CN108251359A - 一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法，无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子‑1，所述的低氧诱导因子‑1的浓度为10‑20ng/ml；还包括力生长因子，所述的力生长因子的浓度为20‑50ng/ml。利用本发明的无血清培养基，并将间充质干细胞在5％的低氧培养条件下进行。本发明的无血清培养基成分确定，质量可控，可用于组织贴壁分离间充质干细胞，可使间充质干细胞生长正常；无血清培养基配合低氧的培养条件，对间充质干细胞的生长具有协同促进作用，间充质干细胞生长情况大大改善，同时多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。

Description

一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体地说，涉及一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注；现已从肌肉、脂肪、牙周质、脐血、脐带等多种组织中分离得到。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。MSC已经在多方面被证明是自体和异体细胞移植、治疗的理想种子细胞。目前国内外已开展了多项MSC临床应用研究，涉及多种来源的MSC类型及多种疾病类型。

从原代组织分离人脐带间充质干细胞都采用含血清培养基进行分离培养，特别是用于组织贴壁法获取间充质干细胞。血清中含有大量的氨基酸、核苷、蛋白质、激素、脂类等微量成分，可以让原代细胞轻易从组织中爬出，但血清中有些成分的含量和具体作用仍没有完全确定；且血清经常被病毒污染，还含有血小板生长因子等可能抑制细胞生长的物质。

目前国内外对于间充质干细胞的扩增体系主要是基础培养基添加5-10％浓度的胎牛血清(FBS)。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明干细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白(7mg-30mg/10⁸个细胞)，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体，引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注间充质干细胞治疗后治疗失效。

现有的无血清培养基较难使干细胞从组织中爬出，难以进行细胞原代培养。因此，成分确定、质量可控且适合进行干细胞原代培养的无血清培养基是临床应用MSC培养的必然选择。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法。本发明的无血清培养基成分确定，质量可控，可用于组织贴壁分离间充质干细胞，可使间充质干细胞生长正常；无血清培养基配合低氧的培养条件，对间充质干细胞的生长具有协同促进作用，间充质干细胞生长情况大大改善，同时多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子-1，所述的低氧诱导因子-1的浓度为10-20ng/ml。

低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor，HIF)，也是低氧诱导结合蛋白，是细胞或组织在缺氧情况下产生的一种核转录因子。HIF能与人红细胞生成素基因结合增强其转录。HIF-1是HIF家族成员。HIF-1由一个120000的HIF-1α亚基和一个91000～94000的HIF-1β亚基组成，其广泛存在于哺乳动物和人体内。

HIF-1α亚基和HIF-1β亚基同属basic-helix-loop-helix基因序列，是基本的螺旋环螺旋(basic helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim，bHLH-PAS)转录因子超家族的一员。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下(氧气的体积分数为21％)也有表达，但合成的HIF-1蛋白很快就被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达并能维持其活性。

在缺氧状态下，HIF-1α亚基的降解被抑制，1α和β亚基形成有活性的HIF-1，转移到细胞核内调节多种基因的转录。HIF-1稳定表达时调节的靶基因有：促红细胞生成素(EPO)编码基因：血管内皮生长因子(VEGF)编码基因、胰岛素样生长因子Ⅱ编码基因、血小板源性生长因子(PDGF)、葡萄糖载体蛋白1、3(glucose transporter-1、3，GLUT-1、3)和糖酵解酶，包括醛缩酶A(aldolase A，ALDA)、烯醇化酶1(enolase 1，ENO1)、乳酸脱氢酶A(1actatedehedrogenase A，LDHA)、磷酸果糖激酶L(phosphofructokinase L，PFKL)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase1，PGK1)、己糖基酶，2、3-磷酸甘油醛脱氢(glyceraldehydes-3-ph0sphate dehydrogenase，GAPDH)编码基因。

HIF-1能够促使干细胞迁移，增殖，并能有效维护干细胞的分化能力。

进一步的方案，所述的添加成分还包括力生长因子，所述的力生长因子的浓度为20-50ng/ml。

力生长因子(mechano growth factor，MGF)，是胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的选择性剪接变异体，具有应力敏感性，MEG在细胞与组织中的作用是多样的。MGF能促间充质干细胞的增殖和迁移。MGF对成间充质干细胞的分化表现出不同程度的延迟作用，MGF能抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，维持间充质干细胞处于未分化状态，MGF促增殖和抑制分化是通过下调关键转录因子来实现的。

