KR20210053725A

KR20210053725A - 요유래 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 요유래 줄기세포의 배양방법

Info

Publication number: KR20210053725A
Application number: KR1020190139702A
Authority: KR
Inventors: 이홍기; 이성훈; 김상헌; 진정아; 강태욱; 소수빈; 윤진상
Original assignee: 주식회사 이에이치엘바이오
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2021-05-12
Also published as: KR102320682B1

Abstract

본 발명은 요유래 줄기세포의 분리를 위한 배양액, 요유래 줄기세포의 배양을 위한 배양액, 및 상기 배양액들을 이용한 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 관한 것이다.

Description

요유래 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 요유래 줄기세포의 배양방법{Culture medium composition for culturing urine-derived stem cells, and method for culturing urine-derived stem cells by using same}

최근 여러 질병으로 인해 손상된 인체 조직과 기관의 기능부전에 대해 세포나 조직, 장기를 대체 또는 재생시켜 본래의 기능을 유지, 복원, 향상시키는 재생의학에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 중에서도 회복이 불가능했던 조직이나 장기들의 고유한 회복 메커니즘을 활성화하거나 손상된 조직을 재생하기 위한 목적으로 줄기세포를 이용하는 치료법이 그 잠재성을 인정받고 있다. 줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 '미분화' 세포이다. 적절한 외부 자극과 환경의 조절에 따라 다양한 조직의 세포로 분화 유도되며, 현재 성체에서 얻어 분화시킬 수 있는 성체줄기세포가 줄기세포 치료 연구에 주도적 역할을 하고 있다. 과거에는 한 조직에 있는 성체줄기세포는 오직 그 조직의 세포로만 분화한다고 알려져 있었으나, 최근에는 다른 조직의 세포로도 분화할 수 있다는 연구 결과들이 보고되었다. 성체줄기세포는 배아줄기세포보다 분화 다양성은 낮지만, 배양조건을 보다 개선함으로써 그 적용범위를 점차 넓히고 있다. 또한 성체줄기세포를 치료에 이용할 경우, 치료하고자 하는 환자로부터 직접 성체줄기세포를 얻을 수 있기 때문에 배아줄기세포에 비해 윤리적인 문제가 적고, 환자 자신의 세포를 이용하는 것이기 때문에 면역거부반응도 적다. 성체줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 근육, 간, 치수 등에 존재한다고 알려져 있으며, 점차 성체줄기세포를 얻을 수 있는 조직의 종류가 다양해지고 있다. 이 중 간엽 줄기세포의 공급원으로 골수와 지방이 유용하나 채취 과정이 침습적이어서 주위 조직에 손상을 초래할 수 있고, 낮은 세포 수득율과 순도는 이들 세포를 치료법으로 적용하는데 보완해야 할 문제점으로 남아있다. 환자이식에 필요한 줄기세포 수를 확보하기 위해서는 체외 배양을 통한 세포증식이 필요하고, 이 과정에서 줄기세포의 특성이 유지되어야 하나, 골수 및 지방유래 줄기세포는 장기간 체외 배양 시 세포의 특성이 변하는 문제점이 있고 공여자의 연령이 증가함에 따라 줄기세포의 수, 증식능, 분화능이 감소하는 경향도 있다. 따라서 초기 배양시 필요한 충분한 세포를 얻을 수 있으며, 체외 배양 기간이 짧고 계대배양 후에도 줄기세포적 특성을 유지시킬 수 있는 새로운 세포원의 개발이 필요하다.

