CN105324391A - 多配体蛋白聚糖-2的医学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明将SDC2、包含SDC2的组合物、编码SDC2的载体及通过细胞调节SDC2表达的化合物用于处理哺乳动物如人的细胞，以实现免疫调节或用于其它特定治疗干预。将细胞与SDC2结合，采用与SDC2结合的抗体或其抗体片段处理细胞或通过细胞调节SDC2的表达或活性，对细胞进行处理。从经处理细胞获取细胞或组织，根据其免疫调节或其它治疗特性用于治疗用途。

Description

多配体蛋白聚糖-2的医学用途
技术领域
本发明涉及免疫调节和治疗试剂和组合物及其用途。此外，本发明涉及现有基于细胞的产品的试验和修饰，从而影响其免疫调节与/或其它治疗特性。
背景技术
人们对许多临床应用的间充质干细胞(MSC)相关产品非常熟悉，还有更多的产品正在研发之中，并预期将来可批准用于人类。MSC具有某些免疫调节特性，使其具有治疗价值，特别是，MSC可用于治疗自身免疫性疾病。人MSC的免疫抑制潜力得到了证明，例如，研究表明，人MSC对T-细胞、B-细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的增殖具有抑制效果(Han等，2012)。
EP1795588描述了将源自脂肪组织的MSC用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)的用途；据称，这种细胞具有免疫抑制特性。
EP2545928涉及含MSC的细胞制备物，通过无血清或低血清培养，其免疫抑制能力得以保持。
WO2012/111997公开了一种组合治疗方法，其中MSC与免疫调节性T细胞一起使用，为基于MSC的疗法实现合适的免疫抑制效果。
WO2009/1105624公开了向细胞共同传输分子和多肽从而改善分子治疗效果的组合物和方法。将生长因子与其受体和共受体，如多配体蛋白聚糖()1、2、3和4共传输，改善了这些生长因子的传输。多配体蛋白聚糖和生长因子的共传输可以防止生长因子发生蛋白水解，增强其活性，将生长因子靶向细胞表面，从而促进生长因子的信号传导。
KR1020100106744涉及一种预防或治疗转移性皮炎或黑素生成相关疾病的组合物。预防或治疗转移性皮炎的组合物包含活性成分多配体蛋白聚糖-2。考虑的转移性皮炎疾病有黑色素瘤、色素沉着过度、色素沉着不足或白癜风。
WO02/087609涉及一种预防哺乳动物乳头瘤病毒感染的药物组合物，包括可溶肽、蛋白质或融合蛋白，它们与乳头瘤病毒粒子结合，作为连接硫酸乙酰肝素粘多糖链的多配体蛋白聚糖的配体。
WO03/062386涉及调节动物体内多配体蛋白聚糖水平和血管形成的方法和材料。其公开了多配体蛋白聚糖多肽和编码多配体蛋白聚糖多肽的核酸。这些都用于制备调节血管形成的多核苷酸和多核苷酸类似物。亦探讨了鉴定多配体蛋白聚糖调节剂和血管形成调节剂的方法。
Mukhopadhyay,A.etal.,J.TraumaInjuryInfect.Crit.Care,2010,vol.68,pp.999-1008得出了以下结论：多配体蛋白聚糖-2和FGF-2可相互作用，使多配体蛋白聚糖-2从细胞上脱落，反过来激活负责瘢痕瘤表型的事件。
Kaur,C.etal.,Glia,2009,vol.57,pp.336-349研究了多配体蛋白聚糖-2在变形虫小胶质细胞中的表达，并指出这是缺氧上调的。
Contreras,H.R.etal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2001,vol.286,pp.742-751研究了多配体蛋白聚糖-2在癌症中的表达，并指出多配体蛋白聚糖-2表达包含在某些细胞朝转移性间充质样表型的分化中。
SojoongChoi,etal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2012,vol.417,pp.1260-1264研究了基质金属蛋白酶-7(MMP-7)在多配体蛋白聚糖-2从结肠癌细胞上脱落中的作用。据其观察，MMP-7直接调节多配体蛋白聚糖-2从这些细胞上的脱落。
Alexopoulou,A.N.etal.,BMCCellBiol.,vol.9,2008,doi:10:10.1186/1471-2121-9-2研究了干细胞朝中胚层分化期间用于转基因长期表达的载体。使用的其中一个载体编码多配体蛋白聚糖-2。
WO2011/153458公开了一种干扰登革热感染的方法，包括采用与登革热病毒靶向的细胞上的多配体蛋白聚糖结合的登革热病毒进行干扰。还公开了涉及这种用途的药物组合物。
Mytilinaiou,M.etal.,IUBMBLife,2013,vol.65,pp.134-143研究了多配体蛋白聚糖-2作为TGFβ2/Smad2介导的纤维肉瘤细胞的细胞粘附的调节剂的作用。
据Kim,Y.etal.,Oncogene(2003),vol.22,pp.826-830观察，多配体蛋白聚糖-2表达减少与曲古柳菌素-A-诱导的形态变化及结肠癌细胞中肿瘤发生活性降低有关。此外，反义cDNA引起的多配体蛋白聚糖-2表达下调模拟了形态变化及减少了结肠癌细胞的非贴壁依赖性生长。
Chung,H.etal.,JournalofBiologicalChemistry,vol.287,no.23,pp.19326-19335,2012发现，黑皮质素1受体通过控制多配体蛋白聚糖-2表达来调节黑色素瘤细胞的迁移。这是因为黑皮质素1受体抑制了p38MAPK的活化，继而增强了多配体蛋白聚糖-2的表达和黑色素瘤细胞的迁移。
据Péterfia,B.etal.,PLoSONE,vol.7,no.6,e39474观察，多配体蛋白聚糖-1通过诱导多配体蛋白聚糖-2表达增强了间充质肿瘤细胞系的恶性程度。因此，多配体蛋白聚糖-1与多配体蛋白聚糖-2一起增强了人纤维肉瘤细胞系的增殖、迁移和转移。
Ruiz,X.etal.,PLoSONE,vol.7,no.8,e43049描述了他们的发现：多配体蛋白聚糖-2是一种与蛋白-3(IGFBP-3)结合的胰岛素样生长因子新型靶，以及多配体蛋白聚糖-2在纤维化中过度表达。SDC2表达的增加至少部分是由于两种促纤维化因子TGFβ和IGFBP-3的活性引起的。Dieudonné,F-Xetal.,JournalofBoneandMineralResearch,vol.27,no.10,pp.2118-2129描述了多配体蛋白聚糖-2表达是如何被骨肉瘤细胞中的阿霉素上调的。T-细胞因子(TCF)负责抑制多配体蛋白聚糖-2。因此，TCF活性的靶向抑制促进了多配体蛋白聚糖-2的表达和对小鼠骨肉瘤细胞和骨肿瘤中阿霉素的敏感性。
KR20120013915描述了一种用于诊断结肠癌的组合物，包含一种测定多配体蛋白聚糖-2肽片段表达水平的试剂。该试剂包含一种对多配体蛋白聚糖-2肽片段具有特异性的抗体。
Huang,X.etal.,OncologyReports2009,vol.21,pp.1123-1129讨论了食管鳞状细胞癌中多配体蛋白聚糖-2(SDC2)和富半胱氨酸61(CYR61)表达改变的预后意义。
现有技术中存在的一个共同问题是，MSC-类产品单独使用时免疫抑制性不够或MSC的免疫抑制特性在细胞培养传代中随时间而丧失，即得不到保持。理想的是保持、刺激起或能够恢复这些特性。
免疫抑制方案可用于防止或减少移植排斥，临床使用的免疫抑制方案通常包括同时使用几种试剂的组合。最好是鉴定替代免疫抑制剂和治疗方法。同样，最好鉴定促进血管形成的试剂和治疗方法。此外，最好能够对此领域潜在治疗产品的效力进行试验。建议的一种试验是基于可溶TNFR1，但是，需要替代且最好是改进的试验。
发明目的
本发明的一个目的是提供具有此处指出的免疫调节性与/或其它治疗特性的替代试剂和治疗方法。本发明具体实施例的一个目的是提供赋予包含细胞或组织的产品或组合物的较低免疫原性或较高免疫抑制性的试剂和疗法。
发明概述
本发明实施例在使用时表明，增强的多配体蛋白聚糖-2(SDC2)表达和/或活性增强了免疫抑制和/或具有其它治疗特性。因此，本发明提供了SDC2、包含SDC2的组合物、编码SDC2的载体和调节SDC2表达的化合物，用于治疗细胞——然后那些细胞用于治疗用途。这些组合物、载体和化合物本身可用于治疗性处理，特别是人的治疗性处理，例如，用于如本文描述的免疫调节或用于其它治疗用途。
本发明还提供处理细胞群的方法，包括将细胞与SDC2结合，采用与SDC2结合的抗体或抗体片段处理细胞与/或通过细胞调节SDC2的表达或活性。这种方法制备的细胞以及来源于经处理细胞的细胞和组织构成本发明的其它部分。
具体实施方式
本发明的实施例包括含SDC2的组合物、使用SDC2的方法及SDC2的特定用途。适宜的是，这是可溶形式的，以及在特定实施例中，是人或马SDC2，虽然本发明包括通常源自哺乳动物的SDC2，特别是源自人、小鼠、大鼠、狗、马、兔、羊、牛和猪的SDC2。
