CN110468101A - 一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括下述步骤：S1、分离提取骨髓细胞，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80‑90％时，用胰酶溶液消化，进行传代培养；S2、待P3‑P5代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80‑90％时，用胰酶溶液消化，接种至预铺促贴壁材料的培养容器中，加入增殖培养基进行培养，即可。本发明的培养方法能大大提高骨髓间充质干细胞的扩增细胞数量、缩短培养周期，有效提高了骨髓间充质干细胞的增殖效率，适合应用于骨髓间充质干细胞的体外扩增。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法
背景技术
骨髓间充质干细胞是在哺乳动物的骨髓基质中存在的以种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞。由于其具备多向分化潜能和自我更新能力，在体外可分化为成骨、软骨和脂肪细胞等，可参与软骨缺损修复、治疗骨缺损或骨折、促进血管化构建等用途，在组织工程领域具备广阔前景；同时，骨髓间充质干细胞还具有较容易获取、低免疫排斥等优点，使其成为干细胞研究的热点。但是，目前的骨髓间充质干细胞体外扩增方法普遍存在增殖效率低、获取细胞数量少、培养周期长的缺陷，限制了骨髓间充质干细胞更广泛的应用。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，有利于提高骨髓间充质干细胞的扩增细胞数量、缩短培养周期，从而提高骨髓间充质干细胞的增殖效率。
本发明提出的一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：
S1、分离提取骨髓细胞，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80-90％时，用胰酶溶液消化，进行传代培养；
S2、待P3-P5代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时，用胰酶溶液消化，接种至预铺促贴壁材料的培养容器中，加入增殖培养基进行培养，即可；
所述增殖培养基包括下述成分：柚皮苷，姜黄素，维生素C，成纤维细胞生长因子，胰岛素，胎牛血清，基础培养基。
优选地，所述增殖培养基包括下述成分：柚皮苷3-6μg/mL，姜黄素1.2-2.4μg/mL，维生素C 20-30μg/mL，成纤维细胞生长因子5-10ng/mL，胰岛素10-15μg/mL，胎牛血清10％，基础培养基补足。
优选地，所述基础培养基为α-MEM培养基或者DMEM/F12培养基。
优选地，所述促贴壁材料包括胶原蛋白和胶原三肽，优选地，所述胶原蛋白和胶原三肽的质量比为1：(0.01-0.1)；优选地，所述胶原三肽为棕榈酰三肽-1或者棕榈酰三肽-5。
优选地，所述促贴壁材料的预铺处理方法为：将促贴壁材料溶于醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5-1％的促贴壁材料溶液，然后铺于培养容器上，干燥后即可；优选地，所述促贴壁材料溶液的用量为80-150μg/cm2。
优选地，所述步骤S1中，传代培养的比例为1:3-1:4。
优选地，所述胰酶溶液的浓度为0.15-0.25％。
优选地，所述步骤S2中，培养的接种密度为1-2×104个/mL。
优选地，所述步骤S2中，培养的具体条件为：5％CO2,37℃。
本发明的有益效果如下：
本发明骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，采用柚皮苷，姜黄素，维生素C，成纤维细胞生长因子，胰岛素，胎牛血清，基础培养基复配的增殖培养基，其中，柚皮苷，姜黄素配合，能高效激活Wnt/β-catenin信号通路，从而提高骨髓间充质干细胞的增殖活力，促进骨髓间充质干细胞的增殖；柚皮苷，姜黄素，维生素C配合，具有很好的抗氧化能力，减少细胞在体外培养时受到的损伤；成纤维细胞生长因子和胎牛血清配合，有助于维持骨髓间充质干细胞处于未分化状态，从而保持其分化能力；采用胶原蛋白和胶原三肽复配作为促贴壁材料，在培养前对培养容器进行预铺处理，其中胶原三肽具有很高的抗氧化、清除自由基能力，有利于提高骨髓间充质干细胞的贴壁活力，促进骨髓间充质干细胞的贴壁生长，从而缩短细胞的增殖时间，提高细胞的增殖效率。因此，本发明的培养方法能大大提高骨髓间充质干细胞的扩增细胞数量、缩短培养周期，有效提高了骨髓间充质干细胞的增殖效率，适合应用于骨髓间充质干细胞的体外扩增。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：
S1、将小鼠处死后分离股骨、胫骨，清洗干净后打开骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔收集含骨髓细胞的提取液，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，按1:3的比例进行传代培养；
S2、待P3代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，接种至预铺促贴壁材料的培养瓶中，接种密度为2×104个/mL，加入增殖培养基，在5％CO2,37℃条件下进行培养，即可；
