CN106754670A - 一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用。通过添加EGF、PDGF、bFGF、β‑TGF、BMP‑7及Wnt5a来替代血清中的细胞因子；添加亚油酸、亚麻酸、卵磷酸替代血清中的脂类物质；通过正交设计，对这些添加物进行复配，并获得良好的增殖效果。而且本发明成份明确，减少了批次间的差异；无潜在的外源性病毒和致病性因子的风险；减少了临床研究的不良反应。具有很好的应用前景。

Description

一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种新型间充质干细胞无血清培养基的配方及配制方法，以及在人脐带间充质干细胞的原代培养及大规模传代培养中的应用。

背景技术

随着再生医学的迅猛发展，干细胞的研究及其临床应用已是当今生命科学最前沿最热门的领域之一，它不但为人类战胜多种疾病带来希望，而且具有巨大的市场潜力。而与干细胞研究及临床应用息息相关的培养基则是不可或缺的重要一环。目前，干细胞的培养都添加了一定量的动物源性的血清，如新生牛血清或胎牛血清，来满足干细胞生长增殖的需要。但也存在许多问题：(1)血清是种非常复杂的混合物，成分多样，目前对其准确的成分、含量及其作用机制仍不清楚，有些可能对干细胞的生长产生抑制或毒害作用；(2)血清都是批量生产，各批次之间生物活性物质及因子等成份或含量不一致，导致实验结果或产品的重现性较差，使得干细胞生产标准化困难；(3)动物血清可能存在外源性病毒和致病性因子的风险，如支原体、病毒等，导致干细胞生产污染；(4)大规模干细胞培养中，血清价格昂贵，是构成生产成本的主要部分之一；(5)干细胞的临床应用中，残留的血清可能会引起患者的过敏反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种化学成分限定的间充质干细胞无血清培养基，这种无血清培养基是目前最安全的，最为理想的培养基。其优点如下：(1)成份明确，避免血清批次间的质量变动，提高干细胞研究及临床应用结果的可重复性；(2)避免血清对干细胞培养的毒性作用和血清源性污染；(3)降低了干细胞培养及临床应用的成本；(4)有利于干细胞体外培养的分化；(5)减少了干细胞临床应用可能引起的过敏反应，降低了风险。

本发明的间充质干细胞无血清培养基，是由9倍体积基础培养基与1倍体积的浓缩添加剂混合而成；

混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG培养基粉末10g/L；Purmorphamine 1-20μM；胰岛素1.0-20.0mg/L；转铁蛋白0.5-10.0mg/L；乙醇胺0.2-2.0mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸5-50μmol/L；2-巯基乙醇0.5-5.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺30-300mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20-200mg/L；亚硒酸钠1-10mg/L；丙酮酸钠20-200mg/L；硫酸亚铁0.5-5.0mg/L；氯化锌0.2-2.0mg/L；地塞米松0.5-5.0nmol/L；碳酸氢钠1000-3000mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸500-2000mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度(与基础培养基混合之前)：

人血清白蛋白10-50g/L；纤黏连蛋白2-20mg/L；α-抗胰蛋白酶1-20mg/L；亚油酸0.5-10mg/L；亚麻酸2-20mg/L；卵磷脂1-10mg/L；BMP-7 1-50μg/L；Wnt5a 50-200μg/L；EGF10-200μg/L；bFGF 20-200μg/L；PDGF 5-50μg/L；TGF-β1-50μg/L。

本发明所述的间充质干细胞无血清培养基优选混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG培养基粉末10g/L；Purmorphamine 1-5μM；胰岛素5.0-15.0mg/L；转铁蛋白0.5-2.0mg/L；乙醇胺0.2-1.0mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸5-20μmol/L；2-巯基乙醇0.5-1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺100-200mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20-100mg/L；亚硒酸钠1-5mg/L；丙酮酸钠100-200mg/L；硫酸亚铁0.5-1.0mg/L；氯化锌0.2-0.5mg/L；地塞米松0.5-1.0nmol/L；碳酸氢钠1500-2500mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸800-1500mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度优选(与基础培养基混合之前)：

人血清白蛋白15-25g/L；纤黏连蛋白5-15mg/L；α-抗胰蛋白酶1-10mg/L；亚油酸2.5-7.5mg/L；亚麻酸2-10mg/L；卵磷脂1-5mg/L；BMP-7 1-10μg/L；Wnt5a 100-150μg/L；EGF10-100μg/L；bFGF 50-150μg/L；PDGF 5-20μg/L；TGF-β1-10μg/L。

