KR102480812B1

KR102480812B1 - 신데칸 2의 의학적 용도

Info

Publication number: KR102480812B1
Application number: KR1020227014712A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 조셉 엘리먼
Original assignee: 오르브센 테라퓨틱스 리미티드
Priority date: 2013-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2022-12-22
Also published as: US11026994B2; EP2986631B1; BR112015026258A2; JP6438457B2; US10251934B2; WO2014170411A1; US20160058832A1; JP2016516797A; EP2986631A1; KR20150143625A; CA2909356C; RU2015148769A3; AU2014255755B2; CA3205855A1; US20190365851A1; CN105324391A; KR20220062677A; AU2014255755A1; CA2909356A1; RU2015148769A

Abstract

SDC2, SDC2를 포함하는 조성물, SDC2를 암호화하는 벡터, 및 세포에 의한 SDC2의 발현을 조절하는 화합물은 면역 조절 또는 다른 특정한 치료학적 중재를 성취하기 위해 포유동물, 예를 들어 인간 세포의 처리에 사용된다. 세포를 SDC2와 결합시키고, 상기 세포를 SDC2와 결합하는 항체 또는 그의 단편으로 처리하거나, 또는 상기 세포에 의한 SDC2의 발현 또는 활성을 조절함으로써 상기 세포를 처리한다. 세포 또는 조직은 그들의 면역조절 또는 다른 치료학적 성질을 근거로 치료학적 용도를 위해 처리된 세포로부터 유래된다.

Description

신데칸 2의 의학적 용도{MEDICAL USE OF SYNDECAN-2}

본 발명은 면역조절 및 치료제 및 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 면역조절 및/또는 다른 치료학적 성질에 영향을 주기 위해서 기존의 세포-기반 제품을 시험하고 변형시킴에 관한 것이다.

임상 용도의 다수의 중간엽 줄기세포(MSC) 관련 제품들이 공지되어 있으며 보다 많은 제품들이 개발중에 있고 장차 인간 용도로 승인될 것이 예상된다. MSC는 그의 치료학적 가치에 기여할 수 있는 일부 면역조절 성질을 나타내며, MSC는 특히 자가면역 질환의 치료에 사용된다. 인간 MSC의 면역억제 잠재성은 예를 들어 T-세포, B-세포, 수지상 세포 및 천연 살해 세포의 증식에 억제 효과를 나타내는 연구들에 의해 입증된다(Han et al., 2012).

EP 1795588은 이식편 대 숙주병(GVHD)의 치료를 위한 지방조직 유래된 MSC의 용도를 개시하며; 상기 세포가 면역억제 성질을 발휘한다고 한다.

EP 2545928은 무혈청 또는 저혈청 배양에 의해 유지되는 면역억제 능력을 갖는 MSC-함유 세포 제제에 관한 것이다.

WO 2012/111997은 MSC-기반 치료법에 적합한 면역억제를 성취하기 위해서, MSC를 면역조절성 T 세포와 함께 제공하는 복합 치료법을 개시한다.

WO 2009/1105624는 분자 및 폴리펩타이드를 함께 세포에 전달하여 상기 분자의 치료학적 효능을 개선시킴과 관련된 조성물 및 방법을 개시한다. 성장 인자들의 전달은 상기 성장 인자들을 그들의 수용체 및 공-수용체; 예를 들어 신데칸 1, 2, 3 및 4와 함께 전달함으로써 개선된다. 신데칸과 성장 인자의 공-전달은 상기 성장 인자를 단백질 분해로부터 보호하고, 이들의 활성을 증대시키며, 상기 성장 인자를 세포 표면에 표적화하여 성장 인자 신호전달을 촉진시킨다.

KR1020100106744는 이동성 피부염 또는 멜라닌형성-관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다. 이동성 피부염의 예방 또는 치료 조성물은 활성 성분으로서 신데칸-2를 함유한다. 상기 고려되는 이동성 피부염 질환은 흑색종, 과색소침착, 저색소침착 또는 백반증이다.

WO 02/087609는 헤파란 설페이트 글리코스아미노글리칸 쇄가 부착된 신데칸에 대한 리간드로서 유두종바이러스 입자에 결합하는 용해성 펩타이드, 단백질, 또는 융합 단백질을 포함하는, 포유동물에서 유두종바이러스 감염을 예방하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

WO 03/062386은 동물에서 신데칸 수준 및 혈관형성을 조절함과 관련된 방법 및 물질에 관한 것이다. 신데칸 폴리펩타이드 및 신데칸 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 개시되어 있다. 이들을 사용하여 혈관형성 조절을 위한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 유사체를 생성시킨다. 신데칸- 및 혈관형성-조절제의 확인 방법이 또한 논의되어 있다.

문헌[Mukhopadhyay, A. et al., J. Trauma Injury Infect. Crit. Care, 2010, vol. 68, pp. 999-1008]은 신데칸-2 및 FGF-2가 서로 상호작용하여, 세포로부터 신데칸-2의 발산을 생성시키고 차례로 켈로이드 표현형의 원인인 사건들을 활성화시킬 수 있음을 추정한다.

문헌[Kaur, C. et al., Glia, 2009, vol. 57, pp.336-349]은 아메바모양 미세교세포에서 신데칸-2 발현을 검사하며 상기 발현이 저산소증에 의해 상향조절됨을 나타낸다.

문헌[Contreras, H. R. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001 , vol. 286, pp. 742-751]은 암에서 신데칸-2 발현을 검사하며 신데칸-2 발현이 몇몇 세포의 이동성 중간엽-유사 표현형으로의 분화에 관련됨을 나타낸다.

문헌[Sojoong Choi, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2012, vol. 417, pp. 1260-1264]은 결장암 세포로부터 신데칸-2의 발산에 대한 기질 메탈로프로테이나제-7(MMP-7)의 역할을 검사하였다. MMP-7은 상기 세포로부터 신데칸-2의 발산을 직접 매개하는 것으로 관찰되었다.

문헌[Alexopoulou, A. N. et al., BMC Cell Biol., vol. 9, 2008, doi:10:10.1186/1471-2121-9-2]은 중배엽으로의 줄기세포 분화 중 트랜스유전자의 장기간 발현에 유용한 벡터들을 조사하였다. 상기 사용되는 벡터들 중 하나는 신데칸-2를 암호화한다.

WO 2011/153458은 뎅기 바이러스에 의해 표적화되는 세포상에 존재하는 신데칸에의 뎅기 바이러스 결합을 방해함을 포함하는 뎅기열 감염을 방해하는 방법을 개시한다. 또한 상기 목적과 관련된 약학 조성물들을 개시한다.

문헌[Mytilinaiou, M. et al., IUBMB Life, 2013, vol. 65, pp. 134-143]은 TGFβ2/Smad2에 의해 매개되는 섬유육종 세포의 세포 부착의 조절인자로서 신데칸-2의 역할을 검사하였다.

문헌[Kim, Y. et al., Oncogene (2003), vol. 22, pp. 826-830]은 감소된 신데칸-2 발현이 트리코스타틴-A-유발된 형태 변화와 상관 있으며 결장 암종 세포에서 종양형성 활성을 감소시킴을 관찰하였다. 또한 안티센스 cDNA에 의한 신데칸-2 발현의 하향조절은 상기 형태 변화를 모방하여 결장암 세포의 정박-독립적인 성장을 감소시켰다.

문헌[Chung, H. et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 287, no. 23, pp. 19326-19335, 2012]은 멜라노코르틴 1 수용체가 신데칸-2 발현을 조절함으로써 흑색종 세포 이동을 조절함을 발견하였다. 이는 멜라노코르틴 1 수용체가 p38 MAPK의 활성화를 억제하고, 후속으로 흑색종 세포에서 신데칸-2 발현 및 이동을 증대시키기 때문이다.

문헌[Peterfia, B. et al., PLoS ONE, vol. 7, no. 6, e39474]은 신데칸-1이 신데칸-2 발현의 유도를 통해, 중간엽 종양 세포주의 악성을 증대시킴을 관찰하였다. 따라서, 신데칸-1은 신데칸-2와 협력하여 인간 섬유육종 세포주의 증식, 이동 및 전이를 증대시킨다.

문헌[Ruiz, X. et al., PLoS ONE, vol. 7, no. 8, e43049]은 신데칸-2가 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-3(IGFBP-3)의 새로운 표적이며 신데칸-2가 섬유증에서 과발현됨을 개시한다. 상기 증가된 SDC2 발현은 적어도 부분적으로 2개의 섬유증 전구인자, TFGβ 및 IGFBP-3의 활성에 기인한다.

문헌[Dieudonne, F-X et al., Journal of Bone and Mineral Research, vol. 27, no. 10, pp. 2118-2129]은 신데칸-2 발현이 골육종 세포에서 독소루비신에 의해 어떻게 상향조절되는지를 개시한다. T-세포 인자(TCF)는 신데칸-2의 억제를 맡고 있다. 따라서, TCF 활성의 표적화된 억제는 마우스의 골육종 세포 및 골 종양에서 신데칸-2 발현 및 독소루비신에 대한 감작을 촉진한다.

KR 20120013915는 신데칸-2 펩타이드 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 작용제를 함유하는 결장암의 진단 조성물을 개시한다. 상기 작용제는 신데칸-2 펩타이드 단편에 특이적인 항체를 함유한다.

문헌[Huang, X. et al., Oncology Reports 2009, vol. 21 , pp. 1123-1129]은 식도 편평세포 암종에서 신데칸-2(SDC2) 및 시스테인-풍부 61(CYR61)의 변경된 발현의 예후 양상을 논의한다.

당해 분야에서 공통적인 문제는, 단독으로 사용되는 MSC-기반 제품에 대해 불충분한 면역억제가 존재하거나 또는 상기 MSC의 면역억제 성질이 세포 계대 배양물에서 시간이 지남에 따라 상실됨, 즉 유지되지 않는다는 것이다. 이러한 성질을 유지하거나, 자극하거나 또는 회복시킬 수 있는 것이 바람직하다.

면역억제 섭생을 사용하여 이식 거부를 예방하거나 감소시킬 수 있으며, 임상적으로 사용되는 면역억제 섭생은 전형적으로는 현재 사용되는 다수의 작용제들의 조합을 포함한다. 대안의 면역억제제 및 치료법들을 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 유사하게, 혈관형성을 촉진하는 작용제 및 치료법들을 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 당해 분야의 잠재적인 치료 제품의 효능을 분석할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 제안된 분석은 용해성 TNFR1을 기본으로 하지만, 대안의, 바람직하게는 개선된 분석이 필요하다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 면역조절성이고/이거나 본 발명에 명시된 바와 같은 다른 치료학적 성질들을 갖는 대안의 작용제 및 치료법들을 제공하는 것이다. 본 발명의 특정한 실시태양들의 목적은 세포 또는 조직을 포함하는 제품 또는 조성물을 덜 면역원성으로 또는 보다 더 면역억제성으로 만드는데 사용하기 위한 작용제 및 치료법들을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 실시태양들의 용도에서, 증가된 신데칸-2(SDC2) 발현 및/또는 활성이 면역억제를 증대시키고/시키거나 다른 치료학적 성질을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 SDC2, SDC2를 포함하는 조성물, SDC2를 암호화하는 벡터, 및 세포의 처리에 사용하기 위해 SDC2의 발현을 조절하는 화합물(이때 상기 세포는 치료학적 용도를 위한 것이다)을 제공한다. 이들 조성물, 벡터 및 화합물은 그 자체가 치료학적 치료 특히 인간의 치료학적 치료, 예를 들어 면역조절 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 다른 치료학적 용도에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 세포를 SDC2와 결합시키고, 상기 세포를 SDC2와 결합하는 항체 또는 그의 단편으로 처리하고/하거나 상기 세포 또는 세포들에 의한 SDC2의 발현 또는 활성을 조절함을 포함하는, 상기 세포들의 집단의 처리 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 생성된 세포 및 또한 처리된 세포로터 유래된 세포 및 조직은 본 발명의 다른 부분을 형성한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 실시태양들은 SDC2를 포함하는 조성물, SDC2를 사용하는 방법 및 SDC2의 특정한 용도를 포함한다. 적합하게는 상기 SDC2는 용해성 형태이며, 특정한 실시태양에서 상기는 인간 또는 말 SDC2이지만, 일반적으로 포유동물로부터의 SDC, 특히 인간, 마우스, 래트, 개, 말, 토끼, 양, 소 및 돼지로부터의 SDC2가 본 발명에 포함된다.

