CN113005079B - 一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂及扩增方法 - Google Patents

一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂及扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，所述添加剂加入至人骨髓间充质干细胞体外扩增基础培养基中使用，由以下成分组成：儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L‑谷氨酰胺、胰岛素。本发明提供添加剂中的莽草酸、石杉碱甲及铌酸钾钠和丝素蛋白等协同作用，显著提高人骨髓间充质干细胞的体外扩增速度，提高增殖效率，减少细胞老化，通过扩增培养得到的细胞还保持较好的分化潜能。本发明还提供了一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，在基础培养基中加入本发明的添加剂作为扩增培养基，在短时间内可收获大量人骨髓间充质干细胞，为骨髓间充质干细胞的临床应用提供保障。

Description

一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂及扩增方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂及扩增方法。
背景技术
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是骨髓基质的主要成份，为骨髓的造血功能提供支持。骨髓间充质干细胞具有较强增殖能力和多向分化潜能，能够在特定诱导条件下分化为成骨细胞或软骨细胞、成纤维细胞、神经元样细胞、肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞，可进行自体移植而不存在组织配型和免疫排斥，在细胞移植、基因治疗和组织工程等领域具有广泛的应用前景。
骨髓间充质干细胞在应用于临床治疗和组织工程中需要大量细胞，但从骨髓中获取的干细胞数量有限，不能满足实际应用所需的细胞量，这就需要将骨髓间充质干细胞在体外进行扩增培养。现有的扩增培养过程存在诸多问题，如细胞增殖速度慢、活性差，细胞培养基中的部分添加物存在安全问题，如培养基中常用动物血清（胎牛血清）来提高细胞的增殖活性，但是动物血清来源自动物体内，其生物复杂性和不确定性增加了细胞制品生产及质量控制的难度，同时血清容易引起细菌、真菌、病毒等的污染，增加细胞制品的安全性隐患。在临床应用过程中需谨慎考虑。
在体外培养扩增过程中，骨髓间充质干细胞还易分化、老化而失去多向分化潜能，最终得到的细胞制品在临床应用时效果不理想，不能满足临床需求，限制了骨髓间充质干细胞的应用。因此需要改进骨髓间充质干细胞的扩增用培养基成分及扩增方法，实现骨髓间充质干细胞快速扩增并保持较好的分化潜能，以满足科研及临床应用的需要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种人骨髓间充质干细胞扩增用添加剂，成分明确，可显著促进骨髓间充质干细胞的增殖，减少细胞老化，保持其分化潜能。
本发明的目的之二在于提供一种人骨髓间充质干细胞的扩增方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，所述添加剂加入至人骨髓间充质干细胞体外扩增基础培养基中使用，由以下成分组成：儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素。
进一步地，所述添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素5-10μg/mL、莽草酸1-5μg/mL、石杉碱甲2-7μg/mL、铌酸钾钠5-10ng/mL、丝素蛋白10-15ng/mL、bFGF 20-30 ng/mL、L-谷氨酰胺12-16μg/mL、胰岛素8-13μg/mL。
进一步地，所述添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素7μg/mL、莽草酸3μg/mL、石杉碱甲5μg/mL、铌酸钾钠8ng/mL、丝素蛋白12ng/mL、bFGF 25 ng/mL、L-谷氨酰胺14μg/mL、胰岛素10μg/mL。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，在基础培养基中加入上述添加剂进行扩增。
上述人骨髓间充质干细胞体外扩增方法包括以下步骤：
（1）取基础培养基加入儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素混合均匀；
（2）将用于扩增培养的人骨髓间充质干细胞接种于步骤（1）的培养基中，在5%CO2，37℃的培养箱中进行扩增培养，连续培养8天。
进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
进一步地，步骤（2）中人骨髓间充质干细胞在培养基中的密度为1-5×104个/mL。
进一步地，步骤（2）中扩增用人骨髓间充质干细胞为传代培养得到的P2-P6代细胞。
进一步地，步骤（2）中在培养过程中每2天更换一次培养基。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，添加剂中的莽草酸、石杉碱甲及铌酸钾钠和丝素蛋白等协同作用，显著提高人骨髓间充质干细胞的体外扩增速度，提高增殖效率，减少细胞老化，通过扩增培养得到的细胞还保持较好的分化潜能。添加剂中的儿茶素还能及时清除培养过程中产生的自由基，有助于细胞保持增殖活性。