本发明所述的间充质干细胞无血清培养基进一步优选混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG培养基粉末10g/L；Purmorphamine 2.5μM；胰岛素10.0mg/L；转铁蛋白0.60mg/L；乙醇胺0.4mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸15μmol/L；2-巯基乙醇1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺150mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺50mg/L；亚硒酸钠2.5mg/L；丙酮酸钠150mg/L；硫酸亚铁0.8mg/L；氯化锌0.4mg/L；地塞米松1.0nmol/L；碳酸氢钠2000mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸1000mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度进一步优选(与基础培养基混合之前)：

人血清白蛋白20g/L；纤黏连蛋白10mg/L；α-抗胰蛋白酶5mg/L；亚油酸5mg/L；亚麻酸5mg/L；卵磷脂2mg/L；BMP-7 5μg/L；Wnt5a 125μg/L；EGF 50μg/L；bFGF 100μg/L；PDGF 10μg/L；TGF-β2μg/L。

本发明的另一个目的是提供上述培养基的配制方法：

本发明所述的间充质干细胞无血清培养基的配制方法，

1)基础培养基的配制方法如下：

取超纯水，先充分溶解DMEM-LG培养基粉末，一边溶解一边搅拌，再依次加入Purmorphamine、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、丙酮酸钠、硫酸亚铁、氯化锌、地塞米松、碳酸氢钠及4-羟乙基哌嗪乙磺酸，充分溶解后，用浓盐酸调整pH值，用氯化钠调整渗透压，补加超纯水至900ml，过滤除菌，4℃保存；

2)浓缩添加剂配制方法如下：

取超纯水，放入37℃的水浴锅中，恒温搅拌，先加入人血清白蛋白，搅拌充分溶解；在37℃恒温的条件下，边搅拌边缓慢地滴入亚油酸，完全加入后再搅拌使充分溶解；按加入亚油酸的方法，依次加入亚麻酸及卵磷脂；最后37℃恒温的条件下，再依次加入细胞因子EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a，边加入边搅拌，使充分溶解，补加超纯水至100ml，过滤除菌，-20℃避光保存；

3)基础培养基与浓缩添加剂按照9：1的体积比混合。

本发明的间充质干细胞无血清培养基的配制方法更加具体的步骤如下：

1)基础培养基的配制方法如下：

取800ml超纯水，先充分溶解DMEM-LG培养基粉末，一边溶解一边搅拌，搅拌子转速50-200rpm；再依次加入Purmorphamine、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、丙酮酸钠、硫酸亚铁、氯化锌、地塞米松、碳酸氢钠及4-羟乙基哌嗪乙磺酸，充分溶解后，用浓盐酸调整pH6.8-7.2，用氯化钠调整渗透压为260-335mOsm/kg，补加超纯水至900ml，0.22μm过滤除菌，4℃保存；

2)浓缩添加剂配制方法如下：

取90ml超纯水，放入37℃的水浴锅中，恒温搅拌，转速50-100rpm，先加入人血清白蛋白，搅拌时间15min，使充分溶解；在37℃恒温的条件下，边搅拌边缓慢地滴入亚油酸，完全加入后再搅拌10min，使充分溶解；按加入亚油酸的方法，依次加入亚麻酸及卵磷脂；最后37℃恒温的条件下，再依次加入细胞因子EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a，边加入边搅拌，使充分溶解，补加超纯水至100ml，0.22μm过滤除菌,-20℃避光保存；

3)基础培养基与浓缩添加剂按照9：1的体积比混合。

本发明的第三个目的是提供上述培养基在培养间充质干细胞上的应用。

干细胞培养基是人工模拟干细胞在体内的生长环境，为干细胞体外的生长增殖提供的营养环境。通常，干细胞的生长均有赖于血清的存在，如胎牛血清或新生牛血清，在不添加血清的培养基中，绝大部分细胞(包括干细胞)均不能生长增殖或分化。研究发现，血清能够提供许多细胞(包括干细胞)生长必须的营养物质，如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等；还提供激素和各种生长因子，如胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等；还提供携带各种重要的低分子量物质的结合蛋白，如白蛋白携带维生素、脂肪以及激素等，转铁蛋白携带铁等；还提供一些促进细胞接触及伸展的因子，使细胞免受机械损伤，对培养中的细胞起保护作用。