상기 조성물은 약물에 사용하기에 적합한, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 세포 배양에 사용하기에 적합한, 예를 들어 치료학적 세포-기반 제품의 제조에서 배양되는 세포에의 첨가를 위해, 세포 배양 배지(예를 들어 세포 배양 배지 중의 SDC2)를 포함하거나 또는 상기 배지로서 제형화될 수 있다. 상기 조성물을 서방성으로 제형화하고 임의로 반감기를 개선시키기 위해 변형시킬 수 있다, 예를 들어 상기 SDC2(또는 단편, 변체, 유도체 또는 유사체)를 PEG화하거나 또는 PSA화할 수 있다. 상기 조성물을 주사용으로, 예를 들어 주사용수 또는 염수 용액 중에서 제형화할 수 있다. 상기 조성물을 흡입용으로, 예를 들어 분무에 의해 제형화할 수 있다. 상기 SDC2를 재조합체 형태로 제조하거나 또는 SDC2를 발현하거나 과발현하는 세포로부터 단리할 수 있다. 시험된 예에서, SDC2는 SDC2를 발현하는 세포의 상등액으로부터 단리되었으며 재조합적으로 제조되었고; 본 발명의 어딘가에 나타낸 바와 같이, SDC2가 배양 배지내로 발산될 수 있으며 따라서 SDC2를 SDC2 발현 세포의 배양물로부터 수확할 수 있다.

본 발명은 또한 SDC2; 다시 바람직하게는 인간 또는 말 SDC2를 암호화하는 발현 벡터를 제공하지만, 일반적으로는 또한 언급된 포유동물로부터의 SDC2를 암호화하는 벡터도 본 발명의 실시태양을 형성한다. "발현 벡터"란 용어는 전사를 위해 제공되는 추가적인 분절에 작동적으로 연결되는 SDC2 암호화 분절을 포함하는 핵산, 예를 들어 선형 또는 환상 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 상기와 같은 추가적인 분절들은 프로모터(다수가 공지되어 있으며, 적합한 예로는 CMV 및 UbC 프로모터가 있다), 종결자 및 UTR 서열을 포함할 수 있으며, 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선택성 마커, 인헨서, 폴리아데닐화 신호 등을 임의로 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 상기 두 요소를 모두 함유할 수도 있다. 하기의 실시예에 사용되는, 본 발명의 하나의 적합한 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 다른 적합한 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련된 바이러스가 있다. 인간 SDC2의 발현에 바람직한 벡터는 서열번호 1 또는 2로부터의 암호화 서열(예를 들어 폴리A 꼬리 없음), 또는 그의 대립유전자 변체, 또는 서열번호 3 또는 4를 암호화하는 또 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

SDC2는 상기 배양 배지내로 세포에 의해 발산될 수 있으며 이러한 엑토도메인 발산은 쉐다제(sheddase)로서 일반적으로 지칭되는 효소의 고도로 조절되는 직접 작용이다. 기질 메탈로프로테이나제(MMP)는 신데칸의 쉐다제로서 공지되어 있다. 특히 MMP-7은 SDC2 발산에 필요한 것으로 입증되었다(Ryu et al., 2007). 그러나 성장 인자(Subramanion et al., 1997), 케모킨(Li et al., 2002; Brule et al., 2006; Charnaux et al., 2005), 헤파라나제(Yang et al., 2007), 및 세포 스트레스(Fitzgerald et al., 2000)를 포함한 다양한 세포외 자극들이 또한 SDC2의 발산을 유도하는 것으로 입증되었다.

하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 인간 MSC의 표면으로부터 배양 배지내로 발산된 SDC2는 상기 SDC2-함유 배지가 별도의 세포 집단의 치료에 사용되는 경우 면역억제 성질을 가졌다. 따라서, 본 발명은 상기 치료학적 효과인 면역억제를 제공하는 SDC2의 용도를 제공한다. 치료, 예를 들어 이식을 위한 세포를 이러한 방식으로, 예를 들어 SDC2에의 노출에 의해 처리하여 상기 세포의 면역원성 성질을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따라 성취되는 면역억제 효과를 또한 다른 세포 기반 치료법들과 병용하여, 예를 들어 환자에서 불리한 면역 반응의 위험성 또는 발생을 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 SDC2 및 SDC2-함유 조성물, 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물을, MSC 및/또는 기질 줄기세포이거나 또는 이들을 포함할 수 있는 또 다른 치료학적 조성물, 예를 들어 세포 치료 제품과 함께 환자에게 투여할 수 있다.

세포의 처리에 사용하기 위해 세포에 의한 SDC2의 발현을 조절하는 화합물이 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 본 발명의 실시태양에서, 상기 화합물은 SDC2의 발현을 증가시킨다. 상기와 같은 화합물의 예는 p53을 활성화하는 화합물, ERK, p38 또는 JNK SAPK 키나제 경로를 활성화하는 화합물, 저산소증 유도 인자(HIF)-매개된 경로를 활성화하는 화합물, TGF, BMP, 레프티(Lefty), 노달(Nodal) 및 액티빈(Activin) 경로를 작용화 (agonize)하는 화합물, 노취(NOTCH) 경로를 작용화하는 화합물, 예를 들어 Jagged1, Jagged2, DLL1, DLL2, DLL3 및 DII4, 헤지호그(Hedgehog) 신호전달 (signaling) 경로를 작용화하는 화합물, WNT 경로를 작용화하는 화합물, 안드로젠 수용체 또는 에스트로젠 수용체 경로를 활성화하는 화합물, 및 NFkB 경로를 활성화하는 화합물을 포함한다. SDC2 발현을 증대시키는데 사용하기 위한 화합물의 예는 p53 조절 화학요법제(예를 들어 누틀린, 5-FU, 독소루비신, 시스플라틴, 젬시타빈, 탁솔), HDAC 억제제, PPAR 작용물질, DMOG(저산소증 모방물질), 포스콜린, 콜포신(포스콜린의 수용성 버전, cAMP 자극제), WY4,643(피리니식산, 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체-α(PPARα) 작용물질), 트로글리타존(PPARα 및 PPARγ 모두에 대한 리간드), 스플리토미신, Sir2(3 부류 HDAC 억제제), 트리코스타틴 A(1/2 부류 HDAC 억제제), 나트륨 페닐부티레이트(HDAC 억제제), 발프로산(HDAC 억제제) 또는 SAHA(또 다른 HDAC 억제제)를 포함한다. 따라서 세포 요법 제품에서 SDC2의 발현 증대를 사용하여 상기 제품을 면역억제성으로 만들거나 상기 제품의 면역억제 성질을 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 다루는 문제점은 또 다른 면역조절성 및/또는 다른 치료학적 중재의 제공 문제이다. 본 발명의 용도에서, 상기 조성물, 벡터 및 화합물을 치료학적 치료에 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 일련의 실시태양들에서, 상기 조성물, 벡터 또는 화합물은 면역조절을 포함하는 치료학적 치료에 사용하기 위한 것이다. SDC2의 양 및/또는 발현 및/또는 활성의 증가는 면역억제를 촉진하며; 따라서 본 발명은 면역억제를 포함하는 치료학적 치료를 제공한다.

본 발명의 조성물, 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물을 단독으로 또는 본 발명에서 언급한 바와 같은 복합 요법에 사용하여 폐의 질환, 예를들어 ARDS, COPD 및 IPF를 치료할 수 있다. 시험시 정맥내 주사된 기질 세포는 폐에 축적되는 경향이 있으며, 이는 상기 폐로의 전달이 성취될 수 있음을 나타낸다. SDC2를 또한 폐 전달을 위해 분무할 수 있다.

SDC 발현 및/또는 활성을 증대시키는 본 발명의 조성물 및 치료 및 또한 본 발명의 상응하는 벡터 및 화합물은 일반적으로, 면역억제를 필요로 하거나 또는 면역억제가 이로울 수 있는 임의의 적응증에 적합하며; 이들 적응증은 일반적으로 이식편 이식, 건선, 천식 및 자가면역 성분을 갖는 적응증, 예를 들어 알러지, 대장염, 피부염 및 염증성 질환에 적합하다.

실시태양들에서, 본 발명의 조성물 및 치료 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물을 소염제, 예를 들어 항-TNF 항체(상기와 같은 항체의 예는 인플릭시맵(레미케이드), 아달리뮤맵(휴미라), 세르톨리주맵 페골(심지아), 및 골리뮤맵(심포니)을 포함한다), 또는 순환 수용체 융합 단백질, 예를 들어 에타너셉트(엔브렐)와 함께 사용할 수 있다. 본 발명을 항-CD3 항체와 함께 사용할 수 있으며, 상기와 같은 항체의 예는 뮤로모냅-CD3, 오텔릭시주맵, 테플리주맵 및 비실리주맵을 포함한다. 상기 조합을 면역억제 요법에 사용할 수 있으며; 이를 이식 거부 및 다른 염증성 또는 자가면역 질환, 예를 들어 크론병, 궤양성 대장염 및 1형 당뇨병의 치료 또는 예방, 및 면역 관용의 유도에 사용할 수 있다.

하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, 인간 MSC의 표면상의 증가된 SDC2는 상기 세포를 대조용 MSC에 비해 보다 면역억제성으로 만들었다. 따라서, 본 발명은 SDC2의 증가된 세포 발현 또는 활성 또는 양을 제공하여 상기 치료학적 효과를 제공한다. 이식용 세포를 이와 같은 식으로 처리하여 상기 세포의 면역원성 성질을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따라 성취되는 면역억제 효과를 또한 다른 세포 기반 요법과 병용하여, 예를 들어 환자에서 불리한 면역 반응의 위험성 또는 발생을 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 본 발명의 처리된 세포를 환자에게, MSC 및/또는 기질 줄기세포이거나 또는 이들을 포함할 수 있는 또 다른 치료 조성물, 예를 들어 세포 요법 제품과 함께 투여할 수 있다.

본 발명의 세포를 다른 치료학적 제품 전에, 상기 제품과 동시에 또는 상기 제품 이후에 투여할 수 있다. 본 발명의 세포를 미리 투여하여 세포 요법 제품, 예를 들어 이식물의 후속 투여에 대한 환자의 면역계의 관용을 지원할 수 있다.

본 발명의 조성물, 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물, 및 또한 SDC 발현 및/또는 활성을 증대시키는 본 발명의 조성물, 용도, 방법 및 치료를 사용하여 암을 치료할 수 있다. 암, 구체적으로 간세포 암종, 경부암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 결장암, 섬유육종, 수질모세포종, 및 성상세포종은 일반적으로 본 발명을 사용하여 치료될 수 있다.

본 발명의 실시태양에서 상기 치료되는 암은 고형 종양이다. 더욱이, 본 발명의 실시태양은 상기 치료를, 암 유지 및 성장을 지탱하는데 필수적인 것으로 여겨지는 암 기질에 표적화함, 유리하게는 상기 치료법을 상기 암 기질에 집중시킴을 포함한다.

하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, SDC2는 췌장암, 전립선암, 유방암 및 결장암 각각에 대해 항암 효과를 나타내었다.

본 발명의 조성물, 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물, 및 또한 SDC 발현 및/또는 활성을 증대시키는 본 발명의 조성물, 용도, 방법 및 치료를 사용하여 염증 및/또는 염증성 질병을 치료할 수 있다. 따라서, 소염 효과가 본 발명을 사용하여 성취될 수 있다.

하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, SDC2는 분석시 소염 효과를 나타내었다.

본 발명의 조성물, 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물, 및 또한 SDC 발현 및/또는 활성을 증대시키는 본 발명의 조성물, 용도, 방법 및 치료를 상처 치유 또는 골 치유에, 또는 상처 치유 또는 골 치유의 촉진에 사용할 수 있다.

하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, SDC2를 발현하는 세포는 한 모델에서 상처 치유를 현저하게 증대시켰다. 본 발명의 다른 데이터에 유추하여, 이는 당뇨병 상처 치유 및 골절 치유를 포함한 상처 치유에서 SDC2의 유사한 활성을 지지한다.