所述组合物可包含药学上可接受、适合医药用途的赋形剂与/或载体。组合物可以包含细胞培养基或配制为细胞培养基——例如，在细胞培养基中的SDC2——适合用于细胞培养，例如，用于加入到培养的细胞中，用于制备基于治疗性细胞的产品。该组合物可配制用于缓释和任选经修饰而改善半衰期，例如，SDC2(或片段、变体、衍生物或类似物)可聚乙二醇化(PEGylated)或多聚唾液酸化(PSAylated)。组合物可配制用于注射，例如，配制在水中或盐水溶液中用于注射。组合物可配制用于吸入，例如，通过雾化。SDC2可以重组体形式制备或从表达或过度表达SDC2的细胞分离。在试验的实例中，从表达SDC2的细胞上清液中分离出，并且重组制备；正如其它地方所指出的那样，SDC2可脱落到培养基内，因此，可从表达SDC2的细胞培养物中收获SDC2。
本发明还提供编码SDC2的表达载体；再一次，优选人或马SDC2，但是，通常来源于上文所述哺乳动物的编码SDC2的载体亦构成本发明的实施例。词语“表达载体”指的是核酸，例如，线性或环状DNA或RNA，包括编码SDC2的片段，该片段可与用于其转录的其它片段可操作地连接。这种其它片段可包括启动子(许多是人们已知的，合适的实例包括CMV和UbC启动子)、终止子和UTR序列，并可任选包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记物、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常源于质粒或病毒DNA，或包含两者的元件。本发明下文一个实例中采用的合适载体是腺病毒载体。其它合适的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒。表达人SDC2的优选载体包括源于SEQIDNO:1或2(例如，没有polyA尾)的编码序列，或其等位变体，或编码SEQIDNO:3或4的替代核苷酸序列。
SDC2可被细胞脱落进入到培养基中，这种胞外域脱落是由通常称为脱落酶的高度调节直接作用引起的。已知基质金属蛋白酶(MMP)是多配体蛋白聚糖的脱落酶。特别是，已经证明，MMP-7是SDC2脱落必须的(Ryuetal.,2007)。然而，亦已经证明，各种细胞外刺激，包括生长因子(Subramanionetal.,1997)、趋化因子(Lietal.,2002；Bruleetal.,2006；Charnauxetal.,2005)、乙酰肝素酶(Yangetal.,2007)和细胞应激(Fitzgeraldetal.,2000)都可以诱导SDC2的脱落。
在本发明下文更详细地描述的具体实施例中，当含SDC2的培养基用于处理分开的细胞群时，从人MSC表面脱落进入到培养基内的SDC2具有免疫抑制特性。因此，本发明提供SDC2用于提供这种治疗效果——免疫抑制的用途。用于疗法例如移植的细胞可以采用这种方式进行处理，例如，暴露于SDC2，以降低其免疫原特性。本发明实现的免疫抑制效果还可以与其它基于细胞的疗法一起平行使用，例如，从而降低或延迟患者出现不良免疫反应的风险或发生。因此，本发明的SDC2和含SDC2的组合物，以及本发明的载体和化合物，可与另一治疗组合物，例如，细胞治疗产品一起对患者给药，这种细胞治疗产品可以是MSC与/或基质干细胞或包含MSC与/或基质干细胞。
本发明另外还提供用于处理细胞的调节细胞SDC2表达的化合物。在本发明的实施例中，所述化合物增加SDC2的表达。这类化合物的实例包括激活p53的化合物、激活ERK、p38或JNKSAPK激酶通路的化合物、激活缺氧诱导因子(HIF)-介导的通路的化合物、激动(agonize)TGF、BMP、Lefty、Nodal和激活素()通路的化合物、激动NOTCH通路(如Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL2、DLL3和DII4)的化合物、激动Hedgehog信号传导通路的化合物，激动WNT通路的化合物、激活雄激素受体或雌激素受体通路的化合物及激活NFkB通路的化合物。用于增强SDC2表达的化合物实例包括，p53调节化疗剂(如nutlins、5-FU、阿霉素、顺铂、吉西他滨、紫杉酚)、HDAC抑制剂、PPAR激动剂、DMOG(缺氧模拟物)、毛喉素、考福新(毛喉素的水溶物，是一种cAMP刺激剂)、WY4643(匹立尼酸，是一种过氧化物酶体增生物激活受体-α(PPARα)激动剂)、曲格列酮(PPARα和PPARγ两者的配体)、斯普利特麻一辛(splitomicin)、Sir2(3类HDAC抑制剂)、曲古柳菌素A(1/2类HDAC抑制剂)、苯丁酸钠(HDAC抑制剂)、丙戊酸(HDAC抑制剂)和SAHA(另一HDAC抑制剂)。因此，细胞治疗产品中SDC2表达的增强可赋予其免疫抑制性或提高其免疫抑制特性。
本发明解决的一个问题是提供替代免疫调节干预与/或其它治疗干预。在本发明的用途中，组合物、载体和化合物可用于治疗性处理。
例如，在本发明的一系列实施例中，组合物、载体或化合物用于包括免疫调节的治疗性处理中。SDC2含量与/或表达与/或活性的增加促进了免疫抑制性；因此，本发明提供包括免疫抑制的治疗性处理。
本发明的组合物，以及本发明的载体和化合物，可单独或与其它疗法，如本文提到的那些疗法一起使用，以治疗肺部疾病，如ARDS、COPD和IPF。在试验中发现，静脉注射的基质细胞(stromalcell)倾向于在肺部积聚，表明可以实现向肺部传输。SDC2亦可经雾化吸入实现肺部传输。
本发明增强SDC表达与/或活性的组合物和处理以及本发明对应的载体和化合物通常适合任何需要免疫抑制或将从免疫抑制中受益的任何迹象(indication)；这些迹象包括移植、牛皮癣、哮喘及通常具有自身免疫成分的迹象，如过敏、结肠炎、皮炎和炎性疾病。
在实施例中，本发明的组合物和处理以及本发明的载体和化合物可与抗炎剂(如抗-TNF抗体，这种抗体的实例包括英夫利昔(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)和高利单抗(Simponi))，或与循环受体融合蛋白(如依那西普(Enbrel))一起使用。本发明可与抗-CD3抗体一起使用，这种抗体的实例包括莫罗单抗-CD3()、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。这些组合可用于免疫抑制疗法中；它们可用于治疗或预防移植排斥和其它炎性疾病或自身免疫性疾病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和1型糖尿病及用于诱导免疫耐受性。
在下文详细描述的本发明的具体实施例中，与对照MSC相比，人MSC表面SDC2的增加赋予细胞更高的免疫抑制性。因此，本发明提供增加的SDC2细胞表达或活性或含量，从而提供这种治疗性效果。可以采用这种方式对移植细胞进行处理，从而降低其免疫原特性。本发明实现的免疫抑制效果还可以与其它基于细胞的疗法一起平行使用，例如，从而降低或延迟患者出现不良免疫反应的风险或发生。本发明经处理的细胞可与另一治疗组合物，如细胞治疗产品一起对患者施用，这些细胞治疗产品可以是MSC与/或基质干细胞或包括MSC与/或基质干细胞。
本发明的细胞可在其它治疗产品之前、同时或之后施用。本发明的细胞可提前施用，以帮助患者的免疫系统耐受后续施用的细胞治疗产品，如移植物。
增强SDC表达与/或活性的本发明的组合物，以及本发明的载体和化合物，以及本发明的组合物、用途、方法和处理可用于治疗癌症。利用本发明，通常可治疗癌症，特别是包括肝细胞癌、宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、纤维肉瘤、髓母细胞瘤和星形细胞瘤。
在本发明的实施例中，治疗的癌症是实体瘤。此外，本发明的实施例包括将该处理靶向癌间质–最好是使治疗聚焦癌间质，人们认为，癌间质是支持癌症维持和生长所必需的。
在下文详细描述的本发明的具体实施例中，证明了SDC2对胰腺癌、前列腺癌、乳癌和结肠癌中的每一种均具有抗癌效果。
增强SDC表达与/或活性的本发明的组合物，以及本发明的载体和化合物，以及本发明的组合物、用途、方法和处理可用于治疗炎症与/或炎性疾病。因此，利用本发明，可以实现抗炎效果。
在下文详细描述的本发明的具体实施例中，通过检测证明了SDC2具有抗炎效果。
增强SDC表达与/或活性的本发明的组合物，以及本发明的载体和化合物，以及本发明的组合物、用途、方法和处理可用于伤口愈合或骨愈合，或促进伤口愈合或骨愈合。
在下文详细描述的本发明的具体实施例中，表达SDC2的细胞显著增强了模型中伤口的愈合。根据本文的其它数据进行类推，这一事实支持了SDC2在伤口愈合方面的类似活性，包括糖尿病伤口愈合和骨折愈合。
增强SDC表达与/或活性的本发明的组合物，以及本发明的载体和化合物，以及本发明的组合物、用途、方法和处理可用于治疗马的各种疾病，包括蹄叶炎、腱损伤和运动性肺出血(EIPH)——亦称为“出血”或“突发出血”。
本发明还提供用于治疗动物，特别是哺乳动物，如人或马的疾病或病症的药物组合物。该药物组合物合适地包括有效量的治疗动物疾病或病症的本发明的化合物、组合物或载体。因此，本发明的活性剂可采用可接受的药物载体施用。例如，活性剂可在药学上可接受的注射用液体介质中施用。液体介质的实例有盐水、磷酸盐缓冲盐水，任选还包含其它材料，如二甲基亚砜(DMSO)和人血清白蛋白。施用治疗性蛋白质和肽的方法是本领域熟悉的。本发明提供了一种处理动物，优选处理人的方法，包括向动物施用本发明的活性剂。