但血清也是一种非常复杂的混合物，成分可能多达几百种。目前对其准确的成分、含量及其作用机制仍不清楚。血清各批次之间的质量差别较大，受生产商原料来源地的影响较大，要保证每批的一致性很困难，不利于实验室研究或产品生产的标准化。血清中可能含有一些未知的或未检测出的支原体、病毒等有害微生物，对细胞产生潜在的影响。血清中存在的一些抗体、补体及细菌毒素等物质，也会对细胞的生长产生不利影响，甚至造成细胞死亡。

无血清细胞培养基的发明是培养基的发展历程上的一个里程碑。它完全采用人工合成的化合物，成分确定，可以排除有血清培养基中许多未知因素的干扰，减少由血清带来的污染机会，减少过敏源。培养基中确定的成份更有利于某一类型的细胞生长或繁殖，使实验结果更为可靠，有利于标准化及连续化生产。

本发明使用的Purmorphamine是一种小分子化合物，属于Hedgehog激动剂，分子式为C₃₁H₃₂N₆O₂，CAS号为：483367-10-8。本发明发现在无血清培养体系中加入适当浓度Purmorphamine，能显著增加间充质干细胞的增殖能力。添加EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a来替代血清中的细胞因子；添加亚油酸、亚麻酸、卵磷酸替代血清中的脂类物质；通过这些添加物的复配或者正交试验获得良好的增殖效果。

此外，添加人血清白蛋白、转铁蛋白来替代血清中的结合类蛋白物质；添加胰岛素、乙醇胺、地塞米松来替代血清中的激素类物质；添加氯化锌、硫酸亚铁及亚硒酸钠来替代血清中的金属离子及微量元素；添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、丙酮酸来替代血清中的能量物质，添加L-抗坏血酸-2-磷酸、2-巯基乙醇来替代血清中还原类物质，添加4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠来替代血清中缓冲系统，维持细胞(干细胞)生存环境的pH。

本发明培养基配方的获得经过了大量探索，以下仅仅是部分实验。

使用本发明中的无血清间充质干细胞培养基，配制Purmorphamine母液，浓度为80μM。收集对数期脐带间充质干细胞，2×10³个/孔接种于96孔细胞培养板。通过一系列的倍比稀释，使Purmorphamine最终的处理浓度为别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.312μM、0.156μM、0.078μM，以不加Purmorphamine的为对照，培养72小时后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，继续培养4h。吸弃培养孔内培养基，加DMSO 100μl/孔，置摇床上低速振荡10-15min，使结晶物充分溶解。在酶标仪下测定OD450nm的吸光值。以处理组的吸光值除以对照组的吸光值，计算细胞的活力。结果见图1。实验结果表明，小分子化合物Purmorphamine能显著提高MSCs的活性及增殖能力。当浓度为2.5μM时，细胞存活率提高40％左右；当浓度低于2.5μM时，细胞存活率随着浓度的提高而增加；当浓度大于2.5μM时，细胞存活率随着浓度的增加，几乎无变化。

进一步的实验发现，当Purmorphamine与BMP-7骨形态发生蛋白的联合使用，使MSCs存活率优于Purmorphamine或BMP-7的单独使用。实验分为四组：

第一组：本发明中的无血清培养基，做为对照组；

第二组：本发明中的无血清培养基，添加2.5μM的Purmorphamine；

第三组：本发明中的无血清培养基，添加0.50μg/L的BMP-7骨形态发生蛋白。

第四组：本发明中的无血清培养基，添加2.5μM的Purmorphamine及0.50μg/L的BMP-7骨形态发生蛋白。

结果见图2，实验结果表明，第二组单独添加2.5μM的Purmorphamine，24h小时细胞存活率提高10％，48h小时细胞存活率提高25％，72h小时细胞存活率提高39％；第三组单独添加0.50μg/L的BMP-7骨形态发生蛋白，24h小时细胞存活率提高2％，48h小时细胞存活率提高3％，72h小时细胞存活率提高8％；第四组同时添加上述两种物质，24h小时细胞存活率提高14％，48h小时细胞存活率提高35％，72h小时细胞存活率提高66％。结论，Purmorphamine与BMP-7的同时使用，产生协同作用，效果更好。