增殖培养基包括下述成分：柚皮苷3μg/mL，姜黄素1.2μg/mL，维生素C20μg/mL，成纤维细胞生长因子5ng/mL，胰岛素10μg/mL，胎牛血清10％，α-MEM培养基补足。
促贴壁材料的预铺处理方法为：将促贴壁材料溶于0.02mol/L的醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5％的促贴壁材料溶液，然后铺于培养瓶上，干燥后即可，其中促贴壁材料为胶原蛋白和棕榈酰三肽-1按质量比为1：0.01混合得到，促贴壁材料溶液的用量为80μg/cm2。
实施例2
一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：
S1、将小鼠处死后分离股骨、胫骨，清洗干净后打开骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔收集含骨髓细胞的提取液，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.2％的胰酶溶液消化，按1:3的比例进行传代培养；
S2、待P3代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.2％的胰酶溶液消化，接种至预铺促贴壁材料的培养瓶中，接种密度为2×104个/mL，加入增殖培养基，在5％CO2,37℃条件下进行培养，即可；
增殖培养基包括下述成分：柚皮苷4μg/mL，姜黄素2μg/mL，维生素C 25μg/mL，成纤维细胞生长因子8ng/mL，胰岛素12μg/mL，胎牛血清10％，α-MEM培养基补足。
促贴壁材料的预铺处理方法为：将促贴壁材料溶于0.02mol/L的醋酸溶液中配制成质量浓度为0.8％的促贴壁材料溶液，然后铺于培养瓶上，干燥后即可，其中促贴壁材料为胶原蛋白和棕榈酰三肽-5按质量比为1：0.05混合得到，促贴壁材料溶液的用量为120μg/cm2。
实施例3
一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：
S1、将小鼠处死后分离股骨、胫骨，清洗干净后打开骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔收集含骨髓细胞的提取液，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，按1:3的比例进行传代培养；
S2、待P3代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，接种至预铺胶原蛋白的培养瓶中，接种密度为2×104个/mL，加入增殖培养基，在5％CO2,37℃条件下进行培养，即可；
增殖培养基包括下述成分：柚皮苷3μg/mL，姜黄素1.2μg/mL，维生素C20μg/mL，成纤维细胞生长因子5ng/mL，胰岛素10μg/mL，胎牛血清10％，α-MEM培养基补足。
胶原蛋白的预铺处理方法为：将胶原蛋白溶于0.02mol/L的醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5％的胶原蛋白溶液，然后铺于培养瓶上，干燥后即可，胶原蛋白溶液的用量为80μg/cm2。
对比例1
一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：
S1、将小鼠处死后分离股骨、胫骨，清洗干净后打开骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔收集含骨髓细胞的提取液，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，按1:3的比例进行传代培养；
S2、待P3代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，接种至预铺胶原蛋白的培养瓶中，接种密度为2×104个/mL，加入增殖培养基，在5％CO2,37℃条件下进行培养，即可；
增殖培养基包括下述成分：柚皮苷3μg/mL，维生素C 20μg/mL，成纤维细胞生长因子5ng/mL，胰岛素10μg/mL，胎牛血清10％，α-MEM培养基补足。
胶原蛋白的预铺处理方法为：将胶原蛋白溶于0.02mol/L的醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5％的胶原蛋白溶液，然后铺于培养瓶上，干燥后即可，胶原蛋白溶液的用量为80μg/cm2。
对比例2
一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：
S1、将小鼠处死后分离股骨、胫骨，清洗干净后打开骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔收集含骨髓细胞的提取液，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，按1:3的比例进行传代培养；
S2、待P3代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，接种至预铺胶原蛋白的培养瓶中，接种密度为2×104个/mL，加入增殖培养基，在5％CO2,37℃条件下进行培养，即可；
增殖培养基包括下述成分：姜黄素1.2μg/mL，维生素C 20μg/mL，成纤维细胞生长因子5ng/mL，胰岛素10μg/mL，胎牛血清10％，α-MEM培养基补足。