本发明公开的药物组合物可用于医学和兽医学应用，可向个体单独施用，或与其它补充活性成分、试剂、药物或激素一起施用。该组合物可任选包括药学上可接受的载体，包括药学上可接受的溶媒、稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂或赋形剂。有用的药学上可接受的载体包括但不限于含水介质，如水、盐水、甘氨酸、透明质酸等；固体载体(如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等；溶剂；分散介质；包衣；抗菌剂和抗真菌剂；等渗剂和吸收延迟剂；或任何其它非活性成分。可根据施用模式选择药学上可接受的载体。除非药学上可接受载体与活性成分不相容，否则，即可设想其可用于药学上可接受的组合物。此类药物载体具体使用的非限制性实例可参见《药物剂型和药物传递系统(PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems)》(HowardC.Anseletal.,eds.,LippincottWilliams&WilkinsPublishers,7thed.1999)；REMINGTON：《药剂学科学与实践(THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY)》(AlfonsoR.Gennaroed.,Lippincott,Williams&Wilkins,20thed.2000)；Goodman&Gilman的《治疗学的药理学基础(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)》(JoelG.Hardmanetal.,eds.,McGraw-HillProfessional,10thed.2001)；及《药用辅料手册(HandbookofPharmaceuticalExcipients)》(RaymondC.Roweetal.,APhAPublications,4thedition2003)。
本发明公开的药物组合物可任选包括其它药学上可接受的组分，包括但不限于，缓冲液、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧剂、渗透压调节剂、生理物质、药理物质、膨胀剂、乳化剂、润湿剂、甜味剂或调味剂等。用于调节pH的各种缓冲液和手段可用于制备本发明公开的药物组合物，只要得到的制剂是药学上可以接受的即可。
本发明公开的治疗化合物可以通过各种给药途径给药。因此，局部、肠内或肠胃外给药途径都是合适的，这些途径包括局部和全身输送本发明公开的治疗化合物或组合物。吸入、局部、鼻内、舌下、注射、输注、滴注、直肠与/或阴道施用的组合物可按照本领域已知的任何药物组合物制造方法制造。
独立地或与上面的一起，SDC2含量与/或表达与/或活性增加可以促进血管形成；因此，本发明的这些实施例提供了包括或促进血管形成的治疗处理。
本发明提供了处理细胞群的方法，包括将细胞与SDC2结合。这一点可以这样实现：(i)将细胞与表达SDC2的细胞结合；或(ii)将细胞与本发明其它实施例的组合物或化合物结合。包括体外处理和间接体内(exvivo)处理。
在其它实施例中，本发明可经改动用于降低SDC2的量与/或表达与/或活性，以提供包括免疫活化与/或免疫刺激的治疗性处理。
处理的细胞可以是干细胞，如基质干细胞或MSC，而且适合地为哺乳动物细胞，优选是人、小鼠、大鼠、狗、马、兔、羊、牛或猪的细胞，特别是马和人的细胞。
此外，本发明提供处理细胞群的方法，包括通过群内一个细胞或多个细胞调节SDC2的表达或活性。再一次，包括体外处理和间接体内处理。SDC2的调节表达或活性可以调节细胞的免疫抑制特性。其可以增加SDC2的表达，从而提高细胞的另一免疫抑制特性。其可以增加SDC2的表达，从而提高细胞的另一治疗特性。
为了处理细胞，可以采用促进SDC2表达的化合物处理细胞；实例见本发明的其它地方。细胞可以采用编码SDC2的载体转染。
可以对细胞进行处理，从而增加其外源SDC2表达，例如，通过暴露于增加SDC2表达的培养条件或环境条件。可采用多种策略来刺激SDC2的表达，特别是在干细胞中，包括基质干细胞和MSC中SDC2的表达。这些策略包括利用特异性生物因子、化合物或应激引起p53活化；激活ERK、p38或JNKSAPK激酶通路的化合物、生物因子和应激；激活缺氧诱导因子(HIF)-介导的通路的生物因子、化合物或应激；激动TGF、BMP、Lefty、Nodal和激活素(Activin)通路的生物因子、化合物或应激；激动NOTCH通路的生物因子、化合物或应激，包括Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL2、DLL3、DII4；激动Hedgehog信号传导通路的生物因子、化合物或应激；激动WNT通路的生物因子、化合物或应激；激活雄激素受体或雌激素受体通路的生物因子、化合物或应激；及激活NFkB通路的生物因子、化合物或应激。
在本发明的实施例中，通过直接或间接活化肿瘤抑制蛋白p53增加了SDC2表达。不希望受限于理论，这可能是由于SDC2基因启动子中“推测的”p53-结合位点的存在(如在人基因上)引起的。这种活化可通过多种方法实现，其中一些方法是本领域技术人员已知的，如HDAC抑制、生长抑制、饥饿、毒素暴露与/或化疗。
血清饥饿(SS)和生长停滞(融合)都会刺激SDC2表达。SS和生长停滞都是人们已知的p53刺激。
HDAC抑制剂和去乙酰化酶(sirtuins)可用于增加SDC2表达。在本发明使用中，斯普利特麻一辛(splitomicin)、丙戊酸和2-吡咯烷酮-正-丁酸(PBA)均在24小时时增加了SDC2RNA水平，III类HDAC抑制剂斯普利特麻一辛的刺激非常强劲。HDAC的去乙酰化酶家族包括SIRT1和SIRT2，它们可用于增加SDC2表达。去乙酰化酶是NAD-依赖性的HDAC，据报道，它们可脱去p53蛋白的乙酰基——据报道，p53的乙酰化对其反式激活/转录活性非常重要。因此，去乙酰化酶是p53活性的关键调节因子。去乙酰化酶的实例包括烟酰胺、sirtinol、EX-527和tenovins。在本发明的其它试验中，溶剂DMSO也增加SDC2RNA水平。据报道，DMSO也具有HDAC抑制剂(p53活化)能力。
诱导或导致细胞缺氧可用于增加SDC2表达；在另一系列测试中，缺氧模拟DMOG(二甲基乙二酰基甘氨酸)导致SDC2RNA强健增加。DMOG是一种缺氧模拟物，本发明使用的其它缺氧模拟物包括氯化钴、EDHB和去铁胺。据报道，缺氧会(通过ATR/CHK1激酶)刺激p53。
毒素可用于增加SDC2表达，例如，环境毒素苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物(BPDE)。本发明使用的其它p53活化剂包括使用γ辐射、MDM2抑制剂(nutilins)和化学治疗剂，如顺铂和吉西他滨。
因此，本发明的实施例包括处理细胞，以活化p53，从而增加SDC2表达与/或脱落。
处理的细胞合适地是哺乳动物细胞，优选是人、小鼠、大鼠、狗、马、兔、羊、牛或猪的细胞，特别是马和人的细胞。在处理之前，细胞引起的SDC2表达可以较低或不存在，从而该处理可以在那些细胞上提供之前未看到的SDC2水平。或者，处理之前的表达水平最初较高，但是，随着时间延长而降低，处理是为了恢复之前的SDC2表达水平，例如，恢复细胞或组织随时间而消失的免疫抑制性与/或其它治疗特性。
调节SDC2的表达或活性可降低SDC2的量与/或活性与/或表达，从而降低细胞的免疫抑制特性。可降低SDC2的量与/或活性与/或表达，从而降低细胞的血管形成特性。本发明的其它实施例提供了包括处理细胞，从而诱导免疫刺激与/或免疫活化的方法。可对细胞进行处理，消除天然SDC2表达；例如，可采用反义疗法或其它疗法来敲除或敲低SDC表达。
本发明的所有方法进一步包括从经处理的细胞得到后代细胞或组织；本发明还扩展到采用这些方法得到的细胞或组织。
因此，在本发明的实施例中，细胞和细胞培养基上SDC2的水平与免疫调节与/或其它治疗特性由此相联系。本发明还提供一种检测包含细胞与/或组织的细胞治疗产品的方法，包括检测SDC2。这可通过采用基于结合SDC2抗体，优选SDC2-特异性抗体的试验实现。现有的SDC2ELISA方法是合适的。可以测量细胞表面或培养基或两者中的SDC2。将SDC2水平与预定标准相比较，水平升高表明存在免疫抑制与/或其它治疗特性，水平降低表明缺乏免疫抑制与/或其它治疗特性。
在本发明的一个实施例中，提供了一种用于含细胞的治疗产品效力的试验，包括对细胞的SDC2表达或检测产品(例如溶液)中是否存在SDC2进行试验。本发明的另一个实施例利用试验中SDC2的水平检测细胞治疗产品的效力。
通常在本发明的测试/试验方法中，可采用ELISA监测SDC2脱落，从而监测特定批次人MSC的效力。
未通过测试/试验的细胞或产品被舍弃或经处理以增加其SDC2表达。可在决定是否根据本发明的其它方法处理细胞或组织之前，开展SDC2的试验。
本发明的试验方案包括：
