CN109943524A - 人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用，包括基础培养基和血清替代物；基础培养基选自L‑氨基酸及其衍生物、L‑抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D‑葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。实现了未含有动物源成分，步骤简单、原料易得，培养的细胞代次多、增殖能力强、状态好，提高多代次培养后的间充质干细胞纯度的效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养基材料领域，具体地，涉及人间充质干细胞培养基及其制备方法和应用。
背景技术
干细胞指的是能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。间充质干细胞(MSC)是一种多能干细胞，其起源于中胚层，而且来源广泛，可从多种组织如骨髓、脐带、脂肪组织等中分离得到。间充质干细胞具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在特定条件下不仅能够分化为中胚层的心肌细胞和软骨细胞，还能分化成外胚层的神经细胞等。
间充质干细胞不仅来源丰富，具有多种分化潜能，而且可以在体外长期保存，具有自我更新和无限增殖潜力，还具有影响免疫细胞的增殖分化的功能。间充质干细胞的这些特点为科学研究和医学应用提供了很好的细胞来源。目前临床上间充质干细胞对血液系统疾病(如白血病等)、神经系统疾病(如帕金森氏综合征等)、实质器官损伤或病变(如肝硬化等)、心血管系统疾病(如心肌梗塞等)、代谢性疾病(如糖尿病及其并发症等)、骨关节疾病(如骨关节炎，股骨头坏死)等多种疾病都有不错的应用空间。其所具有的免疫调节特性，使它在免疫性疾病的治疗中也有非常广泛的用途和研究价值。同时间充质干细胞其能稳定表达转染到细胞内的目的基因，因此在基因治疗中也应用广泛，是一种新型的基因治疗靶细胞。
另一方面，目前干细胞研究已完成了一系列安全性实验，包括毒性试验、遗传学试验、局部刺激试验、发热试验和免疫毒性试验等，结果表明，干细胞是安全、无毒的。成体干细胞经过多次传代后，没有出现变异现象，也就是说，不会有致瘤的可能。大量的临床资料也表明，干细胞治疗过程中除了极少数病人有短时、轻微的发热、头痛外，没有发现其它显著的副作用或不良反应。
然而，在培养过程中，普遍采用动物源培养基进行培养，从而使得其在培养过程中会引入大量动物源性物质，给其自我更新和分化过程带来了很多的不确定因素，造成分化过程中出现误差；同时，还可能在其培养过程中引入动物源性污染，导致间充质干细胞被污染等问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中对于间充质干细胞的培养往往含有动物源成分，虽然可以保证细胞具有优异的自我更新能力，但是由于培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；同时可能引入动物源性污染，如支原体污染等；另外，在细胞治疗的过程中还可能会诱发免疫反应等问题，从而提供一种未含有动物源成分，并且能够为培养间充质干细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时其制备方法步骤简单、原料易得，且培养的细胞代次多、增殖能力强、状态好，能够有效提高多代次培养后的间充质干细胞的纯度的细胞培养基及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种人间充质干细胞培养基，其中，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，
所述基础培养基选自L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；
所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。
本发明还提供了一种人间充质干细胞培养基的制备方法，其中，所述制备方法包括：
1)将基础培养基和血清替代物混合，制得混合物M1；
2)将混合物M1进行pH值的调节，制得混合物M2；
3)将混合物M2进行灭菌处理，制得人间充质干细胞培养基；其中，
所述基础培养基和所述血清替代物如上所述。
本发明还提供了一种人间充质干细胞培养基在培养间充质干细胞中的应用，其中，所述人间充质干细胞培养基如上所述或者如上述所述的制备方法制得。
通过上述技术方案，本发明以基础培养基和血清替代物进行混合，并将基础培养基和血清替代物各自限定为特定的原料，通过各原料之间的协同作用为间充质干细胞提供更为有效的营养和更为稳定的培养环境，使其能够具有更为优异的自我更新和分化能力。并且，本技术方案中没有使用动物源成分，有效规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是检测例中使用的脐带间充质干细胞的形态特征图；
图2是检测例中的脐带间充质干细胞的增值倍数图；
图3是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD14的流式检测结果；
图4是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD19的流式检测结果；
