッピングされている(クロサワ(Kurosawa)他,1988,J.Biol.Chem 263;5993−5996;アペラ(Appella)他,1987,J.Biol.Chem.262;4437−4440)。
EGF様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含む、さまざまなタンパク質、およびEGFおよびNotchおよびNotchリガンドで見つかっている(フュリーおよびフュリー(Furie and Furie),1988,Cell 53;505−518)。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子IXおよびXといった細胞外タンパク質で(リーズ(Rees)他,1988,EMBO J.7;2053−2061;フュリーおよびフュリー(Furie and Furie),1988,Cell 53;505−518)、他のショウジョウバエ(Drosophila)遺伝子で(クヌースト(Knust)他,1987 EMBO J.761−766;ロスバーグ(Rothberg)他,1988,Cell 55;1047−1059)、およびトロンボモジュリン(スズキ(Suzuki)他,1987,EMBO J.6;1891−1897)およびLDL受容体(ズドホフ(Sudhof)他,1985,Science 228;815−822)といった一部の細胞表面受容体タンパク質で見つかっている。タンパク質結合部位が、トロンボモジュリンおよびウロキナーゼ中のEGF反復ドメインにマッピングされている(クロサワ(Kurosawa)他,1988,J.Biol.Chem 263;5993−5996;アペラ(Appella)他,1987,J.Biol.Chem.262;4437−4440)。
PROSITEによって報告された通り、典型的なEGFドメインは、(EGFにおいて)ジスルフィド結合に関与すると示されている6個のシステイン残基を含みうる。主構造は、二本鎖のβ−シートに続くループとその後のC末端の短い二本鎖のシートであると提案されているが必ずしも必要ではない。保存されたシステインの間のサブドメインは、典型的なEGF様ドメインの下記の模式図に示す通り、長さが大きく異なる;
ここで;
’C’;ジスルフィド結合に関与する保存されたシステイン。
’G’;しばしば保存されたグリシン
’a’;しばしば保存された芳香族アミノ酸
’x’;任意の残基
5番目と6番目のシステインの間の領域は、2個の保存されたグリシンを含み、そのうち少なくとも1個は大部分のEGF様ドメイン中に通常存在する。
’C’;ジスルフィド結合に関与する保存されたシステイン。
’G’;しばしば保存されたグリシン
’a’;しばしば保存された芳香族アミノ酸
’x’;任意の残基
5番目と6番目のシステインの間の領域は、2個の保存されたグリシンを含み、そのうち少なくとも1個は大部分のEGF様ドメイン中に通常存在する。
使用するEGF様ドメインは、たとえばショウジョウバエ(Drosophila)、ツメガエル(Xenopus)、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはEGF様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトNotchリガンド配列に由来する。
適切には、たとえば、本発明における用途のためのEGF様ドメインは、ヒトJagged1のEGF様ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのEGF様ドメインは、たとえば、ヒトJagged2のEGF様ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのEGF様ドメインは、たとえば、ヒトDelta1のEGF様ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのEGF様ドメインは、たとえば、ヒトDelta3のEGF様ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのEGF様ドメインは、たとえば、ヒトDelta4のEGF様ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
実際問題として、任意の特定のアミノ酸配列が別の配列と少なくともX%同一であるかどうかは、従来は既知のコンピュータープログラムを用いて決定することができる。たとえば、クエリー配列と対象配列との間の最良の全体の一致は、全体配列整列ともいうが、ブルトラグ(Brutlag)他(Comp.App.Biosci.(1990)6;237−245)のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムといったプログラムを用いて決定することができる。配列整列では、クエリー配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは、両方ともアミノ酸配列である。全体配列整列の結果は、パーセント同一性として与えられる。
「NotchリガンドN末端ドメイン」の語は、Notchリガンド配列の、N末端からDSLドメインの開始までの部分を意味する。この語は天然に存在するドメインに対応する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、およびミメティックを含むことが理解される。
適切には、たとえば、本発明における用途のためのNotchリガンドN末端ドメインは、ヒトJagged1のNotchリガンドN末端ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのNotchリガンドN末端ドメインは、たとえば、ヒトJagged2のNotchリガンドN末端ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのNotchリガンドN末端ドメインは、たとえば、ヒトDelta1のNotchリガンドN末端ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのNotchリガンドN末端ドメインは、たとえば、ヒトDelta3のNotchリガンドN末端ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
代替として、本発明における用途のためのNotchリガンドN末端ドメインは、たとえば、ヒトDelta4のNotchリガンドN末端ドメインに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
ここで用いられる「異種アミノ酸配列」または「異種ヌクレオチド配列」の語は、天然の配列またはそのコード配列には見出されない配列を意味する(たとえばNotchリガンド配列の場合には、天然のNotchリガンド配列には見出されない)。典型的には、たとえば、そのような配列は、IgFcドメイン、またはV5Hisタグといったタグでありうる。
Notchシグナル伝達阻害のためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
適切にはNotchシグナル伝達経路の阻害因子は、Notch受容体またはNotchリガンドと相互作用し、好ましくは結合して、内因性Notchリガンド−受容体相互作用(「Notch−Notchリガンド相互作用」ともいう)に干渉するが受容体を活性化しない、または活性化するが内因性Notchリガンドよりも程度が低い物質でありうる。そのような物質は、「Notch拮抗因子」または「Notch受容体拮抗因子」ということができる。好ましくはその阻害因子はリンパ球およびAPCといった免疫細胞で、好ましくはリンパ球で、好ましくはT細胞で、Notchリガンド−受容体相互作用を阻害する。
適切にはNotchシグナル伝達経路の阻害因子は、Notch受容体またはNotchリガンドと相互作用し、好ましくは結合して、内因性Notchリガンド−受容体相互作用(「Notch−Notchリガンド相互作用」ともいう)に干渉するが受容体を活性化しない、または活性化するが内因性Notchリガンドよりも程度が低い物質でありうる。そのような物質は、「Notch拮抗因子」または「Notch受容体拮抗因子」ということができる。好ましくはその阻害因子はリンパ球およびAPCといった免疫細胞で、好ましくはリンパ球で、好ましくはT細胞で、Notchリガンド−受容体相互作用を阻害する。
適切には、たとえば、一実施形態では、Notchシグナル伝達の調節因子は、1個のNotchリガンドDSLドメインおよび1個以上のNotchリガンドEGF様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。
代替的に、たとえば、Notchシグナル伝達の調節因子は、リガンド結合に関与するNotch細胞外ドメインの全部または一部、たとえば、好ましくはヒトNotch1、Notch2、Notch3またはNotch4のEGFドメインに対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%のアミノ酸配列類似性または同一性を有する1個のNotchEGF様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。好ましくは少なくとも2個以上のそのようなEGFドメインが存在する。このような物質は、内因性Notchリガンドと結合することができ、それによってそのようなリガンドによるNotch活性化を阻害することができる。
たとえば、Notchシグナル伝達のそのような阻害因子は、ヒトNotch1、Notch2、Notch3またはNotch4のEGF11に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するNotchEGF様ドメイン、および、ヒトNotch1、Notch2、Notch3またはNotch4のEGF12に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するNotchEGF様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。
たとえば、IgFcドメインと融合したNotchタンパク質の細胞外ドメインを含むさまざまな融合タンパク質/キメラが、たとえばR&Dシステムズ社(R&D Systems)から入手可能であり、たとえば下記の通り;Notch−1ラット組み換えラットNotch−1/Fcキメラ、(カタログ番号1057−TK−050);Notch−2組み換えラットNotch−2/Fcキメラ、(カタログ番号1190−NT−050);およびNotch−3マウス組み換えマウスNotch−3/Fcキメラ、(カタログ番号1308−NT−050)。
他のNotchシグナル伝達経路拮抗因子/阻害因子は、Notchシグナル伝達経路の成分間の相互作用を阻害する抗体、たとえばNotch受容体(Notchタンパク質)またはNotchリガンドに対する抗体を含む。
したがって、たとえば、Notchシグナル伝達の阻害因子は、Notch受容体を活性化することなくNotch受容体と結合する抗体、適切にはヒトNotch1、Notch2、Notch3および/またはNotch4と結合する抗体であって、それによって正常なNotch−リガンド相互作用に干渉することで、内因性Notchリガンドによる結合した受容体の活性化を低下させるかまたは阻害する抗体でありうる。
代替として、たとえば、Notchシグナル伝達の阻害因子は、Notchリガンドと結合する抗体、適切にはヒトDelta1、Delta3および/またはDelta4またはヒトJagged1および/またはJagged2と結合する抗体であって、それによって正常なNotch−リガンド相互作用に干渉することで、結合したリガンドの内因性Notch受容体との相互作用を低下させるかまたは阻害する抗体でありうる。
たとえば、NotchおよびNotchリガンドに対する抗体は、米国特許第5648464号明細書、米国特許第5849869号明細書、および米国特許第6004924号明細書(エール大学/インペリアル・キャンサー・テクノロジー(Imperial Cancer Technology))に記載されており、その本文は参照により本開示に含まれる。
Notch受容体に対して作製された抗体もまた、国際公開第0020576号パンフレット(その本文は参照により本開示に含まれる)に記載されている。たとえば、この文書はヒトNotch−1 EGF様反復11および12に対する抗体の作製を開示する。たとえば、特定の実施形態で、国際公開第0020576号パンフレットは、ATCC登録番号HB12654を有しA6で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、ATCC登録番号HB12656を有しCllで表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、およびATCC登録番号HB12655を有しF3で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体を開示する。
抗ヒト−Jagged1抗体はR&Dシステムズ社(R&D Systems,Inc)から整理番号MAB12771(クローン188323)として入手可能である。
適当な核酸配列は、アンチセンス構造、たとえばアンチセンスNotchリガンド構造およびNotchリガンド発現のアップレギュレーターの発現を低下または阻害するように設計されたアンチセンス構造をコードする核酸配列を含みうる(上記参照)。アンチセンス核酸は合成一本鎖DNAのようなオリゴヌクレオチドであることができる。しかし、より好ましくは、アンチセンスは遺伝子ベクターの導入の結果として患者自身の細胞で産生されたアンチセンスRNAである。ベクターは、宿主細胞へのベクターの導入に際して、目的の特異性のアンチセンスRNAの産生を担う。
好ましくは、本発明における用途のための核酸配列は、SerrateおよびDelta、好ましくはSerrate1およびSerrate2、同様にDelta1、Delta3およびDelta4発現を、樹状細胞といったAPCにおいて阻害することができる。特に、その核酸配列は、APCsまたはT細胞においてSerrate発現を阻害できるがDelta発現は阻害できない、または、Delta発現を阻害できるがSerrate発現は阻害できないことがありうる。代替的に、本発明における用途のための核酸配列は、CD4+ヘルパーT細胞といったT細胞、または、Deltaを発現する免疫系の他の細胞におけるDelta発現を阻害することができる(たとえば細胞表面受容体の刺激に反応して)。特に、その核酸配列は、T細胞においてDelta発現を阻害することができるがSerrate発現は阻害できないことがありうる。特に好ましい一実施形態では、その核酸配列はT細胞およびAPCの両方でNotchリガンド発現を阻害することができ、たとえばAPCにおいてSerrate発現を、およびT細胞においてDelta発現を阻害することができる。
Notchシグナル伝達の阻害のための分子はまた、Notch−タンパク質発現または細胞膜上の提示またはシグナル伝達経路を改変することができるポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドも含む。完全に機能する細胞膜タンパク質としての提示を減少させるかまたはそれに干渉する分子は、ヒドロキサム酸(hydroxymate)系阻害因子といったMMP阻害因子を含むことができる。
NotchとNotchリガンドとの間の相互作用を低下させるために用いることができる他の物質は、外因性NotchまたはNotchリガンドまたはその機能性誘導体である。そのようなNotchリガンド誘導体は、好ましくはN末端にDSLドメインを、および好ましくは約14個までまたはそれ以上、たとえば約3ないし8個のEGF様反復を細胞外表面上に有する。hJagged1のDelta/Serrate/LAG−2ドメインに対応するペプチド、および、hJagged1の細胞外部分の可溶性型を発現しているCOS細胞由来の上清は、Notch1の阻害においてJagged1の作用を模倣することが見出された(リー(Li))。
ポリペプチド、タンパク質、およびアミノ酸配列
ここで用いられる「アミノ酸配列」の語は、「ポリペプチド」の語および/または「タンパク質」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「ペプチド」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「タンパク質」の語と同義である。