1.检测潜在产品的SDC2水平；
2.将此水平与合格治疗产品的最低预定水平进行对比；
a.如果该水平等于或超过最低预定水平，则潜在产品合格；
b.如果该水平低于最低预定水平，则产品不合格；
3.任选接下来将该水平与不合格治疗产品的最高预定水平进行对比；
a.如果该水平低于最高预定水平，则舍弃该产品；
b.如果该水平处于合格治疗产品最低预定水平和不合格治疗产品最高预定水平之间，则可以对潜在产品进行处理，尝试提高其SDC2水平，然后，重复该试验。
上文提到的试验的SDC2取舍水平、最低预定水平和最高预定水平，根据其它测试、使用的细胞、疗法的性质及其它因素而变化。治疗产品的最低预定水平可以是大约1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml或更高值的SDC2水平。不合格制剂的最高预定水平可以是大约200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml或600pg/ml；虽然通常明显低于合格产品的最低水平，但是，也可以比这些指出的值更高或更低。或者，低于合格治疗产品最低预定水平的任何制剂可视为不合格，但是，适合经处理，尝试将SDC2水平提高到合格水平。
在下文详细描述的本发明的具体实施例中，较差的MSC供体细胞制备物未通过SDC2试验，而合格供体通过了SDC2试验。
因此，本发明提供使用、分派等之前干细胞和其它细胞治疗贴片或产品的“批释放”或质量控制效力试验。
多配体蛋白聚糖-2(SDC2)亦称为纤维蛋白聚糖(Fibroglycan)，现在称为CD362，是一种跨膜(I型)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycan)，是多配体蛋白多糖家族的成员。本发明所述SDC2通常指的是所有物种的SDC2，包括其直系同源物，优选人、小鼠、大鼠、狗、马、兔、羊、牛和猪的SDC2，特别是马以及更优选是人的SDC2。
本发明进一步涉及SDC2的抗体、利用SDC2抗体的处理方法、SDC2抗体的用途及包含SDC2抗体的药物组合物。与至少人、小鼠和大鼠反应的抗多配体蛋白聚糖2抗体、orb13481可由BiorbytLtd.(12PembrokeAvenue,DennyIndustrialCentre,Waterbeach,Cambridge,CB259QR,UK)提供。目录编号MAB29651(Clone305507)、与人、小鼠、大鼠、马、兔和猪反应的其它SDC2抗体可从R&DSystems,Inc获取。本发明公开的SDC2抗体片段也包括在词语抗-SDC2抗体之内。
使用实例的数据证明了因此，本发明提供SDC2拮抗剂，如SDC2或SDC2抗体的治疗用途，这些用途与本发明公开的SDC2的用途对应，及与WO2013/117761公开的SDC2阳性细胞的用途对应。因此，本发明提供用于免疫抑制、炎症治疗、癌症治疗和伤口/骨愈合的SDC2拮抗剂(如抗体)。
因此，本发明进一步提供作为肿瘤抑制剂的SDC2抗体。SDC2抗体可用于治疗肺部疾病，包括急性肺损伤(ALI)；急性呼吸窘迫综合症(ARDS)；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；及特发性肺纤维化(IPF)。SDC2抗体可用于治疗败血症和败血症诱发的多器官功能衰竭、骨髓移植(BMT)或造血干细胞(HSC)排斥；实体器官移植(SOT)排斥(包括肝、肾、皮肤、角膜、心脏、肺)；急性毒素诱发肝功能衰竭；自身免疫性肝炎；原发性胆汁性肝硬变(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)；骨坏死；退行性椎间盘疾病；类风湿性关节炎；糖尿病患者骨关节炎和骨延迟愈合；自身免疫性肾炎，包括韦格纳氏肉芽肿病(WG)；烧伤、严重烧伤；肌肉萎缩病和萎缩症，包括肌少症；恶病质和其它肌肉萎缩病，包括肌营养不良症(杜氏和贝氏)；充血性心力衰竭、急性心肌梗塞和中风；1型糖尿病；2型糖尿病；糖尿病视网膜病变和其它视网膜病；糖尿病肾病和其它肾病；糖尿病神经病变和其它神经病变；无法愈合的糖尿病溃疡；糖尿病心肌病和其它肌病；动脉粥样硬化症；外周动脉疾病和严重肢体缺血；葡萄膜炎；(湿或干)急性黄斑变性(AMD)；视网膜和角膜损伤；自身免疫性疾病，如自身免疫性胃炎(AIG)；移植物抗宿主病(GvHD)；多发性硬化疾病和脱髓鞘病；甲状腺疾病；炎症性肠病，包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和瘘化克罗恩氏病；硬皮病；狼疮(SLE)；格雷夫斯氏病；和自身免疫性淋巴增生性疾病(ALPS)。
SDC2抗体还可用于治疗马的各种疾病，包括蹄叶炎、腱损伤和运动性肺出血(EIPH)——亦称为“出血”或“突发出血”。
用于本发明的抗体包括具有与SDC2结合的特性及具有与第二靶标结合的特性的抗体。因此，这些抗体可包括与另一个抗原(如细胞表面抗原)结合的第二结合域，包括本领域通常已知的双特异性抗体。
词语“抗体”包括仍然保留结合特异性的抗体的衍生物或其功能片段。生产抗体的技术是本领域所熟悉的，并且在例如Harlow和Lane的《抗体：实验室手册(Antibodies,ALaboratoryManual)》，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)1988及Harlow和Lane的《使用抗体：实验室手册(UsingAntibodies:ALaboratoryManual)》，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1999中进行了描述。词语“抗体”还包括不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和子类(IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig(s))。
词语“抗体”还包括实施例如嵌合、单链和人源化抗体，以及抗体片段等，特别是Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab')2、Fv、scFv片段或单域抗体、单可变域抗体或免疫球蛋白单可变域，单可变域仅包括一个可变域，这个可变域可以是VH或VL，与独立于其它V区或域的抗原或表位特异性结合。这种免疫球蛋白单可变域不仅包括分离的抗体单可变域多肽，而且还包括较大的多肽，这些较大的多肽包括抗体单可变域多肽序列的一个或多个单体。
人SDC2可进一步包括由下述各项组成或包括下述各项的多肽：
(a)SEQIDNO:3或4规定的氨基酸序列；
(b)(a)的天然变体；
(c)(a)或(b)的直系同源物；
(d)生物活性和对诊断或治疗有用的片段，其类似物、变体及衍生物；
(e)(a)-(d)的胞外域，及
(f)所有以上各项的二聚体和低聚物。
本发明的SDC2多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选是天然或重组多肽。词语“片段”、“衍生物”、“变体”及“类似物”指的是基本上保留SDC2相同生物功能或活性的多肽，可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或(iii)其中成熟多肽与另一化合物融合，所述化合物如提高多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇或多唾液酸)，但不限于这些，或(iv)其中另外的氨基酸被融合到成熟多肽上，例如，方便成熟多肽的提纯，但并不限于这些。
本发明的多肽还包括SEQIDNO:3和4的多肽(特别是成熟多肽)，以及与SEQIDNO:3和4的多肽具有至少60％类似性(优选至少60％一致性)的多肽，优选与SEQIDNO:3和4的多肽具有至少80％类似性(优选至少80％一致性)的多肽，更优选与SEQIDNO:3和4的多肽具有至少90％类似性(优选至少90％一致性)的多肽，更优选与SEQIDNO:3和4的多肽具有至少95％类似性(优选至少95％一致性)的多肽，还包括此类多肽的部分，此类多肽的部分通常包含至少100个氨基酸，优选包含至少120个或更优选包含至少140个氨基酸。两个多肽之间的“类似性”这样确定：将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行对比。各种计算序列类似性和一致性的不同方法是人们所熟悉的。通常，执行这些计算的合适方法是利用程序，如Smith-Waterman、BLAST或FASTA进行数据库搜索，及采用一个或优选两个或甚至三个类似性表格。Blosum和PAM(可接受点突变)矩阵是用于数据库搜索和序列比对的合适的氨基酸类似性矩阵。如果采用Smith-Waterman或FASTA，则有关的是确保空位罚分足够大，而且如果初次运行未揭露任何同源序列，则尝试采用不同的算法是合适的——如果你一开始使用启发式算法BLAST或FASTA，这尤其正确。