한편, 요유래 줄기세포는 줄기세포를 소변에서 간단한 분리과정을 통해 획득할 수 있으므로, 다른 간엽줄기세포에 비해 환자에게 통증과 후유증을 전혀 유발하지 않고 여러 번 획득이 가능하여 초기 배양에 필요한 줄기세포 수를 기존 세포원에 비해 많이 얻을 수 있다. 또한 요유래 줄기세포는 증식률이 높아 단기간에 많은 세포 수를 얻을 수 있기 때문에 상용화 가능성이 높고, HLA-DR의 발현이 낮아 체내 이식 시 면역 반응을 유발하지 않는 자가세포치료제로서 사용 가능하다는 점에서 임상적 접근에 매우 용이하다는 장점을 가지고 있다. 그 외에도 요유래 줄기세포는 적절한 배양환경에서 여러 가지 성장인자를 포함한 사이토 카인을 분비하는 등 그 치료적 잠재성이 인정받고 있다. 따라서, 요유래 줄기세포를 배양하기 위해 다양한 선행 연구들이 진행되어 왔으며, 이러한 연구들의 대부분은 우뇌하수체 추출물(Bovine pituitary extract, BPE)과 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS)을 포함한 각질형성세포 무혈청 배지(Keratinocyte serum free media, KSFM, Gibco)를 이용하여 요유래 줄기세포를 분리, 배양하였다. 그런데 우뇌하수체 추출물과 우태혈청에는 많은 성장인자와 호르몬 단백질들이 포함되어 있으며, 이를 통해 줄기세포를 배양할 경우 자칫 배양 중에 무작위적 분화로 이어지는 경우가 적지 않다. 또한 각질형성세포 무혈청 배지의 경우 높은 가격으로 인해 줄기세포를 대량 배양하기에 경제적으로 효율적이지 못하다. 또한, 다양한 선행 연구에서 요유래 줄기세포를 분리할 때, 원심분리를 통해 분리해낸 요유래 세포들을 6 웰 플레이트 또는 100mm 배양접시에 접종하여 요유래 줄기세포 콜로니를 형성시키는 방법을 사용하였는데, 이러한 분리 방법을 사용하면 여러 세포들이 함께 배양되어 요유래 줄기세포만을 얻기 위해서는 요유래 줄기세포 콜로니를 선택적으로 픽킹(Picking)하여야 한다. 따라서 작업자에 따라 초기 세포수 및 순도가 달라질 수 있고, 작업의 효율이 낮을 뿐 아니라, 작업과정의 복잡성으로 인해 오염의 가능성도 높다는 한계점을 가지고 있다.

본 발명자들은 요유래 줄기세포의 분리 및 배양시에 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 요유래 세포들을 24웰 플레이트에 접종하는 경우 별도의 콜로니 픽킹 과정 없이도 간단한 방법으로 높은 순도의 요유래 줄기세포를 얻을 수 있음을 확인하였으며, 또한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 기본배지로 하고, 우태혈청(FBS)을 5%만을 첨가하여 배양액을 제조하는 경우 증식률이 우수한 요유래 줄기세포를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 장기배양시에도 줄기세포적 특성을 우수하게 유지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액, 상기 분리된 요유래 줄기세포의 배양을 위한 제2배양액, 및 상기 제1배양액 및 제2배양액을 이용한 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "배양액“은 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "개체"는 신장 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

1. 요유래 줄기세포의 분리

본 발명은 기본배지, 5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액에 있어서, 상기 배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액에 있어서, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(Chemically defined lipids), FGF23(Fibroblast growth factor 23), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3), 칼시페디올(Calcifediol) 및 Y27632로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 제1배양액을 이용한 요유래 줄기세포의 분리 방법으로, 상기 방법은:

(a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계;

(b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계;

(c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계; 및

(d) 상기 세포를 24웰 플레이트에서 기본배지, 5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 제1배양액으로 접종하는 단계를 포함하는 요유래 줄기세포의 분리 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 방법에 있어서, 상기 방법은 (e) 상기 세포를 트립신 처리하여 요유래 줄기세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 방법에 있어서, 상기 원심분리는 300g 내지 700g에서 5분 내지 10분 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 방법에 있어서, 상기 세척은 PBS(phosphate buffered saline)에 의하여 세척되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 방법에 있어서, 상기 배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 방법에 있어서, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(Chemically defined lipids), FGF23(Fibroblast growth factor 23), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3), 칼시페디올(Calcifediol) 및 Y27632로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