Wnt蛋白是一组长度为350-400个氨基酸之信号转导蛋白，可通过激活或抑制特异的细胞信号通路来维持MSCs增殖及存活而不诱导分化；在胚胎发育、细胞增殖调控中发挥重要作用。在间充质干细胞无血清培养体系中，加入Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b均能促进细胞的增殖与存活，其中优选Wnt5a。

使用本发明中的无血清间充质干细胞培养基，分别加入Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b三种蛋白，比较三种蛋白对细胞增殖及活力的影响。收集P1代对数期脐带间充质干细胞，2×10³个/孔接种于96孔细胞培养板，每种蛋白系列作用浓度如下：100μg/L、50μg/L、25μg/L、12.5μg/L、6.25μg/L、3.13μg/L、1.56μg/L、0.78μg/L、0.39μg/L、0μg/L(对照)。培养72h，加5mg/ml MTT 10μl/孔，继续培养4h。吸弃培养孔内培养基，加DMSO 100μl/孔，置摇床上低速振荡10-15min，使结晶物充分溶解。在酶标仪下测定OD450nm的吸光值。以处理组的吸光值除以对照组的吸光值，计算细胞的活力。结果见图3。实验结果表明，Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b三种蛋白均为显著的提高细胞的存活率，其中，以Wnt5a蛋白为最优。从数据来看，Wnt5a蛋白使用浓度为12.5μg/L时，细胞的存活率最大，活性比对照提高50％左右；其次为Wnt3a蛋白，使用浓度为25μg/L时，细胞存活率达到最高，活性比对照提高40％左右；Wnt10b使用浓度为12.5μg/L时，细胞存活率达到最大，活性比对照提高20％左右。

本发明细胞因子复配方法及效果：(采用正交设计)

使用本发明中的无血清间充质干细胞培养基，调整细胞悬液浓度为1×10⁴个/ml；200ul/孔，2×10³个/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱培养。每孔加入一定浓度的EGF、bFGF、PDGF、TGF-β及Wnt5a细胞因子。其中EGF采用1μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L四个剂量；bFGF采用0μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L四个剂量；PDGF采用0.2μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L四个剂量；TGF-β采用0.2μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L四个剂量；Wnt5a采用3.13μg/L、6.25μg/L、12.5μg/L、25μg/L四个剂量。采用L₁₆(4⁵)正交设计加样方案。培养72小时后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，继续培养4h。吸弃培养孔内培养基，加DMSO 100μl/孔，置摇床上低速振荡10-15min，使结晶物充分溶解。在酶标仪下测定OD450nm的吸光值，结果见表1。

表1细胞因子复合配方对MSCs存活率的影响

表1的实验数据表明，实验方案12(EGF 5μg/L，bFGF 10μg/L，PDGF 1μg/L，TGF-β0.2μg/L，Wnt5a 12.5μg/L)的吸光值最高，使用该复配方案MSCs的细胞活性最大，存活率最高。该配方的五种细胞因子中，以bFGF最为重要，然后依次为Wnt5a、EGF、TGF-β、PDGF。该配方中bFGF的最佳浓度为10μg/L，Wnt5a的最佳浓度为12.5μg/L，EGF的最佳浓度为5μg/L，TGF-β的最佳浓度为0.2μg/L，PDGF的最佳浓度为1μg/L。实验结果表明，bFGF、Wnt5a、EGF、TGF-β、PDGF的添加是本发明中无血清培养基的必要添加组分，有利于细胞的生长及增殖。其中Wnt5a、EGF、TGF-β、PDGF随着浓度的再进一步增加，没有明显的促进MSCs的活性及存活率。

本发明脂类复配方法及效果：(采用正交设计)

使用本发明中的无血清间充质干细胞培养基，调整细胞悬液浓度为1×10⁴个/ml；200ul/孔，2×10³个/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱培养。每孔加入一定浓度的油酸、亚油酸、亚麻酸及卵磷脂。其中油酸采用0mg/L、0.5mg/L、1mg/L三个剂量，亚油酸采用0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L三个剂量，亚麻酸采用0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L三个剂量，卵磷脂采用0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L三个剂量；采用L₉(3⁴)正交设计加样方案。培养72小时后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，继续培养4h。吸弃培养孔内培养基，加DMSO 100μl/孔，置摇床上低速振荡10-15min，使结晶物充分溶解。在酶标仪下测定OD450nm的吸光值。结果见表2。