图5是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD34的流式检测结果；
图6是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD45的流式检测结果；
图7是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其HLA-DR的流式检测结果；
图8是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD73的流式检测结果；
图9是检测例中脐带间充质干细胞在P5代时其CD90的流式检测结果；
图10是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD14的流式检测结果；
图11是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD19的流式检测结果；
图12是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD34的流式检测结果；
图13是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD45的流式检测结果；
图14是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其HLA-DR的流式检测结果；
图15是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD73的流式检测结果；
图16是检测例中脐带间充质干细胞在P15代时其CD90的流式检测结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种人间充质干细胞培养基，其中，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，
所述基础培养基选自L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；
所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。
本发明以基础培养基和血清替代物进行混合，并将基础培养基和血清替代物各自限定为特定的原料，通过各原料之间的协同作用为间充质干细胞提供更为有效的营养和更为稳定的培养环境，使其能够具有更为优异的自我更新和分化能力。并且，本技术方案中没有使用动物源成分，有效规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。
上述L-氨基酸及其衍生物可以在宽的范围内选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，为了使得培养基相对于间充质干细胞的培养具有更稳定的培养环境，并能够对其提供更为充足的营养，所述L-氨基酸及其衍生物可以进一步选自L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水物、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的至少一种。
当然，这里的基础培养基和血清替代物之间的含量比可以在宽的范围内选择，在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的细胞培养基对间充质干细胞培养的稳定性，以所述细胞培养基的总量为基准，所述基础培养基的含量为90-98体积％，所述血清替代物的含量为2-10体积％。
基础培养基中各原料的含量可以由本领域技术人员根据实际进行选择，例如，一种更为优选的实施方式中，为了使得培养基环境更为稳定，且能够保证提供充足的营养，L-氨基酸及其衍生物的含量为20-200mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为1-5mg/L，叶酸的含量为2-5mg/L，磷酸二氢钠的含量为109-125mg/L，碳酸氢钠的含量为1-5g/L，D-葡萄糖的含量为500-1000mg/L，酚红的含量为10-15mg/L，丙酮酸钠的含量为5-30mg/L，人血白蛋白的含量为1-5g/L。
同样地，另一优选的实施方式中，总胆红素的含量为50-250μmol/L，胆固醇的含量为20-60mmol/L，高密度脂蛋白的含量为5-20mmol/L，低密度脂蛋白的含量为不大于40mmol/L，甘油三酯的含量为5-20mmol/L，总蛋白质的含量为500-800g/L，白蛋白的含量为400-550g/L，天冬氨酸氨基转移酶的含量为不大于400U/L，谷丙转氨酶的含量为不大于400U/L，碱性磷酸酶的含量为450-1350U/L，乳酸脱氢酶的含量为1000-2000U/L，葡萄糖的含量为30-80mmol/L，钾的含量为10-50mmol/L，钠的含量为1000-1500mmol/L，钙的含量为10-30mmol/L，无机磷的含量为10-30mmol/L，氯化物的含量为800-1200mmol/L，镁的含量为600-1200mmol/L，铁的含量为50-300μmol/L，肌酐的含量为400-1500μmol/L，血小板衍生因子的含量为25-50mg/L，乙型转化生长因子的含量为5-50mg/L，血管内皮生长因子的含量为100-250mg/L。
