KR101948934B1

KR101948934B1 - 세포투과성을 갖는 Ｒ12 - Ｇｒｉｍ19 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101948934B1
Application number: KR1020120011092A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 문영미; 이선영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2019-02-18
Also published as: KR20130090054A

Abstract

본 발명은 세포 투과성을 갖는 R12 - Ｇｒｉｍ19 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 세포 투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 R12 - Ｇｒｉｍ19 융합 펩타이드는 목적 세포 내로의 투과성이 우수하여 Grim19 단독을 사용하는 것에 비해 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)는 활성화 시키는 효과가 우수하므로 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

세포투과성을 갖는 Ｒ12 - Ｇｒｉｍ19 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{R12 - Grim19 Fusion peptide having cell penetration for preventing or treating immune disease and pharmaceutical composition comprising thereof}

본 발명은 면역질환의 치료 효과를 향상시킬 수 있는 세포투과성을 갖는 R12 및 Ｇｒｉｍ19의 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역 질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환의 치료를 위한 치료제를 효과적으로 세포내로 전달할 수 있는 세포투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하고, 면역조절 T세포(Treg)의 활성을 촉진시키며, 염증성 세포의 침윤 및 증식을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스로부터 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 R12 - Ｇｒｉｍ19 융합 펩타이드는 목적 세포 내로의 투과성이 우수하여 Grim19 단독을 사용하는 것에 비해 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)는 활성화 시키는 효과가 우수하므로 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 제작한 pcDNA3.1+GRIM19 벡터와 pcDNA3.1+R12+GRIM19 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 제작한 pET15b/6xHis+GRIM19 벡터와 pET15b/6xHis+R12+GRIM19 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.

본 발명은 면역 조절작용을 통해 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 Grim19 단백질의 치료 효과 상승을 위해 세포 투과성이 우수한 아르기닌 12개와 Grim19이 융합된 세포투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 효능이 우수한 새로운 면역질환 치료제를 개발하기 위해 Grim19 유전자에 주목 하였는데, 상기 Grim19(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19)은 세포의 죽음과 관련된 유전자로 밝혀졌고, 최근에는 yeast-2-hybrid 스크리닝을 통해 STAT3와 상호작용을 하는 파트너로 알려진 바 있다(Zhang J, Yang J, Roy SK, Tininini S, Hu J, Bromberg JF. The cell death regulator Grim-19 is an inhibitor of signal transducer and activator of transcription 3. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:93429347). 초기 STAT3 관련 인자들이 거론되었을 때, PIAS3 및 SOCS3(suppressor of cytokine signaling 3)는 STAT3의 억제 피드백으로 거론된 바 있고, SOCS 단백질은 JAKs을 억제하여 리간드에 의해 유도되는 반응을 억제하는 활성이 있으며, PIAS 단백질은 STAT3의 인산화를 억제하는 활성이 있는 것으로 알려져 있다(Starr R, Hilton DJ. Negative regulation of the JAK/STAT pathway. Bioessays 1999;21:4752). Grim19또한 STAT3에 의해 유도되는 전사를 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 흥미롭게도 Grim19은 SOCS3 및 PIAS3와는 달리 타이로신(tyrosin)과 세린(serine) 잔기의 인산화를 억제하거나 DNA 결합을 방해하지 않는다(Chung CD, Liao J, Liu B, Rao X, Jay P, Berta P. Specific inhibition of Stat3 signal transduction by PIAS3. Science . 1997;278:18031805). 반면, Grim19는 STAT3의 트랜스 활성 도메인(trans activation domain:TAD)에 결합하여 STAT3에 관련된 전사를 억제할 때 STAT3가 인산화되어 핵으로 전위되는 것을 억제하는 작용을 한다(Dhananjaya V. Kalvakolanu. The Grims: a new interface between cell death regulation and interferon/retinoid induced growth suppression. Cytokine & Growth Factor Reviews . 2004;15:169194).