2. 요유래 줄기세포의 배양

본 발명은 기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 요유래 줄기세포의 배양을 위한 제2배양액을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 배양을 위한 제2배양액에 있어서, 상기 제2배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 2.5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 배양을 위한 제2배양액에 있어서, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(Chemically defined lipids), FGF23(Fibroblast growth factor 23), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3) 및 칼시페디올(Calcifediol) 로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 제2배양액을 이용한 요유래 줄기세포의 배양 방법으로, 상기 방법은:

(f) 상기 요유래 줄기세포를 세척하는 단계; 및

(g) 상기 요유래 줄기세포를 24웰 플레이트에서 제2배양액으로 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 요유래 줄기세포의 배양 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 배양 방법에 있어서, 상기 방법은 (h) 배양된 요유래 줄기세포를 6웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴내지1x10⁶(cells/cm²)의 밀도로 접종하여 5 내지 8 계대 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 배양 방법에 있어서, 상기 세척은 PBS(phosphate buffered saline)에 의하여 세척되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 배양 방법에 있어서, 상기 제2배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 2.5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 배양 방법에 있어서, 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(Chemically defined lipids), FGF23(Fibroblast growth factor 23), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3), 칼시페디올(Calcifediol) 및 Y27632로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포이 배양 방법에 있어서, 상기 배양된 요유래 줄기세포는:

(1) 25 내지 30시간의 DT(Doubling Time)을 나타내고,

(2) 25 내지 30회의 CPDL(Cumulative Population Doubling Level)을 나타내고, 그리고

(3) OCT4, SOX2, Nanog, FOXO1, FOXO3 및 Klotho의 발현량이 KSFM/EFM(1:1 부피비) 배지에서 배양된 요유래 줄기세포에 비해 증가하는 것을 특징으로 한다.

3. 요유래 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명은 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법으로, 상기 방법은

(a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계;

(b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계;

(c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계;

(d) 상기 세포를 24웰 플레이트에서 기본배지, 5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 제1배양액으로 접종하는 단계;

(e) 상기 세포를 트립신 처리하여 요유래 줄기세포를 회수하는 단계;

(f) 상기 요유래 줄기세포를 세척하는 단계; 및

(g) 상기 요유래 줄기세포를 24웰 플레이트에서 제2배양액으로 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 방법은 (h) 배양된 요유래 줄기세포를 6웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴내지1x10⁶(cells/cm²)의 밀도로 접종하여 5 내지 8 계대 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 제1배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(Chemically defined lipids), FGF23(Fibroblast growth factor 23), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3), 칼시페디올(Calcifediol) 및 Y27632로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 제2배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 2.5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 첨가제는 우혈청알부민, 지질 혼합물(Chemically defined lipids), FGF23(Fibroblast growth factor 23), 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3) 및 칼시페디올(Calcifediol) 로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 배양된 요유래 줄기세포는:

(1) 25 내지 30시간의 DT(Doubling Time)을 나타내고,

본 발명의 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법에 따르면, 요유래 줄기세포 분리시 24 웰 플레이트에 세포를 접종함으로써 순도 높은 요유래 줄기세포를 별도의 픽킹 없이 획득할 수 있으며, 독특한 조성과 배합비를 가지는 첨가물을 혼합한 배지를 사용하여 배양함으로써 장기배양 후에도 줄기세포의 특성을 잘 유지하며 증식률이 높은 요유래 줄기세포를 얻을 수 있으므로, 경제적이고 효율적으로 요유래 줄기세포를 배양하여 세포치료제로서 산업적으로 활발히 이용할 수 있다. 따라서, 요유래 줄기세포의 대량 배양을 통해 비뇨생식계의 질환들을 타겟으로 한 줄기세포의 치료제의 개발뿐만 아니라, 최근 그 효능을 주목받고 있는 세포외소포(Exosome) 치료제 개발을 통해 다양한 난치성 질환에 안전하고 효율적인 치료제로써 사용될 것으로 기대된다.