表2脂类复合配方对MSCs存活率的影响

表2的实验数据表明，实验方案2(油酸0mg/L，亚油酸0.5mg/L、亚麻酸0.5mg/L，卵磷脂0.2mg/L)的吸光值最高，使用该复配方案MSCs的细胞活性最大，存活率最高。四种脂肪酸中，以卵磷脂最为重要，其次为亚油酸，再次为亚麻酸，最后为油酸。卵磷脂的最佳浓度为0.2mg/L，亚油酸的最佳浓度为0.5mg/L，亚麻酸的最佳浓度为0.5mg/L，油酸作用不明显，添加与否不影响细胞的存活率。亚油酸及亚麻酸为人体细胞必须的脂肪酸，人体维持机体正常代谢不可缺少而自身又不能合成。实验结果表明，亚油酸、亚麻酸及卵磷脂的添加是本发明中无血清培养基的必要添加组分，有利于细胞的生长及增殖，但三种脂肪酸随着浓度的再进一步增加，没有明显的促进MSCs的活性及存活率。

本发明优点：

1.成份明确，减少了批次间的差异；

2.无潜在的外源性病毒和致病性因子的风险；

3.减少了临床研究的不良反应；

4.增殖效果好。

附图说明

图1为本发明小分子化合物Purmorphamine对MSCs活性影响；

图2为本发明Purmorphamine与BMP-7对MSCs活性的影响；

图3为Wnt蛋白对MSCs活性的影响；

图4为实施例2中A培养基培养MSCs的贴壁图；

图5为实施例2中B培养基培养MSCs的贴壁图；

图6为实施例2中C培养基培养MSCs的贴壁图；

图7为实施例4中A、B、C三种培养基对MSCs细胞增殖的影响。

具体的实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：本发明的优选方案如下：

基础培养基与浓缩添加剂混合后基础培养基中各组分的终浓度：

DMEM-LG培养基粉末 10g/L；Purmorphamine 2.5μM；胰岛素10.0mg/L；转铁蛋白0.60mg/L；乙醇胺 0.4mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸 15μmol/L；2-巯基乙醇 1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺 150mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 50mg/L；亚硒酸钠 2.5mg/L；丙酮酸钠150mg/L；硫酸亚铁 0.8mg/L；氯化锌 0.4mg/L；地塞米松 1.0nmol/L；碳酸氢钠 2000mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸 1000mg/L；

混合之前配制的浓缩添加剂组分及浓度：

人血清白蛋白 20g/L；纤黏连蛋白 10mg/L；α-抗胰蛋白酶 5mg/L；亚油酸 5mg/L；亚麻酸 5mg/L；卵磷脂 2mg/L；BMP-7 5μg/L；Wnt5a 125μg/L；EGF 50μg/L；bFGF 100μg/L；PDGF 10μg/L；TGF-β2μg/L。

实施例2：实验分三组，分别为三种培养基，具体如下：

A培养基：本发明中的间充质干细胞无血清培养基，由基础培养基与浓缩添加剂组成按9:1的体积比混合而成；

B培养基：商业化的无血清培养基，Life technologies公司的StemPro MSC SFMCTS人间充质干细胞无血清培养基；

C培养基：商业化的有血清培养基，MEM+10％胎牛血清。

本实施例中比较三种培养基对人脐带间充质干细胞原代细胞的培养。取脐带组织，用75％酒精消毒后，无菌条件下去除动脉静脉血管及羊膜，撕取华通胶，充分剪碎至约1-3mm³大小，用移液管吸取华通胶块，平分至分别装有A培养基、B培养基、C培养基的三个75cm²的细胞培养瓶中，轻轻摇晃使华通胶分散在培养基中。细胞培养瓶放置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中，静止培养，从第4天起，每天观察一次是否出现脐带间充质干细胞贴壁的现象，比较贴壁出现时间的早晚。继续培养至第15天，收获原代脐带间充质干细胞并计数。

实验结果表明，使用本发明中A培养基，在第6天时即可出现贴壁的原代脐带间充质干细胞(见图4)，这与B培养基出现贴壁现象时的时间一致(见图5)，但均略晚于C培养基1天时间(见图6)。培养至第15天，使用A培养基收获的脐带间充质干细胞数量计数为170万个，使用B培养基的细胞计数为130万个，使用C培养基的细胞计数为116万个。A培养基的原代细胞数量比B培养基的多30.8％，比C培养基的多46.5％；B培养基的原代细胞数量比C培养基的多12.1％，结果见表3。结论：使用本发明中的无血清间充质干细胞A培养基培养原代脐带间充质干细胞(UCMSC)，其出现细胞贴壁的时间与市场上的B培养基一致，但都比C培养基稍晚1天；A培养基培养的原代细胞数量优于B培养基与C培养基，B培养基优于C培养基。A培养基更适于MSCs细胞的原代培养。