在下文详细描述的本发明的具体实施例中，制备了SDC2片段，并相对天然的，即完整的人SDC2对其活性进行了测试。鉴别了活性片段。因此，本发明还提供保留SDC2活性的SDC2片段——在本发明其它地方表明，在实例2或实例9的试验中(即对TNF或IL1引起的NFkB活化产生剂量依赖性抑制)，所述片段将显示人SDC2的特有活性(虽然不必具有相同的效力)。活性片段保留了SDC2活性，且可能超过天然SDC2的活性；所述片段优选保留天然SDC2至少30％、至少50％、至少70％或至少80％的活性。
因此，本发明包括并提供包含SDC2片段或由SDC2片段组成的多肽，其中所述多肽具有SDC2活性。所述片段适宜地包含不超过150、不超过120、不超过100或不超过80个SEQIDNO:3的氨基酸。此外，本发明的片段分别地可包括SDC2的信号序列，即SEQIDNO:3的氨基酸1-18。所述片段的合适长度是至少30、至少40、至少50或至少60个氨基酸。片段、包含片段的组合物的用途、及利用片段的处理方法就如完整SDC2。所述片段构成SDC2的实施例。
优选地，词语SDC2指的是天然(“完整”)SDC2、SDC2的活性片段、SDC2的活性变体及被SDC2抗体识别，优选被SDC2特异性抗体识别的SDC2型表面蛋白；SDC2优选指天然SDC2及其活性片段，更优选指天然SDC2。SDC2抗体的目录编号是：MAB29651(Clone305507)，可从R&DSystems,Inc公司获取，与人、小鼠、大鼠、马、兔和猪反应。本发明的人SDC2在按照实例2或实例9的免疫抑制性试验中呈阳性，而且更优选与SDC2抗体结合。
本发明进一步提供一种包含SDC2片段或由SDC2片段组成的多肽的抗体。这种抗体适合用于人体治疗，特别是用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。这种抗体也适合用于本发明所述的完整SDC2抗体的疗法。
序列
SEQIDNO:1-SDC2人mRNA
SEQIDNO:2-SEQIDNO:1的核苷酸605-1210
(编码SEQIDNO:3)
SEQIDNO:3-SDC2人蛋白
SEQIDNO:4-SEQIDNO:3的氨基酸19-201
(成熟蛋白)
现在，将对照附图，在下述实例中描述本发明，其中：
图1表明了用ELISA检测Ad.SDC2表达MSC的上清液中脱落SDC2的情况；
图2表明Ad.SDC2过度表达导致SDC2蛋白过度表达，所述过度表达在72小时期间增加；
图3表明，与亲代MSC相比，Ad.SDC2MSC(“S2”)的免疫抑制活性明显提高；
图4表明了含SDC2的细胞培养上清液(“S2”)对T细胞增殖的影响的分析；
图5表明了SDC2蛋白抑制了TNFα和IL1β对NFkB的活化；
图6表明了响应重组SDC2及TNFα和IL1β引起的活化得到的NFkB诱导；
图7表明了响应TNFα和IL1β活化后SDC2过度表达的NFkB诱导；
图8表明了MSC的nutlin-3a处理导致SDC2脱落剂量依赖性增加。
图9表明了化疗增强了SDC2从人MSC上的脱落；
图10表明SDC-2C-末端删除片段(1-6)的过度表达降低了NF-kB响应IL-1β和TNF-α的活性；及
图11表明了SDC-2的腺病毒表达降低了响应IL-1β、TNFα和IL-1β/TNFα的NF-kB活性和IL6/IL8分泌。
实例1–SDC2表达增强提供免疫抑制性
方法
MSC的转导
将MSC按每孔105个细胞的密度平板接种于6-孔板(Nunc)完全培养基(α-MEM，10％FBS)内，让其粘附过夜。细胞不进行转导作为阴性对照，或采用1μl腺病毒(
蛋白质印迹分析
通过胰蛋白酶消化收获细胞，并在含50mMTrispH7.4、10％甘油、0.5％NP40、150mMNaCl和完全迷你型蛋白酶(抑制剂(Roche)的细胞裂解缓冲液中裂解。让细胞裂解液进行10％SDS-PAGE；每个轨道加载50μg蛋白质。将抗人多配体蛋白聚糖-2Ab(R&Dsystems)按1:500稀释在TBS0.1％Tween，3％BSA溶液中，进行蛋白质检测。将与辣根过氧化物酶结合的二级抗大鼠IgG抗体(SantaCruz)按1:1000稀释度加入。然后，利用ECL蛋白质印迹化学发光试剂(Pierce)和Flourochem成像系统，进行检测。
酶联免疫吸附试验
利用酶联免疫吸附试验测定收集的上清液中人多配体蛋白聚糖-2的水平。采用商业上可获取的ELISA试验来测定SDC2的水平(CUSABIO)。按照生产商的说明开展试验。利用纯化的SDC2标准品的制作校正曲线。按照生产商的说明，通过S形(sigmoidal)逻辑回归法完成曲线拟合。
人外周血单核细胞的分离
为了分离外周血单核细胞(PBMC)，收集抗凝血样(7-8ml)，分层放到液体密度梯度培养基(GEHealthcare)上，在室温以400xg离心分离30分钟。吸出顶层并舍弃，小心移取对应的密度中间层(沉棕黄层)，转移到新的50ml管内，收获PBMC。加入20mlPBS洗涤PBMC2次，以400xg离心分离10分钟。然后，以200xg低速离心分离10分钟，以脱除血小板。将PBMC在T细胞培养基(RPMI-1640，Gibco)中重悬，该T细胞培养基在洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)培养基中含10％FBS、50μMβ巯基乙醇、1％NEAA、1％L-谷氨酰胺。取出10μl等份的这种悬浮液，并采用血球计测定细胞数。
人T细胞增殖试验
采用0.1％BSA/PBS洗涤人PBMC，并按浓度2x107个细胞/ml在预热(37℃)的10μMVybrant羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)/PBS染色溶液(Invitrogen)中染色。将细胞在37℃、避光的条件下培养6分钟，加入5体积冰冷的含10％FBS的培养基，使反应停止。用培养基洗涤PBMC3次，以脱除未结合的CFSE的所有痕迹。将10万个CFSE染色的PBMC在96-孔圆底板中用T细胞培养基中的抗人CD3/抗人CD28可溶性多克隆抗体进行刺激。然后，向经过刺激的PBMC中按各种比例(1:10、1:50、1:100、1:200和1:400)加入MSC。亦培养不进行刺激的PBMC作为对照。4天后，收获PBMC，之后移除上清液，将细胞在100μl含2％FBS的autoMACS清洗液中进行洗涤。然后，采用抗-人CD4+-APC进行复染色。利用FACSCanto分析PBMC的CFSE荧光。分析所有增殖，并与没有MSC共培养的刺激的PBMC进行对比。
结果
采用SDC2ELISA可检测出Ad.SDC2过度表达MSC上清液中的脱落SDC2
采用Ad.EGFP或Ad.SDC2转导24小时后，吸出培养基，并代之以无血清培养基，并在24、48和72h后收集。此上清液用于SDC2ELISA，包括新鲜无血清培养基作为对照。
多配体蛋白聚糖在称为脱落的过程中，通常在质膜附近发生调节裂解。多配体蛋白聚糖胞外域的释放不仅会下调信号转导，而且将膜结合受体转化为可溶效应子/或拮抗剂(Manon-Jensenetal.,2010)。
通过采用人特异性SDC2ELISA技术，我们能够对huMSC脱落的SDC2蛋白进行检测和定量。我们测定Ad.EGFP和Ad.SDC2表达MSC培养基中脱落的SDC2蛋白的水平。在48小时后检测Ad.EGFP细胞培养基中的SDC2(346.4pg/ml)，72小时后，这一数值增加到689.2pg/ml。48小时时，SDC2过表达细胞显示培养基中脱落SDC2的水平增加(456pg/ml)，在72小时时，其水平大约是Ad.EGFP的2倍(1412.7pg/ml)(参见图1)。
参考图1，转导后24小时，将完全培养基换为无血清培养基(1ml/孔)。48小时和72小时后收集无血清上清液。采用商业上可获取的SDC2ELISA试剂盒来检测上清液中存在的脱落SDC2。与Ad.EGFP表达细胞相比，Ad.SDC2上清液中的脱落SDC2的量增加(～2倍)。
接下来，检测SDC2的蛋白表达，以确保无血清培养基不会影响过度表达。
Ad.SDC2过度表达导致高水平的SDC2蛋白表达
HuMSC按1×105个细胞/孔的密度接种在6孔板上&让其粘附24小时。然后，采用Ad.EGFP或Ad.S2(1×1012vp/ml)转导HuMSC。转导24小时后，将完全培养基换为无血清培养基。24、48和72小时后收获蛋白裂解液。对这些裂解液进行SDC2蛋白质印迹分析(R&D)，结果发现，SDC2蛋白表达显著增加。我们观察到，与核心蛋白(～25kDa)及其二聚形式(～48kDa)的分子量对应的SDC2条带增加(参见图2)。
免疫抑制潜力随SDC2过度表达增加而增加
已经证明，在Ad.SDC2转导后，SDC2蛋白表达增加，此外，从细胞表面脱落的可溶形式的SDC2也增加。我们对SDC2过度表达对huMSC免疫抑制潜力的影响(如果有任何影响的话)进行了研究。
利用T细胞增殖试验，对亲代细胞、Ad.EGFP细胞和Ad.SDC2hMSC细胞的免疫抑制潜力进行了评价。利用CFSE表达的流式细胞分析，测定了PBMC的T细胞(CD4+)部分的增殖。CFSE是一种用于评价细胞增殖的荧光细胞染料，每次细胞分裂之后，其荧光随子细胞逐渐减半。由于存在MSC，受刺激T细胞的免疫抑制导致增殖抑制。在Ad.SDC2过度表达MSC的存在下，增殖明显降低。结果以3代百分比增殖显示。在1:200MSC:PBMC比率时，与经刺激的T细胞阳性对照相比，Ad.SDC2MSC表现出显著的T细胞免疫抑制潜力(使用1:10、1:50和1:100比率时，得到类似的结果)。与亲代MSC相比，Ad.EGFP细胞显示出可以比得上的T细胞免疫抑制水平(参见图3)。