较优选的方案，低氧诱导因子-1与力生长因子的含量终浓度的比值为1：2-3；优选的，比值为1：2。经试验发现，当低氧诱导因子-1与力生长因子的含量终浓度比值在此范围内时，既能够提高细胞增殖速率，又能够维持间充质干细胞处于未分化状态，保证干细胞的分化能力。

进一步的方案，所述的添加成分还包括CDLC、PDGF和促肾上腺皮质激素，CDLC的体积分数为1-5％，PDGF的浓度为10-20ng/ml，促肾上腺皮质激素的浓度为0.5-1ug/ml。

CDLC(Chemically Defined Lipid Concentrate)，是化学成分确定的脂质浓缩物，是浓缩的脂质乳液，设计用于减少或替代细胞培养基中的胎牛血清，用于多种应用，包括CHO、杂交瘤和昆虫细胞培养物的生长和维持；通过杂交瘤产生单克隆抗体；以及在昆虫细胞中表达病毒。这种培养基添加剂的化学成分是确定的。

PDGF是血小板衍生因子，是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。

进一步的方案，所述的添加成分还包括以下成分，各成分的含量终浓度为：

层粘连蛋白LN521 1-4ug/mL、bFGF 20-40ng/ml、EGF 20-30ng/ml，VEGF 20-40ng/ml、HGF 20-40ng/ml、白血病抑制因子500-2000U/mL中的至少一种。

碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，分子量为16～18.5KD。bFGF具有广泛的生物学作用，对多种细胞的生长、分化及功能有影响，在正常生理和病理过程中发挥作用，其主要生物学作用有：(1)作为血管生长因子；(2)促进创伤愈合与组织修复；(3)促进组织再生；(4)参与神经再生等。bFGF有很强的肝素亲和力，在其114～123位氨基酸为高亲和力区，其它部位则有低亲和力区。抗bFGF与受体结合的单克隆抗体对其与肝素结合力无影响，取消有羟基端42位氨基酸，肝素亲和力即消失，而且可丧失部分生物学活性。

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，EGF是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。

进一步的方案，添加成分中还包括维生素B2，维生素B2的含量终浓度为30-50ug/ml。

维生素B2参与体内生物氧化与能量代谢，与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢有关，可提高肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育，维护皮肤和细胞膜的完整性。在缺氧条件下，虽然HIF-1稳定表达并维持活性，一定程度上促进下游基因的表达，维持细胞的代谢功能，但低氧条件下乳酸生成比例仍会明显提高，游离的堆积脂肪酸也会有所增加。维生素B2能够促进脂肪酸、乳酸的代谢，与HIF-1起到协同作用，在增加间充质干细胞增殖速率的同时，改善细胞内环境。

进一步的方案，添加成分中还包括螺旋藻多糖，螺旋藻多糖的含量终浓度为5-30ug/ml。

螺旋藻多糖能够促进细胞生长、促进蛋白质合成，在低氧条件下能够提高细胞中超氧化物岐化酶(SOD)的活力，保护细胞。螺旋藻多糖与低氧诱导因子协同作用，加快低氧条件下脂肪酸、乳酸等的代谢，在增加间充质干细胞增殖速率的同时，改善细胞内环境，同时也提高细胞的抗感染能力。

优选的方案，在无血清培养基中同时添加维生素B2和螺旋藻多糖，并且加入的维生素B2和螺旋藻多糖的含量终浓度比值为2-4：1；优选的方案，维生素B2和螺旋藻多糖的含量终浓度比值为3：1。

经试验发现，当维生素B2和螺旋藻多糖的含量终浓度比值在此范围内时，能够进一步提高细胞的增殖速率。螺旋藻多糖在低氧条件下提高细胞中超氧化物岐化酶(SOD)的活力的同时，维生素B2促进蛋白合成，提高酶活，能够减小低氧对细胞带来的不良影响，更有利于改善细胞的内环境。

