CN111621476B - 一种用于间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基、重组人胰岛素、胆固醇、重组纤连蛋白、亚油酸钠、重组人转铁蛋白、紫苏籽蛋白、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物。上述无血清培养基，通过添加重组人转铁蛋白和植物蛋白紫苏籽蛋白复配，添加二苯乙烯苷、白藜芦醇和银杏叶提取物复配使用，一方面具有抗氧化清除自由基的效果，有助于细胞保持活性；另一方面在不添加外源血清的情况下仍然使细胞保持较高的增殖速度和较好的生长状态。本发明的无血清培养基成分明确，可以提高实验的重复性、准确性和稳定性，原料易获取，有效降低无血清培养基的制备成本。本发明还提供了上述无血清培养基的制备方法，制备过程简便易操作。

Description

一种用于间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种用于间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。
背景技术
人间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，存在于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中。在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。除此，人间充质干细胞不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效。
尽管MSCs在再生医学中的应用得到广泛关注，但其在体外扩增和体内移植过程中却不可避免的暴露于相当大的氧化应激之下，造成ROS(如过氧化氢、羟基自由基、超氧化物阴离子自由基)超标。体外长期培养的MSCs内H2O2水平增加，导致细胞衰老和增殖抑制。传统的间充质干细胞培养需要添加胎牛血清，培养的间充质干细胞通过胞吞摄取牛血清蛋白而携带牛血清蛋白，能够引起受体免疫反应，同时有引入异源血清携带的细菌、病毒的风险，再者血清培养的细胞产率、传代次数有限，极大限制了间充质干细胞的应用。间充质干细胞的研究和应用需要足够数量的细胞，因此就要求细胞在培养过程中具有较好的活性和增殖速度。对间充质干细胞的培养基提出了更高的要求。
现有技术中虽然公开了采用无血清培养基培养间充质干细胞，但是，目前的间充质干细胞无血清培养基存在培养的细胞活性差，增殖速率慢等问题，不能满足间充质干细胞的科研或临床需求，限制了无血清培养基在间充质干细胞培养的应用。
脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)是指存在新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，能分化成骨、软骨、肌肉、心肌等多种组织细胞，并且增殖能力强，免疫原性低，取材方便，无道德伦理问题限制。
脐带组织来源极为丰富，脐带通常作为分娩后医疗废弃物进行处理，在合法、合规条件下，挖掘利用脐带资源获取UC-MSCs，用于人类疾病治疗，将极大有益于人类健康事业的发展。尽管组织来源丰富，但是如何获得高产量、高活性、高一致性、更安全的脐带间充质干细胞，是间充质干细胞研究应用的重要课题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于间充质干细胞的无血清培养基，有效提高细胞的增殖速率，保持细胞活性。
本发明的目的之二在于提供一种用于间充质干细胞的无血清培养基的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种用于间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基、重组人胰岛素、胆固醇、重组纤连蛋白、亚油酸钠、重组人转铁蛋白、紫苏籽蛋白、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物。
进一步地，以培养基的终浓度计，各组分的用量为：重组人胰岛素6.5-9.0mg/L、胆固醇1.5-4.0mg/L、重组纤连蛋白22.3-25.0μg/L、亚油酸钠15.4-17.2μg/L、重组人转铁蛋白8.3-12.4mg/L、紫苏籽蛋白5.0-8.0mg/L、二苯乙烯苷8.5-9.5μg/L、白藜芦醇5.8-8.4μg/L、银杏叶提取物7.3-9.0μg/L。
进一步地，以培养基的终浓度计，各组分的用量为：重组人胰岛素7.0mg/L、胆固醇3.0mg/L、重组纤连蛋白24.7ng/L、亚油酸钠16.5μg/L、重组人转铁蛋白11.5mg/L、紫苏籽蛋白6.0mg/L、二苯乙烯苷9.0μg/L、白藜芦醇7.3μg/L、银杏叶提取物8.5μg/L。