도 1는 분리 직후 소변에 포함된 세포들의 현미경 사진 (100X)을 나타낸다.
도 2는 24 웰 플레이트에 형성된 요유래 줄기세포 콜로니(40X)를 나타낸다.
도 3은 요유래 줄기세포 콜로니 배양 과정을 나타낸다.
도 4는 요유래 줄기세포 분리 및 배양 모식도를 나타낸다.
도 5는 요유래 줄기세포 분리 방법에 따른 초기 세포수 비교를 나타낸다.
도 6.은 요유래 줄기세포의 계대 별 증식률 비교 (접종한 세포 수 대비)를 나타낸다.
도 7은 요유래 줄기세포의 계대 별 DT(Doubling time)를 나타낸다.
도 8은 요유래 줄기세포의 계대 별 CPDL(Cumulative population doubling level)를 나타낸다.
도 9는 요유래 줄기세포의 줄기세포 관련 유전자 발현 비교를 나타낸다.
도 10은 요유래 줄기세포의 항노화 관련 유전자 발현 비교를 나타낸다.
도 11은 요유래 줄기세포 계대 별 세포 표면 마커 발현 비교를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1 : 요유래 줄기세포의 분리

채취된 200ml의 소변을 점액사 등과 같은 이물질을 제거하기 위해 100μm 필터로 여과하였다. 여과된 소변을 50ml 튜브에 나누어 담고 500xg에서 15분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 모아 1X PBS(Gibco)로 세척한 뒤, 500xg에서 10분간 원심분리 하였다. 위의 세척과정을 2회 반복하였다. 그 다음, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 제1배양액(표 1)으로 현탁한 뒤, 24 웰 플레이트에 500μl씩 분주하였다. 요유래 줄기세포 콜로니가 생성되도록 5-7일 동안 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였다.

Basal media	Supplement	Concentration
DMEM (Low glucose) + DMEM/F12 (1:1 mix)	FBS	5%
	Bovine serum albumin	0.1-10 mg/ml
	Chemically defined lipids	표 3 참조
	FGF23	1-100 ng/ml
	Triiodothyronine(T3)	0.1-20 nM
	Calcifediol	10-500 nM
	Y27632	1-100μM

분리 직후 소변에 포함된 세포들은 도 1과 같은 형태를 보이며, 신세뇨관세포(Renal tubular cell), 요로상피세포(Uroepithelial cell), 편평상피세포(Squamous epithelial cell), 백혈구(Leukocyte), 적혈구(Erythrocyte) 등이 포함되어 있었다. 소변에서 유래된 세포 중 99%는 세포 배양 용기에 부착되지 않는 세포들이며, 이 세포들은 배지 교체시 제거된다. 나머지 세포 중 0.1%의 세포는 요로상피세포, 근육세포, 내피세포 등에서 유래한 세포들이며, 그 밖의 다분화능을 가지고 있는 줄기세포의 성격을 띤 0.2%의 세포가 요유래 줄기세포임이 알려져 있다. 본 분리방법에서 요유래 줄기세포가 아닌 세포들은 배지 조성과 요유래 줄기세포와의 증식속도 차이에 의해 도태되었다.

실시예 2 : 요유래 줄기세포의 배양

상기 실시예 1에 따른 분리일로부터 5-7일간 배양 후 요유래 줄기세포 약 3-5개 웰에서 콜로니가 형성됨을 확인하였다(도 2). 콜로니가 형성된 후 배지교체를 위해, 배지를 모두 제거한 뒤 1X PBS를 이용하여 세척하고, 제2배양액(표 2)으로 5-7일간 더 배양하였다.