进一步的方案，所述的添加成分还包括以下成分，各成分的含量终浓度为：

转铁蛋白0.2-2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素1-10U/ml、胆碱二柠檬酸盐20-30nM、磷脂酰胆碱1-10ng/ml、磷脂酸钠盐1-10ng/ml、大豆卵磷脂1-10ng/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1-5ng/ml、睾酮1-5ng/ml、孕酮1-5ng/ml、地塞米松0.2-0.3nM、肝素50-200μg/mL、乙醇胺20-50nM、还原型谷胱甘肽2.5-5ug/ml、亚硒酸钠15-30nM、柠檬酸铁2.5-5ng/mL、L-谷氨酰胺2-8mM、2-巯基乙醇100-300mM中的至少一种。

肝素是一种由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量从5至30kDa，其中硫酸根约占40％。肝素主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，在肺、心、肝、肌肉等组织中含量丰富，生理情况下血浆中含量甚微。无论在体内还是体外，肝素的抗凝作用都很强，故临床把它作为抗凝剂广泛使用。

L-谷氨酰胺在细胞培养时起到很重要的作用。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢；在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。L-谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20℃冰冻保存，用前加入培养基中。

2-巯基乙醇(又称为β-巯基乙醇)是一种有机化合物，其化学式为HOCH₂CH₂SH，它兼具乙二醇(HOCH₂CH₂OH)和乙二硫醇(HSCH₂CH₂SH)的官能团，通常用于二硫键的还原，保护二硫键，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。

白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)具有调节细胞的增殖、分化和表型的作用；丙酮酸钠(分子式CH₃COCOONa，分子量110.04g/mol)可以作为细胞培养中的替代碳源。

乙醇胺能够促进细胞膜的构建。

进一步的方案，所述的添加成分及含量终浓度包括：力生长因子20ng/ml、低氧诱导因子-1 10ng/ml、层粘连蛋白LN521 2.5ug/mL、CDLC 2％、bFGF 20ng/ml、EGF 30ng/ml、VEGF20ng/ml、HGF 20ng/ml、PDGF 20ng/ml、转铁蛋白0.2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素5U/ml、白血病抑制因子500U/mL、胆碱二柠檬酸盐20nM、磷脂酰胆碱1ng/ml、磷脂酸钠盐1ng/ml、大豆卵磷脂1ng/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1ng/mL、睾酮2ng/mL、孕酮2ng/mL、促肾上腺皮质激素0.5ug/ml、地塞米松0.2nM、肝素50μg/mL、乙醇胺20nM、还原型谷胱甘肽5ug/ml、亚硒酸钠15nM、柠檬酸铁2.5ng/mL、L-谷氨酰胺5mM、2-巯基乙醇100mM。

进一步的方案，所述的添加成分及含量终浓度包括：力生长因子20ng/ml、低氧诱导因子-1 10ng/ml、层粘连蛋白LN521 2.5ug/mL、CDLC 2％、bFGF 20ng/ml、EGF 30ng/ml、VEGF20ng/ml、HGF 20ng/ml、PDGF 20ng/ml、转铁蛋白0.2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素5U/ml、白血病抑制因子500U/mL、胆碱二柠檬酸盐20nM、磷脂酰胆碱1ng/ml、磷脂酸钠盐1ng/ml、大豆卵磷脂1ng/ml、维生素B2 50ug/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1ng/mL、睾酮2ng/mL、孕酮2ng/mL、促肾上腺皮质激素0.5ug/ml、地塞米松0.2nM、肝素50μg/mL、乙醇胺20nM、还原型谷胱甘肽5ug/ml、亚硒酸钠15nM、柠檬酸铁2.5ng/mL、L-谷氨酰胺5mM、2-巯基乙醇100mM、螺旋藻多糖15ug/ml。

进一步的方案，所述的基础培养基选自L-DMEM培养基、DMEM-F12培养基和IMDM培养基中的至少一种。

本发明的第二目的提供一种培养间充质干细胞的培养方法，培养方法为：将所述的间充质干细胞在氧体积分数为4-7％的低氧条件下进行培养，和/或利用如上所述的无血清培养基培养间充质干细胞。