参考图3，采用刺激T细胞共培养，对亲代细胞、Ad.EGFP细胞和Ad.SDC2细胞的免疫抑制潜力进行评价，并采用流式细胞术进行定量。结果表明，Ad.SDC2细胞显著提高了免疫抑制性，与刺激T细胞阳性对照相比，能够抑制T细胞增殖。Ad.EGFP群保持了与亲代MSC相当的免疫抑制潜力，但是，与亲代及与Ad.EGFPMSC相比，Ad.SDC2群(标记为“S2”)显示出明显增强的免疫抑制潜力(采用未配对T检验确定，*＝P≤0.05，**＝P≤0.001)。
因此，与亲代huMSC相比，huMSC中SDC2过度表达导致免疫抑制效果得到增强。
实例2–过度表达SDC2的细胞(MSC)上清液抑制T细胞增殖
我们对过度表达SDC2的一群MSC的上清液的免疫抑制活性进行了试验。
参考图4，结果表明，与来自两个对照：(1)亲代MSC(“亲代”)，及(2)CD3/CD28刺激的T细胞(“T细胞St”)的培养基相比，来自本发明细胞，即S2-过度表达的MSC(“S2”)的培养基，足以抑制CD3/CD28诱导的T细胞增殖。因此，该上清液具有免疫抑制性。
实例3
作为治疗产品效力试验的SDC2试验方案
我们开发了基于SDC2试验的产品效力测试方案。
该方案包括：
1.检测潜在产品中的SDC2水平
2.与合格治疗产品最低预定水平进行对比
a.等于或高于最低预定水平＝合格(测试结束)
b.低于最低预定水平＝不合格
3.与不合格治疗产品的最高水平进行对比
a.低于最高水平＝舍弃(测试结束)
b.处于合格治疗产品的最低预定水平和不合格治疗产品的最高水平之间＝进行处理，以提高SDC2水平，然后重复试验
实例4
作为治疗产品效力试验的SDC2试验
我们将实例3的方案在人细胞制备物的一特定试验中实施。
该方案采用下述预定水平：
1.我们对潜在产品中的SDC2水平进行了试验
2.SDC2水平等于或高于1400pg/ml的制备物被认为适合进行进一步处理作为潜在治疗产品；制备物低于该水平被认为不合格
3.SDC2水平低于500pg/ml的制备物一开始被标注为不适合进一步处理
4.500至1400pg/ml之间的制备物被鉴定为适合采用SDC2活化剂进行处理，以提高其SDC2水平
5.然后，我们还注意到，即使SDC2水平低于500pg/ml的制备物也可以采用SDC2活化剂进行处理，以提高其SDC2水平
6.SDC2水平升高到1400pg/ml以上的经处理细胞被认为适合进行进一步处理作为潜在治疗产品。
实例5-活化p53以增加内源SDC2
我们对各种HDAC抑制剂对一开始根据SDC2表达分离，然后在培养中保持的人细胞群上SDC2表达的影响进行了测试。
在24小时时，斯普利特麻一辛(Splitomicin)、丙戊酸和2-吡咯烷酮-正-丁酸(PBA)的SDC2RNA水平均增加，其中斯普利特麻一辛的刺激最大。
类似地，我们对环境毒素苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物(BPDE)进行了测试，发现600nMBPDE使SDC2分泌增加了近3倍。
实例6–供体细胞群的SDC2水平
对3个人MSC供体(供体细胞制备物)的SDC2分泌水平进行了测试。结果表明，其中两个供体被鉴定为良好执行者(标记为供体109和110)，具有高水平的SDC2，而第三个供体被鉴定为差执行者(供体111)，具有低水平的SDC2，并且未能通过实例4的SDC2试验。
实例7
局部施用SDC2+、SDC2-和PA-SSC在糖尿病伤口愈合方面的对比
我们利用(一种纤维状牛I型胶原高纯度配制匀浆)对各种干细胞群在伤口愈合模型方面的活性进行了对比。
体内实验模型
采用雄性新西兰白兔(3-3.5kg)开展研究。通过耳缘静脉给予Alloxan(150mg/kg)，在这些兔子中诱发糖尿病。利用Accucheck优越型试纸(Roche)每天检查血清血糖。在5周高血糖后，采用甲苯噻嗪和氯胺酮对兔子进行麻醉。采用消毒的、一次性6-mm钻取活组织切刀(punchbiopsies)制造5个伤口(一只耳朵上三个伤口，另一只耳朵上两个伤口)。每个伤口按以下五个随机处理组中的一个进行处理：
1不处理
2仅支架(25μl)；
3及1x106个野生型MSC(来自重悬在中的细胞小球(pellet)的25μl溶液)
4及1x106个SDC2阳性(“SDC2+”)型MSC(来自重悬在中的细胞小球的25μl溶液)及
5及1x106个SDC2阴性(“SDC2-”)型MSC(来自重悬在中的细胞小球的25μl溶液)。
在进行处理后，用聚氨酯敷料(OpSite；Smith&Nephew)覆盖伤口，缝合耳朵，并用粘合性敷料(Operfix；Promedicare,Clonee,Ireland)覆盖，直到第7天。为了进行无偏见的评价，该研究处理是随机的和盲的。7天后，通过静脉内注射戊巴比妥钠(2mL)处死兔子。
结果分析
处理一周后，不同处理组的伤口愈合情况呈现显著差异。在兔子处死当天对每个伤口进行跟踪。在处死当天制造一个新伤口，计算1周期间伤口面积减少百分比。
伤口闭合百分比评价
在处死当天，每个伤口跟踪检查6次。采用CellB软件(Olympus)测定每个图像的面积，计算平均面积。计算每个处理组1周期间伤口面积减少百分比。
伤口闭合百分比
伤口闭合百分比分析表明，与未处理伤口相比，加速了伤口愈合速度。采用支架中的100万个SDC2+细胞处理伤口，结果表明，与未处理组相比，在1周时出现最高、最显著的伤口闭合百分比。当与SDC2+细胞混合时，的伤口闭合效果显著增强。
所有伤口部分均进行进一步处理，用于组织学分析和体视学分析。
组织学分析
沿中线切开伤口，并在10％福尔马林中固定24小时。采用组织处理器(ASP300；MeyerInstruments,Houston,TX)处理组织，并包埋在石蜡中。采用标准方案，用苏木精、曙红和马松三色对切片(5mm)进行染色。
从组织染色可以观察到，处理的伤口愈合情况良好，在伤口部位形成了新的组织。SDC2+细胞和混合处理显示出最有效的伤口愈合。混合SDC2+细胞增强了的愈合潜力。与未处理组相比，SDC2+处理的伤口在伤口部位形成了新的组织，在伤口床底部形成了胶原。
经SDC2+细胞处理的伤口的伤口床中的新生血管
众所周知，除改善皮肤伤口愈合之外，MSC还可促进血管形成。在采用SDC2+细胞处理的伤口中也观察到类似的作用。在这些伤口中，可以观察到在伤口床内形成了新的血管。因此，在SDC2+处理的伤口中观察到显著的伤口愈合，伤口闭合百分比增加，这可能与更有效的新生血管形成有关。
总结
MSC混合保持了良好的代谢活性，反映出基质对细胞活力没有不良影响。细胞在整个基质上密集存在，适当分布，没有形成任何细胞块。在目前的研究中，与单独采用处理的对照相比，采用SDC2+细胞混合处理伤口时，伤口闭合百分比增加。SDC2+细胞显著增强了的伤口愈合潜力。据报道，MSC还可以促进血管形成。在目前的研究中，在SDC2+细胞处理组的伤口床中观察到血管形成增加。因此，SDC2+处理伤口提高了伤口闭合百分比，形成了更突出(prominent)的新生血管，显示出显著的伤口愈合益处。因此，基质中本发明的SDC2+细胞改善了伤口愈合潜力，缩短了愈合时间。
实例8–癌症细胞迁移
细胞迁移是体外细胞培养相关研究的关键参数。必须对细胞群在不同条件下的动态变化进行监测。采用基于阻抗的实时细胞分析仪(RTCA,xCELLigence,Roche)，我们可以对下述特性进行实时监测：增殖、迁移和细胞粘附。这些特性均涉及癌症演变。我们采用这种方法来确定癌细胞向条件培养基迁移的能力。这种模型被作为癌症治疗效果的预测——模型内迁移减少表明具有抗癌特性。
在我们的研究中，采用16-孔CIM板，利用前面提到的xCELLigence装置实时读数，确定细胞迁移。为了开展这些研究，采用来自乳癌(MDA-MB-231、MDA-MB-486、MCF-10A)、前列腺癌(DU145)、胰腺癌(SU-86-86)和结肠癌(HCT116)的各种癌细胞系。
结果总结在表1中：
表1：癌细胞迁移
图例：
↑＝与条件培养基相比，迁移增加；
↓＝与条件培养基相比，细胞迁移减少；
_＝与条件培养基相比无变化。
乳癌细胞系
·重组SDC2(500ng/mlrSDC2(n＝5)和100ng/ml(n＝2))抑制MDA-MB-231细胞的迁移。采用Ad.SDC2(3ul)-CM(n＝3)时，也得到类似的迁移结果。
·MDA-MB-486细胞朝Ad.SDC2-CM(3ul；n＝1)的迁移减少。
·Ad.SDC2(3ul)未改变MCF-10A细胞(n＝1)的迁移。
前列腺癌细胞系
·与仅采用条件培养基相比，向无血清MSC-CM中加入500ng/mlrSDC2，在一个实验中，降低了DU145细胞的迁移，在第二个实验中，未发生任何变化。Ad.SDC2(3ul)降低了DU145细胞(n＝1)的迁移。这些结果表明，SDC2的EC域抑制了这种前列腺癌细胞系的迁移。
胰腺癌细胞系