한편, STAT(Signal transducers and activators of transcription)는 신호전달 및 전사조절 단백질로서, 사이토카인, 호르몬, 성장인자 등의 세포외 자극에 의해 활성화되어 타이로신 잔기가 인산화되고, SH2 도메인의 상호작용으로 이량체(dimer)가 형성되어 핵 안으로 들어가 특정 프로모터에 결합하게 된다. 이런 STAT 단백질의 신호체계는 탈인산화 작용 및 단백질 분해에 의해 억제될 수 있다.

특히, 최근에는 다양한 암종에서 STAT1, STAT3 및 STAT5의 활성화된 형태가 발견되고 있는데, STAT3는 백혈병과 같은 혈액암 뿐만 아니라, 유방암, 두부경부암, 흑색종, 난소암, 폐암, 췌장암, 전립선암과 같은 다양한 고형암에서 활성화되어 있어 중요한 항암 타겟이 되고 있다(Hua Yu and Richard Jove, Nature Review Cancer.,2004, 8, 945).

또한, STAT3의 활성은 세포사멸을 억제하고, 신생혈관(angiogenesis)을 유도하며, 면역회피를 유도하는 것으로 알려진 바 있다((Wang T. et al., Nature Medicine., 2004, 10, 48). 따라서 STAT3 활성 억제는 복합적인 항암 기작으로 종양을 제어할 수 있는 효과가 있고, STAT3 단백질은 종양뿐만 아니라 다양한 세포내 기능에도 관여하므로 이의 저해제 발굴은 면역억제제로의 개발도 가능하다.

일반적으로 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.

특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.

또한, 앞서 종래기술에도 기술한 바와 같이, T 세포는 Treg 세포 이 외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

또한, Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.

이에 본 발명자들은 Grim19이 T 세포에서 병적 세포인 Th17 세포로의 분화를 억제함을 통해 면역질환을 치료하는 효과가 있으며, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에서 Foxp3의 발현이 증가됨을 확인하고, Treg에서 분비되는 사이토카인인 IL-10의 분비량이 증가함을 확인함으로써, Grim19가 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 활성 또는 증폭시켜 면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다는 사실을 특허출원번호 10-2011-0010999호를 통해 규명한 바 있다.

한편, 본 발명에서는 이러한 Grim19에 의한 면역질환 치료 효과를 보다 증진시킬 수 있는 방법, 즉 Grim19의 세포내 최적 전달 시스템을 고안하였는데, 즉 Grim19 에 12개의 연속적인 아르기닌(Arg; R) 펩타이드를 연결한 융합 펩타이드의 경우, 아르기닌 펩타이드가 연결되지 않은 Grim19에 비해 목적 세포내로 효과적으로 전달되어 Grim19에 의한 면역질환 치료 효과가 향상된다는 것을 규명한 특징이 있다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, R12와 Grim19이 융합된 펩타이드를 제조하고, 융합 펩타이드를 코딩하는 유전자 서열을 함유한 재조합 벡터를 제조한 다음, 제작된 제조합 벡터를 이용하여 R12- Grim19의 IL-17 사이토카인 생성 억제능, Treg 세포의 활성화, 관절염 치료 효과, 염증 반응에 미치는 영향을 조사한 결과, R12- Grim19을 처리한 군이 R12과 융합되지 않은 Grim19 단독에 비해 상기 효능 등이 더 우수한 것으로 나타났다.

따라서 본 발명은 세포투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드를 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 재조합 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어 진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드를 암호화하는 염기서열(폴리뉴클레오티드)을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체인 숙주세포를 제공할 수 있으며, 바람직하게 상기 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 Grim19를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있는데, Grim19 단백질을 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