进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述用于间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入重组人胰岛素、胆固醇、重组纤连蛋白、亚油酸钠、重组人转铁蛋白、紫苏籽蛋白、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物，混合均匀，过滤除菌即得用于间充质干细胞的无血清培养基。
进一步地，采用滤膜过滤，滤膜的孔径为0.22μm。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种用于间充质干细胞的无血清培养基，添加重组人转铁蛋白和紫苏籽蛋白复配，通过添加植物蛋白紫苏籽蛋白和重组人转铁蛋白复配，和无血清培养基中的重组纤连蛋白、胆固醇等成分一起为细胞培养提供合适的微环境，提高间充质干细胞的增殖能力。
2、本发明的无血清培养基中还添加二苯乙烯苷、白藜芦醇和银杏叶提取物复配使用，一方面具有抗氧化清除自由基的效果，有助于细胞保持活性；另一方面在不添加外源血清的情况下仍然使细胞保持较高的增殖速度和较好的生长状态。
3、本发明的无血清培养基成分明确，可以提高实验的重复性、准确性和稳定性，原料易获取，有效降低无血清培养基的制备成本，避免血清所带来的血源性污染等问题。
4、本发明还提供了一种用于间充质干细胞无血清培养基的制备方法，制备过程简便易操作，便于实现商业化。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种用于脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基DMEM/F12、以培养基的终浓度计，还包括以下含量的组分：重组人胰岛素7.0mg/L、胆固醇3.0mg/L、重组纤连蛋白24.7ng/L、亚油酸钠16.5μg/L、重组人转铁蛋白11.5mg/L、紫苏籽蛋白6.0mg/L、二苯乙烯苷9.0μg/L、白藜芦醇7.3μg/L、银杏叶提取物8.5μg/L。
上述脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入重组人胰岛素、胆固醇、重组纤连蛋白、亚油酸钠、重组人转铁蛋白、紫苏籽蛋白、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物，混合均匀，采用孔径0.22μm的滤膜过滤、除菌即得用于脐带间充质干细胞的无血清培养基。
实施例2
一种用于脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基DMEM/F12、以培养基的终浓度计，还包括以下含量的组分：重组人胰岛素6.5mg/L、胆固醇1.5mg/L、重组纤连蛋白22.3μg/L、亚油酸钠15.4μg/L、重组人转铁蛋白8.3mg/L、紫苏籽蛋白5.0mg/L、二苯乙烯苷8.5μg/L、白藜芦醇5.8μg/L、银杏叶提取物7.3μg/L。
上述脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法同实施例1。
实施例3
一种用于脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基DMEM/F12、以培养基的终浓度计，还包括以下含量的组分：重组人胰岛素9.0mg/L、胆固醇4.0mg/L、重组纤连蛋白25.0ng/L、亚油酸钠17.2μg/L、重组人转铁蛋白12.4mg/L、紫苏籽蛋白8.0mg/L、二苯乙烯苷9.5μg/L、白藜芦醇8.4μg/L、银杏叶提取物9.0μg/L。
上述脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法同实施例1。
对比例1
对比例1和实施例1的区别为省去紫苏籽蛋白，将重组人转铁蛋白的用量调整为17.5mg/L，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2和实施例1的区别为省去重组人转铁蛋白，将紫苏籽蛋白的用量调整为17.5mg/L，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3和实施例1的区别为省去二苯乙烯苷，将白藜芦醇的用量调整为16.3μg/L其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4和实施例1的区别为省去白藜芦醇，将银杏叶提取物的用量调整为15.8μg/L，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5和实施例1的区别为省去银杏叶提取物，将白藜芦醇的用量调整为15.8μg/L，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6和实施例1的区别为省去二苯乙烯苷，将银杏叶提取物的用量调整为17.5μg/L，其余均和实施例1相同。
试验例
获取脐带间充质干细胞：
(1)于超净台内取出脐带，PBS冲洗，剔除脐带外膜及血管，将脐带胶质剪成1mm×1mm×1mm的组织块，分成9组于60cm2的培养皿中，待其贴壁，分别加入实施例1至3、对比例1至6的无血清培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养；