·SU-86-86细胞的迁移能力发生变化；在一个实验中，朝rSDC2-CM(100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml；n＝1)的迁移增加，另一个实验中，朝rSDC2-CM(100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml；n＝1)的迁移降低。
结肠癌细胞系
·HCT116细胞在测试的所有浓度(100-1000ng/ml)均表现出朝rSDC2-CM的迁移降低。
结论
总体来说，这些结果表明了不同癌细胞朝培养基中SDC2的行为发生变化。一般说来，SDC2降低癌症的迁移能力，表明在模型中具有抗癌效果，特别是MDA-MB-231细胞(乳癌)。
在初步测试中，SDC2抗体表现出类似的乳癌迁移抑制能力，表明具有抗癌活性，初步试验还需要通过此领域的后续扩大工作项目进行证实。
实例9–免疫抑制
采用实例8中使用的rSDC2，我们研究了SDC2在免疫抑制模型中的活性。我们发现，SDC2蛋白抑制了TNFα和IL1β引起的NFkB活化。这表明了SDC2蛋白本身具有免疫抑制活性。
将kB荧光素酶质粒稳定转导的A549细胞用SDC2重组蛋白预处理1小时。向培养基中加入10ng/mLTNF-α/IL-1β，24小时后开展荧光素酶试验。结果见图5。***＝相对0ng/mLS2，p<0.0001。
将A549细胞用kB荧光素酶质粒稳定转导，并用重组SDC2处理24小时。结果见图6。在上图面中：向培养基中加入细胞因子，24小时后开展荧光素酶分析。在下图面中：在加入细胞因子处理24小时之前，更换培养基。*＝p<0.01，相对0ng/mLS2；***＝p<0.0001，相对0ng/mLS2；+++＝p<0.0001，相对100ng/mLS2。
将A549kBL细胞采用1μL/mL或3μL/mLAd.Null或Ad.SDC2转导，并在开展荧光素酶试验之前用细胞因子处理24小时。结果见图7。***＝p<0.001，相对0ng/mLS2。
这些结果表明了SDC2蛋白的免疫抑制效果。
实例10-SDC2的p53调节
为了确定p53在SDC2蛋白信号传导中的作用，我们利用p53激动剂(nutlin-3a)在药理学上扰乱MSC内的p53通路，以帮助描述SDC2响应。Nutlin-3a诱导明显的p53响应并抑制生长。
方法
细胞培养和处理
将MSC按每孔105个细胞的密度平板接种于6-孔板(Nunc)上的完全培养基(a-MEM，10％FBS)内，让其粘附过夜。然后，将培养基换为含Nutlin-3a或含DMSO作为载体对照的无血清培养基。诱导24小时后，收获细胞用于RNA和蛋白操作，收集无血清上清液开展ELISA检测。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
利用商业上可获取的ELISA试验(CUSABIO)测定从hMSC收集的上清液中人多配体蛋白聚糖-2的水平。按照生产商的说明开展试验。利用SDC2的纯化标准品制作校正曲线。按照生产商的说明，通过S形逻辑回归法完成曲线拟合。
结果
MSC的Nutlin-3a处理导致SDC2脱落出现剂量依赖性增加
采用Nutlin-3a(5、10、20uM)或DMSO载体对照(5、20uM)处理24小时后，收集MSC上清液，在1500rpm离心分离5分钟，开展SDC2ELISA试验，包括采用无条件无血清培养基作为附加对照。
图8表明，MSC的Nutlin-3a处理导致SDC2脱落存在剂量依赖性增加。采用Nutlin-3a或DMSO作为载体对照在无血清培养基中处理MSC24小时。收集无血清上清液，采用商业可提供的SDC2ELISA试剂盒检测上清液中存在的脱落SDC2。与DMSO对照相比，Nutlin-3a处理的细胞表现出SDC2脱落增加。
图8是三个不同人MSC供体的三个独立实验的代表。脱落SDC2的量从20μMDMSO对照的250pg/ml上升到Nutlin-3a20μM剂量的平均差不多1000pg/ml。
因此，该实验表明，上调p53活性的化合物(Nutilin-3a)也增加了SDC2脱落。
实例11
化疗增加人MSC的SDC2脱落
我们测试了不同化疗抑制剂，特别是紫杉酚、喜树碱、依托泊苷和BPDE(苯并(a)芘二醇环氧化物)对人MSCSDC2脱落的影响。
在血清饥饿法处理24小时之前，采用化疗处理MSC24小时。收获细胞上清液，采用ELISA分析脱落SDC2蛋白表达的相对倍数变化。
图9表明了这些实验的结果，表明化疗增强了人MSC的SDC2脱落。
实例12
鉴别负责NF- k B调节的SDC-2域
为了确定负责调节NF-kB信号传导的是SDC-2的哪个片段或域，我们采用kB基序控制的荧光素酶报告基因系统。我们采用空载体对照腺病毒(p3xFLAG-CMV-14)或表达SDC2的12个片段(1.4至12.4)的载体，对这些细胞进行转导，确定它们对NF-kB转录活性的影响。
图10表明，SDC-2C-端删除片段(1-6)的过度表达降低了响应IL-1β或TNF-α的NF-kB活性。采用空载体(p3xFLAG-CMV-14)或表达片段1.4-12.4的载体对NF-KB-荧光素酶表达细胞进行转染。24小时后，采用细胞因子IL-1β(10ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)处理细胞24小时，然后，开展荧光素酶试验。
这些片段在图10中以数字1至12表示。这些片段对应下述SDC-2肽片段：1，1-79；2，1-87；3，1-100；4，1-144；5，1-169；6，1-201；7，19-79；8，19-87；9，19-100；10，19-144；11，19-169；12，19-201。
促炎性细胞因子，如TNF-α和IL-1β，可以活化NF-kB转录活性，这一点在空载体对照道中可以观察到。对照细胞中TNF-α和IL-1β诱导的NF-kB转录活性分别是大约3倍和4倍。但是，在片段1-6表达细胞中，TNF-α、IL-1β和TNFα/IL-1β-诱导的NF-kB转录活性增加显著降低(图10)。特别是，表达N-末端信号肽(1-18)的片段显著抑制了NF-kB的IL1β和TNF-α活化。片段1.4(1-79)和2.4(1-87)强劲地抑制了NF-kB活化，表明NFkB的抑制需要硫酸乙酰肝素结合位点和信号肽。
这一数据表明了SDC2的免疫抑制特性，以及可能的迁移特性归功于SDC-2的N-末端。通过抑制NF-kB活性，SDC2片段可以降低免疫响应，并作为抗炎剂使用，以及用于伤口愈合、癌症治疗和炎性疾病。
实例13
多配体蛋白聚糖-2抑制响应IL-1β、TNFα和IL1β/TNFα的NF-kB信号传导以及IL6 和1L8分泌
为了确定SDC-2是否影响NF-kB的信号传导，我们采用kB基序控制的荧光素酶报告基因系统。我们采用空载体对照腺病毒(Ad-对照)或SDC2表达腺病毒(Ad-SDC2)对这些细胞进行转导，确定对NF-kB转录活性的影响。促炎性细胞因子如TNFα、IL-1β，以及TNFα/IL-1β组合可以激活NF-kB转录活性，如图11A所示。对照细胞中TNFα、IL-1β和TNFα/IL-1β诱导的NF-kB转录活性分别是大约3倍、3.5倍和4-倍。但是，在SDC-2表达细胞中，TNFα、IL-1β和TNFα/IL-1β诱导的NF-kB转录活性增加显著降低(图11)。
除NF-kB转录活性下降之外，还存在TNFα-、IL-1β-和TNFα/IL-1β-诱导的IL-6和IL-8释放的相关的显著减少，IL-6和IL-8都是由NF-kB调节的(图11B和11C)。
这些数据共同表明了SDC2通过调节NF-kB通路具有抗炎特性。
实例14
将SDC2抗体靶向定位于癌症基质的SDC2
我们对在癌症模型中SDC2+细胞定位进行了研究，以验证早期工作和确定癌症中的治疗性干预战略。
旧金山加利福尼亚大学()的MattKrummel教授友善地准备了MMTVPyMT-P2A-mCherry-P2A-OVA(PyMTChOVA)小鼠。其中mCherry和OVA(卵白蛋白)序列连接至多瘤病毒的中间T抗原(PyMT)，以及整个序列采用MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)启动子驱动。
肿瘤生长–通过触诊乳腺监测雌性PyMTChOVA小鼠的肿瘤发生情况，及采用游标卡尺测量肿瘤尺寸，每周对总肿瘤负荷进行监测。将所有触摸到的肿瘤面积相加，计算合并的肿瘤负荷。肿瘤面积定义为肿瘤长度×宽度。当肿瘤负荷超过200mm2时，按照ACREC动物协议处死小鼠。
肿瘤消化–从小鼠身上剖下PyMT肿瘤，测定切下来的肿瘤总重。然后，用解剖刀切碎肿瘤，每0.3g肿瘤重量用2mg/ml胶原酶IV(Sigma)和200ug/mlDNA酶消化1.5小时。然后，将肿瘤通过100μm细胞过滤器，脱除较大块的未消化肿瘤。然后，运行70％/37％/30％Percoll梯度，脱除死细胞和红细胞，收集两个界面。