따라서 Grim19 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 폴리뉴클레오티드, 즉, 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 등가의 핵산서열, 즉 DNA 서열은 상이하나 동일한 서열의 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 코돈 축퇴성 (codon degeneracy) 서열을 포함한다. 본 발명의 다양한 형태의 조성물은 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 등가의 핵산서열, 즉 DNA 서열은 상이하나 동일한 서열의 펩타이드를 암호화하는 코돈 축퇴성 (codon degeneracy) 서열을 포함하는 벡터일 수 있으며, 상기 뉴클레오티드들의 세포 내 전달(gene delivery) 방식 역시 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 상기 뉴클레오타이드는 공지된 형태로 세포 내 전달될 수 있으며, 일 예로 종래의 유전자 운반체로 이용되어온 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노 연관 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector)를 포함하는 바이러스 성벡터, 리포좀, 폴리리신 (polylysine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine (PEI)), 프로타민(protamine), 히스톤(histone), 폴리에스테르아민(Polyester amine) 및 이들 각각의 변형체를 포함하는 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 비바이러스성 벡터를 사용할 수 있으며, 벡터 시스템 외에도, 공지된 세포 내 물질전달 펩타이드 등을 활용하여 효율적으로 세포내로 전달될 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

형질전환체는 상기 벡터에 의해 형질전환될 수 있다. 바람직하게 상기 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextranmediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 또한, 상기 본 발명에 따른 벡터를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환을 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 자가면역질환이라고 한다.

또한, 염증성 질환이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

또한, 본 발명에서 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환의 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 벡터를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 펩타이드의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 상기 유효성분을 포함하는 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

R12 - GRIM19 의 과발현 벡터 및 단백질의 제조

자가면역질환과 같은 면역반응 이상으로 초래되는 질환에서 GRIM19에 의한 치료 효과를 증진시키기 위해 세포내로 투과가 우수한 GRIM19를 제작하였다.

<1-1> GRIM19 와 R12 - GRIM19 의 제작

세포 투과성이 높은 아르기닌 12개가 결합된 R12와 GRIM19의 유전자를 포함하는 벡터를 제적하였는데, 이를 위해 코돈 최적화로 포유류세포에서 발현이 잘되도록 한 GRIM19 서열로 재조합유전자를 합성하였다(Genscript, USA). 또한, 사용한 GRIM19 유전자가 맞는 것인지 시퀀싱을 통해 확인한 다음, BamH 1과 Xho1의 제한효소를 사용하여 GRIM19 유전자를 절단한 다음, pcDNA3.1+(promega)에 삽입하였고(pcDNA3.1+GRIM19), 이후 R12-GRIM19 제작을 위해서는 arginine 서열을 12개 포함한 pcDNA3.1+벡터를 BamH 1과 Xhol의 제한 효소로 절단하여 R12 부분을 GRIM19를 포함하고 있는 상기 pcDNA3.1+GRIM19 벡터에 삽입하여 pcDNA3.1+R12-GRIM19 재조합 벡터를 제조하였다(도 1 참조).

이후, 재조합 벡터로 대장균을 형질 전환 시킨 다음 플라스미드를 분리하였고, 재조합된 유전자의 염기서열을 분석한 뒤 염기서열이 정확한 재조합 플라스미드를 선택한 다음, 이를 NIH3T3 마우스 섬유아세포에 형질도입하여 R12-Grim19을 대량발현하는 고효율 재조합 벡터를 선택하였다. 이때 대조군으로는 R12가 삽입되지 않은 pcDNA3.1+GRIM19을 사용하였다.

<1-2> GRIM19 와 R12 - GRIM19 유전자를 포함하는 단백질 발현 벡터 제작

6× His를 포함한 pET15b(novagen) 벡터를 제한효소 Ndel과 Xho1으로 절단하였고(pET15b/6× His GRIM19), R12-GRIM19 단백질의 제조를 위해 6× His와 arginine 서열을 12개 포함한 pET15b(novagen) 벡터를 제한효소 Nde1과 Xho1으로 절단하여 pET15b/6×His-R12-GRIM19 벡터를 제조하였다(도 2 참조). 또한 이때 대조군으로는 R12가 없는 pET15b/6×His-GRIM19 벡터를 사용하였다.

<1-3> R12 - GRIM19 단백질의 정제

pET15b/6×His-GRIM19와 pET15b/6×His-R12-GRIM19를 각각 E.coli BL-21 컴피턴스 세포로 형질전환 한 후, 엠피실린이 첨가된 LB 아가 플레이트에 도말하여 37℃에서 12시간 배양한 다음, 각각의 독립적인 하나의 콜로니를 엠피실린이 첨가된 LB broth 배양액에서 15℃에서 12시간 배양하였다.