본 발명의 조성물, 및 또한 본 발명의 벡터 및 화합물, 및 또한 SDC 발현 및/또는 활성을 증대시키는 본 발명의 조성물, 용도, 방법 및 치료를 사용하여 다양한 말 질환, 예를 들어 제엽염, 힘줄 손상, 및 운동 유발된 폐 출혈(EIPH)(또한 "출혈" 또는 "출혈 발작"으로서 공지됨)을 치료할 수 있다.

동물, 특히 포유동물 및 예를 들어 인간 또는 말의 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약학 조성물을 또한 본 발명에 의해 제공한다. 상기 약학 조성물은 적합하게는 상기 동물에서 상기 질병 또는 질환을 치료하기에 유효한 양의 본 발명의 화합물, 조성물 또는 벡터를 포함한다. 따라서 본 발명의 활성제를 허용 가능한 약학 담체와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 활성제를 주사용의 약학적으로 허용 가능한 액체 매질 중에서 투여할 수 있다. 액체 매질의 예는, 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 인간 혈청 알부민과 같은 추가적인 물질을 또한 임의로 함유하는 염수, 인산염 완충된 염수이다. 치료학적 단백질 및 펩타이드의 투여 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 동물, 바람직하게는 인간에게 본 발명의 활성제를 투여함을 포함하는, 상기 동물, 바람직하게는 인간의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 개시된 약학 조성물은 의학적 및 수의학적 용도에 유용하며 상기 조성물을 개인에게 단독으로 또는 다른 보충적인 활성 성분, 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께 투여할 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 비히클, 안정제, 희석제, 첨가제, 보조제 또는 부형제를 임의로 포함할 수 있다. 유용한 약물적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 수성 매질, 예를 들어 물, 염수, 글리신, 히아루론산 등; 고체 담체, 예를 들어 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 마그네슘 카보네이트 등; 용매; 분산 매질; 코팅제; 항균제 및 항진균제; 등장화제 및 흡수 지연제; 또는 임의의 다른 불활성 성분을 포함한다. 약물적으로 허용 가능한 담체의 선택은 투여 방식에 따라 변할 수 있다. 임의의 약물학적으로 허용 가능한 담체가 상기 활성 성분과 배합 금기인 경우를 제외하고, 약학적으로 허용 가능한 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 상기와 같은 약학 담체의 특정한 용도의 비제한적인 예들을 하기 문헌들에서 찾을 수 있다: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); and Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003).

본 발명에 개시된 약학 조성물은 다른 약학적으로 허용 가능한 성분들, 예를 들어 비제한적으로 완충제, 보존제, 긴장성 조절제, 염, 산화방지제, 삼투압농도 조절제, 생리학적 물질, 약물학적 물질, 벌크화제, 유화제, 습윤제, 감미 또는 풍미제 등을 임의로 포함할 수 있다. pH 조절을 위한 다양한 완충제 및 수단을 사용하여 본 발명에 개시된 약학 조성물을 제조할 수 있으나, 단 생성되는 제제는 약학적으로 허용 가능해야 한다.

다양한 투여 경로가 본 발명에 개시된 치료학적 화합물의 투여에 유용할 수 있다. 국소, 장 또는 비경구 투여 경로가 그 자체로서 적합할 수 있으며 상기와 같은 경로는 본 발명에 개시된 치료학적 화합물 또는 조성물의 국소 및 전신 전달을 모두 포함한다. 흡입, 국소, 비내, 설하, 주사, 주입, 적하, 직장 및/또는 질 사용을 위한 조성물을 약학 조성물의 제조에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있다.

별도로 또는 상기와 함께, 증가하는 SDC2 양 및/또는 발현 및/또는 활성은 혈관형성을 촉진하며; 따라서 본 발명의 상기와 같은 실시태양은 혈관형성을 포함하거나 촉진하는 치료학적 치료를 제공한다.

본 발명은 세포를 SDC2와 결합시킴을 포함하는 상기 세포 집단의 처리 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 (i) SDC2를 발현하는 세포, 또는 (ii) 본 발명의 다른 실시태양들에 따른 조성물 또는 화합물과 결합시킴으로써 성취될 수 있다. 시험관내 및 생체외 치료가 포함된다.

다른 실시태양에서, 본 발명을 면역활성화 및/또는 면역자극을 포함하는 치료학적 치료를 제공하기 위해 SDC2 양 및/또는 발현 및/또는 활성을 감소시키는데 적응시킬 수 있다.

상기 처리되는 세포는 줄기 세포, 예를 들어 기질 줄기세포 또는 MSC일 수 있으며, 적합하게는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 개, 말, 토끼, 양, 소 또는 돼지 및 특히 말 및 인간 세포이다.

본 발명은 상기 집단 중의 세포 또는 세포들에 의한 SDC2의 발현 또는 활성을 조절함을 포함하는, 상기 세포 집단의 처리 방법을 추가로 제공한다. 다시, 시험관내 및 생체외 처리가 포함된다. 상기 SDC2의 발현 또는 활성의 조절은 상기 세포의 면역억제성 성질을 조절할 수 있다. 상기 조절은 상기 세포의 또 다른 면역억제성 성질을 증가시키기 위해서 SDC2의 발현을 증가시킬 수도 있다. 상기 조절은 상기 세포의 또 다른 치료학적 성질을 증가시키기 위해서 SDC2의 발현을 증가시킬 수 있다.

세포를 처리하기 위해서, 상기 세포를 SDC2의 발현을 촉진하는 화합물로 처리할 수 있으며; 예를 본 발명의 어딘가에 제공한다. 상기 세포를 SDC2를 암호화하는 벡터로 형질감염시킬 수 있다.

상기 세포를, 예를 들어 SDC2 발현을 증가시키는 배양 또는 환경 조건에의 노출에 의해 상기 세포의 외인성 SDC2 발현을 증가시키도록 처리할 수 있다. 다수의 전략들을 사용하여 특히 기질 줄기세포 및 MSC를 포함한 줄기세포에서 SDC2 발현을 자극할 수 있다. 여기에는 특정한 생물 인자, 화합물 또는 스트레스에 의한 p53 활성화; ERK, p38 또는 JNK SAPK 키나제 경로를 활성화하는 화합물, 생물 인자 및 스트레스; 저산소증 유도성 인자(HIF)-매개된 경로를 활성화하는 생물 인자, 화합물 또는 스트레스; TGF, BMP, 레프티, 노달 및 액티빈 경로를 작용화하는 생물 인자, 화합물 또는 스트레스; 노취 경로를 작용화하는 생물인자, 화합물 또는 스트레스, 예를 들어 Jagged1, Jagged2, DLL1, DLL2, DLL3 및 DII4; 헤지호그 신호전달 경로를 작용화하는 생물 인자, 화합물 또는 스트레스; WNT 경로를 작용화하는 생물 인자, 화합물 또는 스트레스; 안드로젠 수용체 또는 에스트로젠 수용체 경로를 활성화하는 생물 인자, 화합물 또는 스트레스; 및 NFkB 경로를 활성화하는 생물 인자, 화합물 또는 스트레스가 포함된다.

본 발명의 실시태양들에서, SDC2 발현은 종양 억제 단백질인 p53의 직접 또는 간접 활성화에 의해 증가되었다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이는 SDC2 유전자의(예를 들어 인간 유전자상의) 프로모터 중의 "추정적인" p53-결합 부위의 존재에 기인할 수 있다. 상기 활성화를 다수의 방식으로 성취할 수 있으며, 이들 중 일부, 예를 들어 HDAC 억제, 성장 정지, 기아, 독소 노출 및/또는 화학요법은 숙련가에게 공지되어 있다.

혈청 기아(SS) 및 성장 정지(융합)는 모두 SDC2 발현을 자극하였다. SS 및 성장 정지는 모두 공지된 p53 자극이다.

HDAC 억제제 및 시르투인을 사용하여 SDC2 발현을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 용도에서, 스플리토미신, 발프로산 및 2-피롤리디논-n-부티르산(PBA)은 모두 24시간째에 SDC2 RNA 수준을 증가시켰으며, III 부류 HDAC 억제제인 스플리토미신에 의한 확고한 자극이 있었다. SIRT1 및 SIRT2를 포함한 HDAC의 시르투인 부류를 사용하여 SDC2 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 시르투인은 NAD-의존성 HDAC이며 p53 단백질을 탈아세틸화시키는 것으로 보고된다, 즉 p53의 아세틸화는 그의 전사활성화/전사 활성에 중요한 것으로 보고된다. 따라서, 시르투인은 p53 활성의 핵심 조절인자이다. 시르투인의 예는 니코틴아미드, 시르티놀, EX-527 및 테노빈을 포함한다. 본 발명의 다른 시험에서, 용매 DMSO가 또한 SDC2 RNA 수준을 증가시켰다. DMSO는 또한 HDAC 억제제(p53 활성화) 능력을 함유하는 것으로 보고된다.

세포에서 저산소증의 유도 또는 유발을 사용하여 SDC2 발현을 증가시킬 수 있으며; 또 다른 일련의 시험에서, 상기 저산소증 모방 DMOG(다이메틸옥살로일글리신)는 SDC2 RNA에서 매우 확고한 증가를 생성시켰다. DMOG는 저산소증 모방물질이며, 본 발명에 사용하기 위한 다른 저산소증 모방물질은 코발트 클로라이드, EDHB 및 데스페리옥사민을 포함한다. 저산소증은 p53을 자극하는 것으로 보고된다(ATR/CHK1 키나제를 통해).

독소, 예를 들어 환경 독소 벤조[a]피렌-7,8-다이올-9,10-에폭사이드(BPDE)를 사용하여 SDC2 발현을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 p53 활성제는 감마-조사, MDM2 억제제(누틸린) 및 화학요법제, 예를 들어 시스플라틴 및 젬시타빈의 사용을 포함한다.

따라서 본 발명의 실시태양은 SDC2 발현 및/또는 발산을 증가시키기 위해서 p53을 활성화시키는 세포의 처리를 포함한다.

처리하고자 하는 세포는 적합하게는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 개, 말, 토끼, 양, 소 또는 돼지 및 특히 말 및 인간 세포이다. 처리에 앞서, 상기 세포에 의한 SDC2의 발현은 낮거나 없을 수 있으며, 따라서 상기 처리는 상기 세포에 대해 앞서 보이지 않았던 SDC2 수준을 제공한다. 한편으로 처리 전의 발현 수준은 처음에는 높았으나 시간이 지남에 따라 감소되었을 수 있으며 상기 처리는 선행의 SDC2 발현 수준을 복원시키는 것이다, 예를 들어 세포 또는 조직으로부터 시간이 지남에 따라 상실되었던 면역억제성 및/또는 다른 치료학적 성질들을 복원시키는 것이다.

SDC2의 발현 또는 활성의 조절은 상기 세포의 면역억제성 성질을 감소시키기 위해서 SDC2의 양 및/또는 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있다. 상기 조절은 상기 세포의 혈관신생 성질을 감소시키기 위해서 SDC2의 양 및/또는 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 추가의 실시태양은 면역자극 및/또는 면역활성화를 유도하기 위해서 세포를 처리함을 포함한다. 세포를 고유의 SDC2 발현을 제거하기 위해 처리할 수 있다; 예를 들어 안티센스 요법 또는 다른 치료법을 사용하여 SDC 발현을 녹-아웃 또는 녹-다운시킬 수 있다.

본 발명의 모든 방법들은 상기 처리된 세포로부터 자손 세포 또는 조직을 이끌어냄을 추가로 포함하며; 본 발명은 또한 상기 방법들로부터 수득된 세포 또는 조직으로 연장된다.

따라서 본 발명의 실시태양에서 세포 상의 및 세포 매질 중의 SDC2의 수준을 면역조절 및/또는 다른 치료학적 성질들과 관련짓는다. 더욱 또한 본 발명은 세포 및/또는 조직을 포함할 수 있는 세포 요법 제품을 SDC2에 대해 시험함을 포함하는 시험 방법을 제공한다. 이를 SDC2에 대한 항체, 바람직하게는 SDC2-특이성 항체에 대한 결합에 근거한 분석을 사용하여 성취할 수 있다. 기존의 SDC2 ELISA 방법이 적합할 수 있다. SDC2를 세포 표면상에서 또는 매질 중에서 또는 상기 둘 다에서 측정할 수 있다. SDC2 수준을 사전측정된 표준과 비교할 수 있으며, 상승된 수준은 면역억제성 및/또는 다른 치료학적 성질의 존재를 가리키고 감소된 수준은 그의 부재를 가리킨다.