本发明还提供了一种人间充质干细胞培养基的制备方法，其中，所述制备方法包括：
1)将基础培养基和血清替代物混合，制得混合物M1；
2)将混合物M1进行pH值的调节，制得混合物M2；
3)将混合物M2进行灭菌处理，制得人间充质干细胞培养基；其中，
所述基础培养基和所述血清替代物如上所述。
进一步优选的实施方式中，为了进一步提高制得的细胞培养基对间充质干细胞培养的稳定性，所述基础培养基和所述血清替代物的用量的体积比为10-49:1。
步骤2)中调节pH的操作可以采用本领域技术人员能够理解的方式进行操作，例如，可以采用加入酸碱调节剂进行调节，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤2)中为加入碱调节pH值。
这里的碱可以选自本领域技术人员能够理解和使用的类型，例如，一种更为优选的实施方式中，所述碱选自氢氧化钠和/或氢氧化钾。
当然，调节后的pH值可以在宽的范围内选择，例如，一种优选的实施方式中，为了进一步保证培养环境的稳定性，混合物M2的pH值为7.3-8。
步骤3)中灭菌处理能够采用本领域技术人员所能够理解的方式进行操作，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤3)中灭菌处理选自射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌中的至少一种。
进一步优选的实施方式中，灭菌处理采用湿热灭菌。
更为优选的实施方式中，灭菌处理为通过具有0.1-0.3μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。
本发明还提供了一种人间充质干细胞培养基在培养间充质干细胞中的应用，其中，所述人间充质干细胞培养基如上所述或者如上述所述的制备方法制得。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。其中，L-氨基酸及其衍生物由L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水物、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸各自等重量份进行混合得到。
实施例1
1)将L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白混合，制得基础培养基；将总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子混合，制得血清替代物；将基础培养基和血清替代物按照体积比为19:1进行混合，制得混合物M1；其中，基础培养基和血清替代物的体积比为90:10，且混合物M1中，L-氨基酸及其衍生物的含量为20mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为1mg/L，叶酸的含量为2mg/L，磷酸二氢钠的含量为109mg/L，碳酸氢钠的含量为1g/L，D-葡萄糖的含量为500mg/L，酚红的含量为10mg/L，丙酮酸钠的含量为5mg/L，人血白蛋白的含量为1g/L，总胆红素的含量为50μmol/L，胆固醇的含量为20mmol/L，高密度脂蛋白的含量为5mmol/L，低密度脂蛋白的含量为1mmol/L，甘油三酯的含量为5mmol/L，总蛋白质的含量为500g/L，白蛋白的含量为400g/L，天冬氨酸氨基转移酶的含量为100U/L，谷丙转氨酶的含量为100U/L，碱性磷酸酶的含量为450U/L，乳酸脱氢酶的含量为1000U/L，葡萄糖的含量为30mmol/L，钾的含量为10mmol/L，钠的含量为1000mmol/L，钙的含量为10mmol/L，无机磷的含量为10mmol/L，氯化物的含量为800mmol/L，镁的含量为600mmol/L，铁的含量为50μmol/L，肌酐的含量为400μmol/L，血小板衍生因子的含量为25mg/L，乙型转化生长因子的含量为5mg/L，血管内皮生长因子的含量为100mg/L；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌，制得细胞培养基A1。
实施例2
1)将L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白混合，制得基础培养基；将总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子混合，制得血清替代物；将基础培养基和血清替代物混合，制得混合物M1；其中，基础培养基和血清替代物的体积比为98:2，且混合物M1中，L-氨基酸及其衍生物的含量为200mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为5mg/L，叶酸的含量为5mg/L，磷酸二氢钠的含量为125mg/L，碳酸氢钠的含量为5g/L，D-葡萄糖的含量为1000mg/L，酚红的含量为15mg/L，丙酮酸钠的含量为30mg/L，人血白蛋白的含量为5g/L，总胆红素的含量为250μmol/L，胆固醇的含量为60mmol/L，高密度脂蛋白的含量为20mmol/L，低密度脂蛋白的含量为40mmol/L，甘油三酯的含量为20mmol/L，总蛋白质的含量为800g/L，白蛋白的含量为550g/L，天冬氨酸氨基转移酶的含量为不大于400U/L，谷丙转氨酶的含量为不大于400U/L，碱性磷酸酶的含量为1350U/L，乳酸脱氢酶的含量为2000U/L，葡萄糖的含量为80mmol/L，钾的含量为50mmol/L，钠的含量为1500mmol/L，钙的含量为30mmol/L，无机磷的含量为30mmol/L，氯化物的含量为1200mmol/L，镁的含量为1200mmol/L，铁的含量为300μmol/L，肌酐的含量为1500μmol/L，血小板衍生因子的含量为50mg/L，乙型转化生长因子的含量为50mg/L，血管内皮生长因子的含量为250mg/L；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌，制得细胞培养基A2。