低氧条件培养能提高间充质干细胞的增殖能力，迁移能力及黏附能力，并降低细胞凋亡率。其原因为低氧更符合细胞生理环境，主要通过减少氧自由基的产生；低氧环境能促进HIF-1的表达，并且能维持HIF-1活性稳定，HIF-1能诱导相关生长因子的表达，从而能显著性促进对间充质干细胞的增殖。

本发明的第三目的在于提供一种培养间充质干细胞的培养系统，具体为：将间充质干细胞置于如上所述的无血清培养基中，并在氧体积分数为5％的低氧条件下进行培养。

进一步的方案，培养间充质干细胞时培养箱内的条件为：含有4-7％O₂，5％CO₂；

优选的，培养条件为：含有5％O₂，5％CO₂，温度为37℃，湿度饱和。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明的间充质干细胞无血清培养基，完全去除了动物血清和人血清，克服了含血清的培养基有细胞毒性、易污染的缺陷；同时，本发明的无血清培养机成分确定，质量可控，同时能够提高间充质干细胞的生长速度，提高了扩增效率，可用于组织贴壁分离间充质干细胞，可使间充质干细胞生长正常；多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。

2、本发明的培养方法将间充质干细胞在低氧条件下进行培养，能够促进间充质干细胞贴壁和增殖，提高了生产速率。

3、利用本发明的无血清培养基，并在低氧培养条件下培养间充质干细胞时，两者对间充质干细胞的生长起到了协同促进作用，显著提高了间充质干细胞的生长速度，提高了扩增效率，多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是脐带组织分离的脐带间充质干细胞至第0代第10天的生长状况；

图2是脐带间充质干细胞传代培养至第3代第三天的生长状况；

图3是脐带间充质干细胞表面免疫标记物的流式细胞鉴定图；

其中，3A-3D为脐带间充质干细胞表面带有阳性免疫标记物的鉴定图，3E和3F为带有阴性免疫标记物的鉴定图，具体的，各标记物分别为：3A、CD90；3B、CD73；3C、CD105；3D、CD44；3E、CD45；3F、HLA-DR；

图4是间充质干细胞被诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的形态图；

其中，4A是分化成软骨细胞的形态图，阿尔新兰染色；4B是分化成脂肪细胞的形态图，油红O染色；4C是分化成成骨细胞的形态图，茜素红染色；

图5是不同培养基和培养条件下的脐带间充质干细胞生长曲线图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中所用的力生长因子、低氧诱导因子-1购自近岸生物公司；层粘连蛋白LN521购自BioLamina公司；Chemically Defined Lipid Concentrate、bFGF、白血病抑制因子购自Gibco公司；HGF、转铁蛋白、胰蛋白酶、抑肽酶、胰岛素、胆碱二柠檬酸盐、磷脂酰胆碱、磷脂酸钠盐、大豆卵磷脂、维生素C、维生素E、维生素B12、雌二醇、睾酮、孕酮、地塞米松、乙醇胺、谷胱甘肽(还原型)、亚硒酸钠、柠檬酸铁、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇购自Sigma公司；EGF、VEGF、PDGF购自PeproTech公司；促肾上腺皮质激素购自源叶生物公司；肝素购自天道医药公司；所用的基础培养基L-DMEM、DMEM-F12或IMDM购自Gibco公司。

实施例1

本实施例的间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加成分，基础培养基为L-DMEM、DMEM-F12或IMDM中的一种。添加成分及其含量范围如下：力生长因子20-50ng/ml、低氧诱导因子-1 10-20ng/ml、层粘连蛋白LN521 1-4ug/mL、Chemically DefinedLipid Concentrate 1-5％、bFGF 20-40ng/ml、EGF 20-30ng/ml，VEGF 20-40ng/ml、HGF20-40ng/ml、PDGF 10-20ng/ml、转铁蛋白0.2-2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素1-10U/ml、白血病抑制因子500-2000U/mL、胆碱二柠檬酸盐20-30nM、磷脂酰胆碱1-10ng/ml、磷脂酸钠盐1-10ng/ml、大豆卵磷脂1-10ng/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1-5ng/ml、睾酮1-5ng/ml、孕酮1-5ng/ml、促肾上腺皮质激素0.5-1ug/ml、地塞米松0.2-0.3nM、肝素50-200μg/mL、乙醇胺20-50nM、谷胱甘肽(还原型)2.5-5ug/ml、亚硒酸钠15-30nM、柠檬酸铁2.5-5ng/mL、L-谷氨酰胺2-8mM、2-巯基乙醇100-300mM。