ここで用いられる「アミノ酸配列」の語は、「ポリペプチド」の語および/または「タンパク質」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「ペプチド」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「タンパク質」の語と同義である。
「ペプチド」は通常、アミノ酸10個ないし40個の長さ、好ましくはアミノ酸10個ないし35個の、短いアミノ酸配列をいう。
アミノ酸配列は適当な起源から調製および単離することができ、または合成によって作製することができ、または組み換えDNA技術を用いて調製することができる。
本発明で有用な「タンパク質」の定義内で、問題のタンパク質がその内因性機能の少なくとも1つを保持するような方法で、特定のアミノ酸残基を修飾することができ、そのような修飾タンパク質を「変異体」という。変異体タンパク質は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも一個のアミノ酸の付加、欠失、および/または置換によって修飾されうる。
典型的には、修飾された配列が、必要な標的活性を、またはNotchシグナル伝達を調節する能力を保持するという条件で、アミノ酸置換を、たとえば1、2または3ないし10または20個の置換を行うことができる。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含みうる。
本発明で有用であるタンパク質はまた、サイレント変異を生じおよび機能的に等価のタンパク質を結果として生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しうる。標的または調節機能が保持される限り、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または残基の両親媒的性質における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行いうる。たとえば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む;正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含む;および、同様の親水性値を有する、非荷電の極性頭部基を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
ここで用いられる「タンパク質」の語は、一本鎖ポリペプチド分子、および個々の構成ポリペプチドが共有または非共有的方法によって結合している複数ポリペプチド複合体を含む。ここで用いられる「ポリペプチド」および「ペプチド」の語は、モノマーがアミノ酸であってペプチドまたはジスルフィド結合を介して結びついているポリマーをいう。サブユニットおよびドメインの語はまた、生物学的機能を有するポリペプチドおよびペプチドをいうことができる。本発明で有用なペプチドは、少なくとも標的またはシグナル伝達調節能力を有する。「断片」はまた変異体でありその語は典型的には、結合測定法で対象であり、その結合相手が既知であるかまたは測定可能な、タンパク質の選択された領域をいう。「断片」はしたがって、完全長ポリペプチドの一部、たとえば長さが約8ないし約1500アミノ酸、典型的には長さが約8ないし約745アミノ酸、好ましくは約8ないし約300、より好ましくは約8ないし約200アミノ酸、およびさらにより好ましくは長さが約10ないし約50または100アミノ酸であるアミノ酸配列をいう。「ペプチド」は好ましくはアミノ酸10個ないし40個の長さ、好ましくはアミノ酸10個ないし35個の、短いアミノ酸配列をいう。
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発といった標準的な組み換えDNA技術を用いて調製することができる。挿入を行う場合は、挿入部位の両側に天然に存在する配列に対応する5’および3’隣接領域と共に挿入部をコードする合成DNA。配列を適当な酵素を用いて切断することができ、合成DNAを切断部に繋ぐことができるように、隣接領域は、天然に存在する配列中の部位に対応する便利な制限部位を含む。コードされたタンパク質を作製するために、DNAをその後に本発明にしたがって発現させる。これらの方法は、DNA配列の操作について本分野で既知である数々の標準技術の単なる例であり、他の既知の技術もまた用いることができる。
ヌクレオチド配列の変異体もまた作製することができる。そのような変異体は好ましくはコドンが最適化された配列を含む。コドン最適化は、RNA安定性、および、したがって遺伝子発現を増大させる方法として本分野で既知である。遺伝子コードの冗長性は、いくつかの異なるコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性があることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、およびセリンはそれぞれ、6種類の異なるコドンによってコードされる。異なる生物はその異なるコドンの使用に優先性を示す。たとえば、HIVといったウイルスは、多数の稀なコドンを用いる。稀なコドンが対応する一般的に用いられる哺乳類コドンで置換されるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳類標的細胞における当該配列の発現増加を達成することができる。哺乳類細胞およびさまざまな他の生物について、コドン用法表は本分野で既知である。
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列(HISオリゴマー、免疫グロブリンFc、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、FLAGなどといった)を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断(たとえば化学的にまたは酵素的に)して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり(IgFc融合タンパク質の場合のように)、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
Notchシグナル伝達の調節因子または抗原/抗原決定基がヌクレオチド配列を含む場合、それは適切には、哺乳類細胞における発現のためにコドンを最適化されたものでありうる。好ましい一実施形態では、そのような配列は全体が最適化されている。
核酸およびポリヌクレオチド
一実施形態ではNotchシグナル伝達の調節因子は、ポリヌクレオチド、たとえばDeltaまたはSERRATEといったNotchリガンドまたはその活性部分をコードするポリヌクレオチドであることができる。適切には、たとえば、そのようなポリヌクレオチドは、NotchリガンドDSLドメインおよび少なくとも1個のEGFドメイン、好ましくは少なくとも3個のEGFドメインをコードすることができる。好ましくはそのポリヌクレオチドはまた、Notchリガンド膜貫通ドメインおよび好ましくはまたNotchリガンド細胞内ドメインもコードすることができる。
一実施形態ではNotchシグナル伝達の調節因子は、ポリヌクレオチド、たとえばDeltaまたはSERRATEといったNotchリガンドまたはその活性部分をコードするポリヌクレオチドであることができる。適切には、たとえば、そのようなポリヌクレオチドは、NotchリガンドDSLドメインおよび少なくとも1個のEGFドメイン、好ましくは少なくとも3個のEGFドメインをコードすることができる。好ましくはそのポリヌクレオチドはまた、Notchリガンド膜貫通ドメインおよび好ましくはまたNotchリガンド細胞内ドメインもコードすることができる。
そのようなポリヌクレオチドは、たとえばDNAワクチン接種などといった従来のDNA配送手法によって投与することができ、または注射することができ、または他の方法でたとえば針を用いない系によって配送することができる。非ウイルス配送機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物(CFAs)およびその組み合わせを含む。そのような配送機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも長さ10塩基で最大10,000塩基以上のヌクレオチドの高分子型で、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾形をいう。その語はDNAおよびRNAの一本鎖および二本鎖型、およびタンパク質核酸(PNA)といった誘導体化型も含む。
これらは標準的な組み換えDNA方法論を用いて構築することができる。核酸はRNAまたはDNAであることができ、好ましくはDNAである。RNAである場合は、操作はcDNA中間体を用いて実施することができる。一般的に、第一の領域をコードする核酸配列が調製され、適当な制限部位が5’および/または3’末端に与えられる。便利に配列はpBR322またはpUC19を基礎とするプラスミドベクターといった標準の実験ベクター中で操作される(下記参照)。適当な技術の正確な詳細については、サムブルック(Sambrook)他著の『分子クローニング』(Molecular Cloning)(コールド・スプリング・ハーパー社(Cold Spring Harbor),1989)または同様の標準的参考書を参照することができる。
第二の領域をコードする核酸は同様に、類似のベクター系において提供することができる。
核酸の起源は、公表文献または、GenBankのようなデータバンクへの参照によって確認することができる。目的の第一または第二の配列をコードする核酸は、起源が材料を提供してくれる場合は学術的起源または商業起源から、または配列データのみが利用可能である場合は適当な配列を合成またはクローニングすることによって、入手することができる。一般的にこれは問題の遺伝子のクローニングを記載する文献情報源を参照することによって行うことができる。
代替として、利用可能な配列データが限られている場合、または、既知の核酸と相同であるか、でなければ関連した核酸を発現したい場合は、本分野で既知である核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として、典型的な核酸を特徴づけることができる。
数々の異なるヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明に用いられる同一のタンパク質をコードすることができることが当業者に理解される。加えて、当業者は、通常の技術を用いて、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質に影響しないヌクレオチド置換を行って、標的タンパク質または本発明のNotchシグナル伝達調節のためのタンパク質が発現される任意の特定の宿主生物のコドン用法を反映することができることが理解される。
一般的に、本発明で用いられるヌクレオチド配列に関する「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」の語は、結果として生じるヌクレオチド配列がNotchシグナル伝達の調節因子をコードし対応する活性を保持するという条件で、当該配列からまたは当該配列への一個(以上)の核酸の、任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。
上記に示す通り、配列ホモロジーに関して、好ましくは参照配列に対して少なくとも40%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%のホモロジーが存在する。より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%のホモロジーが存在する。ヌクレオチドホモロジー比較は上記の通り実施することができる。好ましい配列比較プログラムは上記のGCGウィスコンシン・ベストフィット(GCG Wisconsin Bestfit)プログラムである。初期設定のスコアリングマトリクスは同一のヌクレオチドごとに10、およびミスマッチごとに−9の一致値を有する。初期設定のギャップ生成失点は−50であり、初期設定のギャップ延長失点はヌクレオチド当たり−3である。
本発明はまた、選択的に参照配列、またはその任意の変異体、断片または誘導体、または上記のいずれかの相補鎖とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも長さが15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さが20、30、40または50ヌクレオチドである。
ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、「それによって、核酸鎖が相補鎖と塩基対形成により結びつく過程」およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術で実施される増幅の過程を含むものとする。
ここに示すヌクレオチド配列と、またはその相補鎖と、選択的にハイブリダイズすることができる、本発明で有用であるヌクレオチド配列は、一般的に、ここに示す対応するヌクレオチド配列と、少なくとも20、好ましくは少なくとも25または30、たとえば少なくとも40、60または100以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも75%、好ましくは少なくとも85または90%、およびより好ましくは少なくとも95%または98%相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、好ましくはそのヌクレオチド配列と少なくとも80または90%およびより好ましくは少なくとも95%相同である、そのヌクレオチド配列と相同な領域を含む。
「選択的にハイブリダイズ可能な」の語は、プローブとして用いられるヌクレオチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブとハイブリダイズすることが見出されている条件下で用いられることを意味する。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、たとえば、スクリーニングされているcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリ中に存在する他のヌクレオチド配列のために起こりうる。この現象において、バックグラウンドとはプローブとライブラリの非特異的DNAメンバーとの間の相互作用によって生じる、標的DNAとで観察される特異的相互作用よりも強度が10倍小さい、好ましくは100倍小さいシグナルのレベルを意味する。相互作用の強度は、たとえば32Pを用いてプローブを放射性標識することによってたとえば測定することができる。
ハイブリダイゼーション条件は、ベルガー(Berger)およびキンメル(Kimmel)(1987,『分子クローニング技術の手引き』(Guide to Molecular Cloning Techniques),Methods in Enzymology,Vol 152,アカデミックプレス社(Academic Press)、米国カリフォルニア州サンディエゴ)に示された通り、核酸結合複合体の融点(Tm)に基づいており、下記に説明する「厳密性」を与える。
最大の厳密性は典型的には約Tm−5℃(プローブのTmの5℃下)で生じる;高い厳密性はTmの約5℃ないし10℃下で;中等度の厳密性はTmの約10℃ないし20℃下で;および低い厳密性はTmの約20℃ないし25℃下で生じる。当業者によって理解される通り、最大厳密性のハイブリダイゼーションを用いて同一のヌクレオチド配列を同定または検出することができる一方、中等度(または低)厳密性ハイブリダイゼーションを用いて類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
好ましい一態様では、本発明は、厳密条件下で(たとえば65℃および0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl、0.015Mクエン酸Na3、pH7.0)本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合は、二重鎖の両方の鎖が、個別にまたは組み合わせで、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列もまた本発明の範囲内に含まれることが理解される。