본 발명의 실시태양에서, 세포를 SDC2의 발현에 대해 분석하거나 또는 상기 세포를 포함하는 치료학적 제품(예를 들어 용액)을 SDC2의 존재에 대해 분석함을 포함하는, 상기 제품의 효능에 대한 분석을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 세포 요법 제품의 효능에 대한 분석에서 SCD2 수준의 사용에 있다.

일반적으로 본 발명의 시험/분석 방법의 사용에서, ELISA를 사용하여 SDC2 발산 및 따라서 인간 MSC의 특정 배치의 효능을 모니터할 수 있다.

상기 시험/분석에 실패한 세포 또는 제품은 버리거나 그의 SDC2 발현이 증가하도록 처리할 수 있다. SDC2의 분석을, 본 발명의 다른 방법에 따라 세포 또는 조직을 처리할 것인지의 여부를 결정하기 전에 사용할 수 있다.

본 발명의 분석 프로토콜은

1. 잠재적인 제품 중의 SDC2 수준을 분석하고;

2. 상기 수준을 허용 가능한 치료학적 제품에 대해 사전 측정된 최소값과 비교하고,

a. 상기 수준이 상기 최소값이상이면, 상기 잠재적인 제품은 허용되며;

b. 상기 수준이 상기 최소값 미만이면, 상기 제품은 허용되지 않고;

3. 임의로, 이어서 상기 수준을 허용될 수 없는 치료학적 제품에 대해 사전 측정된 최대값과 비교하고;

a. 상기 수준이 상기 최대값 미만이면 상기 제품은 거부되며;

b. 상기 수준이 허용 가능한 치료학적 제품에 대한 최소값과 허용될 수 없는 치료학적 제품에 대한 최대값 사이의 중간이면, 상기 잠재적인 제품을 그의 SDC 수준이 증가하도록 처리할 수 있으며, 이어서 상기 분석을 반복함

을 포함한다.

상기 분석에 대한 컷오프 SDC2 수준인 상기 언급된 사전 측정된 최소값 및 최대값은 다른 시험, 사용되는 세포, 상기 치료법의 성질, 및 다른 인자들에 따라 변할 수 있다. 치료학적 제품에 대해 사전 측정된 최소값 수준은 대략 1200 pg/㎖, 1300 pg/㎖, 1400 pg/㎖, 1500 pg/㎖ 또는 그 이상 값의 SDC2 수준일 수 있다. 허용될 수 없는 제제에 대해 사전 측정된 최대값 수준은 대략 200 pg/㎖, 300 pg/㎖, 400 pg/㎖, 500 pg/㎖ 또는 600 pg/㎖일 수 있으며; 상기 수준은 이들 서술된 값들보다 더 높거나 더 낮을 수 있지만, 일반적으로는 허용 가능한 제품에 대한 사전 측정된 최소값보다 현저하게 더 낮을 것이다. 한편으로, 허용 가능한 치료학적 제품에 대한 사전 측정된 최소값 미만의 임의의 제제들은 허용될 수는 없지만 상기 SDC2 수준을 허용 가능한 수준으로 상승시키고자 하는 처리에 적합할 수 있다.

하기에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시예에서, 불량한 MSC 공여 세포 제제는 상기 SDC2 분석을 실패한 반면 허용 가능한 공여 제제는 실패하지 않았다.

따라서, 본 발명은 줄기 세포 및 다른 세포 요법 패치 또는 제품을 사용 전에 점검하고, 운송하는 등을 위한 "일괄 출시" 또는 품질 조절 효능 분석을 제공한다.

신데칸-2(SDC2)(또한 피브로글리칸 및 현재 CD362라 칭한다)는 막관통(I형) 헤파란 설페이트 프로테오글리칸이며 신데칸 프로테오글리칸 계열의 일원이다. 본 발명에서 SDC2에 대한 언급은 일반적으로 이종상동체를 포함하여 모든 종, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 개, 말, 토끼, 양, 소 및 돼지, 특히 말 및 보다 바람직하게는 인간의 SDC2를 지칭한다.

본 발명은 또한 SDC2에 대한 항체, SDC2에 대한 항체를 사용하는 치료 방법, SDC2에 대한 항체의 용도, 및 SDC2에 대한 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 적어도 인간, 마우스 및 래트와 반응성인 항-신데칸 2 항체, orb13481을 바이올비트 리미티드(Biorbyt Ltd.)(영국 CB25 9QR 캠브리지 워터비치 데니 인더스트리얼 센터 펨브로크 애비뉴 12 소재)로부터 입수할 수 있다. 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지와 반응성인 추가의 SDC2 항체, 카탈로그 번호: MAB29651(클론 305507)을 R&D 시스템스 인코포레이트드로부터 입수할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같은 SDC2 단편에 대한 항체는 또한 항-SDC2 항체란 용어내에 포함된다.

SDC2의 사용 실시예로부터의 데이터는 고유 SDC2의 활성의 우세한 음성 억제제로서 SDC2의 역할을 입증한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 개시된 SDC2 및 WO 2013/117761에 개시된 SDC2 양성 세포의 용도에 상응하는 SDC2 길항물질, 예를 들어 SDC2 또는 SDC2에 대한 항체의 치료학적 용도를 제공한다. 본 발명은 따라서 면역억제, 염증의 치료, 암의 치료 및 상처/골 치유에 사용하기 위한 SDC2에 대한 길항물질(예를 들어 항체)을 제공한다.

따라서 본 발명은 또한 종양 억제제로서 사용하기 위한 SDC2에 대한 항체를 제공한다. SDC2에 대한 항체를 급성 폐 손상(ALI)을 포함한 폐 질환; 급성 호흡곤란 증후군(ARDS); 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD); 및 특발성 폐 섬유증(IPF)의 치료에 사용할 수 있다. SDC2에 대한 항체를 패혈증 및 패혈증-유발된 다발성 장기부전, 골수 이식(BMT) 또는 조혈모세포(HSC) 거부; 고형 기관 이식(SOT) 거부(간, 신장, 피부, 각막, 심장, 폐 포함); 급성 독소-유발된 간부전; 자가면역 간염; 원발 담즙성 간경변(PBC) 및 원발 경화성 담관염(PSC); 골괴사; 퇴행성 디스크 질환; 류마티스성 관절염; 당뇨병 환자에서 골관절염 및 지연된 골 치유; 베게너 육아종증(WG)을 포함한 자가면역 신장염; 화상, 중증 화상; 근육 소모 질환 및 근육감소증을 포함한 위축 증후군; 악액질 및 근이영양증을 포함한 다른 근육 소모 질환(뒤시엔느 및 벡커); 울혈성심부전, 급성 심근경색 및 뇌졸중; 1형 당뇨병; 2형 당뇨병; 당뇨성 망막병증 및 다른 망막병증; 당뇨성 신장병증 및 다른 신장병증; 당뇨성 신경병증 및 다른 신경병증; 비-치유성 당뇨성 궤양; 당뇨성 심근병증 및 다른 근육병증; 죽상동맥경화증; 말초 동맥 질환 및 중증 하지 허혈; 포도막염; (습성 또는 건성) 급성 황반 변성(AMD); 망막 및 각막 손상; 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 위염(AIG); 이식편대 숙주병(GvHD); 다발성 경화증 및 탈수초성 질병; 갑상선 질병; 크론병, 궤양성 대장염 및 누공성 크론 질환을 포함한 염증성 장 질환; 피부경화증; 루푸스(SLE); 그레이브스병; 및 자가면역 림프증식성 질환(ALPS)의 치료에 사용할 수 있다.

SDC2에 대한 항체를 또한 다양한 말 질환, 예를 들어 제엽염, 힘줄 손상 및 운동 유발된 폐 출혈(EIPH)(또한 "출혈" 또는 "출혈 발작"으로서 공지됨)의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명에 유용한 항체는 SDC2에 결합하고 2차 표적에 또한 결합하는 성질을 포함하는 항체를 포함한다. 따라서 이들 항체는 또 다른 항원, 예를 들어 세포 표면 항원에 결합하는 2차 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 이중특이성 항체를 포함할 수 있다.

"항체"란 용어는 결합 특이성을 여전히 유지하는 유도체 또는 그의 기능성 단편을 포함한다. 항체의 생산 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 및 문헌[Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]에 개시되어 있다. "항체"란 용어는 또한 상이한 부류(예를 들어 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE) 및 하위부류(예를 들어 lgG1, lgG2 등)의 면역글로불린(Ig)을 포함한다.

"항체"란 용어는 또한 키메릭, 단쇄 및 인간화된 항체뿐만 아니라 항체 단편, 특히 Fab 단편과 같은 실시태양들을 포함한다. 항체 단편 또는 유도체는 또한 F(ab')2, Fv, scFv 단편 또는 단일 도메인 항체, 단일 가변 도메인 항체, 또는 다른 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는, VH 또는 VL일 수 있는 단지 하나의 가변 도메인만을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 상기와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단리된 항체 단일 가변 도메인 폴리펩타이드뿐만 아니라, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 보다 큰 폴리펩타이드를 포함한다.

인간 SDC2에 대한 언급은

(a) 서열번호 3 또는 4에 설명된 바와 같은 아미노산 서열;

(b) (a)의 천연 변체;

(c) (a) 또는 (b)의 이종상동체,

(d) 생물학적 활성이고 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 단편, 그의 유사체, 변체 및 유도체,

(e) (a) 내지 (d)의 세포외 도메인, 및

(f) 상기 모두의 이량체 및 올리고머

로 이루어지거나 또는 이들을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 SDC2 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드, 바람직하게는 천연 또는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다. "단편", "유도체", "변체" 및 "유사체"란 용어는 SDC2와 필수적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하고 (i) 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 보존되거나 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환된 것, 또는 (ii) 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩타이드가 또 다른 화합물, 예를 들어 비제한적으로 상기 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리시알산)과 융합된 것, 또는 (iv) 추가적인 아미노산이, 예를 들어 성숙한 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위해서 상기 성숙한 폴리펩타이드에 융합된 것일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 3 및 4의 폴리펩타이드(특히 성숙한 폴리펩타이드)뿐만 아니라 상기 서열번호 3 또는 4의 폴리펩타이드와 적어도 60%의 유사성(바람직하게는 적어도 60% 일치성), 바람직하게는 적어도 80% 유사성(보다 바람직하게는 적어도 80% 일치성) 및 보다 바람직하게는 상기 서열번호 3 또는 4의 폴리펩타이드와 적어도 90% 유사성(보다 바람직하게는 적어도 90% 일치성), 및 더욱 더 바람직하게는 상기 서열번호 3 또는 4의 폴리펩타이드와 적어도 95% 유사성(더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 일치성)을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함하고 또한 일반적으로 적어도 100개의 아미노산을 함유하는, 바람직하게는 적어도 120개 및 보다 바람직하게는 적어도 140개의 아미노산을 함유하는 상기 폴리펩타이드의 상기와 같은 부분을 포함한다. 두 폴리펩타이드간의 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 측정된다. 다양한 상이한 접근법들이 서열 유사성 및 일치성의 계산에 대해서 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 계산을 수행하기에 적합한 방식은 스미스-워터맨(Smith-Waterman), BLAST 또는 FASTA와 같은 프로그램을 사용하여 데이터베이스 탐색을 실행시키고 하나 또는 바람직하게는 2개 또는 심지어 3개의 유사성 표를 사용하는 것이다. 블로섬(Blosum) 및 PAM(점 허용된 돌연변이) 매트릭스가 데이터베이스 탐색 및 서열 정렬에 적합한 아미노산 유사성 매트릭스이다. 스미스-워터맨 또는 FASTA를 사용하는 경우, 끊김 벌점이 충분히 넓도록 보장하는 것이 적절하며, 초기 실행이 임의의 상동 서열을 밝히지 못하는 경우, 상이한 연산을 시도하는 것이 적합할 수 있으며, 이는 발견적 연산, BLAST 및 FASTA 중 하나로 시작하는 경우 특히 그렇다.