实施例3
1)将L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白混合，制得基础培养基；将总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子混合，制得血清替代物；将基础培养基和血清替代物混合，制得混合物M1；其中，基础培养基和血清替代物的体积比为95:5，且混合物M1中，L-氨基酸及其衍生物的含量为100mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为3mg/L，叶酸的含量为4mg/L，磷酸二氢钠的含量为115mg/L，碳酸氢钠的含量为3g/L，D-葡萄糖的含量为800mg/L，酚红的含量为12mg/L，丙酮酸钠的含量为15mg/L，人血白蛋白的含量为3g/L，总胆红素的含量为150μmol/L，胆固醇的含量为40mmol/L，高密度脂蛋白的含量为10mmol/L，低密度脂蛋白的含量为20mmol/L，甘油三酯的含量为10mmol/L，总蛋白质的含量为650g/L，白蛋白的含量为500g/L，天冬氨酸氨基转移酶的含量为200U/L，谷丙转氨酶的含量为200U/L，碱性磷酸酶的含量为900U/L，乳酸脱氢酶的含量为1500U/L，葡萄糖的含量为50mmol/L，钾的含量为30mmol/L，钠的含量为1200mmol/L，钙的含量为20mmol/L，无机磷的含量为20mmol/L，氯化物的含量为1000mmol/L，镁的含量为900mmol/L，铁的含量为150μmol/L，肌酐的含量为1000μmol/L，血小板衍生因子的含量为40mg/L，乙型转化生长因子的含量为30mg/L，血管内皮生长因子的含量为200mg/L；
2)将氢氧化钠加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4，制得混合物M2；
3)将上述混合物M2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌，制得细胞培养基A3。
实施例4
按照实施例1的方法进行制备，不同的是，L-氨基酸及其衍生物的含量为5mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为0.2mg/L，叶酸的含量为0.5mg/L，制得细胞培养基A4。
实施例5
按照实施例2的方法进行制备，不同的是，丙酮酸钠的含量为3mg/L，人血白蛋白的含量为0.5g/L，制得细胞培养基A5。
实施例6
按照实施例3的方法进行制备，不同的是，总胆红素的含量为30μmol/L，胆固醇的含量为10mmol/L，高密度脂蛋白的含量为3mmol/L，低密度脂蛋白的含量为10mmol/L，甘油三酯的含量为3mmol/L，制得细胞培养基A6。
实施例7
按照实施例3的方法进行制备，不同的是，天冬氨酸氨基转移酶的含量为100U/L，谷丙转氨酶的含量为100U/L，碱性磷酸酶的含量为300U/L，乳酸脱氢酶的含量为500U/L，制得细胞培养基A7。
对比例1
按照实施例1的方法进行制备，不同的是，不加入基础培养基，制得细胞培养基B1。
对比例2
按照实施例2的方法进行制备，不同的是，不加入血清替代物，制得细胞培养基B2。
对比例3
按照实施例3的方法进行制备，不同的是，不加入L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠，制得细胞培养基B3。
对比例4
按照实施例3的方法进行制备，不同的是，不加入总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶，制得细胞培养基B4。
检测例
将来源于脐带的间充质干细胞采用实施例1中制得的细胞培养基A1培养多代次(至少15代次)，其增值倍数图如图2所示，并对其P5代和P15代进行流式检测。对P5代的检测中，其中，CD14的检测结果如图3所示，CD19的检测结果如图4所示，CD34的检测结果如图5所示，CD45的检测结果如图6所示，HLA-DR的检测结果如图7所示，CD73的检测结果如图8所示，CD90的检测结果如图9所示，通过图3-图9可以看出，CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阳性率均小于2％；CD73、CD90阳性率均大于95％，纯度合乎要求。
对P15代的检测中，其中，CD14的检测结果如图10所示，CD19的检测结果如图11所示，CD34的检测结果如图12所示，CD45的检测结果如图13所示，HLA-DR的检测结果如图14所示，CD73的检测结果如图15所示，CD90的检测结果如图16所示，通过图10-图16可以看出，CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阳性率均小于2％；CD73、CD90阳性率均大于95％，纯度合乎要求。