Basal media	Supplement	Concentration
DMEM (Low glucose) + Ham’s F12 (3:1 mix)	FBS	2.5%
	Bovine serum albumin	0.1-50 mg/ml
	Chemically defined lipids	표 3 참조
	FGF23	1-500 ng/ml
	Triiodothyronine(T3)	0.1-100 nM
	Calcifediol	10-1000 nM

Chemically defined lipids	Concentration
Arachidonic acid	2-20 ng/ml
Cholesterol	220-2200 ng/ml
DL-alpha-Tocopherol Acetate	70-700 ng/ml
Linoleic acid	10-100 ng/ml
Myristic acid	10-100 ng/ml
Oleic acid	10-100 ng/ml
Palmitic acid	10-100 ng/ml
Palmitoleic acid	10-100 ng/ml
Pluronic F-68	90-900 μg/ml
Stearic acid	10-100 ng/ml
Tween 80	2.2-22 μg/ml

37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였으며, 배지는 3일마다 교체되었다. 분리일로부터 10-15일 배양 후 요유래 줄기세포 콜로니의 직경이 약 5-10mm로 증식되면, 효소처리를 통해 1차 계대배양을 실시하였다(도 3). 배지를 제거하고 1X PBS로 세척한 뒤, TrypLE Express(Gibco)를 웰 당 200μl씩 첨가하여 5분간 37℃ CO₂인큐베이터에서 반응시켰다. FBS(Gibco)가 함유된 배지를 사용하여 효소를 중화시키고, 부유된 세포를 15ml 튜브에 모아 1500rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 뒤 세포 펠렛을 제2배양액으로 현탁하여 세포수를 측정하였다. 그 후, 6웰 플레이트에 면적(cm²) 당 5x10³개의 농도로 세포를 접종하고 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였다. 배지는 2-3일에 한번씩 교체되었으며, 세포 포화도가 80-90%로 증식되면 면적(cm2)당 2.5x10³개의 농도로 계대배양을 실시하였다. 상기 과정을 도 4에 모식도로 나타내었다.

실시예 3 : 세포 증식률 평가

기존의 콜로니 픽킹을 이용한 요유래 줄기세포 분리 방법과 본 발명에 따른 24 웰 플레이트를 이용한 요유래 줄기세포 분리 방법 간의 초기 세포 회수율을 비교하기 위하여, 소변 100ml을 원심 분리하여 각각 100mm 세포 배양 접시 와 24 웰 플레이트에 제1배양액으로 접종하였다. 분리일로부터 10일 후, 각각 픽킹 및 효소 처리를 통해 세포를 회수한 후 계수하였다. 그 결과 24 웰 플레이트를 이용한 분리방법(5.4x10⁵)에서 픽킹 방법(2.8x10⁵) 대비 약 1.93배 많은 수의 세포를 얻을 수 있었다. 또한 픽킹 방법(89%)보다 24 웰 플레이트를 이용한 분리방법(93%)에서 더 높은 세포 생존율을 나타내었다. 이는 픽킹 과정에서 세포에 물리적인 손상이 일어나게 되며 이로 인해 세포 생존율의 감소한 것으로 보인다. 따라서, 본 발명에 따른 24 웰 플레이트를 이용한 요유래 줄기세포 분리방법이 기존의 콜로니 픽킹을 이용한 분리방법보다 배양 초기에 높은 세포 수득율을 가지는 것으로 확인되었다 (도 5).

또한, 기존 배양액(표 4)과 본 발명에 따른 제2배양액(표 2)으로 각각 요유래 줄기세포를 분리 및 배양하여 증식률의 차이를 비교하기 위하여 소변 100ml로부터 요유래 줄기세포를 분리하여, 기존 배양액과 본 발명에 따른 제2배양액으로 세포를 24 웰 플레이트에 접종하였다.

Basal media	Supplement	Concentration
KSFM (gibco) + EFM (1:1 mix)	FBS	10%
	EGF	2.5μg/ml
	Hydrocortisone	0.4μg/ml

분리일로부터 10일 후 직경 약 5-10mm 크기의 콜로니가 증식된 것을 확인하였으며, 6 well plate에 웰 당 1x10⁵개로 접종하여 계대배양 하였다. 4일 후 세포 포화도가 80-90%로 증식되면 세포를 회수하여 계수하고, 6 well plate에 웰 당 1x10⁵개로 접종하여 계대배양을 하였다. 상기과정은 계대배양 8회차까지 반복하였으며, 세포수는 ADAM cell counter(NanoEnTek, Korea)를 이용하여 측정하였다. 세포 증식률은 다음과 같이 CPDL(Cumulative Population Doubling Level)과 DT(Doubling Time)를 구하는 공식을 이용하여 평가하였다.