이후, E.coli를 원심 분리하여 침전물을 수확 한 후 인산완충용액(PBS)에 재부유시키고, 부유액에 1% Triton-X 100을 첨가한 뒤 30분간 실온에 두었다. 그 후 12000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리 하여 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액으로 부터 His가 붙은 단백질을 분리하기 위하여 Immobilized metal ion adsorption chromatography (IMAC)(GE healthcare Life sciences, USA)의 지침서에 따라서 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질은 단백질 정량법으로 정량하였고 12% SDS- polyacrylamide gel에서 전기 영동하여 분리한 다음, coommasie blue 염색시약으로 염색하여 R12-Grim19 단백질의 정제 정도를 분석하였다.

< 실시예 2>

Th17 세포에서 R12 - GRIM19 의 IL -17 생성 억제능 분석

상기 실시예 1에서 정제한 R12-Grim19 단백질이 자가면역질환과 같은 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는지를 확인하기 위해, 자가면역질환과 관련된 Th17세포에서 R12-Grim19에 의한 IL-17 사이토카인의 분비변화를 측정하였다. 이를 위해 T 세포주인 LBRM를 사용하였고 R12-Grim19이 함유된 재조합 벡터 1ug을 혈청이 없는 RPMI 배지에 희석하고, polymag(Chemicell) 용액에 넣어 희석한 다음, 그 혼합물을 30분 동안 실온에 방치한 다음, 마그네토플레이트에 5분간 반응시킨 뒤 CD4+T 세포에 형질도입 시켰다. 이때 대조군으로 Grim19이 함유된 재조합 벡터 및 mock 벡터를 사용하였다. 하루 뒤, Th17분화조건, 즉, anti-CD3 항체 0.5ug/ml, anti-CD28 항체 1μg/mL과 IL-6 20ng/mL, TGF-beta 2ng/ml, anti-IL-4 항체 2ug/ml및 anti-IFNr항체 2ug/ml, anti-IL-2항체 2ug/ml를 상기 세포 배양액에 처리하여 3일 배양하여 Th17 세포로 분화시킨 뒤 IL-17 mRNA 발현정도를 real time PCR방법으로, IL-17의 분비를 ELISA를 수행하여 확인하였으며 PCR을 위한 프라이머 서열은 다음과 같다.

프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열
IL-17 센스	5′- CCTCAAAGCTCAGCGTGTCC -3'
IL-17 안티센스	5’- GAGCTCACTTTTGCGCCAAG -3'
β-actin 센스	5’- GAAATCGTGCGTGACATCAAAG -3'
β-actin 안티센스	5’- TGTAGTTTCATGGATGCCACAG -3'

실험 결과, STAT3 억제제인 Grim19이 과발현 되어 있는 상태에서는 IL-17의 mRNA 발현이 억제되는 것으로 나타났으며 따라서 염증성 사이토카인인 IL-17의 분비도 억제되는 것으로 나타났다. 반면, R12를 함께 발현시켜 세포내 수송이 더 원활히 이루어진 R12-Grim19이 과발현된 상태에서는 Grim19이 과발현 되어 있는 상태보다 IL-17의 분비 억제 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.

< 실시예 3>

Treg 세포에서 R12 - GRIM19 의 Treg 생성능 분석

제어성 T림프구, 즉 Treg(regulatory T lymphocyte)세포는 면역 관용을 일으키는 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Nat. Rev. Immunol. 2009, 7:305), Foxp3의 발현이 요구되며 이는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발병자들은 R12-Grim19을 처리한 Th17 분화환경을 거친 세포에서 Foxp3의 발현정도를 mRNA수준에서 조사하였다.

이를 위해 T 세포주에 Grim19, R12-Grim19, mock 벡터를 각각 상기 실시예 2와 마찬가지로 형질 도입하고 하루가 경과한 다음, anti-CD3 항체 0.5ug/ml, anti-CD28 항체 1ug/mL과 IL-2 10ng/mL, TGF-beta 5ng/ml, anti-IL-4 항체 2ug/ml및 anti-IFNr항체 2ug/ml, anti-IL-6항체 2ug/ml를 처리하여 Treg 분화배양을 3일 실시하였다. 그 후에 세포에서 RNA를 수득하여 하기에 기재된 프라이머 서열을 이용하여 real time PCR를 수행하였다.