(2)上述脐带组织培养2d后进行半量换液，培养7d时，组织块周边有脐带间充质干细胞出现，记为P0代，进行全换液处理；
(3)待细胞达到80％的融合时，弃去脐带组织块和原有培养液，生理盐水洗涤后加入2mL 0.25％的胰酶消化；
(4)将上述消化液过滤后离心处理，在T75培养瓶中加入对应的实施例1至3、对比例1至6的培养基，细胞浓度为3×104个/mL，进行传代培养。
取上述培养的P3代脐带间充质干细胞，接种于12孔板中，分成9组，每组12孔，分别继续对应采用实施例1至3、对比例1至6的培养基进行培养，接种的细胞浓度为1×104个/mL，分别于培养1d、3d、5d和7d时各取3孔用台盼兰染色进行细胞计数，取平均值，并计算第7d时细胞存活率，结果如表1和表2所示。
表1
Figure GDA0002848995950000071
表2
组别 细胞存活率
实施例1 98.34％
实施例2 97.45％
实施例3 97.81％
对比例1 90.12％
对比例2 88.73％
对比例3 86.42％
对比例4 85.10％
对比例5 80.22％
对比例6 84.16％
由表1可知各实施例和对比例相比差异明显(P＜0.05)，实施例1至3的细胞数量均高于对比例1至6，说明实施例1至3的无血清培养基中脐带间充质干细胞的增殖能力更好。对比例1和对比例2中分别省去了紫苏籽蛋白和重组人转铁蛋白，即使调整另一成分的用量后，制备的无血清培养基中细胞的增殖能力不及实施例1至3，说明本发明采用重组人转铁蛋白和植物蛋白紫苏籽蛋白复配使用，结合培养基中的其他组分为细胞培养提供合适的微环境，有助于提高细胞的增殖能力。
对比例3至6中调整了二苯乙烯苷、白藜芦醇和银杏叶提取物，省去任一成分后，细胞的增殖能力下降，说明本发明的无血清培养基中通过添加二苯乙烯苷、白藜芦醇和银杏叶提取物，三种成分协同作用，一方面具有抗氧化清除自由基的效果，有助于细胞保持活性；另一方面在不添加外源血清的情况下仍然使细胞保持较高的增殖速度和较好的生长状态。综上，采用本发明的无血清培养基进行脐带间充质干细胞的培养，有助于提高细胞的增殖能力，并且本发明的无血清培养基原料易获取，有效降低无血清培养基的制备成本，可以提高实验的重复性、准确性和稳定性，避免血清所带来的血源性污染等问题。
由表2可以看出各实施例和对比例相比差异明显(P＜0.05)，实施例1至3的细胞活率高于对比例1至6，说明本发明的无血清培养基通过添加重组人转铁蛋白和紫苏籽蛋白复配、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物复配使用，各组分协同作用，在不添加血清的情况下有助于脐带间充质干细胞保持活性，从而具有较高的细胞存活率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种用于间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基、重组人胰岛素、胆固醇、重组纤连蛋白、亚油酸钠、重组人转铁蛋白、紫苏籽蛋白、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物；
以培养基的终浓度计，各组分的用量为：重组人胰岛素6.5-9.0mg/L、胆固醇1.5-4.0mg/L、重组纤连蛋白22.3-25.0μg/L、亚油酸钠15.4-17.2μg/L、重组人转铁蛋白8.3-12.4mg/L、紫苏籽蛋白5.0-8.0mg/L、二苯乙烯苷8.5-9.5μg/L、白藜芦醇5.8-8.4μg/L、银杏叶提取物7.3-9.0μg/L。
2.根据权利要求1所述一种用于间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，以培养基的终浓度计，各组分的用量为：重组人胰岛素7.0mg/L、胆固醇3.0mg/L、重组纤连蛋白24.7ng/L、亚油酸钠16.5μg/L、重组人转铁蛋白11.5mg/L、紫苏籽蛋白6.0mg/L、二苯乙烯苷9.0μg/L、白藜芦醇7.3μg/L、银杏叶提取物8.5μg/L。
3.根据权利要求1所述一种用于间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求1所述一种用于间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
5.如权利要求1至4任一项所述用于间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：向基础培养基中加入重组人胰岛素、胆固醇、重组纤连蛋白、亚油酸钠、重组人转铁蛋白、紫苏籽蛋白、二苯乙烯苷、白藜芦醇、银杏叶提取物，混合均匀，过滤除菌即得用于间充质干细胞的无血清培养基。
6.根据权利要求5所述用于间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于，采用滤膜过滤，滤膜的孔径为0.22μm。
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