ヌクレオチド配列はいくつかの方法で得ることができる。ここに記載された配列の変異体は、たとえばある範囲の起源から作製されたDNAライブラリをプロービングすることによって得ることができる。加えて、他のウイルス/細菌または細胞ホモログ、特に哺乳類細胞(たとえばラット、マウス、ウシ、および霊長類細胞)で見出される細胞ホモログを得ることができ、そのようなホモログおよびその断片は一般的に、ここで配列一覧中に示された配列と選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種に由来するゲノムDNAライブラリまたはそれから作製されたcDNAライブラリをプロービングし、そのようなライブラリを、参照ヌクレオチド配列の全部または一部を含むプローブを用いて、中等度ないし高厳密性の条件下でプロービングすることによって得ることができる。同様の検討が、本発明で有用なアミノ酸および/またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。
変異体および系統/種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重(degenerate)PCRを用いて得ることができる。保存された配列は、たとえば、いくつかの変異体/ホモログに由来するアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。配列の整列は、本分野で既知であるソフトウェアを用いて実施することができる。たとえばGCGウィスコンシン・パイルアップ(GCG Wisconsin PileUp)プログラムは広く用いられている。縮重PCRに使用されるプライマーは、1つ以上の縮重部位を含み、既知の配列に対する単一の配列プライマーを使用する配列クローニングに用いられるよりも低い厳密性条件で用いられる。
代替として、そのようなヌクレオチド配列は、特徴づけられた配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえば、ヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞についてコドン優先性を最適化するため、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされるNotchシグナル伝達の調節因子の活性を変化させるため、他の配列変化が望まれる可能性がある。
本発明で有用であるDNAポリヌクレオチドといったヌクレオチド配列は、組み換えによって、合成によって、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。配列はまた標準的技術によってクローニングすることができる。一般的に、プライマーは、目的の核酸配列の、一度にヌクレオチド一個の段階的製法を含む合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は本分野で容易に利用可能である。
より長いヌクレオチド配列は、一般的に組み換え手段を用いて、たとえばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)クローニング技術を用いて作製される。これは、クローニングを望む標的配列の領域に隣接する一対のプライマー(たとえば約15ないし30ヌクレオチドの)を作製し、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたmRNAまたはcDNAと接触させ、目的領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施し、増幅された断片を単離し(たとえばアガロースゲル上で反応混合物を精製することによって)、増幅されたDNAを回収することを含む。増幅されたDNAを適当なクローニングベクターへクローニングすることができるように、プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。より大きな遺伝子については、この方法で一部を別々にクローニングし、その後に繋いで完全な配列を形成することができる。
タンパク質およびポリペプチド発現
組み換え産生のためには、宿主細胞を遺伝子操作して発現系または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はデービス(Davis)他およびサムブルック(Sambrook)他といった多数の標準的な実験手引書に記載された通りの、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、および感染といった方法によって実施することができる。そのような方法はまた、in vitroまたはin vivoで薬物配送系として使用することもできることが理解される。
組み換え産生のためには、宿主細胞を遺伝子操作して発現系または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はデービス(Davis)他およびサムブルック(Sambrook)他といった多数の標準的な実験手引書に記載された通りの、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、および感染といった方法によって実施することができる。そのような方法はまた、in vitroまたはin vivoで薬物配送系として使用することもできることが理解される。
適当な宿主の代表的な例は、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス、および枯草菌(Bacillus subtilis)細胞といった細菌細胞;酵母細胞およびアスペルギルス(Aspergillus)細胞といった真菌細胞;ショウジョウバエ(Drosophila)S2およびヨトウガ(Spodoptera)Sf9細胞といった昆虫細胞;CHO、COS、NSO、HeLa、C127、3T3、BHK、293およびBowesメラノーマ細胞といった動物細胞;Jurkat細胞といったT細胞株;A20細胞といったB細胞株;および植物細胞を含む。
本発明で有用なポリペプチドを産生するためには、幅広い発現系を用いることができる。そのようなベクターは、中でも、染色体由来、エピソーム由来、およびウイルス由来ベクター、たとえば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入配列由来、酵母染色体配列由来、バキュロウイルス、SV40といったパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、オーエスキー病ウイルスおよびレトロウイルスといったウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファージミドといったプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子に由来するもののようなその組み合わせに由来するベクターを含む。発現系構造は、発現を調節すると共に引き起こす調節領域を含むことができる。一般的に、ポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現するためにおよび/または宿主においてポリペプチドを発現するために適当な任意の系またはベクターを、この際に発現のために用いることができる。適当なDNA配列は、たとえば、サムブルック(Sambrook)他に示されたもののような幅広い既知で通常の技術のうち任意のものによって発現系に挿入することができる。
翻訳されたタンパク質の、小胞体内腔へ、細胞膜周辺腔へ、または細胞外環境への分泌のために、適当な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であることができ、または異種シグナルであることができる。
本発明における使用のための活性物質は、組み換え細胞培養から、硫安またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法によって回収および精製することができる。非常に好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離および/または精製の間に変性する場合は、タンパク質再折りたたみのための技術を用いて活性立体構造を再生することができる。
測定法
ある物質を、Notch−Notchリガンド発現を調節するのに用いることができるかどうかは、適当なスクリーニング測定法を用いて測定することができる。
ある物質を、Notch−Notchリガンド発現を調節するのに用いることができるかどうかは、適当なスクリーニング測定法を用いて測定することができる。
たとえば、Notchシグナル伝達に適当なHES−1/ルシフェラーゼレポーター測定法は、たとえば、バーナム・フィニー(Varnum−Finney)他,Journal of Cell Science 113,4313−4318(2000)に記載されている。
Notchシグナル伝達はまた、タンパク質測定法によって、または核酸測定法によって監視することができる。Notch受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解切断、および細胞核へのその移動に繋がる。ここでいう「検出可能なシグナル」は、Notchの切断された細胞内ドメインの存在に帰することができる任意の検出可能な徴候であることができる。したがって、Notchシグナル伝達の増加は、切断されたNotchドメインの細胞内濃度を測定することによって、タンパク質レベルで評価することができる。Notch受容体の活性化はまた、一連の下流の反応を触媒し、ある種の明確な遺伝子の発現のレベルの変化に繋がる。したがって、Notchシグナル伝達の増加は、たとえば特定のmRNAの細胞内濃度を測定することによって、核酸レベルで評価することができる。本発明の好ましい一実施形態では、測定法はタンパク質測定法である。本発明の別の好ましい一実施形態では、測定法は核酸測定法である。
核酸測定法を用いることの利点は、核酸測定法は高感度であり少量の試料を分析することができることである。
任意の時間に測定された、特定のmRNAの細胞内濃度は、対応する遺伝子のその時点での発現レベルを反映する。したがって、Notchシグナル伝達経路の下流標的遺伝子のmRNAのレベルは、免疫系のT細胞の間接的測定によって測定することができる。特に、Deltex、Hes−1および/またはIL−10mRNAのレベルの上昇はたとえば誘導された免疫反応不顕性を示しうる一方、Dll−1またはIFN−γmRNAのレベルまたはIL−2、IL−5およびIL−13といったサイトカインをコードするmRNAのレベルの上昇は反応性の改善を示しうる。
さまざまな核酸測定法が既知である。既知であるかまたは後に開示される任意の従来の技術を用いることができる。適当な核酸測定法の例は下記に示され、増幅、PCR、RT−PCR、RNase保護、ブロッティング、分光分析、レポーター遺伝子測定法、遺伝子チップアレイおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
特に、遺伝子の存在、増幅および/または発現は、試料中で直接に、たとえば、従来のmRNAの転写を定量するサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング(DNAまたはRNA分析)、またはin situハイブリダイゼーションによって、適当に標識化されたプローブを用いて測定することができる。当業者は必要に応じて、これらの方法をどのように改変しうるかを容易に考えることができる。
PCRは最初は、不純な試料からDNAを増幅する手段として開発された。その技術は、反応溶液を繰り返し加熱および冷却してプライマーを標的配列とアニーリングさせる温度サイクル、および複製娘鎖の形成のためのそれらのプライマーの伸長に基づく。RT−PCRは、逆転写酵素を用いた最初のcDNA鎖の生成に、RNAテンプレートを用いる。cDNAはその後、標準のPCR手順に従って増幅する。合成および変性の繰り返しサイクルの結果として、生じる標的DNAのコピー数の指数的増加が起こる。しかし、反応成分が限られてくるにつれ、増幅の速度は低下して停滞状態に達し、その後はPCR産物の正味の増加はほとんどまたは全く無い。核酸標的の開始コピー数が多いほど、この「終点(エンドポイント)」に到達するのは早い。
リアルタイムPCRは、蛍光タグまたは蛍光色素で標識化されたプローブを用い、一定数のサイクル後の産物蓄積の測定のためでなく、蓄積していくPCR産物を検出するために用いられるという点で、定量測定のためのエンドポイントPCRとは異なる。反応は、標的配列の増幅が蛍光の有意な増加によって最初に検出される際のサイクル反応中の時点によって特徴づけられる。
リボヌクレアーゼ保護(RNase保護)測定法は、溶液中の特定のRNAの定量のための極めて高感度な技術である。リボヌクレアーゼ保護測定法は、標的として細胞RNA全体またはポリ(A)−選択されたmRNAについて実施することができる。リボヌクレアーゼ保護測定法の感度は、高い比活性で放射性標識された相補in vitro転写物プローブの使用に由来する。プローブおよび標的RNAは溶液中でハイブリダイズされ、その後、混合物は希釈されてリボヌクレアーゼ(RNase)で処理され、残っている一本鎖RNAすべてが分解される。プローブのハイブリダイズした部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動とその後のオートラジオグラフィーによって可視化することができる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるため、リボヌクレアーゼ保護測定法を用いてmRNA特性を正確にマッピングすることができる。プローブが標的RNAに関して過剰なモル数でハイブリダイズされるならば、結果として生じるシグナルは試料中の相補RNAの量に正比例する。
遺伝子発現はまた、レポーター系を用いて検出することができる。そのようなレポーター系は、発現系、たとえば監視される遺伝子の調節下にある、容易に同定可能なマーカーを含むことができる。FACSによって検出および選別が可能である蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはGFPおよびルシフェラーゼである。別の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカー、すなわち細胞表面上に発現されしたがって容易に同定可能であるタンパク質である。
一般的に、レポーター遺伝子の発現によってNotchシグナル伝達を検出するために有用なレポーター構造は、サムブルック(Sambrook)他(1989)の一般的教示に従って構築することができる。典型的には、本発明に記載の構造は、目的の遺伝子によるプロモーター、およびたとえばGFPまたはルシフェラーゼのような目的のレポーター構造をコードするコード配列を含む。GFPおよびルシフェラーゼをコードするベクターは本分野で既知でありまた市販されている。
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上記に例示された通り、本分野で既知である任意の技術によって実施することができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリーまたはFACSによって選別することができる。全般的参考には、『フローサイトメトリーおよびセルソーティング:実験の手引き』(Flow Cytometry and Cell Sorting:A Laboratory Manual)(1992)A.ラドブルーフ(Radbruch)(編)、スプリンガー・ラボラトリー(Springer Laboratory)、ニューヨーク、を参照。
フローサイトメトリーは、細胞を研究および精製するための強力な方法である。フローサイトメトリーは特に免疫学および細胞生物学で幅広い用途を見出している:しかし、FACSの能力は生物学の他の多数の分野で応用することができる。頭文字のF.A.C.S.はFluorescence Activated Cell Sorting(蛍光活性化細胞選別)を表し、「フローサイトメトリー」と相互に交換可能に用いられる。FACSの原理は、液体の細流中にある個々の細胞に一種類以上のレーザー光線を通過させると、光の散乱が起こり蛍光色素がさまざまな周波数で光を放出することである。光電子増倍管(PMT)が光を電気シグナルに変換し、電気シグナルはソフトウェアで処理されて、当該細胞についてのデータを生成する。明確な特徴を持つ細胞の部分集団を特定して、懸濁液から非常に高純度で(〜100%)自動的に選別することができる。