流式细胞术–所有抗体均购自R&DSystems、BDPharmingen、eBioscience、Invitrogen或Biolegend。为了进行表面染色，采用抗Fc受体抗体(24G2)培养细胞，并采用PBS2％FCS中的合适的抗体染色。在FACSCanto流式细胞仪(BDBiosciences)上开展所有流式细胞分析。采用FlowJo(Treestar)开展流式细胞数据分析。
肿瘤基质细胞根据下述标记物CD45—、mCherry—、gp38+、CD362+和DAPI—分类。上皮肿瘤细胞根据CD45-、DAPI-和mCherry+进行分类。
结果表明，SDC2(CD362/多配体蛋白聚糖-2)蛋白表达定位于CD45-、mCherry-、gp38+、CD362+和DAPI肿瘤基质。因此，SDC2-阳性细胞定位于癌症基质内，对早期表明SDC2拮抗剂，如SDC2抗体在癌症治疗中具有抗癌效果的工作提供了进一步的支持。
因此，本发明通过调节SDC2水平与/或活性提供免疫调节和其它治疗。

Claims (75)

1.SDC2或包含SDC2的组合物，其用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
2.根据权利要求1使用的SDC2或组合物，包括可溶SDC2。
3.根据权利要求1或2使用的SDC2或组合物，其中SDC2是人SDC2。
4.根据权利要求1至3任一项使用的SDC2或组合物，包括细胞培养基。
5.根据权利要求4使用的SDC2或组合物，其中所述SDC2从细胞培养上清液获得。
6.一种编码SDC2的载体，用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
7.根据权利要求6使用的载体，其编码人SDC2。
8.一种调节SDC2表达的化合物，用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
9.根据权利要求8使用的化合物，其降低SDC2的表达。
10.根据权利要求8使用的化合物，其提高SDC2的表达。
11.根据权利要求10使用的化合物，选自激活p53的化合物。
12.根据权利要求10使用的化合物，选自激活ERK、p38或JNKSAPK激酶通路的化合物。
13.根据权利要求10使用的化合物，选自激活缺氧诱导因子(HIF)-介导的通路的化合物。
14.根据权利要求10使用的化合物，选自激动TGF、BMP、Lefty、Nodal和激活素通路的化合物。
15.根据权利要求10使用的化合物，选自激动NOTCH通路，如Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL2、DLL3和DII4的化合物。
16.根据权利要求10使用的化合物，选自激动Hedgehog信号传导通路的化合物。
17.根据权利要求10使用的化合物，选自激动WNT通路的化合物。
18.根据权利要求10使用的化合物，选自激活雄激素受体或雌激素受体通路的化合物。
19.根据权利要求10使用的化合物，选自激活NFkB通路的化合物。
20.一种处理细胞群的方法，包括将细胞与SDC2结合。
21.根据权利要求20所述处理细胞群的方法，从而所述细胞适合用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
22.根据权利要求20或21所述的方法，包括将待处理细胞与表达SDC2的细胞结合。
23.根据权利要求20或21所述的方法，包括将细胞与SDC2结合或与权利要求1至19任一项所述的组合物、载体或化合物相结合。
24.根据权利要求20至23任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞，以及所述SDC2是人SDC2。
25.根据权利要求20至24任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞是基质干细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞是MSC。
28.根据权利要求20至27任一项所述的方法，包括从经处理细胞得到后代细胞或组织。
29.由权利要求28所述方法得到的细胞或组织。
30.一种处理细胞群的方法，包括通过细胞调节SDC2的表达或活性。
31.根据权利要求30所述处理细胞群的方法，从而所述细胞适合用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
32.根据权利要求30或31所述的方法，包括调节SDC2的表达或活性，从而调节细胞的免疫抑制特性。
33.根据权利要求30至32任一项所述的方法，包括提高SDC2的表达，从而增加细胞的免疫抑制特性。
34.根据权利要求30至33任一项所述的方法，包括采用促进SDC2表达的化合物处理细胞。
35.根据权利要求30至34任一项所述的方法，包括采用编码SDC2的载体转染细胞。
36.根据权利要求30至35任一项所述的方法，包括处理细胞，从而增加其外源SDC2表达，例如，通过暴露于增加SDC2表达的培养条件或环境条件。
37.根据权利要求30至36任一项所述的方法，其中处理之前细胞的SDC2表达较低或没有。
38.根据权利要求30至37任一项所述的方法，其中细胞的SDC2表达开始时高，但随时间而降低，以及所述处理是用于恢复之前的SDC2表达水平。
39.根据权利要求30或38所述的方法，包括采用与SDC2结合的抗体或其片段处理细胞。
40.根据权利要求30至39任一项所述的方法，其中所述细胞是人的细胞，以及所述SDC2是人SDC2。
41.根据权利要求34至40任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是基质干细胞。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是MSC。
44.根据权利要求30至43任一项所述的方法，包括从经处理细胞得到后代细胞或组织。
45.由权利要求44所述方法得到的细胞或组织。
46.用于人类治疗的SDC2抗体。
47.一种SDC2抗体，用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
48.根据权利要求47所述的抗体，其用于免疫抑制。
49.包括SDC2片段或由SDC2片段组成的多肽，其中所述多肽具有SDC2活性，以及所述片段包括不超过150个SEQIDNO:3氨基酸。
50.根据权利要求49所述的多肽，其中所述片段包括不超过120个SEQIDNO:3氨基酸。
51.根据权利要求49所述的多肽，其中所述片段包括不超过100个SEQIDNO:3氨基酸。
52.根据权利要求49-51任一项所述的多肽，其中所述片段是包括至少SEQIDNO:3的氨基酸1-18的N-末端片段。
53.针对权利要求49至52任一项所述的多肽的抗体，用于人类治疗。
54.针对权利要求49至52任一项所述的多肽的抗体，用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗或(iv)伤口愈合。
55.根据权利要求54所述的抗体，用于免疫抑制。
56.一种测试细胞治疗产品的方法，包括测试SDC2。
57.根据权利要求56所述的方法，使用SDC2特异性抗体。
58.根据权利要求56或57所述的方法，包括将SDC2水平与预定标准进行对比。
59.根据权利要求56至58任一项所述的方法，实施以确定是否按照本发明任何其它方法的方法来处理细胞或组织。
60.一种包含细胞的治疗产品的效力试验，包括检测细胞的SDC2表达。
61.SDC2水平在细胞治疗产品的效力试验中的用途。
62.根据权利要求1至5任一项使用的SDC2，其中所述SDC2是长度至少30个氨基酸的SEQIDNO:3且保留天然SDC2至少50％活性的片段，或包含这样的片段。
63.根据权利要求62使用的SDC2，其中所述SDC2是长度至少40个氨基酸的SEQIDNO:3片段或包含这样的片段。
64.根据权利要求62或63使用的SDC2，包括SEQIDNO:3的氨基酸1-18。
65.一种治疗患者的方法，从而导致免疫抑制，包括给予患者SDC2或SDC2抗体。
66.一种治疗患者炎症的方法，包括给予患者SDC2或SDC2抗体。
67.一种治疗患者癌症的方法，包括给予患者SDC2或SDC2抗体。
68.一种促进患者伤口愈合的方法，包括给予患者SDC2或SDC2抗体。
69.一种SDC2拮抗剂，用于(i)免疫抑制，(ii)炎症治疗，(iii)癌症治疗，(iv)伤口愈合或(v)骨愈合。
70.一种根据权利要求69使用的拮抗剂，选自权利要求1至5任一项所述的SDC2，权利要求6至7任一项所述的载体，权利要求8至19任一项所述的化合物，权利要求46至48或53至55任一项所述的抗体，权利要求49-52任一项所述的多肽及权利要求62至64任一项所述的SDC。
71.根据权利要求69或70使用的拮抗剂，用于免疫抑制。
72.根据权利要求69或70使用的拮抗剂，用于治疗炎症。
73.根据权利要求69或70使用的拮抗剂，用于治疗癌症。
74.根据权利要求69或70使用的拮抗剂，用于伤口愈合。
75.根据权利要求69或70使用的拮抗剂，用于骨愈合。
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