하기 실시예에 보다 상세히 개시되는 본 발명의 특정한 실시태양에서, SDC2의 단편을 제조하고 고유, 즉 완전한 인간 SDC2에 대한 활성에 대해서 시험하였다. 활성 단편이 확인되었다. 따라서 본 발명은 또한 SDC2 활성을 유지하는 SDC2의 단편을 제공하며, 이는 상기 단편이 실시예 2의 분석 또는 실시예 9의 분석(즉 TNFα 또는 IL1β에 의한 NFkB 활성화의 용량-의존적인 억제를 생성시키는)에서 인간 SDC2의 특징적인 활성(반드시 동일한 효능을 갖는 것은 아니지만)을 예시할 것임을 본 발명의 어딘가에서와 같이 암시한다. 활성 단편은 SDC2 활성을 유지하며 고유 SDC2의 활성을 능가할 수 있고; 상기 단편은 바람직하게는 고유 SDC2의 활성의 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%를 유지한다.

따라서 본 발명은 SDC2의 단편을 포함하거나 또는 상기 단편으로 이루어지는 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 폴리펩타이드는 SDC2 활성을 갖는다. 상기 단편은 적합하게는 150개 이하, 120개 이하, 100개 이하 또는 80개 이하의 서열번호 3의 아미노산을 포함한다. 또한, 본 발명의 단편은 별도로 SDC2의 신호 서열, 즉 서열번호 3의 아미노산 1 내지 18을 포함할 수 있다. 상기 단편은 적합하게는 길이가 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 또는 적어도 60개 아미노산이다. 상기 단편의 용도, 상기 단편을 포함하는 조성물 및 상기 단편을 사용하는 치료 방법은 완전한 SDC2에 대한 것과 같다. 상기 단편은 SDC2의 실시태양을 구성한다.

바람직하게, SDC2란 용어는 고유("완전한") SDC2, SDC2의 활성 단편, SDC2의 활성 변체 및 SDC2에 대한 항체, 바람직하게는 SDC2-특이성 항체에 의해 인식되는 SDC2-유형 표면 단백질을 지칭하며; 바람직하게는 SDC2에 대한 언급은 고유 SDC2 및 그의 활성 단편, 보다 바람직하게는 고유 SDC2를 지칭한다. SDC2 항체는 인간, 마우스, 래트, 말, 토끼 및 돼지와 반응성인, R&D 시스템스 인코포레이티드로부터 입수할 수 있는, 카탈로그 번호: MAB29651(클론 305507)로서 발견된다. 본 발명에 따른 인간 SDC2는 본 발명의 실시예 2 또는 9에 따른 면역억제에 대한 분석에서 양성으로 시험되며 보다 바람직하게는 SDC2 항체에 결합한다.

더욱 추가로 본 발명은 SDC2의 단편을 포함하거나 또는 상기 단편으로 이루어지는 폴리펩타이드에 대한 항체를 제공한다. 상기와 같은 항체는 인간 치료법에 사용하기에, 특히 (i) 면역억제, (ii) 염증의 치료, (iii) 암의 치료, (iv) 상처 치유 또는 (v) 골 치유에 사용하기에 적합하다. 상기와 같은 항체는 또한 완전한 SCD2에 대한 항체에 대해서 본 발명에 개시된 바와 같은 치료법들에 적합하다.

서열

서열번호 1 - SDC2 인간 mRNA

서열번호 2 - 서열번호 1의 뉴클레오타이드 605-1210

(서열번호 3을 암호화한다)

서열번호 3 - SDC2 인간 단백질

서열번호 4 - 서열번호 3의 아미노산 19-201

(성숙한 단백질)

본 발명을 이제 첨부되는 도면에 의해 예시되는, 하기의 실시예들에 개시하며, 도면에서:
도 1은 ELISA를 사용하는, Ad.SDC2 발현 MSC의 상등액 중의 발산된 SDC2의 검출을 도시하고;
도 2는 Ad.SDC2의 과발현이, 72시간에 걸쳐 증가하는 SDC2 단백질의 과발현을 생성시킴을 도시하고;
도 3은 Ad.SDC2 MSC("S2")가 모 MSC에 비해 현저하게 증가된 면역억제 활성을 가졌음을 도시하고;
도 4는 T 세포 증식에 대한 효과에 대한 SDC2("S2")를 함유하는 세포 배양 상등액의 분석을 도시하고;
도 5는 SDC2 단백질이 TNFα 및 IL1β에 의한 NFkB 활성화를 억제함을 도시하고;
도 6은 재조합 SDC2 및 TNFα 및 IL1β에 의한 활성화에 반응하는 NFkB 유도를 도시하고;
도 7은 TNFα 및 IL1β에 의한 활성화에 따른 SDC2의 과발현에 반응하는 NFkB 유도를 도시하고;
도 8은 MSC의 누틀린-3a 처리가 SDC2 발산에서 용량-의존적인 증가를 야기함을 도시하고;
도 9는 화학요법이 인간 MSC로부터의 SDC2 발산을 증대시킴을 도시하고;
도 10은 SDC-2 C-말단 결실 단편(1-6)의 과-발현이 IL-1β 또는 TNF-α에 반응하는 NF-kB 활성을 약화시킴을 도시하고;
도 11은 SDC-2의 아데노바이러스 발현이 IL-1β, TNFα 및 IL-1β/TNFα에 반응하는 NF-kB 활성 및 IL6/IL8 분비를 약화시킴을 도시한다.

실시예 1 - 증대된 SDC2 발현에 의한 면역억제

방법

MSC의 형질도입

MSC를 완전 배지(α-MEM, 10% FBS)에서 6-웰 플레이트(넝크(Nunc))의 웰당 10⁵ 세포의 밀도로 도말하고 밤새 부착되도록 방치하였다. 세포를 음성 대조군으로서 형질도입시키지 않은 채로 두거나 또는 인간 SDC2를 암호화하는 1 ㎕ 아데노바이러스(AD5 계열)(10¹² vp/㎖)로 형질도입시키고 플레이트를 37 ℃에서 90분 동안 800 x g에서 회전시켰다. 상기 바이러스를 대략 4시간 동안 상기 세포상에 두고 이어서 세척하고 무혈청 배지(1 ㎖/웰)로 교체하였다.

웨스턴 블럿 분석

세포를 트립신 처리에 의해 수확하고 50 mM 트리스 pH 7.4, 10% 글리세롤, 0.5% NP40, 150 mM NaCl 및 완전 미니 프로테아제 억제제(롯슈(Roche))를 함유하는 세포 용해 완충액 중에서 용해시켰다. 세포 용해물에 10% SDS-PAGE를 수행하고; 트랙당 50 ㎍ 단백질을 로딩하였다. 단백질 검출을, 항-인간 신데칸-2 Ab(R&D 시스템스)를 TBS 0.1% 트윈, 3% BSA 중에서 1:500 희석하여 수행하였다. 양고추냉이-퍼옥시다제에 접합된 2차 항-래트 IgG 항체(산타 크루즈(Santa Cruz))를 1:1000의 희석비로 가하였다. 이어서 ECL 웨스턴 블럿 화학발광 시약(피어스(Pierce)) 및 플루로켐(Flourochem) 영상화 시스템을 사용하여 검출을 수행하였다.

효소-결합된 면역흡수 분석

인간 신데칸-2의 수준을 효소-결합된 면역흡수 분석을 사용하여 hMSC로부터 수거된 상등액 중에서 측정하였다. 상업적으로 입수할 수 이는 ELISA 분석을 사용하여 SDC2의 수준을 측정하였다(CUSABIO). 상기 분석을 제조사의 설명에 따라 수행하였다. SDC2에 대한 정제된 표준을 사용하여 교정 곡선을 작성하였다. 곡선 정합을 제조사의 설명에 따라 s자 로지스틱 회귀분석에 의해 수행하였다.

인간 말초 혈액 단핵 세포의 단리

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해서, 응고방지된 혈액 샘플을 수거하고(7 내지 8 ㎖), 액체 밀도 구배 배지(GE 헬쓰케어)상에 적층하고, 실온에서 30분 동안 400 x g에서 원심분리시켰다. 상층을 흡출하여 버리고 상응하는 밀도 접촉계면 층(버피 코트)을 조심스럽게 피펫팅하여 PBMC를 수확하고 이를 새로운 50 ㎖ 튜브로 옮겼다. 상기 PBMC를 20 ㎖의 PBS를 가하여 2회 세척하고 400 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 이어서 200 x g에서 10분 동안 1회 저속 원심분리하여 혈소판을 제거하였다. 상기 PBMC를 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 배지 중에 10% FBS, 50 μM β 머캅토에탄올, 1% NEAA, 1% L-글루타민을 함유하는 T-세포 배양 배지(RPMI-1640, 깁코(Gibco))에 재현탁시켰다. 10 ㎕ 분액의 상기 현탁액을 회수하고 혈구계를 사용하여 세포수를 측정하였다.

인간 T-세포 증식 분석

인간 PBMC를 0.1% BSA/PBS로 세척하고 예온된(37 ℃) 10 μM 비브란트(Vybrant) 카복시플루오레세인 다이아세테이트, 숙신이미딜 에스터(CFSE)/PBS 염색용액(인비트로젠(Invitrogen)) 중에서 2 x 10⁷ 세포/㎖의 농도로 염색하였다. 세포를 빛을 차단하여 37 ℃에서 6분 동안 배양하고 5 부피의, 10% FBS를 함유하는 빙냉 배지를 가하여 반응을 정지시켰다. 상기 PBMC를 배양 배지로 3회 세척하여 모든 잔량의 결합되지 않은 CFSE를 제거하였다. 10만 개의 CFSE 염색된 PBMC를 96-웰 환저 플레이트에서 T-세포 배지 중의 항-인간 CD3/항-인간 CD28 용해성 다클론성 항체로 자극하였다. 이어서 다양한 비의 MSC를 상기 자극된 PBMC에 가하였다(1:10, 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400). 자극되지 않은 PBMC를 또한 대조군으로서 배양하였다. 4일 후에 PBMC를 수확하고, 그 후에 상등액을 제거하고 세포를, 2% FBS를 함유하는 100 ㎕의 오토MACS 세정 용액 중에서 세척하였다. 이어서 항-인간 CD4+-APC에 의한 대비염색을 수행하였다. PBMC의 CFSE 형광을 FACSCanto를 사용하여 분석하였다. 모든 증식을 분석하고 MSC 공-배양의 부재하에서 자극된 PBMC와 비교하였다.

결과

Ad.SDC2 과발현 MSC의 상등액으로부터 발산된 SDC2는 SDC2 ELISA에 의해 검출가능하다

Ad.EGFP 또는 Ad.SDC2에 의한 형질도입후 24시간째에, 상기 배지를 흡출하고 무혈청 배지로 교체하고 24, 48 및 72시간 후에 수거하였다. 상기 상등액을 대조군으로서 신선한 무혈청 배지를 포함하여 SDC2 ELISA에 사용하였다.

신데칸은 발산으로서 공지된 과정으로, 대개는 혈장막 부근에서 조절된 절단을 겪는다. 상기 신데칸의 세포외 도메인 방출은 신호전달을 하향조절할 뿐만 아니라 막-결합된 수용체를 용해성 효과기/또는 길항물질로 전환시킬 수 있다(Manon-Jensen et al., 2010).

인간 특이성 SDC2 ELISA 기법을 사용함으로써 우리는 huMSC에 의해 발산된 SDC2 단백질을 검출하고 정량분석할 수 있었다. 우리는 Ad.EGFP 및 Ad.SDC2를 모두 발현하는 MSC의 배양 배지 중의 발산된 SDC2 단백질 수준을 측정하였다. SDC2는 48시간 후에 Ad.EGFP 세포의 배양 배지에서 검출되었고(346.4 pg/㎖) 이는 72시간 후에 689.2 pg/㎖까지 증가하였다. 상기 SDC2-과발현 세포는 48시간째에 배양 배지에서 상승된 수준의 발산된 SDC2를 나타내었으며(456 pg/㎖), 이는 72시간째에 Ad.EGFP의 대략 2배였다(1412.7 pg/㎖)(도 1을 참조하시오).