CPDL = ln(Nf/Ni) ln2

DT (hr) = X*Log2/(Log(Nf)-Log(Ni))*24

(Ni= 초기 접종 시 세포 수, Nf = 최종 세포 수, X = 배양일 수)

그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 제2배양액(이하 TM5-EXP으로 명명)으로 증식시킨 요유래 줄기세포는 계대배양 8회차까지 활발히 증식되었으며, 기존 배양액(이하 RM으로 명명) 대비 각 계대 별 최소 2.00, 최대 3.27배의 우수한 세포 증식률을 확인할 수 있었다.

도 7에서는 세포가 한번 분열하는데 걸리는 시간, 즉 DT(Doubling Time)를 그래프로 나타내었다. 그 결과, RM은 계대배양 5회차까지 약 37.79 ~ 39.67 시간의 DT를 나타내었으나, 계대배양 6회차 이후 48.01 ~ 85.74 시간으로 급격히 DT가 증가하였다. 반면, TM5-EXP은 계대배양 8회차까지 평균 28.23 시간의 비교적 일정한 DT를 나타내었다. 이를 통해, RM은 계대배양 5회차 이후 급격한 세포 증식률 감소를 보이는 반면, TM5-EXP에서는 계대배양 8회차까지의 장기배양에서도 비교적 우수한 세포 증식률을 가지는 것으로 확인되었다.

도 8에서는 계대배양 8회차까지 세포가 분열한 횟수, 즉 CPDL(Cumulative Population Doubling Level)을 그래프로 나타내었다. 그 결과, RM은 계대배양 8회차까지 17.03회의 CPDL을 나타내었다. 반면, TM5-EXP는 계대배양 8회차까지 27.65회의 CPDL을 나타내어 RM 대비 약 1.62배 높은 CPDL을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서, 요유래 줄기세포를 본 연구진의 제2배양액(TM5-EXP)으로 배양하였을 때, 기존 배양액(RM)보다 우수한 배양이 가능함이 확인되었다.

실시예 4 : 실시간 중합효소연쇄반응 분석

본 발명에 따른 분리 및 배양방법으로 계대배양 5회차까지 배양된 요유래 줄기세포에서 줄기세포 관련인자와 항노화 인자(표 5)의 발현을 확인하고자 실시간 중합효소연쇄반응 분석을 실시하였다.

	Primer	Sequence (5’- 3’)
Housekeeping gene	GAPDH	F - AGC CAC ATC GCT CAG ACA C
		R - GCC CAA TAC GAC CAA ATC C
Stem cell markers	OCT4	F - TTC AGC CAA ACG ACC ATC TG
		R - CAC GAG GGT TTC TGC TTT GC
	SOX2	F - CCC ACC TAC AGC ATG TCC TAC TC
		R - TGG AGT GGG AGG AAG AGG TAA C
	NANOG	F - TTC CCT CCT CCA TGG ATC TG
		R - TGT TTC TTG ACT GGG ACC TTG TC
Anti-aging markers	FOXO1	F - TTA TGA CCG AAC AGG ATG ATC TTG
		R - TGT TGG TGA TGA GAG AAG GTT GAG
	FOXO3A	F - GCG TGC CCT ACT TCA AGG ATA AG
		R - GAC CCG CAT GAA TCG ACT ATG
	Klotho	F - ACA GAG GTT ACA GCA TCA GGC G
		R - TTC CTC TTC TTG GTC ACA ACC

계대배양 5회차의 요유래 줄기세포 1x10⁶개를 계수하여 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거하고, 1X PBS를 이용하여 세척해주었다. 상층액을 제거한 세포 펠렛을 TAKARA MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Cat. #9767)를 이용하여 total RNA를 추출하였고, PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Cat. 6110A)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. SYBR Green Premix Ex Taq II (Cat. #RR820S/A/B)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 유전자 발현 레벨을 분석하였다. Housekeeping gene으로 GAPDH를 사용하였고, 줄기세포의 유전자 발현 확인을 위해 줄기세포 관련 마커인 OCT4, SOX2, Nanog의 발현을 확인하였다. 또한 항노화인자로 알려진 FOXO1, FOXO3A, Klotho의 발현을 함께 확인하여 본 발명에 따라 분리한 요유래 줄기세포가 얼마나 세포 노화에 대한 저항성을 가지는지 확인하였다 (표 5).