表3

实施例3：使用本发明中无血清A培养基与B培养基、C培养基分别培养原代脐带间充质干细胞检测其对细胞表型的影响。收获采用三种培养基培养的原代脐带间充质干细胞，用生理盐水洗涤2次，弃上清，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml。每个样本分别采用荧光抗体标记，标记的抗体有CD13、CD14、CD19、CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR，分别采用同型抗体作对照。每管中加入对应荧光抗体5μl，再每管加入100μl脐带间充质干细胞，用旋涡振荡器充分摇匀，4℃下避光孵育30min。每管加3ml生理盐水，洗涤，1200rpm离心5min弃上清；每管加2ml PBS，1500rpm离心5min，弃上清，加500μl PBS，旋涡震荡混匀，流式上机检测。细胞表型如下：

表4

流式检测结果表明，三种培养基培养的原代脐带间充质干细胞，均强烈表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC表面抗原，表型在95％以上，均不表达CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR表面抗原，表型均在2％以下，均满足脐带间充质干细胞的细胞表型。说明无血清A培养基培养的脐带间充质干细胞，在细胞表型方面，能够与C有血清培养基、商业化的B无血清达到同样的效果。

实施例4：本发明中A培养基与B培养基、C培养基对人脐带间充质干细胞增殖的影响。取原代脐带间充质干细胞，分别采用A培养基、B培养基、C培养基进行传代培养。调整细胞密度为2×10⁴个/ml，接种75cm²细胞培养瓶，每瓶接种20ml，放置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。当细胞生长融合度达到90％时，按1:3的比例进行传代，每传代一次细胞代次增加一代，传至第5代为止，观察细胞的形态；比较三种培养基，细胞相对于原代细胞的增殖倍数。

实验结果见图7，表明脐带间充质干细胞传代至第5代时，细胞形态呈明显的纤维状，呈螺旋样，增殖能力强。使用本发明中A培养基脐带间充质干细胞至P5代时，累计增殖325倍；B培养基细胞至P5代累计增殖240倍；C培养基细胞至P5代累计增殖225倍。P3代以前代次(含P3代)，A培养基的细胞增殖倍数略低于C培养基，从P4代起，使用A培养基的脐带间充质干细胞增殖速度明显快于C培养基，也快于B培养基。A培养基能满足人脐带间充质干细胞的传代需求，显著促进其增殖。使用C培养基的后面代次细胞增殖慢于A培养基甚至B培养基，可能因为血清含有的一些有害因子的抑制作用导致。

Claims (6)

1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，是由9倍体积基础培养基与1倍体积的浓缩添加剂混合而成；

混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG 培养基粉末 10g/L；Purmorphamine 1-20μM；胰岛素 1.0-20.0mg/L；转铁蛋白 0.5-10.0mg/L；乙醇胺 0.2-2.0mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸 5-50μmol/L；2-巯基乙醇0.5-5.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺 30-300mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 20-200mg/L；亚硒酸钠 1-10mg/L；丙酮酸钠 20-200mg/L；硫酸亚铁 0.5-5.0mg/L；氯化锌 0.2-2.0mg/L；地塞米松 0.5-5.0nmol/L；碳酸氢钠 1000-3000mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸 500-2000mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度：

人血清白蛋白 10-50g/L；纤黏连蛋白 2-20mg/L；α-抗胰蛋白酶 1-20mg/L；亚油酸0.5-10mg/L；亚麻酸 2-20mg/L；卵磷脂 1-10mg/L；BMP-7 1-50μg/L；Wnt5a 50-200μg/L；EGF 10-200μg/L；bFGF 20-200μg/L；PDGF 5-50μg/L；TGF-β 1-50μg/L。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，是由9倍体积基础培养基与1倍体积的浓缩添加剂混合而成；

混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG 培养基粉末 10g/L；Purmorphamine 1-5μM；胰岛素 5.0-15.0mg/L；转铁蛋白0.5-2.0mg/L；乙醇胺 0.2-1.0mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸 5-20μmol/L；2-巯基乙醇 0.5-1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺 100-200mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 20-100mg/L；亚硒酸钠1-5mg/L；丙酮酸钠 100-200mg/L；硫酸亚铁 0.5-1.0mg/L；氯化锌 0.2-0.5mg/L；地塞米松0.5-1.0nmol/L；碳酸氢钠 1500-2500mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸 800-1500mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度：