FACSを用いて、ポリペプチドをコードする組み換えDNAをトランスフェクションした細胞における遺伝子発現を測定することができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接的に、または、当該構造中のレポーター遺伝子を用いることによって間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例はβ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)である。β−ガラクトシダーゼ活性はFACSによって、フルオレセインジガラクトシド(FDG)といった蛍光基質を用いて検出することができる。FDGは低張ショックによって細胞に導入され、酵素によって切断されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕捉される。1つの酵素がしたがって大量の蛍光産物を生じることができる。GFP構造を発現している細胞は基質の添加無しで蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが同一のチャンネルで蛍光を発するGFPの突然変異体が入手可能である。2レーザーFACS装置では、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって2種類のトランスフェクションを同時に測定することができる。
細胞選別の別の方法もまた使用することができる。たとえば、本発明は、mRNAと相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現している細胞を個別に同定することができ、そのため細胞をその後に手作業でまたはFACS選別を用いて選別することができる。mRNAと相補的な核酸プローブは、上記に示す教示に従って、サムブルック(Sambrook)他(1989)によって記載された一般的手順を用いて調製することができる。
好ましい一実施形態では、本発明は、mRNAと相補的な、FACS細胞選別に使用することができる蛍光団と結合した、アンチセンス核酸分子の使用を含む。
遺伝子発現および同一性についての情報を、いわゆる遺伝子チップアレイまたは高密度DNAアレイを用いて得るための方法もまた記載されている(チー(Chee))。これらの高密度アレイは、診断および予測診断目的に特に有用である。In Vivo発現技術(IVET)もまた利用することができる(カミリ(Camilli))。IVETは、実験室培養と比較して、たとえば治療または疾患の際にアップレギュレートされる遺伝子を特定する。
タンパク質測定法を用いることの利点は、Notch活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる測定法技術は当業者によく知られている。そのような測定法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、FACS、およびELISA測定法を含む。
上述の通り、Notchシグナル伝達の調節因子はまた、Notch、Notchリガンド、またはNotchシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社(Lorantis Ltd)の名義の国際公開第00/36089号パンフレットに記載されるように、容易に調製することができる。
ある物質を、Notch−Notchリガンド相互作用を調節するために用いることができるかどうかは、たとえば、英国特許第0118153.6号の優先権を主張する国際公開第03/011317号パンフレット(ロランティス社(LorantisLtd))に記載されるように、適当なスクリーニング測定法を用いて判断することができる。
上述の通り、Notchシグナル伝達の調節因子はまた、Notch、Notchリガンド、またはNotchシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社(Lorantis Ltd)の名義の国際公開第00/36089号パンフレットに記載されるように、容易に調製することができる。
初回抗原刺激を受けたAPCおよびリンパ球の調製
本発明の一態様によると、免疫細胞を用いて抗原またはアレルゲンを提示することができるおよび/または免疫細胞を処理してNotch、NotchリガンドまたはNotchシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞(APC)を、DMEMまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清といった血清の存在下で、培養することができる。サイトカインの最適濃度は滴定によって決定することができる。Notchシグナル伝達の1つ以上の調節因子、およびインターフェロンを、その後典型的には培地に、目的の抗原(または抗原決定基)と共に、添加する。抗原は、当該物質の前、後、またはそれと実質的に同時に、添加することができる。細胞は典型的には、当該物質および抗原と共に、少なくとも1時間、好ましくは少なくとも3時間、好ましくは少なくとも12または少なくとも24時間、約37℃にて培養する。必要に応じて、細胞の少量を、標的遺伝子発現の調節について上記の通り試験することができる。代替として、国際公開第98/20142号パンフレットに記載の通り、細胞活性はT細胞活性化の阻害によって、表面マーカー、サイトカイン分泌または増殖を監視することで測定することができる。
本発明の一態様によると、免疫細胞を用いて抗原またはアレルゲンを提示することができるおよび/または免疫細胞を処理してNotch、NotchリガンドまたはNotchシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞(APC)を、DMEMまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清といった血清の存在下で、培養することができる。サイトカインの最適濃度は滴定によって決定することができる。Notchシグナル伝達の1つ以上の調節因子、およびインターフェロンを、その後典型的には培地に、目的の抗原(または抗原決定基)と共に、添加する。抗原は、当該物質の前、後、またはそれと実質的に同時に、添加することができる。細胞は典型的には、当該物質および抗原と共に、少なくとも1時間、好ましくは少なくとも3時間、好ましくは少なくとも12または少なくとも24時間、約37℃にて培養する。必要に応じて、細胞の少量を、標的遺伝子発現の調節について上記の通り試験することができる。代替として、国際公開第98/20142号パンフレットに記載の通り、細胞活性はT細胞活性化の阻害によって、表面マーカー、サイトカイン分泌または増殖を監視することで測定することができる。
上で述べた通り、APC中でポリペプチドの発現を可能にする条件下でポリペプチドをコードする核酸構造/ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をAPCへ投与することができる。同様に、抗原をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってAPCへ導入することができる。結果として生じる、Notchシグナル伝達のレベル上昇を示すAPCがこれで使用可能な状態である。
下記の技術はT細胞に関して説明されているが、B細胞にも等しく適用可能である。使用した技術は、T細胞が一般的にAPCと共培養されること以外は、APC単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたAPCをまず作製し、次いでそれをT細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたAPCが一旦作製されると、それを沈澱させPBSで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。これは、たとえばAPCについて用いられたのとは異なる物質でT細胞を処理したい場合に、APCに用いられた別の物質とT細胞が接触させられることがないという利点を有する。代替として、T細胞をNotchシグナル伝達を調節する第一の物質(または物質の組)とインキュベートし、洗浄し、再懸濁し、次いでAPCを調節するために用いられた物質およびT細胞を調節するために用いられた物質の両方の非存在下で、初回抗原刺激を受けたAPCとインキュベートすることができる。代替的に、抗TCR抗体(たとえば抗CD3)といったAPC代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体(たとえば抗CD28)と共にまたはそれ無しで、T細胞をAPCの非存在下で培養して初回抗原刺激することができ、または代替的にT細胞をMHC−ペプチド複合体(たとえば四量体)で活性化することができる。
インキュベートは典型的には、適当な培地中で37℃にて、少なくとも1時間、好ましくは少なくとも3または6または12または24時間またはそれ以上とする。免疫寛容の誘導といった免疫反応の改変は、続いてT細胞に抗原を負荷し、APCに曝露されていない対照細胞と比較してIL−2産生を測定することによって測定することができる。
この方法で初回抗原刺激を受けたT細胞またはB細胞は、本発明にしたがって、他のT細胞またはB細胞において免疫寛容を誘導するのに用いることができる。
治療可能な症状
好ましくは免疫系の調節はT細胞活性の調節による。特に、本発明はT細胞に媒介される疾患および感染の治療に用いることができる。T細胞によって媒介されると説明されうる疾患状態または感染状態は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発されるT細胞系の異常、および、マラリア原虫(Plasmodium)の種、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、HIV、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコッカス、B型インフルエンザ(ヘモフィルス・インフルエンザB型)、麻疹、C型肝炎または回虫によって引き起こされるものといった感染症のいずれか1つ以上を含むがこれらに限定されない。このように、治療または予防されうる、T細胞によって媒介される特定の症状は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、および糖尿病を含む。本発明はまた、臓器移植術または骨髄移植術に用いることができる。
好ましくは免疫系の調節はT細胞活性の調節による。特に、本発明はT細胞に媒介される疾患および感染の治療に用いることができる。T細胞によって媒介されると説明されうる疾患状態または感染状態は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発されるT細胞系の異常、および、マラリア原虫(Plasmodium)の種、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、HIV、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコッカス、B型インフルエンザ(ヘモフィルス・インフルエンザB型)、麻疹、C型肝炎または回虫によって引き起こされるものといった感染症のいずれか1つ以上を含むがこれらに限定されない。このように、治療または予防されうる、T細胞によって媒介される特定の症状は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、および糖尿病を含む。本発明はまた、臓器移植術または骨髄移植術に用いることができる。
上記に示す通り、本発明は、自己免疫疾患といった免疫疾患、または、同種異系移植片拒絶といった移植片拒絶の治療に有用である。
治療されうる疾患の例は、一般に自己免疫疾患と呼ばれる一群を含む。自己免疫疾患の範囲は、臓器特異的疾患(たとえば甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症)から、慢性関節リウマチまたはエリテマトーデスのような全身性疾患にわたる。他の疾患は、アレルギー反応のような免疫過敏性を含む。
より詳細には:臓器特異的自己免疫疾患は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、いくつかの型の貧血(再生不良性、溶血性)、自己免疫肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患(クローン病、潰瘍性大腸炎)を含む。
全身性自己免疫疾患は:慢性関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症および全身性硬化症、シェーグレン症候群、分類不能結合組織症候群、抗リン脂質症候群、さまざまな型の血管炎(結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎)、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛、本態性(混合)クリオグロブリン血症、尋常性乾癬および乾癬性関節炎、好酸球性または非好酸球性びまん性筋膜炎、多発性筋炎および他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、さまざまな型の炎症性皮膚炎を含む。
疾患のより広範囲のリストは;慢性関節リウマチを含む関節炎を含む不必要な免疫反応および炎症、過敏性、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫疾患に伴う炎症、アテローム性硬化症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に伴う炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および消化管の他の疾患に伴う炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および/または炎症性関連婦人科疾患、後部ブドウ膜、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜強膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫および炎症性要素、眼外傷の炎症性要素、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、たとえば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕、眼インプラントに対する免疫および/または炎症反応、および他の免疫および炎症性関連眼疾患、自己免疫疾患または症状に伴う炎症、または、中枢神経系(CNS)または任意の他の臓器の両方で、免疫および/または炎症抑制が有益である疾患、パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および/または副作用、AIDS関連痴呆症候群、HIV関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、症状、またはCNS疾患、脳卒中(stokes)の炎症性要素、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫および炎症性要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性 神経障害、亜急性 神経障害、慢性 神経障害、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病(chora)、重症筋無力症、特発性頭蓋内圧亢進症、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、CNS圧迫またはCNS外傷またはCNS感染の炎症性要素、筋萎縮症および筋ジストロフィーの炎症性要素、および、中枢および末梢神経系の免疫および炎症性関連疾患、症状または疾患、外傷後炎症、敗血性ショック、感染症、手術または臓器の炎症性合併症または副作用、遺伝子治療のたとえばウイルスキャリヤーの感染による炎症性および/または免疫合併症および副作用、または体液性および/または細胞性免疫反応を抑制または阻害するための、AIDSに関連する炎症、単球または白血球増殖性疾患、たとえば白血病を、単球またはリンパ球の量を減らすことによって治療または改善すること、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織といった天然または人工細胞、組織、および臓器の移植術の場合に移植片拒絶の防止および/または治療のため、を含む。