实施例2

本实施例提供培养基一种间充质干细胞无血清培养基，在L-DMEM(或DMEM-12/IMDM)培养基中添加下述添加成份，并使其终浓度为下述浓度，由此得到间充质干细胞无血清培养基：

力生长因子20ng/ml、低氧诱导因子-1 10ng/ml、层粘连蛋白LN521 2.5ug/mL、CDLC 2％、bFGF 20ng/ml、EGF 30ng/ml、VEGF 20ng/ml、HGF 20ng/ml、PDGF 20ng/ml、转铁蛋白0.2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素5U/ml、白血病抑制因子500U/mL、胆碱二柠檬酸盐20nM、磷脂酰胆碱1ng/ml、磷脂酸钠盐1ng/ml、大豆卵磷脂1ng/ml、维生素C50ug/ml、维生素E 30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1ng/mL、睾酮2ng/mL、孕酮2ng/mL、促肾上腺皮质激素0.5ug/ml、地塞米松0.2nM、肝素50μg/mL、乙醇胺20nM、还原型谷胱甘肽5ug/ml、亚硒酸钠15nM、柠檬酸铁2.5ng/mL、L-谷氨酰胺5mM、2-巯基乙醇100mM。

实施例3

本实施例提供培养基一种间充质干细胞无血清培养基，本实施例与实施例1的区别为：添加成分还包括维生素B2 50ug/ml；

另外一种方案，添加成分还包括螺旋藻多糖15ug/ml；

更优选的方案，添加成分还包括维生素B2 50ug/ml和螺旋藻多糖15ug/ml。

实施例4

本实施例提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，本实施例中采用的间充质干细胞无血清培养基为实施例2中的培养基，培养方法具体包括：

一、脐带间充质干细胞分离培养

(1)脐带间充质干细胞分离

将脐带从手术台上取下，无菌条件下浸入DMEM/F12培养液中，4℃保存,超净台内取出脐带,用含有双抗PBS冲洗,纵向剖开脐带，露出血管，将血管从周围组织分离出来，将脐带组织中的华通氏胶分离出来，PBS漂洗三次，剪碎至1mm³左右大小组织块，组织块均匀接种于25T的塑料培养瓶中滴加1ml制备的间充质干细胞无血清培养基，放置于5％O₂、37℃、5％的CO₂饱和湿度的孵箱内培养内。24小时后再缓慢加入2ml间充质干细胞无血清培养基；10天后，去掉组织块并更换无血清培养基，以后每隔3天换培养基1次.

(2)脐带间充质干细胞传代培养

MSC细胞长到90％汇合时，吸出培养基，用PBS清洗，加入适量0.25％胰蛋白酶消化2-5min，弃胰蛋白酶加入基础培养基，将细胞吹散，收集到15ml离心管内。1000转/分离心5分钟离，弃上清，加入1ml间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度，接种至细胞培养皿或培养瓶中，接种密度为5x10⁴/cm²，在5％O₂、37℃、CO₂培养箱静置培养。

图1是脐带组织分离脐带间充质干细胞至第0代第10天的生长状况，图2是脐带间充质干细胞传代培养至第3代第三天的生长状况。

二、脐带间充质干细胞的冷冻保存和复苏

1，细胞冷冻保存：取培养至第三代的脐带间充质干细胞(汇合90～100％)，去掉培养基，PBS清洗两次，加入0.25％胰酶-EDTA消化，每瓶T25用1-2毫升，37℃，2-3分钟，在显微镜下观察，待细胞变亮后去掉胰酶，加入3ml基础培养基，将细胞从培养瓶壁上吹下来，收集到15ml离心管内。1000转/分离心5分钟，离心后弃上清液，加入冻存液吹打重悬，细胞密度1.2～2×10⁶/mL，分装到2mL冻存管中，使用程序降温仪缓慢降温冻存，然后转移到液氮罐中长期保存备用。所述细胞冻存液组成：10％的DMSO+90％的完全培养基。