프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열
Foxp3 센스	5′- GGCCCTTCTCCAGGACAGA -3'
Foxp3 안티센스	5’- GCTGATCATGGCTGGGTTGT -3'

그 결과 R12-Grim19가 과발현된 세포에서는 Foxp3의 발현이 Grim19가 과발현된 세포에 비해 더 증가한 것으로 나타났고 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 R12가 Grim19에 의한 Treg 세포의 기능을 향상시키는 작용을 한다는 것을 알 수 잇었다.

< 실시예 4>

관절염 동물모델에서 R12 - GRIM19 의 관절염 치료효과 분석

R12-Grim19이 실제적으로 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는지를 확인하기 위해 관절염이 유도된 마우스에 Grim19 또는 R12-Grim19를 처리한 후, 관절염의 증상 개선 정도를 확인하였다. 먼저 관절염 동물모델 제조를 위해 DBA1/J 마우스에 타입 II 콜라겐을 intra-dermal 주사하여 관절염을 유도하였으며, 관절염 유도 후 Grim19 및 R12-Grim19 과발현 벡터를 각각 Hydrodynamic injection 방법을 통해 마우스에 주사하였는데, Hydrodynamic injection은 물리적인 힘을 사용하여 세포막을 통과하여 세포질 내로 도입하는 방법으로 생리 식염수에 희석된 과발현벡터를 꼬리 정맥으로 주사하였으며, 이때 대조군으로는 MOCK 벡터를 주사한 마우스를 사용하였다. 또한, 각 마우스 군에 대해 관절염 유도 후부터 관절염 지수, 조직파괴 정도 및 염증 정도를 평가 하였다.

그 결과, 관절염이 유도된 마우스를 대상으로 R12-Grim19를 주사한 경우 mock 벡터 및 Grim19 벡터를 주사한 군에 비해 시간에 따른 관절염이 효과적으로 억제되는 것으로 나타났으며 염증반응 및 연골의 파고 정도 또한 가장 현저하게 감소된 것으로 나타났다. 또한 조직 염색 결과 Mock 벡터의 경우 염증성 세포들이 상당수 침윤되어 있음과 비교해 관절 조직의 파괴 정도가 R12-Grim19에 의해서는 확연히 줄어든다는 것을 알 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발병자들은 본 발병에 따른 R12-Grim19이 실제적으로 면역질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 5>

관절염 동물모델에서 R12 - GRIM19 처리에 따른 염증성 항체 생성 억제 효과 분석

관절염 생체모델에서 혈청 내 R12-Grim19에 의해 염증성 자가 항체 생성이 억제되는지 알아보기 위해, 상기 <실시예 4 >의 관절염 유도 마우스의 관절염 유도 3주 후 각 마우스 군에서 혈액을 채취하고 원심 분리기를 이용하여 혈청을 분리 하였으며, 96well plate에 type ll collagen을 코팅한 뒤 Bethyl 사에서 제공하는 mouse IgG2a ELISA kit를 이용하여 분리 된 혈청 내의 Cll 특이적인 염증성 항체(IgG2a)의 발현 양을 측정하였다.

그 결과, R12-Grim19에 의해 혈청 내 Cll-IgG2a의 발현이 현저하게 억제 되는 것으로 나타났고, 이러한 억제정도는 Grim19 보다 더 우수한 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른R12-Grim19는 관절염 동물 모델의 생체 내에서 Cll 항원에 특이적인 염증성 자가 항체를 선택적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