本発明はまたがん治療法において有用である。本発明は特に、腺がん、たとえば小細胞肺がん、および腎臓、子宮、前立腺(prostrate)、膀胱、卵巣、大腸および乳房のがんに関して有用である。
本発明は、感染症を治療するために、たとえばいわゆる予防ワクチンおよびいわゆる治療ワクチンに用いることができることが理解される。
たとえば、予防ワクチンは、未感染の対象に感染防御免疫を提供して将来の感染成立に対する防御を提供するために用いることができる。
逆に、治療ワクチンは、たとえば、感染が(たとえば急性または慢性感染のどちらかとして)成立した後に、その感染に対する免疫反応を高めるために用いることができる。適切には、治療ワクチンは、たとえば細菌感染症(結核のような)、マラリア感染症のような寄生虫感染症、またはウイルス感染症(HPV、HCV、HBVまたはHIV感染症のような)であることができる慢性感染症と戦うために用いることができる。
顕著な罹患率および早期死亡を伴う慢性感染症の例は、A、B、C、D、E型肝炎といったヒト肝炎ウイルス、たとえばB型肝炎ウイルス(HBV)および慢性肝炎、肝硬変、および肝がんを引き起こすC型肝炎ウイルス(HCV)を含む(米国特許第5738852号明細書を参照)。
ウイルス性感染性物質によって引き起こされる慢性感染症の他の例は、ヒトレトロウイルスによって生じるものを含む;後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こすヒト免疫不全ウイルス(HIV−1 およびHIV−2);およびT細胞白血病および脊髄症を引き起こすヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV−1およびHTLV−2)。多くの他の感染症、例えば、1型および2型単純ヘルペスウイルス(HSV)を含むヒトヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、水痘−帯状疱疹ウイルス(VZV)および6型ヒトヘルペスウイルス(HHV−6)といった他の多数の感染はしばしば宿主機構によって根絶されずに、それどころか慢性化してこの状態で疾患を引き起こす可能性がある。ヒトパピローマウイルスの慢性感染は子宮頸がんを伴う。多数の他のウイルスおよび他の感染性物質は細胞内で複製し、宿主防御機構がそれらを排除できない場合は慢性化しうる。これらは、病原性原虫(たとえば、ニューモシスチス・カリニ(P.carinii)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、リーシュマニア(Leishmania)、プラスモジウム(Plasmodium)(マラリアの原因)、およびトキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii))、細菌(たとえば、mycobacteria (たとえば結核の原因である結核菌(Mycobacterium tuberculosis))、サルモネラおよびリステリア)、および真菌(たとえば、カンジダおよびアスペルギルス)を含む。
医薬組成物
好ましくは本発明の活性物質(Notchシグナル伝達の調節因子およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドおよび/またはインターフェロン誘導因子)は医薬組成物の形で投与される。当該医薬組成物は、ヒトおよび動物医学においてヒトまたは動物用途向けであることができ、また、1つ以上の活性物質に加えて、典型的には任意の1つ以上の、医薬品として許容される希釈剤、キャリヤー、または賦形剤を含む。治療的用途のための許容されるキャリヤーまたは希釈剤は医薬分野でよく知られており、たとえば、『レミントンの医薬科学』(Remington’s Pharmaceutical Sciences)Mack Publishing Co.(A.R.GENNARO edit.1985)。マック・パブリッシング社(Mack Publishing Co.)(A.R.ジェナロ(Gennaro)編、1985)に記載されている。医薬キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医薬実務に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。また、保存料、安定剤、色素および香料さえ、そのような医薬組成物中に提供することができる。保存料の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびp−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤もまた用いることができる。
好ましくは本発明の活性物質(Notchシグナル伝達の調節因子およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドおよび/またはインターフェロン誘導因子)は医薬組成物の形で投与される。当該医薬組成物は、ヒトおよび動物医学においてヒトまたは動物用途向けであることができ、また、1つ以上の活性物質に加えて、典型的には任意の1つ以上の、医薬品として許容される希釈剤、キャリヤー、または賦形剤を含む。治療的用途のための許容されるキャリヤーまたは希釈剤は医薬分野でよく知られており、たとえば、『レミントンの医薬科学』(Remington’s Pharmaceutical Sciences)Mack Publishing Co.(A.R.GENNARO edit.1985)。マック・パブリッシング社(Mack Publishing Co.)(A.R.ジェナロ(Gennaro)編、1985)に記載されている。医薬キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医薬実務に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。また、保存料、安定剤、色素および香料さえ、そのような医薬組成物中に提供することができる。保存料の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびp−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤もまた用いることができる。
投与
典型的には、医師は個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。下記の投与量は、平均的な例の典型である。もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありうる。
典型的には、医師は個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。下記の投与量は、平均的な例の典型である。もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありうる。
一実施形態では、本発明に用いられる治療剤を患者に直接in vivoで投与することができる。代替としてまたは加えて、当該治療剤を細胞(たとえばT細胞および/またはAPCまたは幹細胞または組織細胞)にex vivoの方法で投与することができる。たとえば、T細胞またはAPCといった白血球を、患者またはドナーから既知の方法で得て、本発明の方法でex vivoで処理/インキュベートし、その後、患者に投与することができる。
一般的に、治療的に有効な一日量は、たとえば0.01ないし500mg/kg、たとえば0.01ないし50mg/治療される対象の体重kg、たとえば0.1ないし20mg/kgの範囲になりうる。本発明の物質はまた、たとえば0.001〜10mg/kg/hrの範囲である可能性が高い用量で、静脈輸液によって投与することができる。
熟練した医師は、任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができる。好ましくは医薬組成物は単位用量剤形である。
本発明の物質は、たとえば、経口、直腸内、経鼻、局所(皮内、経皮、エアロゾル、口内および舌下を含む)、膣内および非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)投与経路を含むがそれに限定されない、任意の適当な手段によって投与することができる。
適切には活性物質は、上記の「医薬組成物」の見出しの下に記載の通りの、医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤と組み合わせて投与される。医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤は、たとえば、滅菌等張生理食塩水溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液であることができる。本発明の物質は、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤と適切に混合することができる。
一実施形態では、化合物を経口的に活性な形に処方することが望ましい可能性がある。このように、一部の用途については、活性物質は、デンプンまたは乳糖といった賦形剤を含む錠剤の形で、または、カプセル剤または胚珠状で単独でまたは賦形剤と混合して、または、香料または着色料を含むエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、経口投与することができる。本物質を含む錠剤またはカプセル剤のような用量は、必要に応じて一度に1つずつまたは2個以上投与することができる。複合体を徐放性処方で投与することもまた可能である。
代替としてまたは加えて、活性物質は吸入によって、経鼻的にまたはエアロゾルの形で、または坐剤またはペッサリーの形で投与することができ、または活性物質はローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に投与することができる。経皮投与の1つの選択手段は、皮膚パッチを用いることである。たとえば、活性物質はポリエチレングリコールまたは液体パラフィンの水系エマルジョンから成るクリームに取り入れることができ、たとえば重量で1ないし10%の濃度で、白ロウまたは白色軟質パラフィン基剤と共に必要に応じて安定剤および保存料から成る軟膏に取り入れることができる。
ポリヌクレオチドおよびタンパク質/ポリペプチドといった活性物質もまた、ウイルス技術または非ウイルス技術によって投与することができる。ウイルス配送機構は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むがそれらに限定されない。非ウイルス配送機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物(CFAs)およびその組み合わせを含む。そのような配送機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。活性物質はまた、表皮または真皮またはその他の粘膜表面のような部位への配送のための粒子の弾丸配送(ballistic derivery)といった、針を用いない系によって投与することができる。
活性物質はまた、非経口的に、たとえば海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。
非経口投与のためには、活性物質はたとえば、溶液を血液と等張にするための十分な塩または単糖といった他の物質を含みうるような、無菌水溶液の形で用いることができる。
口内または舌下投与のためには、物質はたとえば、従来の方法で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形で投与することができる。
対象(たとえば患者)への経口、非経口、口内および舌下投与のためには、活性物質およびその医薬品として許容される塩および溶媒和物の投与量レベルは、典型的には10ないし500mgでありうる(一回または分割用量で)。このように、および例として、錠剤またはカプセル剤は、必要に応じて一度に1つずつまたは2つ以上の投与について、5ないし100mgの活性物質を含みうる。上記に示す通り、医師は個別の患者について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上記の投与量は平均的な例の典型である一方、もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありえ、そのような用量範囲は本発明の範囲内であることに注意する。
当業者は任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができるため、記載の投与経路および投与量は単に指針として意図される。
ここで用いられる治療または療法の語は、診断および予防用途を包含すると考える。
本発明の治療は、ヒトの用途および獣医学用途の両方を含む。
本発明の活性物質は、たとえば、免疫抑制剤、ステロイドまたは抗がん剤のような、他の活性物質と共に投与することができる。
ex−vivoで処理される場合、本発明の修飾細胞は好ましくは患者のリンパ節への直接注射によって宿主へ投与される。典型的には104ないし108個の処理細胞、好ましくは105ないし107個の細胞、より好ましくは約106個の細胞が患者に投与される。好ましくは、細胞は濃縮された細胞集団から採取される。
ここで用いられる「濃縮された」の語は、本発明の細胞集団に用いられるとき、天然に共存する他の細胞がより少ない、細胞のより均一な集団をいう。濃縮された細胞の集団は、本分野で既知であるいくつかの方法によって達成することができる。たとえば、T細胞の濃縮された集団は、T細胞上だけに見出される決定基に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティクロマトグラフィーを用いて得ることができる。
濃縮された集団はまた、混合細胞懸濁液から、ポジティブ選択(目的の細胞だけを回収する)またはネガティブ選択(望ましくない細胞を除去する)によって得ることができる。特異的な細胞をアフィニティ材料上に捕捉するための技術は本分野でよく知られている(ウィグゼル(Wigzel)他,J.Exp.Med.,128;23,1969;メイジ(Mage)他,J.Imnmunol.Meth.,15;47,1977;ウィソッキ(Wysocki)他,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75;2844,1978;シュレンプ・デッカー(Schrempf−Decker)他,J.Immunol Meth.,32;285,1980;ミュラー・ジーブルク(Muller−Sieburg)他,Cell,44;653,1986)。
成熟分化細胞に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体が、望ましくない細胞を除去するさまざまなネガティブ選択、たとえば、T細胞または悪性細胞をそれぞれ同種異系または自家骨髄移植片から除去するために用いられている(ジー(Gee)他,J.N.C.I.80;154,1988)。モノクローナル抗体および免疫磁気マイクロスフィアを用いたネガティブ選択によるヒト造血細胞の精製は、複数のモノクローナル抗体を用いて達成することができる(グリフィン(Griffin)他,Blood,63;904,1984)。
細胞の分離のための手順は、抗体被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、たとえば、補体およびサイトトキシンのような、モノクローナル抗体と結合させたかまたはモノクローナル抗体と組み合わせて用いる細胞毒性物質、および、たとえば、プレートのような固体マトリクスに結合させた抗体を用いる「パンニング(濃縮)」、または他の便利な技術を含むことができる。正確な分離を提供する技術は、蛍光活性化セルソーターを含み、これはたとえば、複数の色チャンネル、低角度および鈍光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、などといったさまざまな程度の高度機能を持つことができる。
併用治療
本発明の活性物質が、他の活性物質、抗原または抗原決定基と共に投与される併用治療もまた本発明の範囲内にある。
本発明の活性物質が、他の活性物質、抗原または抗原決定基と共に投与される併用治療もまた本発明の範囲内にある。