2，细胞复苏：将冻存管中细胞从液氮中取出，在37℃水浴中迅速解冻，再转移至装有5mL预冷完全培养基的离心管中，在1000转/分离心5分钟，弃上清，再用PBS洗一遍，1ml无血清培养基重悬，细胞计数，按5x10⁴/cm²接种到新T25培养瓶中，置于5％O₂、37℃、饱和湿度5％CO₂培养箱中培养。

三、脐带间充质干细胞的鉴定

1、鉴定方法

细胞鉴定：细胞表面免疫标记物鉴定

细胞培养到到第二代至第六代细胞时，用显微镜鉴定细胞形态，流式抗体鉴定细胞表面的免疫标记物，脐带间充质干细胞的标记物包括：阳性标记物有CD44，CD73，CD90和CD105，阴性标记物有CD45，HLA-DR。图3为脐带间充质干细胞流式鉴定图

功能鉴定：成脂、成骨和成软骨分化

成脂、成骨和成软骨分化：4×10⁴细胞/孔接种于6孔板内，细胞贴壁后培养24小时后，弃培养液。分别按下述方式进行诱导分化：

加入成脂分化诱导培养基继续培养。每3天换培养基1次，诱导21天。弃掉培养液，PBS洗1次，4％多聚甲醛甲醛固定15分钟。PBS再洗3次。加入0.2％油红O染液，37℃染色30分钟。吸出染液，PBS洗3次。显微镜下观察并照相。

加入成骨分化诱导培养基继续培养。每3天换培养基1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定20min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，加入2％茜素红(pH4.2，使用前过滤)室温染色30min。弃茜素红，PBS清洗至上清无颜色或浅色，最后加入PBS，显微镜下观察并拍照。

加入成软骨分化诱导培养基继续培养。每3天换液1次，共诱导21天。弃上清，PBS清洗1遍，4％多聚甲醛室温固定20min。弃多聚甲醛，PBS清洗2遍，加入1％阿尔新蓝室温20min。弃亚甲基蓝，加入3％醋酸漂洗2min,再使用PBS冲洗3次，显微镜下观察并拍照。

2、鉴定结果

1)形态学鉴定

显微镜下可观察到细胞贴壁生长，形态为典型的短梭形(见图1和图2)，符合间充质干细胞的细胞形态。

2)免疫标记物鉴定

流式抗体鉴定阳性标记纯度达到95％以上，阴性标记纯度在2％以下(见图3)，符合间充质干细胞表面标记。

3)分化能力鉴定

本发明所获得的间充质干细胞可以诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞(见图4)。说明间充质干细胞在多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。

四、细胞生长曲线测定比较

1，测定方法

取第三代脐带间充质干细胞，接种于96孔板，接种密度为1x10⁴/孔，每个测定样本做6个复孔，共接种8个96孔板，设定4个对照条件：1，干细胞在10％FBS和正常含氧量条件下培养(FBS)；2，干细胞在10％FBS和5％氧条件下培养(FBS+5％O₂)；3，干细胞在本发明的培养基和正常含氧量条件下培养(培养基)；4，干细胞在本发明的培养基和5％氧条件下培养(培养基+5％O₂)。次日起每日定时取一块96孔板，加入10ulCCK-8培养1.5小时，设定酶标仪450nm，测出吸光值(OD值)，根据每个样本复孔的吸光值算出平均值。

2，生长曲线结果

待8块96孔板的OD值测完后，根据所得OD值绘制生长曲线，结果如图5所示。

从生长曲线中可以看出，利用含有10％的FBS的培养基培养间充质干细胞，在低氧条件下能够促进细胞的生长。而仅利用本发明实施例2中的无血清培养基培养间充质干细胞，在常氧条件下培养，细胞的生长速率与低氧条件下在10％FBS的培养基中的生长速率相近，在第8天时略高。而利用本发明实施例2中的无血清培养基培养间充质干细胞，并在5％的低氧条件下培养，细胞的生长速率显著高于其他试验组。综上说明，本发明的无血清培养基和5％的低氧条件对细胞的生长具有协同促进效应，能够显著提高细胞的生长速率。