항원특이적인 면역세포의 증식억제

관절염 마우스 모델에서 R12-Grim19에 의한 항원특이적인 면역세포의 증식이 억제되는지 알아보기 위해 상기<실시예4>의 관절염 유도 마우스의 비장세포에서 얻은 세포를 항원(이형콜라겐)으로 자극후 증가하는 세포를 CFSE 염색으로 FACs 분석을 통해 확인해보았다. 분리된 각 군의 세포 2X10^6당 0.1% BSA/PBS 1ml에 넣고 CFSE를 5uM농도가 되게 첨가 한다. 첨가 후 세포는 37℃C에서 15분간 반응 시킨다. 반응 후 차가운 1% FBS/RPMI로 세척 해주고 CFSE가 염색된 각 군의 세포는 5x10^5 세포로 48well에 plating 한다. 각 세포는 anti CD3와 type II collagen 50ug/ml을 주고 3일 배양 하였다. 배양 후 세포는 FACs caliber를 사용하여 FL1-FITC 채널에서 분석하였으며, 증식되어 왼쪽으로 이동된 세포를 분석 하였다.

그 결과 대조군 벡터를 주입한 마우스의 증식보다 Grim19를 주입한 마우스의 증식이 감소되는 것으로 나타탔고, Grim19에 비해 R12-Grim19를 주입한 마우스에서는 증식이 더 현저하게 감소되어있는 것이 확인되었다. 따라서 R12-Grim19는 항원에 의한 면역세포의 증식도 억제하는 것으로 자가면역질환에 중요한 역할을 한다고 생각된다.

< 실시예 7>

관절염 동물모델에서 R12 - GRIM19 처리에 따른 관절 내 염증성 사이토카인, 신생혈관인지 및 관절파괴 인자의 억제효과 분석

상기 실시예들을 통해 본 발명자들은 본 발명의 R12-Grim19가 관절염 동물모델의 생체 내에서 관절염 대표 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현을 억제하며, Foxp3의 발현을 증가시켜 Treg의 분화를 돕고, 자가항체의 생성을 억제하며, 관절의 파괴 및 염증성 세포들의 침윤을 억제하는 사실을 확인하였다. 따라서 관절 조직 내 염증성 세포의 발현에도 R12-Grim19이 영향을 주는지 조사하고자, 관절조직을 염색하여 관찰하였는데, 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 관절염이 유도된 마우스를 대상으로 Grim19 및 R12-Grim19를 각각 주사한 마우스 및 mock 벡터를 주사한 마우스로부터 각 마우스의 관절을 채취한 후, 조직 염색을 수행하였는데, 이때 각 염색대상인 인자로 IL-1b, IL-6, IL-17, TNF-a 및 RANK와 VEGF에 대한 항체를 사용(시그마 사로부터 구입)하여 각 인자들을 염색하였다.