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 분리된 요유래 줄기세포(UDSC#1, UDSC#2)를 RM과 TM5-EXP로 배양한 결과, TM5-EXP로 배양하였을 때 RM 보다 줄기세포 관련 유전자(OCT4, SOX2, Nanog)의 발현이 향상된 것을 확인하였다. 또한 도 10에 나타낸 바와 같이, TM5-EXP로 배양하였을 때 RM 보다 항노화 관련 유전자로 알려진 FOXO1, FOXO3A의 발현이 향상된 것을 확인하였으며, 신장에서 특이적으로 발현되는 항노화 관련 유전자인 Klotho를 높게 발현하는 것을 확인하였다. 이로써, 요유래 줄기세포를 본 발명에 따른 제2배양액(TM5-EXP)으로 배양하였을 때, 기존 배양액(RM)보다 줄기세포 관련 유전자의 발현이 향상됨을 확인하였으며, 항노화 관련 유전자의 발현이 보다 향상된 것으로 보아, 장기 배양시 수반될 수 있는 세포 노화에 대해 저항성을 가지는 것으로 추측된다. 이는 앞선 세포 증식률 결과와 연관이 있는 것으로 예상된다.

실시예 5 : 유세포 분석

본 실시예에서는 요유래 줄기세포의 세포 특성을 설명하기 위해서, 계대배양 5, 8회차 요유래 줄기세포에서 줄기세포 특이적 표면 마커의 발현을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 어떤 실시예에서 요유래 줄기세포는 CD73, CD90, CD105, CD146, SSEA-4 중 하나 이상을 가지며 CD31, CD34, 및 CD45 중 하나 이상을 갖지 않는다. 구체적으로는 RM과 TM5-EXP로 각각 배양한 요유래 줄기세포를 계대배양 5, 8회차에서 회수하여 세포 1X10⁶개를 PBS(Gibco) 500μl에 부유시켰다. 그 후 세포를 FACS 튜브(5ml, poly styrene round-bottom, Falcon)에 100μl씩 분주하였다. 분주한 세포에 FACS 항체(표 6)를 각각 첨가하고 실온에서 빛을 차단하여 20분간 반응시켰다.

	세포 표면형 마커	용량
CD31	FITC Mouse Anti-Human CD31	5μl
CD34	PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD34	5μl
CD45	FITC Mouse Anti-Human CD45	5μl
CD73	FITC Mouse Anti-Human CD73	5μl
CD90	PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	5μl
CD105	PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD105	5μl
CD146	PE Mouse Anti-Human CD146	5μl
SSEA4	FITC Mouse Anti-SSEA-4	5μl

반응 후 각 튜브에 PBS를 500μl씩 첨가하여 유세포 분석기로 분석하였다. 유세포 분석기는 BD사의 FACSverse^TM기기를 사용하였고 기기 측정 매뉴얼에 따라 측정하였으며, 분석 소프트웨어를 통해 분석하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 RM과 TM5-EXP로 배양한 요유래 줄기세포는 계대배양 5회차에서 CD73, CD90, CD105, CD146, SSEA-4에 대해 99%이상으로, 모두 포지티브로 염색되었고 CD31, CD34, CD45는 10% 미만으로, 모두 네거티브로 염색되었다. 계대배양 5회차에서는 RM과 TM5-EXP간의 유의적 차이는 없었다. 반면 계대배양 8회차에서 RM은 CD73(61.28%), CD90(83.37%), CD105(54.46%), CD146(67.97%), SSEA4(72.63%)에 대해 계대배양 5회차 대비 발현이 감소하였다. 반면, TM5-EXP는 CD73(84.40%), CD90(93.57%), CD105(83.32%), CD146(71.17%), SSEA4(82.54%)에 대해 계대배양 5회차 대비 발현이 감소하였으나, RM에 비해 비교적 낮은 감소율을 보였다. 한편 계대배양 8회차에서 CD31, CD34, CD45는 1% 미만으로, 모두 네거티브로 염색되었으며 RM과 TM5-EXP 간의 유의적 차이는 없었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