도 1에 관하여, 형질도입 후 24시간째에, 완전 배지를 무혈청으로 교환하였다(1 ㎖/웰). 무혈청 상등액을 48시간 및 72시간 후에 수거하였다. 상업적으로 입수할 수 있는 SDC2 ELISA 키트를 사용하여 상기 상등액 중에 존재하는 발산된 SDC2를 검출하였다. 상기 Ad.SDC2 상등액은 Ad.EGFP 발현 세포에 비해 증가된 발산된 SDC2 양(∼2배)을 나타내었다.

이어서 무혈청 배지가 과발현에 영향을 미치지 않음을 확실히 하도록 상기 SDC2 단백질 발현을 시험하였다.

Ad.SDC2 과발현은 높은 수준의 SDC2 단백질 발현을 생성시켰다

HuMSC를 6-웰 플레이트의 1 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 부착하도록 방치하였다. 이어서 HuMSC에 Ad.EGFP 또는 Ad.S2(1 x 10¹² vp/㎖)를 형질도입시켰다. 형질도입 후 24시간째에, 완전 배지를 무혈청 배지로 교환하였다. 단백질 용해물을 24, 48, 및 72시간 후에 수확하였다. 이들 용해물에 SDC2에 대한 웨스턴 블럿팅(R&D)을 수행하였으며, SDC2 단백질 발현이 현저하게 증가됨을 발견하였다. 우리는 코어 단백질(∼25 kDa) 및 이량체화된 형태(∼48 kDa)의 분자량에 상응하는 SDC2 밴드의 증가를 관찰하였다(도 2를 참조하시오).

면역억제 잠재성이 SDC2의 과발현으로 증가되었다

SDC2 단백질 발현이 Ad.SDC2 형질도입에 따라 증가되고 또한 세포 표면으로부터 발산된 SDC2의 용해성 형태도 또한 증가함을 확인한 후에, 우리는 SDC2 과발현이 huMSC의 면역억제 잠재성에 미칠 수도 있는 영향(존재하는 경우)을 조사하였다.

모, Ad.EGFP 및 Ad.SDC2 hMSC 세포의 면역억제 잠재성을 T-세포 증식 분석을 사용하여 평가하였다. PBMC의 T-세포(CD4+) 분획의 증식을 CFSE 발현의 유식 세포측정 분석에 의해 측정하였다. CFSE는, 세포의 형광이 각 세포 분열에 따른 딸 세포와 점진적으로 이등분됨에 의해 세포 증식을 평가하는데 사용되는 형광 세포 염색 염료이다. MSC의 존재에 기인한 상기 자극된 T-세포의 면역억제는 증식의 억제를 발생시킨다. 이는 Ad.SDC2 과발현 MSC의 존재하에서 현저하게 감소되었다. 결과를 3 세대에 걸친 증식 백분율로서 나타내었다. 1:200 MSC:PBMC 비에서, Ad.SDC2 MSC는 상기 자극된 T-세포 양성 대조군에 비해 현저한 T-세포 면역억제 잠재성을 나타내었다(유사한 결과가 1:10, 1:50 및 1:100 비를 사용하여 획득되었다). Ad.EGFP 세포는 모 MSC에 비해 필적하는 수준의 T-세포 면역억제를 나타내었다(도 3을 참조하시오).

도 3에 관하여, 모, Ad.EGFP 및 Ad.SDC2 세포 집단의 면역억제 잠재성을 자극된 T 세포와의 공-배양에 의해 평가하고 유식 세포측정에 의해 정량분석하였다. 결과는 Ad.SDC2 세포에 의한 현저한 면역-억제를 나타내었으며, 이는 상기 자극된 T-세포 양성 대조군에 비해 T-세포 증식을 억제할 수 있었다. Ad.EGFP 집단은 모 MSC에 대해 동등한 면역억제 잠재성을 유지하였지만, Ad.SDC2 집단("S2"로 표시됨)은 모 및 Ad.EGFP MSC 모두에 대해 현저하게 증대된 면역억제 잠재성을 나타내었다(독립표본 T 검정을 사용하여 측정 시 * = P≤0.05, ** = P≤0.001).

따라서, huMSC에서 SDC2의 과발현은 모 huMSC에 비해 증대된 면역억제 효과를 생성시켰다.

실시예 2 - SDC2를 과발현하는 세포(MSC)로부터의 상등액은 T 세포 증식을 억제하였다

우리는 면역억제 활성에 대해서 SDC2를 과발현하는 MSC의 집단으로부터의 상등액을 분석하였다.

도 4에 관하여, 결과는 본 발명의 세포, 즉 S2-과발현 MSC("S2")로부터의 배지가 2개의 대조군, 즉 (1) 모 MSC("모") 및 (2) CD3/CD28 자극된 T 세포("T 세포 St")로부터의 배지와 비교할 때 CD3/CD28 유도된 T-세포 증식을 억제하기에 충분함을 보였다. 따라서, 상기 상등액은 면역억제성이었다.

실시예 3

치료학적 제품에 대한 효능 분석으로서 SDC2 분석 프로토콜

우리는 SDC2 분석에 근거한 제품 효능 시험용 프로토콜을 개발하였다.

상기 프로토콜은

1. 잠재적인 제품 중의 SDC2 수준을 분석한다

2. 허용 가능한 치료학적 제품에 대해 사전 측정된 최소값과 비교한다

a. 상기 최소값 이상의 수준 = 허용됨(시험 종료)

b. 상기 최소값 미만의 수준 = 허용되지 않음

3. 허용될 수 없는 치료학적 제품에 대한 최대값과 비교한다

a. 상기 최대값 미만의 수준 = 거절됨(시험 종료)

b. 허용 가능한 치료학적 제품에 대한 최소값과 허용될 수 없는 치료학적 제품에 대한 최대값 사이의 중간 수준 = SDC2 수준을 증가시키기 위해 처리하고, 이어서 분석을 반복한다

실시예 4

치료학적 제품에 대한 효능 분석으로서 SDC2 분석

우리는 인간 세포 제제에 특이적인 분석으로 실시예 3의 프로토콜을 실행하였다.

상기 프로토콜을 하기의 사전 측정된 수준으로 사용하였다:

1. 우리는 SDC2 수준을 잠재적인 제품들에서 분석하였다

2. 1400 pg/㎖ 이상의 SDC2 수준을 갖는 제제를 잠재적인 치료학적 제품으로서 추가로 가공하기에 적합한 것으로서 허용하였으며; 상기 수준 미만의 제제는 허용하지 않았다

3. 500 pg/㎖ 미만의 SDC2 수준을 갖는 제제를 처음에는 추가의 가공에 적합하지 않은 것으로서 기록하였다

4. 500 내지 1400 pg/㎖의 중간인 것으로 밝혀진 제제는 그의 SDC2 수준을 증가시키기 위해 SDC2 활성제로 처리하기에 적합한 것으로서 나타내었다

5. 후속으로, 우리는 또한 심지어 500 pg/㎖ 미만인 SDC2 수준을 갖는 제제를 그의 SDC2 수준을 증가시키기 위해 SDC2 활성제로 처리할 수 있는 것으로 기록하였다

6. 이어서 1400 pg/㎖ 이상으로 상승된 SDC2 수준을 갖는 처리된 집단을 잠재적인 치료학적 제품으로서 추가로 가공하기에 적합한 것으로서 허용하였다.

실시예 5 - 내인성 SDC2를 증가시키기 위한 p53의 활성화

우리는 다양한 HDAC 억제제들을, SDC2 발현을 근거로 초기에 단리되고 후속으로 배양물 중에서 유지된 인간 세포 집단상의 SDC2 발현에 대한 그들의 효과에 대해서 시험하였다.

스플리토미신, 발프로산 및 2-피롤리디논-n-부티르산(PBA)은 모두 24시간째에 SDC2 RNA 수준을 증가시켰으며, 스플리토미신에 의해 가장 크게 자극되었다.

우리는 유사하게 환경 독소 벤조[a]피렌-7,8-다이올-9,10-에폭사이드(BPDE)를 시험하였으며 600 nM BPDE가 SDC2 분비를 대략 3배 증가시킴을 발견하였다.

실시예 6 - 공여 세포 집단에서 SDC2 수준

3명의 인간 MSC 공여자(공여 세포 제제)를 그들의 SDC2 분비에 대해 시험하였다. 결과는 양호한 수행자로서 확인된 2명의 공여자(공여자 109 및 110으로서 표지됨)가 높은 수준의 SDC2를 가진 반면 불량한 수행자로서 확인된 세 번째 공여자(공여자 111)는 낮은 SDC2 수준을 가졌고, 실시예 4의 SDC2 분석을 실패했음을 보였다.

실시예 7

당뇨성 상처 치유에서 SDC2+, SDC2- 및 PA-SSC의 국소 투여의 비교

우리는 엑셀라젠(Excellagen)(등록상표)(섬유성 소 I형 콜라겐의 고도로 정제된 제형화된 균질물)을 사용하여 상처 치유 모델에서 다양한 줄기 세포 집단들의 활성을 비교하였다.

생체내 실험 모델

수컷 뉴질랜드 화이트 토끼(3 내지 3.5 ㎏)를 상기 연구에 사용하였다. 상기 토끼에서 귀의 연변정맥을 통해 알록산(150 ㎎/㎏)의 투여에 의해 당뇨병을 유발시켰다. 혈청 혈당을 매일 애큐첵 어드밴티지 스트립(Accucheck advantage strip)(롯슈)을 사용하여 검사하였다. 5주의 고혈당 후에, 토끼를 자일라진 및 케타민을 사용하여 마취시켰다. 멸균의 일회용 6-㎜ 펀치 생검을 사용하여 5개의 상처(3개의 상처는 한쪽 귀에, 2개의 상처는 다른 쪽 귀에)를 생성시켰다. 각각의 상처를 5개의 무작위 처리 그룹 중 하나로 처리하였다:

1. 처리 없음

2. 엑셀라젠(등록상표) 스캐폴드 단독(25 ㎕)

3. 1 x 10⁶ 야생형 MSC를 갖는 엑셀라젠(등록상표)(엑셀라젠(등록상표) 중에 재현탁된 세포 펠릿으로부터의 25 ㎕ 용액)

4. 1 x 10⁶ SDC2 양성("SDC2+")형 MSC를 갖는 엑셀라젠(등록상표)(엑셀라젠(등록상표) 중에 재현탁된 세포 펠릿으로부터의 25 ㎕ 용액)

5. 1 x 10⁶ SDC2 음성("SDC2-")형 MSC를 갖는 엑셀라젠(등록상표)(엑셀라젠(등록상표) 중에 재현탁된 세포 펠릿으로부터의 25 ㎕ 용액).

처리의 적용 후에, 상기 상처들을 폴리유레탄 드레싱제(옵사이트(OpSite); 스미스 & 네퓨(Smith & Nephew))로 덮고 상기 귀를 봉합하고 7일까지 접착 드레싱제(오퍼픽스(Operfix); 프로메디케어(Promedicare), 아일랜드 클로니 소재)로 덮었다. 상기 연구 처리를 편향되지 않은 평가를 위해 무작위 맹검으로 수행하였다. 7일 후에, 토끼를 정맥내 나트륨 펜토바르비탈(2 ㎖)로 죽였다.

결과 분석

1주일의 처리 후에, 상이한 처리 그룹들 간에 상처 치유에 있어서 현저한 차이가 존재하였다. 각각의 상처를 죽인 날에 추적하였다. 죽인 날에 새로운 상처를 만들고 1주일에 걸쳐 상처 면적 감소 백분율을 계산하였다.

상처 종결 백분율 평가

죽인 날에, 각 상처를 6회 추적하였다. 각 상의 면적을 세포 B 소프트웨어(올림푸스(Olympus))를 사용하여 측정하고 평균 면적을 계산하였다. 각 처리 그룹에서 1주일에 걸친 상처 면적 감소 백분율을 계산하였다.

상처 종결 백분율

상처 종결 백분율 분석은 엑셀라젠(등록상표)이 처리되지 않은 상처에 비해 상기 상처 치유를 가속화함을 밝혀냈다. 엑셀라젠(등록상표) 스캐폴드 중의 100만개의 SDC2+ 세포로 처리된 상처는 1주일째에 처리되지 않은 그룹에 비해 최고의 가장 현저한 상처 종결 백분율을 나타내었다. 상기 엑셀라젠(등록상표)의 상처 종결 효과는 SDC2+ 세포와 혼합되었을 때 현저하게 증대되었다.