通过上述可以看出，在本发明提供的细胞培养基中培养分化多代次后，间充质干细胞依然具有很高的纯度，未被污染。
同样地，通过检测例的方法采用培养基A2-A7进行培养，检测表明其也能稳定的培养间充质干细胞。
按照检测例的方法进行操作，不同的是，将细胞培养基分别替换为B1-B4，结果显示，细胞培养基B1-B4无法成功培养间充质干细胞。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种人间充质干细胞培养基，其特征在于，所述人间充质干细胞培养基包括基础培养基和血清替代物；且，
所述基础培养基选自L-氨基酸及其衍生物、L-抗坏血酸钠、叶酸、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、D-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠和人血白蛋白中的至少一种；
所述血清替代物选自总胆红素、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总蛋白质、白蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、钾、钠、钙、无机磷、氯化物、镁、铁、肌酐、血小板衍生因子、乙型转化生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述L-氨基酸及其衍生物选自L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水物、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，以所述细胞培养基的总量为基准，所述基础培养基的含量为90-98体积％，所述血清替代物的含量为2-10体积％。
4.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，L-氨基酸及其衍生物的含量为20-200mg/L，L-抗坏血酸钠的含量为1-5mg/L，叶酸的含量为2-5mg/L，磷酸二氢钠的含量为109-125mg/L，碳酸氢钠的含量为1-5g/L，D-葡萄糖的含量为500-1000mg/L，酚红的含量为10-15mg/L，丙酮酸钠的含量为5-30mg/L，人血白蛋白的含量为1-5g/L。
5.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，总胆红素的含量为50-250μmol/L，胆固醇的含量为20-60mmol/L，高密度脂蛋白的含量为5-20mmol/L，低密度脂蛋白的含量为不大于40mmol/L，甘油三酯的含量为5-20mmol/L，总蛋白质的含量为500-800g/L，白蛋白的含量为400-550g/L，天冬氨酸氨基转移酶的含量为不大于400U/L，谷丙转氨酶的含量为不大于400U/L，碱性磷酸酶的含量为450-1350U/L，乳酸脱氢酶的含量为1000-2000U/L，葡萄糖的含量为30-80mmol/L，钾的含量为10-50mmol/L，钠的含量为1000-1500mmol/L，钙的含量为10-30mmol/L，无机磷的含量为10-30mmol/L，氯化物的含量为800-1200mmol/L，镁的含量为600-1200mmol/L，铁的含量为50-300μmol/L，肌酐的含量为400-1500μmol/L，血小板衍生因子的含量为25-50mg/L，乙型转化生长因子的含量为5-50mg/L，血管内皮生长因子的含量为100-250mg/L。
6.一种人间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
1)将基础培养基和血清替代物混合，制得混合物M1；
2)将混合物M1进行pH值的调节，制得混合物M2；
3)将混合物M2进行灭菌处理，制得人间充质干细胞培养基；其中，所述基础培养基和所述血清替代物如权利要求1-5中任意一项所述。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述基础培养基和所述血清替代物的用量的体积比为10-49:1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其中，步骤2)中为加入碱调节pH值；
优选地，所述碱选自氢氧化钠和/或氢氧化钾；
更为优选地，混合物M2的pH值为7.3-8。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其中，步骤3)中灭菌处理选自射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌中的至少一种；
优选地，灭菌处理采用湿热灭菌；
更为优选地，灭菌处理为通过具有0.1-0.3μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。
10.一种人间充质干细胞培养基在培养间人充质干细胞中的应用，其特征在于，所述人间充质干细胞培养基如权利要求1-5中任意一项所述或者如权利要求6-9中任意一项所述的制备方法制得。
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