「同時に」によって、活性物質が実質的に同一の時に、および好ましくは同一の処方中で一緒に、投与されることを意味する。
「同時期に」によって、活性物質が近い時間に投与されることを意味し、たとえば、1つの物質がもう1つの物質の前または後約1分間以内から約1日以内に投与される。任意の同時期の時間が有用である。しかし、同時に投与されない場合、物質は約1分間以内から約8時間以内、および好ましくは約1ないし約4時間より短い間に投与される場合が多い。同時期に投与される場合、物質は好ましくは動物の同一の部位に投与される。「同一の部位」の語は正確な位置(exact location)を含むが、しかし約0.5ないし約15センチメートル以内、好ましくは約0.5ないし約5センチメートル以内であることができる。
ここで用いられる「別々に」の語は、物質が、間隔を置いて、たとえば約1日ないし数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性物質はどちらの順序でも投与することができる。
ここで用いられる「順次に」の語は、物質が順番に、たとえば分、時間、日、または週間隔で投与されることを意味する。必要に応じて、活性物質は規則的な反復サイクルで投与することができる。
一実施形態では本発明に用いられる治療剤は、直接的に患者にin vivo投与することができることが理解される。代替として、または加えて、当該物質はT細胞および/またはAPCのような免疫細胞にex vivoの方法で投与することができる。たとえば、T細胞またはAPCのような白血球を、患者またはドナーから既知の方法で入手し、ex vivoで本発明の方法で処理/インキュベートし、その後患者に投与することができる。加えて、投与経路の組み合わせを必要に応じて用いることができることが理解される。たとえば、適切な場合には、1成分(たとえばNotchシグナル伝達の調節因子)をex−vivoで投与することができ、他方をin vivoで投与することができ、また逆も可能である。
化学的架橋化
化学的に結合した(架橋した)配列を、個別のタンパク質配列から調製し既知の化学結合技術を用いて結合させることができる。複合体は、たとえば従来の溶液相または固相ペプチド合成法を用いて組み立てることができ、末端アミノ基だけが脱保護された反応性形である完全に保護された前駆体が得られる。この官能基は次いでNotchシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその適当な反応性誘導体と直接反応させることができる。代替として、このアミノ基を、カーゴ部分またはリンカーを有する、反応に適した別の官能基に変換することができる。このように、たとえば無水コハク酸とのアミノ基の反応は選択的に指定可能なカルボキシル基を与え、一方、システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長は、選択的に指定可能なチオール基を結果として生じる。適当な選択的に指定可能な官能基が配送ベクター前駆体中に一旦導入されると、Notchシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその誘導体を、たとえばアミド、エステル、またはジスルフィド結合形成を介して結合することができる。利用することができる架橋化試薬は、たとえば、ミーンズ(Means),G.E.およびフィーニー(Feeney),R.E.,『タンパク質の化学修飾』(Chemical Modification of Proteins)ホールデン・デイ社(Holden−Day),1974,pp.39−43で考察されている。
化学的に結合した(架橋した)配列を、個別のタンパク質配列から調製し既知の化学結合技術を用いて結合させることができる。複合体は、たとえば従来の溶液相または固相ペプチド合成法を用いて組み立てることができ、末端アミノ基だけが脱保護された反応性形である完全に保護された前駆体が得られる。この官能基は次いでNotchシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその適当な反応性誘導体と直接反応させることができる。代替として、このアミノ基を、カーゴ部分またはリンカーを有する、反応に適した別の官能基に変換することができる。このように、たとえば無水コハク酸とのアミノ基の反応は選択的に指定可能なカルボキシル基を与え、一方、システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長は、選択的に指定可能なチオール基を結果として生じる。適当な選択的に指定可能な官能基が配送ベクター前駆体中に一旦導入されると、Notchシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその誘導体を、たとえばアミド、エステル、またはジスルフィド結合形成を介して結合することができる。利用することができる架橋化試薬は、たとえば、ミーンズ(Means),G.E.およびフィーニー(Feeney),R.E.,『タンパク質の化学修飾』(Chemical Modification of Proteins)ホールデン・デイ社(Holden−Day),1974,pp.39−43で考察されている。
Notchシグナル伝達調節の調節因子は、必要に応じて、直接的に、または適切にはリンカー部分を介して間接的に、結合することができる。直接結合は、チオール、ヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基といった、調節因子(たとえばNotchシグナル伝達調節のためのタンパク質)上の任意の便利な官能基を通じて生じうる。しばしば好ましい可能性がある間接結合は、連結部分を介して起こる。適当な連結部分は、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体およびスクシンイミド誘導体のような、二官能性および多官能性アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリールまたはアラルキルアルデヒド酸エステルおよび無水物、スルフヒドリルまたはカルボキシル基を含み、または臭化または塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステルまたはハロゲン化スルホンなどに由来することができる。
修飾/ヒト化抗体
好ましくは、ヒト患者を治療するための用途向けの抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。抗体「ヒト化」技術は本分野でよく知られている。これらの技術は典型的には、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDNA配列を操作するための、組み換えDNA技術の使用を含む。
好ましくは、ヒト患者を治療するための用途向けの抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。抗体「ヒト化」技術は本分野でよく知られている。これらの技術は典型的には、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDNA配列を操作するための、組み換えDNA技術の使用を含む。
米国特許第5859205号明細書に記載された通り、モノクローナル抗体(Mabs)をヒト化するための初期の方法は、1つの抗体の完全な可変領域を含む抗原結合部位が、別の抗体に由来する定常領域と結合している、キメラ抗体の産生を含んだ。そのようなキメラ化手順は欧州特許第A−0120694号明細書(セルテック社(Celltech Limited))、欧州特許第A−0125023号明細書((ジェネテック社(Genentech Inc.)およびシティ・オブ・ホープ(City of Hope))、欧州特許第A−0 171496号明細書(Res.Dev.Corp.Japan)、欧州特許第A−0 173 494号明細書(スタンフォード大学)、および国際公開第86/01533号パンフレット(セルテック社)に記載されている。たとえば、国際公開第86/01533号パンフレットは、マウスMAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体分子を調製するための製法を開示する。
欧州特許第A−0239400号明細書(ウィンター(Winter))に記載された別の手法では、マウスMAbの相補性決定領域(CDRs)がヒト免疫グロブリンの可変領域の骨格領域に、部位特異的突然変異誘発によって長オリゴヌクレオチドを用いて移植される。そのようなCDR移植されたヒト化抗体は、ヒト化キメラ抗体よりも、それらが含む非ヒトアミノ酸配列の大幅に低い比率の点から、抗−抗体反応を生じる可能性が大幅に低い。リゾチームを認識するマウスMAbおよびヒトT細胞上の抗原を認識するラットMAbがCDR移植によってヒト化された例が、ヴェルヘイエン(Verhoeyen)他(Science,239,1534−1536,1988)およびリーヒマン(Riechmann)他(Nature,332,323−324,1988)によってそれぞれ記載されている。ヒトT細胞上の抗原に対するCDR移植抗体の作製もまた、国際公開第89/07452号パンフレット(英国医療審議会)に記載されている。
国際公開第90/07861号パンフレットにおいて、クイーン(Queen)らはヒト化免疫グロブリンを設計するための4つの基準を提示している。第一の基準は、ヒトアクセプターとして、ヒト化する非ヒトドナー免疫グロブリンと著しく相同である特定のヒト免疫グロブリンに由来する骨格を用いるか、または多数のヒト抗体に由来する共通骨格を用いることである。第二の基準は、ヒト配列について骨格の特定残基でヒトアクセプター残基が稀であってドナー残基が典型的である場合は、アクセプターでなくドナーアミノ酸を用いることである。第三の基準は、CDRsに直に隣接する位置では、アクセプターでなくドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。第四の基準は、CDRsに直に隣接する位置では、アクセプターでなくドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。第四の基準は、アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルでCDRsの約3A以内に側鎖原子を有し、抗原またはヒト化免疫グロブリンのCDRsと相互作用が可能であると予測される場合は、その骨格位置でドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。基準2、3、または4は基準1に加えて、またはその代替として適用することができ、また1つずつでまたは任意の組み合わせで適用することができる。
抗原およびアレルゲン
一実施形態では、本発明の物質は、抗原または抗原決定基(またはそれをコードするポリヌクレオチド)と同時、別々または順次の組み合わせで投与することができ、そのような抗原または抗原決定基に対する免疫反応を修飾(上昇または低下)することができる。
一実施形態では、本発明の物質は、抗原または抗原決定基(またはそれをコードするポリヌクレオチド)と同時、別々または順次の組み合わせで投与することができ、そのような抗原または抗原決定基に対する免疫反応を修飾(上昇または低下)することができる。
本発明での用途に適した抗原は、免疫系によって認識されうる、また一般的に抗原受容体によって認識される、任意の物質であることができる。好ましくは本発明に用いられる抗原は免疫原である。宿主が、以前に遭遇した抗原に再曝露される時、アレルギー反応が起こる。
抗原に対する免疫反応は一般的に細胞性(T細胞媒介殺菌)または体液性(完全な抗原の認識を介した抗体産生)のどちらかである。免疫反応に関与するTH細胞によるサイトカイン産生のパターンは、これらの反応型のどちらが優位になるかに影響を与えることができる;細胞性免疫(TH1)は高いIL−2およびIFNγとしかし低いIL−4産生で特徴づけられる一方、体液性免疫(TH2)ではパターンは低いIL−2およびIFNγとしかし高いIL−4、IL−5およびIL−13である。分泌パターンは二次リンパ器官または細胞のレベルで調節されるため、特定のTHサイトカインパターンの薬理学的操作は、生じる免疫反応の種類および程度に影響を与えることができる。
TH1−TH2バランスは、2つの異なる型のヘルパーT細胞の相対的な発現量をいう。2つの型は免疫系に対して大規模かつ相反する作用を有する。ある免疫反応がTH1細胞を優先する場合、これらの細胞は細胞応答を推進し、一方でTH2細胞は抗体に支配される応答を推進する。一部のアレルギー反応を担う種類の抗体はTH2細胞によって誘導される。
本発明に用いられる抗原またはアレルゲン(またはその抗原決定基)は、ペプチド、ポリペプチド、糖質、タンパク質、糖タンパク質、または、タンパク質複合体、細胞−膜調製物、完全な細胞(生存可能なまたは生存不能な細胞)、細菌細胞またはウイルス/ウイルス成分のような、複数の抗原性エピトープを含むより複雑な材料であることができる。特に、ミエリン塩基性タンパク質(多発性硬化症に関連)、コラーゲン(慢性関節リウマチに関連)、およびインシュリン(糖尿病)、またはMHC抗原またはその抗原決定基のような非自己組織の拒絶に関連する抗原、といった自己免疫疾患に関連することが知られている抗原を用いることが好ましい。初回抗原刺激を受けた本発明のAPCおよび/またはT細胞が組織移植術手続に用いられる場合、抗原は組織ドナーから得ることができる。対象において発現される可能性がある抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチドもまた用いることができる。
APCおよびT細胞への核酸配列の導入
上記の通りのT細胞およびAPCは、DMEMまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清の存在下で、培養することができる。
上記の通りのT細胞およびAPCは、DMEMまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清の存在下で、培養することができる。
T細胞および/またはAPC中でポリペプチドの発現を可能にする条件下でポリペプチドをコードする核酸構造/ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をT細胞および/またはAPCへ投与することができる。同様に、アンチセンス構造をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってT細胞および/またはAPCへ導入することができる。
好ましい一実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーター/エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む調節配列に、調節可能に結合している。「調節可能に結合」の語は、記載の成分が、意図された方法でそれらが機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列と「調節可能に結合」した調節配列は、好ましくはコード配列の発現が対照配列と一致する条件下で達成されるような方法で繋げられている。
プロモーターは典型的には、哺乳類細胞中で機能するプロモーターから選択されるが、原核プロモーターおよび、他の真核細胞中で機能するプロモーターを用いることができる。プロモーターは典型的にはウイルス遺伝子または真核遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、発現が起こる細胞のゲノムに由来するプロモーターであることができる。真核プロモーターについては、遍在的な形で(a−アクチン、b−アクチン、チューブリンのプロモーターのように)または、代替として、組織特異的な形で(ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターのように)機能するプロモーターであることができる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、および眼内の上皮細胞に特異的である、組織特異的プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれCD2、CD11c、keratin14、Wnt−1およびロドプシンプロモーターである。好ましくは上皮細胞プロモーターSPCが用いられる。また、たとえばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターのように、特定の刺激に反応するプロモーターであることができる。たとえばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復(MMLVLTR)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーターといった、ウイルスプロモーターもまた用いることができる。