另外，利用本发明实施例3中的培养基，并在5％的低氧条件下培养，其他培养步骤均相同的情况下，添加成分中分别添加维生素B2或螺旋藻多糖的培养基中，细胞的生长OD与图5中无血清培养基+低氧条件的生长曲线类似，且在第3天、第4天时细胞OD均提高了约0.2，第5天、第6天时细胞OD均提高了约0.3。而同时添加维生素B2和螺旋藻多糖的培养基，细胞的生长OD在第2天为0.25，第3天为0.34，第4天为0.43，第5天为0.58，第6天为0.66，第7天为0.68，第8天为0.68，因此，高于利用实施例1培养基的生长速率，说明维生素B2、螺旋藻多糖和低氧诱导因子-1在低氧条件下，进一步促进了细胞生长，提高了细胞的生长速率。维生素B2和螺旋藻多糖起到了协同作用，或者维生素B2、螺旋藻多糖和低氧诱导因子-1在低氧条件下起到了协同作用。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子-1，所述的低氧诱导因子-1的浓度为10-20ng/ml。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括力生长因子，所述的力生长因子的浓度为20-50ng/ml。

3.根据权利要求1或2所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括CDLC、PDGF和促肾上腺皮质激素，所述CDLC的体积分数为1-5％，PDGF的浓度为10-20ng/ml，促肾上腺皮质激素的浓度为0.5-1ug/ml。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括以下成分，各成分及含量终浓度为：

层粘连蛋白LN521 1-4ug/mL、bFGF 20-40ng/ml、EGF 20-30ng/ml，VEGF 20-40ng/ml、HGF 20-40ng/ml、白血病抑制因子500-2000U/mL中的至少一种。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括以下成分，各成分的含量终浓度为：

转铁蛋白0.2-2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素1-10U/ml、胆碱二柠檬酸盐20-30nM、磷脂酰胆碱1-10ng/ml、磷脂酸钠盐1-10ng/ml、大豆卵磷脂1-10ng/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1-5ng/ml、睾酮1-5ng/ml、孕酮1-5ng/ml、地塞米松0.2-0.3nM、肝素50-200μg/mL、乙醇胺20-50nM、还原型谷胱甘肽2.5-5ug/ml、亚硒酸钠15-30nM、柠檬酸铁2.5-5ng/mL、L-谷氨酰胺2-8mM、2-巯基乙醇100-300mM中的至少一种。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分及含量终浓度包括：力生长因子20ng/ml、低氧诱导因子-1 10ng/ml、层粘连蛋白LN521 2.5ug/mL、CDLC 2％、bFGF20ng/ml、EGF 30ng/ml、VEGF 20ng/ml、HGF 20ng/ml、PDGF 20ng/ml、转铁蛋白0.2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素5U/ml、白血病抑制因子500U/mL、胆碱二柠檬酸盐20nM、磷脂酰胆碱1ng/ml、磷脂酸钠盐1ng/ml、大豆卵磷脂1ng/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 30ug/ml、维生素B12 30ug/ml、雌二醇1ng/mL、睾酮2ng/mL、孕酮2ng/mL、促肾上腺皮质激素0.5ug/ml、地塞米松0.2nM、肝素50μg/mL、乙醇胺20nM、还原型谷胱甘肽5ug/ml、亚硒酸钠15nM、柠檬酸铁2.5ng/mL、L-谷氨酰胺5mM、2-巯基乙醇100mM。

7.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的基础培养基选自L-DMEM培养基、DMEM-F12培养基和IMDM培养基中的至少一种。

8.一种利用权利要求1-7中任意一项的无血清培养基培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述的间充质干细胞在氧体积分数为4-7％的低氧条件下进行培养。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述的间充质干细胞在氧体积分数为5％的低氧条件下进行培养。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，培养间充质干细胞时培养箱内的条件为：含有4-7％O₂，5％CO₂；

优选的，培养条件为：含有5％O₂，5％CO₂，温度为37℃，湿度饱和。