胶原蛋白的预铺处理方法为：将胶原蛋白溶于0.02mol/L的醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5％的胶原蛋白溶液，然后铺于培养瓶上，干燥后即可，胶原蛋白溶液的用量为80μg/cm2。
对比例3
对比例3为常规的骨髓间充质干细胞培养方法，具体包括以下步骤：
S1、将小鼠处死后分离股骨、胫骨，清洗干净后打开骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔收集含骨髓细胞的提取液，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，按1:3的比例进行传代培养；
S2、待P3代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80％时，用浓度为0.15％的胰酶溶液消化，接种至预铺胶原蛋白的培养瓶中，接种密度为2×104个/mL，加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基，在5％CO2,37℃条件下进行培养，即可；
胶原蛋白的预铺处理方法为：将胶原蛋白溶于0.02mol/L的醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5％的胶原蛋白溶液，然后铺于培养瓶上，干燥后即可，胶原蛋白溶液的用量为80μg/cm2。
试验例
(1)细胞增殖能力检测
按实施例1-3以及对比例1-3的方法进行骨髓间充质干细胞的增殖培养，分别在增殖培养3、4、5d时检测细胞数量，结果如表1所示：
表1细胞增殖试验结果
(2)分化能力检测
将实施例1-3增殖培养得到的骨髓间充质干细胞进行成脂分化以及成骨分化检测。其中成脂分化：将细胞用0.25％胰酶消化，接种于6孔板中，待细胞生长至80-90％融合后加入常规成脂诱导液(α-MEM培养基，10％FBS，1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，0.5mMIBMX，200μM吲哚美辛)，3d换一次液，14d时采用油红O染色法检测成脂分化情况；成骨分化：将细胞用0.25％胰酶消化，接种于6孔板中，待细胞生长至80-90％融合后加入常规成骨诱导液(α-MEM培养基，10％FBS，0.1μM地塞米松，50μg/mL抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠)，3d换一次液，14d时采用茜素红染色法检测成骨分化情况。试验结果表明，实施例1-3增殖培养得到的骨髓间充质干细胞成脂分化染色后，均可见形成染成鲜红色的脂滴；成骨分化染色后，均可见形成红色的矿化钙结节。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分离提取骨髓细胞，接种后进行原代培养，待培养至细胞融合度达到80-90％时，用胰酶溶液消化，进行传代培养；
S2、待P3-P5代骨髓间充质干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时，用胰酶溶液消化，接种至预铺促贴壁材料的培养容器中，加入增殖培养基进行培养，即可；
所述增殖培养基包括下述成分：柚皮苷，姜黄素，维生素C，成纤维细胞生长因子，胰岛素，胎牛血清，基础培养基。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养基包括下述成分：柚皮苷3-6μg/mL，姜黄素1.2-2.4μg/mL，维生素C 20-30μg/mL，成纤维细胞生长因子5-10ng/mL，胰岛素10-15μg/mL，胎牛血清10％，基础培养基补足。
3.根据权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述基础培养基为α-MEM培养基或者DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求1-3任一项所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述促贴壁材料包括胶原蛋白和胶原三肽，优选地，所述胶原蛋白和胶原三肽的质量比为1：(0.01-0.1)；优选地，所述胶原三肽为棕榈酰三肽-1或者棕榈酰三肽-5。
5.根据权利要求1-4任一项所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述促贴壁材料的预铺处理方法为：将促贴壁材料溶于醋酸溶液中配制成质量浓度为0.5-1％的促贴壁材料溶液，然后铺于培养容器上，干燥后即可；优选地，所述促贴壁材料溶液的用量为80-150μg/cm2。
6.根据权利要求1-5任一项所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述步骤S1中，传代培养的比例为1:3-1:4。
7.根据权利要求1-6任一项所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述胰酶溶液的浓度为0.15-0.25％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，培养的接种密度为1-2×104个/mL。
9.根据权利要求1-8任一项所述的骨髓间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，培养的具体条件为：5％CO2,37℃。
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