人血清白蛋白 15-25g/L；纤黏连蛋白 5-15mg/L；α-抗胰蛋白酶 1-10mg/L；亚油酸2.5-7.5mg/L；亚麻酸 2-10mg/L；卵磷脂 1-5mg/L；BMP-7 1-10μg/L；Wnt5a 100-150μg/L；EGF 10-100μg/L；bFGF 50-150μg/L；PDGF 5-20μg/L；TGF-β 1-10μg/L。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，是由9倍体积基础培养基与1倍体积的浓缩添加剂混合而成；

混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG 培养基粉末 10g/L；Purmorphamine 2.5μM；胰岛素 10.0mg/L；转铁蛋白0.60mg/L；乙醇胺 0.4mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸 15μmol/L；2-巯基乙醇 1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺 150mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 50mg/L；亚硒酸钠 2.5mg/L；丙酮酸钠150mg/L；硫酸亚铁 0.8mg/L；氯化锌 0.4mg/L；地塞米松 1.0nmol/L；碳酸氢钠 2000mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸 1000mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度：

人血清白蛋白 20g/L；纤黏连蛋白 10mg/L；α-抗胰蛋白酶 5mg/L；亚油酸 5mg/L；亚麻酸 5mg/L；卵磷脂 2mg/L；BMP-7 5μg/L；Wnt5a 125μg/L；EGF 50μg/L；bFGF 100μg/L；PDGF10μg/L；TGF-β 2μg/L。

4.权利要求1或2或3所述的间充质干细胞无血清培养基的配制方法，其特征在于，

1)基础培养基的配制方法如下：

取超纯水，先充分溶解DMEM-LG培养基粉末，一边溶解一边搅拌，再依次加入Purmorphamine、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、丙酮酸钠、硫酸亚铁、氯化锌、地塞米松、碳酸氢钠及4-羟乙基哌嗪乙磺酸，充分溶解后，用浓盐酸调整pH值，用氯化钠调整渗透压，补加超纯水至900ml，过滤除菌，4℃保存；

2)浓缩添加剂配制方法如下：

取超纯水，放入37℃的水浴锅中，恒温搅拌，先加入人血清白蛋白，搅拌充分溶解；在37℃恒温的条件下，边搅拌边缓慢地滴入亚油酸，完全加入后再搅拌使充分溶解；按加入亚油酸的方法，依次加入亚麻酸及卵磷脂；最后37℃恒温的条件下，再依次加入细胞因子EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a，边加入边搅拌，使充分溶解，补加超纯水至100ml，过滤除菌，-20℃避光保存；

3)基础培养基与浓缩添加剂按照9：1的体积比混合。

5.权利要求4所述的间充质干细胞无血清培养基的配制方法，其特征在于，

1)基础培养基的配制方法如下：

取800ml超纯水，先充分溶解DMEM-LG培养基粉末，一边溶解一边搅拌，搅拌子转速50-200rpm；再依次加入Purmorphamine、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、L-抗坏血酸-2-磷酸、2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、丙酮酸钠、硫酸亚铁、氯化锌、地塞米松、碳酸氢钠及4-羟乙基哌嗪乙磺酸，充分溶解后，用浓盐酸调整pH6.8-7.2，用氯化钠调整渗透压为260-335mOsm/kg，补加超纯水至900ml，0.22μm过滤除菌，4℃保存；

2)浓缩添加剂配制方法如下：

取90ml超纯水，放入37℃的水浴锅中，恒温搅拌，转速50-100rpm，先加入人血清白蛋白，搅拌时间15min，使充分溶解；在37℃恒温的条件下，边搅拌边缓慢地滴入亚油酸，完全加入后再搅拌10min，使充分溶解；按加入亚油酸的方法，依次加入亚麻酸及卵磷脂；最后37℃恒温的条件下，再依次加入细胞因子EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a，边加入边搅拌，使充分溶解，补加超纯水至100ml，0.22μm过滤除菌,-20℃避光保存；

3)基础培养基与浓缩添加剂按照9：1的体积比混合。

6.权利要求1或2或3所述的培养基用于间充质干细胞的培养。