異種遺伝子の発現のレベルを、細胞の生涯の間に調節することができるように、プロモーターは誘導性であることもまた有利でありうる。誘導性とは、当該プロモーターを用いて得られた発現のレベルを調節することができることを意味する。
上記のプロモーターのうち任意のものを、別の調節配列、たとえばエンハンサー配列の付加によって修飾することができる。2つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターもまた用いることができる。
代替として(または加えて)、調節配列は、目的の遺伝子が本発明で有用な細胞でだけ発現されるように、細胞特異的であることができる。そのような細胞は、たとえば、APCおよびT細胞を含む。
必要に応じて、細胞の少量の一部を上記の通りNotchシグナル伝達活性のアップレギュレーションについて試験することができる。細胞は、患者への投与のために調製、またはT細胞とin vitro(ex vivo)でインキュベートすることができる。
免疫系の細胞
抗原提示細胞
状況によっては、抗原提示細胞(APC)は「専門の」抗原提示細胞である可能性があり、または抗原をT細胞へ提示するように誘導されうる別の細胞である可能性がある代替として、培養条件下で分化するかまたは活性化されてAPCを生じるAPC前駆細胞を用いることができる。本発明のex vivoの方法に用いられるAPCは、典型的には患者の体内で見出される腫瘍または末梢血から単離される。好ましくはAPCまたは前駆細胞はヒト起源である。しかし、適当な核酸配列を同定および試験するための予備in vitroスクリーニング手続にAPCが用いられる場合は、たとえば健康な被験者といった任意の適当な起源に由来するAPCを用いることができる。
抗原提示細胞
状況によっては、抗原提示細胞(APC)は「専門の」抗原提示細胞である可能性があり、または抗原をT細胞へ提示するように誘導されうる別の細胞である可能性がある代替として、培養条件下で分化するかまたは活性化されてAPCを生じるAPC前駆細胞を用いることができる。本発明のex vivoの方法に用いられるAPCは、典型的には患者の体内で見出される腫瘍または末梢血から単離される。好ましくはAPCまたは前駆細胞はヒト起源である。しかし、適当な核酸配列を同定および試験するための予備in vitroスクリーニング手続にAPCが用いられる場合は、たとえば健康な被験者といった任意の適当な起源に由来するAPCを用いることができる。
APCは、表面上にMHC分子(クラスIまたはII)を発現するように活性化されたかまたはトランスフェクションによって操作された、指状嵌入(interdigitating)DCまたは濾胞DCといった樹状細胞(DC)、ランゲルハンス細胞、PBMC、マクロファージ、Bリンパ球、または他の、上皮細胞、線維芽細胞または内皮細胞のような細胞型を含む。APCの前駆細胞は、CD34+細胞、単球、線維芽細胞および内皮細胞を含む。APCまたは前駆細胞は、培養条件によって修飾することができ、または、たとえば抗原提示に関与するタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子および/または免疫増強作用を促進する選択されたサイトカイン遺伝子(たとえばIL−2、IL−12、IFN−γ、TNF−α、IL−18など)との組み合わせのトランスフェクションによって、遺伝子操作することができる。そのようなタンパク質は、MHC分子(クラスIまたはクラスII)、CD80、CD86、またはCD40を含む。非常に好ましくはDCまたはDC前駆細胞がAPCの起源として含まれる。
樹状細胞(DC)はいくつかの方法で単離/調製することができ、たとえばDCは末梢血から直接精製することができ、または、たとえばGM−CSFを用いた処理による末梢血への移行後に、または骨髄から直接、CD34+前駆細胞から発生させることができる。末梢血から、接着性の前駆細胞をGM−CSF/IL−4混合物で処理することができ(イナバ(Inaba)K,他(1992)J.Exp.Med.175;1157−1167(Inaba))、または骨髄から、非接着性のCD34+細胞をGM−CSFおよびTNF−aで処理することができる(コー(Caux)C,他(1992)Nature360;258−261(Caux))。DCはまた、サルスト(Sallusto)およびランザベキア(Lanzavecchia)の方法(Sallusto F and Lanzavecchia A (1994) J.Exp.Med.179;1109−1118)と同様に、精製末梢血単核球(PBMC)を用いて接着性細胞をGM−CSFおよびIL−4で2時間処理して、ヒト提供者の末梢血から定型的に調製することができる。必要に応じて、これらから磁気ビーズを用いてCD19+B細胞およびCD3+、CD2+T細胞を除去することができる(コフィン(Coffin)RS,他(1998) Gene Therapy 5;718−722 (Coffin))。培養条件は、GM−CSFまたはIL−4のような他のサイトカインを、樹状細胞または他の抗原提示細胞の維持および/または活性のために含むことができる。
このように、ここで用いられる「抗原提示細胞など」の語は、APCに限られないことが意図されると理解される。当業者は、T細胞集団に提示することができる任意の媒介物を用いることができることを理解し、便宜上APCの語がこれらすべてをいうのに用いられる。上記に示す通り、適当なAPCの好ましい例は、樹状細胞、L細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、B細胞または脂質膜のような合成APCを含む。
T細胞
状況によっては、健常被験者といった任意の適当な起源由来のT細胞を、用いることができ、血液または他の起源(たとえばリンパ節、脾臓、または骨髄)から得ることができる。T細胞は任意に、標準的手順によって濃縮するかまたは精製することができる。T細胞は、同一のまたは別の個体から得られた、他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。代替として、全血を、または白血球が濃縮された血液または精製白血球を、T細胞および他の細胞型の起源として用いることができる。ヘルパーT細胞(CD4+)を用いることが特に好ましい。代替として、CD8+細胞のような他のT細胞を用いることができる。また、T細胞ハイブリドーマのような細胞株を用いることも便利である。
状況によっては、健常被験者といった任意の適当な起源由来のT細胞を、用いることができ、血液または他の起源(たとえばリンパ節、脾臓、または骨髄)から得ることができる。T細胞は任意に、標準的手順によって濃縮するかまたは精製することができる。T細胞は、同一のまたは別の個体から得られた、他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。代替として、全血を、または白血球が濃縮された血液または精製白血球を、T細胞および他の細胞型の起源として用いることができる。ヘルパーT細胞(CD4+)を用いることが特に好ましい。代替として、CD8+細胞のような他のT細胞を用いることができる。また、T細胞ハイブリドーマのような細胞株を用いることも便利である。
免疫反応および寛容化の測定法
上に記載された測定法(「測定法」を参照)のうち任意のものを、免疫細胞における反応性低下および寛容化を測定または検出し、および、免疫反応の抑制および増大を臨床用途での使用のために検出するのに用いることができる。
上に記載された測定法(「測定法」を参照)のうち任意のものを、免疫細胞における反応性低下および寛容化を測定または検出し、および、免疫反応の抑制および増大を臨床用途での使用のために検出するのに用いることができる。
免疫細胞活性は、当業者に既知である任意の適当な方法によって監視することができる。たとえば、細胞傷害性活性を監視することができる。ナチュラルキラー(NK)細胞は活性化後に細胞傷害性活性の増大を示す。したがって細胞傷害性の何らかの低下または安定化は、反応性の低下の徴候となる。
一旦活性化されると、白血球はさまざまな新しい細胞表面抗原を発現する。NK細胞は、たとえば、トランスフェリン受容体、HLA−DRおよびCD25 IL−2受容体を活性化後に発現する。反応性低下はしたがってこれらの抗原の発現を監視することによって測定することができる。
ハラ(Hara)他『ヒトT細胞活性化;III,12−0−テトラデカノイルホルボール−13−酢酸、マイトジェンおよび抗原によるリン酸化28kD/32kDジスルフィド結合初期活性化抗原(EA−1)の迅速誘導』(Human T−cell Activation;III,Rapid Induction of a Phosphorylated 28 kD/32kD Disulfide linked Early Activation Antigen (EA−1) by 12−0−tetradecanoyl Phorbol−13−Acetate,Mitogens and Antigens),J.Exp.Med.,164;1988(1986)、およびコスリッヒ(Cosulich)他『T細胞活性化の初期段階に関与する抗原(MLR3)の機能的特徴づけ』(Functional Characterization of an Antigen (MLR3) Involved in an Early Step of T−Cell Activation),PNAS,84;4205(1987)は、活性化の直後にT細胞上に発現される細胞表面抗原を記載している。これらの抗原、それぞれEA−1およびMLR3は、28kDおよび32kDの主要成分を有する糖タンパク質である。EA−1およびMLR3はHLAクラスII抗原ではなく、MLR3 MabはIL−1結合を遮断する。これらの抗原は、活性化されたT細胞上に18時間以内に出現し、したがって免疫細胞反応性を監視するために用いることができる。
加えて、白血球反応性は、参照により本開示に含まれる欧州特許第0325489号明細書に記載の方法で監視することができる。要約すると、これは、ATCC番号HB−9627で表されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に認識される細胞性抗原と相互作用するモノクローナル抗体(「抗Leu23」)を用いて達成される。
抗Leu23は、活性化されたおよび抗原刺激された白血球上の細胞表面抗原を認識する。活性化NK細胞上では、その抗原Leu23は活性化後4時間以内に発現され、活性化後72時間まで発現され続ける。Leu23は、少なくとも2個のN結合型糖鎖を有する24kDサブユニットから構成されるジスルフィド結合ホモ二量体である。
Leu23のNK細胞上での出現が細胞傷害性の発生と相関するため、およびLeu23のある種のT細胞上での出現がT細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、抗Leu23は白血球の反応性を監視するのに有用である。
免疫細胞反応性の監視のための技術のさらなる詳細は、参照により本開示に含まれる;『ナチュラルキラー細胞』(The Natural Killer Cell)ルイス(Lewis)C.E.およびJ.O’D.マクジー(McGee)1992.オックスフォード大学出版会;トリンチエリ(Trinchieri)G.『ナチュラルキラー細胞の生物学』(Biology of Natural Killer Cells) Adv.Immunol.1989 vol 47 pp187−376;『免疫反応遺伝子ハンドブック』(Handbook of Immune Response Genes)の7章『免疫反応のサイトカイン』(Cytokines of the Immune Response)マク(Mak)T.W.およびJ.J.L.シマード(Simard)1998に見出される。
調節T細胞(およびB細胞)のex vivo調製
下記の技術はT細胞に関して説明されているが、B細胞に等しく適用可能である。使用した技術は、T細胞が一般的にAPCと共培養されること以外は、APC単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたAPCをまず作製し、次いでそれをT細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたAPCが一旦作製されると、それを沈澱させPBSで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。このことは、たとえば、T細胞を異なる物質で処理したい場合、T細胞はAPCに用いた別の物質と接触させられることがないという利点を有する。初回抗原刺激を受けたAPCが一旦作製されると、初回抗原刺激を受けたAPCはそれ自体が免疫反応を調節するかまたは免疫寛容を誘導することができ、おそらく初回抗原刺激を受けたAPCとT細胞との間のNotch/Notchリガンド相互作用を介してT細胞におけるNotchまたはNotchリガンド発現の増加に繋がるため、T細胞に何らかの物質を投与することは必ずしも常に必要でない。
下記の技術はT細胞に関して説明されているが、B細胞に等しく適用可能である。使用した技術は、T細胞が一般的にAPCと共培養されること以外は、APC単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたAPCをまず作製し、次いでそれをT細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたAPCが一旦作製されると、それを沈澱させPBSで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。このことは、たとえば、T細胞を異なる物質で処理したい場合、T細胞はAPCに用いた別の物質と接触させられることがないという利点を有する。初回抗原刺激を受けたAPCが一旦作製されると、初回抗原刺激を受けたAPCはそれ自体が免疫反応を調節するかまたは免疫寛容を誘導することができ、おそらく初回抗原刺激を受けたAPCとT細胞との間のNotch/Notchリガンド相互作用を介してT細胞におけるNotchまたはNotchリガンド発現の増加に繋がるため、T細胞に何らかの物質を投与することは必ずしも常に必要でない。
インキュベートは典型的には、適当な培地中で37℃にて、少なくとも1時間、好ましくは少なくとも3、6、12、24、48時間または36時間以上とする。Notchシグナル伝達の進行は、上記の方法を用いて細胞の少量の一部について測定することができる。たとえばDeltaの発現を指示する核酸構造をトランスフェクションしたT細胞を対照として用いることができる。免疫反応/寛容の調節は、たとえば、続いてT細胞に抗原を負荷し、APCに曝露されていない対照細胞と比較してIL−2産生を測定することによって測定することができる。
初回抗原刺激を受けたT細胞またはB細胞はまた、APCの非存在下で同様の培養技術およびインキュベート時間を用いて、他のT細胞またはB細胞において免疫寛容を誘導するのに用いることができる。
代替として、抗TCR抗体(たとえば抗CD3)といったAPC代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体(たとえば抗CD28)と共にまたはそれ無しで、T細胞をAPCの非存在下で培養して初回抗原刺激することができ、または代替的にT細胞をMHC−ペプチド複合体(たとえば四量体)で活性化することができる。
免疫寛容の誘導は、その後にT細胞に抗原を負荷し、APCに曝露していない対照細胞と比較してIL−2産生を測ることによって測定することができる。
この方法で初回抗原刺激されているT細胞またはB細胞を、本発明にしたがって、別のT細胞またはB細胞において免疫寛容を促進または上昇させるのに用いることができる。
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態をここで、非限定的な実施例を用いて、より詳細に説明する。
[実施例1]
Notchリガンド/IgGFc融合タンパク質で被覆されたビーズの調製