2、本发明还提供了一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，在基础培养基中加入本发明的添加剂作为扩增培养基，在短时间内可收获大量人骨髓间充质干细胞，为骨髓间充质干细胞的临床应用提供保障。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，添加剂加入至DMEM/F12培养基中使用，由以下成分组成：儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素；添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素7μg/mL、莽草酸3μg/mL、石杉碱甲5μg/mL、铌酸钾钠8ng/mL、丝素蛋白12ng/mL、bFGF 25 ng/mL、L-谷氨酰胺14μg/mL、胰岛素10μg/mL。
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：
（1）取DMEM/F12培养基加入儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素混合均匀；
（2）将P2代人骨髓间充质干细胞接种于步骤（1）的培养基中于T75培养瓶中培养，培养基中细胞密度为1×104个/mL，将培养瓶置于5%CO2，37℃的培养箱中进行扩增培养，培养过程中每2天更换一次培养基，连续培养8天。
实施例2
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，添加剂加入至DMEM/F12培养基中使用，由以下成分组成：儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素；添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素5μg/mL、莽草酸1μg/mL、石杉碱甲2μg/mL、铌酸钾钠5ng/mL、丝素蛋白10ng/mL、bFGF 20 ng/mL、L-谷氨酰胺12μg/mL、胰岛素8μg/mL。
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：
（1）取DMEM/F12培养基加入儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素混合均匀；
（2）将P4代人骨髓间充质干细胞接种于步骤（1）的培养基中于T75培养瓶中培养，培养基中细胞密度为3×104个/mL，将培养瓶置于5%CO2，37℃的培养箱中进行扩增培养，培养过程中每2天更换一次培养基，连续培养8天。
实施例3
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，添加剂加入至DMEM/F12培养基中使用，由以下成分组成：儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素；添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素10μg/mL、莽草酸5μg/mL、石杉碱甲7μg/mL、铌酸钾钠10ng/mL、丝素蛋白15ng/mL、bFGF 30 ng/mL、L-谷氨酰胺16μg/mL、胰岛素13μg/mL。
一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：
（1）取DMEM/F12培养基加入儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素混合均匀；
（2）将P6代人骨髓间充质干细胞接种于步骤（1）的培养基中于T75培养瓶中培养，培养基中细胞密度为5×104个/mL，将培养瓶置于5%CO2，37℃的培养箱中进行扩增培养，培养过程中每2天更换一次培养基，连续培养8天。
对比例1
对比例1提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去莽草酸，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去石杉碱甲，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去石杉碱甲，将莽草酸的用量调整为8μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去莽草酸，将石杉碱甲的用量调整为8μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去铌酸钾钠，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：将铌酸钾钠的用量调整为4ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例7
对比例7提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：将铌酸钾钠的用量调整为11ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例8
对比例8提供一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，和实施例1的区别为：省去铌酸钾钠，将丝素蛋白的用量调整为20ng/mL，其余均和实施例1相同。
采用台盼蓝染色法分别统计实施例1至3，对比例1至8中骨髓间充质干细胞在培养8天后细胞的总数量及活细胞数量，计算骨髓间充质干细胞的增殖倍数及活率，结果如表1所示。
增殖倍数=培养8天的细胞总数量/初始接种数量；
细胞活率=活细胞数量/总细胞数量×100%。
表1
组别 增殖倍数 细胞活率
实施例1 34.79 98.41%
实施例2 32.84 97.58%
实施例3 33.98 98.04%