기본배지, 5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액.
제1항에 있어서,
상기 배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액.
(a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계;
(b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계;
(c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계; 및
(d) 상기 세포를 제1항 또는 제2항에 따른 요유래 줄기세포의 분리를 위한 제1배양액으로 접종하는 단계
를 포함하는 요유래 줄기세포의 분리 방법.
제3항에 있어서,
상기 방법은 (e) 상기 세포를 트립신 처리하여 요유래 줄기세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 분리 방법.
제3항에 있어서,
상기 원심분리는 300g 내지 700g에서 5분 내지 10분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 분리 방법.
제3항에 있어서,
상기 세척은 PBS(phosphate buffered saline)에 의하여 세척되는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 분리 방법.
기본배지, 2.5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 요유래 줄기세포의 배양을 위한 제2배양액.
제7항에 있어서,
상기 제2배양액은 3:1 비율의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 와 햄의 F-12(Ham’s F12)를 3:1 비율로 포함하는 기본 배지, 2.5%의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 배양을 위한 제2배양액.
(f) 분리된 요유래 줄기세포를 세척하는 단계; 및
(g) 상기 요유래 줄기세포를 24웰 플레이트에서 제7항 또는 제8항에 따른 제2배양액으로 접종하여 배양하는 단계
를 포함하는 요유래 줄기세포의 배양 방법.
제9항에 있어서,
상기 방법은 (h) 배양된 요유래 줄기세포를 6웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴내지1x10⁶(cells/cm²)의 밀도로 접종하여 5 내지 8 계대 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 배양 방법.
제9항에 있어서,
상기 배양된 요유래 줄기세포는:
(1) 25 내지 30시간의 DT(Doubling Time)을 나타내고,
(2) 25 내지 30회의 CPDL(Cumulative Population Doubling Level)을 나타내고, 그리고
(3) OCT4, SOX2, Nanog, FOXO1, FOXO3 및 Klotho의 발현량이 KSFM/EFM(1:1 부피비) 배지에서 배양된 요유래 줄기세포에 비해 증가하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 배양 방법.
(a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계;
(b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계;
(c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계;
(d) 상기 세포를 24웰 플레이트에서 기본배지, 5% 이하의 우태아혈청 및 첨가제를 포함하는 제1항 또는 제2항에 따른 제1배양액으로 접종하는 단계;
(e) 상기 세포를 트립신 처리하여 요유래 줄기세포를 회수하는 단계;
(f) 상기 요유래 줄기세포를 세척하는 단계; 및
(g) 상기 요유래 줄기세포를 24웰 플레이트에서 제7항 또는 제8항 따른 제2배양액으로 접종하여 배양하는 단계
를 포함하는 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제12항에 있어서,
상기 방법은 (h) 배양된 요유래 줄기세포를 6웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴내지1x10⁶(cells/cm²)의 밀도로 접종하여 5 내지 8 계대 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제12항에 있어서,
상기 배양된 요유래 줄기세포는:
(1) 25 내지 30시간의 DT(Doubling Time)을 나타내고,
(2) 25 내지 30회의 CPDL(Cumulative Population Doubling Level)을 나타내고, 그리고
(3) OCT4, SOX2, Nanog, FOXO1, FOXO3 및 Klotho의 발현량이 KSFM/EFM(1:1 부피비) 배지에서 배양된 요유래 줄기세포에 비해 증가하는 것을 특징으로 하는 것인, 요유래 줄기세포의 분리 및 배양 방법.