모든 상처 구획들을 조직학 및 혈청학적 분석을 위해 추가로 처리하였다.

조직학

상기 상처를 중선을 가로질러 절단하고 10% 포르말린 중에서 24시간 동안 고정시켰다. 상기 조직을 조직 프로세서(ASP300; 마이어 인스트루먼츠(Meyer Instruments), 미국 텍사스주 휴스톤 소재)를 사용하여 처리하고 파라핀에 매몰하였다. 구획(5 ㎜)을 표준 프로토콜을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 및 마쏭의 트라이크롬으로 염색하였다.

상기 조직학 염색으로부터, 엑셀라젠(등록상표) 처리된 상처가 상처난 부위상의 새로운 조직의 형성과 함께 양호한 상처 치유를 나타냄을 관찰할 수 있었다. 엑셀라젠(등록상표)과 혼합된 SDC2+ 세포로 처리된 상처는 가장 유효한 상처 치유를 보였다. SDC2+ 세포의 혼합은 엑셀라젠(등록상표) 단독의 치유 잠재성을 증대시켰다. 처리되지 않은 그룹에 비해, SDC2+ 처리된 상처는 상처층의 기부에 콜라겐 형성과 함께 상처난 부위상의 새로운 조직의 형성을 나타내었다.

SDC2+ 세포 처리된 상처를 갖는 상처층 중의 혈관신생

MSC는 피부 상처 치유의 개선 외에 혈관형성을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 유사한 효과가 SDC2+ 세포로 처리된 상처에서 관찰되었다. 상기 상처에서, 새로운 혈관의 형성이 상기 상처층내에서 관찰될 수 있었다. 따라서, 현저한 상처 치유가, SDC2+ 처리된 상처에서 증가된 상처 종결 백분율에 의해 관찰되었으며 이는 보다 효율적인 혈관신생과 관련될 수 있다.

요약

엑셀라젠(등록상표)과 혼합된 MSC는 양호한 대사 활성을 유지하였으며 이는 세포의 생육력에 대한 상기 엑셀라젠(등록상표) 기질의 부작용이 없음을 반영한다. 세포는 적합한 분포와 함께 어떠한 세포 덩어리 형성도 없이 상기 엑셀라젠(등록상표) 기질 전체를 통해 치밀하게 존재하였다. 현행 연구에서, 엑셀라젠(등록상표)과 혼합된 SDC2+ 세포로 처리된 상처는 엑셀라젠(등록상표) 처리된 대조군 단독에 비해 증가된 상처 종결 백분율을 나타내었다. 상기 SDC2+ 세포는 엑셀라젠(등록상표)의 상처 치유 잠재성을 현저하게 증대시켰다. MSC는 또한 혈관형성을 촉진하는 것으로 보고된다. 본 연구에서, 증가된 혈관 형성이 SDC2+ 세포 처리 그룹에서 상처층내에서 관찰되었다. 따라서, SDC2+ 처리된 상처는 보다 현저한 혈관신생과 함께 증가된 상처 종결 백분율에 의해 현저한 상처 치유 이점을 나타내었다. 따라서, 기질 중 본 발명의 SDC2+ 세포는 적은 치유 시간으로 개선된 상처 치유 잠재성을 나타내었다.

실시예 8 - 암세포 이동

세포 이동은 시험관내 세포 배양-관련 연구에 대한 중요 매개변수이다. 상이한 조건하에서 세포 집단의 동적인 변화를 모니터하는 것이 필요하다. 임피던스-기반 장치인 실시간 세포 분석기(RTCA, xCELLigence, 롯슈)를 사용하여, 우리는 하기의 성질들을 실시간으로 모니터할 수 있다: 증식, 이동 및 세포 부착. 상기와 같은 성질은 암 전개에 관련된다. 우리는 상기 방법을 사용하여 컨디셔닝된 배지를 향한 암세포의 이동 능력을 확립시켰다. 상기 모델은 암 치료법에서 효능의 전조로서 허용된다, 즉 상기 모델에서 감소된 이동은 항암 성질을 가리킨다.

우리의 조사에서, 세포 이동을 상기 언급한 xCELLigence 장치를 사용하는 실시간 16-웰 CIM 플레이트 판독을 사용하여 측정하였다. 상기 연구를 위해서, 유방암(MDA-MB-231, MDA-MB-486, MCF-10A), 전립선암(DU145), 췌장암(SU-86-86) 및 결장암종(HCT116)으로부터의 다양한 암세포주들을 사용하였다.

결과를 표 1에 요약한다:

암세포 이동
세포 유형	재조합 SDC2 양
세포 유형	100 ng/㎖	500 ng/㎖	1000 ng/㎖	Ad.SDC2(3 ㎕)
MDA-MB-231	↓↓	↓↓↓↓↓-		↓↓↓
MDA-MB-486				↓
MCF-10A				-
Du145		↓-		↓
SU-86-86	↓↑	↓↓	↓↑	↓
HCT116	↓	↓	↓
주) ↑ = 컨디셔닝된 배지에 비해 증가된 이동; ↓ = 컨디셔닝된 배지에 비해 감소된 세포 이동; - = 컨디셔닝된 배지에 비해 변화 없음

유방암 세포주

·재조합 SDC2(500 ng/㎖ rSDC2(n=5) 및 100 ng/㎖(n=2))는 MDA-MB-231 세포의 이동을 억제하였다. 유사한 이동 결과가 Ad.SDC2(3 ㎕)-CM(n=3)에 의해 생성되었다.

·MDA-MB-486 세포는 Ad.SDC2-CM(3 ㎕; n=1)을 향한 이동의 감소를 나타내었다.

·Ad.SDC2(3 ㎕)는 MCF-10A 세포(n=1)의 이동을 변경시키지 않았다.

전립선암 세포주

·무혈청 MSC-CM에의 rSDC2 500 ng/㎖의 첨가는 컨디셔닝된 배지 단독에 비해 하나의 실험에서 DU145 세포의 이동을 감소시켰고 두 번째 실험에서는 변화가 없었다. Ad.SDC2(3 ㎕)는 DU145 세포(n=1)의 이동을 감소시켰다. 이는 SDC2의 EC 도메인이 상기 전립선 암 세포주의 이동을 억제하였음을 보인다.

췌장암 세포주

·SU-86-86 세포의 이동 능력은 다양하였다; 하나의 실험은 rSDC2-CM(100 ng/㎖, 500 ng/㎖ 및 1000 ng/㎖; n=1)을 향한 이동을 증가시켰고 또 다른 실험은 rSDC2-CM(100 ng/㎖, 500 ng/㎖ 및 1000 ng/㎖; n=1)을 향한 이동의 감소를 보였다.

결장 암종 세포주

· HCT116 세포는 시험된 모든 농도(100 내지 1000 ng/㎖)에서 rSDC2-CM을 향한 이동의 감소를 보였다.

결론

종합적으로, 상기 결과는 배지에서 SDC2를 향한 상이한 암세포의 행동 변화를 나타낸다. 일반적으로, SDC2는 암의 이동 능력을 감소시켰으며, 이는 상기 모델, 특히 MDA-MB-231 세포(유방암)에서 항암 효과를 가리킨다.

초기 시험에서, 후속의, 당해 분야의 확대된 연구 프로그램에 의해 입증되는 SDC2에 대한 항체는 유방암 이동의 유사한 억제를 보였으며, 이는 항암 활성을 가리킨다.

실시예 9 - 면역 억제

실시예 8에 사용된 바와 같은 rSDC2를 사용하여, 우리는 면역 억제의 모델에서 SDC2의 활성을 조사하였다. 우리는 SDC2 단백질이 TNFα 및 IL1β에 의한 NFkB 활성화를 억제함을 발견하였다. 이는 상기 SDC2 단백질 자체의 면역 억제 활성을 입증하였다.

kB 루시페라제 플라스미드로 안정하게 형질도입된 A549 세포를 1시간 동안 SDC2 재조합 단백질로 전처리하였다. 10 ng/㎖의 TNF-α/IL-1β를 상기 배지에 가하고 루시페라제 분석을 24시간 후에 수행하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. *** = 0 ng/㎖ S2에 관하여 p<0.0001.

A549 세포를 kB 루시페라제 플라스미드로 안정하게 형질도입시키고 24시간 동안 재조합 SDC2로 처리하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 상부 패널에서: 사이토킨을 상기 배지에 24시간 동안 가하고 루시페라제 분석을 수행하였다. 기부 패널에서: 배지를 교체한 후에 24시간 동안 사이토킨을 첨가하였다. * = 0 ng/㎖ S2에 관하여 p<0.01; *** = 0 ng/㎖ S2에 관하여 p<0.0001; +++ = 100 ng/㎖ S2에 관하여 p<0.0001.

A549 kBL 세포를 1 ㎕/㎖ 또는 3 ㎕/㎖ Ad.Null 또는 Ad.SDC2로 형질도입시키고 사이토킨으로 24시간 동안 처리한 후에 루시페라제 분석을 수행하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. ** = 0 ng/㎖ S2에 관하여 p<0.001.

상기 결과는 SDC2 단백질의 면역 억제 효과를 나타내었다.

실시예 10 - SDC2의 p53 조절

SDC2 단백질 신호전달에서 p53의 역할을 측정하기 위해서 우리는 상기 SDC2 반응의 상세한 기술을 돕기 위해, p53 작용물질(누틀린-3a)을 사용하여 상기 MSC 내 p53 경로를 약물학적으로 교란시켰다. 누툴린-3a는 현저한 p53 반응을 유도하고 성장을 억제시킨다.

방법

세포 배양 및 처리

MSC를 완전 배지(a-MEM, 10% FBS)에서 6-웰 플레이트(넝크)의 웰당 10⁵ 세포의 밀도로 도말하고 밤새 부착되도록 방치하였다. 이어서 배지를 무혈청 누툴린-3a 또는 담체 대조군으로서 DMSO로 교환하였다. 도입 후 24시간째에 상기 세포를 RNA 및 단백질 모두를 위해 수확하고 무혈청 상등액을 ELISA를 위해 수거하였다.

효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)

인간 신데칸-2의 수준을 상업적으로 입수할 수 있는 ELISA 분석(CUSABIO)을 사용하여 hMSC로부터 수거된 상등액 중에서 측정하였다. 상기 분석을 제조사의 설명에 따라 수행하였다. 교정 곡선을 SDC2에 대한 정제된 표준을 사용하여 작성하였다. 곡선 정합을 제조사의 설명에 따라 s자 로지스틱 회귀분석에 의해 수행하였다.

결과

MSC의 누틀린-3a 처리는 SDC2 발산의 용량-의존적인 증가를 생성시킨다

누틀린-3a(5, 10, 20 μM) 또는 DMSO 담체 대조군(5, 20 μM)으로 처리후 24시간째에, MSC로부터의 상등액을 수거하고, 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리시키고, 추가적인 대조군으로서 컨디셔닝되지 않은 무혈청 배지를 포함시켜 SDC2 ELISA를 수행하였다.

도 8은 MSC의 누틀린-3a 처리가 SDC2 발산의 용량-의존적인 증가를 야기함을 나타낸다. MSC를 누틀린-3a 또는 담체 대조군으로서 DMSO로 무혈청 배지에서 24시간 동안 처리하였다. 상기 무혈청 상등액을 수거하고 상업적으로 입수할 수 있는 SDC2 ELISA 키트를 사용하여 상기 상등액 중에 존재하는 발산된 SDC2를 검출하였다. 상기 누틀린-3a 처리된 세포는 상기 DMSO 대조군에 비해 증가된 SDC2 발산을 나타내었다.

도 8은 3명의 상이한 인간 MSC 공여자에 대한 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 발산된 SDC2의 양은 20 μM DMSO 대조군에서 250 pg/㎖에서부터 누틀린-3a 20 μM 용량 중에서 거의 평균 1000 pg/㎖까지 증가한다.

따라서 본 실험은 p53 활성을 상향조절하는 화합물(누틀린-3a)이 또한 SDC2 발산을 증가시킴을 입증한다.

실시예 11

화학요법제는 인간 MSC로부터의 SDC2 발산을 증대시킨다

우리는 인간 MSC로부터의 SDC2 발산에 대한 효과에 대해서 다양한 화학요법 억제제; 특히 탁솔, 캄토테신, 에토포시드 및 BPDE(벤조(a)피렌 다이올에폭사이드)를 시험하였다.