그 결과, 관절염이 유도된 대조군 마우스 군의 경우, 염증성 사이토카인인 L-1b, IL-6, IL-17 및 TNF-a가 세포내에서 강력하게 발현되는 것으로 나타났고, 특히 관절 파괴인자인 RANK 및 신생 혈관 형성과 관련된 VEGF를 발현하는 세포 또한 강하게 침윤되어 있는 것으로 나타났다. 반면, Grim19 및 R12-Grim19이 처리된 관절염 마우스 군의 경우 대조군에 비해 염증성 사이토카인, 관절 파괴 인자 및 VEGF의 발현이 현저하게 억제되어 있는 것으로 나타났으며, Grim19에 비해 R12-Grim19이 더 현저한 억제 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 R12-Grim19이 관절염 동물 모델의 관절에서 염증성 세포의 침윤 및 증식을 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> R12-Grim19 Fusion peptide having cell penetration for preventing or treating immune disease and pharmaceutical composition comprising thereof <130> np12-1046 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> R12-Grim19 peptide sequence <400> 1 Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met Ala Ala 1 5 10 15 Ser Lys Val Lys Gln Asp Met Pro Pro Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Ile 20 25 30 Asp Tyr Lys Arg Asn Leu Pro Arg Arg Gly Leu Ser Gly Tyr Ser Met 35 40 45 Phe Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Ile Phe Gly Tyr Trp Arg Met Met 50 55 60 Arg Trp Asn Gln Glu Arg Arg Arg Leu Leu Ile Glu Asp Leu Glu Ala 65 70 75 80 Arg Ile Ala Leu Met Pro Leu Phe Gln Ala Glu Lys Asp Arg Arg Thr 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Arg Glu Asn Leu Glu Glu Glu Ala Ile Ile Met Lys 100 105 110 Asp Val Pro Asn Trp Lys Val Gly Glu Ser Val Phe His Thr Thr Arg 115 120 125 Trp Val Pro Pro Leu Ile Gly Glu Met Tyr Gly Leu Arg Thr Lys Glu 130 135 140 Glu Met Ser Asn Ala Asn Phe Gly Phe Thr Trp Tyr Thr 145 150 155 <210> 2 <211> 474 <212> DNA <213> R12-Grim19 DNA sequence <400> 2 atgcgacgga gacgacgtag acgcaggcgg cgacgccgta tggctgccag caaggtgaag 60 caggacatgc cccctcctgg cggctacggc cccatcgact acaagagaaa cctgcccaga 120 agaggcctga gcggctacag catgttcgcc gtgggcatcg gcgccctgat cttcggctac 180 tggagaatga tgagatggaa ccaggagaga cggagactgc tgatcgagga cctggaggcc 240 agaatcgccc tgatgcccct gttccaggcc gagaaggaca gaagaaccct gcagatcctg 300 agagagaacc tggaggagga ggccatcatc atgaaggacg tgcccaactg gaaggtgggc 360 gagagcgtgt tccacaccac aagatgggtg cctcccctga tcggcgagat gtacggcctg 420 agaaccaagg aggagatgag caacgccaac ttcggcttca cctggtacac ctag 474 <210> 3 <211> 435 <212> DNA <213> Grim19 DNA sequence <400> 3 atggctgcca gcaaggtgaa gcaggacatg ccccctcctg gcggctacgg ccccatcgac 60 tacaagagaa acctgcccag aagaggcctg agcggctaca gcatgttcgc cgtgggcatc 120 ggcgccctga tcttcggcta ctggagaatg atgagatgga accaggagag acggagactg 180 ctgatcgagg acctggaggc cagaatcgcc ctgatgcccc tgttccaggc cgagaaggac 240 agaagaaccc tgcagatcct gagagagaac ctggaggagg aggccatcat catgaaggac 300 gtgcccaact ggaaggtggg cgagagcgtg ttccacacca caagatgggt gcctcccctg 360 atcggcgaga tgtacggcct gagaaccaag gaggagatga gcaacgccaa cttcggcttc 420 acctggtaca cctag 435 <210> 4 <211> 144 <212> PRT <213> Grim19 peptide sequence <400> 4 Met Ala Ala Ser Lys Val Lys Gln Asp Met Pro Pro Pro Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Ile Asp Tyr Lys Arg Asn Leu Pro Arg Arg Gly Leu Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Met Phe Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Ile Phe Gly Tyr Trp 35 40 45 Arg Met Met Arg Trp Asn Gln Glu Arg Arg Arg Leu Leu Ile Glu Asp 50 55 60 Leu Glu Ala Arg Ile Ala Leu Met Pro Leu Phe Gln Ala Glu Lys Asp 65 70 75 80 Arg Arg Thr Leu Gln Ile Leu Arg Glu Asn Leu Glu Glu Glu Ala Ile 85 90 95 Ile Met Lys Asp Val Pro Asn Trp Lys Val Gly Glu Ser Val Phe His 100 105 110 Thr Thr Arg Trp Val Pro Pro Leu Ile Gly Glu Met Tyr Gly Leu Arg 115 120 125 Thr Lys Glu Glu Met Ser Asn Ala Asn Phe Gly Phe Thr Trp Tyr Thr 130 135 140

Claims

삭제
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삭제
삭제
세포투과성을 갖는 12개의 연속적인 아르기닌(R)과 Grim19이 융합된 재조합 펩타이드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물로서,
상기 재조합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이고,
상기 재조합 펩타이드는 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하고, 면역조절 T세포(Treg)의 활성을 촉진시키며, 염증성 세포의 침윤 및 증식을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제5항에 있어서,
상기 면역질환은 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스로부터 선택된 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.