对比例1 18.36 76.83%
对比例2 15.32 74.06%
对比例3 14.79 72.59%
对比例4 16.02 75.33%
对比例5 21.49 81.79%
对比例6 23.79 84.93%
对比例7 19.87 80.08%
对比例8 18.72 79.36%
由表1可以看出实施例1至3中骨髓间充质干细胞的增殖活性及细胞活率较高，优于对比例1至8，这是因为对比例1至8中调整了添加剂的原料组成。
对比例1至4中分别对莽草酸或石杉碱甲进行了调整，当省去其中一种成分后，无论是否调整剩余原料的用量，细胞的增殖倍数及细胞活率均不及实施例1至3，说明本发明通过添加莽草酸和石杉碱甲，提高了骨髓间充质干细胞的增殖活性，经扩增后得到的细胞数量较多，同时还有助于避免细胞凋亡，细胞活率较高。
对比例5至7中分别省去铌酸钾钠或者调整铌酸钾钠的用量，对比例8中在省去铌酸钾钠后增加了丝素蛋白的用量，由表1可知，细胞的增殖活性及活率和实施例1相比均有不同程度的下降，这说明本发明通过加入铌酸钾钠以及限定其用量，有助于提高人骨髓间充质干细胞的体外扩增速度，提高增殖效率。
取实施例1至3，对比例1至8中培养8天后的细胞用0.25%的胰酶消化后接种于6孔板中，待细胞生长至85%融合后加入成骨分化诱导液（诱导液组成为：α-MEM、10%FBS、地塞米松1×105mol/mL、抗坏血酸40μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L）诱导分化21天后进行染色鉴定，期间每3天更换一次诱导液。将诱导分化21天后的细胞弃去培养基，用4℃预冷的PBS清洗，然后用4%的多聚甲醛在常温下固定20min，弃去多聚甲醛，再用PBS清洗三遍，用0.2%的茜素红染色30min，弃去染色液，蒸馏水洗涤 3遍，在显微镜下观察染色情况，统计钙化面积百分比，结果如表2所示。
表2
样品 钙化面积（%）
实施例1 72.31±4.14
实施例2 70.57±4.25
实施例3 72.17±4.12
对比例1 54.19±3.68
对比例2 52.46±3.91
对比例3 58.02±3.85
对比例4 61.71±4.31
对比例5 45.37±3.27
对比例6 48.95±4.06
对比例7 44.65±3.79
对比例8 45.12±3.90
由表2可以看出实施例1至3中细胞钙化面积高于对比例1至8，说明实施例1至3中的骨髓间充质干细胞在经成骨诱导培养后得到的成骨细胞数量较多。
对比例1至4中分别对莽草酸或石杉碱甲进行了调整，当省去其中一种成分后，无论是否调整剩余原料的用量，钙化面积和实施例1相比均减少，说明上述成分的添加有助于避免细胞老化，使细胞保持良好的分化潜能。
同样在对比例5至7中分别省去铌酸钾钠或者调整铌酸钾钠的用量，对比例8中在省去铌酸钾钠后增加了丝素蛋白的用量，钙化面积也不及实施例1，说明经诱导培养后对比例5至8中的成骨细胞数量少于实施例1，这是因为本发明添加的铌酸钾钠有助于细胞保持干性，经培养后得到的细胞分化潜能好。
综上，本发明添加剂中的莽草酸、石杉碱甲及铌酸钾钠和丝素蛋白等协同作用，显著提高人骨髓间充质干细胞的体外扩增速度，提高增殖效率，减少细胞老化，通过扩增培养得到的细胞还保持较好的分化能力。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，其特征在于，所述添加剂加入至人骨髓间充质干细胞体外扩增基础培养基中使用，由以下成分组成：儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素；所述添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素5-10μg/mL、莽草酸1-5μg/mL、石杉碱甲2-7μg/mL、铌酸钾钠5-10ng/mL、丝素蛋白10-15ng/mL、bFGF 20-30 ng/mL、L-谷氨酰胺12-16μg/mL、胰岛素8-13μg/mL。
2.根据权利要求1所述人骨髓间充质干细胞体外扩增用添加剂，其特征在于，所述添加剂在培养基中的终浓度为：儿茶素7μg/mL、莽草酸3μg/mL、石杉碱甲5μg/mL、铌酸钾钠8ng/mL、丝素蛋白12ng/mL、bFGF 25 ng/mL、L-谷氨酰胺14μg/mL、胰岛素10μg/mL。
3.一种人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，其特征在于，在基础培养基中加入权利要求1至2任一项所述添加剂进行扩增。
4.根据权利要求3所述人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取基础培养基加入儿茶素、莽草酸、石杉碱甲、铌酸钾钠、丝素蛋白、bFGF、L-谷氨酰胺、胰岛素混合均匀；
（2）将用于扩增培养的人骨髓间充质干细胞接种于步骤（1）的培养基中，在5%CO2，37℃的培养箱中进行扩增培养，连续培养8天。
5.根据权利要求4所述人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
6.根据权利要求4所述人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤（2）中人骨髓间充质干细胞在培养基中的密度为（ 1-5） ×104个/mL。
7.根据权利要求4所述人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤（2）中扩增用人骨髓间充质干细胞为传代培养得到的P2-P6代细胞。
8.根据权利要求4所述人骨髓间充质干细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤（2）中在培养过程中每2天更换一次培养基。
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