M450ストレプトアビジン・ダイナビーズ(Dynabead)(登録商標)磁気ビーズ(米国ダイナル社(Dynal))を抗ヒト−IgG4ビオチニル化モノクローナル抗体(BDバイオサイエンス社(BD Bioscience)、555879)で、抗体の存在下で30分間室温にて回転することによって被覆した。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水(PBS;1ml)を用いて3回洗浄した。ビーズをさらにヒトIgG4Fcドメインと融合したヒトDelta1の細胞外ドメインを含む融合タンパク質の形のNotchシグナル伝達の調節因子(hDelta1−hIgG4;国際公開第03/041735号パンフレット、実施例1を参照)と共に、2時間室温にてインキュベートし、その後PBS(1ml)を用いて3回洗浄した。
[実施例2]
Notchリガンド/IgGFc融合タンパク質で被覆されたビーズの調製
M450ストレプトアビジン・ダイナビーズ(Dynabead)(登録商標)磁気ビーズ(米国ダイナル社(Dynal))を抗ヒト−IgG4ビオチニル化モノクローナル抗体(BDバイオサイエンス社(BD Bioscience)、555879)で、抗体の存在下で30分間室温にて回転することによって被覆した。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水(PBS;1ml)を用いて3回洗浄した。ビーズをさらにヒトIgG4Fcドメインと融合したヒトDelta1の細胞外ドメインを含む融合タンパク質の形のNotchシグナル伝達の調節因子(hDelta1−hIgG4;国際公開第03/041735号パンフレット、実施例1を参照)と共に、2時間室温にてインキュベートし、その後PBS(1ml)を用いて3回洗浄した。
[実施例2]
IFN−アルファおよびダイナル(Dynal)マイクロビーズ上に固定化されたDelta1−hIgG4の存在下におけるヒトCD4+T細胞によるサイトカイン産生の調節。
ヒト末梢血単核球(PBMC)を、フィコール・パーク(Ficoll−Paque)分離液(ファルマシア社(Pharmacia))を用いて血液から精製した。要約すると、血液28mlをフィコール・パーク分離液21mlに重層し、18〜20℃にて40分間400gで遠心分離した。PBMCを界面から回収し、CD4+T細胞精製に用いる前に3回洗浄した。
ヒト末梢血単核球(PBMC)を、フィコール・パーク(Ficoll−Paque)分離液(ファルマシア社(Pharmacia))を用いて血液から精製した。要約すると、血液28mlをフィコール・パーク分離液21mlに重層し、18〜20℃にて40分間400gで遠心分離した。PBMCを界面から回収し、CD4+T細胞精製に用いる前に3回洗浄した。
ヒトCD4+T細胞を、ミルテニー・バイオテク社(Miltenyi Biotech)からの抗CD4マイクロビーズを用いて取扱説明書に従って、ポジティブ選択によって単離した。
CD4+T細胞を3連で96ウェルプレート(平底)で、105CD4/ウェル/200μlにて、10%FCS、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびメルカプトエタノールを含むRPMI培地中でインキュベートした。
サイトカイン産生は、細胞を、ダイナル社からの抗CD3/CD28T細胞増殖ビーズを1:1比(ビーズ/細胞)にて用いて、またはプレートに結合した抗CD3(クローンUCHT1、BDバイオサイエンス社(BD Bioscience)、5μg/ml)および可溶性抗CD28(クローンCD28.2、BDバイオサイエンス社、2μg/ml)を用いて、刺激することによって誘導した。ヒト組み換えIFN−アルファ(ぺプロテック社(Peprotech)、5ng/ml)、およびヒトDelta1ECドメイン−hIgG4融合タンパク質で被覆されたビーズ(上記の通り調製)または対照ビーズを、一部のウェルに5;1比(ビーズ/細胞)にて添加した。
37℃/5%CO2/加湿雰囲気にての3日間のインキュベート後に上清を除去し、サイトカイン産生をELISAによって、ファーミンジェン社(Pharmingen)のキットでそれぞれIL−10およびIL−5用のOptEIAセット・ヒトIL10(カタログ番号555157)、OptEIAセット・ヒトIL−5(カタログ番号555202)、およびIL−2用のR&Dシステムズ社(R&D Systems)からのヒトIL−2デュオセット(DuoSet)(カタログ番号DY202)を取扱説明書に従って用いて評価した。
結果を図7に示し、各々の場合のIL−10、IL−5、およびIL−2レベルをそれぞれ図7Aから7Cに示す。
[実施例3]
[実施例3]
さまざまな用量でのIFN−アルファの存在下におけるヒトCD4+T細胞によるサイトカイン産生の調節
IFNaをさまざまな異なる濃度すなわち0ng/ml、0.04ng/ml、0.2ng/ml、1ng/ml、5ng/mlおよび25ng/mlにて添加したという改変を加えて、実施例2の手順を繰り返し、そしてIL−10およびIL−5のレベルを実施例2の場合のように3日間のインキュベート後に測定した。結果を図8に示す。
IFNaをさまざまな異なる濃度すなわち0ng/ml、0.04ng/ml、0.2ng/ml、1ng/ml、5ng/mlおよび25ng/mlにて添加したという改変を加えて、実施例2の手順を繰り返し、そしてIL−10およびIL−5のレベルを実施例2の場合のように3日間のインキュベート後に測定した。結果を図8に示す。
結果から判る通り、単独で用いられたDeltaビーズおよびIFNaはそれぞれ、IL−10産生において4倍および5.5倍の増加を誘導した。組み合わせて用いられた場合、Deltaビーズの存在は、同じ作用を達成するのにIFN−a濃度を25〜125倍低下させることを可能にした。さらに、IL−10産生に対するIFNaの作用はIFNa 5〜25ng/mlで横ばいになるように見えた一方、Deltaビーズが存在した場合は、その水平状態を大きく上回ったIL−10産生の連続的増加があった。Deltaビーズ単独について観察されたIL−5における減少は、DeltaをIFNaと組み合わせて使用した際にもまた存在したが、しかしIFNaの有意な追加の作用は伴わなかった。
[実施例4]
[実施例4]
再刺激の作用
実施例2に記載の通り精製したヒトCD4+T細胞を、プレートに結合した抗CD3(クローンUCHT1、BDバイオサイエンス社(BD Bioscience)、10μg/ml)、可溶性抗CD28(クローンCD28.2、BDバイオサイエンス社、2μg/ml)およびヒトIL−2(ぺプロテック社(Peprotech)100U/ml)を用いて刺激した。ヒト組み換えIFN−アルファ(ぺプロテック社、5ng/ml) および/またはヒトDelta1ECドメイン−hIgG4融合タンパク質で被覆されたビーズ(上記の通り調製)または対照ビーズを、一部のウェルに5:1比(ビーズ/細胞)にて添加した。細胞を37℃/5%CO2/加湿雰囲気にてインキュベートし、7日目および14日目に正確に同一条件で再刺激した。
実施例2に記載の通り精製したヒトCD4+T細胞を、プレートに結合した抗CD3(クローンUCHT1、BDバイオサイエンス社(BD Bioscience)、10μg/ml)、可溶性抗CD28(クローンCD28.2、BDバイオサイエンス社、2μg/ml)およびヒトIL−2(ぺプロテック社(Peprotech)100U/ml)を用いて刺激した。ヒト組み換えIFN−アルファ(ぺプロテック社、5ng/ml) および/またはヒトDelta1ECドメイン−hIgG4融合タンパク質で被覆されたビーズ(上記の通り調製)または対照ビーズを、一部のウェルに5:1比(ビーズ/細胞)にて添加した。細胞を37℃/5%CO2/加湿雰囲気にてインキュベートし、7日目および14日目に正確に同一条件で再刺激した。
17日目に上清を除去し、サイトカイン産生をELISAによって、ファーミンジェン社(Pharmingen)のキットでIL−10およびIL−5用のOptEIAセット・ヒトIL10(カタログ番号555157)、OptEIAセット・ヒトIL−5(カタログ番号555202)を取扱説明書に従って用いて評価した。結果を図9に示す。IL−10およびIL−5の産生に対する、上記の実施例3の場合と同様の作用が見られたことが分かる。
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Claims (31)
- 免疫系の調節を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、
i)Notchシグナル伝達経路の調節因子;および、
ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子
:を含む製品。 - T細胞活性の調節のための、請求項1に記載の製品。
- 喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、がん、腫瘍に誘発される免疫系の異常、または感染症の治療のための、請求項1または請求項2に記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、DeltaまたはJagged、またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Delta、Jaggedまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、Notchリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンFcセグメントを含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1から4のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、DSLまたはEGF様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項1から4のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、Notch細胞内ドメイン(NotchIC)またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Notch細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項1から3のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、Notchシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはNotchシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1から3のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、少なくとも1個のNotchリガンドDSLドメインおよび少なくとも1個のNotchリガンドEGFドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、少なくとも1個のNotchリガンドDSLドメインおよび少なくとも2個のNotchリガンドEGFドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、少なくとも1個のNotchリガンドDSLドメインおよび少なくとも3個のNotchリガンドEGFドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、
i)NotchリガンドDSLドメイン;
ii)1〜5個のNotchリガンドEGFドメイン;
iii)任意にNotchリガンドN末端ドメインの全部または一部;および
iv)任意に1つ以上の異種アミノ酸配列
:を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。 - Notchシグナル伝達経路の調節因子が、
i)NotchリガンドDSLドメイン;
ii)2〜3個のNotchリガンドEGFドメイン;
iii)任意にNotchリガンドN末端ドメインの全部または一部;および
iv)任意に1つ以上の異種アミノ酸配列
:を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。 - Notchシグナル伝達経路の調節因子が、
i)NotchリガンドDSLドメイン;
ii)3個のNotchリガンドEGFドメイン;
iii)任意にNotchリガンドN末端ドメインの全部または一部;および
iv)任意に1つ以上の異種アミノ酸配列
:を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。 - Notchシグナル伝達経路の調節因子が、Delta DSLおよび/またはEGFドメインを含む、請求項1から14のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、Serrate/Jagged DSLおよび/またはEGFドメインを含む、請求項1から14のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、ヒトDelta DSLおよび/またはEGFドメインを含む、請求項1から14のうちいずれか1つに記載の製品。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子が、ヒトJagged DSLおよび/またはEGFドメインを含む、請求項1から14のうちいずれか1つに記載の製品。
- インターフェロンを含む、前記請求項のうちいずれか1つに記載の製品。
- インターフェロンがI型インターフェロンである、請求項19に記載の製品。
- インターフェロンがアルファインターフェロンである、請求項20に記載の製品。
- インターフェロンがベータインターフェロンである、請求項20に記載の製品。
- インターフェロンがヒトインターフェロンである、請求項19から22のうちいずれか1つに記載の製品。
- i)Notchシグナル伝達経路の調節因子の有効量;および
ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量
:を、同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法。 - 免疫系の調節における同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための:
i)Notchシグナル伝達経路の調節因子;および
ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子;
の組み合わせ。 - インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせで、免疫系を調節することにおける使用のための、Notchシグナル伝達経路の調節因子。
- i)Notchシグナル伝達経路の調節因子;および
ii)インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子;
の組み合わせの、免疫系の調節のための薬剤の製造における使用。 - 免疫系の調節のための薬剤の製造における、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子と同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Notchシグナル伝達の調節因子の使用。
- Notchシグナル伝達経路の調節因子、および、インターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子を含む医薬キット。
- 第1の処置手順でNotchシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する段階;および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の有効量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
- 第1の処置手順でNotchシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階;および第2の処置手順でインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチド、またはインターフェロン誘導因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
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