MSC를 24시간 동안 혈청 기아 전에 상기 화학요법제들로 24시간 동안 처리하였다. 상기 세포 상등액을 수확하고 발산된 SDC2 단백질 발현에서 상대 변화 배수를 ELISA에 의해 분석하였다.

도 9는 상기 실험의 결과를 도시하며 화학요법제들이 인간 MSC로부터의 SDC2 발산을 증대시킴을 나타낸다.

실시예 12

NF-kB의 조절을 맡고 있는 SDC-2의 도메인 확인

SDC-2의 단편 또는 도메인이 NF-kB 신호전달의 조절에 책임이 있을 수 있음을 측정하기 위해서, 우리는 kB 동기의 조절하에서 루시페라제 리포터 유전자 시스템을 사용하였다. 우리는 상기 세포를 빈 벡터 대조용 아데노바이러스(p3xFLAG-CMV-14) 또는 12 단편의 SDC2(1.4 내지 12.4)를 발현하는 벡터로 형질도입시키고 NF-kB 전사 활성에 대한 효과를 측정하였다.

도 10은 SDC-2 C-말단 결실 단편(1 내지 6)의 과발현이 IL-1β 또는 TNF-α에 반응하는 NF-kB 활성을 약화시킴을 보인다. NF-kB-루시페라제 발현 세포를 빈 벡터(p3xFLAG-CMV-14) 또는 단편 1.4 내지 12.4를 발현하는 벡터로 형질감염시켰다. 24시간 후에, 세포를 24시간 동안 사이토킨, IL-1β(10 ng/㎖), TNF-α(10 ng/㎖)로 처리하고, 이어서 루시페라제 분석을 수행하였다.

상기 단편들을 도 10에서 숫자 1 내지 12로 지칭한다. 이들은 하기의 SDC-2의 펩타이드 단편들에 상응한다: 1,1-79; 2,1-87; 3,1-100; 4,1-144; 5,1-169; 6,1-201 ; 7,19-79; 8,19-87; 9,19-100; 10,19-144; 11,19-169; 12,19-201

TNF-α 및 IL-1β와 같은 염증전 사이토킨은 NF-kB 전사 활성을 활성화시킬 수 있으며; 이는 빈 벡터 대조군 레인에서 관찰된다. NF-kB 전사 활성은 대조용 세포에서 TNF-α 및 IL-1β에 의해 각각 대략 3- 및 4-배 유도된다. 그러나, 단편 1 내지 6 발현 세포에서 NF-kB 전사 활성의 TNF-α-, IL-1β- 및 TNF-α/IL-1β-유도된 증가는 현저하게 감소한다(도 10). 현저하게도, 상기 N-말단 신호 펩타이드(1-18)를 발현하는 단편들은 NF-kB의 TNF-α 및 IL-1β 활성을 모두 현저하게 억제하였다. 단편 1.4(1-79) 및 2.4(1-87)는 NF-kB 활성화를 확고하게 억제하였으며, 이는 헤파란 설페이트 결합 부위 및 신호 펩타이드가 모두 NFkB의 억제에 요구됨을 암시한다.

상기 데이터는 SDC2의 면역억제 성질, 및 가능하게는 이동 성질이 SDC-2의 N-말단에 기인할 수 있었음을 암시한다. NF-kB 활성을 억제시킴으로써, SDC2 단편은 상기 면역 반응을 감소시킬 수 있고 소염제로서, 및 상처 치유, 암 요법 및 염증 질환에 사용될 수 있다.

실시예 13

신데칸-2는 TNF-α, IL-1β 및 TNF-α/IL-1β에 반응하는 NF-kB 신호전달을 억제하고 IL6 및 IL8 분비를 제한한다

SDC-2가 NF-kB 신호전달에 영향을 미칠 수 있음을 측정하기 위해서 우리는 kB 동기의 조절하에서 루시페라제 리포터 유전자 시스템을 사용하였다. 우리는 상기 세포를 빈 벡터 대조용 아데노바이러스(Ad-대조군) 또는 SDC2 발현 아데노바이러스(Ad-SDC2)로 형질도입시키고 NF-kB 전사 활성에 대한 효과를 측정하였다. TNF-α, IL-1β 및 TNF-α/IL-1β의 조합과 같은 염증전 사이토킨은 도 11A에 도시된 바와 같이 NF-kB 전사 활성을 활성화시킬 수 있다. NF-kB 전사 활성은 대조용 세포 중에서 TNF-α, IL-1β 및 TNF-α/IL-1β에 의해 각각 대략 3-, 3.5- 및 4-배 유도된다. 그러나, SDC-2 발현 세포에서 NF-kB 전사 활성의 상기 TNF-α-, IL-1β- 및 TNF-α/IL-1β-유도된 증가는 현저하게 감소된다(도 11).

NF-kB 전사 활성의 감소 외에, IL-6 및 IL-8(이들은 모두 NF-kB에 의해 조절된다)의 TNF-α-, IL-1β- 및 TNF-α/IL-1β-유도된 방출에서 관련된 현저한 감소가 존재하였다(도 11B 및 11C).

합쳐서 상기 데이터는 상기 NF-kB 경로의 조절에 의한 SDC2의 소염 성질을 나타낸다.

실시예 14

암 기질 중에 국소화된 SDC2에 대한 SDC2 항체의 표적화

우리는 암 모델에서 SDC2⁺ 세포의 국소화를 조사하여 암 치료에 있어서 보다 이른 연구를 확인하고 치료학적 중재의 전략을 결정하였다.

MMTV PyMT-P2A-mCherry-P2A-OVA(PyMT ChOVA) 마우스를 친절하게도 USCF의 매트 크럼멜(Matt Krummel) 교수가 만들어냈다. 여기에서 상기 mCherry 및 OVA(오브알부민) 서열은 폴리오마 바이러스, 중간 T 항원(PyMT)에 결합되고 전체 서열은 상기 MMTV(마우스 유방 종양 바이러스) 프로모터에 의해 구동된다.

종양 성장 - 암컷 PyMT ChOVA 마우스를 유선의 촉진에 의해 종양 개시에 대해 모니터하고 버니어 캘리퍼스에 의한 종양 크기의 측정에 의해 매주 전체 종양 크기에 대해 모니터하였다. 합한 종양 크기를 모든 촉진가능한 종양 면적의 가중에 의해 계산하였다. 종양 면적을 종양의 길이 x 너비로서 한정하였다. 마우스를 종양 크기가 200 ㎟를 초과했을 때, ACREC 동물 프로토콜에 따라 죽였다.

종양 절단 - PyMT 종양을 마우스로부터 절제하고 제거된 종양의 총 중량을 측정하였다. 이어서 종양을 메스를 사용하여 다지고 1.5시간 동안 0.3 그램의 종양 중량당 2 ㎎/㎖ 콜라게나제 IV(시그마) 및 200 ㎍/㎖ DNAse로 절단하였다. 이어서 종양을 100 ㎛ 세포 스트레이너에 통과시켜 절단되지 않은 큰 조각의 종양을 제거하였다. 이어서 70%/37%/30% 퍼콜(Percoll) 구배를 실행하여 죽은 세포 및 적혈구를 제거하고, 상기 두 접촉경계면을 수거하였다.

유식 세포측정 - 모든 항체를 R&D 시스템스, BD 파밍겐(Pharmingen), 이바이오사이언스(eBioscience), 인비트로젠 또는 바이오레전드(Biolegend)로부터 구입하였다. 표면 염색을 위해서, 세포를 항-Fc 수용체 항체(24G2)와 배양하고 PBS 2% FCS 중의 적합한 항체로 염색하였다. 모든 유식 세포측정을 FACSCanto 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈)상에서 수행하였다. 유식 세포측정 데이터의 분석을 플로우조(FlowJo)(트리스타(Treestar))를 사용하여 수행하였다.

종양 기질 세포를 하기의 마커 CD45^-, mCherry^-, gp38⁺, CD362⁺ 및 DAPI^-에 근거하여 분류하였다. 상피 종양 세포를 CD45^-, DAPI^- 및 mCherry⁺에 근거하여 분류하였다.

상기 결과는 SDC2(CD362/신데칸-2) 단백질 발현이 CD45^-, mCherry^-, gp38⁺, CD362⁺ 및 DAPI 종양 기질에 국소화됨을 보였다. 따라서, SDC2-양성 세포는 암 기질 중에 국소화되었으며, 이는 암 치료법에서 SDC2 길항물질, 예를 들어 SDC2에 대한 항체의 항암 효과를 암시하는 초기의 연구를 추가로 지원한다.

따라서 본 발명은 SDC2 수준 및/또는 활성의 조절을 통해 면역조절 및 다른 치료법들을 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Orbsen Therapeutics Limited <120> Immuno-modulatory and Therapeutic Agents and Compositions, and Uses Thereof <130> P39937WO <150> GB 1306886.1 <151> 2013-04-16 <150> GB 1314544.6 <151> 2013-08-14 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcccggagaa gcaggctcag gagggaggga gccagaggaa aagaagagga ggagaaggag 60 gaggacccgg ggagggaggc gcggcgcggg aggaggaggg gcgcagccgc ggagccagtg 120 gccccgcttg gacgcgctgc tctccagata cccccggagc tccagccgcg cggatcgcgc 180 gctcccgccg ctctgcccct aaacttctgc cgtagctccc tttcaagcca gcgaatttat 240 tccttaaaac cagaaactga acctcggcac gggaaaggag tccgcggagg agcaaaacca 300 cagcagagca agaagagctt cagagagcag ccttcccgga gcaccaactc cgtgtcggga 360 gtgcagaaac caacaagtga gagggcgccg cgttcccggg gcgcagctgc gggcggcggg 420 agcaggcgca ggaggaggaa gcgagcgccc ccgagccccg agcccgagtc cccgagcctg 480 agccgcaatc gctgcggtac tctgctccgg attcgtgtgc gcgggctgcg ccgagcgctg 540 ggcaggaggc ttcgttttgc cctggttgca agcagcggct gggagcagcc 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145 150 155 160 Ile Phe Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Asp Glu 165 170 175 Gly Ser Tyr Asp Leu Gly Glu Arg Lys Pro Ser Ser Ala Ala Tyr Gln 180 185 190 Lys Ala Pro Thr Lys Glu Phe Tyr Ala 195 200 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Ser Arg Ala Glu Leu Thr Ser Asp Lys Asp Met Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Ser Ser Ile Glu Glu Ala Ser Gly Val Tyr Pro Ile Asp Asp Asp Asp 20 25 30 Tyr Ala Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Asp Glu Asp Val Glu Ser Pro 35 40 45 Glu Leu Thr Thr Ser Arg Pro Leu Pro Lys Ile Leu Leu Thr Ser Ala 50 55 60 Ala Pro Lys Val Glu Thr Thr Thr Leu Asn Ile Gln Asn Lys Ile Pro 65 70 75 80 Ala Gln Thr Lys Ser Pro Glu Glu Thr Asp Lys Glu Lys Val His Leu 85 90 95 Ser Asp Ser Glu Arg Lys Met Asp Pro Ala Glu Glu Asp Thr Asn Val 100 105 110 Tyr Thr Glu Lys His Ser Asp Ser Leu Phe Lys Arg Thr Glu Val Leu 115 120 125 Ala Ala Val Ile Ala Gly Gly Val Ile Gly Phe Leu Phe Ala Ile Phe 130 135 140 Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Asp Glu Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Asp Leu Gly Glu Arg Lys Pro Ser Ser Ala Ala Tyr Gln Lys Ala 165 170 175 Pro Thr Lys Glu Phe Tyr Ala 180

Claims

단리된 신데칸2(SDC2) 또는 그의 단편을 포함하며,
상기 단편이 서열번호 3의 아미노산 1-79, 1-87, 1-100, 1-144, 1-169 또는 1-201인 것인 면역억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
SDC2가 수성 배지에 용해성인 조성물.
제 1 항에 있어서,
SDC2가 인간 SDC2인 조성물.
제 1 항에 있어서,
세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
제 4 항에 있어서,
SDC2가 세포 배양 상등액으로부터 수득되는 조성물.
제 1 항에 있어서,
단편이 서열번호 3의 아미노산 1 내지 18을 포함하는 N-말단 단편인 조성물.